DE69429534T2

DE69429534T2 - Monoklonale antikörper gegen schaumzellen und ihre pharmazeutische und diagnostische anwendung

Info

Publication number: DE69429534T2
Application number: DE69429534T
Authority: DE
Inventors: Walter De Smet; Ann Union
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1993-11-02
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2014-10-27
Also published as: HK1042726A1; US6027922A; DK0726942T3; EP0726942A1; EP0726942B1; DE69429534D1; PT726942E; EP1188824A2; EP1188824A3; WO1995012666A1; ATE211167T1; ES2168314T3; AU7940594A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung 3.A9F5E1, der bei der ECACC unter der Nr. 93102638 hinterlegt ist, ein Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung und ihre Anwendung für pharmazeutische und diagnostische Zwecke.
Atherosklerose umfasst eine Kombination aus Veränderungen in der Intima der Arterienwand, was zu Verdickungen und Verhärtungen der Arterien führt; typische Läsionen wie beispielsweise Fettstreifen und fibröse Plaques, die aus Lipiden, Proteinen und anderen Komponenten bestehen, werden zu calcifizierten fibrösen Plaques, die die darunterliegenden Medien in späteren Stadien beeinträchtigen. Der Ursache der Krankheit ist eine Reaktion auf eine Verletzung der Endothelzellen und sie hat viele Eigenschaften mit Entzündungsprozessen in anderen Geweben gemeinsam (Ross, 1986).
Schlüsselelemente der atherosklerotischen Plaques sind die Schaumzellen, die hauptsächlich von zirkulierenden Blut-Monocyten abstammen. Nach Eindringen in die Arterienwand differenzieren Monocyten zu Makrophagen die gern große Mengen an modifizierten Lipoproteinen aufnehmen, was zur Schaumzellbildung führt. Die Verletzungen des Arterienlumens unterbrechen den Blutstrom und führen letztendlich zu klinischen Komplikationen wie beispielsweise Myocardinfarkt, Schlaganfall, Thrombose, Angina, Nierenhypertension und Erkrankungen der peripheren Blutgefäße.
Eine frühe Detektion atherosklerotischer Plaques ist von entscheidender Bedeutung, um eine rechtzeitige Intervention für eine Reduktion der Plaque-Größe und -Bildung zu erlauben und eine erneute Plaque-Bildung zu verhindern. Herkömmlicherweise wird die Arteriographie für eine Diagnose fortgeschrittener Gefäßkrankheiten eingesetzt. Auf Grund der aus einer Katheterisierung resultierenden Risiken wird die Arteriographie nur bei Patienten mit einer fortgeschrittenen oder akuten atherosklerotischen Erkrankung durchgeführt. Bis heute gibt es keine diagnostische Verfahren, die eine frühe Detektion atherosklerotischer Plaques erlauben und es besteht ein Bedarf an besseren nicht-invasiven Techniken und Reagenzien, die in der Lage sind, frühe nicht-stenosierende, die Durchblutung nicht störende arterielle Läsionen zu detektieren, zu kartieren und zu behandeln.
Kodama et al. (WO 90/05748) hat ein Scavenger-Rezeptor-Molekül und Antikörper gegen diesen Rezeptor für die Detektion und Behandlung von Atherosklerose charakterisiert. Es handelt sich um ein Rezeptor-Protein mit etwa 220 kDa, das acetyliertes und oxidiertes LDL bindet. Um diesen Rezeptor zu isolieren, wurden PMA differenzierte THP-1 Zellen verwendet. Zahlreiche Modelle für die Bildung von in vitro Schaumzellen sind bereits für murine Zelllinien beschrieben, wo eines der klassischen Systeme aus einer 48 stündigen Inkubation von murinen J774A.1 Zellen mit acetyliertem Lipoprotein geringer Dichte (LDL) besteht, was zu einem intrazellulären Cholesterol-Gehalt von > 100 ug/mg Zeliprotein und zu einer Abnahme der Veresterung um +50% führt (Tabas et al., 1985; Via et al., 1985; Snow et al., 1988; 1992). Im Gegensatz dazu konnten humane Makrophagen-ähnliche Zelltinien HL-60 und U-937 nicht in Schaumzellen unter Verwendung von acetyliertem LDL transformiert werden (Via et al., 1985). Eine vorherige Induktion mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder ein konditioniertes Medium von Concanavalin A-stimulierten Lymphocyten beeinflusste ihren Acetyl-LDL-Metabolismus nicht. Die humane Monocyten-Zelllinie THP-1 (Tsuchiya et al., 1980) konnte mit PMA zu einem differenziertem Phänotyp, der zahlreiche funktionale Makrophagen- Charakteristika zeigt, induziert werden (Tsuchiya et al., 1982). Die Suspensionszellen wurden in ihrem Wachstum gehemmt und haften an das Substrat und sezernierten Lipoprotein-Lipase und Apolipoprotein E (Tajima et al., 1985; Auwerx et al., 1988; Menju ef al., 1989). Hara et al. (1987) beschrieben einen vermehrten Abbau von Acetyl-LDL in PMA-differenzierten THP-1 Zellen, selbst wenn eine Gesamtcholesterolakkumulation von +45 ug/mg Zeliprotein nach 48 Stunden eher gering im Vergleich zu dem beobachteten Cholesterol-Gehalt von aus atherosklerotischem Plaque isolierten Schaumzellen ist, der normalerweise bis zu 300 ug/mg Protein reicht (Haley et al., 1977; St. Clair, 1986). Ebenfalls enthielten die in einer Studie von Yamamoto et al. (1988), die PMA-induzierte humane THP-1 und UE-12 Zellen umfasste, gebildeten Schaumzellen nur 20-40 ug Cholesterol/mg Protein.
Deshalb besteht ein anhaltender Bedarf an der Etablierung eines in vitro human Makrophagen-Schaumzellmodells, das atherosklerotischen Plaque Schaumzellen hinsichtlich ihrer großen Mengen an intrazellulärem Cholesterol und Cholesterylestern ähnelt.
Mehrere Klassen Leukocyten-Endothel-Adhäsionsmoleküle sind möglicherweise an der Atherogenese beteiligt. Zum Beispiel haften, vor ihrem Einwandern in extravaskulares Gewebe, Monocyten/Makrophagen an vaskularen Endothelzellen. Dieses Anhaften ist von den Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Strukturen ("Ligand-Rezeptor" Paare) auf beiden Zelltypen abhängig. Für die Monocyten/Makrophagen sind dies, unter anderen, "Lymphocyten-funktionsassoziiertes Antigen-1" (LFA-1), Mac-1 und/oder p 150.95. Für die Endothelzellen sind dies, unter anderen, "Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1" (CAM-1) und ICAM-2.
LFA-1, Mac-1 und p150.95 (in der "World Health Organization" Nomenklatur als CD11a/CD18, CD11bICD18 beziehungsweise CD11c/CD18 bezeichnet) sind Mitglieder der beta 2 Integrin-Subfamilie (=Leukointegrin- Subfamilie). Alle drei sind nicht-kovalent assoziierte alfabeta Membran- Glycoproteine. Sie besitzen die gleiche beta-Untereinheit, haben aber verschiedene alfa-Untereinheiten. Die Expression von LFA-1 ist nicht auf Monocyten/Makrophagen beschränkt, da es auch auf B-Lymphocyten, T- Lymphocyten und Granulocyten vorliegt. Obwohl LFA-1 ursprünglich durch monoklonale Antikörper (mAk) identifiziert wurde, die T-Zell-vermitteltes Abtöten hemmen, wurde später eine Beteiligung über seine Wechselwirkungen mit seinen Liganden ICAM-1 und -2 in einem breiten Bereich anderer Leukocyten-Funktionen (einschließlich T-Helfer und B-Lymphocyten- Antwort, natürliches Abtöten, von Monocyten und Granulocyten vermittelte Antikörper-abhängige Cytotoxizität, und, wie oben erwähnt, Anhaften von Leukocyten an Endothelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen) gezeigt. Für einen allgemeinen Überblick über die "Leukointegrine" siehe Larson und Springer (1990) und Springer (1990).
ICAM-1 und ICAM-2 sind beide Mitglieder einer anderen Familie Adhäsionsmoleküle, nämlich die Immunglobulin-Gen-Superfamilie. ICAM-1 (auch CD54 Antigen genannt) ist ein einkettiges Glycoprotein, dessen Masse zwischen 76 und 114 kDa abhängig vom Ursprungszelltyp variiert. Es ist hoch induzierbar auf einem großen Spektrum Zelltypen mit Cytokinen, wie beispielsweise Tumor-Nekrose-Faktor, gamma-Interferon und Interleukin-1 (Dustin et al., 1988). ICAM-2 unterscheidet sich von ICAM-1 in der Zellverteilung (siehe unten) und Cytokin-Induktion. Gestützt auf die Existenz eines von ICAM-1 und ICAM-2- unabhängigen Adhäsionswegs an gereinigtes LFA-1, wurde ein dritter Ligand (= ICAM-3) für LFA-1 postuliert (de Fougerolles et al., 1991) und mit dem monoklonalen Antikörper CBR-IC3/1 charakterisiert (WO92/22323; de Fougerolles und Springer, 1992). Kürzlich haben drei Forschergruppen eine cDNA-Sequenz für ICAM-3 (WO 93/14776; Fawcett et al., 1992; Vazeux et al., 1992, de Fougerolles et al., 1993) unabhängig voneinander beschrieben. Jüngst haben immunchemische, funktionale und Proteinsequenzierungsuntersuchen gezeigt, dass ICAM-3 und CDw50 Antigen das gleiche Molekül sind (Juan et al., 1993). CDw50 wurde ursprünglich mit Hilfe zweier mAk (101-1D2 und 140-11) charakterisiert und wurde einem der neuen Differenzierungscluster während des "Fourth International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens" zugeordnet (Hadam et al., 1990).
Die Existenz dreier LFA-1 Liganden lässt eine Spezialisierung für verschiedene Aspekte der LFA-1 abhängigen Leukocyten-Wechselwirkungen vermuten (WO92/22323). ICAM-1 ist auf dem Endothel und vielen Epithelzelltypen basal exprimiert und bei Entzündung und Immunität stark induziert, wo es Zelllokalisation reguliert und spezifische Antigenerkennung erleichtert (Wawryk et al., 1989). Da ICAM-2 der prädominante LFA-1 Ligand auf rufiendem Endothel ist, kann dieser Adhäsionsweg wichtige Folgen für die gewöhnliche Rezirkulation von LFA-1 tragenden Lymphocyten durch das Gewebe-Endothel haben. Der Befund, dass (a) die Adhäsion von ruhenden T-Lymphocyten an gereinigtem LFA-1 primär über ICAM-3 erfolgt (de Fougerolles und Springer, 1992); (b) die höchste Expression von ICAM-3 mRNA in Zelltypen gefunden wird, die bei Antigenpräsentierung an T-Zellen beteiligt sind (nämlich B-Zellen und Monocyten/Makrophagen) (Fawcett et al., 1992; Vazeux et al., 1992); und (c) ICAM-3 viel besser exprimiert wird als die anderen LFA-1 Liganden auf ruhenden Monocyten und Lymphocyten (de Fougerolles und Springer, 1992) lässt auf eine wichtige Rolle für ICAM-3 beim Auslösen von Immunantworten schließen. Als Stütze dieser Hypothese gilt der Befund, dass CDw50 mAk in der Lage sind, zum Teil primäre allogene Antworten zu hemmen (Vilella et al., 1990). DE BAETSELIER et al. in Tissue Antigens, Vol 42, 1993, Seite 412, veröffentlichen Antikörper, die ein verstärktes Binden an THP-1 Schaumzellen zeigen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, einen neuartigen ICAM-3 monoklonalen Antikörper bereitzustellen, der in der Lage ist, Schaumzellen von aktivierten Nicht-Schaumzellen zu unterscheiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung besagter monoklonaler Antikörper bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Hybridomzelllinien, die besagte monoklonale Antikörper produzieren, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, pharmazeutische wie auch diagnostische Anwendungen für besagte monoklonale Antikörper bereitzustellen.
Sämtliche Ziele werden mit den Anwendungsformen der Erfindungen erreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft aus Monocyten/Makrophagen verwandten Zelllinien gebildete humane Schaumzellen, die einen durchschnittlichen intrazellulären Cholesterol-Gehalt von mindestens 139 + 36 ug/mg Zellprotein, wie mittels HPLC bestimmt, zeigen, wobei besagtes Cholesterol durch einen Veresterungsgrad von 46+6% charakterisiert ist, wie mittels HPLC bestimmt.
Die Bezeichnung "Schaumzellen" bezieht sich auf Lipid-beladene Zellen, die im Allgemeinen in der Technik als Schaumzellen bezeichnet werden und zum Beispiel in atherosklerotischen Plaques vorkommen (für eine Übersicht über Schaumzellen siehe Bowyer & Mitchinson, 1989).
