DE69432475T2

DE69432475T2 - Von menschlichen t-zellen immunodominante epiropen des virus der c-hepatitis

Info

Publication number: DE69432475T2
Application number: DE69432475T
Authority: DE
Inventors: Geert Leroux-Roels; Robert Deleys; Geert Maertens
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2014-10-29
Also published as: ATE236981T1; DK0992580T3; JPH09504534A; PT992580E; EP0725824A1; EP0992581B2; ES2197170T3; CA2175692A1; US20040047877A1; EP0992580A2; EP0992580A3; EP0979867A3; AU7993294A; DE69433971D1; PT725824E; EP0992581A2; EP0725824B1; AU698878B2; US6613333B1; ATE274578T1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt immundominante T-Zellen-Epitope von Hepatitis-C-Viren, die für prophylaktische und therapeutische Hepatitis-C-Impfstoffe geeignet sind und aus dem HCV-Kernprotein stammen.
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung neuartiger, den Kernbereich von Hepatitis-C-Viren betreffende synthetische Immunogene sowie deren Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen, Therapeutika u. ä. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptidzusammensetzungen mit T-Zellen-Determinanten des HCV-Kerns.
Allgemeiner Stand der Technik
In den wenigen Jahren seit seiner Entdeckung konnte das Hepatitis-C-Virus (HCV) als eine Hauptursache für akute und chronische Erkrankungen der Leber identifiziert werden. Bei dem HCV handelt es sich um ein einzelsträngiges RNA-Virus mit einem Genom von ungefähr 9400 Nukleotiden, das aus einem 5'-nicht translatierten Bereich (5' Untranslated Region, 5'UR) von 341 Nukleotiden besteht, auf den ein einziges großes offenes Leseraster folgt, das ein Polyprotein-Vorläufermolekül mit etwa 3010 Aminosäuren codiert (Kato et al., 1990). Die genetische Organisation des Virusgenoms ist mit dem der Flavi- und Pestiviren verwandt, wobei die putativen Strukturproteine im N- terminalen Bereich und verschiedene Nicht-Strukturproteine am C-terminalen Ende des Polyproteins lokalisiert sind. Bei den Strukturproteinen handelt es sich um das Kernprotein (C, Aminosäuren 1-191), gefolgt von den putativen Hüllproteinen E1 (Aminosäuren 192- 383) und E2/NS1 (Aminosäuren 384-746). Die Ausdrücke E2 und NS1 lassen sich häufig gegeneinander austauschen. Eine weitere Form von E2 setzt sich aus den Aminosäuren 384 bis 809 zusammen, und eine dritte Form ist mit NS2 assoziiert. Bei den Nicht-Strukturproteinen handelt es sich um NS2, NS3, NS4 und HS5, von denen wenigstens für NS4 und MS5 gezeigt werden konnte, daß sie weiter zu HS4A, NS4B, NS5A und NS5B prozessiert werden können.
Die Strukturanalyse von HCV-Genomen zeigte die Existenz unterschiedlicher Genotypen, die in Typen und Subtypen eingeteilt wurden (Stuyver et al., 1993). Die Sequenzunterschiede sind über das gesamte Genom verteilt, einschließlich des 5'-nicht translatierten Bereichs. Die höchste Sequenzvariabilität wurde in den NS2- und 3'-nicht translatierten Bereichen sowie in den putativen Hüllbereichen beobachtet, die die E1- und E2-Proteine codieren. Der Kern, NS3 sowie gewisse Bereiche des NS4-Proteins zeigen deutlich weniger Unterschiede (Okamoto et al., 1992).
Humorale HCV-Antwort
Bereits kurz nach der Entdeckung des HCV standen Immunoassays zum Nachweis von im Kreislauf vorhandenen Antikörpern gegen HCV-Proteine in großem Ausmaß zur Verfügung. Diese Werkzeuge führten zu einer explosionsartigen Erweiterung des Kenntnisstandes auf dem Gebiet der menschlichen humoralen Immunantwort auf HCV unter unterschiedlichen Bedingungen. Sobald gezeigt werden konnte, daß HCV die Hauptursache für die Posttransfusionshepatitis von Nicht-A-, Nicht-B-Typ war, wurde die Suche nach Antikörpern gegen HCV zu der Liste der Sicherheits-Screeningtests von Blutprodukten hinzugefügt. Durch diese Vorgehensweise wurde nicht nur die Sicherheit von Bluttransfusionen erhöht, sondern auch die Kenntnisse über die Epidemiologie des Virus erweitert. Die Tatsache, daß HCV für einen großen Teil chronischer Infektionen der Leber verantwortlich ist, bei denen Bluttransfusion oder parenterale Injektion eine Rolle spielt, ist weiterhin eine große Herausforderung für weitere epidemiologische Untersuchungen. Die weitverbreitete Verwendung der Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV führt gleichfalls zur Identifizierung der Bereiche mit humoraler Antigenität des Virus. Die Beziehung zwischen Kinetik und Größe der humoralen Immunantwort auf die verschiedenen HCV-Proteine und dem Verlauf und Ausgang der Krankheit bedarf weiterhin der Aufklärung.
HCV-T-Zellen-Epitope
Die Immunantwort auf virale Antigene hängt fast ausschließlich von T-Zellen ab. T-Zellen werden sowohl für die Antikörperproduktion als auch für einige cytotoxische Reaktionen benötigt. HCV-codierte Proteine sind nicht nur auf dem Niveau der B-Zellen, sondern auch auf dem Niveau der T-Zellen immunogen.
Es liegen nur sehr wenige Arbeiten vor, in denen die zelluläre Immunantwort gegenüber HCV beschrieben wird. Von Lin et al. (1993) werden Kandidatensequenzen für T-Zellen-Epitope beschrieben, die in absolut konservierten Bereichen von HCV-Genen liegen und mittels einer Computerrecherche, bei der sich eine große Anzahl möglicher T-Zellen-Epitope ergab, erhalten wurden. Ebenso wurde berichtet, daß sich periphere Blutzellen-Monozyten (PBMC) aus mit HCV infizierten Personen als Reaktion auf HCV-rekombinante Proteine vermehren und daß periphere Reaktionen gegen das Kernprotein mit einem günstigen Verlauf der Infektion korrelieren (Botarelli et al., 1993). In der Leber von Patienten mit chronischer HCV-Infektion wurden HCV-spezifische, auf die HLA-Klasse I beschränkte cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) identifiziert und danach cloniert, die Epitope in E1- und NS2-Proteinen erkennen. Diese Untersuchungen konzentrierten sich hauptsächlich auf die Gewinnung von T-Zellklonen aus einzelnen Patienten und auf die. Lokalisierung der immunreaktiven Domäne für die einzelnen CTL-Klone. Solche Arbeiten führten zur Entdeckung des Epitops ASRCWVAM (AS 235-242) im aminoterminalen Teil des E1-Proteins sowie des Epitops LMALTLSPYYKRY (AS 826-838) aus dem NS2-Bereich (Koziel et al., 1992). In Patienten mit chronischer HCV-Hepatitis wurden intrahepatische CD4⁺-T-Zellen beobachtet, die das NS4-Protein von HCV spezifisch erkennen. Der Klonotyp dieser T-Lymphozyten konnten in den PBMC dieser Patienten nicht nachgewiesen werden (Minutello et al., 1993). Diese Arbeiten zeigen, daß bei Patienten mit HCV-Hepatitis HCV-spezifische T-Lymphozyten aus der infizierten Leber und dem peripheren Blut isoliert werden können. Ihre Rolle in der Pathogenese der Leberschädigung bei HCV-Hepatitis und ihre Relevanz hinsichtlich der Clearance oder Persistenz des Virus bedürfen noch der Aufklärung.
Zwar können gewisse Virusinfektionen durch die humorale Immunität allein neutralisiert werden, doch lassen sich die meisten mikrobiologischen Erreger nur mit Hilfe der zellulären Immunität aus dem Wirtsorganismus beseitigen. Selbst wenn die Neutralisierungskapazität der im Kreislauf befindlichen Antikörper bei bestimmten Infektionen etabliert ist, wird im allgemeinen die Aktivität der T-Helferzellen benötigt, damit die B-Zellen die zur Erreichung der Neutralisation und Clearance des infektiösen Erregers benötigten Antikörperkonzentrationen im Kreislauf produzieren können. Gewisse infektiöse Erreger lassen sich jedoch nur mittels zellulärer Immunität neutralisieren.
Im Fall des Hepatitis-C-Virus darf man annehmen, daß die T-Zellenimmunität für die Virus-Clearance erforderlich ist, da in den meisten Patienten die Krankheit einen chronischen Verlauf nimmt und da die meisten mit HCV infizierten Patienten eine humorale Immunität gegen die meisten der HCV-Antigene, die zur Diagnose der HCV-Infektion eingesetzt werden können, entwickelt haben, wie in den Patentanmeldungen Nr. EP-A-0 318 216, EP-A-0 388 232, EP-A-0 442 394, EP-A-0 484 787, EP-A-0 489 968 beschrieben. Doch konnte bei den meisten der Antikörper-positiven Patienten der Virus nicht aus dem Kreislauf beseitigt werden, da diese Patienten immer noch HCV-PCR-positiv sind und demzufolge die nachgewiesenen Antikörper weder einen Schutz boten noch ausreichten, das Virus zu neutralisieren. Möglicherweise sind Antikörper gegen andere Epitope, die zur Zeit nicht in den HCV-Diagnoseassays eingeschlossen sind, dazu in der Lage, die HCV-Infektion zu neutralisieren. Solche Epitope können auf den Virusmembranproteinen E1 und E2 lokalisiert sein, doch könnte ein Schutz gegen viele unterschiedliche HCV-Spezies durch die Hypervariabilität der HCV-Hüllenbereiche erschwert werden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, T-Zellen stimulierende Polypeptide und Peptide, die aus dem HCV-Strukturbereich stammen, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von T-Zellen stimulierenden Polypeptide und Peptiden, wie sie oben definiert sind, zur Verwendung bei der Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von aus dem HCV-Kernbereich stammenden T-Zellen stimulierenden Peptiden oder Polypeptiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von T-Zellen stimulierenden Peptiden oder Polypeptiden aus HCV, wie oben angegeben, die entweder T-Helferzellen-(CD4⁺-)Epitope und/oder CTL-(CD8⁺-)Epitope enthalten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von dieselbigen enthaltenden rekombinanten Polypeptiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von dieselbigen umfassenden therapeutischen ebenso wie prophylaktischen Zusammensetzungen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von die Polypeptide umfassenden prophylaktischen oder therapeutischen Zusammensetzungen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von auf denselbigen beruhenden Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer HCV-Infektion.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren, das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem Kernbereich des HCV-Polyproteins, umfaßt bzw. aus diesen besteht, wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und unter der Voraussetzung, daß sich das Polypeptid von allen bekannten, T-Zellen-Epitope enthaltenden HCV-Peptiden oder -Polypeptiden, die für einen der obenerwähnten Bereiche beschrieben wurden, unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und -Peptide werden für das Screening nach B-Zellen-Epitopen beschrieben. Solche Polypeptide und Peptide werden beispielsweise in EP-A-0 318 216, BP-A-0 388 232, EP-A-0 442 394, EP-A-0 484 787, EP-A-0 489 968, WO 92/22571, Lesniewski et al., 1993; Weiner et al., 1993; usw. erwähnt. Der Gehalt dieser Anmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben für Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung beschrieben wurden.
