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Die
Erfindung betrifft eine Partikelabscheidevorrichtung und die Benutzung
einer solchen Vorrichtung in der Zellkultur. Die Erfindung ist anwendbar
für die
Züchtung
von Tierzellen zur Produktion von abgeschiedenen Substanzen wie
Polypeptiden und Proteine, insbesondere monoklonale Antikörper.
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In
den vergangenen Jahren hat es ein beträchtliches Interesse an der
Kultur von Tierzellen für
die Produktion einer Vielfalt nützlicher
Produkte gegeben. Die Zellenfusionstechnologie (Köhler und
Milstein, Nature 256, 495-597 (1975)) hat die Erschaffung von vielen
unterschiedlichen Hybridom abscheidenden monoklonalen Mäuseantikörpern mit
einem Bereich spezifischer Eigenschaften ermöglicht. Monoklonale Antikörper haben
sich als nützliche
therapeutische und diagnostische Mittel erwiesen, zur Immunreinigung
und als Forschungs-werkzeuge. Menschliche monoklonale Antikörper wurden
auch mit Zellfusionsprozessen erzeugt (Thompson et al, Immunology
58 157 (1986)), wodurch der Bereich der Anwendbarkeit weiter ausgedehnt
wurde. Rekombinante DNA-Techniken sind angewendet worden, um monoklonale
Antikörper
zu verändern
und zu verbessern, oft unter Verwendung einer Vielzahl von Tierzellen
als Wirtszellen. Die rekombinante DNA-Technologie ist auch verwendet
worden, um Zelllinien mit fremden Genen zu erzeugen, die aufgenommen
werden und in der Lage sind, das Produkt zu erzeugen, das durch
dieses Gen kodiert ist. Es wurde oft herausgefunden, daß die Tierzelle
Bakterien oder Hefe als Gast für
Proteinexpression überlegen
ist, wegen der Fähigkeit der
Tierzelle zum Glykolysieren von Protein und zum Austragen posttranslationaler
Modifikation.
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Damit
spielen die Technologien der Tierzellenfusion und die rekombinante
DNA-Technologie
in Tierzellen eine wichtige Rolle in der Produktion von nützlichen
Produkten, zusätzlich
zu ihrer traditionellen Rolle in der Impfstoffproduktion.
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Um
diese Produkte in ausreichender Menge mit wirtschaftlichen Kosten
herzustellen, müssen
Zellkulturprozesse maßstäblich vergrößert werden.
Die herkömmliche
Batch-Fermentationstechnologie
beruhte auf Rührkessel
oder Druckluftfermentern. Verschiedene Beispiele von großen Fermentern
(beispiels-weise 2000 dm3 Druckluftfermentern)
existieren bereits. Solche Fermenter müssen in großen Gebäuden untergebracht werden und
benötigen
die Versorgung mit Betriebskraft. Üblicherweise ist eine stromabwärtige Bearbeitung der
Ausbringung, die oft relativ gering ist, erforderlich.
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Es
hat ein großes
Interesse an der kontinuierlichen Perfusionstechnologie gegeben,
bei der Zellen innerhalb des Fermenters gehalten werden, während ein
zellfreies Überstandsprodukt
fortlaufend abgezogen wird und der Fermenter kontinuierlich über eine
Zeitspanne von Wochen oder Monaten mit frischem Medium aufgefüllt wird.
Dies ermöglicht
den Erhalt höherer
Zelldichte in dem Fermenter, was zu höheren Substrat-zu-Produkt-Umwandlungsgeschwindigkeiten
und zu einer besseren Ausnutzung von Fermenterzeit führen kann;
außerdem
können
kleinere Fermenter benutzt werden. Um einen Zellenrückstand
zu erreichen, muß es Mittel
zum physikalischen Zurückhalten
der Zellen innerhalb des Fermenters geben, schließlich zum
Abscheiden der Zelle von dem umgebenden Medium, das dann der Produktstrom
wird. Da Tierzellen keine Zellwand haben und empfindlich sind, muß das Rückhaltemittel
sanft sein. Die Vorrichtung oder das Verfahren, das zu diesem Zweck
angewendet wird, muß zu
einer im wesentlichen kontinuierlich sterilen Operation ohne signifikante
Ausfälle
oder Prozeßunterbrechungen
in der Lage sein. Der Aufbau sollte einfach, robust, hygienisch sein
und von einem ökonomischen
großen
Maßstab.
Sie sollte auch zur sicheren Einschließung in der Lage sein, wenn
gefährliche
Organismen darin wachsen müssen.
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Eine
Vielzahl von Vorrichtungen oder Verfahren sind zur Zellretention
vorgeschlagen oder in Benutzung genommen worden. Diese schließen externe
oder interne Spinfilter (Himmelfarb et al., Science 164, 555-557
(1969)) Membranseparatoren (Knazek et al, Science 178, 65-67 (1972)),
Zelleinschluß (Nilsson
et al., Nature 302, 629-630 (1983), Einkapselung (Jarvis und Grdrina,
Bio Techniques 1 22-27 (1983)) oder Schwerkraftablagerung (Kitano
et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 24 282-286 (1986) und Batt
et al., Biotechnol. Prog. 6 458-464 (1990)) ein.
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Die
meisten gegenwärtig
verwendeten Vorrichtungen haben im Labormaßstab erfolgreich gearbeitet, und
einige im industriellen Maßstab,
jedoch leiden sie alle unter einigen Nachteilen. Spinfiltervorrichtungen
neigen zum Verklumpen, stützen sich
auf mechanische Dichtungen und sind für Betriebsausfälle oder
den Verlust von Integrität
anfällig.
Membranvorrichtungen neigen zum Faulen, erfordern häufigen Ersatz
während
eines Laufs mit einem aseptischen Risiko. Membranvorrichtungen erfordern
auch eine hohe tangentiale Fließgeschwindigkeit,
um die Membran sauber zu halten, was bei scherempfind-lichen Zellen
Probleme bereiten kann.
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Die
Zelleinhülltechnologie
führt oft
zu einer geringen Lebensfähigkeit
in der Hülle,
und der Antikörper wird
darin zurückgehalten.