Die Bezeichnung "Monocyten/Makrophagen verwandte Zelllinien" ist von Lyons & Aschmann (1989) rezensiert und umfasst zum Beispiel THP-1 Zelllinien
Die Bezeichnung "Cholesterylester" bezieht sich auf eine beliebig veresterte Form von Cholesterol.
Die Menge an Cholesterol und Cholesterylestern kann mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt werden (Vercaernst et al., 1989), wie es im Beispielteil beschrieben ist. Mengen, die mit anderen, in der Technik bekannten Mitteln bestimmt werden, können gemäß der im Beispielteil der vorliegenden Erfindung dargestellten Techniken festgestellt werden.
Der Ausdruck "Moleküle, die spezifisch in den in vitro Schaumzellen der vorliegenden Erfindung hochreguliert sind" bezieht sich auf Verbindungen oder Moleküle, die ein stärkeres Binden an die "THP-1 Schaumzellen" der vorliegenden Erfindung als an "THP-1 + PMA/RA Zellen" zeigen, wie es in der vorliegenden Erfindung definiert ist.
Wie im Beispielteil dargestellt, umfasst die vorliegende Erfindung einen neuen Typ in vitro gebildeter humaner Schaumzellen, die durch ihre hohen Mengen an intrazellulärem Cholesterol und Cholesterylestern gekennzeichnet sind. Derartig hohe Mengen an intrazellulärem Cholesterol sind für humane Monocyten/Makrophagen verwandte Zelllinien bis heute nie erhalten worden und besitzen den Vorteil, dass sie mehr den in vitro atherosklerotischen Plaque Schaumzellen hinsichtlich ihrer großen Mengen an Cholesterol und Cholesterylestern ähneln.
Die vorliegende Erfindung betrifft humane Schaumzellen, wie sie oben definiert sind, die beispielsweise aus THP-1 Zellen hergestellt wurden, die 24 Stunden mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M Phorbol-12-Myristat-13- Acetat (PMA) und 0,5 · 10&supmin;&sup7; Retinsäure (RA) aktiviert und danach 48 Stunden bei Anwesenheit von aggregiertem Lipoprotein (LDL) (THP-1 Schaum) kultiviert wurden.
THP-1 Zellen sind von der ATCC Sammlung (ATCC TIB 202) beziehbar.
Die Bezeichnung "aktiviert" oder differenziert ist von Dougherty & McBride (1989) rezensiert.
Die Bezeichnung "aggregiertes LDL" bezieht sich größere LDL- Partikel, die wie im Beispielteil der vorliegenden Erfindung (Beschallung) beschrieben oder mittels beliebig anderer, in der Technik bekannter Verfahren, wie beispielsweise Verwirbelungsmischung (Khoo et al., 1988). Phospholipase C Modifikation (Suits et al., 1989) erhalten werden können. Der Aggregationsgrad wird nach der Präparation, wie im Beispielteil beschrieben, oder mittels anderer in der Technik bekannter Verfahren kontrolliert. Die bevorzugte Konzentration von aggregiertem LDL im Medium, wie im Beispielteil offengelegt, beträgt 200 ug/ml. Die bevorzugten Wachstumsbedingungen zur Bildung von THP-1 abgeleiteten Schaumzellen sind ausführlich im Beispielteil dargelegt. Es ist allerdings zu verstehen, dass beliebige dem Fachmann bekannte Modifikationen eingesetzt werden können, die in THP-1 Zellen die Aufnahme von nativem LDL oder einem beliebig modifizierten, in der Technik bekannten LDL erhöhen.
Andere Monocyten/Makrophagen verwandte Zelllinien neben THP-1 könnten sich ebenfalls zur Bildung von Schaumzellen mit den oben erwähnten Merkmalen und folgenden oben skizzierten Protokollen eignen. Bis heute sind derartige Zelilinien nicht charakterisiert worden.
Der Beispielteil der vorliegenden Erfindung zeigt, dass THP-1 Zellen, die unter den hier genannten Bedingungen gewachsen sind, beachtlich hohe intrazelluläre Cholesterol-Mengen enthalten wie oben angegeben. Die humanen Schaumzellen enthalten gemäß Definition eine durchschnittliche Cholesterol-Menge von mindestens 139 + 36 ug/mg Zeliprotein, wovon 46 + 6% in der Esterform vorliegt und die Zellen werden durch 24 stündige Aktivierung von THP-1 Zellen mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M Phorbol-12- Myristat-13-Acetat (PMA) und 0,5 · 10&supmin;&sup7; Retinsäure (RA) und danach 48 Stunden Kultivieren in Medium mit aggregiertem Lipoprotein geringer Dichte erhalten und werden des weiteren als "THP-1 Schaum"-Zellen bezeichnet. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung humaner Schaumzellen, wie oben definiert, zur Selektion von Verbindungen, die ein verstärktes Binden an humane Schaumzellen (THP-1 Schaum), wie oben definiert, im Vergleich zu ihrem Binden an humane Zellen, die durch 24 Stunden Aktivierung von THP-1 Zellen mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 0,5 · 10&supmin;&sup7; Retinsäure (RA) und danach 48 Stunden Kultivieren in Medium unter Lipid-freien Bedingungen (THP-1 + 1PMA/RA) erhalten werden.
Wie im Beispielteil gezeigt, können bestimmte Verbindungen gefunden werden, die ein höheres Binden an THP-1 Schaumzellen als THP-1 Zellen zeigen, die durch 24 Stunden Aktivierung mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 0,5 · 1&supmin;&sup7; Retinsäure (RA) und danach 48 Stunden Kultivieren in Medium unter Lipid-freien Bedingungen (als THP-1 + PMA/RA bezeichnet) erhalten werden.
Das "verstärkte Binden" kann mittels indirekter Immunfluoreszenz, wie beispielsweise mittels Durchflusscytometrie (FACS Analyse), oder mittels einer beliebig anderen dem Fachmann bekannten Technik, wie beispielsweise Immuno-Markierungs- oder Enzym-Markierungstechniken, bestimmt werden. Die Bezeichnung "verstärktes Binden" bezieht sich auf ein mindestens zweimal, bevorzugt dreimal und noch bevorzugter fünfmal so starkes Binden wie das von der gleichen Verbindung beobachtete Binden an THP-1 + PMA/RA Zellen.
Die Bezeichnung "Verbindungen" bezieht sich auf einen beliebigen Molekül-Typ wie beispielsweise Antikörper, Peptide Medikamente etc. vorzugsweise allerdings auf monoklonale Antikörper. Derartige Verbindungen können zur Feststellung des Vorhandenseins von Schaumzellen (zum Beispiel in atherosklerotischen Plaques) oder zur Hemmung der Bildung derartiger Schaumzellen durch Hemmung ihrer LDL-Aufnahme von Interesse sein. Das THP-1 Schaumzell-Modell kann zum Testen neuer oder bekannter Moleküle, chemischer oder pharmazeutischer Verbindungen bezüglich ihrer inhibitorischen Kapazität für Lipoprotein-Aufnahme und Cholesterol- Akkumulation eingesetzt werden, und dadurch eine Schaumzellbildung verhindern. Das humane in vitro Schaumzell-Modell der vorliegenden Erfindung kann folglich ebenfalls für Durchmusterung neuer oder bekannter Peptide und Proteine und Komplexe davon eingesetzt werden, die als Cholesterol-Akzeptoren und Carrier wirken, die für einen Cholesterol-Efflux aus Lipid-beladenen Zellen sorgen und für das Entfernen von Cholesterol aus atherosklerotischen Läsionen verwendet werden können.
In dem Beispielteil der vorliegenden Erfindung werden mehrere Beispiele angeführt, wie das humane Schaumzellsystem der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, um spezifische Antikörper zu selektieren, die ein verstärktes Binden an THP-1 Schaumzellen im Vergleich zu THP-1 + PMA zeigen, wie es mittels inirekter Immunfluoreszenz bestimmt ist und die als Schaumzell-Marker (zum Beispiel als atherosklerotische Prognose- Marker) potenziell interessieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Antikörper" auf polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, humanisierte Antikörper, einkettige Antikörper und Fragmente davon wie beispielsweise F(ab), F(ab')2, Fv und andere Fragmente, die die Antigenbindungsfunktion des elterlichen Antikörpers beibehalten.
Besonders bevorzugte Beispiele von Verbindungen gemäß dieser Anwendungsform der Erfindung sind monoklonale Antikörper. Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf eine Antikörper- Zusammensetzung mit einer homogenen Antikörper-Population. Die Bezeichnung ist nicht hinsichtlich der Species oder des Ursprungs des Antikörpers beschränkt noch ist es beabsichtigt, die Art der Herstellung zu beschränken. Die Bezeichnung umfasst vollständige Immunglobuline wie auch Fragmente wie beispielsweise F(ab), F(ab')2, Fv und andere, die die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers beibehalten. Monoklonale Antikörper von beliebigen Säuger-Species können in dieser Erfindung verwendet sein. In der Praxis allerdings sind die Antikörper typischerweise von der Ratte oder Maus, auf Grund der Verfügbarkeit von Ratten- oder Maus-Zelllinien für die Herstellung der benötigten Hybrid-Zelllinien oder Hybridome für die Produktion der Antikörper.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein verstärktes Binden an humane Schaumzellen (THP-1 Schaum), wie oben definiert, im Vergleich zu seinem 1 Binden an humane Zellen zeigt, die durch 24 stündige Aktivierung von THP-1 Zellen mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 0,5 · 10&supmin;&sup7; Retinsäure (RA) und danach 48 Stunden Kultivieren in Medium unter Lipid-freien Bedingungen (THP-1 + PMA/RA) erhalten werden, und wobei besagter Antikörper außerdem dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Antigen bindet, das von dem monoklonalen Antikörper 3.A9F5E1 erkannt wird, der bei der ECACC Sammlung unter Nr. 93102638 am 26. Oktober 1993 hinterlegt worden ist.
ECACC steht für European Collection of Animal Cell Cultures.
Zur Vereinfachung ist der monoklonale Antikörper "3.A9F5E1" des weiteren als "3.A9" abgekürzt.
Wie im Beispielteil gezeigt, ist der monoklonale Antikörper 3.A9, der unter Nr. 93102638 bei der EACC hinterlegt ist, in der Lage, ein im Beispielteil als 3.A9 Antigen bezeichnetes Antigen zu immunpräzipitieren. Diese spezifische Anwendungsform der vorliegenden Erfindung umfasst folglich jeden monoklonalen Antikörper, der ein verstärktes Binden an THP-1 Schaumzellen im Vergleich zu THP-1 + PMA/RA Zellen zeigt und der das Antigen 3.A9 bindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, der außerdem dadurch gekennzeichnet ist, dass er an eine 150 kDa Komponente bindet, wie sie beispielsweise auf KG-1a Zellen vorhanden ist, wie mittels Immunpräzipitation und SDS-PAGE bestimmt wurde.
KG-1a Zellen sind von der ATCC Collection (ATCC CCL 246.1) erhältlich.
Wie im Beispielteil der vorliegenden Erfindung gezeigt, führt eine Immunpräzipitation und SDS-PAGE Analyse des ¹²&sup5;I-markierten 3.A9 Antigens, das von radiomarkierten und lysierten KG-1a Zellen erhalten wurde, zu einer Bande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 150 kDa, wenn es unter reduzierenden Bedingungen auf 7,5% Gelen läuft.
Die Bezeichnung "reduzierende Bedingungen" bedeutet Zugabe von 2-Mercaptoethanol zum Probenpuffer.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, der außerdem dadurch gekennzeichnet ist, dass er an ICAM-3 und nicht an ICAM-1 oder ICAM-2 bindet.
Wie im Beispielteil der vorliegenden Erfindung (insbesondere in Fig. 2) gezeigt, binden der monoklonale Antikörper 3.A9 wie auch 8 zuvor offengelegte anti-CAM-3 und 3 zuvor offengelegte CDw50 monoklonale Antikörper an das Material, das von einer mit monoklonalem Antikörper 3.A9 präparierten Immunoaffinitätssäule eluiert wird. Die Spezifität dieser Reaktion ist durch die Tatsache verdeutlicht, dass gegen ICAM-1, ICAM-2 oder andere Moleküle gerichtete monoklonale Antikörper kein Binden zeigten, wenn sie unter ähnlichen Bedingungen auf das immungereinigte Material aufgetragen wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, mit der Bezeichnung 3.A9F5E1 und der unter der Nr. 93102638 am 26. Oktober 1993 bei der ECACC hinterlegt wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, der mit dem Verfahren hergestellt ist, das die Schritte umfasst:
(a) Immunisieren eines Tieres mit KG-1a Zellen,
(b) Fusionieren der Milzzellen von besagtem Tier mit MyeJomzellen, um Antikörper sezernierende Hybridomzellen zu bilden,
(c) Durchmustern der Hybridomzellen auf Produktion von gegen KG-1a Zellen gerichtete monoklonale Antikörpern und,
(d) Durchmustern der Hybridomzellen, die in Schritt (c) positiv auf Produktion von monoklonalem Antikörper bewertet wurden, der ein verstärktes Binden an THP-1 Schaumzellen, wie oben definiert, im Vergleich zu seinem Binden an THP-1 + PMA/RA Zellen, wie oben definiert, zeigt,
(e) Kultivieren der gemäß Schritt (d) ausgewählten Hybridome in einem geeigneten Kulturmedium,
(f) Wiederfinden der monoklonalen Antikörper, die von den selektierten, wie in
(e) kultivierten Hybridome sezerniert sind, oder wahlweise,
(g) Implantieren der in (c) selektierten Hybridome in das Peritoneum einer Maus und, wenn Ascites vom Tier produziert worden ist, Wiederfinden der dann von Ascites gebildeten monoklonalen Antikörper.
Monoklonale Antikörper werden unter Verwendung des Verfahrens von Köhler und Milstein (1975) oder einer Modifikation davon hergestellt. Typischerweise wird eine Maus oder Ratte, wie im Beispielteil beschrieben, immunisiert. Die Milz (und gegebenenfalls mehrere große Lymphknoten) werden entfernt und in einzelne Zellen getrennt. Die resultierenden B-Zellen oder alle getrennten Milzzellen werden dann für eine Fusion mit Myelomzellen induziert, um Hybridome zu bilden und werden dann in einem Selektivmedium (z. B. Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin Medium, "HAT") kultiviert. Die resultierenden Hybridome werden dann in Grenzverdünnung ausplattiert und auf Produktion von Antikörpern, die spezifisch an das gewünschte immunisierende Zelloberflächen-Antigen binden (und die nicht an nicht-verwandte Antigene binden) getestet. Die selektierten mAk sezernierenden Hybridome werden dann entweder in vitro (z. B. in Gewebekulturflaschen oder Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (als Ascites in Mäusen) kultiviert:
Der monoklonale Antikörper 3.A9 wurde, wie im Beispielteil hier beschrieben, hergestellt. Andere monoklonale Antikörper der Erfindung können ähnlich oder wie oben beschrieben hergestellt werden.
Gemäß einer noch weiteren Anwendungsform betrifft die Erfindung ein Antikörper-Derivat, wie beispielsweise ein Antikörper-Fragment, oder einen humanisierten monoklonalen Antikörper oder einen einkettigen Antikörper oder einen markierten monoklonalen Antikörper, wobei besagte Derivate von einem monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, abgeleitet sind.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "humanisierte Antikörper", dass mindestens ein Teil der Gerüstregionen eines Immunglobulins von humanen Immunglobulin-Sequenzen abgeleitet sind.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "einkettige Antikörper" auf Antikörper, die mittels Bestimmen der Bindungsdomänen (sowohl schwere als auch leichte Kette) eines bindenden Antikörpers und Bereitstellen eines bindenden Teils, der den Erhalt der Bindungsfunktion erlaubt, hergestellt sind. Dieses bildet im wesentlichen einen radikal verkürzten Antikörper mit nur dem Teil der für das Binden des Antigens notwendigen variablen Domäne. Bestimmung und Konstruktion einkettiger Antikörper sind in U.S. Patent Nr. 4.946.778 von Ladner et al. beschrieben.
Falls es gewünscht ist, können die Antikörper (ob polyklonal oder monoklonal) unter Verwendung herkömmlicher Techniken markiert werden. Geeignete Marker umfassen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (besonders ³²P und ¹²&sup5;I), Elektronen-Dichte-Reagenzien, Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern. Enzyme werden typischerweise durch ihre Aktivität detektiert. Zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase (HRP) wird normalerweise über ihre Fähigkeit detektiert, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Pigment umzuwandeln, was mit einem Spektrometer quantifizierbar ist. "Spezifischer Bindungspartner" bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, ein Ligand-Molekül mit hoher Spezifität zu binden wie es zum Beispiel im Falle eines Antigens und eines hierfür spezifischen monoklonalen Antikörpers ist. Andere spezifische Bindungspartner umfassen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A und die zahlreichen in der Technik bekannten Rezeptor-Ligand Paare. Es ist zu verstehen, dass die obige Beschreibung nicht die Aufgabe hat, die verschiedenartigen Marker in verschiedene Klassen einzuordnen, da der gleiche Marker in mehreren verschiedenen Verfahren Verwendung finden kann. Zum Beispiel kann ¹²&sup5;I als ein radioaktiver Marker oder als ein Elektronen-Dichte Reagenz dienen. HRP kann als ein Enzym oder als ein Antigen für einen mAk dienen. Außerdem kann man verschiedene Marker für einen gewünschten Effekt kombinieren. Zum Beispiel mAk und Avidin erfordern ebenfalls Marker bei der praktischen Anwendung der Erfindung: folglich kann man einen mAk mit Biotin markieren und sein Vorhandensein mit ¹²&sup5;I markiertem Avidin detektieren oder mit einem mit HRP markierten anti-Biotin mAk. Andere Permutationen und Möglichkeiten sind ohne weiteres dem Fachmann bekannt und werden als gleichwertig im Rahmen der Erfindung liegend betrachtet.
Gemäß einer weiteren Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, wie oben definiert, wobei besagtes Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:
(a) Immunisieren eines Tieres mit KG-1a Zeilen,
(b) Fusionieren der Milzzellen von besagtem Tier mit Myelomzellen, um Antikörper sezernierende Hybridomzellen zu bilden,
(c) Durchmustern der Hybridomzellen auf Produktion von gegen KG-1a Zellen gerichtete monoklonale Antikörpern und,
(d) Durchmustern der Hybridomzellen, die in Schritt (c) positiv auf Produktion von monoklonalem Antikörper bewertet wurden, der ein verstärktes Binden an THP-1 Schaumzellen, wie oben definiert, im Vergleich zu seinem Binden an THP-1 + PMA/RA Zellen, wie oben definiert, zeigt,
(e) Kultivieren der gemäß Schritt (d) ausgewählten Hybridome in einem geeigneten Kulturmedium,
(f) Wiederfinden der monoklonalen Antikörper, die von den selektierten wie in
(e) kultivierten Hybridome sezerniert sind, oder wahlweise,
(g) Implantieren der in (c) selektierten Hybridome in das Peritoneum einer Maus und, wenn Ascites vom Tier produziert worden ist, Wiederfinden der dann von Ascites gebildeten monoklonalen Antikörper.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelllinie, wie oben definiert, das die Schritte (a) bis (d) wie oben definiert umfasst.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Hybridomzelllinie, die beispielsweise gemäß dem Verfahren wie oben offengelegt hergestellt ist, das die Schritte (a) bis (d) wie oben definiert umfasst.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, der beispielsweise mit einem Verfahren hergestellt ist, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Kultivieren einer Hybridomzelllinie gemäß wie oben definiert in einem geeigneten Kulturmedium,
(b) Wiederfinden der monoklonalen Antikörper, die von den selektierten, wie in (a) kultivierten Hybridome sezerniert sind, oder wahlweise,
(c) Implantieren der wie in (a) selektierten Hybridome in das Peritoneum einer Maus und, wenn Ascites vom Tier produziert worden ist, Wiederfinden der dann von Ascites gebildeten monoklonalen Antikörper.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper oder Derivat davon, wie oben definiert, für die Verwendung als ein Medikament, insbesondere den monoklonalen Antikörper 3.A9 zum Behandeln oder Supprimieren einer Entzündung.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere monoklonale Antikörper, wie oben definiert, zum Behandeln oder Supprimieren einer Entzündung. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung leitet sich von der Fähigkeit von ICAM-3 und seinen funktionalen Derivaten ab, mit Rezeptoren der Leukointegrin-Familie von Molekülen, insbesondere LFA-1 zu interagieren. Auf Grund der Fähigkeit von ICAM-3 mit LFA-1 zu interagieren, können die Antikörper gegen ICAM-3 gemäß der vorliegenden Erfindung zur Suppression (d. h. Prävention oder Attenuierung) einer Entzündung eingesetzt werden.
Die Bezeichnung "Entzündung" wie hier verwendet beinhaltet sowohl die Reaktionen der spezifischen Abwehr als auch die Reaktionen der unspezifischen Abwehr.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper wie oben definiert zum Behandeln oder Supprimieren einer spezifischen Entzündung, insbesondere zum Behandeln oder Supprimieren einer Entzündung als Antwort auf einen Krankheitszustand, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Hypersensibilitäts-Spätreaktion, Psoriasis, eine Autoimmunerkrankung, Abstoßung eines Organ- oder Gewebetransplantats.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "spezifische Abwehr" beabsichtigterweise auf die Komponente des Immunsystems, die auf das Vorhandensein eines spezifischen Antigens reagiert. Entzündung ist das Resultat einer Antwort der spezifischen Abwehr, falls die Entzündung von einer Reaktion der spezifischen Abwehr verursacht, vermittelt oder mit dieser assoziiert ist. Beispiele für eine aus einer Reaktion der spezifischen Abwehr resultierenden Entzündung umfassen die Reaktion auf Antigene wie beispielsweise Rubella-Virus, Autoimmunkrankheiten und von T-Zellen vermittelte Hypersensibilitäts-Spätreaktion (zu erkennen zum Beispiel in Individuen, deren Mantoux-Test positiv ausfällt). Chronische Entzündungskrankheiten und die Abstoßung von transplantiertem Gewebe und kompakten Organen (z. B. Niere) und nicht kompakten Organen wie beispielsweise Knochenmarktransplantate sind weitere Beispiele für Entzündungsreaktionen der spezifischen Abwehr.
Wie oben diskutiert, ist das Binden von ICAM-3 Molekülen an LFA-1 von zentraler Bedeutung für die Zelladhäsion. Durch den Adhäsionsprozess sind die Lymphocyten in der Lage, auf das Vorhandensein von Fremdantigenen im Tier zu ständig kontrollieren. Obwohl diese Prozesse normalerweise erwünscht sind, sind sie ebenfalls die Ursache von Transplantat-Abstoßungen kompakter Organe (z. B. Niere), Transplantat- Abstoßungen nicht kompakter Organe (z. B. Knochenmark), Gewebetransplantat-Abstoßung und vielen Autoimmunkrankheiten. Somit ist jedes Mittel, das in der Lage ist, eine Zelladhäsion zu attenuieren oder zu inhibieren, in Empfängern von Transplantaten kompakter Organe (insbesondere Nierentransplantate), Transplantaten nicht kompakter Organe (insbesondere Knochenmarktransplantate), Gewebetransplantaten oder für Patienten mit Autoimmunkrankheiten hoch willkommen.