Der Ausdruck "HCV-immunogene Zusammensetzung" bezieht sich auf die Vorbeugung oder Behandlung einer HCV-Infektion.
Das Polypeptid ist vorzugsweise von RALAHGVRVLEDG verschieden.
Der Begriff "HCV-Polyprotein" bezieht sich auf alle im Fachgebiet offenbarten HCV-Polyproteine und ist in Okamoto et al., 1992, zusammenfassend beschrieben, wie z. B. das Typ-1a-HCV-Polyprotein des HC-J1-Isolats, wie z. B. das HCV-Polyprotein des Typ-2a-HC-J6-Isolats (Okamoto et al., 1991), das Typ-2b-HC-J8-Isolat (Okamoto et al., 1992). Gemäß dieser Definition sind alle bereits in einem der beschriebenen HCV-Bereiche beobachteten Variationen als Teil der Definition des HCV-Polyproteins zu betrachten. So sind beispielsweise zahlreiche Typen und Subtypen in Bukh et al., 1993, Bukh et al., 1994, Stuyver et al., 1993a, Stuyver et al., 1993b, Stuyver et al., 1994a, Stuyver et al., 1994c offenbart. Außerdem können konservative Substitutionen in diese erfindungsgemäßen HCV-Poly- proteine eingeführt werden. Der Begriff "konservative Substitution", wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerestes gegen einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Zu den konservativen Substitutionen zählen beispielsweise die Substitution eines hydrophoben Rests, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, gegen einen anderen hydrophoben Rest oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest, wie z. B. zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure oder zwischen Glutamin und Asparagin, usw. Der Begriff "konservative Substitution" umfaßt ebenfalls die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Ausgangsaminosäure, vorausgesetzt, daß gegen ein solches Polypeptid hergestellte Antikörper auch eine Immunreaktion mit dem entsprechenden Polypeptid mit der unsubstituierten Aminosäure eingehen.
Der Begriff "Antikörper" bezieht sich auf ein Molekül, ein Mitglied einer Familie glykosylierter Proteine Immunglobuline genannt, die spezifisch mit einem Antigen kombinieren können.
Das Wort "Antigen" wurde historisch als Bezeichnung für eine Einheit, die von einem Antikörper gebunden wird, und ebenfalls als Bezeichnung für die Einheit, die die Produktion des Antikörpers induziert, verwendet. Im neueren Sprachgebrauch beschränkt sich die Bedeutung von Antigen auf die von einem Antikörper gebundene Einheit, während das Wort "Immunogen" für die Einheit, die die Antikörperproduktion induziert, verwendet wird. Falls eine hier erörterte Einheit sowohl immunogenisch als auch antigenisch ist, wird auf sie typischerweise entsprechend ihrer beabsichtigten Nutzung entweder als Imunogen oder Antigen Bezug genommen.
Der Begriff "entspricht" in seinen verschiedenen grammatischen Formen, wie er hier im Zusammenhang mit Peptidsequenzen verwendet wird, bedeutet das beschriebene Peptid plus oder minus bis zu drei Aminosäureresten am Amino- oder Carboxyterminus oder an beiden Termini, wobei dieses nur konservative Substitutionen bei bestimmten Aminosäureresten entlang der Polypeptidsequenz enthält.
"Epitop" bezieht sich auf den Teil eines Moleküls, der spezifisch von einem T-Zellen-Antigenrezeptor oder einem Antikörper-Paratop gebunden wird.
Der Begriff "Immunreaktion eingehen" in seinen unterschiedlichen Formen bedeutet die Bindung zwischen einem Antigen als Liganden und einem Molekül, das ein Antikörper-Paratop enthält, wie z. B. einen Fab-Teil eines Gesamtantikörpers.
Der Ausdruck "T-Zellen stimulierendes Epitop" oder T-Zellen-Epitop gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein zur Stimulation von T-Zellen fähiges Epitop. Gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich ein T-Zellen stimulierendes Epitop auswählen, indem die lymphoproliferative Antwort (wie im Beispielteil ausgeführt) gegenüber Polypeptiden, die in ihrer Aminosäuresequenz wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem Kernbereich eines beliebigen HCV-Polyproteins stammen, enthalten, verfolgt wird. Die lymphoproliferative Antwort kann entweder mit einem T-Helfer-Assay gemessen werden, bei dem eine in-vitro-Stimulation von PMBC aus Patienten mit Hepatitis-C-Infektion mit unterschiedlichen Konzentrationen an den auf die T-Zellen stimulierende Aktivität zu testenden Peptiden durchgeführt und die Menge an aufgenommenem radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt wird. Die lymphoproliferative Antwort läßt sich auch mittels eines CTL-Assays messen, bei dem die lytische Aktivität cytotoxischer Zellen über die Freisetzung von ⁵¹Cr gemessen wird. Eine positive Proliferation wird angenommen, wenn der Stimulationsindex (cpm-Mittelwert Antigen-stimulierte Kulturen/cpm-Mittelwertkontrollkulturen) größer als 1, vorzugsweise größer als 2, und ganz besonders bevorzugt mehr als 3 beträgt. Um ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthaltendes Peptid auszuwählen, werden die Ergebnisse dieser lymphoproliferativen Assays miteinander verglichen und Polypeptide oder Peptide mit immundominantem T-Zellen-Epitop ausgewählt. Die Ergebnisse der lymphoproliferativen Assays gegen bestimmte Peptide können auch zwischen Patienten ohne Reaktion und Patienten mit einer Reaktion auf Interferon-α-Behandlung verglichen werden. Die lymphoproliferative Antwort gegenüber einer Reihe von synthetischen, sich überlappenden Peptiden, die die HCV-Kern-, E1- und E2/NS1-Sequenzen darstellen, sowie einem rekombinantem NS3-Protein wurde in 32 Patienten mit chronischer HCV-Hepatitis verfolgt, wie im Beispielteil der vorliegenden Erfindung offenbart.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung eine Auswahl immundominanter T-Zellen-Epitope aus einer Reihe von Antigenen, die den Kernbereich abdecken, dar. Aus dem Beispielteil wird deutlich, daß nicht nur die Peptidpools 2 und 3 und die Peptide NS1-5* und NS1-7*, sondern auch die Pools 4, 5, 6 und 9 sowie NS3 häufig eine Reaktion in HCV-Patienten hervorriefen (Tabelle 4), während in den Normalkontrollen mit denselben Polypeptiden nur selten eine Reaktivität beobachtet werden konnte (Tabelle 5). Aus den in Tabelle 4 dargestellten Daten ist ersichtlich, daß große Bereiche des HCV-Strukturbereichs, wie z. B. Pool 1 (Aminosäuren 5-72) und Pools 7 und 8 (Aminosäuren 427-578) geringe Reaktivität mit T-Zellen infizierter Patienten zeigen, selbst bei Patienten mit einer Reaktion auf IFN-α-Behandlung. Am bemerkenswertesten war jedoch die Feststellung, daß, während die dominate B-Zellantwort gegen Hepatitis-C im allgemeinen auf dem Aminoterminus des Kerns lokalisiert ist (siehe auch Tabelle 3), die dominante T-Zellantwort auf den carboxyterminalen Bereich des Kerns gerichtet ist (siehe Tabelle 4). In der Literatur lassen sich zahlreiche Beweise dafür finden, daß die carboxyterminale Hälfte des Kerns nur wenige oder keine B-Zellen-reaktiven Epitope enthält. Aufgrund der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein, beispielsweise Teile des carboxyterminalen Kernbereichs (die Aminosäuren 73-176 umfassend) in prophylaktische oder therapeutische Impfstoffzusammensetzungen noch mit einzubeziehen.
Die Wörter „Polypeptid" und „Peptid" lassen sich in der gesamten Beschreibung gegeneinander austauschen und bezeichnen eine lineare Folge von Aminosäuren, die über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren miteinander verbunden sind. Polypeptide können verschieden lang sein, entweder in ihrer natürlichen (ungeladenen) Form oder in Form von Salzen vorliegen, und sowohl frei von Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, Seitenkettenoxidation oder Phosphorylierung, sein oder diese Modifikationen enthalten. Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß Aminosäurensequenzen saure und basische Gruppe enthalten und daß der in dem Peptid vorliegende bestimmte Ionisierungszustand vom pH-Wert des umgebenden Mediums, wenn das Protein in Lösung vorliegt, oder dem des Mediums, aus dem es gewonnen wurde, wenn das Protein in Festform vorliegt, abhängt. Die Definition umfaßt ebenfalls Proteine, die durch zusätzliche, an die Aminosäureseitenketten gebundenen Substituenten, wie z. B. Glykosyleinheiten, Lipide oder anorganische Ionen wie z. B. Phosphate, modifiziert sind ebenso wie Modifikationen, die im Zusammenhang mit chemischen Umwandlungen an den Ketten, wie z. B. Oxidation von Sulfhydrylgruppen, stehen. Somit soll „Polypeptide" bzw. die dazu äquivalenten Begriffe die entsprechende, damit bezeichnete Aminosäuresequenz umfassen, vorbehaltlich derjenigen der vorhergehenden Modifikationen, die ihre Funktionalität nicht zerstören.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, und unter diesen insbesondere die kürzeren Peptide, lassen sich über die klassische chemische Synthese herstellen. Die Synthese kann in homogener Lösung oder an der Festphase durchgeführt werden.
So handelt es sich beispielsweise bei der in homogener Lösung anwendbaren Synthesetechnik um diejenige, die von Houbenweyl in dem Buch mit dem Titel „Methode der organischen Chemie", herausgegeben von B. Wunsh, Bd. 15-I und II. THIEME, Stuttgart 1974, beschrieben ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich auch an der Festphase gemäß den von Atherton und Shepard in ihrem Buch mit dem Titel „Solid Phase Peptide Synthesis" [Festphasen-Peptidsynthese] (IRL Press, Oxford, 1989) beschriebenen Verfahren herstellen.
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung lassen sich ebenfalls mittels rekombinanter DNA-Techniken, wie sie unten aufgeführt sind, herstellen.
Die Polypeptide oder Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können, wie oben angegeben, unterschiedliche Längen aufweisen. Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten wenigstens 8 aufeinanderfolgende HCV-Aminosäuren. Die Peptide besitzen eine bevorzugte Länge von 8, 9, 10 oder mehr (z. B. 15, 20, usw.) Aminosäureresten.
Der Ausdruck „umfaßt zwischen den Aminosäuren X bis Y" schließt die Aminosäure X und die Aminosäure Y mit ein.
Die Nummerierung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten HCV-Polyproteins bezieht sich auf die Nummerierung, wie sie für das HCV-J-Isolat gemäß Kato et al., 1990 verwendet wurde. Alle anderen im Fachgebiet bekannten HCV-Isolate können an dieser Sequenz ausgerichtet werden, so daß sich die Nummerierung für jedes einzelne HCV-Isolat auf das HCV-Polyprotein bezieht. So ist beispielsweise bekannt, daß Typ-2-Isolate 4 zusätzliche Codons/Aminosäuren in ihrer E2-Sequenz enthalten können, während Typ-3-Sequenzen eine Insertion von 2 Aminosäuren verglichen mit Typ-1-Sequenzen aufweisen.