Die Ausbildung der Hüllen
ist ein komplexer Vorgang, der schwerlich erfolgreich im größeren Maßstab ausgeführt werden
kann. Der Zelleinschluß in
Tröpfchen
von Substanzen wie Agarose oder Alginat kann unter der Desintegration
der Tröpfchen
bei ausgedehnter Kultur leiden, womit wiederum Probleme mit dem
größeren Maßstab bestehen.
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Die
Schwerkraftablagerungsvorrichtungen haben ein großes Potential,
da sie eine einfache Konstruktion haben und keine bewegten Teile,
die brechen können.
Da sie keine Filter oder Membrane verwenden, ist es unmöglich, daß sie bei
normaler Benutzung verstopfen oder blockieren. Die Benutzung eines
Absetztanks ist ein einfacher Weg, dies zu erreichen, wobei eine
Zellsuspension in dem Tank ruht und die Zellen sich am Boden absetzen,
wobei eine zellfreie obere Schicht zurückbleibt. Der Hauptnachteil
für die
Art von Tank besteht darin, daß er
groß im
Verhältnis
zu dem Fermenter ist, an dem er angebracht ist, und die Verweilzeit
der Zellen darin ist lang, was zu nachteiligen metabolischen Effekten
führt.
Die metabolischen Effekte können durch
Kühlen
des Tanks überwunden
werden, jedoch ist die Größe des Tanks
weiterhin problematisch, selbst wenn Verbesserungen des Aufbaus
wie bei dem Dortmund Settler (Hulscher et al., Biotechnology and
Bioengineering 39 442-446
(1992)) möglich
sind.
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Die
Theorie der schrägen
Sedimentation wurde 1925 von E. Pounder (J. Exp. Physiol. 15 235-253 (1925))
durch Studien der Sedimentation und Rouleaux Formation von Erythrozyten
entwickelt. Sie wurde beim Biomassen-Recycling im breiten Maße angewendet,
jedoch erst kürzlich
bei der Tierzellenkultur. In ihrer einfachsten Form werden Zellen
aus einer Suspension entfernt, indem sie sich auf einer nach oben
weisenden Schrägen
eines langen Rohres oder einen Kanal, der gegenüber der Vertikalen geneigt
ist, absetzen. Hier bilden sie dünne Ablagerungsschichten,
die zum Boden des Behälters
herabgleiten. Somit werden die Zellen an dem Boden konzentriert,
und der Flüssigkeitsüberstand
im oberen Bereich wird geklärt.
Die konzentrierten Zellen werden zu dem Fermenter zurückgeführt, womit
Zellen innerhalb des Fermenters behalten werden, und die geklärte Überstandflüssigkeit,
die das abgetrennte Molekül
enthält,
wird als Ernte oben abgezogen.
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Allgemein
kann die Theorie der schrägen
Sedimentation durch die folgende Gleichung zusammengefaßt werden,
die von Batt et al. (Biotechnol. Prog. 6 458-464 (1990)), ausgedrückt ist,
wonach: S(v) = vw(lsinθ+bcosθ)
- wobei s(v) die
volumetrische Menge des geklärten
Fluids
- v die Partikelabsetzgeschwindigkeit
- w die Breite der Absetzplatte
- l die Länge
der Absetzplatte
- θ der
Neigungswinkel zur Vertikalen
- b der Abstand zwischen den schrägen Wänden der Absetzplatte
sind.
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Ausgehend
von dieser Gleichung ist es möglich,
die Leistungseigenschaften einer Absetzvorrichtung für Partikel
verschiedener Sedimentationsgeschwindigkeiten vorherzusagen, beispielsweise
nicht-lebensfähiges
Hybridom bei 1.1 cm/h und lebensfähiges Hybridom bei 2,9 cm/h.
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Alle
bisher entworfenen oder getesteten Vorrichtungen sind nur in einem
sehr kleinen Maßstab
angewendet worden. Die Vorrichtungen konnten nicht volumetrisch
vergrößert werden,
da ein Anstieg der Größe einen
proportionalen Anstieg in der Zellenverweilzeit bedeutet hätte, um
eine Benutzung in einem industriellen Maßstab ermöglichen zu können.
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Es
wurde nun herausgefunden, daß es
durch eine Änderung
im Aufbau der Sedimentationsabsetzeinrichtung möglich ist, daß diese
Absetzeinrichtungen vergrößert werden
können.
Die Konstruktionsänderung, die
dies ermöglicht,
besteht darin, daß mehr
als eine Sedimentationsfläche
vorgesehen ist.
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Nach
einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung
(1) zum Abscheiden von Säugetier-Zellen aus einer Zellüberstandsflüssigkeit
unter aseptischen oder sterilen Bedingungen vorgesehen, die ein
Kastenelement, Mittel, die mehrere entfernbare, aus spiegelpoliertem
rostfreien Stahl erzeugten Platten {3) bilden, die zu der
Vertikalen geneigt sind, und Mittel aufweist, die bewirken, daß Flüssigkeit,
in der die Zellen enthalten sind, nach oben über die Platten mit einer solchen
Geschwindigkeit fließt,
daß die
Zellen von der Flüssigkeit
abgeschieden werden, um Sedimentschichten auf den Platten zu bilden
und an diesen herunterzugleiten, wobei die Platten in einem Gehäuse (5)
enthalten sind, das mit einem am Boden der Platten angeordneten
Einlaß (13)
für Flüssigkeit,
in der abzuscheidende Zellen enthalten sind, einem Auslaß (21)
für Flüssigkeit,
aus der Zellen ausgeschieden sind, und einem Sammelauslaß (11)
für abgeschiedene
Zellen ausgestattet ist, wobei jeder Einlaß und jeder Auslaß mit einem
Sanitärverbinder
versehen ist, und wobei das Kastenelement vorgesehen ist, um Raum
einzunehmen, der von Platten, die entfernt wurden, hinterlassen
wurde, um die Trennung zwischen den Platten aufrecht zu erhalten.
Die abgeschiedenen Partikel können
dann gesammelt, zurückgeführt, verworfen
oder auf andere Weise einer weiteren Bearbeitung und/oder Handhabung und
Abhängigkeit
von der bestimmten Anwendung unterworfen werden.
