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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für den selektiven somatischen Gentransfer in
Epithelzellen des Pankreas eines Patienten. Die Verfahren dieser Erfindung umfassen das
Einbringen des Gens, das transferiert werden soll und das mit einem geeigneten
Transfervehikel verbunden ist, in das Gangsystem des Pankreas. Genauer umfaßt die
Erfindung die Verwendung dieser Verfahren, um genetische Erkrankungen wie z. B. cystische
Fibrose zu behandeln, die durch genetische Defekte in diesen Epithelzellen charakterisiert
sind.
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Die Epithelzellen, die die Gänge der Leber und des Pankreas (sowohl endokrin als auch
exokrin) auskleiden, sind für die Synthese zahlreicher Proteine verantwortlich, die für die
Aufrechterhaltung des einwandfreien Funktionierens dieser Organe und die Homöostase im
allgemeinen wichtig sind. Erkrankungen, die Defekte in den Genen verursachen, die diese
Proteine codieren, können schwerwiegende und manchmal tödliche Auswirkungen haben.
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Zum Beispiel ist die cystische Fibrose (CF) eine Erkrankung, die durch Abnormalitäten im
Wasser- und Elektrolyttransport in die und aus den Zellen charakterisiert ist. Das Gen, das für
die CF verantwortlich ist, das CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)-
Gen, ist dafür bekannt, dass es in den Epithelzellen von CF-Patienten defekt ist. Die
Isolierung und die Sequenz dieses Gens werden in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung
mit der Serien-Nr. 401,609, die am 31. August 1989 eingereicht wurde, beschrieben. Obwohl
der primäre Schadensort bei CF-Patienten das Lungenepithel ist, sind sowohl die Epithelien
des Pankreas als auch die der Gallengänge ebenfalls betroffen [T. F. Boat et al., in: The
Metabolic Basis of Inherited Disease - 6. Ausgabe, C. R. Scriver et al., Hrsg., McGraw-Hill,
New York, S. 2649-80 (1989)].
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Andere Erkrankungen, die durch genetische Defekte in den Epithelzellen der Leber und des
Pankreas charakterisiert sind, sind Gallensteine (Cholelithiasis), aufsteigende sklerosierende
Gallengangsentzündung, primäre Gallenzirrhose und Diabetes mellitus.
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Die Behandlung der vorstehend beschriebenen Erkrankungen ist von großer Bedeutung. Ein
aufregender Ansatz besteht in der Verwendung der Genersatztherapie, um funktionelle
Kopien defekter Gene direkt in die betroffenen Zellen zu inserieren.
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Die Idee der Genersatztherapie entstand aus dem erfolgreichen Transfer von Genen in
Säugerzellen heraus, die in Kultur gehalten wurden. Das am besten bekannte Verfahren des
Gentransfers wird durch die Behandlung von Säugerzellen mit einem Copräzipitat aus
Calciumphosphat und der Nucleinsäuresequenz, die transferiert werden soll, erreicht. Die
Säugerzellen nehmen dieses Präzipitat über Endocytose auf, und einige dieser Zellen können
dann das Polypeptid, das durch die Nucleinsäuresequenz codiert wird, exprimieren.
Unglücklicherweise ist dieses Verfahren auf in vitro-Zellkulturen beschränkt and hat bei der
Behandlung eines Patienten in vivo keine große Nützlichkeit. Die Gründe dafür liegen in der
unlöslichen Natur der Nucleinsäuren und in der niedrigen Wirksamkeit, mit der die
Körperzellen diese Präzipitate aufnehmen.
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Andere Verfahren wie die Verwendung von Viren oder Liposomen, um die Nucleinsäuren zu
den Zielzellen zu tragen, besitzen eine größere Anwendbarkeit in vivo [C. Nicolau et al.,
Meth. Enzymol. 149, S. 157-76 (1987)]. Aber diese Verfahren leiden ebenfalls unter
Unzulänglichkeiten. Am wichtigsten ist, dass keines dieser Verfahren für einen bestimmten
Zelltyp spezifisch ist - wodurch es schwierig wird, das Gen von Interesse an die richtigen
Zellen über die Standard-Verabreichungswege anzuliefern.
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Vor Kurzem wurde ein Verfahren zum zellspezifischen Gentransfer unter Verwendung von
Nucleinsäuren, die an Zellrezeptorliganden konjugiert sind, beschrieben [Patent 5,166,320 der
Vereinigten Staaten]. Obwohl dieses Verfahren die zur in vivo-Gentherapie nötige
Zellspezifität bereitstellt, ist es auch mit zusätzlichen Kosten und Manipulationen bei der
Erzeugung der Nucleinsäure-Liganden-Konjugate verbunden.
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Die gleichzeitig anhängige Anmeldung des Anmelders mit der Serien-Nr. 584,275, die am 18.
September 1990 eingereicht wurde nun das Patent 5,240,846 der Vereinigten Staaten darstellt,
beschreibt ein Verfahren zur Verwendung der Gentherapie, um cystische Fibrose zu
behandeln. Die Anmeldung beschreibt eine Anzahl verschiedener Genverabreichungssysteme
und eine Anzahl von Verabreichungsverfahren, genauer gesagt die Inhalation, die Injektion
und die Einnahme. Die Anmeldung richtet sich spezifisch auf die Behandlung der
Lungenepithelien, bezieht sich aber auch kurz auf die Behandlung von Epithelzellen des
Pankreas und der Galle. Die Anmeldung zeigt jedoch nicht, dass jedes der beschriebenen
Verfahren für die Behandlung von Lungenepithelien für Epithelzellen des Pankreas und der
Galle wirksam oder spezifisch sein kann.
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Demgemäß besteht noch immer ein Bedarf an einem kostengünstigen und relativ leichten
Weg, um einen zellspezifischen Gentransfer in die Epithelzellen der Leber und des Pankreas
zu erreichen.
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Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf durch die Bereitstellung eines neuartigen
Verfahrens für den in vivo-Gentransfer in Epithelzellen des Pankreas.
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Der Anmelder entdeckte, dass die Verabreichung des Gens, das transferiert werden soll, wenn
es mit einem geeigneten Transfervehikel verbunden ist, in das Gangsystem des Pankreas
überraschenderweise eine selektive Aufnahme durch die Epithelzellen, die den Gang
auskleiden, bewirkt. Die Verabreichung des Gens kann durch Verfahren erreicht werden, die
derzeit zur Injektion von Kontrastfarbstoffen in diese Gänge für bildgebende Verfahren
verwendet werden.
