DE69431106T2 - Gentransfer zu den pankreatischen epithelzellen - Google Patents

Gentransfer zu den pankreatischen epithelzellen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für den selektiven somatischen Gentransfer in Epithelzellen des Pankreas eines Patienten. Die Verfahren dieser Erfindung umfassen das Einbringen des Gens, das transferiert werden soll und das mit einem geeigneten Transfervehikel verbunden ist, in das Gangsystem des Pankreas. Genauer umfaßt die Erfindung die Verwendung dieser Verfahren, um genetische Erkrankungen wie z. B. cystische Fibrose zu behandeln, die durch genetische Defekte in diesen Epithelzellen charakterisiert sind.
  • Die Epithelzellen, die die Gänge der Leber und des Pankreas (sowohl endokrin als auch exokrin) auskleiden, sind für die Synthese zahlreicher Proteine verantwortlich, die für die Aufrechterhaltung des einwandfreien Funktionierens dieser Organe und die Homöostase im allgemeinen wichtig sind. Erkrankungen, die Defekte in den Genen verursachen, die diese Proteine codieren, können schwerwiegende und manchmal tödliche Auswirkungen haben.
  • Zum Beispiel ist die cystische Fibrose (CF) eine Erkrankung, die durch Abnormalitäten im Wasser- und Elektrolyttransport in die und aus den Zellen charakterisiert ist. Das Gen, das für die CF verantwortlich ist, das CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen, ist dafür bekannt, dass es in den Epithelzellen von CF-Patienten defekt ist. Die Isolierung und die Sequenz dieses Gens werden in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Serien-Nr. 401,609, die am 31. August 1989 eingereicht wurde, beschrieben. Obwohl der primäre Schadensort bei CF-Patienten das Lungenepithel ist, sind sowohl die Epithelien des Pankreas als auch die der Gallengänge ebenfalls betroffen [T. F. Boat et al., in: The Metabolic Basis of Inherited Disease - 6. Ausgabe, C. R. Scriver et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, S. 2649-80 (1989)].
  • Andere Erkrankungen, die durch genetische Defekte in den Epithelzellen der Leber und des Pankreas charakterisiert sind, sind Gallensteine (Cholelithiasis), aufsteigende sklerosierende Gallengangsentzündung, primäre Gallenzirrhose und Diabetes mellitus.
  • Die Behandlung der vorstehend beschriebenen Erkrankungen ist von großer Bedeutung. Ein aufregender Ansatz besteht in der Verwendung der Genersatztherapie, um funktionelle Kopien defekter Gene direkt in die betroffenen Zellen zu inserieren.
  • Die Idee der Genersatztherapie entstand aus dem erfolgreichen Transfer von Genen in Säugerzellen heraus, die in Kultur gehalten wurden. Das am besten bekannte Verfahren des Gentransfers wird durch die Behandlung von Säugerzellen mit einem Copräzipitat aus Calciumphosphat und der Nucleinsäuresequenz, die transferiert werden soll, erreicht. Die Säugerzellen nehmen dieses Präzipitat über Endocytose auf, und einige dieser Zellen können dann das Polypeptid, das durch die Nucleinsäuresequenz codiert wird, exprimieren. Unglücklicherweise ist dieses Verfahren auf in vitro-Zellkulturen beschränkt and hat bei der Behandlung eines Patienten in vivo keine große Nützlichkeit. Die Gründe dafür liegen in der unlöslichen Natur der Nucleinsäuren und in der niedrigen Wirksamkeit, mit der die Körperzellen diese Präzipitate aufnehmen.
  • Andere Verfahren wie die Verwendung von Viren oder Liposomen, um die Nucleinsäuren zu den Zielzellen zu tragen, besitzen eine größere Anwendbarkeit in vivo [C. Nicolau et al., Meth. Enzymol. 149, S. 157-76 (1987)]. Aber diese Verfahren leiden ebenfalls unter Unzulänglichkeiten. Am wichtigsten ist, dass keines dieser Verfahren für einen bestimmten Zelltyp spezifisch ist - wodurch es schwierig wird, das Gen von Interesse an die richtigen Zellen über die Standard-Verabreichungswege anzuliefern.
  • Vor Kurzem wurde ein Verfahren zum zellspezifischen Gentransfer unter Verwendung von Nucleinsäuren, die an Zellrezeptorliganden konjugiert sind, beschrieben [Patent 5,166,320 der Vereinigten Staaten]. Obwohl dieses Verfahren die zur in vivo-Gentherapie nötige Zellspezifität bereitstellt, ist es auch mit zusätzlichen Kosten und Manipulationen bei der Erzeugung der Nucleinsäure-Liganden-Konjugate verbunden.
  • Die gleichzeitig anhängige Anmeldung des Anmelders mit der Serien-Nr. 584,275, die am 18. September 1990 eingereicht wurde nun das Patent 5,240,846 der Vereinigten Staaten darstellt, beschreibt ein Verfahren zur Verwendung der Gentherapie, um cystische Fibrose zu behandeln. Die Anmeldung beschreibt eine Anzahl verschiedener Genverabreichungssysteme und eine Anzahl von Verabreichungsverfahren, genauer gesagt die Inhalation, die Injektion und die Einnahme. Die Anmeldung richtet sich spezifisch auf die Behandlung der Lungenepithelien, bezieht sich aber auch kurz auf die Behandlung von Epithelzellen des Pankreas und der Galle. Die Anmeldung zeigt jedoch nicht, dass jedes der beschriebenen Verfahren für die Behandlung von Lungenepithelien für Epithelzellen des Pankreas und der Galle wirksam oder spezifisch sein kann.
  • Demgemäß besteht noch immer ein Bedarf an einem kostengünstigen und relativ leichten Weg, um einen zellspezifischen Gentransfer in die Epithelzellen der Leber und des Pankreas zu erreichen.
  • Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf durch die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens für den in vivo-Gentransfer in Epithelzellen des Pankreas.
  • Der Anmelder entdeckte, dass die Verabreichung des Gens, das transferiert werden soll, wenn es mit einem geeigneten Transfervehikel verbunden ist, in das Gangsystem des Pankreas überraschenderweise eine selektive Aufnahme durch die Epithelzellen, die den Gang auskleiden, bewirkt. Die Verabreichung des Gens kann durch Verfahren erreicht werden, die derzeit zur Injektion von Kontrastfarbstoffen in diese Gänge für bildgebende Verfahren verwendet werden.