Monoklonale Antikörper für Mitglieder der Leukointegrin-Familie hemmen viele Adhäsions-abhängige Funktionen der Leukocyten einschließlich Binden ans Endothel (Haskard et al., 1986), homotyper Adhäsionen (Rothlein et al., 1986), Antigen und Mitogen induzierter Proliferation von Lymphocyten (Davignon et al., 1981), Antikörper-Bildung (Fischer et al., 1986) und Effektor-Funktionen aller Leukocyten wie beispielsweise lytische Aktivität cytotoxischer T-Zellen (Krensky et al., 1984), Makrophagen (Strassmann et al., 1986) und aller Zellen, die an Antikörperabhängigen zellulären cytotoxischen Reaktionen beteiligt sind (Kohl et al., 1984). In sämtlichen obigen Funktionen hemmen die Antikörper die Fähigkeit des Leukocyten, an einem passenden Zellsubstrat zu haften, was dann wiederum die mit dem Binden verknüpfte biologische Funktion hemmt. Derartige Funktionen können, soweit sie ICAM-3/LFA-1 Wechselwirkungen umfassen, mit anti-ICAM-3 Antikörpern supprimiert werden.
Folglich können monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, ICAM- 3 zu binden, wie beispielsweise die monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung als entzündungshemmendes Mittel in einem Säuger eingesetzt werden. Wichtig ist, dass diese Mittel sich von allgemeinen entzündungshemmenden Mitte darin unterscheiden, dass sie in der Lage sind, selektiv die Adhäsion zu hemmen und keine weiteren Nebenwirkungen wie beispielsweise Nephrotoxizität, die mit herkömmlichen Mitteln verbunden ist, besitzen.
ICAM-3 vermittelt teilweise Adhäsionsereignisse, die für das Ablaufen von Entzündungsreaktionen wie beispielsweise Hypersensibilitäts- Spätreaktionen, notwendig sind. Folglich besitzen Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper), die in der Lage sind, ICAM-3 zu binden, ein therapeutisches Potenzial bei Attenuierung oder Eliminierung derartiger Reaktionen.
Diese möglichen therapeutischen Verwendungen können auf die eine oder andere Weise verwertet werden: Erstens, kann eine Zusammensetzung, die einen anti-ICAM-3 monoklonalen Antikörper enthält, einem Patienten, der an Hypersensibilitäts-Spätreaktionen leidet, verabreicht werden. Zum Beispiel könnten derartige Zusammensetzungen einem Individuum bereitgestellt werden, das einen Kontakt mit Antigenen gehabt hatte wie beispielsweise Toxicodendron diversilobum, Toxicodendron radicans ssp. divaricatum etc. In einer anderen Anwendungsform wird ein monoklonaler Antikörper, der in der Lage ist, an ICAM 3 zu binden, einem Patienten gemeinsam mit einem Antigen verabreicht, um eine nachfolgende Entzündungsreaktion zu verhindern. Folglich kann die zusätzliche Verabreichung eines Antigens mit einem anti-ICAM-3 Antikörper eine zeitweilige Toleranz eines Individuums für eine nachfolgende Präsentation für dieses Antigen bewirken.
Da Leukocyten-Adhäsionsmangel-Krankheit (LAD) Patienten, denen LFA-1 fehlt, keine Entzündungsreaktion durchlaufen, wird geglaubt, dass ein Antagonismus von natürlichen Liganden von LFA-1 ebenfalls eine Entzündungsreaktion hemmt. Die Fähigkeit von Antikörpern gegen ICAM-3, eine Entzündung zu hemmen, liefert die Basis für ihre therapeutische Anwendung bei Behandlung chronischer Entzündungskrankheiten und Autoimmunkrankheiten wie beispielsweise Lupus erythematodes, autoimmune Thyroiditis, experimentelle allergische Enzephalitis (EAE), Multiple Sklerose, einige Diabetes-Formen, Reynauds Syndrom, rheumatoicjp Arthritis etc. Derartige Antikörper können ebenfalls für eine Therapie bei Behandlung von Psoriasis eingesetzt werden.
Im Allgemeinen können die anti-ICAM-3 Antikörper der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit anderen ICAM-3 und/oder ICAM-1 und/oder ICAM-2 Antikörpern bei Behandlung dieser Krankheiten, die gegenwärtig mit einer Steroid-Therapie behandelt werden, verabreicht werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können derartige Entzündungs- und immune Abstoßungsreaktionen supprimiert (d. h. entweder verhindert oder abgeschwächt) werden durch Bereitstellen einem Patienten, der einer Behandlung bedarf, einer hinreichenden Menge eines entzündungshemmenden Mittels, um besagte Entzündung zu supprimieren. Geeignete entzündungshemmende Mittel umfassen einen Antikörper, der in der Lage ist, an ICAM-3 zu binden; ein Fragment von besagtem Antikörper, wobei besagtes Fragment in der Lage ist, an ICAM-3 zu binden; im wesentlichen reines ICAM-3.
Die Erfindung umfasst außerdem die oben beschriebenen Verfahren zum Supprimieren einer Entzündungsreaktion der spezifischen Abwehr, wo ein immunsupprimierendes Mittel dem Patienten bereitgestellt wird. Ein derartiges Mittel wird bevorzugt in einer geringeren Dosis (d. h. eine suboptimale Dosis) als normalerweise erforderlich bereitgestellt. Die Verwendung einer suboptimalen Dosis ist auf Grund des Synergieeffektes der Mittel der vorliegenden Erfindung möglich. Beispiele geeigneter Immunsuppresiva umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Dexamethason, Azathioporin, ICAM-1, ICAM-2 oder Cyclosporin A.
Anti-ICAM-3 Antikörper können zur Prävention einer Abstoßung eines kompakten Organs oder Gewebes, z. B. Niere, Abstoßung eines nicht kompakten Organs, z. B. Knochenmark, oder zur Modifizierung autoimmuner Antworten bei Säugern verwendet werden. Von Bedeutung ist, dass die Verwendung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, ICAM-3 zu erkennen, Organtransplantationen sogar zwischen Individuen mit einer HLA Inkompatibilität erlauben.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen wie oben definierten Antikörper zum Behandeln oder Supprimieren einer nicht spezifischen Entzündung als Reaktion auf einen Zustand, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus akutes Lungenversagen (ARDS), multiples Organschädigungssyndrom nach Sepsis, Trauma oder Hämorrhagie, Reperfusionsschädigung von myokardialen oder anderem Gewebe, akute Glomerulonephritis, reaktive Arthritis, Dermatosen mit akut entzündlichen Komponenten, akute eitrige Meningitis oder anderen entzündlichen Störungen des zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall), thermische Schädigung, Hämodialyse, Leukophorese, Colitus ulcerosa, Morbus Crohn, nekrotisierende Enterokolitis, mit einer Granulocyten- Transfusion assoziierte Syndrome und Zytokin-induzierte Toxizität.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Reaktion der "nicht spezifischen Abwehr" beabsichtigterweise auf eine von Leukocyten vermittelte Reaktion, die kein immunologisches Gedächtnis besitzen. Derartige Zellen umfassen Granulocyten und Makrophagen. Wie hier verwendet, soll eine Entzündung die Folge einer Reaktion der nicht spezifischen Abwehr sein, falls die Entzündung von einer Reaktion der nicht spezifischen Abwehr hervorgerufen, vermittelt oder mit ihr assoziiert ist. Beispiele von Entzündungen, die wenigstens teilweise aus einer Reaktion der nicht spezifischen Abwehr resultieren, umfassen akutes Lungenversagen (ARDS), multiples Organschädigungssyndrom nach Sepsis, Trauma oder Hämorrhagie, Reperfusionsschädigung von myokardialen oder anderem Gewebe, akute Glomerulonephritis, reaktive Arthritis, Dermatosen mit akut entzündlichen Komponenten, akute eitrige Meningitis oder anderen entzündlichen Störungen des zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall), thermische Schädigung, Hämodialyse, Leukophorese, Colitus ulcerosa, Morbus Crohn, nekrotisierende Enterokolitis, mit einer Granulocyten- Transfusion assoziierte Syndrome und Zytokin-induzierte Toxizität.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen wie oben definierten Antikörper zum Behandeln oder Supprimieren der Metastasierung einer hämatopoetischen Tumorzelle, wobei besagte Zelle ein funktionales Mitglied der CD11/18 Familie für eine Migration benötigt und besagtes Mittel besagtem Patienten in einer hinreichenden Menge zum Supprimieren besagter Metastasierung bereitgestellt wird.
Gemäß einer noch anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen wie oben definierten Antikörper zum Behandeln oder Supprimieren der extravaskularen Migration viral infizierter Leukocyten und besagtes ICAM-3 modulierendes Mittel wird einem Patienten mit derartigen Leukocyten in einer hinreichenden Menge zum Supprimieren der Migration besagter Leukocyten verabreicht.
Gemäß einer noch anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen wie oben definierten Antikörper zum Behandeln oder Supprimieren der Migration von mit einer asthmatischen Reaktion assoziierten Zellen und besagtes ICAM-3 modulierendes Mittel wird einem Patienten in einer hinreichenden Menge zum Supprimieren der mit Asthma assoziierten Zellmigration bereitgestellt.
In dieser Anwendungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel verwendet, das in der Lage ist, LFA-1/ICAM-3 Wechselwirkungen zu modulieren. Genauer, besagtes Verfahren umfasst Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antiasthmamittels an ein Individuum, das einer derartigen Behandlung bedarf.
Die Antiasthmamittel der vorliegenden Erfindung umfassen die, wie oben definierten, anti-ICAM-3 Antikörper, die in der Lage sind, die Fähigkeit zum Binden einer Zelle an LFA-1 zu beeinträchtigen. Antikörper, die an ICAM-3 binden, supprimieren die Migration Eosinophiler, in dem sie die Fähigkeit von dem auf diesen Zellen exprimierten IGAM-3 beeinträchtigen, an einen LFA-1 Rezeptor exprimierende Zellen zu binden.
Die Antiasthmamittel der vorliegenden Erfindung sind dafür bestimmt Empfängern in einer hinreichenden Menge bereitgestellt zu werden, um die Schwere, Ausmaß oder Dauer der Asthmasymptome zu verringern oder abzuschwächen.
Die Mittel der vorliegenden Erfindung können entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Antiasthmamitteln (wie beispielsweise Methylxanthinen (wie beispielsweise Theophyllin), betaadrenerge Agonisten (wie beispielsweise Catecholamine, Resorcinole, Saligenine und Ephedrin-, Glucocorticoide (wie beispielsweise Hydrocortison)) verabreicht sein, um die Menge derartiger benötigter Mittel zur Behandlung asthmatischer Symptome zu verringern.
Die Verabreichung der Mittel der vorliegenden Erfindung kann entweder für einen "prophylaktischen" oder "therapeutischen" Zweck erfolgen. Wenn es prophylaktisch bereitgestellt ist, wird das Mittel vor einem beliebigen Asthmasymptom bereitgestellt. Die prophylaktische Verabreichung des Mittels dient der Prävention oder Attenuierung einer beliebigen nachfolgenden asthmatischen Reaktion. Wenn es therapeutisch bereitgestellt ist, wird das Mittel bei (oder kurz nach) Ausbruch eines Asthma-Symptoms bereitgestellt.
