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Diese
Erfindung bezieht sich auf DNS-Konstrukte zum Inserieren heterologer
Gensequenzen in ein Wirtsgenom, um die Expression des heterologen
Gens zu erzielen, auf Verfahren zum Inserieren heterologer Gensequenzen
in ein Wirtsgenom und auf nicht-menschliche Organismen, die modifizierte
Wirtsgenome tragen.
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Gemäß einem
besonderen Aspekt bezieht sich diese Erfindung auf Konstrukte zum
Inserieren eines heterologen Gens in ein ein endogenes Gen in einem
Wirtsgenom, so dass das heterologe Gen an Stelle oder zusätzlich zu
dem endogenen Gen exprimiert wird. In einem zweiten besonderen Aspekt
bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren, um eine heterologe Gensequenz
(Transgen) funktionell in ein bestimmtes Gen eines Wirtsgenoms zu
integrieren, um die Expression des Transgens eng mit den endogenen
transkriptorischen und post-transkriptorischen
regulatorischen Elementen zu koppeln, auf Konstrukte zur Verwendung
bei diesen Verfahren und auf genetisch modifizierte Zellen und transgene
nicht-menschliche Tiere, die mit solchen Konstrukten erzeugt werden,
und ihre Abkömmlinge.
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Gentechnik
schließt
die Fusion unterschiedlicher Gensequenzen ein. In vielen Fällen wird
dieses durchgeführt
mit der Absicht, eine heterologe Gensequenz in einer Art zu exprimieren,
die identisch ist zu oder zum Teil das Expressionsmuster eines anderen
Gens reflektiert. Um die gewünschte
Expressionsrate, -verteilung und/oder die zeitliche Abfolge der
Expression der Sequenz, die exprimiert wird, zu erzielen, werden
regulatorische Sequenzen des Gens, das kopiert wird, mit den Sequenzen
des Gens verschmolzen, das exprimiert werden soll, um ein Expressionskonstrukt
zu erzeugen. In vielen Anwendungen, die höhere eukaryotische Zellen involvieren,
wie zum Beispiel die Auswahl bestimmter Stammzellen oder die Herstellung
heterologer Proteine in transgenen Tieren, ist es jedoch außerordentlich
schwierig, ein Expressionskonstrukt herzustellen, dessen Muster
und Rate der Expression jene des Gens, das kopiert wird, angemessen
nachahmt.
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Es
ist bekannt, heterologe Gene in Säugerzellen, einschließlich Stammzellen,
transgenen Tieren und in vitro aufrechterhaltenen Zelllinien einzuführen. Trotz
spezifischer Gestaltung stellen vorhandene Expressionskonstrukte,
wenn sie in das Wirtsgenom integriert werden, jedoch selten die
gewünschte
Rate und Verteilung (sowohl räumlich
als auch zeitlich) der Genexpression bereit. Von Expressionskonstrukten
ist bekannt, dass sie das Expressionsprofil eines endogenen Gens
versuchen nachzuahmen, indem sie bekannte regulatorische Elemente
des endogenen Gens einschließen.
Der Erfolg mit diesen Konstrukten ist jedoch gering, zum Teil wegen
dem funktionellen Detail der endogenen Genstruktur, einschließlich der
Platzierung und Identität
solcher Elemente und dem Beitrag, den jeder Bestandteil zu der Regulation
der Genexpression beiträgt, zum
größten Teil
bleibt die Ursache jedoch unbekannt. Andere Probleme sind verbunden
mit zufällig
integrierten Expressionskonstrukten, einschließlich Positionswirkungen der
Integrationstelle und zufälliger
Mutation endogener Genexpression.
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Weiterhin,
um regulatorische Elemente in endogenen Genen zu positionieren und
zu definieren, oftmals mit einigem Abstand zu dem transkribierten
Bereich des Gens, verlangt oftmals mühselige Arbeit. Das distale
Positionieren dieser Elemente ist oftmals auch wichtig für ihre Funktion
und kann in transgenen Expressionskonstrukten schwierig zu reproduzieren
sein.
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Weiterhin
gibt es nach dem Identifizieren und Einbauen der endogenen regulatorischen
Elemente in heterologe Genexpressionskonstrukte nur eine geringe
Gewissheit, dass irgendein bestimmtes transgenes Expressionskonstrukt
korrekt funktionieren wird, wenn es einmal per Zufall in das Genom
eingeführt
ist.
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Frühe Ansätze, heterologe
Proteine in transgenen Tieren herzustellen, konzentrierten sich
hauptsächlich
auf die Verwendung transgener Konstrukte, die Promoterbereiche umfassen,
die abgeleitet wurden von einem Gen, das mit cDNS kodierenden Sequenzen
eines anderen Gens verschmolzen war. Zum größten Teil funktionieren die
Fusionskonstrukte schlecht, wenn überhaupt, und die erhaltene
Expressionsrate ist weit geringer als jene des endogenen Gens.
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Dies
steht im Gegensatz zu intakten Genen, wie z. B. dem Schafmolkeprotein
Betalactoglobulin (BLG). Hochexpression des kodierten Proteins wird
erhalten in transgenen Mäusen,
die ein BLG-Gen der vollen Länge,
vollständig
mit allen Introns und angemessenen Längen der 5'- und 3'-untranskribierten Bereiche beherbergen
(Simons et al., Nature 328, 530–532,
1987).
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Versuche
wurden unternommen bei verschiedenen Gruppen, die effiziente Expression
solcher genomischer Transgene nutzbar zu machen, um die Expression
heterologer kodierender Sequenzen in transgenen Tieren zu lenken.
Tandemgenkonstrukte werden normalerweise nicht in Sängersystemen
exprimiert, da nur die erste (stromaufwärts) kodierende Sequenz translatiert
wird. Aus diesem Grund waren die meisten Forscher gezwungen, in
den 5'-untranslatierten
Bereich (5'UTR)
des genomischen Gens eine cDNS, die das heterologe Protein von Interesse
kodiert, zu verschmelzen.
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Tomasetto
et al. (Mol. Endocrinol. 3, 1579–1584, 1989) verschmolzen eine
pS2-cDNS in den 5'UTR des
Gens des sauren Molkenproteins (WAP). Obwohl eine gewisse Expression
beobachtet wurde, war die Produktionsrate extrem niedrig. Ähnlich erzeugten
Simons et al. (Bio/Technology 6, 179–183, 1988) Konstrukte, bei
denen cDNSs, die den menschlichen Faktor IX oder alpha-1 Antitrypsin
kodieren, in den 5'UTR
von Schaf-BLG eingeführt
worden waren. Sowohl in transgenen Mäusen als auch in transgenen
Schafen scheiterten diese Konstrukte, ordentlich zu funktionieren,
wobei nur geringe Expressionsraten erhalten wurden (Clark et al.,
Bio/Technology 7, 487-492, 1989).
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Obwohl
einige Berichte zeigen, dass die einfache Insertion von Intronsequenzen
in Expressionskonstrukte die Expression erhöhen kann (z. B. Brinster et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 836–840, 1988), bleibt die Expressionsrate
niedrig im Vergleich zu der des endogenen Gens, was nahelegt, dass
Intronsequenzen per se nicht ausreichend sind, um eine Genhochexpression
in einem transgenen Zusammenhang zu ermöglichen. Dies wird bestätigt durch
die Ergebnisse von Whitelaw et al. (Transgenic Res. 1, 3–13, 1991),
die die Introns aus dem BLG-Gen entfernten und dann ein einzelnes
Intron zurückgaben.
Das intronlose Gen war nur schwach aktiv und die Anwesenheit eines
einzelnen Introns war nicht ausreichend, die transkriptorische Effizienz
des BLG-Gens in transgenen Mäusen
wiederherzustellen.
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Es
wurde argumentiert, dass die Gen-Gesamtstruktur, einschließlich der
relativen Positionen der Introns und Exons, kritisch wichtig ist
für die
Transgenfunktion. Diese Behauptung wird vollständig gestützt durch die Erkenntnis, dass
das 5'-Ende des
BLG-Gens, wenn es mit einer genomischen Kopie des menschlichen alpha-1
Antitrypsingens verschmolzen ist, zu einer beständigen Hochexpression in transgenen
Tieren führt
(Archibald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5178–5182, 1990).
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In
der Praxis ist es jedoch oftmals schwierig, diese genomische Fusionstechnik
anzuwenden. Viele Gene, die von besonderem Interesse sind, sind
außerordentlich
groß (z.
B. das menschliche Faktor VIII-Gen ist über 100 Kilobasen lang) und
die Erzeugung von Fusionskonstrukten und ihre Einführung in
transgene Säuger
(einschließlich
Vieh) sind außerordentlich
schwierig.
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Eine
Alternative, Expressionskonstrukte in vitro zu bilden (durch Kopplung
regulatorischer Elemente eines oder zahlreicher Gens/e mit der zu
exprimierenden heterologen Gensequenz) ist, den „Genfallen”-Ansatz zu verwenden. Regulatorische
Elemente, die die Expression von Genfallen-Expressionskonstrukten
kontrollieren, werden durch Inserieren der heterologen Sequenz,
die exprimiert werden soll, in ein Gen in dem Genom des Wirts bereitgestellt.
Sequenzen des zu exprimierenden Gens werden dabei eng mit den regulatorischen
Elementen des endogenen Gens gekoppelt.