  • Die Verfahren dieser Erfindung sind wirksam bei der Behandlung von primären Erkrankungen des Pankreas, die durch genetische Defekte in den Epithelien der Gangsysteme der Organe charakterisiert sind. Diese genetischen Defekte umfassen sowohl das Versagen der Zellen, einen ausreichenden Spiegel eines Polypeptids zu exprimieren, als auch die Überproduktion eines Polypeptids. Solche Erkrankungen umfassen cystische Fibrose, die diese Zellen betrifft, sowie Lungenepithelien.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Transfer von Genen in Pankreas-Inselzellen und Pankreas-Acinuszellen bereit. Wenn die Konzentration des Transfervehikels, das mit dem Gen, das transferiert werden soll, verbunden ist, ausreichend hoch ist, nehmen diese weiteren Zellen sowie die Epithelzellen des Ganges das Gen auf und exprimieren es. Dies stellt das erste Verfahren zur Erreichung eines Gentransfers in Pankreas- Insel- und -Acinuszeilen dar.
  • Die Verfahren dieser Erfindung erniedrigen durch ihre Zellspezifität und durch die Vermeidung des Kontaktes mit dem Blutstrom des Patienten vorteilhaft die Risiken die mit einem Gentransfer verbunden sind. Diese Verfahren ziehen ihren Nutzen auch aus den anatomischen Beschränkungen, die sich durch die Benutzung des Gangsystems des Pankreas bieten, und vermeiden dadurch einen unerwünschten Gentransfer in andere Organe und in andere Zellen. Darüber hinaus bieten die Verfahren dieser Erfindung einen zusätzlichen Vorteil, da sie die unmittelbare Anlieferung von genetischem Material und des damit verbundenen Transfervehikels im Überschuß in den Zwölffingerdarm und die Ausscheidung im Stuhl erlauben.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 stellt eine schematische Darstellung der Struktur von pAd.CMV-lacZ dar.
  • Fig. 2 stellt eine schematische Darstellung der Struktur von pAd.CB-CFTR dar.
  • Fig. 3 stellt die Hybridisierung einer menschlichen CFTR-spezifischen DNA-Sonde mit XbaI-verdauter Gesamtzell-DNA sowohl von Ad.CB-CFTR infizierten als auch von scheininfizierten Zellen dar, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF stammen.
  • Fig. 4 stellt die Hybridisierung einer menschlichen CFTR-spezifischen DNA-Sonde mit der Gesamtzell-RNA sowohl von Ad.CB-CFTR infizierten als auch von scheininfizierten Zellen dar, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF stammen.
  • Fig. 5, Teilabbildungen A und B, stellt die Lokalisierung von CFTR in Ad.CB-CFTR infizierten Zellen. die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF stammen, durch Immunfluoreszenz unter Verwendung entweder eines nicht-reaktiven Antikörpers (Teilabbildung A) oder eines CFTR-spezifischen Antikörpers (Teilabbildung Bl und eines sekundären FITC markierten anti-IaG-Antikörpers dar.
  • Fig. 6. Teilabbildungen A-E, stelt die Verteilung der β-Galactosidase in einem Leberschnitt einer Ratte bei unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion mit einer niedrigen Konzertration entweder von Ad.CB-CFTR oder von Ad.CvIV-lacZ unter Verwendung der X-Gal- Cytochemie dar.
  • Fig. 7, Teilabbildungen A-D, stellt die Anwesenheit der menschlichen oder der Ratten- CFTR-RNA in einem Leberschnitt einer Ratte 3 Tage nach der Infektion mit einer niedrigen Konzentration entweder von Aä.CB-CFTR oder von Ad.CMV-lacZ durch Hybridisierung mit markierten CFTR-spezifischen Sonden dar.
  • Fig. 8, Teilabbildungen A-D, stellt die Verteilung von CFTR und Cyokeratin-18 in einem Leberschnitt einer Ratte 3 Tage nach der Infektion mit einer niedrigen Konzentration von Ad.CB-CFTR oder Ad.CMV-lacZ durch Doppel-Immundiffusion unter Verwendung von Antikörpern dar, die für beide Proteine spezifisch sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Einführen eines funktionellen Gens in Epithelzellen des Pankreasganges eines Patienten bereit. Die Bezeichnung "funktionelles Gen", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Gen, das ein Polypeptid codiert und das durch die Zielzelle exprimiert werden kann. Die Bezeichnung umfaßt auch Antisense- Nucleinsäuren, die in der Lage sind, zu binden und die Expression eines Polypeptids zu verhindern. Die Bezeichnung "Zielzelle" bezieht sich auf die Zelle oder den Zelltyp, die/der das Gen von Interesse aufnimmt.
  • Die Verfahren dieser Erfindung umfassen den Schritt des Einführers eines Gens in das Gangsystem des Pankreas. Um den Gentransfer auszuführen, muss dass Gen, das transferiert werden soll, mit einem Träger oder Vehikel, das in der Lage ist, die Epithelzellen des Organs zu transduzieren, verbunden sein. Die Bezeichnungen "Transfervehikel" und "Träger" beziehen sich auf jegliche Art von Struktur, die in der Lage ist, das Gen von Interesse an eine Zielzelle anzuliefern.
  • Im Fachgebiet sind viele solcher Träger bekannt. Zum Beispiel können zahlreiche Viren, die in der Lage sind, Epithelzellen zu infizieren, durch rekombinante Verfahren so manipuliert werden, dass sie das Gen von Interesse tragen, ohne dass ihre Infektiosität beeinflußt wird. Wie in dieser Anwendung verwendet, beziehen sich die Bezeichnungen "infizieren" und "Infektiosität" nur auf die Fähigkeit eines Virus, das genetische Material an eine Zielzelle zu übertragen. Diese Bezeichnungen bedeuten nicht, dass das Virus in der Lage ist, sich in der Zielzelle zu replizieren. Tatsächlich wird bevorzugt, dass solche Viren replikationsdefizient sind, so dass die Zielzellen nicht unter den Auswirkungen einer Replikation des Virus leiden.
  • Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem Virus, das verwendet wird, um das Gen in den Verfahren dieser Erfindung zu tragen, um ein rekombinantes Adenovirus. Das Adenovirus wird wegen seiner Fähigkeit bevorzugt, nicht-teilende oder langsam teilende Zellen wie z. B. Epithelzellen zu transformieren. Am stärksten bevorzugt wird, wenn das rekombinante Adenovirus ein Derivat von Ad5 ist, in dem die Sequenzen, die die E1-Region umspannen, deletiert und durch einen Promotor, mit oder ohne zusätzliche Enhancer-Sequenzen und das Gen, das transferiert werden soll, ersetzt sind. Jeder Promotor, der eine konstitutive Expression des Gens, das einmal in das Zielzellgenom aufgenommen worden ist, bereitstellt, kann verwendet werden. Beispiele für solche Promotoren sind Promotoren des Rous-Sarkom- Virus, LTRs des Maloney-Virus, endogene Promotoren der Zielzelle und Promotoren des Cytomegalie-Virus (CMV). Bevorzugte Promotoren sind der β-Actin-Promotor und die CMV-Promotoren. Beispiel für bevorzugte Enhancer-Sequenzen, die in diesen rekombinanten Adenoviren verwendet werden können. umfassen solche, die im CMV-Genom gefunden werden, besonders solche aus der sehr frühen Region des Genoms und Enhancer-Sequenzen des Alpha&sub1;-Fetoproteins.
  • Andere Viren, die als Transfervehikel in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, sind replikationsdefiziente Retroviren. Wenn diese replikationsdefizienien Retroviren verwendet werden, können ihre Genome durch ein Helfervirus gemäß gut bekannter Verfahren verpackt werden. Geeignete Retroviren umfassen PLJ, pZip, pW e and pEM, von denen jeder im Fachgebiet, wohlbekannt ist. Geeignete Helferviren zur Verpackung der Genome umfassen ΨCrip, ΨCre, Ψ2, ΨAm, und Adeno-assoziierte Viren.
  • Es können auch andere Genanlieferungssysteme als Viren bei den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann das Gen, das transferiert werden soll, in ein Liposom verpackt sein. Wenn Zellen mit Liposomen, in die DNA eingekapselt ist, inkubiert werden, nehmen sie die DNA auf und exprimieren sie. Um diese Liposomen zu bilden, mischt man die DNA eines Expressionsvektors, der das Gen, das tansferiert werden soll, exprimiert, mit Lipid wie z. B. N-[1-(2,3-Dioleyloxy)prepyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in einem geeigneten Puffer wie z. B. Hepes gepufferte Kochsalzlösung. Dies bewirkt die spontane Bildung von Lipid-DNA-Komplexen (Liposomen), die in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können [P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 7413-17 (1987)].
  • Ein anderes Genanlieferungssystem, das in dieser Erfindung verwendet werden kann, sind DNA-Protein-Komplexe. Die Bildung dieser Komplexe wird in dem Patent 5,166,320 der Vereinigten Staaten beschrieben, dessen Offenbarung hierin unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Genauer umfassen diese Komplexe das Gen, das übertragen werden soll (zusammen mit einem Promotor, Enhancer-Sequenzen und anderer DNA, die zur Expression in der Zielzelle nötig ist), verbunden über einen geeigneten Polymer wie z. B. Polylysin mit einem Polypeptidliganden für einen Rezeptor auf der Oberfläche der Epithelzellen der Leber oder des Pankreas ist. Dieser Komplex wird durch die Epithelzellen über Endocytose aufgenommen, nachdem der Ligand an den Rezeptor der Zelloberfläche gebunden hat. Die DNA wird dann vom Rest des Komplexes durch intrazelluläre Enzyme, die den Polymer- Linker schneiden, abgespalten.
  • Wenn das Gen, das transferiert werden soll, einmal mit einem geeigneten Transfervehikel verbunden ist, muß es in das Gangsystem des Pankreas eingeführt werden. Der bevorzugte Weg führt durch den Pankreas gang. Im Falle der Leber sowie im Falle des Pankreas kann das genetische Material zu dem gewünschten Gangsystem durch den Darm angeliefert werden. Wenn nur eines der beiden Organe das gewünschte Ziel darstellt, kann das andere durch eine Ligatur an der Stelle, an der sich der Gang in den Darm entleert, blockiert werden.
  • Jedes medizinisch akzeptierte Verfahren zum Einbringen von Material in die Gänge dieser Organe kann in dieser Erfindung verwendet werden. Das angewendete Verfahren ist bevorzugterweise minimal invasiv und verwendet das retrograde Füllen der Gänge. Ein solches bevorzugtes Verfahren ist das endoskopisch-retrograde Cholangiographieverfahren (ERCP). ERCP wird derzeit angewendet, um die Gangsysteme der Galle und des Pankreas durch Kanülierung des gemeinsamen Gallenganges oder des Pankreasgangs durch ein Endoskop und die Injektion von Kontrastfarbstoffen sichtbar zu machen. In den Verfahren dieser Erfindung wird der Farbstoff durch das Gen, das transferiert werden soll, und das damit verbundene Transfervehikel ersetzt. Andere Verfahren zum Einbringen des Gens von Interesse in das Zielorgan, umfassen die chirurgische Einpflanzung und das Einbringen über ein Laparoskop.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des Pankreas unter Verwendung des Verfahrens des somatischen Gentransfers bereit. Es sind verschiedene Erkrankungen bekannt, die mit genetischen Defekten der Epithelien des Pankreas verbunden sind. Darüber hinaus manifestieren sich bestimmte Symptome verschiedener Erkrankungen des Pankreas in den Epithelzellen dieses Organs. Zum Beispiel könnte die, Entzündung des Pankreas durch die Verfahren dieser Erfindung verhindert werden, wenn sie dazu verwendet werden, um Cytokingene in das Epithel zu transferieren. Beispiele für einige der anderen Erkrankungen, die durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt werden können, umfassen aufsteigende sklerosierende Gallengangsentzündung und primäre Gallensklerose.
  • Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung, die durch die Verfahren dieser Erfindung behandelt werden soll. CF. CF ist eine Erkrankung, die ihre primären Wirkungen auf die Epithelien des Lungenluftweges ausübt. Die Erkrankung betrifft jedoch auch die Epithelien des Pankreas und der Leber. Diese sekundären Erkrankungsorte werden immer wichtiger, da verschiedene Therapien zu Behandlung von an CF erkrankten Lungen entwickelt werden.