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Die Verfahren dieser Erfindung sind wirksam bei der Behandlung von primären
Erkrankungen des Pankreas, die durch genetische Defekte in den Epithelien der Gangsysteme
der Organe charakterisiert sind. Diese genetischen Defekte umfassen sowohl das Versagen
der Zellen, einen ausreichenden Spiegel eines Polypeptids zu exprimieren, als auch die
Überproduktion eines Polypeptids. Solche Erkrankungen umfassen cystische Fibrose, die
diese Zellen betrifft, sowie Lungenepithelien.
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In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Transfer von
Genen in Pankreas-Inselzellen und Pankreas-Acinuszellen bereit. Wenn die Konzentration des
Transfervehikels, das mit dem Gen, das transferiert werden soll, verbunden ist, ausreichend
hoch ist, nehmen diese weiteren Zellen sowie die Epithelzellen des Ganges das Gen auf und
exprimieren es. Dies stellt das erste Verfahren zur Erreichung eines Gentransfers in Pankreas-
Insel- und -Acinuszeilen dar.
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Die Verfahren dieser Erfindung erniedrigen durch ihre Zellspezifität und durch die
Vermeidung des Kontaktes mit dem Blutstrom des Patienten vorteilhaft die Risiken die mit
einem Gentransfer verbunden sind. Diese Verfahren ziehen ihren Nutzen auch aus den
anatomischen Beschränkungen, die sich durch die Benutzung des Gangsystems des Pankreas
bieten, und vermeiden dadurch einen unerwünschten Gentransfer in andere Organe und in
andere Zellen. Darüber hinaus bieten die Verfahren dieser Erfindung einen zusätzlichen
Vorteil, da sie die unmittelbare Anlieferung von genetischem Material und des damit
verbundenen Transfervehikels im Überschuß in den Zwölffingerdarm und die Ausscheidung
im Stuhl erlauben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 stellt eine schematische Darstellung der Struktur von pAd.CMV-lacZ dar.
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Fig. 2 stellt eine schematische Darstellung der Struktur von pAd.CB-CFTR dar.
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Fig. 3 stellt die Hybridisierung einer menschlichen CFTR-spezifischen DNA-Sonde mit
XbaI-verdauter Gesamtzell-DNA sowohl von Ad.CB-CFTR infizierten als auch von
scheininfizierten Zellen dar, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF
stammen.
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Fig. 4 stellt die Hybridisierung einer menschlichen CFTR-spezifischen DNA-Sonde mit der
Gesamtzell-RNA sowohl von Ad.CB-CFTR infizierten als auch von scheininfizierten Zellen
dar, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF stammen.
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Fig. 5, Teilabbildungen A und B, stellt die Lokalisierung von CFTR in Ad.CB-CFTR
infizierten Zellen. die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF stammen,
durch Immunfluoreszenz unter Verwendung entweder eines nicht-reaktiven Antikörpers
(Teilabbildung A) oder eines CFTR-spezifischen Antikörpers (Teilabbildung Bl und eines
sekundären FITC markierten anti-IaG-Antikörpers dar.
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Fig. 6. Teilabbildungen A-E, stelt die Verteilung der β-Galactosidase in einem Leberschnitt
einer Ratte bei unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion mit einer niedrigen Konzertration
entweder von Ad.CB-CFTR oder von Ad.CvIV-lacZ unter Verwendung der X-Gal-
Cytochemie dar.
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Fig. 7, Teilabbildungen A-D, stellt die Anwesenheit der menschlichen oder der Ratten-
CFTR-RNA in einem Leberschnitt einer Ratte 3 Tage nach der Infektion mit einer niedrigen
Konzentration entweder von Aä.CB-CFTR oder von Ad.CMV-lacZ durch Hybridisierung mit
markierten CFTR-spezifischen Sonden dar.
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Fig. 8, Teilabbildungen A-D, stellt die Verteilung von CFTR und Cyokeratin-18 in einem
Leberschnitt einer Ratte 3 Tage nach der Infektion mit einer niedrigen Konzentration von
Ad.CB-CFTR oder Ad.CMV-lacZ durch Doppel-Immundiffusion unter Verwendung von
Antikörpern dar, die für beide Proteine spezifisch sind.
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Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Einführen eines funktionellen Gens in
Epithelzellen des Pankreasganges eines Patienten bereit. Die Bezeichnung "funktionelles
Gen", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Gen, das ein Polypeptid codiert und
das durch die Zielzelle exprimiert werden kann. Die Bezeichnung umfaßt auch Antisense-
Nucleinsäuren, die in der Lage sind, zu binden und die Expression eines Polypeptids zu
verhindern. Die Bezeichnung "Zielzelle" bezieht sich auf die Zelle oder den Zelltyp, die/der
das Gen von Interesse aufnimmt.
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Die Verfahren dieser Erfindung umfassen den Schritt des Einführers eines Gens in das
Gangsystem des Pankreas. Um den Gentransfer auszuführen, muss dass Gen, das transferiert
werden soll, mit einem Träger oder Vehikel, das in der Lage ist, die Epithelzellen des Organs
zu transduzieren, verbunden sein. Die Bezeichnungen "Transfervehikel" und "Träger"
beziehen sich auf jegliche Art von Struktur, die in der Lage ist, das Gen von Interesse an eine
Zielzelle anzuliefern.
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Im Fachgebiet sind viele solcher Träger bekannt. Zum Beispiel können zahlreiche Viren, die
in der Lage sind, Epithelzellen zu infizieren, durch rekombinante Verfahren so manipuliert
werden, dass sie das Gen von Interesse tragen, ohne dass ihre Infektiosität beeinflußt wird.
Wie in dieser Anwendung verwendet, beziehen sich die Bezeichnungen "infizieren" und
"Infektiosität" nur auf die Fähigkeit eines Virus, das genetische Material an eine Zielzelle zu
übertragen. Diese Bezeichnungen bedeuten nicht, dass das Virus in der Lage ist, sich in der
Zielzelle zu replizieren. Tatsächlich wird bevorzugt, dass solche Viren replikationsdefizient
sind, so dass die Zielzellen nicht unter den Auswirkungen einer Replikation des Virus leiden.
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Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem Virus, das verwendet wird, um das Gen in den
Verfahren dieser Erfindung zu tragen, um ein rekombinantes Adenovirus. Das Adenovirus
wird wegen seiner Fähigkeit bevorzugt, nicht-teilende oder langsam teilende Zellen wie z. B.