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Bei
weitem die große
Mehrheit der Vektoren vom Genfallentyp werden für die zufällige Integration oder das
zufällige
Einschließen
des Wirtsgens verwendet, mit dem Nachteil, dass es dabei keine Kontrolle über die Integrationsstelle
oder die Erzeugung endogener Gen/Transgen-Fusionsprodukte gibt.
Ein Genfallenvektor, pGT4.5, ist bekannt aus Genes & Development 6:
903–918
von Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992.
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Eine
Hauptbeschränkung
bei der Gestaltung und funktionellen Verwendung aller „Genfallen”- und „genomischen
Transgen”-Expressionskonstrukte,
die im Stand der Technik bekannt sind, ist der Mechanismus der Translationsinitiation
des Transgens. Die Translation der meisten mRNSs wird durch einen
Abtastmechanismus initiiert, bei dem ein Ribosomenkomplex (bezeichnet
als 43S) an das 5'-Ende
von mRNS mit Kappe bindet und sich entlang der mRNS so lange bewegt,
bis ein geeignet platziertes AUG-Startcodon entdeckt wird. Anschließend stößt eine
zweite Ribosomenuntereinheit (bezeichnet als 60S) zu dem Komplex
hinzu und die Proteinsynthese beginnt.
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1988
zeigten Pettetier und Sonenberg (Nature, 334: 320–325), dass
verschiedene Picornavirus-mRNSs durch einen ungewöhnlichen
Mechanismus des „internen
Ribosomenbindens” translatiert
werden und dass diese besonderen mRNSs spezifische Sequenzen innerhalb
der mRNS enthielten, die einem Ribosom ermöglichten, zu binden und die
Translation zu initiie ren. Diese Sequenzen wurden als „Internal
Ribosome Entry Site” (IRES)
bezeichnet. Picornaviren infizieren menschliche Zellen, also zeigte
diese Arbeit, dass eukaryotische Ribosomen die IRES erkannten und
die Translation intern initiieren konnten, und zwar anders, als über einen
Kappen-abhängigen
Mechanismus.
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Ghattas
et al., (Molecular & Cellular
Biology, Bd. 11 Nr. 12, Dez. 1991, S. 5848–5859) beschreiben die Verwendung
einer internen Ribosomeneintrittsstelle beim Erhalten der Coexpression
von zwei Genen eines rekombinanten Provirus in kultivierten Zellen
und in Hühnchenembryonen.
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Wood
et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88, Sept. 1991, S. 8006–8010) beschreiben
die Verwendung einer internen Ribosomeneintrittsstelle, um die Expression
eines selektierbaren Markergens zu erhalten, das das stromabwärts gelegene
Gen eines bicistronischen Konstruktes in einer ausdifferenzierten
Zelllinie ist, in welcher das Konstrukt durch homologe Rekombination
eingeführt
worden war.
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Es
gibt jedoch gegenwärtig
kein wirksames Vorgehen, durch welches eine heterologe Gensequenz (Transgen),
die in eukaryotischen Zellen, insbesondere in menschlichen Stammzellen,
transgenen Tieren oder Zellen in Kultur exprimiert werden soll,
in das Genom einer Wirtszelle inseriert werden kann, um die Expression jenes
heterologen Gens zu erhalten, mit regulatorischen Elementen, die
die Expression eines zum endogenen Zielgens kontrollieren.
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Es
ist eine Aufgabe der Erfindung, ein DNS-Konstrukt bereitzustellen
und Verfahren für
seine Verwendung, die eine verbesserte Effizienz der heterologen
Genexpression in einer Wirtszelle ermöglichen. Die Bereitstellung
der heterologen Genexpression in einer gewünschten Rate ist ein weiteres
Ziel. Noch ein weiteres Ziel ist es, eine Expression bereitzustellen,
mit einem gewünschten
zeitlichen und/oder räumlichen
Profil während
des Lebens einer Wirtszelle oder -zellpopulation oder eines transgenen
nicht-menschlichen Organismus.
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Mit „heterologer
Genexpression” ist
gemeint, sowohl (1) die Expression eines Gens in einem Wirt, das zuvor
in jenem Wirt nicht exprimiert worden war, als auch (2) die Expression
eines Gens in einem Wirt gemäß einem
bestimmten Expressionsprofil, wobei das Gen zuvor in dem Wirt exprimiert
worden war, aber nicht gemäß dem bestimmten
Expressionsprofil.
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Um
Zweifel zu vermeiden, sollten alle Bezugnahmen auf embryonale Stamm(ES)-Zellen,
Organismen, transgene Tiere oder Säuger und Embryonen verstanden
werden, dass nur jene gemeint sind, die von einer nicht-menschlichen
Quelle stammen.
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Demgemäß wird in
einem ersten Aspekt der Erfindung ein Verfahren bereitgestellt,
eine ein heterologes Gen kodierende Sequenz in ein endogenes Zielgen
in ein eukaryotisches zelluläres
Wirtszellgenom zu inserieren und diese heterologe Gen kodierende
Sequenz zu exprimieren, durch Transformieren der Wirtszelle mit
einem Vektor, der ein DNS-Konstrukt enthält, dadurch gekennzeichnet,
dass die Wirtszelle ausgewählt
wird aus der Gruppe bestehend aus einer nicht-menschlichen embryonalen
Stammzelle und einem nicht-menschlichem befruchteten Ei, und dadurch,
dass das DNS-Konstrukt die folgende Sequenz umfasst:
5' X-A-P-B-Q-C-Y 3'
bei der
X
und Y im Wesentlichen homolog zu separaten Sequenzen des endogenen
Zielgens sind und in der gleichen jeweiligen Orientierung wie in
der endogenen Platzierung und eine ausreichende Länge haben,
um eine homologe Rekombination mit dem Wirtszellgenom zu durchlaufen,
um die A-P-B-Q-C-Sequenz in das Wirtszellgenom zu inserieren;
P
eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) ist;
Q die heterologe
Gen kodierende Sequenz ist; und
A, B und C getrennt voneinander
wahlweise Linkersequenzen sind
worin das Konstrukt die das
heterologe Gen kodierende Sequenz in der endogenen Zielsequenz inseriert,
so dass die Transkription der das heterologe Gen kodierenden Sequenz
durch die regulatorischen Elemente des Wirts für das endogene Zielgen gelenkt
wird.
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Es
wird bevorzugt, dass X und Y jeweils wenigstens 1000 Basenpaare
lang sind. Es wird jedoch geschätzt
werden, dass im Allgemeinen, während
eine wirksame homologe Rekombination in einigen Fällen mit X
und Y erzielt wird, die eher kürzere
Sequenzen haben, die Effizienz gesteigert werden wird mit zunehmender Länge der
Sequenzen. X und Y sind vorzugsweise wenigstens zu 95%, bevorzugter
wenigstens zu 98% und am meisten bevorzugt im Wesentlichen zu 100%
mit dem Wirt homolog.
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In
Ausführungsbeispielen
der Erfindung (i) bilden X und Y gemeinsam eine DNS-Sequenz, die
im Wesentlichen homolog ist mit einer einzelnen zusammenhängenden
DNS-Wirtssequenz, oder (ii) sind X und Y im Wesentlichen homolog
zu zwei getrennten Sequenzen desselben endogenen Wirtsgenorts und
in derselben jeweiligen Orientierung wie in dem endogenen Genort.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das DNS-Konstrukt Teil eines Vektors, der fähig ist, eine Wirtszelle zu
transformieren durch Inserieren des DNS-Konstrukt in die Wirtszell-DNS.
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P,
die IRES, befindet sich 5' zu
dem offenen Leserahmen der heterologen Gensequenz Q. Wo B fehlt, befindet
sich die IRES unmittelbar 5' zu
dem offenen Leserahmen des heterologen Gens.
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Die
Linkerbereiche A, B und C sind zusätzliche DNS-Sequenzen, die
wahlweise in dem DNS-Konstrukt vorhanden sind. Die Linkerbereiche
können
in das Konstrukt eingefügt
werden oder können
als ein Ergebnis der rekombinanten DNS-Techniken entstehen, die
verwendet werden, um das Konstrukt herzustellen. In einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung schließt
ein oder besteht der Linkerbereich A aus einem Spleißakzeptor.
Die Größe und Art
des Linkers B ist besonders ist wichtig, um eine optimale Verbindung
zwischen der IRES und dem heterologen Gen bereitzustellen (Cell,
Bd. 68, S. 119–131,
Januar 1992).
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Um
erfolgreiche Transformanten auszuwählen, die das heterologe Gen
exprimieren, ist es bequem, einen auswählbaren Marker, z. B. ein Antibiotikaresistenzgen
oder ein Hypoxanthin-Ribosyl-Transferase-Gen, in
das heterologe Gen einzuschließen.
Das Einschließen
eines selektierbaren Markers erhöht
die Wahrscheinlichkeit transfizierte Zellen mit der gewünschten
Transgenintegration zu selektieren, da die Expression des selektierbaren
Markers abhängig
ist von der funktionellen Integration in ein aktives Gen. Transgenintegrationen in
nicht transkribierten Bereichen des Genoms sind deswegen leicht
eliminiert.