  • CF kann zu Gallestauung, Gelbsucht und schließlich zur Zirrhose in der Leber und zu Bauchspeicheldrüsenentzündung und Malabsorption im Pankreas führen. Die derzeitige Behandlung von mit CF in Verbindung stehenden Pankreaserkrankungen umfaßt die Enzymersatztherapie. Die Patienten leiden jedoch immer noch unter der Bauchspeicheldrüsenentzündung und damit verbundener Falschernährung. Es gibt derzeit keine Behandlung von mit CF in Verbindung stehenden Leberstörungen.
  • Das defekte Gen bei der CF ist CFTR (der cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), ein angenommener Transmembran-Chloridkanal. Die Expression von CFTR in der Leber wurde in den Epithelzellen, die den Gallengang auskleiden, lokalisiert. Im Pankreas scheinen die Zellen, die die Gänge des exokrinen Pankreas auskleiden, die Quelle der CFTR- Expression darzustellen. Demgemäß sind die Verfahren dieser Erfindung zur Behandlung von mit CF in Verbindung stehenden Pankreasstörungen gut geeignet.
  • Eine CFTR-cDNA wird in der gleichzeitig anhänsigen Anmeldung mit der Serien-Nr. 584,274 und in F. S. Collins et al., Science 235, S. 1046-49 (I987) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Diese cDNA kann in jedes der Genanlieferungssysteme, die vorstehend beschrieben wurden, eingebaut werden und dann in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel wird die Konstruktion bestimmter rekombinanter viraler Vektoren, die die CFTR-cDNA enthalten, in der Anmeldung 584,274 beschrieben. Diese Vektoren sind nützlich bei den Verfahren dieser Erfindung.
  • Am stärksten bevorzugt wird die CFTR-cDNA in ein Derivat des Adenovirus Ad5 eingebaut. Die Konstruktion dieses rekombinanten Vektors wird in den spezifischen Beispielen, nachstehend, beschrieben.
  • Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann werden die nachfolgenden Beispiele angeführt. Es sollte selbstverständlich sein, dass diese Beispiele nur für erläuternde Zwecke dienen und nicht erstellt wurden, um diese Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
    • BEISPIEL I Die Konstruktion rekombinanter Adenoviren I. pAd.CMV-lacZ A. Herstellung eines CMV-Promotor-lacZ-Minigens
  • Das Plasmid pUC19 [C. Yanisch-Perron et al.: Gene 33, S. 103-19 (1985)] wurde mit SmaI verdaut, und ein 8 Nucleotide langer NotI-Linker wurde dann an das Ende cloniert. Dies zerstörte die SmaI-Schnittstele und erzeugte zwei SacII-Schnittstellen auf jeder Seite des Linkers. Ein 196 Basenpaare großes Fragment, das das Polyadenylierungs-Signal aus SV40 (SV40-Nucleotide 233-2729) enthielt, wurde dann aus einem SV40 enthaltenden Vektor [G. MacGregor et al., Somat. Cell Mol. Genet. 13, S. 253-65 (1987)] gereinigt. Diesem Fragment wurden BamHI-Linker angefügt, und es würde dann in die einzige BamHI-Schnittstelle des modifizierten pUC19-Vektors cloniert. Das Polyadenylierungs-Signal war so orientiert, dass die Transkription, die an einem Promotor stromaufwärts der NotI-Schnittstelle begann und diese Restriktionsschnittstelle durchlief, auf das Polyadenylierungs-Signal des späten Gens von SV40 trifft. Das Polyadenylierungs-Signal des frühen Gens von SV40 befindet sich in der entgegengesetzten Orientierung.
  • Ein 180 Basenpaare großes XhoI-PstI-Fragment aus dem Plasmid pLl [H. Okayama et al Mol. Cell Biol. 3, S. 280-89 (1983)], das die 165/195-Spleiß-Donor- und Akzeptor-Signale des späten viralen Proteingens von SV40 enthielt, wurde dann in den vorstehenden Vektor cloniert, um die geeigneten Signale bereitzustellen. Der Promotor und Enhancer des sehr frühen Gens des menschlichen Cytomegalievirus, die als ein 619 Basenpaare großes ThaI-Fragment aus pCM5029 [M. Boshart et al., Cell 41, S. 521-30 (1985)] erhalten wurden, wurde in die HincII-Schnittstelle von pUC18 cloniert und anschließend aus diesem Vektor als Teil eines BamHI/HindIII-Fragments gewonnen. Dieses Fragment wurde dann mit 14-Polymerase behandelt und mit glatten Enden mit dem vorstehend beschriebenen modifizierten pUC19 Vektor ligiert.
  • Das β-Galetosidasegen aus E. coli wurde mit EcoRI und XbaI aus pC4AUG [G. R. McGregor et al., Somat. Cell Mol. Genet, 13, 5 953-65 (1987)] als ein 3530 Basenpaare großes Fragment ausgeschnitten. Dann wurden dem Fragment NotI-Linker angefügt, und das so erhaltene Konstrukt wurde in die NotI-Schnittstelle des vorstehend beschriebenen modifizierten pUC19-Vektors cloniert.
  • Das vollständige Minigen, das den CMV-Promotor/Enhancer, das lacZ-Gen und das SV40-Polyadenylierungs-Signal enthielt, wurde dann mit SphI aus dem pUC19- Vektor ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment behandelt und mit BcII-Linkern liniert.
    • B. Die Herstellung von pAdBglII und die Ligieng des Minigens in dieses Plasmid
  • Das Plasmid pEHX-L3 [E. Falck-Pedersen et al., J Virol 63, S. 532-42 (1989)], das Sequenzen aus Ad5 enthält, die die Kartierungseinheiten 0 bis 16,1 umspannen, wurde mit EcoRI und BglII verdaut, um ein 5,2 Kilobasen großes Fragment, das die Adenovirus-Sequenzen ab der Kartierungseinheit 9,2 bis 16,1 sowie das Plasmidgerüst enthielt, zu entfernen. Die Adenovirus-Sequenzen, die die Kartierungseinheiten 0 bis 1 umspannen, und die invertierte 5'-Wiederholungssequenz, den Replikationsursprung und die Verkapselungs-Signale enthielten, wurden aus dem ursprünglichen pEHX-L3- Vektor amplifiziert und mit einer NheI-Schnittstelle am 5'-Ende, die direkt stromabwärts der EcoRI-Schnittstellle liegt, und mit einer BalII-Schnittstelle am 3 - Ende unter Verwendung der PCR versehen. Das durch PCR amplifizierte Fragment wurde dann mit dem EcoRI/BelII-Fragment ligiert, um das Plasmid pAdBglII herzustellen.