Epithelzellen zu transformieren. Am stärksten bevorzugt wird, wenn das rekombinante
Adenovirus ein Derivat von Ad5 ist, in dem die Sequenzen, die die E1-Region umspannen,
deletiert und durch einen Promotor, mit oder ohne zusätzliche Enhancer-Sequenzen und das
Gen, das transferiert werden soll, ersetzt sind. Jeder Promotor, der eine konstitutive
Expression des Gens, das einmal in das Zielzellgenom aufgenommen worden ist, bereitstellt,
kann verwendet werden. Beispiele für solche Promotoren sind Promotoren des Rous-Sarkom-
Virus, LTRs des Maloney-Virus, endogene Promotoren der Zielzelle und Promotoren des
Cytomegalie-Virus (CMV). Bevorzugte Promotoren sind der β-Actin-Promotor und die
CMV-Promotoren. Beispiel für bevorzugte Enhancer-Sequenzen, die in diesen rekombinanten
Adenoviren verwendet werden können. umfassen solche, die im CMV-Genom gefunden
werden, besonders solche aus der sehr frühen Region des Genoms und Enhancer-Sequenzen
des Alpha&sub1;-Fetoproteins.
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Andere Viren, die als Transfervehikel in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden
können, sind replikationsdefiziente Retroviren. Wenn diese replikationsdefizienien Retroviren
verwendet werden, können ihre Genome durch ein Helfervirus gemäß gut bekannter
Verfahren verpackt werden. Geeignete Retroviren umfassen PLJ, pZip, pW e and pEM, von
denen jeder im Fachgebiet, wohlbekannt ist. Geeignete Helferviren zur Verpackung der
Genome umfassen ΨCrip, ΨCre, Ψ2, ΨAm, und Adeno-assoziierte Viren.
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Es können auch andere Genanlieferungssysteme als Viren bei den Verfahren dieser Erfindung
verwendet werden. Zum Beispiel kann das Gen, das transferiert werden soll, in ein Liposom
verpackt sein. Wenn Zellen mit Liposomen, in die DNA eingekapselt ist, inkubiert werden,
nehmen sie die DNA auf und exprimieren sie. Um diese Liposomen zu bilden, mischt man die
DNA eines Expressionsvektors, der das Gen, das tansferiert werden soll, exprimiert, mit
Lipid wie z. B. N-[1-(2,3-Dioleyloxy)prepyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in
einem geeigneten Puffer wie z. B. Hepes gepufferte Kochsalzlösung. Dies bewirkt die
spontane Bildung von Lipid-DNA-Komplexen (Liposomen), die in den Verfahren dieser
Erfindung verwendet werden können [P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S.
7413-17 (1987)].
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Ein anderes Genanlieferungssystem, das in dieser Erfindung verwendet werden kann, sind
DNA-Protein-Komplexe. Die Bildung dieser Komplexe wird in dem Patent 5,166,320 der
Vereinigten Staaten beschrieben, dessen Offenbarung hierin unter Bezugnahme
eingeschlossen ist. Genauer umfassen diese Komplexe das Gen, das übertragen werden soll
(zusammen mit einem Promotor, Enhancer-Sequenzen und anderer DNA, die zur Expression
in der Zielzelle nötig ist), verbunden über einen geeigneten Polymer wie z. B. Polylysin mit
einem Polypeptidliganden für einen Rezeptor auf der Oberfläche der Epithelzellen der Leber
oder des Pankreas ist. Dieser Komplex wird durch die Epithelzellen über Endocytose
aufgenommen, nachdem der Ligand an den Rezeptor der Zelloberfläche gebunden hat. Die
DNA wird dann vom Rest des Komplexes durch intrazelluläre Enzyme, die den Polymer-
Linker schneiden, abgespalten.
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Wenn das Gen, das transferiert werden soll, einmal mit einem geeigneten Transfervehikel
verbunden ist, muß es in das Gangsystem des Pankreas eingeführt werden. Der bevorzugte
Weg führt durch den Pankreas gang. Im Falle der Leber sowie im Falle des Pankreas kann das
genetische Material zu dem gewünschten Gangsystem durch den Darm angeliefert werden.
Wenn nur eines der beiden Organe das gewünschte Ziel darstellt, kann das andere durch eine
Ligatur an der Stelle, an der sich der Gang in den Darm entleert, blockiert werden.
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Jedes medizinisch akzeptierte Verfahren zum Einbringen von Material in die Gänge dieser
Organe kann in dieser Erfindung verwendet werden. Das angewendete Verfahren ist
bevorzugterweise minimal invasiv und verwendet das retrograde Füllen der Gänge. Ein
solches bevorzugtes Verfahren ist das endoskopisch-retrograde Cholangiographieverfahren
(ERCP). ERCP wird derzeit angewendet, um die Gangsysteme der Galle und des Pankreas
durch Kanülierung des gemeinsamen Gallenganges oder des Pankreasgangs durch ein
Endoskop und die Injektion von Kontrastfarbstoffen sichtbar zu machen. In den Verfahren
dieser Erfindung wird der Farbstoff durch das Gen, das transferiert werden soll, und das damit
verbundene Transfervehikel ersetzt. Andere Verfahren zum Einbringen des Gens von
Interesse in das Zielorgan, umfassen die chirurgische Einpflanzung und das Einbringen über
ein Laparoskop.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur
Behandlung von Erkrankungen des Pankreas unter Verwendung des Verfahrens des
somatischen Gentransfers bereit. Es sind verschiedene Erkrankungen bekannt, die mit
genetischen Defekten der Epithelien des Pankreas verbunden sind. Darüber hinaus
manifestieren sich bestimmte Symptome verschiedener Erkrankungen des Pankreas in den
Epithelzellen dieses Organs. Zum Beispiel könnte die, Entzündung des Pankreas durch die
Verfahren dieser Erfindung verhindert werden, wenn sie dazu verwendet werden, um
Cytokingene in das Epithel zu transferieren. Beispiele für einige der anderen Erkrankungen,
die durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt werden können, umfassen aufsteigende
sklerosierende Gallengangsentzündung und primäre Gallensklerose.