Im Beispielteil der vorliegenden Erfindung werden T-Zellen-Epitope beschrieben, die unter anderem in den folgenden Bereichen des HCV-Strukturbereichs liegen: dem carboxyterminalen Bereich des Kernproteins (AS 73-176), den Aminosäuren 192 bis 383 des E1-Bereichs, Aminosäuren 397 und 428 sowie Aminosäuren 571 bis 638 des E2-Bereichs, den Aminosäuren 1188 bis 1463 des NS3-Bereichs. Gruppen von Peptiden, die Teile des Kern- und des E2-Strukturproteins sowie das vollständige E1-Protein abdecken, wurden ebenso wie ein rekombinantes NS3-Protein untersucht. Die Peptide wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt, als. Gruppe 1 (AS 5-80), Gruppe 2 (AS 73-140), Gruppe 3 (AS 133-200), Gruppe 4 (AS 193-260), Gruppe 5 (AS 253-332), Gruppe 6 (AS 325-392), Gruppe 7 (AS 427-494), Gruppe 8 (AS 487-578) sowie Gruppe 9 (AS 571-638) getestet. Das rekombinante NS3 umfaßte die Aminosäuren 1188 bis 1463 des zur HCV-Subtypgruppe 1b gehörenden Isolats IG8309.
Die T-Zellantwort gegenüber den Gruppe-3-Peptiden ebenso wie gegenüber den Einzelpeptiden NS1-7* und MS1-5* zeigt eine statistisch signifikante Korrelation mit einer Abnahme der Alanin-Aminotransferase-(ALT) und viralen RNA-Niveaus, die nach allgemeiner Auffassung einen eher milden Krankheitsverlauf anzeigen. Eine Korrelation zwischen der Antwort gegenüber einem „rekombinanten HCV-Kernprotein" und einem eher milden Krankheitsverlauf wurde von Botarelli et al. 1993 beschrieben. Doch wurden in Botarelli et al., 1993 weder Epitope markiert noch die Sequenz und genaue Position des rekombinanten Kernproteins beschrieben. In der vorliegenden Erfindung wurde eine ähnliche T-Zell- antwort gegenüber den Gruppe-2-Peptiden (AS 73-140) sowohl in Patienten mit einer Reaktion auf IFN-α als auch in Patienten ohne Reaktion darauf beobachtet. Im Gegenteil wurde in Patienten mit einer Reaktion auf Interferon-α eine T-Zellreaktivität gegenüber den Gruppe-3-Peptiden (AS 133-200) beobachtet, die sich von der in Patienten ohne Reaktion auf die IFN-α-Behandlung beobachtete T-Zellreaktivität gegenüber diesem Bereich unterschied. Weiterhin konnte nach Untersuchung der Reaktivität einzelner Peptide aus den Gruppen 2 und 3 diese spezifische, mit einem eher milden Verlauf der HCV-Infektion korrelierende Antwort mit spezifischen einzelnen Peptiden mit der Bezeichnung LORE 23, LORE 25 bzw. CORE 27 weiter kartieren. Das zu den Gruppe-2-Peptiden gehörende Peptid CORE 19 wurde ebenfalls von einigen der Patienten mit Reaktion auf die IFN-α-Behandlung erkannt (siehe 1).
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich vorzugsweise von RALAHGVRVLEDG, das die Positionen 149 bis 161 des HCV-Kernbereichs umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-Immunogenzusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 157 bis 176 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt bzw. aus diesem besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellenstimulierendes Epitop enthalten und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 13 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert und worin X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I und X₃₄ für F oder Y, X₃₅ für A oder P, X₃₆ für L oder I steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-Immunogenzusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 157 bis 176 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 145 bis 164 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 12 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E, X₂₉ für A oder E, X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I und X₃₄ für F oder Y steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 145 bis 164 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Die Vorliegende Erfindung berücksichtigt ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 133 bis 152 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 11 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁₉ für M oder I, X₂₀ für G oder E, X₂₁ für L oder V oder I, X₂₂ für V oder L, X₂₃ für A oder G, X₂₄ für L, V oder I, X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E und X₂₉ für A oder E steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 133 bis 152 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt, bzw. aus diesen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 109 bis 128 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 9 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁₁ für P oder Q, X₁₂ für N oder T, X₁₃ für R oder H, X₁₄ für R oder K, X₁₅ für L oder V oder F, X₁₈ für K oder R und X₁₇ für L oder I steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 109 bis 128 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von den folgenden Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von den folgenden Peptiden gewählt wird:
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid mindestens 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 73 bis 92 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 6 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁ für R oder K, X₂ für A, S oder T, X₃ für A oder G, X₄ für Q, K oder R, X₅ für Y oder H, X₆ für G oder A, X₇ für E oder K und X₈ für C, M oder L seht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid mindestens 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 73 bis 92 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid ausgewählt wird aus:
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die wie oben beschriebene Verwendung zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid ausgewählt wird aus:
.
Die vorliegende Erfindung betrifft besonders bevorzugt eine der obenerwähnten Verwendungen, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein T-Zellen-Helferepitop handelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine der obenerwähnten Verwendungen, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein CTL-Epitop handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine der obenerwähnten Verwendungen, wobei das Polypeptid in eine prophylaktische Impfstoffzusammensetzung integriert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine der obenerwähnten Verwendungen, wobei Polypeptid in eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung integriert wird.
Darüber hinaus berücksichtigt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Polypeptid, bestehend aus mehrfachen Wiederholungen, Kombinationen oder Mimotopen einer beliebigen der aufgrund der in ihnen enthaltenen, eine T-Zelle stimulierenden Epitope gemäß der oben angegebenen Bedeutung ausgewählten Sequenzen aus aufeinanderfolgenden Aminosäuren, wobei die Kombinationen zwei oder mehrere, zu einer einzigen Struktur verbundene Peptide umfassen und wobei die Mimotope verglichen mit den Peptiden eine oder mehrere Aminosäurevariationen aufweisen, solange die mimotopischen Peptide in der Lage sind, für eine immunologische Stimulierung zu sorgen, wonach die T-Zellen mit wenigstens einem HCV-Stamm reagieren.
Der Begriff "Mimotope" bezieht sich auf Peptide, die die wie oben definierten Polypeptide immunologisch imitieren. Da bei HCV eine Sequenzvariabilität beobachtet wurde, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um so die Epitope unterschiedlicher Stämme besser zu imitieren. Es sollte sich verstehen, daß solche Mimotope nicht mit einer bestimmten HCV-Sequenz identisch zu sein brauchen, solange die betreffenden Verbindungen in der Lage sind, für eine immunologische Stimulierung zu sorgen, wonach die T-Zellen mit wenigstens einem HCV-Stamm reagieren. Die wie oben beschriebenen Polypeptide können daher Insertionen, Deletionen und konservativen ebenso wie nicht konservativen Aminosäuresubstitutionen unterzogen werden, wenn solche Änderungen für gewisse Vorteile bei ihrer Verwendung sorgen könnten. Die Peptide sind vorzugsweise so kurz wie möglich, während sie dennoch die gesamte Empfindlichkeit der größeren Sequenz besitzen. In gewissen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere Peptide zu einer einzigen Struktur zu verbinden. Dabei können an der Bildung einer solchen Verbundstruktur kovalente oder nicht kovalente Verknüpfungen beteiligt sein.
Die vorliegende Erfindung berücksichtigt ebenfalls die wie oben definierten Verwendungen, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein rekombinantes Polypeptid handelt, das mittels eines eine für ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung codierende Nukleinsäureinsertion enthaltenden Expressionsvektors exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines eine für eine Polypeptid mit der hierin angegebenen Bedeutung codierende Nukleinsäureinsertion enthaltenden rekombinanten Expressionsvektors zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung. Zur Durchführung der Expression der erfindungsgemäßen, T-Zellen enthaltenden Polypeptide in Bakterien wie z. B. E. coli oder in eukaryontischen Zellen, wie z. B. in S. cerevisiae, oder in kultivierten Vertebraten- oder Invertebraten-Wirtszellen, wie z. B. Insektenzellen, CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen, COS1-, BHK- und MDCK-Zellen, werden die folgenden Schritte ausgeführt:

– Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor oder mittels Adenoviren, Influenzaviren, BCG und anderer lebender Trägersysteme, in die eine für eines der erfindungsgemäßen Polypeptide codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente, insbesondere eines von den Polymerasen der Wirtszelle oder des lebenden Trägersystems sowie, im Fall eines prokaryontischen Wirts, einer geeigneten ribosomalen Bindungsstelle (RBS), inseriert wurde, wodurch die Expression der Nukleotidsequenz in der Wirtszelle ermöglicht wird,
– Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der Insertion ermöglichen. Rekombinante Virusvektoren oder lebende Trägervektoren können ebenfalls direkt als lebende Impfstoffe in Menschen verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform berücksichtigt die vorliegende Erfindung eine der wie oben definierten Verwendungen, wobei das Polypeptid mit einem mit dem Krankheitserreger in Zusammenhang stehenden Immunogen, wie z. B. den HCV-Hüllproteinen E1 und E2 oder den HCV-Immunogenen NS3, NS4 oder NS5 oder einem ein B-Zellen-Epitop enthaltenden HCV-Peptid, operativ verknüpft ist.
Die Phrase "operativ verknüpft", wie sie hier verwendet wird, bedeutet, daß die Verknüpfung nicht die Fähigkeit einer der beiden verknüpften Gruppen, wie beschrieben, beispielsweise als T- oder B-Zellen-Determinante, zu funktionieren, stört. Somit umfaßt das operative Verknüpfen nicht nur kovalente Verknüpfungen sondern auch Verknüpfungen, die eine T-Zellfunktion induzieren können.
Die Phrase "mit der Krankheitserreger in Zusammenhang stehenden", wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet ein Polypeptid, das die T-Zellfunktion, die eine Immunreaktion mit einem Krankheitserreger in nativer Form eingeht, induzieren kann.
Die definierten Polypeptide lassen sich allein oder in Kombination mit HCV-B-Zellen-Epitopen, HBsAg- oder HBcAg-Partikeln, HBV-Immunogenen, HIV-Immunogenen, HTLV-Immunogenen einsetzen. Bevorzugte B-Zellen-Epitope enthaltende HCV-Peptide sind beispielsweise in EP-A- 489 968 und WO 93/18054 näher beschrieben.
Verfahren zur operativen Verknüpfung einzelner Polypeptide über eine Aminosäurerest-Seitenkette unter Bildung eines immunogenen Konjugats, d. h. eines verzweigtkettigen Polypeptidpolymers, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu diesen Verfahren gehören die Verknüpfung über eine oder mehrere Arten von funktionellen Gruppen an verschiedenen Seitenketten, wodurch die betreffenden Polypeptidgrundgerüste kovalent miteinander verknüpft (gekuppelt) werden, doch durch wenigstens eine Seitenkette voneinander getrennt sind.