  • Das lacZ enthaltende Minigen, das, wie im vorstehenden Teil A beschrieben, hergestellt worden war, wurde dann in der direkten Orientierung in den pAdBglII- Vektor ligiert, der mit BglII verdaut und mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt worden war. Eine schematische Darstellung von pAd.CMV-lacZ ist in Fig. 1 abgebildet.
    • II, yAd.CB-CFTR
  • Das Plasmid pAd.CB-CFTR ist von pAd.CMV-lacZ abgeleitet. Es enthält den β- Aktin-Promotor aus dem Huhn, die menschliche CFTR-cDNA und eine kleines Teilstück retroviraler Mo-MLV-Sequenzen anstelle des CMV-Promotors und des lacZ-Gens.
    • A. Die Konstruktion von pCMV-BA-CFTR
  • Der Vektor pBA-CFTR enthält ein intaktes 5'-LTR aus Mo-MLV und zusätzliche virale Mo-MLV-Sequenzen zwischen dem 5'-LTR und dem internen Promotor, die die Nucleotide 146 bis 624 umspannen. Das Plasmid enthält auch Wildtyp-Mo-MLV- Sequenzen ab der ClaI-Schnittstelle bei Nucleotid 7674, die anschließend mit synthetischen Linkem in eine BamHI-Schnittstelle umgewandelt wurde, bis zu dem Ende des 3'-LTRs. Sequenzen, die die viralen Enhancerelemente des 3' LLTR ab der PvuII-Schnittstelle bei Nucleotid 7933 bis zur XbaI-Schnittstelle bei Nucleotid 8111 enthielten, wurden deletiert. Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Sequenzen enthält der Vektor auch flankierende genomische Maus-DNA- und pBR322- Sequenzen, die die HindIII-Schnittstelle bis, zu der EcoRI-Schnittstelle umspannen.
  • Der β-Aktin-Promotor in diesem Vektor würde aus einem XhoI-MboI-Fragment des Hühner-β-Aktingens, das die Nucleotide -266 bis +1 [T. A. Kost ei al., Nucl. Acids Res. 11, S. 8237-301 (1983)] umspannt, abgeleitet. Die MboI-Schnittstelle wurde anschließend in eine BamHI-Schnittstelle umgewandelt, und das modifizierte Promotor-Fragment wurde in den vorstehenden Vektor cloniert. Die menschlichen codierenden CFTR-Sequenzen wurden aus einem 4.6 kb großen SacI-Fragment einer CFTR-cDNA [J. R. Riordan et al., Science 245, S. 1066-73 (1989)] abgeleitet und enthielten, zusätzlich zu der vollständigen codierenden CFTR-Region, kleine Stücke nicht-translatierter 5'- und 3'-Bereiche. Die SacI-Schnittstellen wurden in BcII- Schnittstellen umgewandelt, und das modifizierte Fragment wurde in die BamHI- Schnittstelle des vorstehenden Vektors direkt hinter den β-Aktin-Promotor cloniert.
  • Die Enhancer-Sequenzen aus dem sehr frühen Gen des menschlichen CMV wurden durch den Verdau von CDM1 [B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 3365- 69 (1937)] mit SpeI und PstI, die Reinigung des Fragments, das die Enhancer- Sequenzen enthielt, und die Clonierung in pUC19 erhalten. Ein Teilstück der Enhancer-Sequenz wurde dann mit XhoI und NcoI aus diesem Vektor herausgeschnitten. Nach der Reinigung wurde die NcoI-Schnittstelle durch Anhängen von synthetischen Linkem in eine XhoI-Schnittstelle umgewandelt, und das modifizierte Fragment wurde in die einzige XhoI-Schnittstelle, die sich 5' des β- Aktin-Promotors des vorstehend beschriebenen Vektors befand, cloniert. Der so erhaltene Vektor wurde als pCMV-BA-CFTR bezeichnet.
    • B. Ersatz des lacZ-Minigens in pAd-CMV-lacZ durch das CFTR-Minigen
  • Der Vektor pCMV-BA-CFTR wurde mit XhoI und NheI verdaut, um ein Fragment, das den β-Aktin-Promotor, das CFTR-Gen und einen kleinen Teil Retrovirusspezifischer Sequenzen enthielt; freizusetzen und dann mit glatten Enden versehen. Das Plasmid pAd.CMV-lacZ wurde mit SnaBI und NotI geschnitten, um den CMV- Promotor und das lacZ-Strukturgen auszuschneiden. Der verbleibende Teil des Plasmids, dem der CMV-Enhancer und das SV40-Poyladenylierungs-Signal verblieb, wurde mit glatten Enden versehen und mit dem glattendigen Fragment aus pCMV- BA-CFTR ligiert, um das Plasmid pAd.CB-CETR zu erzeugen. Eine schematische Darstellung von pAd.CB-CFTR wird in Fig. 2 gezeigt.
  • Plasmide, die durch die vorstehend beschriebenen Schritte hergestellt wurden, werden durch rekombinante DNA-Moleküle veranschaulicht, die bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. USA am 10. Mai 1993 hinterlegt wurden, und sind durch die folgende Hinterlegungsnummer identifiziert:
  • ATCC 75468 - pAd.CB-CFTR.
    • III. Die Erzeugung des rekombinanten Δd.CB-CFTR-Virus
  • Der Vektor pAd.CB-CFTR wurde mit NheI linearisiert und mit dem durch XbaI verdauten viralen Genom d17001gemischt. Das d17001-Virus ist ein rekombinantes Ad5/Ad2-Virus, das eine Deletion in den E3-Sequenzen aufweist, die die Kartierungseinheiten 78,4 bis 86 umspannen. Dieses Virus wurde aus einem rekombinanten Ad5-Ad2-Ad5-Virus abgeleitet, das aus dem EcoRI-Fragment aus Ad5, das die Kartierungseinheiten 0-76 umspannt, dem EcoRI-Fragment aus Ad2, das die Kartierungseinheiten 76-83 umspannt, und dem EcoRI-Fragment aus Ad5, das die Kartierungseinheiten 83-100 umspannt, besteht. Die Sequenzen, die die Kartierungseinheiten 7 8,4 bis 86 dieses rekombinanten Ad5-Ad2-Ad5-Virus umspannen, wurden dann herausgeschnitten, um d17001 zu erzeugen [Claearas und Wold, Virol. 140, S. 23-43 (1985)].