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Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung, die durch die
Verfahren dieser Erfindung behandelt werden soll. CF. CF ist eine Erkrankung, die ihre
primären Wirkungen auf die Epithelien des Lungenluftweges ausübt. Die Erkrankung betrifft
jedoch auch die Epithelien des Pankreas und der Leber. Diese sekundären Erkrankungsorte
werden immer wichtiger, da verschiedene Therapien zu Behandlung von an CF erkrankten
Lungen entwickelt werden.
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CF kann zu Gallestauung, Gelbsucht und schließlich zur Zirrhose in der Leber und zu
Bauchspeicheldrüsenentzündung und Malabsorption im Pankreas führen. Die derzeitige
Behandlung von mit CF in Verbindung stehenden Pankreaserkrankungen umfaßt die
Enzymersatztherapie. Die Patienten leiden jedoch immer noch unter der
Bauchspeicheldrüsenentzündung und damit verbundener Falschernährung. Es gibt derzeit
keine Behandlung von mit CF in Verbindung stehenden Leberstörungen.
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Das defekte Gen bei der CF ist CFTR (der cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator), ein angenommener Transmembran-Chloridkanal. Die Expression von CFTR in der
Leber wurde in den Epithelzellen, die den Gallengang auskleiden, lokalisiert. Im Pankreas
scheinen die Zellen, die die Gänge des exokrinen Pankreas auskleiden, die Quelle der CFTR-
Expression darzustellen. Demgemäß sind die Verfahren dieser Erfindung zur Behandlung von
mit CF in Verbindung stehenden Pankreasstörungen gut geeignet.
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Eine CFTR-cDNA wird in der gleichzeitig anhänsigen Anmeldung mit der Serien-Nr.
584,274 und in F. S. Collins et al., Science 235, S. 1046-49 (I987) beschrieben, deren
Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Diese cDNA kann in jedes der
Genanlieferungssysteme, die vorstehend beschrieben wurden, eingebaut werden und dann in
den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel wird die Konstruktion
bestimmter rekombinanter viraler Vektoren, die die CFTR-cDNA enthalten, in der
Anmeldung 584,274 beschrieben. Diese Vektoren sind nützlich bei den Verfahren dieser
Erfindung.
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Am stärksten bevorzugt wird die CFTR-cDNA in ein Derivat des Adenovirus Ad5 eingebaut.
Die Konstruktion dieses rekombinanten Vektors wird in den spezifischen Beispielen,
nachstehend, beschrieben.
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Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann werden die
nachfolgenden Beispiele angeführt. Es sollte selbstverständlich sein, dass diese Beispiele nur
für erläuternde Zwecke dienen und nicht erstellt wurden, um diese Erfindung in irgendeiner
Weise zu beschränken.
BEISPIEL I
Die Konstruktion rekombinanter Adenoviren
I. pAd.CMV-lacZ
A. Herstellung eines CMV-Promotor-lacZ-Minigens
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Das Plasmid pUC19 [C. Yanisch-Perron et al.: Gene 33, S. 103-19 (1985)] wurde mit
SmaI verdaut, und ein 8 Nucleotide langer NotI-Linker wurde dann an das Ende
cloniert. Dies zerstörte die SmaI-Schnittstele und erzeugte zwei SacII-Schnittstellen
auf jeder Seite des Linkers. Ein 196 Basenpaare großes Fragment, das das
Polyadenylierungs-Signal aus SV40 (SV40-Nucleotide 233-2729) enthielt, wurde
dann aus einem SV40 enthaltenden Vektor [G. MacGregor et al., Somat. Cell Mol.
Genet. 13, S. 253-65 (1987)] gereinigt. Diesem Fragment wurden BamHI-Linker
angefügt, und es würde dann in die einzige BamHI-Schnittstelle des modifizierten
pUC19-Vektors cloniert. Das Polyadenylierungs-Signal war so orientiert, dass die
Transkription, die an einem Promotor stromaufwärts der NotI-Schnittstelle begann und
diese Restriktionsschnittstelle durchlief, auf das Polyadenylierungs-Signal des späten
Gens von SV40 trifft. Das Polyadenylierungs-Signal des frühen Gens von SV40
befindet sich in der entgegengesetzten Orientierung.
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Ein 180 Basenpaare großes XhoI-PstI-Fragment aus dem Plasmid pLl [H. Okayama et
al Mol. Cell Biol. 3, S. 280-89 (1983)], das die 165/195-Spleiß-Donor- und
Akzeptor-Signale des späten viralen Proteingens von SV40 enthielt, wurde dann in
den vorstehenden Vektor cloniert, um die geeigneten Signale bereitzustellen. Der
Promotor und Enhancer des sehr frühen Gens des menschlichen Cytomegalievirus, die
als ein 619 Basenpaare großes ThaI-Fragment aus pCM5029 [M. Boshart et al., Cell
41, S. 521-30 (1985)] erhalten wurden, wurde in die HincII-Schnittstelle von pUC18
cloniert und anschließend aus diesem Vektor als Teil eines BamHI/HindIII-Fragments
gewonnen. Dieses Fragment wurde dann mit 14-Polymerase behandelt und mit glatten
Enden mit dem vorstehend beschriebenen modifizierten pUC19 Vektor ligiert.
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Das β-Galetosidasegen aus E. coli wurde mit EcoRI und XbaI aus pC4AUG [G. R.
McGregor et al., Somat. Cell Mol. Genet, 13, 5 953-65 (1987)] als ein 3530
Basenpaare großes Fragment ausgeschnitten. Dann wurden dem Fragment NotI-Linker
angefügt, und das so erhaltene Konstrukt wurde in die NotI-Schnittstelle des
vorstehend beschriebenen modifizierten pUC19-Vektors cloniert.
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Das vollständige Minigen, das den CMV-Promotor/Enhancer, das lacZ-Gen und das
SV40-Polyadenylierungs-Signal enthielt, wurde dann mit SphI aus dem pUC19-
Vektor ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment behandelt und
mit BcII-Linkern liniert.