Zu den geeigneten funktionellen Seitenkettengruppen gehören epsilon-Aminogruppen, beta- oder gamma- Carboxylgruppen, Thiol(-SH)-Gruppen und aromatische Ringe (z. B. Tyrosin und Histidin). Verfahren zur Verknüpfung von Polypeptiden unter Verwendung einer der obigen funktionellen Gruppen sind in Erlanger (1980), Aurameas et al. (1978) und der US-Patentschrift Nr. 4,493,795 von Nestor et al. beschrieben. Darüber hinaus läßt sich eine stellengerichtete Kupplungsreaktion, wie in Rodwell et al. (1985) beschrieben, durchführen, so daß die biologische Aktivität der Polypeptide nicht wesentlich vermindert ist.
Weiterhin lassen sich, wie im Fachgebiet allgemein bekannt, das HBcAg-Protein-Immunogen und -Polypeptid-Immunogen in ihrer nativen Form verwenden, oder ihr Gehalt an funktionellen Gruppen läßt sich durch Succinylierung von Lysinresten oder Umsetzung mit Cystein-Thiolacton modifizieren. Ebenso kann eine Sulfhydrylgruppe in jeweils eines der beiden Polypeptide durch Umsetzung von Aminofunktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(3-Dithiopyridyl)propionat eingebaut werden. Die Polypeptide lassen sich ebenfalls so modifizieren, daß Spacer-Arme, wie z. B. Hexamethylendiamin oder andere bifunktionelle Moleküle ähnlicher Größe, eingebaut werden können, um die Verknüpfung zu erleichtern.
Alle Polypeptid-Immunogene, gegen die man Antikörper produzieren möchte, lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Polypeptidprotein unter Bildung eines erfindungsgemäßen immunogenen Konjugats verknüpfen. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Polypeptid-Immunogen um ein mit dem Krankheitserreger in Zusammenhang stehendes Immunogen, wobei das Konjugat dazu in der Lage ist, die Produktion von Antikörpern, die mit dem Krankheitserreger eine Immunreaktion eingehen können, wenn es in einer wirksamen Menge in ein Tier injiziert wird. Beispielhafte Immunogene von besonderer Bedeutung stammen aus Bakterien, wie z. B. B. pertussis, S. typosa, S. Parathypoid A und B, C, diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, V. cholerae, N. meningitides, N. gonorrhea, H. influenzae, T. palladium u. ä.; Immunogene, die aus Viren stammen, wie z. B. Poliovirus, Adenovirus, Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, RS-Virus (Respiratory Syncytical Virus), Influenzavirus, Equin-Encephalomyelitis-Virus, Schweinepestvirus, Newcastle-Virus, Hühnerpocken-Virus, Tollwutvirus, Katzen- und Hundestaupenviren, Maul- und Klauenseuche-Virus, Immunschwächeviren von Mensch und Affe, u. ä.; Rickettsien-Immunogene, wie z. B. epidemischer und endemischer Typhus, sowie die Fleckfiebergruppen, u. ä. Immunogene sind im Stand der Technik durch zahlreiche Literaturstellen wie z. B. US-Patentschriften Nr. 3,149,036, Nr. 3,983,228 und Nr. 4,069,313; in Essential Immunology, 3. Aufl., von Roit, veröffentlicht bei Blackwell Scientific Publications; in Fundamentals of Clinical Immunology, von Alexander und Good, veröffentlicht bei W. B. Saunders; und in Immunology, von Bellanti, veröffentlicht bei W. B. Saunders allgemein bekannt. Die in US-Patentschriften Nr. 4,625,015, Nr. 4,544,500, Nr. 4,545,931, Nr. 4,663,436, Nr. 4,631,191, Nr. 4,629,783 und in der internationalen Veröffentlichung PCT-Nr. WO87/02775 und -Nr. WO87/02892, deren Offenbarungen hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Peptid, bestehend aus mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz eines beliebigen der folgenden Peptide, wobei die Peptide ein T-Zellen-Epitop enthalten:
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 13 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 12 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 11 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 9 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 6 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert; worin X₁ für R oder K, X₂ für A, S oder T, X₃ für A oder G, X₄ für Q, K oder R, X₅ für Y oder H, X₆ für G oder A, X₇ für E oder K, X₈ für C, M oder L, X₉ für W oder L, X₁₀ für S, N, T, D oder H, X₁₁ für P oder Q, X₁₂ für N oder T, X₁₃ für R oder H, X₁₄ für R oder K, X₁₅ für L oder V oder F, X₁₆ für K oder R, X₁₇ für L oder I, X₁₈ für F oder L, X₁₉ für M oder I, X₂₀ für G oder E, X₂₁ für L oder V oder I, X₂₂ für V oder L, X₂₃ für A oder G, X₂₄ für L, V oder I, X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E, X₂₉ für A oder E, X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I, X₃₄ für F oder Y, X₃₅ für A oder P und X₃₆ für L oder I steht .
Außerdem berücksichtigt die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung, bestehend aus bzw. umfassend wenigstens eines der mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff vermischten Polypeptide mit der obigen Bedeutung.
Vor Verabreichung an den Patienten können die Palypeptide oder Peptide der vorliegenden Erfindung mit Formulierungsstoffen versetzt werden. Eine Flüssigformulierung ist bevorzugt. Zu diesen Formulierungsstoffen gehören beispielsweise Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, Tenside oder Füllstoffe. Zu den bevorzugten Kohlenhydraten gehören Zucker oder Zuckeralkohole, wie z. B. Mono-, Di- oder Polysaccharide oder wasserlösliche Glukane. Die Saccharide oder Glukane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Saccharose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha- und beta-Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose sowie Gemische davon umfassen. Ganz besonders bevorzugt ist Saccharose. „Zuckeralkohol" ist als C4- bis C8-Kohlenwasserstoff mit einer -OH-Gruppe definiert und umfaßt Galaktit, Inosit, Mannit, Xylit, Sorbit, Glycerin und Arabit. Ganz besonders bevorzugt ist Mannit. Diese obenerwähnten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Es gibt keine festgelegte Grenze für, die verwendete Menge, solange der Zucker bzw. Zuckeralkohol in der wäßrigen Zubereitung löslich ist. Vorzugsweise liegt die Zucker- bzw. Zuckeralkoholkonzentration zwischen 1,0% (w/v) und 7,0% (w/v), besonders bevorzugt zwischen 2,0 und 6,0% (w/v). Zu den bevorzugten Aminosäuren gehören linksdrehende (L-) Formen von Carnitin, Arginin und Betain; es können jedoch auch andere Aminosäuren zugegeben werden. Zu den bevorzugten Polymeren gehören Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2000 und 3000 oder Polyethylenglykol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3000 und 5000. Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung eines Puffers in der Zusammensetzung, um pH-Änderungen vor der Lyophilisierung bzw. nach der Rekonstituierung zu minimieren. Fast alle physiologischen Puffer können verwendet werden, doch sind Citrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamatpuffer oder Gemische davon bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt ist Citratpuffer. Die Konzentration reicht vorzugsweise von 0,01 bis 0,3 M. Tenside, mit denen die Formulierung versetzt werden kann, sind in den EP-Patentanmeldungen Nr. EP 0 270 799 und EP 0 268 110 aufgeführt.
Darüber hinaus können Polypeptide durch kovalente Konjugation an einen Polymer chemisch modifiziert werden, beispielsweise um ihre Kreislauf-Halbwertszeit zu erhöhen. Bevorzugte Polymere sowie Verfahren zu deren Bindung an Peptide sind in den US-Patentschriften Nr. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 und 4,609,546 aufgeführt. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglykol (PEG). PEG ist bei Raumtemperatur wasserlöslich und besitzt die allgemeine Formel: R(O-CH₂-CH₂)_nO-R, wobei R für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, wie z. B. eine Alkyl- oder Alkanolgruppe, stehen kann. Vorzugsweise weist die Schutzgruppe zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatome auf und ist besonders bevorzugt Methyl. Bei dem Symbol n handelt es sich um eine positive ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1000, besonders bevorzugt zwischen 2 und 500. Das PEG besitzt ein bevorzugtes mittleres Molekulargewicht zwischen 1000 und 40000, besonders bevorzugt zwischen 2000 und 20000 und ganz besonders bevorzugt zwischen 3000 und 12000. Vorzugsweise weist PEG wenigstens eine Hydroxygruppe auf, wobei es sich ganz besonders bevorzugt um eine terminale Hydroxygruppe handelt. Es ist diese Hydroxygruppe, die vorzugsweise aktiviert wird. Es versteht sich jedoch, daß die Art und Menge der reaktiven Gruppen zur Erzielung eines kovalent konjugierten PEG/Polypeptid-Moleküls der vorliegenden variiert werden können.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind ebenfalls erfindungsgemäß geeignet. Zu diesen gehören polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glucose, polyoxyethyliertes Glycerin (POG), usw. POG ist bevorzugt, wobei einer der Gründe dafür ist, daß es sich bei dem Glyceringrundgerüst des polyoxyethylierten Glycerins um das gleiche Grundgerüst handelt, das natürlicherweise beispielsweise in Mono-, Di- und Triglycerinen in Tieren und Menschen vorkommt. Daher würde diese Verzweigung im Körper nicht unbedingt als Fremdsubstanz angesehen werden. Das POG besitzt ein bevorzugtes Molekulargewicht im gleichen Bereich wie PEG. Die Struktur für POG ist in Knauf et al., 1988, gezeigt, und die POG/IL-2-Konjugate werden in der US-Patentschrift Nr. 4,766,106 erörtert.
Ein weiteres Medikamentenzuführsystem zur Erhöhung der Kreislauf-Halbwertszeit ist das Liposom. Verfahren zur Herstellung von Liposomenzuführsystemen werden in Gabizon et al., 1982; und Szoka, 1980, erörtert. Weitere Medikamentenzuführsysteme sind im Fachgebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Poznansky, 1984.
Nach Herstellung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung wird diese vorzugsweise lyophilisiert, um einen Abbau zu verhindern und die Sterilität aufrechtzuerhalten. Verfahren zur Lyophilisierung flüssiger Zusammensetzungen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Unmittelbar vor Gebrauch kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (z. B. Ringer-Lösung, destilliertes Wasser oder sterile Kochsalzlösung), das zusätzliche Bestandteile enthalten kann, rekonstituiert werden. Nach der Rekonstituierung wird die Zusammensetzung vorzugsweise unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Verfahren an Patienten verabreicht.
Wie oben angegeben werden die erfindungsgemäßen Polypeptide und Zusammensetzungen für die Behandlung menschlicher Patienten zur Vorbeugung gegen die oder zur Behandlung der oben definierten Krankheitszustände verwendet. Dabei erfolgt die Verabreichung vorzugsweise auf parenteralem Wege. Bei der parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer als Einheitsdosis injizierbaren Form, wie z. B. als Lösung, Suspension oder Emulsion, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen parenteralen Vehikel formuliert. Solche Vehikel sind von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch und sind beispielsweise Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Hanks-Lösung. Nichtwäßrige Vehikel, wie z. B. fette Öle und Ölsäureethylester, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugtes Vehikel ist 5% Dextrose in Kochsalzlösung. Das Vehikel kann geringe Mengen an Zusatzstoffen, wie z. B. Substanzen zur Verbesserung der Isotonizität und chemischen Stabilität, einschließlich Puffern und Konservierungsstoffen, enthalten.