  • Ich zog 293-Zellen [F. L. Graham et al., in: Methods in Molecular Biology, Bd. 7, E. J. Murray, Hrsg., The Humana Press, Clifton, NJ, S. 109-28 (1991)] in 150 mm- Platten an, die DMEM enthielten, das mit 10% fetalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ("1% Pen-Strep") ergänzt worden war, bis eine Konfluenz von 80% erreicht worden war. Die Zellen wurden dann mit dem linearisierten Ad.CB-CFTR und mit XbaI verdautem d17001 cotransfiziert. Die Zellen wurden angezogen, bis sich Plaques bildeten. Dann wurden individuelle Plaques isoliert und in 293-Zellen amplifiziert. Dann isolierte ich die virale DNA aus individellen Plaques und untersuchte sie durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und Southern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der menschlichen CFTR-DNA.
  • Einer der CFTR-positiven Plaques wurde dann ein zweites Mal über Plaques gereinigt, und das darin enthaltene Virus wurde als AD. CB-CFTR bezeichnet. Dieses Virus wurde in 293-Zellen wie folgt vermehrt. 30 150 mm-Platten mit 293-Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, angezogen, bis sie eine Konfluenz von 80-80% erreichten. Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden dann mit Ad.CB- CFTR (enthalten in 10 ml DMEM/1% Pen-Strep) bei einem MOI.-Faktor von 10 über zwei Stunden infiziert. Dann fügte ich 20 ml DMEM/15% fötales Rinderserum/1% Pen-Strep hinzu und setzte die Inkubation fort. Etwa 36-40 Stunden nach der Infektion erntete ich die Zellen durch Zentrifugation und resuspendierte sie in 18 mi 10 mM Tris-HCl, pH 8,1. Die Zellen wurden durch drei Einfrier/Aufbau-Runden aufgebrochen. Dann wurden die Zelltrümmer durch 20 Minuten Zentrifugation bei 1.500 · g sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Sediment wurde einmal mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 gewaschen. Die Überstände wurden vereinigt und auf einen 20 ml-CsCl-Stufengradienten (1,20 g/ml und 1,45 g/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,1) überschichtet und 2 Stunden bei 100.000 · g zentrifugiert. Dann entfernte ich die Bande aus Viruspartikeln, verdünnte sie mit einem Volumen des Tris-Puffers und unterwarf sie einer zweiten Runde der CsCl-Bandierung in 8 ml-Gradienten. Nach 18 Stunden Zentrifugation bei 100.000 · g gewann ich die Viruspartikel und bewahrte sie in 5 Volumina 10 mM Tris-HCl, pH 8,1; 100 mM NaCl; 0,1% BSA; 50% Glycerin auf. Vor der weiteren Verwendung entsalzte ich das Viruspräparat durch Gelfiltration über Sephadex-G50 in Hams-Medium.
  • Die Endonzentration des Virus wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt. Ich beurteilte den Virus-Titer durch Plaque-Testansätze unter Verwendung von 293-Zellen. Ich kontrollierte auch die Anwesenheit replikationskompetenter Viren durch die Infektion von HeLa-Zellen bei einem MOI-Faktor von 10, gefolgt von einer weiteren Passage der Zellen über 30 Tage. Die Anwesenheit replikationskompetenter Viren wird durch die Beobachtung cytopathogener Wirkungen in den infizierten HeLa-Zellen ermittelt. Keiner der Viren, die bei den folgenden Verfahren verwendet wurden, war replikationskompetent.
    • BEISPIEL 2 Die Fähigkeit von Ad.CB-CFTR. CF-Zellen zu transformieren
  • Zuerst untersuchte ich die Fähigkeit von Ad.CB-CFTR, das CFTR-Gen in die Zelllinie CFPAC zu übertragen, die aus einem Pankreas-Adenokarzinom eines Patienten mit CF [M. L. Drumm et al., Cell 62. 511227 (1990)) abgeleitet worden war. Ich zog diese Zellen bei 37ºC bis zur Konfluenz in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (Gibco Laboratories, Grand Island. NY), das mit 10% fötalem Kälberserum und 1% Pen- Strep ergänzt worden war, in 10 cm²-Platten an. Dann infizierte ich die Zellen mit Ad.CB-CFTR mit einem MOI.-Faktor von 1. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen auf den Gentransfer und die Expression von CFTR hin untersucht. Die Untersuchung wurde mit zellulärer DNA und RNA vorgenommen, sowie unter Verwendung der Immuncytochemie, um ganze Zellen zu untersuchen. Radioaktivmarkierte Hybridisierungs-Sonden wurden aus einer PCR-Matrize synthetisiert, die aus der Ratten-CFTR-cDNA (Nucleotide 17 70-2475), die in M. A. Fiedler et al., Am. J. Physiol. 262, 5. L779 (1992) beschrieben wurde, abgeleitet worden war, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist; dies geschah unter Verwendung des in vitro-Transkriptions-Systems von Promega (Promega Corporation, Pittsburgh, PA) und unter Befolgung der Vorschriften des Herstellers. Die Sonden wurden bei Southern- und Northern-Blot-Analysen sowie bei in sitzt- Hybridisierungsstudien verwendet.
  • Die Gesamtzell-DNA sowohl der scheininfizierten als auch der Ad.CB-CFTRinfizierten Zellen (10 gg) wurde isoliert und mit XbaI verdaut. Southern-Blots der DNA, die aus den infizierten Zellen stammte, zeigten hohe Spiegel des Gentransfers (Fig. 3). Die Gesamtzell-RNA sowohl der scheininfizierten als auch der Ad.CB- CFTR infizierten Zellen wurde isoliert, durch Elektrophorese in Formaldehyd/Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Die Northern-Blots zeigten einen hohen Spiegel von CFTR-Transkripten (Fig. 4).