B. Die Herstellung von pAdBglII und die Ligieng des Minigens in dieses Plasmid
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Das Plasmid pEHX-L3 [E. Falck-Pedersen et al., J Virol 63, S. 532-42 (1989)], das
Sequenzen aus Ad5 enthält, die die Kartierungseinheiten 0 bis 16,1 umspannen, wurde
mit EcoRI und BglII verdaut, um ein 5,2 Kilobasen großes Fragment, das die
Adenovirus-Sequenzen ab der Kartierungseinheit 9,2 bis 16,1 sowie das Plasmidgerüst
enthielt, zu entfernen. Die Adenovirus-Sequenzen, die die Kartierungseinheiten 0 bis 1
umspannen, und die invertierte 5'-Wiederholungssequenz, den Replikationsursprung
und die Verkapselungs-Signale enthielten, wurden aus dem ursprünglichen pEHX-L3-
Vektor amplifiziert und mit einer NheI-Schnittstelle am 5'-Ende, die direkt
stromabwärts der EcoRI-Schnittstellle liegt, und mit einer BalII-Schnittstelle am 3 -
Ende unter Verwendung der PCR versehen. Das durch PCR amplifizierte Fragment
wurde dann mit dem EcoRI/BelII-Fragment ligiert, um das Plasmid pAdBglII
herzustellen.
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Das lacZ enthaltende Minigen, das, wie im vorstehenden Teil A beschrieben,
hergestellt worden war, wurde dann in der direkten Orientierung in den pAdBglII-
Vektor ligiert, der mit BglII verdaut und mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt
worden war. Eine schematische Darstellung von pAd.CMV-lacZ ist in Fig. 1
abgebildet.
II, yAd.CB-CFTR
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Das Plasmid pAd.CB-CFTR ist von pAd.CMV-lacZ abgeleitet. Es enthält den β-
Aktin-Promotor aus dem Huhn, die menschliche CFTR-cDNA und eine kleines
Teilstück retroviraler Mo-MLV-Sequenzen anstelle des CMV-Promotors und des
lacZ-Gens.
A. Die Konstruktion von pCMV-BA-CFTR
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Der Vektor pBA-CFTR enthält ein intaktes 5'-LTR aus Mo-MLV und zusätzliche
virale Mo-MLV-Sequenzen zwischen dem 5'-LTR und dem internen Promotor, die
die Nucleotide 146 bis 624 umspannen. Das Plasmid enthält auch Wildtyp-Mo-MLV-
Sequenzen ab der ClaI-Schnittstelle bei Nucleotid 7674, die anschließend mit
synthetischen Linkem in eine BamHI-Schnittstelle umgewandelt wurde, bis zu dem
Ende des 3'-LTRs. Sequenzen, die die viralen Enhancerelemente des 3' LLTR ab der
PvuII-Schnittstelle bei Nucleotid 7933 bis zur XbaI-Schnittstelle bei Nucleotid 8111
enthielten, wurden deletiert. Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Sequenzen
enthält der Vektor auch flankierende genomische Maus-DNA- und pBR322-
Sequenzen, die die HindIII-Schnittstelle bis, zu der EcoRI-Schnittstelle umspannen.
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Der β-Aktin-Promotor in diesem Vektor würde aus einem XhoI-MboI-Fragment des
Hühner-β-Aktingens, das die Nucleotide -266 bis +1 [T. A. Kost ei al., Nucl. Acids
Res. 11, S. 8237-301 (1983)] umspannt, abgeleitet. Die MboI-Schnittstelle wurde
anschließend in eine BamHI-Schnittstelle umgewandelt, und das modifizierte
Promotor-Fragment wurde in den vorstehenden Vektor cloniert. Die menschlichen
codierenden CFTR-Sequenzen wurden aus einem 4.6 kb großen SacI-Fragment einer
CFTR-cDNA [J. R. Riordan et al., Science 245, S. 1066-73 (1989)] abgeleitet und
enthielten, zusätzlich zu der vollständigen codierenden CFTR-Region, kleine Stücke
nicht-translatierter 5'- und 3'-Bereiche. Die SacI-Schnittstellen wurden in BcII-
Schnittstellen umgewandelt, und das modifizierte Fragment wurde in die BamHI-
Schnittstelle des vorstehenden Vektors direkt hinter den β-Aktin-Promotor cloniert.
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Die Enhancer-Sequenzen aus dem sehr frühen Gen des menschlichen CMV wurden
durch den Verdau von CDM1 [B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 3365-
69 (1937)] mit SpeI und PstI, die Reinigung des Fragments, das die Enhancer-
Sequenzen enthielt, und die Clonierung in pUC19 erhalten. Ein Teilstück der
Enhancer-Sequenz wurde dann mit XhoI und NcoI aus diesem Vektor
herausgeschnitten. Nach der Reinigung wurde die NcoI-Schnittstelle durch Anhängen
von synthetischen Linkem in eine XhoI-Schnittstelle umgewandelt, und das
modifizierte Fragment wurde in die einzige XhoI-Schnittstelle, die sich 5' des β-
Aktin-Promotors des vorstehend beschriebenen Vektors befand, cloniert. Der so
erhaltene Vektor wurde als pCMV-BA-CFTR bezeichnet.
B. Ersatz des lacZ-Minigens in pAd-CMV-lacZ durch das CFTR-Minigen
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Der Vektor pCMV-BA-CFTR wurde mit XhoI und NheI verdaut, um ein Fragment,
das den β-Aktin-Promotor, das CFTR-Gen und einen kleinen Teil Retrovirusspezifischer
Sequenzen enthielt; freizusetzen und dann mit glatten Enden versehen.
Das Plasmid pAd.CMV-lacZ wurde mit SnaBI und NotI geschnitten, um den CMV-
Promotor und das lacZ-Strukturgen auszuschneiden. Der verbleibende Teil des
Plasmids, dem der CMV-Enhancer und das SV40-Poyladenylierungs-Signal verblieb,
wurde mit glatten Enden versehen und mit dem glattendigen Fragment aus pCMV-
BA-CFTR ligiert, um das Plasmid pAd.CB-CETR zu erzeugen. Eine schematische
Darstellung von pAd.CB-CFTR wird in Fig. 2 gezeigt.
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Plasmide, die durch die vorstehend beschriebenen Schritte hergestellt wurden, werden
durch rekombinante DNA-Moleküle veranschaulicht, die bei der American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. USA am 10.
Mai 1993 hinterlegt wurden, und sind durch die folgende Hinterlegungsnummer
identifiziert:
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ATCC 75468 - pAd.CB-CFTR.