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Wenn
ein erfindungsgemäßes Konstrukt
verwendet wird, um ein Wirtsgenom zu transformieren, resultiert
die homologe Rekombination mit der Wirts-DNS in der Insertion des
Konstrukts in ein Wirtsgen. Die Transkription des heterologen Gens
befindet sich dann unter der Kontrolle der im Zusammenhang mit dem
Wirtsgen stehenden regulatorischen Elemente. Die Translation der
das heterologe Gen kodierenden Sequenz wird dann durch die Anwesenheit
der IRES in 5'-Position
zum offenen Leserahmen des heterologen Gens ermöglicht. Dies re sultiert in
einer regulierten Expression des heterologen Gens mit einer bemerkenswert
höheren Effizienz
als unter bis jetzt bekannten und verwendeten Techniken, um eine
heterologe Genexpression zu erhalten.
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Bei
der Verwendung werden ein heterologes Gen und ein endogenes Gen
mit einem bestimmten Muster und/oder Rate der Expression in einer
Wirtszelle ausgewählt.
Ein DNS-Konstrukt wird erzeugt, das X und Y enthält, die im Wesentlichen homolog
zu Teilen des endogenen Gens oder zu flankierenden Bereichen des endogenen
Gens sind. Das DNS-Konstrukt wird dann die Insertion des heterologen
Gens plus IRES in jenes endogene Gen zum Ziel nehmen, so dass die
Transkription des heterologen Gens von den regulatorischen Elementen
des Wirts für
jenes endogene Gen gelenkt wird. Die Translation des reifen heterologen
Genprodukts wird ermöglicht,
indem die IRES in das DNS-Konstrukt eingeschlossen ist und neu,
gemeinsam mit dem heterologen Gen, inseriert wird.
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Die
Verwendung der IRES vermittelten Translationinitiation in Zielvektoren
vom Genfallentyp gemäß der Erfindung
stellt einen bemerkenswerten Vorteil über kürzlich beschriebene Genfallen
und auf Genfallen gerichtete Vektoren bereit, dadurch, dass die
funktionelle Integration des Transgens in den gewünschten
Bereich, in dem das endogene Gen transkribiert wird, kein Fusionsprotein
erzeugt und nicht notwendigerweise die endogene Genexpression zu
unterbrechen braucht.
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Der
Octamer bindende Transkriptionsfaktor 4 ist ein Mitglied der POU-Transkriptionsfaktorenfamilie (zusammenfassend
berichtet von Schöler,
1991). Die Oct4-Transkription
wird aktiviert zwischen dem 4- und 8-Zellstadium in dem heranwachsenden
Mausembryo und sie wird hochgradig exprimiert in der sich ausdehnenden
Blastocyste und dann in den pluripotenten Zellen der inneren Zellmasse.
Die Transkription wird herunterreguliert, sobald sich das primitive
Ektoderm differenziert, um Mesoderm zu bilden (Schöler et al.,
1990), und bis 8,5 d. p. c. (Tage nach dem Koitus) ist sie beschränkt auf
wandernde Urkeimzellen. Oct4-Genexpression in hoher Rate wird auch
beobachtet in pluripotenten Embryokarzinom- und embryonalen Stammzelllinien, und
wird herunterreguliert, wenn diese Zellen induziert werden, um zu
differenzieren (Schöler
et al., 1989; Okamoto et al., 1990).
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Das
Oct4-Gen wurde ausgewählt
als ein geeignetes Beispiel der Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte,
wegen der bekannten mäßigen bis
hohen Spiegel an Oct4-mRNS. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz einer
Herunterregulation der Transkription des Oct4-Zielallels, übereinstimmend
mit dem Entfernen einer möglichen
Enhancersequenz im zweiten Intron, das Oct4-Gen mit einer sehr hohen
Effizienz zum Ziel genommen werden kann, unter Verwendung der Verfahren
und Konstrukte der Erfindung.
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In
einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung erzeugt die Integration eines transgenen Konstruktes,
das ein IRES-Element und einen offenen Leserahmen beinhaltet, in
einer Position, die sich 3' zu
dem Stop-Codon und 5' zu
dem Polyadenylierungssignal befindet, eine funktionelle dicistronische
mRNS, die in der Lage ist, sowohl das endogene Genprodukt, als auch
das Produkt des transgenen offenen Leserahmens zu kodieren. In einem
anderen Ausführungsbeispiel
stellt die transgene Integration in einer Position, die sich 5' zu oder an Stelle
des endogenen Gen-Leserahmens befindet, eine Gelegenheit bereit,
das endogene Genprodukt zu „vernichten” (knock
out) (oder anderweitig zu modifizieren).
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Analysen
eukaryotischer Gene in vielen Laboratorien haben gezeigt, dass im
Allgemeinen die kodierenden Sequenzen von DNS, die Bereiche, die
schließlich
zu Aminosäuresequenzen
translatiert werden, nicht fortlaufend sind, sondern durch „stumme” DNS unterbrochen
sind. Sogar bei Genen ohne Proteinprodukt, wie z. B. die tRNS-Gene
von Hefe in Drosophila, enthält
das primäre
RNS-Transkript innere Bereiche, die während der Reifung ausgeschnitten
werden, wodurch die End-tRNS oder -mRNS ein gespleißtes Produkt
ist. Die Bereiche, die in dem reifen Boten verloren sein werden,
werden als „Introns” (für intragenische
Bereiche) bezeichnet und wechseln ab mit Bereiche, die exprimiert
werden, bezeichnet als „Exons”. Transgene
können
funktionell in Exon inseriert werden, oder, gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung, eine Spleißakzeptorsequenz in
5'-Position zu dem
IRES-Element integrieren, um eine funktionelle Integration in ein
Intron zu ermöglichen. Die
funktionelle Transgenintegration ist deswegen nicht durch die Intron/Exon-Anordnung
oder den Leserahmen des endogenen Gens beschränkt. Dies ist ein weiterer
Aspekt bei dem die Gestaltung und der Bau der Transgenkonstrukte
der Erfindung einfacher ist als der von bis jetzt bekannten Konstrukten.
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Die
IRES enthaltenden Vektoren der Erfindung ermöglichen das Gen-Targeting mit
einer erhöhten
Effizienz. Die Erfindung ermöglicht
einer ein heterologes Gen kodierenden Sequenz, in dem 3' untranslatierten Bereich
eines Gens (3'UTR)
inseriert zu werden, wodurch demzufolge die relativen Positionen
aller stromaufwärts
gelegener Introns und Exons bewahrt werden, und was deswegen zu
Hochexpression führt.
Das Erfordernis einer genomischen Kopie des heterologen Gens wird
vermieden und die erfolgreiche Expression kann erhalten werden durch
Inserieren einer cDNS-Kopie stromabwärts des IRES in dem 3'UTR. Da cDNSs sehr viel
kürzer
sind als die entsprechende genomische Kopie, wird der Zusammenbau
von Konstrukten und die Erzeugung von nicht-menschlichen transgenen
Säugern
bemerkenswert erleichtert.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
schließt
das heterologe Gen an seinem 3' (stromabwärts)-Ende
ein Polyadenylierungssignal ein. Ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels
ist, dass das Polyadenylierungssignal in einer wirksamen Verkürzung und
Verarbeitung des Transkripts an dem Ende des heterologen Gens resultiert.
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In
besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen
schließt
das DNS-Konstrukt auch eine Verkürzungs-/Spaltungs-/Transkriptions-Terminationssequenz
5' (stromaufwärts) der
homologen Region X ein. Die Funktion der 5'-Sequenz liegt darin, ein Durch-Lesen
der mRNS zu verhindern; geeignete Sequenzen schließen ein
Poly(A)-Signal, wie z. B. das SV40-Polyadenylierungssignal, und die Upstream
Mouse Sequence (UMS) (Heard et al., 1987) ein. Die 5'-Sequenz kann weiterhin
einen Spleißakzeptor
einschließen.
Es ist bekannt, dass DNS-Konstrukte
zufällig
in das Wirtsgenom integrieren können,
d. h. dass sie nicht immer durch homologe Rekombination mit dem
endogenen Zielgen inserieren. Die zufällige Integration in irgendein
aktives Gen kann in einer heterologen Genexpression resultieren;
dies macht es schwierig, korrekte Insertionsereignisse zu bemerken,
was ein Nachteil ist. Die besonders bevorzugten Ausführungsbeispiele überwinden
dieses Problem, da dort, wo eine zufällige Integration geschieht,
die Transkriptionsterminations- oder -verkürzungs- oder spaltsequenzen
auch integrieren, wodurch die Transkription verhindert wird. Es
wurde vorteilhafterweise gefunden, dass, wo die homologe Rekombination
mit dem endogenen Zielgen geschieht, die die Transkription verhindernde
Sequenz nicht integriert, so dass die Transkription des heterologen
Gens möglich
ist.
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In
diesen besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung
werden Verfahren wirksam etabliert, um die Expression nach zufälligen Genfallen-Integrationsereignissen
zu eliminieren und dadurch eine Targeting-Strategie vom Genfallentyp
bereitzustellen, die die Selektion spezifisch für das gewünschte Targeting-Ereignis ermöglicht.
Dieses Verfahren wird durch die Erfinder bezeichnet als Positive
Only Selection (POS) und verwendet Transkriptverkürzungs-/Spaltsequenzen
(z. B. Polyadenylierungssequenzen) oder transkriptorische Terminationssequenzen,
wie z. B. die UMS, um die Expression des Transgens im Falle der
zufälligen
Integration in aktiv transkribierte Gene zu verhindern. Homologe
Rekombination mit dem Zielgen inseriert funktionell das heterologe
Gen und, falls vorhanden, einen selektierbaren Marker, aber nicht
die stromaufwärts
gelegene transkriptorische Terminationssequenz und ermöglicht deswegen
die Transkription des heterologen Gens und, wo vorhanden, des selektierbaren
Markers.