Die therapeutische Verbreichung des Mittels dient zur Abschwächung eines aktuellen Asthma-Ereignisses. Die Mittel der vorliegenden Erfindung können folglich entweder vor dem Ausbruch eines voraussichtlichen Asthma-Ereignisses (sowie um die voraussichtliche Schwere, Dauer oder Ausmaß des Ereignisses abzuschwächen) oder nach Einsetzen des Ereignisses bereitgestellt werden.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Substanz einen monoklonalen Antikörper oder ein Derivat davon, wie oben definiert, enthält.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Derivats davon, wie oben definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung irgendeiner Erkrankung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus: spezifische Entzündung als Reaktion auf einen Zustand, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus: Hypersensibilitäts-Spätreaktion, Symptom bei Psoriasis, eine Autoimmunerkrankung, Abstoßung eines Organs- oder Gewebetransplantats, z. B. Knochenmark- oder Nierentransplantat, unspezifische Entzündung auf einen Zustand aus der Gruppe bestehend aus: akutes Lungenversagen (ARDS), multiples Organschädigungssyndrom nach Sepsis, Trauma oder Hämorrhagie, Reperfusionsschädigung von myokardialen oder anderem Gewebe, akute Glomerulonephritis, reaktive Arthritis, Dermatosen mit akut entzündlichen Komponenten, akute eitrige Meningitis oder anderen entzündlichen Störungen des zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall), thermische Schädigung, Hämodialyse, Leukophorese, Colitus ulcerosa, Morbus Crohn, nekrotisierende Entecokolitis, mit einer Granulocyten-Transfusion assoziierte Syndrome und Zytokininduzierte Toxizität, Metastasierung von hämatopoetischen Tumorzellen, extravaskuläre Migration von virusinfizierten Leukocyten, Asthma, etc.
Die Antikörper dieser Erfindung sind mit einer Konzentration verabreicht, die für eine Prävention oder Behandlung eines der zuvor genannten Krankheitsstadien therapeutisch wirksam ist. Um dieses Ziel zu erreichen, können die Antikörper unter Verwendung einer Vielzahl an geeigneten, in der Technik bekannten Trägern formuliert sein. Typischerweise werden die Antikörper mittels Injektion, entweder intravenös oder intraperitoneal, verabreicht. Verfahren zur Durchführung dieser Verabreichung sind dem Fachmann bekannt. Es ist ebenfalls möglich, Zusammensetzungen zu erhalten, die topisch oder oral verabreicht werden können, oder die in der Lage sind, muköse Membranen zu durchdringen.
Vor Verabreichung an Patienten können Formulantien zu den Antikörpern gegeben werden. Eine flüssige Formulierung ist bevorzugt. Zum Beispiel können diese Formulantien Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, Tenside oder Füllstoffe umfassen. Bevorzugte Kohlenhydrate umfassen Zucker oder Zuckeralkohole wie beispielsweise Mono-, D1- oder Polysaccharide oder wasserlösliche Glucane. Die Saccharide oder Glucane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Sucrose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha und beta Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose oder Mischungen davon umfassen. Am bevorzugtesten ist Sucrose. "Zuckeralkohol" ist als ein C4 bis C8 Kohlenhydrat mit einer OH-Gruppe definiert und Galactit, Inosit, Mannit, Xylit, Sorbit, Glycerin und Arabit umfasst. Am bevorzugtesten ist Mannit. Diese oben erwähnten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination verwendet sein. Es gibt keine festgelegte Grenze für die eingesetzte Menge, solange der Zucker oder Zuckeralkohol löslich im wässrigen Präparat ist. Bevorzugt liegt die Zuckerkonzentration zwischen 1,0 wlv% und 7,0 w/v%, bevorzugter zwischen 2,0 und 6,0 w/v%. Bevorzugte Aminosäuren umfassen linksdrehende (L) Formen von Carnitin, Arginin und Betain; allerdings können auch andere Aminosäuren zugegeben sein. Bevorzugte Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2.000 und 3.000 oder Polyethylenglycol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3.000 und 5.000. Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung eines Puffers in der Zusammensetzung, um pH-Änderungen in der Lösung vor Lyophilisierung oder nach Rekonstitution zu minimieren. Fast jeder physiologische Puffer kann verwendet sein, aber Citrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamatpuffer oder Mischungen davon sind bevorzugt. Am bevorzugtesten ist ein Citratpuffer. Vorzugsweise liegt die Konzentration von 0,001 bis 0,003 molar. Tenside, die zur Formulierung gegeben sein können, sind in EP Patentanmeldung Nr. EP 0 270 799 und EP 0 268 110 gezeigt.
Zusätzlich können die Antikörper durch kovalente Konjugation an ein Polymer chemisch modifiziert sein, um zum Beispiel ihre Halbwertzeit im Kreislauf zu erhöhen. Bevorzugte Polymere und Verfahren, Antikörper an Peptide zu binden, sind in U.S. Patenten Nr. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 und 4.609.546 gezeigt. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglycol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und besitzt die allgemeine Formel: R(O-CH&sub2;-CH&sub2;)nO-R, worin R ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe wie beispielsweise eine Alkyl- oder Alkanol-Gruppe sein kann. Vorzugsweise besitzt die Schutzgruppe zwischen 1 und 8 Kohlenstoffe, bevorzugter ist dies eine Methyl-Gruppe. Der Wert für n ist eine positive gerade Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1.000, bevorzugter zwischen 2 und 500. Das PEG besitzt ein bevorzugtes durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 1.000 und 40.000, bevorzugter zwischen 2.000 und 20.000, am bevorzugtesten zwischen 5.000 und 12.000. Vorzugsweise besitzt PEG mindestens eine Hydroxy-Gruppe, bevorzugter eine terminale Hydroxy-Gruppe. Die Hydroxy-Gruppe ist vorzugsweise aktiviert. Allerdings ist es zu verstehen, dass die Art und Menge der reaktiven Gruppen variiert werden können, um einen kovalent konjugierten PEG/Antikörper der vorliegenden Erfindung erhalten.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich. Sie umfassen polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glucose, polyoxyethyliertes Glycerin (POG) etc. POG ist bevorzugt. Ein Grund ist, dass das Glycerin-Rückgrat von polyoxyethyliertem Glycerin das gleiche Rückgrat ist, das auch natürlicherweise zum Beispiel in tierischen und menschlichen Mono-, Di- und Triglyceriden vorhanden ist. Deshalb würde eine Verzweigung nicht notwendigerweise als Fremdmittel im Körper zu erkennen sein. Das POG besitzt ein bevorzugtes Molekulargewicht in der gleichen Größenordnung wie PEG. Die Struktur von POG ist in Knauf et al., 1988, gezeigt und eine Diskussion über POG/IL-2 Konjugate ist in U.S. Patent Nr. 4.766.106 zu finden.
Ein anderes System zur Abgabe von Medikamenten mit verlängerter Halbwertzeit im Kreislauf ist das Liposom. Verfahren zur Herstellung von Liposomen-Abgabe-Systemen sind in Gabizon et al., 1982 und Szoka, 1980 diskutiert. Andere Medikament-Abgabe-Systeme sind in der Technik bekannt und in z. B. Poznansky, 1984 beschrieben.
Nachdem die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt ist, wird sie vorzugsweise lyophilisiert, um einen Abbau zu vermeiden und die Sterilität zu erhalten. Verfahren zum Lyophilisieren flüssiger Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt. Unmittelbar vor Gebrauch kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (zum Beispiel Ringer Lösung, destillliertes Wasser oder sterile Saline), das zusätzliche Inhaltsstoffe umfassen kann, wiederhergestellt werden. Nach Wiederherstellung wird die Zusammensetzung bevorzugt Patienten mittels dem Fachmann bekannter Verfahren verabreicht.
Wie oben dargelegt, sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Humanpatienten verwendet, um eines der oben definierten Krankheitsstadien zu verhindern oder zu behandeln. Der parenterale Verabreichungspfad ist bevorzugt. Bei der parenteralen Verbreichung sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung in einer Dosiseinheit in injizierbarer Form formuliert beispielsweise als eine Lösung, Suspension oder Emulsion, in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten parenteralen Vehikulum. Derartige Vehikel sind von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele derartiger Vehikel sind Saline, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und Hank-Lösung. Nichtwässrige Vehikel wie beispielsweise fette Öle und Ethyloleat können auch verwendet sein. Ein bevorzugtes Vehikel ist 5% Dextrose in Saline. Das Vehikel kann geringe Mengen an Additiven wie beispielsweise Substanzen, die die Isotonität und chemische Stabilität verstärken, einschließlich Puffer und Konservierungsmittel enthalten.
Die Dosierung und die Verabreichungsart sind vom Individuum abhängig. Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen so verabreicht, dass die Antikörper in einer Dosis zwischen 1 ug/kg und 20 mg/kg, bevorzugter zwischen 20 ug/kg und 10 mg/kg, am bevorzugtesten zwischen 1 und 7 mg/kg gegeben werden. Vorzugsweise wird eine Bolus-Dosis gegeben, um die zirkulierenden Mengen auf das 10-20fache und für 4-5 Stunden nach der Bolus-Dosis zu erhöhen. Eine kontinuierliche Infusion kann ebenfalls nach der Bolus-Dosis gegeben werden. Falls dies der Fall ist, können die Antikörper mit einer Dosis zwischen 5 und 20 ug/kg/Minute, bevorzugter zwischen 7 und 15 ug/kg/Minute, infundiert werden.
Gemäß einer ebenso bevorzugten Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Derivats davon zur Herstellung eines diagnostischen oder in vivo bildgebenden Mittels eines beliebigen der oben erwähnten Krankheitsstadien. Da ICAM-3 in fast allen Entzündungsherden exprimiert ist, kann ein chimärer Antikörper, der in der Lage ist, an ICAM-3 zu binden, als bildgebendes Mittel oder Visualisierungsmittel der Infektions- und Entzündungsherde in einem Patienten eingesetzt sein.
Gemäß einer bevorzugten Anwendungsform sind ein Antikörper, Fragmente, Analoga und Derivate davon mittels Verwendung von Halogen- Radioisotopen wie beispielsweise ¹³¹I, ¹²&sup5;I, Metall-Radionukliden &sup6;&sup7;Cu, ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup9;&sup9;Tc etc.; Affinitätsmarkern (wie beispielsweise Biotin, Avidin etc.); Fluoreszenzmarkern, paramagnetischen Atomen etc. detektierbar markiert und wird einem Patienten zur Lokalisierung der Infektions- oder Entzündungsherdes bereitgestellt. Verfahren zur Durchführung einer derartigen Markierung sind dem Fachmann bekannt. Ein Überblick über die klinische Anwendung von Antikörpern bei diagnostischer Bildgebung ist in Grossman, 1986; Unger et al., 1985; Khaw et al., 1980; gegeben.
Die Detektion der Fokusse von derartig detektierbar markierten Antikörpern ist ein Hinweis auf den Ort der Entzündung, Tumorentwicklung oder atherosklerotischer Plaques. In einer Anwendungsform erfolgt die Prüfung auf eine Entzündung durch Entnahme von Gewebeproben, einschließlich Blutzellen, und Inkubieren derartiger Proben in Gegenwart von detektierbar markierten Antikörpern. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Technik in nicht-invasiver Weise mittels Verwendung von Kernresonanztomographie (MRI), Single-Photon-Emissionscomputertomographie (SPECT) oder Fluorographie und extrakorporalen Detektionsmitteln (Perkins et al., 1988; Mach et al., 1991) etc durchgeführt. Ein derartiger Diagnosetest kann zur Kontrolle von Organtransplantat- Empfängern auf frühe Anzeichen einer möglichen Gewebeabstoßung eingesetzt sein. Derartige Tests können ebenfalls durchgeführt werden, um die Disposition eines Individuums für rheumatoide Arthritis oder andere chronische Entzündungskrankheiten zu bestimmen.
Gemäß einer anderen Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Derivats davon, wie oben definiert, zur Herstellung eines diagnostischen und in vitro bildgebenden Mittels von Atherosklerose.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele, die besonders vorteilhafte Anwendungsformen zeigen, erläutert. Allerdings sollte angemerkt werden, dass diese Anwendungsformen als Beispiele dienen und die Erfindung in keiner Weise beschränken.