III. Die Erzeugung des rekombinanten Δd.CB-CFTR-Virus
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Der Vektor pAd.CB-CFTR wurde mit NheI linearisiert und mit dem durch XbaI
verdauten viralen Genom d17001gemischt. Das d17001-Virus ist ein rekombinantes
Ad5/Ad2-Virus, das eine Deletion in den E3-Sequenzen aufweist, die die
Kartierungseinheiten 78,4 bis 86 umspannen. Dieses Virus wurde aus einem
rekombinanten Ad5-Ad2-Ad5-Virus abgeleitet, das aus dem EcoRI-Fragment aus
Ad5, das die Kartierungseinheiten 0-76 umspannt, dem EcoRI-Fragment aus Ad2, das
die Kartierungseinheiten 76-83 umspannt, und dem EcoRI-Fragment aus Ad5, das die
Kartierungseinheiten 83-100 umspannt, besteht. Die Sequenzen, die die
Kartierungseinheiten 7 8,4 bis 86 dieses rekombinanten Ad5-Ad2-Ad5-Virus
umspannen, wurden dann herausgeschnitten, um d17001 zu erzeugen [Claearas und
Wold, Virol. 140, S. 23-43 (1985)].
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Ich zog 293-Zellen [F. L. Graham et al., in: Methods in Molecular Biology, Bd. 7, E.
J. Murray, Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ, S. 109-28 (1991)] in 150 mm-
Platten an, die DMEM enthielten, das mit 10% fetalem Kälberserum, 100 U/ml
Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ("1% Pen-Strep") ergänzt worden war, bis eine
Konfluenz von 80% erreicht worden war. Die Zellen wurden dann mit dem
linearisierten Ad.CB-CFTR und mit XbaI verdautem d17001 cotransfiziert. Die Zellen
wurden angezogen, bis sich Plaques bildeten. Dann wurden individuelle Plaques
isoliert und in 293-Zellen amplifiziert. Dann isolierte ich die virale DNA aus
individellen Plaques und untersuchte sie durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und
Southern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der menschlichen CFTR-DNA.
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Einer der CFTR-positiven Plaques wurde dann ein zweites Mal über Plaques gereinigt,
und das darin enthaltene Virus wurde als AD. CB-CFTR bezeichnet. Dieses Virus
wurde in 293-Zellen wie folgt vermehrt. 30 150 mm-Platten mit 293-Zellen wurden,
wie vorstehend beschrieben, angezogen, bis sie eine Konfluenz von 80-80%
erreichten. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden dann mit Ad.CB-
CFTR (enthalten in 10 ml DMEM/1% Pen-Strep) bei einem MOI.-Faktor von 10 über
zwei Stunden infiziert. Dann fügte ich 20 ml DMEM/15% fötales Rinderserum/1%
Pen-Strep hinzu und setzte die Inkubation fort. Etwa 36-40 Stunden nach der Infektion
erntete ich die Zellen durch Zentrifugation und resuspendierte sie in 18 mi 10 mM
Tris-HCl, pH 8,1. Die Zellen wurden durch drei Einfrier/Aufbau-Runden
aufgebrochen. Dann wurden die Zelltrümmer durch 20 Minuten Zentrifugation bei
1.500 · g sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Sediment wurde einmal
mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 gewaschen. Die Überstände wurden vereinigt und auf
einen 20 ml-CsCl-Stufengradienten (1,20 g/ml und 1,45 g/ml in 10 mM Tris-HCl, pH
8,1) überschichtet und 2 Stunden bei 100.000 · g zentrifugiert. Dann entfernte ich die
Bande aus Viruspartikeln, verdünnte sie mit einem Volumen des Tris-Puffers und
unterwarf sie einer zweiten Runde der CsCl-Bandierung in 8 ml-Gradienten. Nach 18
Stunden Zentrifugation bei 100.000 · g gewann ich die Viruspartikel und bewahrte sie
in 5 Volumina 10 mM Tris-HCl, pH 8,1; 100 mM NaCl; 0,1% BSA; 50% Glycerin
auf. Vor der weiteren Verwendung entsalzte ich das Viruspräparat durch Gelfiltration
über Sephadex-G50 in Hams-Medium.
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Die Endonzentration des Virus wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm
bestimmt. Ich beurteilte den Virus-Titer durch Plaque-Testansätze unter Verwendung
von 293-Zellen. Ich kontrollierte auch die Anwesenheit replikationskompetenter Viren
durch die Infektion von HeLa-Zellen bei einem MOI-Faktor von 10, gefolgt von einer
weiteren Passage der Zellen über 30 Tage. Die Anwesenheit replikationskompetenter
Viren wird durch die Beobachtung cytopathogener Wirkungen in den infizierten
HeLa-Zellen ermittelt. Keiner der Viren, die bei den folgenden Verfahren verwendet
wurden, war replikationskompetent.
BEISPIEL 2
Die Fähigkeit von Ad.CB-CFTR. CF-Zellen zu transformieren
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Zuerst untersuchte ich die Fähigkeit von Ad.CB-CFTR, das CFTR-Gen in die Zelllinie
CFPAC zu übertragen, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF
[M. L. Drumm et al., Cell 62. 511227 (1990)) abgeleitet worden war. Ich zog diese
Zellen bei 37ºC bis zur Konfluenz in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (Gibco
Laboratories, Grand Island. NY), das mit 10% fötalem Kälberserum und 1% Pen-
Strep ergänzt worden war, in 10 cm²-Platten an. Dann infizierte ich die Zellen mit
Ad.CB-CFTR mit einem MOI.-Faktor von 1. 48 Stunden nach der Infektion wurden
die Zellen auf den Gentransfer und die Expression von CFTR hin untersucht. Die
Untersuchung wurde mit zellulärer DNA und RNA vorgenommen, sowie unter
Verwendung der Immuncytochemie, um ganze Zellen zu untersuchen.
Radioaktivmarkierte Hybridisierungs-Sonden wurden aus einer PCR-Matrize synthetisiert, die
aus der Ratten-CFTR-cDNA (Nucleotide 17 70-2475), die in M. A. Fiedler et al., Am.
J. Physiol. 262, 5. L779 (1992) beschrieben wurde, abgeleitet worden war, deren
Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist; dies geschah unter
Verwendung des in vitro-Transkriptions-Systems von Promega (Promega Corporation,
Pittsburgh, PA) und unter Befolgung der Vorschriften des Herstellers. Die Sonden
wurden bei Southern- und Northern-Blot-Analysen sowie bei in sitzt-
Hybridisierungsstudien verwendet.