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Folglich
erweitern „POS”-Ausführungsbeispiele
der Erfindung das Potential der Genfallen-Expressionstechnik, indem Verfahren
bereitgestellt werden mit denen im Wesentlichen die Expression des
Transgens an anderen Stellen der Integration als der des gewünschten
Zielgens eliminieren. Das POS-System hat eine besondere Anwendung
bei der Gentherapie, wo die Beschränkung der Transgenexpression
auf den Zielgenort von enormen Wert sein würde.
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Unter
Verwendung der DNS-Konstrukte des ersten Aspektes ist es möglich, ein
heterologes Gen in ein endogenes Wirtsgen zu insertieren.
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Die
Konstrukte der Erfindung sind auch vorteilhaft, um das Problem anzugehen,
in einer Zielwirtszelle oder in einem nicht-menschlichen Organismus
(die wir zur Klarheit als Zelle „T” bezeichnen) ein Gen („G”) zu exprimieren,
gemäß einem
bestimmten Expressionsprofil („E”), wo endogene
Gene mit einem geeigneten Expressionsprofil nicht vorhanden sind
oder nicht zugänglich
sind. Die Lösung
liegt darin, eine Donor-Wirtszelle („D”) zu identifizieren, die ein
Gen („H”) mit einem
Expressionsprofil E einschließt,
und ein Konstrukt gemäß der Erfindung
zu schaffen, bei dem X und Y eine solche Länge haben, dass sie die Elemente
der Zelle D einschließen,
die die Expression des endogenen Gens in der Zelle D, gemäß dem Profil
E, regulieren. Das DNS-Konstrukt schließt folglich (1) die regulatorischen
Elemente der Zelle D für
ein endogenes Zielgen, dessen Expressionsprofil E gewünscht wird,
nachzuahmen, (2) eine IRES und (3) eine heterologe Gensequenz G ein.
Dem DNS-Konstrukt wird ermöglicht,
zufällig
in die DNS der Zelle T zu integrieren.
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Die
zufällige
Integration des Konstruktes in die DNS der Zelle T erzeugt eine
modifizierte Zelle T, die das heterologe Gen gemäß annähernd dem Expressionsprofil
E der Zelle D exprimiert. Das Ergebnis ist die Expression des Gens
in der Zelle T mit einem ähnlichen
Muster zu dem von H in der Zelle D.
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Nach
der zufälligen
Integration des DNS-Konstruktes der Erfindung in die Zelle T, ist
die modifizierte Zelle T Ziel für
DNS-Konstrukte gemäß irgendeinem
Ausführungsbeispiel
der Erfindung, die im Wege der homologen Rekombination funktionieren.
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In
einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Inserieren
eines heterologen Gens in ein endogenes Zielgen in einem Wirtszellgenom
bereitgestellt, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem
DNS-Konstrukt gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung umfasst. Die Transformation kann das Einführen der
DNS der Erfindung in eine Zelle oder die Herstellung von Zellen
durch Transfektion, durch Injektionsballistiken, durch Plasmid-
oder Virusvektor oder durch Elektroporation oder durch Fusion einschließen.
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In
einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit,
ein heterologes Gen in einer Wirtszelle zu exprimieren, indem ein
DNS-Konstrukt gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung hergestellt wird, das das heterologe Gen enthält, indem
dem DNS-Konstrukt ermöglicht
wird, sich der homologen Rekombination mit dem Wirtsgenom zu unterziehen
und indem man eine Kultur an Wirtszellen wachsen lässt, die
das heterologe Gen exprimieren.
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Die
Erfindung stellt folglich ein Verfahren bereit, promoterlose transgene
Konstrukte, die von Bereichen mit Genhomologie flankiert werden,
zu verwenden, so dass die homologe Rekombination zwischen der DNS
eines transgenen Konstruktes und dem Zielgenort zu einer funktionellen
Insertion des Transgens in die gewählte Transkriptionseinheit
führt.
Die Transkription des Transgens wird durch Elemente reguliert, die
verbunden sind mit dem endogenen Gen und/oder zusätzlichen
Elementen, die in die Stelle mit dem Transgen eingefügt wurden.
Die Translation des transgenen Leserahmens oder der -rahmen wird über eine
Kappen-unabhängige Translationsinitiierung
durch den Einbau von interne(n) Ribosomeneintrittsstelle(n) (IRES)
unmittelbar 5' zu
dem/n offenen Leserahmen vermittelt. Dies stellt ein ausgezeichnetes
Ausmaß der
Transgenregulation bereit und vermeidet viele der Probleme, die
mit der Gestaltung und erfolgreichen Nutzung kürzlich beschriebenen Expressionskonstrukte
für die
Transgenexpression verbunden sind.
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In
einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren der Expression
eines heterologen Gens in einer Wirtszelle bereit, indem ein funktionelles
Expressionskonstrukt vor dem Einführen des Konstruktes in das Wirtsgenom
bearbeitet wird. In einem Ausführungsbeispiel
ist ein solches „genomisches
Transgen” in
vitro bearbeitet durch Inserieren einer IRES, die an ein heterologes
Gen gekoppelt ist, das exprimiert werden soll, in eine große genomische
Sequenz (zum Beispiel ein Cosmid oder ein künstliches Chromosom, das das
zu kopierende Gen einschließt),
die die gesamten, wenn nicht alle regulatorischen Elemente des Gens,
integriert. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird ein genomisches
Transgen in vitro bearbeitet, indem IRES und das zu exprimierende
heterologe Gen gezielt in das endogene Wirtsgen eingebaut werden
und anschließend
von der Zielzelllinie ein großes
genomisches Fragment (z. B. ein Cosmid oder ein künstliches
Chromosom) isoliert wird, das die IRES und die zu exprimierende
Sequenz und die meisten, wenn nicht alle der mit dem Zielgen im
Zusammenhang stehenden regulatorischen Elemente einschließt.
-
In
einem fünften
Aspekt stellt die Erfindung eine transgene Zelle oder einen transgenen
nicht-menschlichen
Organismus oder ein transgenes nicht-menschliches Tier bereit, in
deren Genom ein heterologes Gen inseriert worden war, unter Verwendung
eines DNS-Konstruktes, gemäß der Erfindung.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung Abkömmlinge
des sechsten Aspektes bereit, die die heterologen Gene geerbt haben. Die
Erfindung ist auf die heterologe Genexpression sowohl in Eukaryoten
als auch in Prokaryoten anwendbar, obwohl Eukaryoten und noch mehr
Tierzellen bevorzugt werden; und auf Säugerzellen im Besonderen.
-
Offensichtlich
ist die Nützlichkeit
der Konstrukte und Verfahren der Erfindung beim Selektieren nach dem
gewünschten
Integrationsereignis beschränkt
auf das Einführen
von transgenen Konstrukten, die ein selektierbares Markergen in
endogene Gene einbauen, die in ausreichenden Raten in den Zellen,
die transfiziert werden, exprimiert werden. Um ein nicht selektierbares
Gen in ein aktiv transkribiertes Gen für die Expression, unabhängig von
einem selektierbaren Marker, einzuführen, würde der Zielgenort zuerst mit
einem Konstrukt gemäß der Erfindung,
das einen selektierbaren Marker exprimiert, der sowohl selektiert
werden kann (primäres Targeting)
und gegen den auch selektiert werden kann (sekundäres Targeting), „markiert” werden.
Einmal durch ein primäres
Targeting-Ereignis markiert, könnten
Transgenin tegrationen in das „markierte” Gen selektiert
werden, durch die Abwesenheit des primären Targeting-Gen-selektierbaren
Markers. Diese Art des Ansatzes ist besonders anwendbar, wo wiederholtes
Targeting eines bestimmten Gens anvisiert wird, wie z. B. bei der
Entwicklung von Zelllinien oder nicht-menschlichen transgenen Tieren
für die Überexpression
heterologer Gene.
-
Wenn
das gezielt eingebaute Gen nicht ausreichend exprimiert wird für das primäre Genfallen-„Markieren” kann die
Promoter vermittelte Expression eines selektierbaren Markers ähnlich verwendet
werden in Standard-Targetingvektoren vom Nicht-Genfallentyp, um
das Zielgen zu markieren.
-
In
einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel
der Erfindung wurden Vektoren entwickelt, die die Enzephalomyokarditisvirus(EMCV)-IRES
vermittelte Translation eines LacZ/bakteriellen Neomycin-Resistenzfusionsgens
(βgeo, Freidrich
und Soriano, 1991) für
das Gen-Targeting in embryonalen Nagerstamm(ES)-Zellen verwenden.
Die Translation des βgeo-Fusionsgens
erzeugt ein bifunktionelles Genprodukt, das sowohl eine Reporter-
als auch eine selektierbare Markergenaktivität bereitstellt. Vektoren wurden
gestaltet, um gezielt einzubauen und anschließend nachzuweisen (a) die normale
Differentiation Inhibiting Activity/Leukaemia Inhibitory Activity
(DIA/LIF)-Genexpression durch die nicht-unterbrechende Insertion
des Transgens 3' zu
dem Leseraster des endogenen Gens, und (b) eine geänderte DIA-Genexpression,
die von einer definierten Modifikation an dem DIA-Genort resultiert,
(c) eine geänderte
Expression des Octamer bindenden Transkriptionsfaktors 4 (Oct4),
die aus einer definierten Modifikation an dem Genort resultiert.