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Eine
solche „multilamellare" Absetzvorrichtung
kann kompakt sein, den Prinzipien eines sterilen Aufbaus entsprechen,
einen großen
Maßstab
haben und fähig
sein, kontinuierlich zu arbeiten. Vorrichtungen gemäß der Erfindung
können
daher die strengen Anforderungen der Tierzellenkultur erfüllen, die
Zellretention und eine hohe Produktivität erreichen. Durch ihren Aufbau
haben die Absetzvorrichtungen gemäß der Erfindung eine relativ
große
Oberfläche
(im Vergleich zu bekannten Vorrichtungen), die durch die Vielzahl
von Platten gebildet ist, für
die Flüssigkeitsmenge.
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Eine
Vorrichtung zur Behandlung von Abwasser durch Schwerkraftablagerung
ist in EP-A-0003146 beschrieben, wobei das Abwasser von wasserlöslichen
Substanzen wie Öl
getrennt wird. EP-A-0259928 beschreibt eine Anlage zur anaeroben
Fermentation von Abwasser, bei der primäres Sedimentationsmaterial durch
Ablagerung über
geneigte, offenzellige Polyurethanschaumschichten entfernt werden.
EP-A-0599651 ist bezüglich
der vorliegenden Anmeldungen ein Dokument, das unter Artikel 54
(3) EPC eingeordnet ist. Das Dokument beschreibt einen Bioreaktor
für die
Perfusionskultur von Zellen, der oben in dem Tank des Bioreaktors eine Öffnung zum
Einlaß von
Flüssigkeit
hat, die Zellen enthält,
die abzuscheiden sind.
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Eine
Vorrichtung gemäß der Erfindung
hat viele Anwendungsmöglichkeiten,
aber eine der meisten Gemeinsamkeiten besteht in der kontinuierlichen
Fermentation von Zellen. Die Vorrichtung kann mit dem Auslaß eines
Fermenters verbunden sein, um entweder alle Zellen aus der Zellüberstandsflüssigkeit
oder einer ausgewählten
Population von Zellen (beispielsweise nicht-lebensfähige Zellen,
die andere Sedimentationseigenschaften haben als lebensfähige Zellen)
abzuführen.
Die Erfindung hat eine besondere Anwendbarkeit bei der Fermentation
von Proteinproduzierenden Zellen einschl. gezüchteter hybridomabsondernder
monoklonaler Antikörper.
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Es
ist bevorzugt, daß die
Vorrichtung wenigstens drei, fünf,
zehn oder sogar fünfzehn
Platten enthält, um
eine Vielzahl von Größen von
Ablagerungsflächen
aufzunehmen.
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Die
Platten werden bei den meisten Ausführungsformen der Erfindung
parallel zueinander sein, da dann die Ablagerungseigenschaften jeder
Platte ähnlich,
wenn nicht identisch sind. Bisweilen kann es jedoch wünschenswert
sein, daß wenigstens
eine der Platten etwas konvergent (oder divergent) von der anderen
oder den anderen ist, um auf bestimmten Flächen unterschiedliche Sedimentationseigenschaften
hervorzurufen, beispielsweise um Strömungsunterschiede über die
verschiedenen Flächen
hervorzurufen, die beispielsweise aus der Lage des Flüssigkeitseinlasses
herrühren.
Die Platten sind aus spiegelpoliertem, rostfreiem Stahl hergestellt,
was eine ausgezeichnete Oberfläche
bedeutet. Wenn erforderlich oder wünschenswert können die Oberflächen mit
einem geeigneten Gleitmittel wie einem Silikonmaterial beschichtet
sein, Dimethyldichlorsilian ist ein Beispiel. Die Platten können in
einem Stapel angeordnet sein, der entfernbar ist, in einer anderen
Ausführungsform
sind einzelne Platten oder Kombinationen von Platten entfernbar.
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Der
Winkel in dem die Platten zu der Vertikalen geneigt sind, wird entsprechend
der jeweiligen Anwendung der Vorrichtung bestimmt.
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Allgemein
liegt der Winkel zwischen 10° und
50° oder
sogar 80°,
jedoch für
viele Anwendungen zwischen 20° und
40° oder
etwa 30°.
Bevorzugt sind Mittel vorgesehen, die die Einstellung des Neigungswinkels ermöglichen.
Solche Mittel können
ein einstellbarer Arm oder eine Stütze sein.
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Der
Neigungswinkel ist einer der Parameter, der in Abhängigkeit
von der Abtrennaufgabe eingestellt wird, die die Vorrichtung ausführt. Es
wird darauf hingewiesen, daß eine
Flüssigkeitsmenge
eine heterogene Population von Partikeln enthalten kann, von denen
nur einige entfernt werden sollen. Partikel von unterschiedlichen
Dichten und Durchmessern lagern sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten
ab, und somit können
die Parameter der Vorrichtung einschl. des Neigungswinkels so eingestellt
werden, daß nur
die unerwünschten
Partikel entfernt werden. Beispielsweise kann es wünschenswert
sein, Partikel zu entfernen, die Ablagerungsgeschwindigkeiten haben,
die größer als
0,1 cm/h oder von 0,01 – bis
10 cm/h haben; bei der Anwendung der Erfindung auf die Hybridomtechnologie
kann es wünschenswert
sein, lebensfähige
von nicht-lebensfähigen
Zellen zu trennen.
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Andere
Parameter schließen
die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit
und die Oberflächenlänge (in Richtung
der Strömung)
ein. Im Falle der Abscheidung von Hybridomzellen aus einer Zellüberstandsflüssigkeit,
wobei die Zellen in dem Reaktorsystem zurückzuhalten sind, beträgt die Strömungsgeschwindigkeit
der Zellen enthaltenden Flüssigkeit
von einem angebrachten Fermenter über die Platten und zurück zu dem
Fermenter häufig
0,5 bis 5 dm3/h, bevorzugt etwa 1 dm3/h. Diese Menge kann entsprechend dem Zelltyp
variert werden; eine hauptsächliche
Anforderung ist, daß die
Zellen zu dem Fermenter in einer ausreichenden Geschwindigkeit zurückgeführt werden,
um eine nennenswerte Zellenablagerung in der Strömung und der Rückleitung
zu verhindern.