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Die Gesamtzell-DNA sowohl der scheininfizierten als auch der
Ad.CB-CFTRinfizierten Zellen (10 gg) wurde isoliert und mit XbaI verdaut. Southern-Blots der
DNA, die aus den infizierten Zellen stammte, zeigten hohe Spiegel des Gentransfers
(Fig. 3). Die Gesamtzell-RNA sowohl der scheininfizierten als auch der Ad.CB-
CFTR infizierten Zellen wurde isoliert, durch Elektrophorese in
Formaldehyd/Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Die
Northern-Blots zeigten einen hohen Spiegel von CFTR-Transkripten (Fig. 4).
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Es wurde ebenfalls Immuncytochemie mit den Zellen durchgeführt, um das CFTR-
Protein nachzuweisen. Die Zellen wurden 10 Minuten bei -20ºC in Methanol fixiert
und dann 30 Minuten mit 20% normalem Ziegenserum in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung ("GS/PBS") inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 5 p.g/ml eines
polyclonalen Antikörpers aus Kaninchen, der gegen ein C-terminales Peptid
(Aminosäuren 1468-1480) erzeugt wurden war, das zwischen dem menschlichen und
dem CFTR aus Ratten konserviert ist [J. A. Cohn et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. IBI, S. 36 (1991); C. R. Marino et al., J. Clin. Invest. 88, S. 712 (1991); J. A.
Cohn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, S. 2340 (1992)], 50 Minuten in 2%
GS/PBS inkubiert. Die Kontrollen umfaßten die Inkubation mit einem nicht-reaktiven
Antikörper und die Vorinkubation des Anti-CFTR-Peptid-Antikörpers mit 0,5 ug/ml
CFTR-Peptid in 2 Wo GS/PBS über Nacht bei 4 vor der Inkubation mit den Zellen.
Nach der Inkubation mit dem Antikörper wurden die Zellen dreimal 5 Minuten mit 2
Wo GS/PBS gewaschen. Der Antikörper wurde durch Inkubation der Zellen mit einem
anti-Kaninchen-IgG aus Ziegen, das an FITC gekoppelt war, sichtbar gemacht. Die
Ergebnisse dieses Experiments zeigten, das fast alle Zellen, die dem Virus ausgesetzt
worden waren, nachweisbare Spiegel des CFTR exprimierten (Fig. 5).
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Die Zellen wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin, eine cAMP regulierte Anionen-
Leitung zu zeigen, untersucht - eine Eigenschaft, die die Expression eines
funktionellen CFIR-Proteins anzeigt. Genauer gesagt, zog ich die Zellen auf Kollagen
beschichteten Glas-Deckgläsern bis zur Konfluenz unter den vorstehend
beschriebenen Bedingungen an. Dann entfernte ich das Medium und ersetzte es durch
eine hypotonische 1 : 1-Verdünnung eines NaI-Puffers (130 mM NaI, 4 mM KNO&sub3;, 1
mM Ca(NO&sub3;)&sub2;, 1 mM Mg(NO&sub3;)&sub2;, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glucose, 20 mM HEPES,
pH 7,4) in Wasser. Dann fügte ich 10 mM (Endkonzentration) des
Halogenidempfindlichen Fluorophors 6-Methoxy-N-(3-sulfopropyl)-quinolinium ("SPQ") zu
und inkubierte 12 Minuten bei 37ºC. Ich entfernte den SPQ enthaltenden Puffer und
ersetzte ihn durch unverdünnten isoosmotischen NaI-Puffer und inkubierte die Zellen
weitere 5 Minuten. Die Deckgläser wurden dann auf den Mikroskopträger übertragen,
wo sie unter Verwendung einer 40X Ölemersionslinse (Nikon CF-Fluorlinse) unter
Licht, das durch einen Anregungsfilter bei 370 nm geleitet wurde, abgebildet wurden.
Die abgestrahlte Fluoreszenz der Zellen wurde durch einen Bildverstärker mit hoher
Auflösung (Video Scope Inc., Washington. D. C.), der mit einer Videokamera
verbunden war, gesammelt. Der Signalausgang der Kamera war mit einer digitalen
Bildverarbeitungs-Einheit, die durch die IMAGE 1/FL-Software (Universal Imaging.
Media, PA) gesteuert wurde, verbunden.
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Fast alle Zellen, die dem Virus ausgesetzt worden waren, verfügten wieder über die
Fähigkeit, eine c AMP regulierte Anionen-Leitung durchzuführen. Dieses Experiment
zeigte, dass das Ad.CB-CFTR-Virus in der Lage war, den Gentransfer in Zellen
auszuführen und Defekte irr CETR-Gen zu heilen.
BEISPIEL. 3
Die in vivo-Transfektion von Epithelzellen der Galle in Ratten
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Ich verwendete das Ad.CMV-lacZ-Virus, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, um
Verfahren zur gezielten in vivo-Anlieferung an Epithelzellen der Galle in Ratten zu
entwickeln.
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Männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 200 g) wurden mit Isofluran betäubt und
ihre Eingeweide durch einem Medianschnitt freigelegt. Dann identifizierte ich den
gemeinsamen Gallengang und führte eine 27-Gauge-Nadel ein. Unterschiedliche
Konzentrationen des Virus (1 · 10¹¹ - 2 · 10¹² PBE/ml) wurden in 0,3 ml
phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert, und ein 0,3 ml-Aliquot wurde
langsam retrograd jeder Ratte infundiert. Nach Beendigung der Infusion entfernte ich
die Nadel und übte einen sanften Druck auf die Einstichstelle des Gallenganges aus.
Die Haut und die Faszie wurden dann in einer Lage mit unterbrochenen Nähten
geschlossen, und dem Tier wurde erlaubt, sich zu erholen.
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Als Kontrolle verwendete ich das Ad.CB-CFTR-Virus (1 · 10¹¹ BPE/ml) zur
retronraden Infusion, das in Beispiel 2 beschrieben wurde.
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Nach drei Tagen wurden die Tiere euthanisiert. Dann wurde das Lebergewebe auf die
lacZ-Expression unter Anwendung der X-Gal-Immunchemie hin beurteilt. Frische,
eingefrorene Schnitte (6 um) wurden aufgezogen, nachträglich 10 Minuten mit 0,5%
Glutaraldehyd/PBS fixiert, zweimal in 1 mM MgCl&sub2;/PBS gewaschen und 4 Stunden in
X-Gal-Lösung (1,6 ug/ml K&sub3;Fe(CN)&sub6;. 2,1 ug/ml K&sub4;Fe(CN)&sub6; · 3 H&sub2;O. 40 ug/ml 14-
Gal) inkubiert. Tiere, denen die maximale Virusmenge (2 · 10¹² BPE/ml) infundiert
worden war, zeigten eine lacZ-Expressioin in allen Epithelzellen der Galle sowie in
über 80% der Leberzellen. Bei niedrigeren Dosen des Virus (1 · 1011 BPE/ml) war
der Gentransfer selektiver, da weniger als 1% der Leberzellen lacZ exprimierten,
während fast alle Epithelzellen der Gallengänge in der Leber die Expression des lacZ
fortsetzten (Fig. 6, Teilabbildungen B und C). Tiere, denen Ad.BD-CFTR infundiert
worden war, zeigten keine lacZ-Expression (Fig. 6, Teilabbildung A).