Die Dosierung und Art der Verabreichung hängt von dem einzelnen Patienten ab.
Insbesondere berücksichtigt die Erfindung eine wie oben definierte Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung gegen HCV, bei dem eine ausreichende Menge mindestens eines der wie oben definierten Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch unbedenklichen Adjuvantien verabreicht wird, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Insbesondere handelt es sich bei der immunogenen Zusammensetzung um eine Impfstoffzusammensetzung. Vor allem handelt es sich bei der Impfstoffzusammensetzung um eine prophylaktische Impfstoffzusammensetzung. Alternativ dazu kann es sich bei der Impfstoffzusammensetzung auch um eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung handeln.
Die prophylaktische Impfstoffzusammensetzung bezieht sich auf eine Impfstoffzusammensetzung, die auf die Vorbeugung gegen eine HCV-Tnfektion gerichtet ist und an Normalpersonen, die nicht mit HCV infiziert sind, verabreicht werden sollte.
Die therapeutische Impfstoffzusammensetzung bezieht sich auf eine Impfstoffzusammensetzung, die auf die Behandlung einer HCV-Infektion gerichtet ist und an Patienten, die mit HCV infiziert sind, verabreicht werden sollte.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide lassen sich mit Lipid (Lipopeptiden, z. B. PAM₃Cys) modifizieren und mit Alum, Monophosphoryllipid A, Pluronics, SAF1, Ribi, Trehalose-6,6-dimycolat oder weiteren immunstimulierenden, dem Fachmann bekannten Verbindungen formulieren, um ihre Immunogenizität zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung berücksichtigt ebenfalls gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eine wie oben definierte Zusammensetzung, wobei diese Zusammensetzung zusätzlich zu einem der wie oben definierten T-Zellen stimulierenden Polypeptide ein Peptid oder Polypeptid, das wenigstens ein HCV-B-Zellen-Epitop enthält, und/oder ein HCV-Strukturpolypeptid und/oder ein nicht strukturelles HCV-Polypeptid umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform berücksichtigt die vorliegende Erfindung eine wie oben definierte Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von HCV, bei dem eine ausreichende Menge mindestens eines der wie oben definierten Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch unbedenklichen Adjuvantien verabreicht wird, um die Behandlung der HCV-Infektion zu gestatten. In diesem Fall lassen sich die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Form eines therapeutischen Impfstoffs einsetzen, wobei das Ziel die Induktion eines ausreichend hohen T-Zellfunktionsniveaus für die Clearance der Hepatitis-C-Virusinfektion ist.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform berücksichtigt die vorliegende Erfindung eine wie oben definierte Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung zusätzlich zu einem beliebigen der wie oben definierten Polypeptide ein Peptid oder Polypeptid, das wenigstens ein HCV-B-Zellen-Epitop enthält, und/oder ein HCV-Srukturpolypeptid und/oder ein nicht strukturelles HCV-Polypeptid umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform berücksichtigt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, worin die wie oben definierten Polypeptide mit HBsAg- oder HBcAg-Partikeln, HBV-Immunogenen, HIV-Immunogenen und/oder HTLV-Immunogenen vermischt vorliegen.
Erläuterungen zu den Figuren
1: Entwicklung der lymphoproliferativen Antworten und Transaminaseaktivitäten in HCV-Patient Nr. 632. AST bezeichnet Aspartat-Aminotransferase, ALT bezeichnet Alanin-Aminotransferase; SI: Simulationsindex; P1 bis P6 bezieht sich auf die Peptidgruppen 1 bis 6, wie sie in Tabelle 1 offenbart sind.
2: Häufigkeiten der Lympyhoproliferationsantworten gegenüber Peptidpools 1-9, Einzelpeptiden NS1-7*, NS1-5* und rekombinantem NS3-Protein in gesunden Kontrollpersonen, Patienten mit Reaktion auf Interferon (IFN) und Patienten ohne Reaktion auf IFN.
3: stellt die Teilsequenz des Isolats IG8309, die getestet wurde, dar, wobei dieser Teil von Gly in Position 41 bis Ser in Position 318 reicht (SEQ ID NO 57).
4: zeigt eine Gegenüberstellung der HCV-Strukturbereiche.
5: Gegenüberstellung der die Aminosäurepositionen 571 bis 638 umfassenden E2-Bereiche.
6: Gegenüberstellung der die Aminosäurepositionen 1188 bis 1465 umfassenden NS3-Sequenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1. Untersuchte Patienten
Bei den untersuchten Patienten handelte es sich um 19 männliche und 13 weibliche Patienten im Alter zwischen 27 und 71 Jahren (Durchschnittsalter: 49,9 Jahre). Die Diagnose der chronischen HCV-Hepatitis beruhte auf a) einer dokumentierten Erhöhung der Alanin-Aminotransferase um das Zweifache über der normalen Obergrenze über einen Zeitraum von wenigstens sechs Monaten; b) der Anwesenheit HCV-spezifischer Serumantikörper, die mittels zweier Enzymimmunoassay- Tests der zweiten Generation (UB1-Test und Innotest HCV AbII, Innogenetics, Antwerpen, Belgien) und c) der Abwesenheit klinischer, histologischer oder serologischer Anzeichen einer anderen vitalen, toxischen, metabolischen, ererbten oder Autoimmun-Hepatitis. Die Patienten wurden willkürlich ausgewählt, um entweder die Standardbehandlung, bestehend aus der dreimal wöchentlichen Gabe von 3 Millionen Einheiten Interferon α-2b (INTRON A) über 24 Wochen, oder eine experimentelle Behandlung, bestehend aus einer Induktionsphase mit dreimal wöchentlich 6 Millionen Einheiten Interferon α-2b über 8 Wochen, gefolgt von einer Aufrechterhaltungsphase mit dreimal wöchentlich titrierten Dosen von 6 bis 1 Million Einheiten Interferon, bis die biochemische und virologische Remission erreicht wurde (Alanin-Aminotransferaseaktivität normal, Hepatitis-C-Virus-RNA im Plasma nicht nachweisbar), zu erhalten. Als Patienten mit einer klinischen Reaktion werden jene betrachtet, bei denen eine Normalisierung der Alanin-Aminotransferaseaktivität bei wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Kontrollbesuchen während der Behandlung in einem Abstand von wenigstens einem Monat beobachtet wurde.
Als Kontrollpersonen für die Spezifität der lymphoproliferativen Antworten wurden 18 gesunde Individuen im Alter von 25–58 Jahren (Durchschnitt 38,6 Jahre), von denen 10 männlich und 8 weiblich waren, ausgewählt. Diese Versuchspersonen waren negativ hinsichtlich HCV-Antikörpern und HCV-RNA. Eine Versuchsperson hatte eine Vongeschichte einer vergangenen Hepatitis-B-Virusinfektion und 7 besaßen Antikörper gegen HBsAg als Ergebnis einer Impfung.
An allen Patienten wurde eine Leberbiopsie vor dem Start der Interferon-α-Therapie vorgenommen. Der histologische Status wurde gemäß der herkömmlichen histologischen Klassifizierung definiert (Knodell et al., 1981).
Auf Grundlage der oben gegebenen Definition von Patienten mit klinischen Reaktion konnten 18 Versuchspersonen als Patienten mit klinischer Reaktion auf Interferon-α betrachtet werden. Die dabei am meisten relevanten klinischen, pathologischen und virologischen Daten für beide Gruppen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Obwohl die Gruppe mit einer Reaktion mehr Frauen und die Gruppe ohne Reaktion mehr Männer, als theoretisch erwartet, umfaßte, waren die beobachteten Unregelmäßigkeiten nicht signifikant (X²-Test). Die Krankheitsdauer für jede Versuchsperson wurde auf Grundlage der Anamnesedaten (Operation mit mehreren Transfusionen, intravenöser Drogenmißbrauch, arbeitsbedingte Exposition durch Stechen mit einer Nadel, usw.) oder Patientenkarteidaten, die chronisch schwankende und erhöhte Transaminasespiegel zeigen, abgeschätzt. Die Krankheitsdauer variierte von einem Jahr bis 32 Jahre. Die durchschnittliche Krankheitsdauer betrug 9,219,2 Jahre in Patienten mit Reaktion und 6,815,4 Jahre in Patienten ohne Reaktion. Obwohl die Gruppe mit Reaktion mehr Versuchspersonen umfaßte, die nach der experimentellen Vorschrift behandelt worden waren, und die Gruppe ohne Reaktion mehr Versuchspersonen umfaßte, die nach der Standardvorschrift behandelt worden waren, war die Unregelmäßigkeit nicht signifikant (X²-Test). Sechsundzwanzig von 32 Patienten (81%) waren mit HCV-Genotyp 1b infiziert. Die Genotypen 3a, 4a und 5a wurden in 4, 1 bzw. 1 Versuchsperson(en) gefunden. Die Anamnesedaten gestatteten uns, Informationen über die Infektionsquelle zu sammeln. Bluttransfusionen sind die mögliche Quelle der HCV-Infektion in 14 Versuchspersonen, IV-Drogenmißbrauch in 3 Patienten und Unfälle durch Stechen mit einer Nadel in 3 weiteren Personen. In 12 Versuchspersonen konnte die Infektionsquelle nicht zurückverfolgt werden. Die meisten Patienten (20 von 32) zeigten pathologische Läsionen, die mit chronischer aktiver Hepatitis in milder, gemäßigter oder schwerer Form vereinbar waren. Sieben Patienten zeigten Anzeichen einer chronischen anhaltenden Hepatitis. In zwei Versuchspersonen zeigte die Biopsie nur aspezifische Läsionen, und in zwei weiteren Personen wurden Anzeichen von Leberzirrhose beobachtet.
Beispiel 2. Analyse der humoralen Immunantwort
Zum Nachweis von Antikörpern gegen Peptidepitope aus dem Kern-, NS4a+b- bzw. NS5a-Bereich wurde INNO-LIA HCV AbII (Innogenetics, Belgien) verwendet. Von jedem Patienten wurde eine vor dem Start der Interferontherapie gewonnene Serumprobe untersucht, wobei manchmal auch zusätzliche Folgeproben getestet wurden. Alle 32 untersuchten Patienten besaßen zirkulierende Antikörper gegen HCV, was mit zwei kommerziell erhältlichen Enzymimmunoassays demonstriert wurde. Mit einem Immunoblotassay auf Peptidbasis (INNO-LIA HCV AbII) war es möglich, die Spezifitäten dieser Antikörper teilweise zu definieren. Die Seren aus 31 Patienten wurden wenigstens einmal mit diesem Assay untersucht, und in 20 Versuchspersonen wurde der Assay auf zwei Seren, die im Abstand von 4 (Patient 635) bis 124 Wochen (Patient 606) entnommen wurden, angewandt. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse dieser Untersuchung gezeigt. Neben dem Reaktivitätsmuster mit den eingesetzten Antigenen (4 einzeln aufgetragene Kernpeptide, eine fünfte Reihe definierendes Gemisch aus NS4-Peptiden und eine eine sechste Reihe erzeugende Selektion aus NS5-Peptiden) ist in Tabelle 3 auch der HCV-Genotyp sowie der Zeitpunkt, zu dem das Serum bezüglich des Starts der Interferontherapie entnommen wurde, dargestellt. Die Daten weisen deutlich darauf hin, daß sich das Antikörpererkennungsmuster eines individuellen Patienten mit der Zeit kaum verändert. Die einzigen in den 20 Probenpaaren beobachteten Unterschiede bestanden in einstufigen Veränderungen der Reaktionsintensitäten. Sowohl in Patienten mit einer Antwort als in Patienten ohne Antwort auf Interferon wurde die gleiche Hierarchie in den serologischen Reaktionsmustern beobachtet. Unter Nichtberücksichtigung unbestimmter oder schwacher Reaktionen ergibt sich die folgende Hierarchie: Kern2 > NS4 > NS5 > Kern1 > Kern4 > Kern3.