Liste der Abkürzungen

AP: alkalische Phosphatase
BSA: bovines Serumalbumin
CD: Differenzierungscluster
CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat
D'PBS: Dulbeccos Phosphat-gepufferte Sahne ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus;
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz
FACS: Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer
FCS: fötales Kälberserum
FITC: Fluoresceinisothiocyanat
HPLC: Hochleistungsflüssigchromatographie
ICAM: intrazelluläres Adhäsionsmolekül
LDL: Lipoprotein geringer Dichte
LFA-1: Lymphocyten-funktionsassoziiertes Antigen-1
LPDS: Lipoproteinmangel-Serum
mAk: monoklonaler Antikörper
MFI: mittlere Fluoreszenzintensität
NP-40: Nonidet P-40
NRS: Kaninchennormalserum
PAGE: Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS: Phosphat-gepufferte Saline
PEG: Polyethylenglycol
PMA: Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid
RA: Retinsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
THP-1 + PMA/RA: THP-1 Zellen, die 24 Stunden mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; PMA und 0,5 · 10&supmin;&sup7; RA aktiviert und dann 48 Stunden unter Lipidfreien Bedingungen kultiviert wurden
THP-1 Schaum: THP-1 Zellen, die 24 Stunden mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; PMA und 0,5 · 10&supmin;&sup7; RA aktiviert und nachfolgend 48 Stunden mit aggregierten Lipoproteinen geringer Dichte inkubiert wurden
VLA: spätes Aktivierungsantigen