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Um die Stabilität der Expression dieses transferierten Gens abzuschätzen, wurden
Ratten, die die selektivere Dosis des Virus erhalten hatten, 7 und 21 Tage nach der
Infektion euthanisiert. Nach sieben Tagen war die Expression in den Leberzellen und
den Epithelien der großen Gallengänge deutlich vermindert (Fig. 6, Teilabbildung
D). Die Expression von lacZ in den Epithelien der kleinen Gallengänge blieb jedoch
über die 21 Tage bestehen (Fig. 6, Teilabbildung E).
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Die gleichen Arten von Experimenten würden wiederholt zur Untersuchung der
CFTR-RNA unter Verwendung von Ratten- oder menschlichen CFTR
spezifischen-Sonden. Ich verwendete 0,3 ml einer 1 · 10¹¹ PPE/ml-Lösung entweder von Ad.CB-
CFTR oder von Ad.CMV-lacZ-Viren, um Ratten zu infizieren. Serienschnitte der
Leber, die infizierten Ratten entnommen worden waren, wurden auf die Anwesenheit
der CFTR-RNA unter Verwendung der in situ-Hybridisierung mit Sonden, die
entweder für das Ratten- oder das menschliche CFTR spezifisch waren, hin untersucht.
Die Epithelzellen der Galle der mit Ad.CMV-lacZ infizierten Ratten hybridisierten mit
der Ratten-CFTR-Sonde (Fig. 7, Teilabbildung A), aber nicht mit der menschlichen
Sonde (Fig. 7, Teilabbildung B). Dies zeigte die Spezifität der menschlichen Sonde.
Tiere, die mit dem Ad.CB-CTFR-Virus infiziert worden waren, zeigten eine diffuse
Verteilung der menschlichen CFTR-RNA über die ganzen Epithelzellen der Galle der
großen und der kleinen Gallengänge in der Leber (Fig. 7, Teilabbildung C). Diese
Verteilung war ähnlich der Verteilung der endogenen Ratten-CFTR-RNA (Fig. 7,
Teilabbildung D). Darüber hinaus wurde das menschliche CFTR-Transkript in einer
kleinen Zahl von Leberzellen nachgewiesen.
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Die Schnitte der Rattenleber wurden ebenfalls durch Doppel-Immundiffusion unter
Verwendung von Antikörpern, die für CFTR und für Cytokeratin-18. ein Marker, der
in hohem Spiegel in den Epithelzellen der Galle exprimiert wird, spezifisch waren.
untersucht. Tiere, die mit Ad.CB-CFTR behandelt worden waren, zeigten eine
Bindung des CFTR-Antikörpers an die apikalen Oberflächen der meisten Epithelzellen
der Galle (Fig. 8, Teilabbildung A). Diese Bindung war weit im Überschuß
gegenüber der Bindung des Antikörpers an endogenes CFTR-Protein in den
Ad.CMVlacZ-infizierten Tieren (Fig. 8, Teilabbildung C). Die CFTR-spezifische
Antikörperbindung, die in Ad.CB-CFTR infizierten Tieren nachgewiesen wurde,
befand sich in den gleichen Zellen, wie die Antikörper gegen Cytokeratin-18 (dies
wurde ebenfalls für die Ad.CMV-lacZ-infizietten Tiere gezeigt), was bestätigt, dass
das rekombinante CFTR in dem richtigen Zelltyp exprimiert wird (Fig. 8,
Teilabbildungen B und D).
BEISPIEL 4
CFTR-Gentransfer in Epithelzellen der Gallen- und Pankreasgänge menschlicher Patienten
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Ad.CB-CFTR wird verwendet, um die Leber, die Galle und den Pankreas betreffenden
Aspekte der CF zu behandeln. Ein Patient, dei unter CF leidet, wird einer Endoskopie
unterzogen, um den Zwölffingerdarm sichtbar zu machen und den gemeinsamen
Gallengang zu lokalisieren. Nach der Lokalisierung wird in den gemeinsamen
Gallengang eine Kanüle eingeführt. Eine geeignete Konzentration des Virus (etwa 1 ·
10¹¹ PBE/ml) in 50-150 ml PBS wird in den gemeinsamen Gallengang durch
endoskopisch-retrograde Cholangiographie eingebracht. Nach der Prozedur beginnt
der Patient mit der Expression von CFTR in den Epithelzellen der Galle.
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Zur Behandlung der den Pankreas betreffenden Aspekte der CF wird einer ähnlichen
Vorschrift gefolgt. Eine Ligatur wird zwischen den Leber- und den Gallengang
gesetzt. Dann wird eine Nadel in den Darm eingeführt, um das Virus in die
Pankreasgänge zu infundieren.
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Ähnliche rekombinante Adenoviren, die andere Gene oder cDNA-Kopien davon
tragen, werden in den gleichen Verfahren verwendet, um andere genetische Defekte
dieser Epithelzellen zu heilen. Die genetischen Defekte von Leberzellen. Pankreas-
Acinuszellen und Pankreas-Inselzellen können ebenfalls durch die Verwendung
solcher rekombinanter Viren geheilt werden, wenn die Viren in die Gallen- und
Pankreasgänge in höheren Konzentrationen eingebracht werden.
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Obwohl ich hierin vorstehend eine Anzahl von Ausführungsformen dieser Erfindung
präsentiert habe, ist es offensichtlich, dass meine grundlegende Konstruktion verändert
werden kann, um andere Ausführungsformen; die die Verfahren dieser Erfindung
verwenden, bereitzustellen. Deshalb wird anerkannt, dass der Rahmen dieser
Erfindung eher durch die Ansprüche, die hieran angehängt sind, definiert wird, als
durch die spezifischen Ausführungsformen, die hierin vorstehend durch Beispiele
präsentiert wurden.