Beispiel 3. Nachweis der HCV-RNA und HCV-Genotypisierung
Reverse Transkription und PCR wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Stuyver et al., 1993). Die PCR-Produkte wurden weiter zur Genotypisierung mittels des „Inno-LiPA Genotyping Assay" (Stuyver et al., 1993) aufgearbeitet. Die Ergebnisse des Genotypisierungsassays sind in Tabelle 3 enthalten.
Beispiel 4. Analyse der zellulären Immunantwort
4.1. Synthese von HCV-Antigenen
Neun Kern-, E1- und E2/NS1-Sequenzen entsprechende Peptidgruppen (Pools), zwei in diesen Pools nicht enthaltene E2/NS1 entsprechende Einzelpeptide sowie ein den zentralen Teil von NS3-HCV-Genotyp 1b darstellendes rekombinantes Protein wurden zur in-vitro-Stimulierung von PBMC verwendet. In jeder Gruppe waren 4-6 unterschiedliche 20-mer-Peptide, die sich um 8 Aminosäuren überlappten, gepoolt. Die Gruppen 1, 2 und 3 enthielten hauptsächlich. Kernpeptide mit den Aminosäurepositionen 5-80, 73-140 bzw. 133-200 (Tabelle 1). Die Gruppen 4, 5 und 6 umfaßten vorwiegend E1-Peptide mit den Aminosäurepositionen 193-260, 253-332 bzw. 325-392. Die Gruppen 7, 8 und 9 umfaßten E2/MS1-Peptide mit den Aminosäurepositionen 427-494, 487-578 bzw. 571-638. Die beiden zusätzlichen Einzelpeptide (MS1-7* und NS1-5*) deckten die Aminosäuren von 397 bis 428 der E2-Sequenz ab (Tabelle 1). Ein Fusionsprotein mit der NS3-Sequenz wurde in E. coli exprimiert und deckte die HCV-Aminosäuren 1188 bis 1463 des belgischen Isolats IG8309 ab.
Die Peptide wurden in den in Tabelle 1 gezeigten Puffern gelöst und zu den Kulturen mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml gegeben. Bei dieser Peptidkonzentration war die Konzentration der Lösungspuffer in den Zellkulturen nicht toxisch oder inhibierend. Um dies zu bestätigen, wurden Vorversuche ausgeführt. Das NS3-Protein wurde mit einer Endkonzentration von 1,5 μg/ml verwendet. Das als positives Kontrollantigen verwendete Tetanus-Toxoid (WHO, Kopenhagen, Dänemark) wurde dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben.
Alle Peptide wurden entweder auf dem mit dem säurelabilen Linker 4-(a-Fmoc-Amino-2'4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure funktionalisiertem PepSyn K-Harz (Millipore) oder auf dem mit demselben Linker funktionalisierten TentaGel S-RAM-Harz (Rapp Polymere) synthetisiert, wobei nach der Spaltung Peptidamide erhalten wurden. Es wurde ein Seitenkettenschutz auf t-Butyl-Basis sowie Fmoc-a-Amino-geschützte Aminosäurederivate verwendet. Die Guanidinogruppe des Arginin war mit 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidin wurde entweder mit t-Boc oder Trityl und die Sulfhydrylgruppe des Cystein mit einer Tritylgruppe geschützt. Die Kupplungen wurden unter Verwendung zuvor gebildeter O-Pentafluorphenylester durchgeführt, außer im Fall von Arginin, wo TBTU (O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethyluroniumtetrafluorborat; Novabiochem) als das Ativierungsreagens in Gegenwart von 2 Äquivalenten der Base N-Methylmorpholin und 1 Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol verwendet wurde. Gelegentlich wurden auch Glutamin, Asparagin und Tryptophan über TBTU-Aktivierung gekuppelt. In diesen Fällen wurden die Trityl-geschützten Derivate von Glutamin und Asparagin (Millipore) und das t-Boc-geschützte Tryptophanderivat (Novabiochem) verwendet. Alle Synthesen wurden an einem Milligen 9050-PepSynthesizer (Millipore) im Continuous-Flow-Verfahren durchgeführt. Nach Abspaltung der Peptide mit Trifluoressigsäure in Gegenwart geeigneter Fängermoleküle und Präzipitation mit Diethylether wurden alle Peptide mittels C₁₈-Reverse-Phase-Chromatographie analysiert.
Die dem viralen Nukleocapsid-(Kern-)Protein und dem E1-Protein entsprechenden HCV-Aminosäuresequenzen wurden auf die von Okamoto et al. (1990) Japan J. Exp. Med. (1990) 60: 167–177) beschriebene HC-J1-Sequenz bezogen. Die am Aminosäurerest Gly₄₅₁ beginnenden HCV-Sequenzen wurden den von Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2451–2455 veröffentlichten Sequenzen entnommen. Die meisten Peptidsequenzen wurden so gewählt, daß die Peptide sich gegenseitig um 8 Aminosäurereste überlappten.
4.2. T-Zellen-Proliferationsassays
Das für alle Zellkulturen verwendete Medium bestand aus RPMI 1640, supplementiert mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (alle von Gibco Europe, Gent, Belgien), 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, Mo.) und 10% hitzeinaktiviertem gepooltem menschlichem AB-Serum. Dieses AB-Serum wurde aus gesunden Blutspendern mit der Blutgruppe AB⁺ gewonnen und wurde nur dann verwendet, wenn keine Antikörper gegen HCV und HCV-RNA vorhanden waren. Dieses „komplementierte" RPMI-1640-Medium wird im folgenden als „Komplettmedium" bezeichnet.
PBMC wurden aus heparinisiertem venösem Blut mittels isopyknischer Dichtezentrifugation auf Ficoll Hypaque (Lymphoprep, Nyegaard, Dänemark) isoliert und im Komplettmedium suspendiert. 4 × 10⁵ PBMC wurden jeweils in 200 μl Komplettmedium in 96-Well-Mikroplatten mit rundem Boden (Falcon Plastics) in Abwesenheit (nicht stimulierte Kontrollen) oder Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an Antigenen 5 Tage bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft kultiviert. Danach wurde 0,5 μCi (³H)-Thymidin in jedes Well gegeben, und 16 bis 20 h später wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern mit einem Multikanal-„Cell Harvester" (PHD, Cambridge, MA) zur Messung des Einbaus von (³H)-Thymidin mittels Flüssigszintillationszählung in einem LKB-Wallac 8100-Counter (LKB, Bromma, Schweden) geerntet. Die Ergebnisse sind in Form eines Stimulierungsindexes dargestellt (SI; mittlere cpm Antigen-stimulierte Kulturen/mittlere cpm Kontrollkulturen). Die Proliferation wurde als positiv angesehen, wenn der Stimulierungsindex > 3 betrug. In einigen Abbildungen sind die Ergebnisse als cpm (mittlere cpm Antigen-stimulierte Kulturen – mittlere cpm Kontrollkulturen) ausgedrückt. Die Standardabweichungen der cpm-Mittelwerte von Kulturen in Dreifachausfertigung lagen durchweg unter 10%.
Das Auftreten von in-vivo-sensibilisierten HCV- spezifischen Gedächtnis-T-Lymphozyten wurde unter Verwendung eines Lymphoproliferationsassays untersucht. PBMC aus 32 Patienten mit chronischem HCV wurden in vitro mit Pools von 4 bis 6 teilweise überlappenden synthetischen Peptiden, die die Kern-, E1- und E2/NS1-Bereiche von HCV-Typ 1a repräsentieren, mit 2 überlappenden Einzelpeptiden vom Aminoterminus des HCV-Typ 1a und mit einem rekombinanten, die NS3-Sequenz von HCV-Typ 1b enthaltenden Fusionsprotein stimuliert. Mit Ausnahme von 2 Patienten (#610 und #636) wurden an allen Patienten wenigstens 2 und bis zu 11 (#633) Assays durchgeführt. In Patient #632 wurde beispielsweise die Lymphoproliferation zu 8 unterschiedlichen Zeitpunkten zwischen Woche 4 und 54 nach dem Start (Woche 0) der Interferontherapie untersucht. In 1 sind die Ergebnisse dieser Assays in Korrelation mit der biochemischen (ALT/AST)-Antwort auf die Therapie dargestellt. Vier Wochen nach dem Start mit Intron-A (Schering Plough) wurde eine Normalisierung der Transaminaseniveaus beobachtet. PBMCs aus den Patienten proliferierten durchweg und stark nach Stimulierung mit den Peptidpools 2 und 3. Die Antworten gegenüber den anderen Antigenpräparationen waren weniger stark und weniger reproduzierbar, was darauf hindeutet, daß die Anzahl der diese Epitope erkennenden Gedächtniszellen geringer ist. Antigene, mit denen zu keinem Zeitpunkt einer proliferative Antwort mit einem Stimulierungsindex (SI) von 3 induziert wurde, sind in dem Graphen nicht dargestellt.