  • Es wurde ebenfalls Immuncytochemie mit den Zellen durchgeführt, um das CFTR- Protein nachzuweisen. Die Zellen wurden 10 Minuten bei -20ºC in Methanol fixiert und dann 30 Minuten mit 20% normalem Ziegenserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ("GS/PBS") inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 5 p.g/ml eines polyclonalen Antikörpers aus Kaninchen, der gegen ein C-terminales Peptid (Aminosäuren 1468-1480) erzeugt wurden war, das zwischen dem menschlichen und dem CFTR aus Ratten konserviert ist [J. A. Cohn et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. IBI, S. 36 (1991); C. R. Marino et al., J. Clin. Invest. 88, S. 712 (1991); J. A. Cohn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, S. 2340 (1992)], 50 Minuten in 2% GS/PBS inkubiert. Die Kontrollen umfaßten die Inkubation mit einem nicht-reaktiven Antikörper und die Vorinkubation des Anti-CFTR-Peptid-Antikörpers mit 0,5 ug/ml CFTR-Peptid in 2 Wo GS/PBS über Nacht bei 4 vor der Inkubation mit den Zellen. Nach der Inkubation mit dem Antikörper wurden die Zellen dreimal 5 Minuten mit 2 Wo GS/PBS gewaschen. Der Antikörper wurde durch Inkubation der Zellen mit einem anti-Kaninchen-IgG aus Ziegen, das an FITC gekoppelt war, sichtbar gemacht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, das fast alle Zellen, die dem Virus ausgesetzt worden waren, nachweisbare Spiegel des CFTR exprimierten (Fig. 5).
  • Die Zellen wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin, eine cAMP regulierte Anionen- Leitung zu zeigen, untersucht - eine Eigenschaft, die die Expression eines funktionellen CFIR-Proteins anzeigt. Genauer gesagt, zog ich die Zellen auf Kollagen beschichteten Glas-Deckgläsern bis zur Konfluenz unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen an. Dann entfernte ich das Medium und ersetzte es durch eine hypotonische 1 : 1-Verdünnung eines NaI-Puffers (130 mM NaI, 4 mM KNO&sub3;, 1 mM Ca(NO&sub3;)&sub2;, 1 mM Mg(NO&sub3;)&sub2;, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4) in Wasser. Dann fügte ich 10 mM (Endkonzentration) des Halogenidempfindlichen Fluorophors 6-Methoxy-N-(3-sulfopropyl)-quinolinium ("SPQ") zu und inkubierte 12 Minuten bei 37ºC. Ich entfernte den SPQ enthaltenden Puffer und ersetzte ihn durch unverdünnten isoosmotischen NaI-Puffer und inkubierte die Zellen weitere 5 Minuten. Die Deckgläser wurden dann auf den Mikroskopträger übertragen, wo sie unter Verwendung einer 40X Ölemersionslinse (Nikon CF-Fluorlinse) unter Licht, das durch einen Anregungsfilter bei 370 nm geleitet wurde, abgebildet wurden. Die abgestrahlte Fluoreszenz der Zellen wurde durch einen Bildverstärker mit hoher Auflösung (Video Scope Inc., Washington. D. C.), der mit einer Videokamera verbunden war, gesammelt. Der Signalausgang der Kamera war mit einer digitalen Bildverarbeitungs-Einheit, die durch die IMAGE 1/FL-Software (Universal Imaging. Media, PA) gesteuert wurde, verbunden.
  • Fast alle Zellen, die dem Virus ausgesetzt worden waren, verfügten wieder über die Fähigkeit, eine c AMP regulierte Anionen-Leitung durchzuführen. Dieses Experiment zeigte, dass das Ad.CB-CFTR-Virus in der Lage war, den Gentransfer in Zellen auszuführen und Defekte irr CETR-Gen zu heilen.
    • BEISPIEL. 3 Die in vivo-Transfektion von Epithelzellen der Galle in Ratten
  • Ich verwendete das Ad.CMV-lacZ-Virus, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, um Verfahren zur gezielten in vivo-Anlieferung an Epithelzellen der Galle in Ratten zu entwickeln.
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 200 g) wurden mit Isofluran betäubt und ihre Eingeweide durch einem Medianschnitt freigelegt. Dann identifizierte ich den gemeinsamen Gallengang und führte eine 27-Gauge-Nadel ein. Unterschiedliche Konzentrationen des Virus (1 · 10¹¹ - 2 · 10¹² PBE/ml) wurden in 0,3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert, und ein 0,3 ml-Aliquot wurde langsam retrograd jeder Ratte infundiert. Nach Beendigung der Infusion entfernte ich die Nadel und übte einen sanften Druck auf die Einstichstelle des Gallenganges aus. Die Haut und die Faszie wurden dann in einer Lage mit unterbrochenen Nähten geschlossen, und dem Tier wurde erlaubt, sich zu erholen.
  • Als Kontrolle verwendete ich das Ad.CB-CFTR-Virus (1 · 10¹¹ BPE/ml) zur retronraden Infusion, das in Beispiel 2 beschrieben wurde.
  • Nach drei Tagen wurden die Tiere euthanisiert. Dann wurde das Lebergewebe auf die lacZ-Expression unter Anwendung der X-Gal-Immunchemie hin beurteilt. Frische, eingefrorene Schnitte (6 um) wurden aufgezogen, nachträglich 10 Minuten mit 0,5% Glutaraldehyd/PBS fixiert, zweimal in 1 mM MgCl&sub2;/PBS gewaschen und 4 Stunden in X-Gal-Lösung (1,6 ug/ml K&sub3;Fe(CN)&sub6;. 2,1 ug/ml K&sub4;Fe(CN)&sub6; · 3 H&sub2;O. 40 ug/ml 14- Gal) inkubiert. Tiere, denen die maximale Virusmenge (2 · 10¹² BPE/ml) infundiert worden war, zeigten eine lacZ-Expressioin in allen Epithelzellen der Galle sowie in über 80% der Leberzellen. Bei niedrigeren Dosen des Virus (1 · 1011 BPE/ml) war der Gentransfer selektiver, da weniger als 1% der Leberzellen lacZ exprimierten, während fast alle Epithelzellen der Gallengänge in der Leber die Expression des lacZ fortsetzten (Fig. 6, Teilabbildungen B und C). Tiere, denen Ad.BD-CFTR infundiert worden war, zeigten keine lacZ-Expression (Fig. 6, Teilabbildung A).