-
DIA
ist ein pleiotropes Cytokin, das die Differenzierung von ES-Zellen
in vitro unterdrückt
und das in Zusammenhang gebracht wurde mit einer Reihe an Entwicklungsvorgängen und
physiologischen Vorgängen in
vivo. Das DIA-Gen wurde als ein geeignetes Beispiel für die Verwendung
von Konstrukten der Erfindung ausgewählt, wegen der bekannt niedrigen
Spiegel von DIA-mRNS. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz niedriger DIA-mRNS-Gleichgewichtsanteile
(< 10 Kopien/Zelle)
das DIA-Gen mit einer hohen Effizienz zum Ziel genommen werden kann.
-
Diese
Ergebnisse legen folglich nahe, dass die Verwendung von Konstrukten
gemäß der Erfindung
anwendbar ist, wenigstens in nicht-menschlichen ES-Zellen, auf Gene,
die sogar mit geringen Raten exprimiert werden.
-
Um
zu untersuchen, ob die IRES vermittelte Translationseffizienz abhängig ist
vom Zelltyp, erzeugten wir einen zufälligen Genfallenvektor gemäß der Erfindung,
der die EMCV-IRES verwendet, um die Translation des βgeo-Fusionsgens
zu initiieren. Neomycin resistente Zelllinien, die die LacZ-Färbung in
einer Reihe von differenzierten Zelltypen anzeigen, wurden ausgewählt für die Blastocysten-Injektion
und die anschließende Erzeugung
von Chimären.
Chimären
wurden hervorgebracht, um vollständige
nicht-menschliche transgene Tiere für die Analyse des LacZ-Expressionsprofils
bereitzustellen. Diese Analyse sollte eine wertvolle Einsicht in
die Effizienz der IRES vermittelten Translation in anderen Zelltypen
bereitstellen.
-
Es
folgen nun Beschreibungen beispielhafter Ausführungsbeispiele der Erfindung,
bei denen:
-
die 1–3 und 6 die
DNS-Konstrukte der Erfindung darstellen,
-
die 4 und 5 DNS-Konstrukte
zur Verwendung bei der Herstellung der Konstrukte zeigen.
-
Die 7 und 8 zeigen
die IRES-βgeo-Targeting
Strategie:
-
7 – schematische
Darstellung der internen Initiierung der Translation, die durch
die IRES in einem dicistronischen Transkript vermittelt wird.
-
8 – Anwendungen
der IRES-βgeo-Kassette
beim Gen-Targeting. Die Konstrukte können entweder gestaltet sein,
um einen Teil eines Gens zu deletieren, während der lacZ-Reporter eingebaut
ist, oder gestaltet sein, um den Reporter mit oder ohne Modifikation
des intakten Gens anzuhängen,
und
-
9 bis 12 zeigen
DNS- und mRNS-Hybridisierungsanalysen gezielt mutierter Klone:
-
9 – DIA/LIF-Targeting.
Genomische DNS, verdaut mit Hind III und Eco RI wurde hybridisiert
mit entweder einem Exon 1-spezifischen 163 bp langen Xho I-Eae I-Fragment aus
pDR100 oder mit einem 700 bp langen Pst I-Eco RI-3'-genomischen Fragment. Spur 1: CGR8-elterliche
ES-Zellen; Spuren 2, 5 und 6: Klone, gezielt mutiert mit dem nicht
verkürzten
Konstrukt; Spuren 3 und 4: Klone gezielt mutiert mit dem gekürzten Konstrukt.
-
10 – Oct-4-Targeting.
Primärer
Screen genomischer DNS, zubereitet in Agarosestopfen durch Eco RI-Verdauung
und Hybridisierung mit einem 587 bp langen Nco I-5'-Fragment, und durch
bestätigende Hybridisierung
mit einem 600 bp langen Hind III-Sau 3A-3'-Fragment, gefolgt von Cla I-Verdauung
Phenol/Chloroform-extrahierter DNS. Cla I ergab reproduzierbar eine
teilweise Verdauung der eingefügten
Stelle, was andeutend ist für
eine variable Methylierung innerhalb der lacZ-Sequenz. Spur 1: elterliche
CGR8-ES-Zellen; Spur 2: nicht gezielt mutierter Transfektant; Spuren
3–7: gezielt
mutierte Klone.
-
11 – Detektion
von Fusionstranskripten in nicht-menschlichen ES-Zellklonen mit
gezielten Integrationen am DIA-Genort. Um die Rate der DIA-Expression
zu erhöhen,
wurden ES-Zellen induziert, um nach Aussetzen an 10–6 M
Retinsäure
zu differenzieren. Poly(A+)-reiche RNS wurde
nach 4 Tagen zubereitet, aufgetragen auf ein Formaldehydgel und
auf eine Nylonmembran übertragen.
Das Filter wurde mit einer 650 bp langen, die DIA/LIF-Sequenz kodierende
Sonde hybridisiert und für
21 Tage exponiert, dann gestrippt und erneut mit einem 800 bp langen
lacZ-Fragment hybridisiert.
Spur 1: RNS (1,5 μg)
von elterlichen CGR8-Zellen; Spur 2: RNS (3 μg) von Zellen, die mit dem nicht
gekürzten
Konstrukt gezielt mutiert wurden; Spuren 3 und 4: RNS (3 μg) aus Zellen,
die mit dem gekürzten
Konstrukt gezielt mutiert wurden.
-
12 – Nachweis
des Fusionstranskriptes in mit Oct-4 gezielt mutierten nicht-menschlichen ES-Zellen.
Gesamt-RNS wurde zubereitet aus undifferenzierten nicht-menschlichen
ES-Zellen. Die Oct-4-Sonde war ein 408 bp langes Nco I-Pst I-5'-cDNS-Fragment (292), das nur 24 bp
des Exon 2 enthält
und folglich eine äquivalente
Hybridisierung an Wildtyp- und Fusionstranskripte ergeben sollte.
-
13 zeigt
Schritte bei der Herstellung eines Konstruktes der Erfindung, wie
beschrieben in Beispiel 3.
-
BEISPIEL 1
-
DIA-Gen-Targeting-Konstrukte
(1 und 2) wurden entworfen, um Transgene
zu integrieren, die das β-geo-Fusionsgenprodukt
exprimieren, um eine Genexpression unter der Kontrolle des endogenen DIA-Gen-Genorts
bereitzustellen. Ein drittes Konstrukt (3) wurde
entworfen, um die durch transkriptorische Blocker gewonnenen Vorteile
zu zeigen, die, wenn sie in Genfallen-Targeting-Konstrukte in einer
Position 5' zu der
DNS-Targeting Homologie eingebaut werden, die Expression zufällig integrierter
Transgene stark reduzieren, wenn nicht gar eliminieren.
-
Nicht-menschliche ES-Zellkultur und -Manipulation
-
ES-Zellen
wurden routinemäßig gehalten,
wie beschrieben (durch Smith, A. G. (1991) J. Tiss. Cult. Meth.
13, 89–94)
in Abwesenheit von Zellschichten als Wachstumsunterlagen in der
Zellkultur im Medium, das ergänzt
war mit Nager-DIA/LIF. Die Keimbahn kompetente Zelllinie CGR8 wurde
aus Stamm 129-Embryonen durch veröffentlichte Verfahren (Nichols,
J., Evans, E. P. & Smith,
A. G. (1990) Development 110, 1341–1348) etabliert. Aggregationschimären wurden
zwischen ES-Zellen und herausgezüchteten
MF1-Embryonen durch eine Modifikation des Verfahrens von Wood et
al. (Wood, S. A., Pascoe, W. S., Schmidt, C., Kemler, R., Evans, M.
J. & Allen, N.
D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4582–4585) hergestellt, bei welcher
eine Co-Kultur durchgeführt
wird in Hängetropfen.
Für die
Keimbahn-Übertragung
wurden Chimären
erzeugt durch Blastocysteninjektion. Für die Isolierung homologer
Rekombinanten wurden 108 Zellen mit 150 μg linearisiertem
Plasmid bei 0,8 kV und 3 μFd
in einer 0,4 cm Küvette
elektroperforiert, dann in Anwesenheit von 175 μg/ml G418 selektiert. Genomische
DNS wurde in Agarosestopfen zubereitet (Brown, W. R. A. (1988) EMBO
J. 7, 2377–2385)
von 24-Well-Plattenkulturen, während
doppelte Platten gefroren gelagert wurden. (Ure, J. Fiering, S. & Smith, A. G.
(1992) Trends. Genet. 8, 6). Um die DIA/LIF-Produktion zu untersuchen,
wurden ES-Zellen induziert, um zu differenzieren durch Inkubation
mit 6 mM 3-Methoxybenzamid und konditioniertes Medium wurde geerntet
und auf die Fähigkeit
untersucht, die ES-Zelldifferenzierung zu inhibieren, wie beschrieben.
Die Untersuchung wurde spezifisch gemacht für DIA/LIF durch den Einschluss
eines neutralisierenden polyklonalen Antiserums, erzeugt gegen Nager-DIA/LIF
(AS, unveröffentlicht).