Legenden der Figuren

Fig. 1A und 1B: Immunpräzipitationen vom 3.A9 Antigen. Fig. 1A: ¹²&sup5;I markierter KG-1a Zellextrakt wurde mit mAk 3.A9 immunpräzipitiert und mittels 7,5% SDS-PAGE unter reduzierenden (Spur 1) oder nichtreduzierenden (Spur 2) Bedingungen untersucht. Molekulargewichtsmarker (200 kDa, 97 kDa, 69 kDa sind auf der Linken Seite gezeigt). Fig. 1 B: ¹²&sup5;I markierter KG-1 Zellextrakt wurde mit mAk 1.24 (Isotypkontrolle) (Spur 2), TS2/9 (CD58) (Spur 3), 3.A9 (Spur 4), CLB-LFA-1/2 (CD11a) (Spur 5), CLB- LFA-1/1 (CD18) (Spur 6) und HP2/1 (anti-VLA-4) (Spur 7) präzipiert.
Molekulargewichtsmarker (200 kDa, 97 kDa, 69 kDa beziehungsweise 46 kDa sind in Spur 1 gezeigt).
Fig. 2: Binden von 3.A9, anti-ICAM-3, CDw50 und Kontrollantikörpern an affinitätsgereinigtem 3.A9 Antigen. 3.A9 Antigen wurde mittels Affinitätschromatographie von humanem Milzzellextrakt gereinigt. Eluatfraktionen wurden auf Mikrotiterplatten geschichtet und auf Binden an 3.A9, anti-ICAM-3, CDw50 und Kontrollantikörpern mittels Enzymgebundenen Immunoassays getestet.
Fig. 3: Hochregulation von 3.A9 auf THF-1 Schaumzellen. mAk 3.A9 wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz auf THF-1 Zellen in drei Differenzierungsstadien (THP-1, THP-1 + PMA/RA, THP-1 Schaum; zur Definition dieser Zelipopulationen siehe Beispiel 6) getestet mAk 3.A9 zeigt ein verstärktes Binden auf THP-1 Schaumzellen im Vergleich zu THP-1 und THP-1 + PMA/RA Zellen in allen neun durchgeführten Experimenten. Mittlere Fluoreszenzintensität (auf einer vierdekadischen logarithmischen Skala) (MFI) ist angegeben.
Fig. 4: Verhalten von 3.A9, CDw50 und anti-ICAM-3 mAk in unserem Schaumzellmodell. mAk 3.A9 wurde zusammen mit den anderen zur unserer Verfügung stehenden anti-ICAM-3 und CDw50 mAk mittels Durchflusscytometrie auf THP-1 Zellen in drei Differenzierungsstadien (THP-1, THP-1 + PMA/RA, THP-1 Schaum; zur Definition dieser Zelipopulationen siehe Beispiel 6) getestet. mAk 3.A9 ist der einzige anti-ICAM-3 oder anti-CDw50 mAk, der ein verstärktes Binden auf THP-1 Schaumzellen im Vergleich zu TMP-1 und THP-1 + PMA/RA Zellen zeigt. Mittlere Fluoreszenzintensität (auf einer vierdekadischen logarithmischen Skala) (MFI) ist angegeben.
Fig. 5A, 5B, 5C: Hochregulation von mAk 3.A9 aber nicht von den anderen CDw50 oder anti ICAM-3 mAk auf THP-1 Schaumzellen. FACS Histogramme von mAk 1.24 (Isotypkontroll-mAk) (5A), mAk CBR-IC3/1 (stellvertretend für die anderen ICAM-3 und CDw50 mAk) (5B) und mAk 3.A9 (5C) auf THP-1, THP-1 + PMA/RA und THP-1 Schaumzellen.
Fig. 6: mAk 3.A9 hemmt Alloantigen-induzierte T-Zellproliferation. Gereinigte T-Zellen werden in Gegenwart von allogenen Monocyten aber nicht in Gegenwart von autologen Monocyten stimuliert. Diese Alloantigen-induzierte Stimulation kann von mAk 3.A9 (anti-ICAM-3) aber nicht von mAk 84H10 (anti-ICAM-1) stark gehemmt werden. Ein repräsentativer Versuch von zwei durchgeführten.
Fig. 7A und 7B: Hochregulation des CD36 Moleküls auf THP-1 Schaumzellen. Fig. 7A: mAk OKM5 wurde mittels Durchflusscytometrie auf THP-1, THP-1 + PMA/RA und THP-1 Schaumzellen getestet. OKM5 zeigt ein verstärktes Binden auf THP-1 Zellen im Vergleich zu THP-1 und THP-1 + PMA/RA Zellen. Fig. 7B: FACS Histogramm von OKMS mAk auf drei THP- 1 Zellpopulationen.

BEISPIELE

Beispiel 1

Bildung eines neuen humanen THP-1 in vitro Schaumzellmodells

LDL Präparation und Modifikation

Humanes LDL (d = 1,019-1,063 kg/l) wurde aus frischem Plasma mittels sequentieller Flotationsultrazentrifugation isoliert und Lipoproteinmangel-Serum (LPDS) wurde, wie zuvor beschrieben (Vercaernst et al., 1989), gewonnen Diese Präparationen wurden eingehend gegen 0,15 M NaCl, 0,01% Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz (EDTA), pH 7,4, dialysiert, durch einen 0,22 um Millex GV Filter (Millipore, Bedford, MA) gefiltert und bei 4ºC aufbewahrt.
Acetyliertes LDL wurde wie beschrieben hergestellt (Vercaernst et al., 1989). Aggregierte LDL-Partikel wurden unter Sterilbedingungen mittels Beschallung, 10 · 15 Sekunden mit 15 Sekundenintervallen, von nativem LDL (5-10 mg/ml) unter Verwendung einer Branson Mikrotip Sonde (Danbury, CT) bei 52ºC und einer Ausgangsleistung von 60 W erhalten. Der Aggregationsgrad wurde mittels anschließender Messung der optischen Dichte bei 680 nm bestimmt (Khoo et al., 1988). Hierfür wurden die Proben auf 40 ug/ml in Phosphat-gepufferter Sahne (PBS) verdünnt. Die elektrophoretische Mobilität der Lipoproteine wurde mittels Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von Agarosegelen und Universal Barbital Puffer, pH 8,6 (Ciba Corning, Palo Alto, CA) gemäß dem Verfahren von Basu et al. (1979) bestimmt.
Die chemische Zusammensetzung der Aggregate blieb im Vergleich zu nativem LDL unverändert. Auf Agarosegelen wurde eine kleinere Fraktion mit einer Mobilität von LDL detektiert, wohingegen der größte Teil der Partikel auf Grund des höheren Molekulargewichts in das Gel nicht eindrang. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gelfiltration zeigte das Vorhandensein von aggregiertem LDL mit einem Molekulargewicht von > 7,5 · 10&sup6; Dalton (Da). Die chromatographische Trennung von Lipoproteinen unter Verwendung von Gelfiltration wurde wie von Vercaernst et al. (1983) beschrieben mit einer Spectra-Physics SP 8000 HPLC durchgeführt. 50 ul Lipoprotein-Probe (+2 mg/ml) wurde auf eine Ultro Pac TSK-G 4000 SW Säule (60 cm · 7,5 mm; Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) geladen, mit 0,2 M Na&sub2;HPO und einem Fluss von 0,5 ml/Minute eluiert. Protein wurde bei 280 nm detektiert. Transmissionselektronenmikroskopie von aggregiertem LDL wurde, wie von Forte und Nordhausen (1986) beschrieben, durchgeführt. Lipoprotein-Proben wurden auf 150 ul/mg in 125 mM Ammoniumacetat, 2,6 mM Ammoniumcarbonat, 0,27 mM EDTA, pH 7,4, verdünnt und bei 4ºC übernacht dialysiert. Gleiche Volumina Lipoprotein-Probe und 2% Phosphowolframsäure, pH 7,4, wurden gemischt und 10 ul und auf ein Formvar Gitter (Balzers, Liechtenstein) aufgetragen. Präparate wurden mit einem Zeiss EM 10C Elektronenmikroskop untersucht und ergaben eine heterogene Partikelpopulation mit einem Durchmesser, der zwischen 20 und 100 nm schwankte.