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Die
Länge der
Platten in Richtung der Strömung
kann nach Wunsch variiert werden. Größen von 5 cm bis 30 cm sind
zweckmäßig. Für ein maximales
Zurückhalten
sowohl der lebensfähigen
als auch der nicht-lebensfähigen
Hybridomzellen kann eine große
Länge von
beispielsweise etwa 30 cm gewählt
werden. Zur maximalen Unterscheidung zwischen lebensfähigen und
nicht-lebensfähigen
Hybridomzellen sind kleinere Längen
wie beispielsweise etwa 10 cm geeignet. Allgemein gilt, daß die gesamte
Absetzleistung um so geringer ist, je kürzer die Länge ist, wobei die Absetzeinrichtung
um so mehr in der Lage ist, zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen (d.h.
toten) Zellen zu unterscheiden.
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Der
Abstand zwischen den Platten kann jede geeignete Größe haben, üblicherweise
zwischen 0,2 cm und 2 cm, einschließlich. Für die Hybridomtrennung dürfte etwa
0,5 cm die optimale Strömung
der Überstandsflüssigkeit
und Zellenablagerung ermöglichen.
Die Gleichung von Batt et al., die oben angegeben ist, kann folgendermaßen modifiziert
werden, um den Abstand zwischen den Platten in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
zu berücksichtigen: S(v) = vnw(lsinθ + bcosθ)wobei
- S(v) die
volumetrische Geschwindigkeit des geklärten Fluids
- v die Partikelabsetzgeschwindigkeit
- n die Anzahl der Platten
- w die Breite der Absetzplatte
- l die Länge
der Absetzplatte
- θ der
Neigungswinkel zu der Vertikalen und
- b der Abstand zwischen den Platten
bedeuten.
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Diese
modifizierte Gleichung kann verwendet werden, um Abmessungen der
erfindungsgemäßen Vorrichtung
für viele
verschiedene Anwendungen zu ermitteln, und für verschiedene Anzahlen von
Oberflächen bildenden
Platten bei einer vorgegebenen Anwendung. Große oder kleine Vorrichtungen
können
entsprechend aufgebaut sein: die großen Versionen neigen dazu,
mehr und/oder breitere Platten zu haben.
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Die
Platten befinden sich in einem Gehäuse; dieses kann kritisch sein,
wenn die Vorrichtung aseptisch arbeiten soll. Das Gehäuse kann
einen rechteckigen Abschnitt haben und aus jedem geeigneten Material
bestehen, wobei rostfreier Stahl, der elektropoliert sein kann,
für viele
Anwendungen einschl. steriler Art geeignet ist. Das Gehäuse kann
so bemessen sein, daß es
eine größere Anzahl
von Platten aufnehmen kann, als bei einer vorgegebenen Anwendung
erforderlich ist. Ein Kastenelement ist vorgesehen (vorzugsweise
aus spiegelpoliertem, rostfreiem Stahl wie die Platten aufgebaut)
um den Raum einzunehmen, der durch die fehlenden Platten zurückgelassen
wird, um hierdurch für
Plattentrennung zu sorgen.
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Flüssigkeit,
die die Partikel enthält,
die abzuscheiden sind, tritt in das Gehäuse durch einen Einlaß ein. In
einer sterilen Ausführung
ist der Einlaß mit
einem Sanitärverbinder
versehen. Der Einlaß ist
allgemein an dem Boden der Platten, darunter oder nicht weit darüber, angeordnet,
um deren Länge
in Strömungsrichtung optimal
zu nutzen.
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Flüssigkeit,
von der unerwünschte
Partikel entfernt sind, verläßt das Gehäuse durch
einen Auslaß,
das auf ähnliche
Weise mit einem Sanitärverbinder
versehen sein kann. Der Auslaß ist
allgemein am oberen Ende der Platten, darüber oder nicht weit darunter
angeordnet, wiederum um die Länge
der Platten optimal zu nutzen.
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An
dem untersten Punkt des Gehäuses,
der von den abgelagerten Partikeln erreicht werden kann, die die
Platten herabgleiten, kann ein Sammelauslaß für die Partikel vorgesehen sein.
Der Sammelauslaß kann die
Rückkehr
der Partikel zu einem anderen Gerät (beispielsweise einem Fermenter)
erleichtern, an dem die Vorrichtung befestigt ist oder mit dem sie
auf andere Weise operativ gekoppelt ist.
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Die
Mittel, die bewirken, daß die
Flüssigkeit
aufwärts über die
Platten fließt,
können
eine Pumpe sein (beispielsweise eine Peristaltikpumpe), obwohl ein
Schwerkraftzuführsystem
verwendet werden kann, falls dies gewünscht ist.
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Die
Pumpe oder andere Mittel, die die Flüssigkeit fließen lassen,
kann kontinuierlich oder intermittierend arbeiten. Wenn sie intermittierend
arbeitet, tritt während
der Zeitspanne, in der die Pumpe aus ist, das Absetzen auf, während das
umgebende Fluid in Ruhe ist. Dies ermöglicht es, daß die Zellen,
die sich schon abgesetzt haben, an den Platten herableiten, ungehindert
durch einen Aufwärtsstrom
der Flüssigkeit,
wie dies während
eines normalen Gegenstromvorgangs geschieht. Der intermittierende
Betrieb hat den Vorteil, daß er die
Geschwindigkeit verbessern kann, mit dem die Zellen nach unten zurückkehren,
wodurch die Zellenlebensfähigkeit
und die Produktivität
verbessert sind.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann die Strömung
der Flüssigkeit
umgekehrt werden, beispielsweise für Perioden von etwa einer Minute
in jeweils 5 Minuten. Die periodische Umkehr, die erreicht werden
kann, in dem die Betriebsrichtung einer Pumpe umgekehrt wird, hat
die Wirkung, kurze Perioden von mit der Strömung einhergehender Ablagerung
hervorzurufen und außerdem
eine schnellere Rückkehr
solcher Zellen nach unten zu gewährleisten,
die bereits abgesetzt sind, wegen der gleichgerichteten Bewegung
der Flüssigkeit über ihnen.
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Temperatursteuermittel
können
vorgesehen sein, um die Temperatur der Flüssigkeit in der Vorrichtung innerhalb
vorbestimmter Grenzen zu halten. Die Grenzen variieren in Abhängigkeit
von der Anwendung und können
beispielsweise 1°C
bis 60°C
betragen. Üblicherweise
betragen sie etwa 37°C.
Die Temperatursteuermittel können
einen Wassermantel ausgleichen oder jede andere geeignete Anordnung.