Histochemische Färbung
für β-Galactosidase
wurde durchgeführt
unter Verwendung von X-gal
(Beddington, R. S. P., Morgenstern, J., Land, H. & Hogan, A. (1989)
Development 106, 37–46)
und Fluoreszenzfärbung
wurde durchgeführt
mit DetectaGene Green (Molecular Probes), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
-
Plasmidkonstruktion
-
DNS-Manipulationen
wurden durchgeführt
unter Befolgung von Standardverfahren. Die IRES ist eine 594 bp
lange Sequenz des 5'-untranslatierten
Bereichs (UTR) von EMCV- mRNS,
die durch Mutagenese des natürlichen
Startcodons modifiziert worden war. Die Translation wird gestartet
durch ein ATG, das 9 bp in 3'-Richtung
von der normalen Startstelle entfernt liegt und einen Teil der Nco
I-Klonierungsstelle bildet.
-
Kurz,
die IRESβgeo-Kassette
wurde gebaut durch Ligieren eines 5'-Fragmentes der EMCV-IRES/lacZ-Fusion (Ghattas et al., 1991)
an die 3'-lacZ/neoṞ-Sequenzen der βgeo-Genfusion (Friedrich, G. & Soriano, P. (1991)
Genes Dev. 5, 1513–1523).
Das pGTIRESβgeopA-Plasmid wurde dann
erzeugt durch 5'-Ligierung
des en-2 Spleißakzeptors
(Gossler, A., Joyner, A. L., Rossant, J. & Skarnes, W. C. (1989) Science 244,
463–465)
und 3'-Ligierung
der SV40-Polyadenylierungssequenzen. Targeting-Konstrukte wurden
zubereitet aus genomischen Klonen, die aus einer Stamm 129-λ-Bibliothek
isoliert worden waren. DIA/LIF-Targeting-Konstrukte
wurden innerhalb eines 7 kb langen Fragmentes erzeugt, das sich
von einer Sac II-Stelle zwischen den alternativen ersten Exons zu
einer Hind III-Stelle 3' des
Gens erstreckt. Die DIA-βgeo-Konstruktion wurde
zubereitet durch Insertion der IRESβgeo-Kassette in die einzige Xba I-Stelle.
Um das DIA-βgeopA-Konstrukt
zu erzeugen wurde ein 1,2 kb Bam HI-Fragment, das 3'-βgeo-Sequenzen und SV40-Polyadenylierungssequenzen
enthält,
aus pGTIRESβgeopA
isoliert und in das Bam HI-verdaute DIA-βgeo-Konstrukt ligiert. Dies resultiert
in der Insertion der 200 bp SV40-Sequenzen an Stelle eines 400 bp-Fragmentes des DIA/LIF-3'-UTR. Das Oct-4-Targetingkonstrukt
enthielt 1,6 kb 5'-Homologie, sich erstreckend
von einer Hind III-Stelle innerhalb des ersten Exons bis zu einer
Xho I-Stelle in dem ersten Intron, und 4,3 kb 3'-Homologie, die sich von der Nar I-Stelle
3' der Polyadenylierungssequenz
bis zu einer Hind III-Stelle erstreckt.
-
Im
Detail, um die DIA-Targetingkonstrukte zu erzeugen, wurde ein vorläufiger Vektor,
der die EMCV-IRES an das βgeo-Fusionsgen
koppelt, entwickelt. Dies wurde erzeugt durch Ligieren eines 1,2
kb Bam HI-Fragments, das das bakterielle Neomycin-Resistenzgen (neo)
und das SV40-Polyadenylierungssignal enthält, in die Bam HI-Stelle des
Bluescript II KS (–)-Klonierungsvektors
(Stratagene) ligiert wurde, um den Vektor „1” zu erzeugen. Unabhängig davon
wurde ein 1,4 kb großes
Bgl II/Cla I-Fragment, das die EMCV-IRES und 5'-LacZ-Sequenzen einschließt, aus pLZIN isoliert (Ghattas
et al., 1991) und in pGT1.8βgeo
ligiert, um den Vektor zu erzeugen, der pGT1.8IRESβgeo bezeichnet
wurde (4). Ein 4,9 kb langes Xba I-Fragment, das das
gesamte IRESβgeo-Fusionsgen
einschließt,
wurde aus pGT1.8IRESβgeo
isoliert und in den Xba I-verdauten Vektor „1” ligiert, um IRES-βgeo (zum
Targeting) herzustellen (5).
-
Um
den DIA-IRESβgeo-Targetingvektor
(1) zu erzeugen, wurde das 4,9 kb lange Xba I-IRESβgeo-Fragment
von IRES-βgeo
(zum Targeting) (5) in eine einzelne Xba I-Stelle
ligiert, wodurch das Translationsstopcodon des Nager-DIA-Gens überlappt
wurde. Das Nager-DIA-Genfragment, das bei der Gestaltung des DIA-Genfallen-Targetingvektors
verwendet wurde, reichte von einer Sac II-Stelle unmittelbar 3' zu dem abwechselnden
ersten Exon (das das „D”-Transkript
kodiert) zu einer Hind III-Stelle, annähernd 7 kb 3' von dieser Stelle
entfernt.
-
Der
zweite DIA-Gen-Targetingvektor, bezeichnet als DIA IRES-βgeo pA, wurde
erzeugt durch Inserieren der SV40-Polyadenylierungssequenz unmittelbar
3' zu dem IRES-βgeo-Transgen. Dies wurde
erreicht durch Inserieren eines Bam HI-neo/pA-Fragments von IRES-βgeo (zum Targeting) in Bam HI-verdautes
7 kb DIA IRES-βgeo.
Das resultierende Konstrukt war identisch mit dem 7 kb langen DIA
IRES-βgeo-Targetingkonstrukt
mit der Ausnahme des Einschlusses des SV40-Polyadenylierungssignals
an Stelle von ungefähr
400 bp der DIA-Gen-3'-UTR-Sequenz.
-
Der „POS”-DIA IRES-βgeo-Targetingvektor
wurde hergestellt durch Inserieren eines 1400 bp langen Nco I/Pst
I-pSVTKNeob-Fragments, das den β-Globingen-Spleißakzeptor
aus Kaninchen und Exonsequenzen und das SV40-Polyadenylierungssignal
enthält,
in die Sac II-Stelle an das 5' äußerste Ende
der DIA-Gen-DNS-Homologie (3).
-
Das
Oct4-neo-Konstrukt (Oct4-tgtvec), gestaltet für die gezielte Integration
in das Oct4-Gen, ist in 6 gezeigt. Dieses Konstrukt
baut 1,6 kb der 5' Oct4-Genssequenz,
4,3 kb der 3' Oct4-Genssequenz,
ein LacZ-neomycin-Fusionsgen (βgeo,
kodierend ein bifunktionales Protein, Freidrich and Soriano, 1991)
in das erste Intron der Oct4-mRNS ein. Spleißen der Spleiß-Donor-Sequenz
der ersten Exon-Intron-Grenze bis zu der integrierten IRES-βgeo-Sequenz wird erleichtert
durch den Einschluss einer engrailed-2 Nager-Spleißakzeptorsequenz (Skarnes et
al., 1991) unmittelbar 5' zu
der IRES-βgeo-Sequenz.
Die Translation des βgeo-Cistrons
von dem Oct4-βgeo-Fusionstranskript
wird erleichtert durch den Einschluss der EMCV-IRES unmittelbar 5' zu der βgeo kodierenden
Sequenz.
-
Nicht-menschliche ES-Zelltransfektion
und Kolonieselektion:
-
Maus
129 ES-Zellen (Linie CGR-8) wurden zubereitet und gehalten in Anwesenheit
von DIA, wie beschrieben durch Smith (1991). Plasmid-DNS für die Transfektion
wurde wurde linearisiert durch Sal I-Verdauung, Ethanol gefällt und
resuspendiert in einer Konzentration von 10–14 mg/ml in PBS. Nach 10 Stunden
Kultur im frischem Medium wurden annähernd konfluente ES-Zellen
dispergiert durch Trypsinierung, anschließend in Kulturmedium und PBS
gewaschen und zu 1,4 × 108/ml in PBS für die sofortige Transfektion
resuspendiert. Routinemäßig wurden
0,7 ml Zellsuspension mit 0,1 ml DNS enthaltender Lösung vermischt
und bei 0,8 kV und 3,0 μFD
unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser und 0,4 cm Küvetten elektroperforiert.
Transfektionen wurden auf gelatinierten Gewebekulturplatten zu 5-8 × 104/cm2 in Wachstumsmedium
für 16
Stunden ausplattiert, vor der Zugabe von Selektionsmedium, das 200 μg/ml (aktives)
G418 (Sigma) enthält.
Einzelne Kolonien wurden 8–10
Tage nach der Transfektion abgeimpft und doppelt in 24-Well-Gewebekulturplatten
für die weitere
Expansion in Wachstumsmedium, das 200 μg/ml G418 enthält, übertragen.
-
Wenn
sie einmal konfluent waren, wurde eine Reihe an Zellen eingefroren
zur Lagerung, während
die Verbleibenden durch Southern-Analyse und/oder lacZ-Färbung analysiert
wurden.
-
Weitere Charakterisierung der mit DIA-Gen
gezielt mutierten Zelllinien:
-
Ausgewählte Zelllinien
wurden untersucht für
lacZ-Färbemuster
nach dem Wachstum nicht-menschlicher
ES-Zellen und Differenzierung in DIA ergänzten Medium, oder nach Retinsäure induzierter
Differenzierung in Medium, das nicht DIA-ergänzt war.