  • Um die Stabilität der Expression dieses transferierten Gens abzuschätzen, wurden Ratten, die die selektivere Dosis des Virus erhalten hatten, 7 und 21 Tage nach der Infektion euthanisiert. Nach sieben Tagen war die Expression in den Leberzellen und den Epithelien der großen Gallengänge deutlich vermindert (Fig. 6, Teilabbildung D). Die Expression von lacZ in den Epithelien der kleinen Gallengänge blieb jedoch über die 21 Tage bestehen (Fig. 6, Teilabbildung E).
  • Die gleichen Arten von Experimenten würden wiederholt zur Untersuchung der CFTR-RNA unter Verwendung von Ratten- oder menschlichen CFTR spezifischen-Sonden. Ich verwendete 0,3 ml einer 1 · 10¹¹ PPE/ml-Lösung entweder von Ad.CB- CFTR oder von Ad.CMV-lacZ-Viren, um Ratten zu infizieren. Serienschnitte der Leber, die infizierten Ratten entnommen worden waren, wurden auf die Anwesenheit der CFTR-RNA unter Verwendung der in situ-Hybridisierung mit Sonden, die entweder für das Ratten- oder das menschliche CFTR spezifisch waren, hin untersucht. Die Epithelzellen der Galle der mit Ad.CMV-lacZ infizierten Ratten hybridisierten mit der Ratten-CFTR-Sonde (Fig. 7, Teilabbildung A), aber nicht mit der menschlichen Sonde (Fig. 7, Teilabbildung B). Dies zeigte die Spezifität der menschlichen Sonde. Tiere, die mit dem Ad.CB-CTFR-Virus infiziert worden waren, zeigten eine diffuse Verteilung der menschlichen CFTR-RNA über die ganzen Epithelzellen der Galle der großen und der kleinen Gallengänge in der Leber (Fig. 7, Teilabbildung C). Diese Verteilung war ähnlich der Verteilung der endogenen Ratten-CFTR-RNA (Fig. 7, Teilabbildung D). Darüber hinaus wurde das menschliche CFTR-Transkript in einer kleinen Zahl von Leberzellen nachgewiesen.
  • Die Schnitte der Rattenleber wurden ebenfalls durch Doppel-Immundiffusion unter Verwendung von Antikörpern, die für CFTR und für Cytokeratin-18. ein Marker, der in hohem Spiegel in den Epithelzellen der Galle exprimiert wird, spezifisch waren. untersucht. Tiere, die mit Ad.CB-CFTR behandelt worden waren, zeigten eine Bindung des CFTR-Antikörpers an die apikalen Oberflächen der meisten Epithelzellen der Galle (Fig. 8, Teilabbildung A). Diese Bindung war weit im Überschuß gegenüber der Bindung des Antikörpers an endogenes CFTR-Protein in den Ad.CMVlacZ-infizierten Tieren (Fig. 8, Teilabbildung C). Die CFTR-spezifische Antikörperbindung, die in Ad.CB-CFTR infizierten Tieren nachgewiesen wurde, befand sich in den gleichen Zellen, wie die Antikörper gegen Cytokeratin-18 (dies wurde ebenfalls für die Ad.CMV-lacZ-infizietten Tiere gezeigt), was bestätigt, dass das rekombinante CFTR in dem richtigen Zelltyp exprimiert wird (Fig. 8, Teilabbildungen B und D).
    • BEISPIEL 4 CFTR-Gentransfer in Epithelzellen der Gallen- und Pankreasgänge menschlicher Patienten
  • Ad.CB-CFTR wird verwendet, um die Leber, die Galle und den Pankreas betreffenden Aspekte der CF zu behandeln. Ein Patient, dei unter CF leidet, wird einer Endoskopie unterzogen, um den Zwölffingerdarm sichtbar zu machen und den gemeinsamen Gallengang zu lokalisieren. Nach der Lokalisierung wird in den gemeinsamen Gallengang eine Kanüle eingeführt. Eine geeignete Konzentration des Virus (etwa 1 · 10¹¹ PBE/ml) in 50-150 ml PBS wird in den gemeinsamen Gallengang durch endoskopisch-retrograde Cholangiographie eingebracht. Nach der Prozedur beginnt der Patient mit der Expression von CFTR in den Epithelzellen der Galle.
  • Zur Behandlung der den Pankreas betreffenden Aspekte der CF wird einer ähnlichen Vorschrift gefolgt. Eine Ligatur wird zwischen den Leber- und den Gallengang gesetzt. Dann wird eine Nadel in den Darm eingeführt, um das Virus in die Pankreasgänge zu infundieren.
  • Ähnliche rekombinante Adenoviren, die andere Gene oder cDNA-Kopien davon tragen, werden in den gleichen Verfahren verwendet, um andere genetische Defekte dieser Epithelzellen zu heilen. Die genetischen Defekte von Leberzellen. Pankreas- Acinuszellen und Pankreas-Inselzellen können ebenfalls durch die Verwendung solcher rekombinanter Viren geheilt werden, wenn die Viren in die Gallen- und Pankreasgänge in höheren Konzentrationen eingebracht werden.
  • Obwohl ich hierin vorstehend eine Anzahl von Ausführungsformen dieser Erfindung präsentiert habe, ist es offensichtlich, dass meine grundlegende Konstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen; die die Verfahren dieser Erfindung verwenden, bereitzustellen. Deshalb wird anerkannt, dass der Rahmen dieser Erfindung eher durch die Ansprüche, die hieran angehängt sind, definiert wird, als durch die spezifischen Ausführungsformen, die hierin vorstehend durch Beispiele präsentiert wurden.

Claims (8)

1. Verwendung eines funktionellen Gens, das mit einem Träger verbunden ist, der das Gen in Epithelzellen des Pankreasgangs transferieren kann, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer primären Leber- oder Pankreaserkrankung bei einem Patienten durch Einführen des funktionellen Gens in die Epithelzellen des Pankreasgangs eines Patienten durch die interlobulären Gänge des Pankreas.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung cystische Fibrose ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das funktionelle Gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) codiert.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche, 1 bis 3, wobei der Träger ein rekombinantes Adenovirus ist und wobei das funktionelle Gen im Genom des Adenovirus vorhanden ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Träger Ad.CE-CFTR (ATCC 75468) ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das funktionelle Gen in die interlobulären Gänge des Pankreas durch retrogrades Füllen der Gänge eingeführt wird.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das retrograde Füllen durch ein endoskopisch-retrogrades Cholangiographieverfahren erfolgt.
8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gen auch in die Pankreas- Acinuszellen und Pankreas-Inselzellen eingeführt wird.
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