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Wie
oben erklärt,
kann eine Vorrichtung der oben beschriebenen Art mit einem Fermenter
für Zellen gekoppelt
sein. Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher eine Bioreaktoranlage
vorgesehen, die einen Fermentationsbehälter (13), der geeignet
ist, Zellen in flüssigem
Medium zu enthalten, und eine Vorrichtung (1) aufweist,
wie sie oben beschrieben ist, wobei die Vorrichtung so mit dem Fermentationsbehälter gekoppelt
ist, daß Zellen
oder eine Population von Zellen in dem flüssigen Medium von dem flüssigen Medium
abgeschieden und zu dem Fermentationsbehälter zurückgeführt werden können.
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Der
Fermentationsbehälter
kann jeden geeigneten Suspensionsaufbau haben (wie ein Rührkessel oder
Druckluftgärbehälter). Mehr
als eine Absetzvorrichtung können
auf parallele Weise verbunden sein (oder sogar in Reihe, wenn verschiedene
Absetzkriterien nacheinander angewendet werden sollen).
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Der
Fermenter kann zum Züchten
von Säugetierzellen
verwendet werden, die genetisch modifiziert, immortalisiert oder
anderweitig modifiziert oder unmodifiziert sind. Die Erfindung ist
insbesondere auf die kontinuierliche Perfusionsfermentation von
beispielsweise monoklonalen, Antikörper-absondernden Hybridomzellen
anwendbar.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Abscheiden von Säugetierzellen
aus einer Zellenüberstandsflüssigkeit
unter sterilen oder aseptischen Bedingungen vorgesehen, wobei das
Verfahren die Verwendung einer Vorrichtung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung
enthält.
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Bevorzugte
Merkmale jedes Aspekts der Erfindung treffen auch für jeden
anderen Aspekt, mutatis mutandis, zu.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung werden nun mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen,
in der folgenden detaillierten Beschreibung und den Beispielen ausgeführt. Die
Zeichnungen zeigen:
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1 eine vertikale Schnittansicht
durch eine Abscheidevorrichtung gemäß der Erfindung;
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2 schematisch die Befestigung
der Abscheidevorrichtung gemäß 1 an einem 25 dm3 Fermenter;
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3 die Variation der gesamten
und lebensfähigen
Zellenanzahl, Prozent Lebensfähigkeit
und Perfusionsgeschwindigkeit mit der Zeit im Verlaufe des Experiments
gemäß Beispiel
1; und
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4 die Variation der gesamten
und lebensfähigen
Zellenanzahl, Prozent Lebensfähigkeit
und Perfusionsgeschwindigkeit mit der Zeit im Verlauf des Experiments
gemäß Beispiel
2.
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Die
allgemeine Anordnung einer Abscheidevorrichtung gemäß 1 gemäß der Erfindung
ist in 1 gezeigt. Die
Vorrichtung 1 enthält
eine Reihe von Platten 3, die zusammengeschweißt sind,
um einen starren Stapel zu bilden, der in eine rechteckige Kammer 5 eingesetzt
ist, die um 30° zu
der Vertikalen geneigt ist. Die rechteckige Kammer 5 ist
ein Kastenabschnitt einer Größe, um die
Standardplatten mit minimalen Zwischenräumen aufzunehmen. Die gestapelten
Platten 3 sind durch vier Anschläge 7 innerhalb des
Kastenabschnitts gehalten. Der Kastenabschnitt der Kammer 5 ist
zu einer schrägen
Bodenkammer 9 gezogen. Alle Winkel der Schräge verlaufen
um 30° zu
der Vertikalen, wodurch der Neigungswinkel der gestapelten Platten
nachgeahmt wird. Die schräge
Bodenkammer 9 endet in einem 1/2" (1,27cm) OD-Rohr mit einem TRI-CLAMPTM-Verbinder 11; dies ermöglicht eine
Sanitärverbindung
zur Rückkehr
von rezirkulierten und abgesetzten Materialien. Ein Einlaß 13 zu
der Vorrichtung befindet sich in der Bodenkammer 9 und
verbindet die Vorrichtung 1 mit der Fermenterseite einer
Rezirkulationsschleife. Der Einlaß 13 ist abgewinkelt,
um die Rezirkulationsflüssigkeitsströmungsbahn
durch die Bodenkammer zu dem Auslaßverbinder 11 zu richten.
Da die Absetzbewegung durch Konvektionsströme gestört werden kann, ist die Vorrichtung 1 mit
einer Wasserhülle 15 versehen,
die aus einem Rohr eines größeren Querschnitts
als die rechteckige Kammer 5 besteht. Ein Übergangsstück 17 nimmt den
Auslaß des
rechteckigen Kastenabschnitts zu der runden Hülle auf. Das Übergangsstück 17 ist
mit einem 6" (15,27cm)
TRI-CLAMP-Verbinder versehen, um die Verbindung mit einer Kopfplatte 19 zu
ermöglichen,
die ebenfalls mit TRI-CLAMP-Verbindungen versehen ist. Die Kopfplatte 19 hat
ein Auslaßrohr
(1/2" oder 1,27cm OD) 21 mit
einem TRI-CLAMP-Verbinder zum Abziehen der Überstandsflüssigkeit, aus der die Zellen
abgesetzt wurden. Das Auslaßrohr 21 kann
mit jedem geeigneten sterilen Sammeltank verbunden werden. Die Wasserhülle 15 ist
mit Schlauchanschlüssen 23 versehen,
um die Verbindung der Hülle
mit einem Thermozirkulator zu erleichtern, der die Temperatursteuerung
der Absetzvorrichtung ermöglicht.
Die Vorrichtung 11 ist mit drei Beinen versehen, zwei feststehenden 25 und
mit einem 27, das sowohl einstellbar als auch entfernbar ist.
Das einstellbare Bein 27 ermöglich die Änderung des Neigungswinkels
der Vorrichtung 1, wenn dies erforderlich sein sollte.