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Herstellung von Chimären der mit dem DIA-Gen gezielt
mutierten Zelllinien:
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Selektierte
Zelllinien wurden kultiviert in Abwesenheit von G418 für 7 Tage
vor der Injektion in nicht-menschliche Embryonen, wie kürzlich beschrieben
(Nichols et al., 1990). Kurz, Blastocysten für die Injektion wurden gesammelt
4 d. p. c. von C57/B16-Donoren, 10–20 Zellen wurden injiziert
und man ließ sie
sich in Kultur erneut expandieren vor der Übertragung in die Uteri pseudoschwangerer
Empfänger.
Chimären
wurden identifiziert durch die Anwesen heit von Flecken von sandfarbener
Fellfarbe auf dem C57/BL6-Hintergrund. Männliche Chimären können Testzüchtungen
für die Übertragung
der Transgene sein. Transgene Mäuse
können
analysiert werden auf lacZ-Färbung.
-
DNS- und RNS-Hybridisierungsanalysen
-
Filterhybridisierungen
wurden durchgeführt
auf Nylon-Membranen, gemäß Standardverfahren,
unter Verwendung von zufällig
geprimten 32P-markierten Sonden. Homologe
Rekombinanten wurden mit Sonden von sowohl 5'- als auch 3'-flankierenden Sequenzen charakterisiert.
In situ-Hybridisierung des Gesamtpräparates mit Digoxigenin-markierter
Oct-4 Gegensinn-RNS (Schöler,
H., Dressler, G. R., Balling, R., Rohdewold, H. & Gruss, P. (1990) EMBO J. 9, 2185–2195) wurde
durchgeführt
im Wesentlichen, wie beschrieben (Wilkinson, D. G. (1992) in situ
hybridization: a practical approach, Hrsg. Wilkinson, D. G. (IRL
Press, Oxford), S. 75–83).
-
Der
Gleichgewichtsanteil von DIA/LIF-mRNS in nicht-menschlichen ES-Zellen
ist geringer als 10 Kopien pro Zelle; dies verschaffte einen strengen
Test der allgemeinen Nützlichkeit
IRES-gerichteter Vektoren der Erfindung. Targeting-Vektoren wurden
hergestellt durch Einführen
des IRES-βgeo-Moduls
an der Xba I-Stelle, die das Stop-Codon überlappt (9).
Die gesamte kodierende Sequenz wurde folglich intakt gelassen und Intronsequenzen
waren unverändert.
Zwei Konstrukte wurden gebildet, DIA-βgeo und DIA-βgeopA, die sich durch den Einschluss
des SV40-Polyadenylierungssignals 3' der βgeo-Sequenz
unterschieden. Das Fusionstranskript, das hergestellt wurde nach
der homologen Rekombination mit dem früheren Konstrukt, verwendet den
endogenen 3'-UTR
und das Polyadenylierungssignal des DIA/LIF-Gens, wohingegen das DIA-βgeopA-Konstrukt
ein verkürztes
Transkript hervorruft, dem diese Sequenzen fehlen.
-
Im
Gegensatz zu DIA/LIF, sind sowohl mRNS als auch Protein für den Octamer
bindenden Transkriptionsfaktor Oct-4 (auch bekannt als Oct-3) vergleichsweise
fehlend in nicht-menschlichen
ES-Zellen. Oct-4 wird auch gefunden in Oozyten, pluripotenten frühen embryonalen
Zellen und Urkeimzellen. Die Verknüpfung von Oct-4 mit Pluripotenz
wird gestärkt
durch seine schnelle Herunterregulierung während der Differenzierung. Ein
IRES-βgeo-Vektor wurde gestaltet
sowohl, um ein Null-Allel zu erzeugen, als auch, um einen Expressionsmarker
in den Oct-4-Genort einzuführen
(8). Das Letztere könnte den Nachweis bis jetzt
unidentifizierter Stellen der Oct-4-Expression erleichtern. Die
POU-spezifische Domäne
und die die Homäodomäne kodierenden
Sequenzen in den Exons 2 und 5 wurden deletiert und durch das IRES-βgeopA-Modul
(11) ersetzt. Da der 5'-Arm der Homologie innerhalb des ersten
Introns endete, wurde die en-2 Spleißakzeptor-Sequenz 5' zu der IRES eingeschlossen,
um produktives Spleißen
von Exon 1 nach der homologen Rekombination zu erleichtern.
-
Nach
der Elektroporation und Selektion in G418, wurden einzelne Klone
durch Southern-Hybridisierung
mit sowohl 5'- als
auch 3'-flankierenden
Sonden analysiert, um Austausch-Targetingereignisse
nachzuweisen (9–12), und
mit inneren Sonden, um multiple Integrationen zu überwachen.
Die Häufigkeiten homologer
Rekombination, die mit den Konstrukten der Erfindung erhalten werden,
sind in Tabelle 1 vorgestellt.
-
Korrekte
Austauschereignisse wurden mit sämtlichen
Vektoren beobachtet. Eine besonders hohe Frequenz wurde reproduzierbar
erhalten am Oct-4-Genort. Dies kann die hohe Expressionsrate dieses
Gens in ES-Zellen widerspiegeln, zusätzlich zu den Beiträgen isogener
DNS und der Anreicherung, die durch ein promoterloses Konstrukt
gewährleistet
wird. Das Targeting von DIA/LIF mit dem Poly(A)-Zugabe-Vektor war
auch effizient. Die Isolierung korrekt gezielt mutierter Klone am
DIA/LIF-Genort weist nach, dass IRES vermittelte Translation anwendbar
ist auf Gene, die in sehr geringen Raten in ES-Zellen exprimiert
werden.
-
Northern-Analysen
zahlreicher gezielt mutierter Klone bestätigten, dass alle Fusionstranskripte
der vorhergesagten Größen (11, 12),
die sowohl mit lacZ- als auch mit DIA/LIF- bzw. Oct-4-Sonden hybridisierten, enthielten.
Das durch nicht verkürzende
Insertion von IRES-βgeo
in das DIA/LIF-Gen im Klon D70 hergestellte Transkript wurde in ähnlichen,
obgleich im Vergleich zu dem normalen Transkript leicht niedrigeren Mengen,
nachgewiesen. Dies zeigt, dass die IRES-βgeo-Sequenz selber nicht irgendeinen
großen
Einfluss auf entweder die Transkription oder den Nachrichtenumsatz
hat. Die verkürzten
Fusionsarten, erzeugt nach der Integration von IRES-βgeopA, waren
5-mal häufiger
vorhanden beim Phosphoimage-Scanning, als die normale Botschaft.
Der erhöhte
Anteil des Fusionstranskriptes in diesen Zellen wurde widergespiegelt
in der Produktion biologisch aktiven DIA/LIF-Proteins; 3–6 mal mehr
DIA/LIF war vorhanden in konditioniertem Medium, zubereitet aus
differenzierten Kulturen von Zellen gezielt mutiert mit Verkürzungen
als zubereitet aus den elterlichen Zellen oder Zellen, die mit dem
nicht verkürzten
Konstrukt gezielt mutiert worden waren. Folglich ist das Fusionstranskript
eine funktionelle dicistronische mRNS und das Targetingereignis
hat die Aktivität
des gezielt mutierten Gens modifiziert. Das Oct-4-Fusionstranskript
war andererseits 10–20
mal weniger häufig
vorhanden als Wildtyp-Oct-4-mRNS. Dies könnte der ineffizienten Nutzung
des en-2-Spleißakzeptors
zugeschrieben werden, aber könnte
auch von einer Deletion von entweder stabilisierenden Elementen
innerhalb der mRNS oder einem Enhancer innerhalb des Gens stammen.
-
Die
in vitro-Studien erläutern
das Potential der Konstrukte und Verfahren der Erfindung, um eine
gezielt mutierte heterologe Genexpression zu erhalten.
-
BEISPIEL 2
-
Um
die Frage der Gewebespezifität
der IRES-Funktion anzugehen, stellten wir eine Reihe zufälliger IRES-Genfallen
gemäß der Erfindung
durch Elektroporation von pGTIRESβgeopA
in ES-Zellen her. Zahlreiche Klone, die eine weit verbreitete Expression
von β-Galactosidase
in differenzierten Zelltypen in vitro ausübten, wurden verwendet, um
Aggregationschimären
herzustellen. Nach 7,5 und 8,5 Tagen Entwicklung konnte β-Galactosidase
in allen Geweben, die durch die ES-Zellen bewachsen sind, das ist
durch den Embryo und in das Amnion und den viszeralen Dottersack,
nachgewiesen werden. Diese Genfallen wurden durch die Keimbahn hindurchgeführt, wobei
bestätigt
wird, dass die Anwesenheit der IRES kompatibel ist mit funktioneller
Gametogenese, und vorläufige
Analysen an den Heterozygoten zeigen an, dass IRES funktionell ist
in einer breiten Reihe an embryonalen und adulten Geweben. Aggregationschimären wurden
auch erzeugt mit den mit Oct-4 gezielt mutierten Zellen. Das Färbemuster
solcher Embryonen nach 7,5 Tagen zeigt, dass die gewebespezifische
Verteilung von Oct-4-mRNS genau widergespiegelt wird durch das β-Galactosidase-Expressionsmuster.