Um die Ergebnisse der in den 32 HCV-Patienten durchgeführten 135 Assays zu analysieren und zusammenzufassen, wurde entschieden, die Reaktion eines individuellen Patienten auf eine bestimmte Antigenpräparation (Peptidpools 1 bis 9, NS1-5*-, NS1-7*- bzw. NS3-Protein) als signifikant anzusehen, wenn dadurch wenigstens in der Hälfte der durchgeführten Assays SIs von 3 induziert werden. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse wurden mit diesem Auswertungsverfahren erhalten. Die Tabelle zeigt das Antigenerkennungsmuster chronischer HCV-Patienten gegenüber den standardmäßig verwendeten 12 Antigenpräparationen. Neben der individuellen Patientennummer und der Anzahl der mit den PBMCs aus jeder Versuchsperson durchgeführten Assays ist in Tabelle 4 ebenfalls der Zeitrahmen gezeigt, in dem diese Assays durchgeführt wurden. Der Start der Interferontherapie dient als Bezugspunkt, Woche 0. Keiner der Patienten zeigte eine Reaktion auf alle Antigene. PBMCs aus 13 von 18 (72%) Patienten mit klinischer Antwort und aus 12 von 14 (85%) Patienten ohne Antwort proliferierten als Reaktion auf wenigstens eine Antigenpräparation. Alle Antigenpräparationen außer einer, Peptidpool 8, induzierten eine proliferative Reaktion in wenigstens einer Versuchsperson. Die häufigsten Reaktionen wurden mit den Peptidpools 2 und 3 erhalten. Während sowohl Patienten mit Interferonreaktion als auch Patienten ohne Reaktion eine gleichermaßen gute Zellproliferation gegenüber Peptidpool 2 zeigten (56% bzw. 57%), zeigten Patienten ohne Reaktion eine geringere Reaktion gegenüber Peptidpool 3 (29% bzw. 4 von 14) als Patienten mit Reaktion (44% bzw. 8 von 18). Ähnliche Ungleichgewichte wurden bei den Reaktionen gegenüber Peptidpools 5 und 9 beobachtet, die häufiger von Patienten ohne Reaktion (43% bzw. 43%) als von Patienten mit Reaktion (17% bzw. 11%) erkannt wurden. Patienten ohne klinische Reaktion auf Interferontherapie reagierten auch häufiger (57% bzw. 8 von 14) auf eine Stimulierung mit dem NS3-Protein als Patienten mit Reaktion (24% bzw. 4 von 17). Jedoch erreichte keiner dieser Unterschiede in den proliferativen Reaktionsraten gegenüber Peptidpools 3, 5 und 9 bzw. gegenüber dem NS3-Protein statistische Signifikanz (p < 0,05 in ²-Test). Ein bemerkenswerter und signifikanter Unterschied (P = 0,01 in ²-Test) wurde bei der Reaktionsrate von Patienten mit Reaktion und Patienten ohne Reaktion gegenüber den Peptiden NS1-5* und NS1-7* beobachtet. So erkannten tatsächlich 8 von 77 Patienten mit Reaktion eines oder beide Peptide, während dies bei keinem der Patienten ohne Reaktion der Fall war. Die Ergebnisse aller dieser Proliferationsassays sind in 2 zusammengefaßt, mit den Reaktionsraten der HCV-Patienten ebenso wie von den 18 gesunden Kontrollpersonen gegenüber den 12 Antigenpräparationen. Um tatsächlich die Relevanz der in HCV-Patienten beobachteten proliferativen Reaktionen zu etablieren, wurden PBMCs aus 18 gesunden Kontrollpersonen mit den gleichen Antigenpräparationen stimuliert. Insgesamt wurden 27 Assays durchgeführt: ein einzelner Assay bei 10 Personen, zwei bei 7 Freiwilligen und 3 bei einem Individuum. Bei 12 Kontrollpersonen induzierte keines der Antigene eine proliferative Reaktion. In 6 Versuchspersonen wurde eine proliferative Reaktion mit einem SI von 3 in einem Einzelassay oder in wenigstens der Hälfte der durchgeführten Assays von einem oder mehreren Antigenen induziert. In Tabelle 5 sind die Antigene gezeigt, die die Proliferation in diesen Versuchspersonen induzierten. Obwohl Figur 2 vermuten läßt, daß proliferative Reaktionen häufiger in HCV-Patienten als in gesunden Kontrollpersonen auftreten, erreichen diese Unterschiede nicht immer statistische Signifikanz (p < 0,05). Die Peptidpools 2 und 3 sowie das NS3-Protein induzieren deutlich (p < 0,05) häufigere proliferative Reaktionen in der gesamten Gruppe der HCV-Patienten als in den gesunden Kontrollpersonen. Die meisten dieser Unterschiede sind ebenfalls signifikant, wenn Patienten mit Interferonantwort und Patienten ohne Antwort jeweils mit der gesunden Kontrollgruppe verglichen werden. Nur für die proliferative Reaktion von Patienten mit Interferonreaktion gegenüber NS3 gilt dies nicht mehr. Obwohl die Häufigkeit der proliferativen Reaktion gegenüber Peptidpool 5 in gesunden Kontrollpersonen und in HCV-Patienten nicht signifikant unterschiedlich war, war dies der Fall (p < 0.03), wenn nur die Patienten ohne Reaktion mit den Kontrollversuchspersonen verglichen wurden. Alle anderen Unterschiede erreichten nicht das p < 0,05-Niveau.
Beispiel 5. Feinspezifität der Erkennung des HCV-Kernbereichs durch PBMC aus Patienten mit klinischer Reaktion: T-Zellen-Epitop-Lokalisierung im carboxyterminalen Kernbereich
Da die Peptidpools 2 und 3 proliferative Reaktionen in einem großen Teil der HCV-Patienten hervorriefen, wurde untersucht, welche Peptide aus diesen Pools diese Reaktionen induzierten. Die Stimulierungskapazität einzelner Peptide auf die PBMCs aus gesunden Kontrollversuchspersonen wurde ebenso getestet. Dreiundzwanzig Proliferationsassays wurden mit PBMCs aus 17 Kontrollversuchspersonen durchgeführt. Die Peptide Kern-C17, Kern-C21 und Kern-C31 wurden von 2, 1 bzw. 1 Versuchsperson(en) bzw. 12%, 6% bzw. 6% der Versuchspersonen erkannt. Die PBMCs wurden aus 11 HCV-Patienten präpariert, die auf die Interferontherapie ansprachen. Acht Versuchspersonen hatten eine proliferative Reaktion gegenüber einem oder beiden Peptidpools 2 und 3 gezeigt, während 3 Patienten keine Reaktion gezeigt hatten. Es wurden neunzehn Assays durchgeführt. Bei dem Auswertungssystem für positive Reaktionen handelte es sich um das wie in Beispiel 4 beschriebene System. In Tablle 6 sind die Ergebnisse dieser 19 Assays zusammengefaßt, wobei die Übereinstimmung der Assayergebnisse demonstriert wird. So proliferierten in der Tat PBMCs aus den Patienten, die keine Reaktion gegenüber den Peptidpools gezeigt hatten, nicht nach Stimulierung mit einem beliebigen der einzelnen Peptide. Die PBMCs aus den Patienten, die zuvor eine proliferative Antwort gezeigt hatten, reagierten auch nach Stimulierung mit einem oder mehreren Peptiden aus diesen Pools. Wenigstens eines und bis zu 5 dieser Peptide wurden von diesen Patienten erkannt. Der am stärksten immunogene Bereich der HCV-Kernsequenz scheint zwischen den Aminosäuren 109 und 176 lokalisiert zu sein. Das von 6 der 8 Patienten mit proliferativer Reaktion erkannte Peptid C27 (AA 157-176) erwies sich als das am stärksten immunodominante, gefolgt von C25, das von 5 Patienten erkannt wird, und C23 und C19, die jeweils von 3 Versuchspersonen erkannt werden.
Beispiel 6
Die Feinspezifität der lymphoproliferativen Reaktionen wurde nochmals mit neuen Proben getestet, wobei die Mehrheit von diesen aus anderen Patienten als den in Beispiel 5 untersuchten gewonnen wurde. Fünf Patienten (zwei mit αIFN-Reaktion und drei ohne αIFN-Reaktion) und 16 normale Kontrollpersonen wurden untersucht. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der in Patienten mit chronischer Hepatitis C durchgeführten Assays gezeigt. Die höchste in beiden getesteten Patienten mit αIFN-Reaktion beobachteten LPR lagen im Bereich der Aminosäurepositionen: 73-92 (C13); 109-128 (C19); 121-140 (C21); 145-164 (C25); 157-176 (C27). Nur die AS-Reste 121-140 (C21) und 133-152 (C23) riefen eine hohe PLR in zwei Patienten ohne αIFN-Antwort hervor. Daher ist möglicherweise die Verwendung der Peptide C13, C19, C25 und/oder C27 in prophylaktischen oder therapeutischen Impfstoffzusammensetzungen besonders vorteilhaft.
LITERATURHINWEISE
Maertens, G., Ducatteeuw, A., Stuyver, L., Vandeponseele, P., Venneman, A., Wyseur, A., Bosman, F., Heijtink, R. & de Martynoff, G. (1994) Low prevalence of anti-E1 antibodies reactive to recombinant type 1b E1 envelope protein in type 2, 3, and 4 sera, but high prevalence in subtypes 1a and 1b. In: Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the International Symposium on Viral Heptatitis and Liver Disease (Hrsg. Nishioka, K., Suzuki, H., Mishiro, S., und Oda T.), S. 314–316, Springer-Verlag, Tokio.
Simmonds, P., Rose, K. A., Graham, S., Chan, S.-W., McOmish, F., Dow, B. C., Follett, E. A. C., Yap, P. L., & Marsden, H. (1993b) Mapping of serotype-specific, immunodominant epitopes in the NS4 region of hepatitis C virus (HCV): Use of type-specific peptides to serologically discriminate infections with HCV type 1, 2 and 3. J. Clin. Kicrobiol. 31, 1493–1503.
Simmonds, P., Holmes, E. C., Cha, T.-A., Chan, S.-W., McOmish, F., Irvine, B., Beall, E., Yap, P. L., Kolberg, J., & Urdea, M. S. (1993c) J. Gen. Virol. 74, 2391–2399.
Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A. & Maertens, G. (1994) Cloning and phylogenetic analysis of the Core, E2, and NS3/4 regions of hepatitis C virus type 5a. Biochem Biophys. Res. Comm. 202 1308–1314.
Simmonds, P., Alberti, A., Alter, H., Bonino, F., Bradley, D. W., Brechot, C., Brouwer, J., Chan, S.-W., Chayama K., Chen, D.-S., Choo, Q.-L., Colombo, M., Cuypers, T., Date, T., Dusheiko, G., Esteban, J. I., Fay, O., Hadziyannis, S., Han, J. Hatzakis, A., Holmes, E. C., Hotta, H., Houghton, M., Irvine, B., Kohara, M., Kolberg, J. A., Kuo, G., Lau, J. Y. N., Lelie, P. N., Maertens, G., McOmish, F., Miyamura, T., Mizokami, M., Nomoto, A., Prince A. M., Reesink, H. W., Rice, C., Roggendorf, M., Schalm, S., Shikata, T., Shimotohno, K., Stuyver, L., Trepo, C., Weiner, A., Yap, P. L. & Urdea, M. S. (1994) A proposed system for the nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology 19, 1321–1324.
Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., DeLeys, R. & Maertens, G. (1993a) Analysis of the putative E1 envelope and NS4a epitope regions of HCV type 3. Biochem. Biophys. Res. Corm. 192, 635–641.
Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A., Duhamel, M., Vanderborght, B., Van Heuverswyn, H. & Maertens, G. (1993b) Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen Virol. 74, 1093–1102.
Stuyver, L., Wyseur, A., Van Arnhem, W., Rossau, R., Delaporte, E., Dazza, M.-C., Van Doorn, L.-J., Kleter, B. & Maertens, G. (1994a) The use of a line probe assay as a tool to detect new. types or subtypes of hepatitis C virus. In: Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Hrsg. Nishioka, K., Suzuki, H., Mishiro, S., and Oda, T.), S. 317–319, Springer-Verlag Tokio.
Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A. & Maertens, G. (1994b)) Cloning, and Phylogenetic analysis of the Core, E2, and NS3/4 regions of the hepatitis C virus type 5a. Biochem. Biophys. Res. Comm. 202, 1308–1314.
Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., Hernandez, F., Delaporte, E., & Maertens, G. (1994c) Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetics analysis of the E1 and NS5B regions and identification of 5 new subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, in press.
Knauf M, Bell DP, Hirtzer P, Luo Z, Young J, Katre N (1998) Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rate of recombinant interleukin-2 chemically modified with water-soluble polymers. J Biol Chem. 263: 15064–15070.
Poznansky M, Juliano R (1984) Biological approaches to the controlled delivery of drugs: a critical review. Pharmacol Rev. 36: 277–336.
Szoka F Jr, Papahadjopoulos D (1980) Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annu-Rev-Biophys-Bioeng 9: 467–508.
Aurameas et al., Scand J Immunol, Bd. 8, Suppl. 7, 7–23 (1978).
Botarelli P, Brunetto M, Minutello M, Calvo P, Unutmaz D, Weiner A, Choo Q, Shuster J, Kuo G, Bonino F, Houghton M, Abrignani S (1993) T-lymphocyte response to hepatitis C virus in different clinical courses of infection. Gastroenterology 104: 580–587.
Bukh J, Purcell R, Miller R (1992). Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus. Proc. Natl Acad Sci USA 89: 4942–4946.
Cha T, Beal E, – Irvine B, Kolberg J, Chien D, Kuo G, Urdea M (1992) At least five related, but distinct, hepatitis C viral genotypes exist. Proc Natl Acad Sci USA 89: 7144–7148.
Chan S, Simmonds P, McOmish F, Yap P, Mitchell R, Dow B, Follet E (1991) Serological responses to infection with three different types of hepatitis C virus. Lancet 338: 1991.
Chan S, McOmish F, Holmes E, Dow B, Peutherer J, Follet E, Yap P, Simmonds P (1992) Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogenetic relationship to existing variants. J Gen Virol 73: 1131–1141.
Choo Q, Richman K, Han J, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby A, Barr P, Weiner A, Bradley D, Kuo G, Houghton M (1991) Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl Acad Sci USA 88: 2451–2455.
Davies G, Balard L, Schiffer E (1989) Treatment of chronic hepatitis with recombinant interferon alpha: a multicenter randomnized, controlled trial. N Engl Med 321: 1501–1506.
Erlanger, Method of Enzymology, 70: 85 (1980).
Gabizon A, Dagan A, Goren D, Barenholz Y, Fuks Z (1982) Liposomes as in vivo carriers of adriamycin: reduced cardiac uptake and preserved antitumor activity in mice. Cancer Res 42: 4734–4739.
Hoofnagle J, Lullen K, Jones D (1986) Treatment of chronic non-A, non-B hepatitis with recombinant human alpha interferon., N Engl J Med 315: 1575–1578.
Kato N, Hijikata M, ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Sugimura T, Shimotohno K (1990) Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA 87: 9524–9528.
Koziel M, Dudley D, Wong J, Dienstag J, Houghton M, Ralston R, Walker B (1992). Intrahepatic cytotoxic T lymphocytes specific for hepatitis C virus in persons with chronic hepatitis. J Immunology 149: 3339–3344.
Minutello M, Pileri P, Unutmaz D, Censini S, Kuo G, Houghton M, Brunetto M, Bonino P, Abrignani S (1993). Compartmentalization of T lymphocytes to the site of disease: intrahepatic CD4+ T cells specific for the protein NS4 of Hepatitis C Virus in patients with Chronic hepatitis C. J Exp Med 178: 17–25.
Mori S, Kato N, Yagyu A, Tanaka T, Ikeda Y, Petchclai B, Chiewsilp P, Kurimura T, Shimotohno K (1992) A new type of hepatitis C virus in patients in Thailand. Biochem Biophys Res Comm 183: 334–342.
Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, Yotsumoto S, Tanaka T, Yoshizawa H, Tsuda F, Miyakawa Y, Mayumi M (1990). The 5' terminal sequence of the hepatitis C virus genome. Jap J Exp Med 60: 167–177 Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, Kurai K, Zizuka H, Machida A, Miyakawa Y, Mayumi M (1991) Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen Virol 72: 2697–2704.
Okamoto H, Kurai K, Okada S, Yamamoto K, Zizuka N, Tanaka T, Fukuda S, Tsuda F, Mishiro S (1992) Fulllength sequences of a hepatitis C virus genome having poor homology to reported isolates: comparative study of four distinct genotypes. Virology 188: 331–341.
Rodwell et al., Biotech 3, 889–894 (1985).
Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, Duhamel M, Vanderborght B, Van Heuverswyn H, Maertens G (1993) Typing of hepatitis C virus (HCV) isolates and characterization of new (sub) types using a Line Probe Assay. J Gen Virology, 74: 1093–1102.
Essential Immunology, 3. Aufl., von Rolt, veröffentlicht bei Blackwell Scientific Publications; Fundamentals of Clinical Immunology, von Alexander und Good, veröffentlicht bei W. B. Saunders; Immunology, von Bellanti, veröffentlicht bei W. B. Saunders.
TABELLE 1 Als Antigene in den lymphopoliferativen Assays verwendete synthetische Peptide.
Verwendete Lösungsmittel:
Lösungsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure; Lösungsmittel
B: 0,1% Trifluoressigsäure, 25% Acetonitril; Lösungsmittel C: 0,1% Trifluoressigsäure, 30% Acetonitril; Lösungsmittel D: 0,1% Trifluoressigsäure, 50% Acetonitril; Lösungsmittel E: 0,005 Ammoniakpuffer, Lösungsmittel O: 50% Dimethylsulfoxid; Lösungsmittel H: 0,1% Trifluoressigsäure, 40% Acetonitril.
SEQUNZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 157 bis 176 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 13 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I, X₃₄ für F oder Y, X₃₅ für A oder P und X₃₆ für L oder I steht.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 157 bis 176 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
diesen besteht.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 145 bis 164 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 12 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E, X₂₉ für A oder E, X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I und X₃₄ für F oder Y steht.
Verwendung nach Anspruch 5 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 145 bis 164 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Verwendung nach Anspruch 5 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung nach Anspruch 5 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 133 bis 152 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 11 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁₉ für M oder I, X₂₀ für G oder E, X₂₁ für L oder V oder I, X₂₂ für V oder L, X₂₃ für A oder G, X₂₄ für L, V oder I, X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E und X₂₉ für A oder E steht.
Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 133 bis 152 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von der folgenden Liste von Peptiden gewählt wird:
Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 109 bis 128 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 9 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁₁ für P oder Q, X₁₂ für N oder T, X₁₃ für R oder H, X₁₄ für R oder K, X₁₅ für L oder V oder F, X₁₆ für K oder R und X₁₇ für L oder I steht.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid etwa 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 109 bis 128 des HCVKernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von den folgenden Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid von den folgenden Peptiden gewählt wird:
.
Verwendung eines Polypeptids aus etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid mindestens 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 73 bis 92 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht und wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und worin das Polypeptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 6 dargestellten Polypeptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert, und worin X₁ für R oder K, X₂ für A, S oder T, X₃ für A oder G, X₄ für Q, K oder R, X₅ für Y oder H, X₆ für G oder A, X₇ für E oder K und X₈ für C, M oder L steht.
Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid mindestens 8 bis etwa 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus dem von den Aminosäurepositionen 73 bis 92 des HCV-Kernbereichs umfaßten Bereich:
, umfaßt bzw. aus diesen besteht.
Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid ausgewählt wird aus:
.
Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Polypeptid ausgewählt wird aus:
.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein T-Zellen-Helferepitop handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein CTL-Epitop handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Polypeptid in eine prophylaktische Impfstoffzusammensetzung integriert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Polypeptid in eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung integriert wird.
Polypeptid, bestehend aus mehrfachen Wiederholungen, Kombinationen oder Mimotopen einer beliebigen der aufgrund der in ihnen enthaltenen, eine T-Zelle stimulierenden Epitope gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 ausgewählten Sequenzen aus aufeinanderfolgenden Aminosäuren, wobei die Kombinationen zwei oder mehrere, zu einer einzigen Struktur verbundene Peptide umfassen und wobei die Mimotope verglichen mit den Peptiden eine oder mehrere Aminosäurevariationen aufweisen können, solange die mimotopischen Peptide in der Lage sind, für eine immunologische Stimulierung zu sorgen, wonach die T-Zellen auf wenigstens einen HCV-Stamm reagieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein rekombinantes Polypeptid handelt, das mittels eines eine für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 22 codierende Nukleinsäureinsertion enthaltenden Expressionsvektors exprimiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das Polypeptid mit einem mit einem Krankheitserreger in Zusammenhang stehenden Immunogen, wie z. B. den HCV-Hüllproteinen E1 und E2 oder den HCV-Immunogenen NS3, NS4 und NS5 oder einem ein B-Zellen stimulierendes Epitop enthaltenden HCV-Peptid, operativ verknüpft ist.
Peptid, bestehend aus mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz eines beliebigen der folgenden Peptide, wobei die Peptide ein T-Zellen-Epitop enthalten:

worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 13 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 12 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;

, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 11 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 9 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert;
, worin das Peptid die Charakteristik des wie in SEQ ID NO 6 dargestellten Peptids, T-Zellen immunologisch zu stimulieren, imitiert; worin X₁ für R oder K, X₂ für A, S oder T, X₃ für A oder G, X₄ für Q, K oder R, X₅ für Y oder H, X₆ für G oder A, X₇ für E oder K, X₈ für C, M oder L, X₉ für W oder L, X₁₀ für S, N, T, D oder H, X₁₁ für P oder Q, X₁₂ für N oder T, X₁₃ für R oder H, X₁₄ für R oder K, X₁₅ für L oder V oder F, X₁₆ für K oder R, X₁₇ für L oder I, X₁₈ für F oder L, X₁₉ für M oder I, X₂₀ für G oder E, X₂₁ für L oder V oder I, X₂₂ für V oder L, X₂₃ für A oder G, X₂₄ für L, V oder I, X₂₅ für A oder V, X₂₆ für A oder S, X₂₇ für R oder A, X₂₈ für A oder T oder E, X₂₉ für A oder E, X₃₀ für V oder A oder L, X₃₁ für L oder V oder I, X₃₂ für E oder G, X₃₃ für V oder I, X₃₄ für F oder Y, X₃₅ für A oder P und X₃₆ für L oder I steht.
Immunogene Zusammensetzung, bestehend aus bzw. umfassend wenigstens ein mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff vermischtes Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 28.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 29.
Prophylaktische Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 30.
Therapeutische Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 30.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei die Zusammensetzung neben einem beliebigen der Polypeptide nach Anspruch 28 ein Peptid oder Polypeptid, das wenigstens ein B-Zellen stimulierendes HCV-Epitop enthält, und/oder ein HCV-Strukturpolypeptid und/oder ein nicht strukturelles HCV-Polypeptid umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 33, worin das Polypeptid nach Anspruch 28 in mit HBsAg- oder HBcAg-Partikeln, HBV-Immunogenen, HIV-Immunogenen und/oder HTLV-Immunogenen vermischter Form vorliegt.
Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, der eine für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 codierende Nukleinsäureinsertion enthält, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.