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Die
Vorrichtung 1 ist vollständig aus 316L rostfreiem Stahl
konstruiert. Sie kann von jedem Ingenieurbetrieb hergestellt werden,
der für
die Herstellung von kleinen rostfreien Stahlbehältern hoher Qualität geeignet ist,
die in der biologischen oder pharmazeutischen Industrie verwendet
werden. Das Schweißen
sollte in einem hohen Standard durchgeführt werden, wobei alle Schweißnähte, die
zu der Zellensuspension hin liegen, nachbearbeitet und abgeschliffen
sein sollten. Die Platten sollten vor dem Zusammenschweißen in einem
Stapel spiegelpoliert sein und es ist darauf zu achten, daß keine
Kratzer oder Beschädigungen
der fertigen Oberfläche während der
Konstruktion auftreten. Der Rest der Innenfläche des Behälters sollte elektropoliert
sein, um eine glatte Oberfläche
zu erhalten.
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Wie
schematisch in 2 angedeutet
ist, sollte eine Kultur von Säugetierzellen
in einen Fermenter 31 einer geeigneten Größe, beispielsweise
10 bis 30dm3 Arbeitsvolumen, eingeimpft werden. Der Fermenter 31 sollte
in der Lage sein, gelöste
Sauerstofflevel, pH, Temperaturüberdruck
und Mischgeschwindigkeit zu steuern. Der Fermenter 31 sollte
zu einem kontinuierlichen Betrieb mit einer Beschickung von frischem
Medium zugeführt
durch den Einlaß 33,
in der Lage sein, um den Abzug von ausgebeutetem Produkt, das Medium
enthält, über die
Absetzeinrichtung an Auslässen 35 auszugleichen.
Der Fermenter 31 sollte anfänglich wie in einem Batch-Modus
betätigt
werden, bis die Zellen in mittellogarythmischer Wachstumsphase sind.
Der Fermenter sollte mit einem kleinen Überdruck von beispielsweise
0,2 BarG betrieben werden. An diesem Punkt sollte eine äußere Schleife 37, 39,
die die Abscheidevorrichtung 1 enthält mit der Wasserhülle 15,
die zuvor auf dieselbe Temperatur wie der Fermenter gebracht ist,
langsam von dem Fermenter gefüllt
werden, indem die Abscheidevorrichtung 1 am Ventil 41 ventiliert
wird. Da der Fermenter 31 unter Druck steht, füllt der
Fermenterinhalt die Abscheidevorrichtung 1. Der Fermenter 31 sollte
auf seinen Arbeitslevel mit frischem Medium aus einem Vorratstank
für frisches
Medium während
des Füllprozesses
aufgefüllt
werden.
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Die
Rezirkulationsschleife 37, 39, die eine Rezirkulationspumpe 43 enthält, sollte
gestartet werden, um einen kontinuierlichen Durchgang von Zellen
von dem Fermenter durch die Absetzrezirkulations/Rückführkammer
zu gewährleisten.
Das System sollte dann über
eine Zeitspanne von 1 bis 18 Stunden ins Gleichgewicht gebracht
werden. Dies gewährleistet,
daß der
Zelleninhalt, der in die Absatzvorrichtung gezogen wird, sich gesetzt
hat. Die Durchspülung
kann nun eingeleitet werden, in dem eine Entnahmepumpe 45 gestartet
wird. Anfänglich
sollt die Perfusionsrate nicht größer als 1/2 vvd sein und kann
dann, entsprechend dem Zellenwachstum und der Verwendung des Mediums,
erhöht
werden, bis die Grenzen der Fähigkeit
des Fermenters erreicht sind, Zellen zu unterstützen (üblicherweise O2 Übergangsgeschwindigkeit),
oder die Fähigkeit
der Absetzvorrichtung, Zellen zu halten.
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Das
Fermenter/Absetzsystem kann dann über lange Zeitspannen betätigt werden,
vorausgesetzt, daß eine
konstante Zufuhr von frischem Medium und ein konstantes Abziehen
aufrechterhalten werden können. Wenn
die Rezinkulationspumpe 43 mit einer feststehenden Geschwindigkeit
läuft,
kann die Entnahmepumpe 45 mit erhöhter Geschwindigkeit betätigt werden,
und die Strömung
von dem Fermenter zu der Absetzvorrichtung wird automatisch kompensiert,
da das gesamte System von dem Fermenter unter Druck gesetzt ist.
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Alternativ
kann die Pumpe nacheinander über
eine Zeitvorrichtung ein- und ausgeschaltet werden, so daß dann,
wenn die Pumpe eingeschaltet ist, Zellensuspension über die
Absetzplatten gezogen wird, wobei das Absetzen in den normalen Gegenstrommodus
auftritt, wie oben. Wenn die Pumpe abgeschaltet ist, tritt Absetzen
auf, während
das umgebende Fluid in Ruhe ist. Dies ermöglicht es auch, daß solche
Zellen, die bereits abgesetzt sind, an den Absetzplatten ungehindert
durch den Aufwärtsstrom
der Flüssigkeit
nach unten gleichen, wie dies während
des normalen Gegenstrombetriebs auftreten kann. Diese Technik kann
die Geschwindigkeit verbessern, mit der Zellen zu dem Fermenter
zurückkehren,
womit die Zellenlebensfähigkeit
und die Produktivität
verbessert sind.
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Eine
weitere Verbesserung dieser Lösung
besteht darin, periodisch (beispielsweise für eine Minute alle fünf Minuten)
die Strömung
der Pumpe 45 umzukehren, wodurch kurze Zeitespannen einer
Gleichströmungssetzung
hervorgerufen werden, was ferner dabei hilft, eine schnellere Rückkehr solcher
Zellen zu dem Fermenter zu gewährleisten,
die bereits durch die gleichgerichtete Bewegung der Flüssigkeit über ihnen
abgesetzt sind.
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Die
Vorrichtung kann auch in vielen alternativen Modi für eine Vielzahl
von Prozeduren verwendet werden einschließlich:
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- 1. Einstufenklärung von Partikel/Zellen enthaltenden
Flüssigkeiten,
bei der abgesetzte Partikel/Zellen nicht rezirkuliert werden, sondern
die Partikel/Zellen enthaltende Flüssigkeit am Boden der Absetzvorrichtung eintritt
und ein von Partikel/Zellen befreiter Strom abgezogen wird, wobei
die Partikel/Zellen in dem Boden der Absetzvorrichtung zurückgehalten
werden (entweder zur intermittierenden Entfernung oder am Ende des
Prozesses in einem Sammelbehälter
zur weiteren Bearbeitung oder Abtöten).