-
BEISPIEL 3
-
Anwendung
der Erfindung auf die effiziente Expression heterologer Moleküle durch
Insertion einer IRES und einer cDNS in den 3'-untranslatierten Bereich eines genomischen
Klons eines gewebespezifischen Gens und die Erzeugung transgener
Tiere durch Mikroinjektion in befruchtete Eier.
-
In
dem folgenden Beispiel wird eine cDNS (z. B. menschliches alpha-1
Antitrypsin) stromabwärts
einer IRES (z. B. von EMCV) in den 3'-untranslatierten Bereich eines genomischen
Gens inseriert, das effizient und auf eine gewebespezifische Art
und Weise in transgenen Tieren funktioniert (z. B. das Schaf-Betalactoblobulin-Gen,
BLG).
-
Die
IRES des Encephalomyocarditisvirus (EMCV) ist erhältlich als
ein 600 bp langes EcoRI-NcoI-Fragment,
wo die NcoI-Stelle (CCATGG)
die Startstelle der Translation definiert; es enthält auch
eine Hind III-Stelle, eingefügt
einige Nukleotide stromaufwärts
der NcoI-Stelle, wobei der Abstand zwischen der IRES und dem ATG
geändert
wird (Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5848–5859, 1991). Zuerst wird die
stromaufwärts
liegende EcoRI-Stelle umgewandelt durch Linker-Insertion (Sequenz
GAATTGATATCAATT) zu einer EcoRV-Stelle. Zwei
Versionen der IRES werden verwendet, eine (IRES-1), bei der die
heterologe kodierende Sequenz eingefügt wird an der NcoI-Stelle,
eine zweite, bei der die ortsgerichtete Mutagenese verwendet wird,
um das ATG innerhalb der NcoI-Stelle 20 Nukleotide stromabwärts von
Box A (TTTCC, Pilipenko et al., Cell 68, 119–131, 1992) zu positionieren,
wobei die Hind III-Stelle
entfernt wird (die DNS-Sequenz in diesem Bereich lautet nun:
TTTCCTTTGAAAAACACGATAACCATGG) (13, A).
Das modifizierte IRES wird als IRES-2 bezeichnet. IRES-1 und IRES-2
werden beide verwendet als EcoRI-NcoI-Fragmente, für die folgenden
Experimente.
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Das
Schaf-BLG-Gen ist vorhanden auf einem großen SaII-SaII-Fragment (oder,
alternativ als ein etwas kleineres SaII-XbaI-Fragment) (Simons et
al., Nature 328, 530–532,
1987; Ali und Clark, J. Mol. Biol. 199, 415–426, 1988; Harris et al.,
Nucl. Acids Res. 16, 10379, 1988) kloniert in pPolyIII-I (Lathe
et al., Gene 57, 193–201,
1987). Beide Fragmente exprimieren in einer hohen Rate in der Taktierenden
Brustdrüse,
wenn sie in transgene Tiere eingeführt werden (Simons et al.,
Nature 328, 530–532,
1987).
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Unmittelbar
stromabwärts
des Translations-Stop-Codons in dem letzten Exon liegt eine einzelne
AatII-Stelle (GACGT/C). Diese Stelle wird umgewandelt durch Insertion
eines Linkers zu einer EcoRV-Stelle (Endsequenz GACGTGATATCACGTC) (13, D).
Obwohl diese Konstruktion auf der Verwendung des gesamten SaII-SaII-Fragmentes
beruht, kann das SaII-XbaI-Fragment
auch verwendet werden mit geeigneten kleineren Modifikationen des
Vorgehens.
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Das
in diesen Experimente verwendete Reporter-Gen ist menschliche alpha-1
Antitrypsin-cDNS,
obwohl der Vorgang wiederholt werden kann mit irgendeiner anderen
cDNS. Die cDNS wird bearbeitet durch lokalisierte Mutagenese, dergestalt,
dass eine NcoI-Stelle die Startsequenz ATG überlappt (dies kann zu einem einzelnen
Basenaustausch in dem zweiten Codon führen, so dass die Art der an
dieser Stelle kodierten Aminosäure
geändert
wird. Da in den meisten Fällen
diese Aminosäure
nicht zu dem reifen Protein beiträgt, da sie am Anfang der Signalsequenz
liegt, hat dies keine gegenteiligen Folgen für Expression, Sekretion oder
Aktivität
des reifen Proteins). Ähnlich
wird eine EcoRV-Stelle am 3'-Terminus
der cDNS bearbeitet, so dass der 3'-untranslatierte Bereich entfernt wird
(die Sequenz am 3'-Terminus
der cDNS heißt
TAAGATATC, wo das Stopcodon TAA TAA, TAG oder TGA sein könnte) (13,
B). Das NcoI-EcoRV-Fragment (erhalten, wo notwendig, durch teilweise
Verdauung in Fällen,
wo interne Stellen vorhanden sind) wird in den folgenden Experimenten verwendet.
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Als
Nächstes
wird pPolyIII-I (Lathe et al., Gene 57, 193–201, 1987) modifiziert, so
dass ein synthetischer BamHI-SaII-PstI-Polylinker inseriert wird
zwischen die BamHI- und PstI-Stellen
(Sequenz des Polylinkers – GGATCCGCGTCGACCACTGCAG;
Restriktionsstellen sind unterstrichen) (13, C).
Das SaII-SaII-Fragment, welches das modifizierte (EcoRV-Stelle an Stelle
der AatII-Stelle) genomische Schaf-BLG-Gen enthält, wird in die SaII-Stelle
kloniert. Die IRES und die modifizierte cDNS werden aus EcoRV-NcoI-
bzw. NcoI-EcoRV-Fragmenten
ausgeschnitten, miteinander ligiert und das Fusionsprodukt EcoRV-NcoI-EcoRV
wird in die EcoRV-Stelle innerhalb des 3'-untranslatierten Bereichs des BLG-Gens
inseriert (13, E).
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Das
Hybridmolekül,
BLG-IRES-AAT-BLG, wird aus dem Plasmid mit SfiI oder einem anderen
geeigneten Enzym ausgeschnitten und in befruchtete Eier von Maus
oder Schaf mikroinjiziert. Bei transgenen Tieren, die dieses Konstrukt
beherbergen, wird zum größten Teil
beobachtet, dass sie hohe Anteile an AAT in ihrer Milch exprimieren.
Konstrukte der Erfindung könnten
auch verwendet werden, um die Expression anderer Proteine von biomedizinischer
Wichtigkeit zu erhalten.
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Die
hierin berichteten Experimente weisen nach, dass die Verwendung
von IRES-Targeting gemäß der Erfindung
ein starkes Mittel ist, ein gewünschtes
Gen in einem Wirtsgenom zu exprimieren. Ferner war die in diesen
Studien verwendete IRES-Konfiguration nicht optimal für die Translation
des 3'-Cistrons.
Es wurde herausgefunden, dass die präzise Örtlichkeit des ATG relativ
zu dem 3'-Ende der
IRES eine Hauptwirkung auf die translatorische Effizienz hat. Es
scheint, dass die Produktion von βgeo
mehrfach über
die, die in der vorliegenden Studie erzielt wurde, gesteigert werden
könnte.
Dies sollte die Fähigkeit,
Rekombinanten in schwach exprimierten Genen zu isolieren, erhöhen und
die Empfindlichkeit des lacZ-Reporters
verstärken.
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Die
IRES-Targeting Strategie der Erfindung ist ein starkes Mittel, die
Säugergenexpression
nachzuweisen und zu modifizieren. Weiterhin ist es offensichtlich,
dass die nicht unterbrechende Integration eines IRES-verknüpften Markers
in einen 3'-UTR
ein bequemes Mittel zum Einfügen
schwieriger Mutationen in ein Gen bereitstellt. Ferner ist die IRES-Strategie
nicht beschränkt
auf die Modifikation endogener Gene und das Einführen von Reporter, sondern
ist auch anwendbar auf die kontrollierte Expression von Transgenen.
Die gewünschte
Spezifität
und Raten der Tansgenexpression könnten durch die Verwendung
von IRES vermittelter Translation, entweder in genomischen Konstrukten
für die
pronukleäre
Injektion oder nach homologer Integration in einen geeigneten Genort,
sichergestellt werden. Letzteres könnte erreicht werden durch
die Konstruktion polycistronischer Vektoren, die zwei IRES-Elemente enthalten.
Alternativ könnten
aufeinander folgende Runden homologen Ersetzens oder Targetings,
gefolgt von rekombinatorischer Deletion des selektierbaren Markers,
verwendet werden, um eine IRES-Expressionskassette mit minimaler
Unterbrechung in irgendwelche Gene einzuführen, die nicht in ES-Zellen
exprimiert werden. Im Allgemeinen scheint deswegen wahrscheinlich die
Flexibilität
und Nützlichkeit
der IRES vermittelten Translation, eine weit verbreitete Anwendung
bei der Transgenforschung zu finden. Tabelle 1 Isolationsfrequenz homologer Rekombinanten
mit IRES-Vektoren.
Konstrukt | Zelllinie | gescreente
Kolonien | Anzahl
Positiv | Prozent
Positiv |
Oct4-βgeo | CGR8 | 51 | 44 | 86% |
Oct4-βgeo | E14TG2a | 10 | 7 | 70% |
Oct4-βgeo | D1C2 | 30 | 21 | 70% |
DIA-βgeopA | CGR8 | 79 | 21 | 26% |
DIA-βgeo | CGR8 | 109 | 3 | 2,7% |
„POS” DIA-Bgeo | CGR8 | 20 | 20 | 100% |