- 2. Die Verwendung von zwei oder mehr Absetzvorrichtungen in
Reihe, die erste zum Halten von lebensfähigen Zellen zur Rückkehr in
einen Fermenter. Die zweite oder weitere größere Absetzvorrichtung dient
der Aufnahme von allen Zellen vor der weiteren stromabwärtigen Verarbeitung.
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Weitere
Ausführungsformen
enthalten Vorrichtungen 1 mit fünfzehn Platten und 10 Platten.
Der Hauptkörper
der Absetzvorrichtung kann in beiden Fällen identisch sein, wobei
sich nur der Aufbau des Einsatzes unterscheidet. Der Zehnplatteneinsatz
kann somit identisch in jeder Hinsicht mit dem Fünfzehnplatteneinsatz sein mit
der Ausnahme, daß fünf Platten
durch einen wasserdichten Kasten (ebenfalls spiegelpoliert) ersetzt sind.
Die Plattenlänge
für den
Zehnplatteneinsatz ist 10 cm.
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Beispiel 1 – Wachstum
von Hybridomzellen
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Mäusehybridomzellen
von ES4 bezeichneter Zelllinie wurden gezüchtet, um ausreichend Zellen
zu erhalten, um einen 25 dm3 Druckluftfermenter
(Chemap Zürich)
zu inokulieren. Diese Zellen wurden verschmolzen aus Mäusemilzzellen
und Mäusemyelomzellen
auf herkömmliche
Art, die auf dem Gebiet bekannt ist, und stellten eine immortale
Zelllinie dar, die in Kultur Antikörper gegen Antigene der menschlichen
Blutgruppe B produzieren.
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Das
Inokulum wurde vorbereitet, indem eine Ampulle mit etwa 107 gefrorenen Zellen aufgetaut und in Fläschchen
bei 37°C
in einem Gemisch von DMEM/F12 (Gibco) + 5% fötales Kalbserum gezüchtet wurden. Die
Kultur wurde nacheinander in Fläschchen
ausgeweitet um ausreichend Zellen zu erhalten, um einen 1 dm3 Wirbelbehälter mit 105 Zellen/ml
in dem obigen Medium zu impfen. Ein weiteres Zellenwachstum in dem
1 dm3 Spinner wurde verwendet, um einen
weiteren Wirbelbehälter
mit 4 dm3 Arbeitsvolumen zu impfen. Diese
4 dm3 Spinnerkultur wurde verwendet, um den 25 dm3 Fermenter
zu impfen.
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Die
anfängliche
Zelldichte in dem Fermenter (Tag 0) betrug 0,7 ×105 lebende
Zellen/ml. Der Fermenter wurde gesteuert mit einer Temperatur von
37°C, pH
bei 7.2 und gelöstem
Sauerstoff (dO) bei 50% Luftsättigung.
Die Gasdurchblasgeschwindigkeit wurde auf 20dm3 Gas
pro Stunde eingestellt. Gas, das Luft mit Sauerstoff, Kohlendioxid
und Stickstoff enthielt, wurde in den gesamten Gasstrom eingegeben,
um die eingestellten Steuerventile für pH und dO zu halten. Der
Lauf wurde mit SAL024 bezeichnet.
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Das
Medium war wieder DMEM/F12 mit 5% FCS. Das Arbeitsvolumen des Fermenters
betrug 21 dm3. Die Zellen durften frei im
Batchmodus über
drei Tage wachsen, bis die Anzahl der lebensfähigen Zellen 5×105/ml mit einer Lebensfähigkeit von 86% erreichte.
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Eine
zuvor autoklavierte Abscheidevorrichtung 1 (Absetzen) wurde
an dem Fermenter angebracht, wie in 2 gezeigt,
mit Silikonschläuchen
von dem Rezirkulationsauslaß und
-einlaß zu
den Nadelverbindern (Chemap) zur sterilen Verbindung mit dem Fermenter.
Die Absetzhülle
wurde gefüllt
und auf 37°C
gebracht, um mit der Fermentertemperatur übereinzustimmen. Der Absetzer
wurde langsam mit dem Inhalt des Fermenters gefüllt, indem eingeschlossene
Luft aus dem Absetzer ventiliert wurde. Das Volumen des Kulturverlustes aus
dem Fermenter in den Absetzer oder automatisch durch ein Mediumbeschickungssystem
mit frischem Medium (DMEM/F12 5% FCS) ersetzt. Die Rezirkulationspumpe 43 wurde
gestartet, und das gesamte System konnte über 2 Stunden im Gleichgewicht
sein, um ein Absetzen und Zurückkehren
der in den Absetzer eingeführten
Zellen zu ermöglichen.
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Geklärte Flüssigkeit
wurde aus dem Absetzer mit einer anfänglichen Geschwindigkeit von
10 dm pro Tag abgezogen (die Perfusionsgeschwindigkeit als Volumenentzug
pro Volumen des Fermenters pro Tag). Dies wurde progressiv über eine
Zeitspanne von 9 Tagen auf ein Maximum von 50 dm3 pro
Tag erhöht.
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Die
lebensfähige
Zellmasse stieg auf etwa 5×106 Zellen/ml nach 12 Tagen an (stimmt mit
50 dm3/Tag Perfusionsgeschwindigkeit überein).
Dies blieb für
weitere 10 Tage relativ konstant. Die gesamte Zellenanzahl (lebensfähige + tote
Zellen) stieg vom Tag 12 bis zum Tag 15 scharf an und danach weniger
scharf.
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Eine
konstante lebensfähige
Zellenmasse wurde demnach mit ansteigender Gesamtzellenmasse und abnehmender
prozentualen Lebensfähigkeit
erhalten. Dies wurde bis zum Tag 22 beibehalten, als Probleme mit
der Steuerung der Fermentereinstellpunkte eine Abnahme der lebensfähigen Zellenpopulation
mit sich brachten und danach eine Beendigung des Durchlaufs. Die
Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
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Eine
Gesamtheit von 935 dm3 Medium wurde benutzt.
Die anfänglichen
100 dm3 waren DMEM/F12 5% FCS, und das folgende
Medium war DMEM/F12 2% FCS. Dies führte zu einer Gesamtheit von
34,9 g Antikörpern. Über das
Experiment hielt die Absetzvorrichtung 95 bis 99% der Zellen. Typischerweise
gab es 0.5 × 105 lebensfähige
Zellen mit 2 × 105 toten Zellen in der abgesetzten Entnahme.
Dies stellt ein Halten von 99% lebensfähigen Zellen und 96% toten
Zellen dar.
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Beispiel 2
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Alle
Betriebsbedingungen (mit Ausnahme der Perfusionsrate) des Beispiels
1 wurden wiederholt; die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Die Laufnummer war SAL 027.
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Beispiel 3 – Effizienz
der Absetzvorrichtung für
den Rückstand
von lebensfähigen
und toten Zellen
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Eine
Fermentation wurde durchgeführt
wie im Beispiel 2, jedoch mit folgenden Modifikationen:
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- 1. Die verwendete Zelllinie war BIRMA 1, ein
Mäusehybridom,
das Antikörper
absondert, die spezifisch für die
Blutgruppensubstanz A sind.
- 2. 9 Tage nach der Inokulation betrug die Perfusionsmenge 50
dm3 pro Tag und die Zellenpopulation in
dem Fermenter hatte sich bei 3.76 × 106 lebensfähige und
5.08 × 106 total stabilisiert (total ist die Summe
von lebensfähigen
und toten Zellen). In dem Entnahmestrom befanden sich 0,3 × 105 lebensfähige
und 2 × 105 totale Zellen, was 99% Retention lebensfähiger Zellen
und 96% Retention der totalen Zellen bedeutet.
- 3. Die Perfusionsmenge wurde stufenweise erhöht, um die Zurückhalteeffizienz
der Absetzvorrichtung zu untersuchen (siehe Tabelle unten für die Ergebnisse).
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Aus
den obigen Ergebnissen ist zu ersehen, daß kein wirksamer Anstieg im
Verlust von Zellen pro ml des Entnahmestroms bis zu einer Perfusionsmenge
von 4,38 auftrat. Für
diese Fermentation würde
der Gesamtverlust von Zellen von dem Fermenter über die Absetzvorrichtung bei
einer Perfusionsmenge von 3,62 WD 3,27×1010 sein.
Bei dem gesamten Fermenterinhalt von 1,59×1011 ist
der Gesamtverlust von Zellen aus dem Fermenter 20%. Der Fermenter
ist durch Zellenwachstum in der Lage, diesen Verlust an Zellen zu
ersetzen.
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Bei
einer Perfusionsmenge von 4,38 WD gibt es keinen signifikanten Anstieg
in dem prozentualen Verlust von Zellen pro ml des abgesetzten Materials
aus dem Fermenter. Jedoch steigt der Gesamtzellenverlust pro Tag
infolge der erhöhten
Perfusionsmenge, die 3,8 × 1010 beträgt
an. Die Gesamtzahl von Zellen in dem Fermenter betrug 1,06 × 1011, was einem Gesamtverlust von Zellen aus
dem Fermenter von 36% darstellt. Wegen des Abfalls der Zahl der
lebensfähigen
Zellen und der Gesamtzellen in dem Fermenter war zu schließen, daß der Fermenter
nicht in der Geschwindigkeit Zellen ersetzen konnte, in der sie
verloren gingen.
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Die
Perfusionsmenge wurde auf 6,03 WD erhöht, und nach einer Stunde hatte
sich die Anzahl der lebensfähigen
Zellen und der gesamten Zellen in dem Entnahmestrom erhöht, was
einen Verlust von 6,6 × 1010 pro Tag bedeutet bei einem Fermenter mit
4,87 × 1010 gesamte Zellen. Dies zeigte an, daß bei dieser
Menge ein Auswaschen gesamter Zellen schnell erreicht würde. Ein
weiterer Anstieg des Zellenverlustes wurde bei einer Perfusionsmenge
von 8,1 WD beobachtet.
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Aus
diesen Ergebnissen für
diese Größe der Absetzvorrichtung,
die mit einem 21 dm3 Druckluftfermenter
verwendet wurde, ist die maximale Perfusionsmenge 76 dm3 pro
Tag (oder 3,62 WD). Experimente dieser Art können verwendet werden, um eine
optimale Konfiguration der Absetzvorrichtungsgröße gegenüber der erforderlichen Perfusionsmenge
abzuleiten.
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Beispiel 4 – Durchbruchprüfung nicht-lebensfähiger Zellen
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Eine
Fermentation wie im Beispiel 3 wurde durchgeführt, jedoch mit folgenden Modifikationen:
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- 1. Die verwendete Zelllinie war NELP 3, ein
menschliches Heterohybridom, das Antikörper absondert, die spezifisch
für die
Blutgruppensubstanz RhD sind.
- 2. Die Absetzvorrichtung wurde mit einem Einsatz von 15 Platten
versehen, wobei jede Platte eine Länge und eine Breite von 10
cm hatten. Mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit von 1,1 cm/h.
für nicht-lebensfähige Zellen
wurde von einer 10 cm Platte erwartet, gemäß der modifizierten Batt-Gleichung, daß sie einen
Zellendurchbruch über
21,5 dm3 Tag Austauschgeschwindigkeit zeigt,
d.h. annähernd
1 WD.
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Die
Perfusionsmenge wurde stufenweise erhöht, um die Rückhalteeffizienz
und den Durchbruchlevel der Absetzvorrichtung zu untersuchen (siehe
Resultate der nachfolgenden Tabelle).
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Aus
den obigen Ergebnissen ist zu ersehen, daß kein wirksamer Anstieg des
Verlustes von Zellen pro ml des Entnahmestroms bis zu einer Perfusionsmenge
von 1,57 WD auftrat.
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Oberhalb
dieser Perfusionsmenge konnte eine ansteigende Konzentration nicht-lebensfähiger Zellen in
dem Entnahmestrom beobachtet werden, mit einer abnehmenden Gesamtzellenrückhalteeffizienz
auf 79,6 % bei 2,38 WD. Die Retention lebensfähiger Zellen nahm ebenfalls
ab, aber in einem geringeren Maß.
Dies zeigte an, daß die
Absetzvorrichtung zur Leistung in der Lage war, wie für nicht-lebensfähige Zellen
errechnet, mit einer Gesamtzellenretention unter 21 dm3 Tag,
und einem Durchbruch von kleineren, nicht-lebensfähigen Zellen
oberhalb dieser Strömungsmenge.