Zellkultur und Schaumzellbildung

Die THP-1 Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC TIB 202 Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), das 10% fötales Kälberserum enthielt (FCS; Gibco), in einem Befeuchtungsikubator mit 5% Kohlendioxid bei 37ºC gehalten. Um Schaumzellbildung zu induzieren, würden THP-1 Zellen in 35 mm Vertiefungen (Nung, Roskilde, Dänemark) mit 1 · 10&sup6; Zellen/ml in 2 ml RPMI 1640 Medium in Gegenwart von 10% FCS, 2 · 10&supmin;&sup7; M PMA (Kat-Nr. P8139, Sigma, St. Louis, MO), 0,5 · 10&supmin;&sup7; M all-trans Retinsäure (RA) (Kat-Nr. R2625, Sigma) ausgesät und 24 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mittels Ansaugen mit 2 ml RPMI 1640 ohne FCS gewaschen und 48 Stunden in 2 ml 10% LPDS, 25 ug/ml Gentamycin (Gibco) haltigem RPM1 1640 mit oder ohne 200 ug/ml aggregiertem LDL inkubiert. Insgesamt wurden drei Populationen untersucht:
(a) Zellen in RPMI 1640 in Gegenwart von 10% FGS (THP-1) gewachsen, (b) PMA/RA differenzierte Zellen, die außerdem 48 Stunden unter Lipid-freien Bedingungen wachsen gelassen wurden (THP-1 + PMA/RA), und (c) PMA/RA differenzierte Zellen, die weiter 48 Stunden in Gegenwart von aggregiertem LDL wachsen gelassen wurden, um Schaumzellbildung zu induzieren (THP-1 Schaum).
Zelluläres freies Cholesterol und Cholesterylester wurden mittels Umkehrphasen-HPLC wie beschrieben (Vercaernst et al., 1989) bestimmt. Am Ende der Cholesterol-Beladungsinkubationszeit wurde das Medium aus den Schalen entfernt und die anhaftenden Zellen wurden einmal mit PBS, 0,2% bovinem Serumalbumin (BSA), zweimal ausschließlich mit PBS und mit einem Gummischaber in PBS geschabt. Etwa 2 · 106 Zellen wurden mit 5 ml Hexan/Isopropanol (3 : 2, v/v; Merck, Darmstadt, BRD), das 50 ml Cholesterylheptadecanoat (1,2 mg/ml Chloroform; Sigma) als interner Standard enthielt, extrahiert. Nach 15 Minuten Zentrifugation mit 1800 g wurde der organische Phase-Überstand unter Stickstoff getrocknet und das Präzipitat wurde in 1 ml Chloroform gelöst und dreimal gewaschen. Der trockene Rückstand wurde schließlich in 10 ml Chloroform und 40 ul Elutionslösemittel, Acetonitril/Isopropanol (1 : 1, v/v), gelöst. 20 ui wurden für eine HPLC-Analyse (Vercaernst et al., 1989) injiziert. Das Proteinpellet wurde in 0,1 M NaOH gelöst und der Proteingehalt wurde mit dem BCA Protein Assay Reagent kit (Pierce, Rockford, IL) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt. Cholesterol-Mengen sind als ug pro mg Zeliprotein angegeben.
THP-1 Schaumzellen akkumulierten im Durchschnitt 139 + 36 ug/mg Zellprotein intrazelluläres Cholesterol, das zu 46 + 6% in der veresterten Form vorlag. Schaumzellbildung wurde nur durch Zugabe von aggregiertem LDL zu PMA/RA differenzierten THP-1 Zellen induziert. Vorherige Induktion mit ausschließlich PMA ergab keine ähnlich hohen Cholesterol-Gehalte (Tabelle 1). Zugabe von nativem oder acetyliertem LDL zu PMA/RA differenzierten THP-1 Zellen führte nur zu einem leichten Anstieg der Lipoprotein-Aufnahme, vergleichbar mit ausschließlich PMA Differenzierung. Die erythroleukämische K-562 Zeltlinie (ATCC CCL 243), die in einem analogen Experiment verwendet wurde, konnte nicht zur Akkumulation gleicher Cholesterol-Mengen, wie sie in THP-1 Schaumzellen gefunden wurden, (Tabelle 1) induziert werden. Zugabe von aggregiertem LDL nach PMA/RA Differenzierung führte nur zu 30 ug Gesamtcholesterol pro mg Zellprotein und es wurde nur ein geringer Veresterungsgrad beobachtet. Für Sudan III Färbung von zellulären Lipiden wurden THP-1 Zellen auf Lab Tek Trägern (Nung) wachsen gelassen, mit PBS gewaschen und in Formol-Dampf 15 Minuten fixiert. Cytospins von Suspensionszellen wurden in 4% Formaldehyd-Lösung 7 Minuten fixiert. Präparate wurden 2 Minuten in Propylenglycol eingetaucht, mit destilliertem Wasser in einer Petrischale gewaschen und mit einer gefilterten 5 mg/ml Sudan III Lösung (Aldrich, Milwaukee, WI) in Propylenglycol 1 Stunde gefärbt. Sie wurden in 85% Propylenglycol gespült (1 Minute) und in destilliertem Wasser gewaschen. PMA/RA differenzierte THP-1 Zellen zeigten viele Extrusionen und wenige cytoplasmatische Sudan III anfärbbare Tröpfchen waren zu erkennen. Nach Zugabe von aggregiertem LDL waren zahlreiche Tröpfchen festzustellen, was die intrazelluläre Aufnahme von Partikel bewies. Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden Zellen auf Deckgläschen in 35 mm Platten wachsen gelassen, zweimal mit kalter PBS gewaschen und mit 2,5% Glutardialdehyd in 0,1 M Cacodylat, pH 7,4, fixiert. Präparate wurden mit 1% OsO4 in Cacodylat-Puffer gefärbt, mit Uranylacetat und Bleicitrat nachgefärbt und mit einem Zeiss EM 10C Elektronenmikroskop untersucht. THP-1 Zellsuspension wurde mit einer Konzentration von 106 Zellen/ml unter Verwendung von 2,5% Glutardialdehyd 2 Stunden fixiert. Cytospins wurden angefertigt und, wie oben erwähnt, verarbeitet. Elektronenmikroskopie dieser Schaumzellen ergab, dass die meisten Lipid-Einschlüsse aus cytoplasmatischen freien Tröpfchen bestanden, daneben wurden ebenfalls lysosomale Lipid-Strukturen und große mit Zelltrümmern gefüllte Vakuolen detektiert.
Das beschriebene in vitro humane Schaumzellmodell, das durch 48 stündige Zugabe von aggregiertem LDL zu PMA/RA differenzierten THP-1 Zellen gebildet wurde, zeigt, dass es ein besseres System ist als die in der Literatur beschriebenen (Hara et al., 1987; Yamamoto et al., 1988), da die höheren Mengen an intrazellulären Cholesterol und Cholesterylestern der in vitro Situation gleichen.

Beispiel 2

Produktion des monoklonalen Antikörpers 3.A9

Immunisierungsprotokoll

Weiblichen BALB/c Mäusen wurde an Tag 0,14 und 28 2 · 10&sup7; humane KG-1a Zellen (American Type Culture Collection CCL 246.1) in 200 ul Dulbeccos PBS ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus; (D'PBS) injiziert.

Fusions-, Selektions- und Klonierungsprotokoll

Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz einer immunen Maus steril entfernt und eine Single-Cell-Suspension durch vorsichtiges Auseinanderzupfen mit einer Pinzette hergestellt. Die Milzzellen wurden zweimal 10 Minuten mit 200 g in Serum-freiem RPMI 1640 Medium gewaschen. SP2/0-Ag-14 Maus-Myelomzellen (ATCC CRL 1581), die in der log-Phase in RPMI 1640 mit 10% FCS drei Tage vor der Fusion gehalten wurden, wurden mit 200 g 10 Minuten zentrifugiert und zusätzlich zweimal in Serum-freiem RPMI gewaschen. Maus-Milzzellen und SP2/0-Ag-14 Myelomzellen wurden in einem Verhältnis von 10 : 1 unter Verwendung von 50% Polyethylenglycol 4000 (Merck) fusioniert. Hierzu wurden beide Zellsuspensionen (in Serum-freiem RPMI) gemischt, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Zellpellet wurde durch Antippen des Röhrchens resuspendiert und 2 ml Polyethylenglycol (50% in RPMI, pH 7,4) wurde bei 37ºC unter Rühren im Verlauf 1 Minute zugegeben, anschließend wurde 5 ml warmes Serum-freies RPMI (37ºC) innerhalb von 90 Sekunden zugegeben. Zusätzlich wurde 20 ml warmes RPMt zugegeben und die Zellen wurden mit 200 g 10 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in HAT Selektivmedium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 IE/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 100 uM Hypoxanthin, 0,4 uM Aminopterin und 16 uM Thymidin enthielt, alle Reagenzien von Gibco) resuspendiert. Die Zellen wurden in Plastikplatten mit 96 Vertiefungen bei 37ºC mit 5% CO&sub2; in feuchter Atmosphäre gehalten. Vom Tag 5 an wurden Klonierungsplatten mit einem Phasenkontrast-Mikroskop sorgfältig beobachtet. Hybrid-Kolonien waren in 5-14 Tagen erkennbar und die Überstände von diesen Kolonien wurden durchmustert auf (a) Produktion von mAk für humane KG-1 Zellen unter Verwendung indirekter Immunfluoreszenz (67 Vertiefungen von insgesamt 10 Platten = 960 getestete Vertiefungen wurden als positiv bewertet) und (b) auf unterschiedliches Binden auf THP-1 + PMA/RA und THP-1 Schaumzellen unter Verwendung indirekter Immunfluoreszenz (1 von 67 wurde positiv bewertet, nämlich 3.A9). Für detaillierte Informationen zum Färbeverfahren siehe Beispiel 3. Zellen aus der 3.A9 Vertiefung wurden zweimal mittels Grenzverdünnung in Anwesenheit von Maus-Milzzellen und Feeder-Schichten geklont. Hybridom 3.A9F5E1 (nach zwei Grenzverdünnungszyklen erhalten) wurde bei der "European Collection of Animal Cell Cultures" am 26. Oktober 1993 unter der Hinterlegungsnummer 93102638 hinterlegt. Zur Vereinfachung wird dieses Hybridom (3.A9F5E1) und der von ihm sezernierte mAk des weiteren als 3.A9 in den Beispielen, der Beschreibung und den Ansprüchen bezeichnet.
Antikörper in Form von Ascites-Flüssigkeit wurde durch Injizieren von 1 · 10&sup6; Hybridomzellen intraperitoneal in BALB/c Mäuse, die mit Pristan (2,6.10,14 Tetramethylpentadecan) (Aldrich) behandelt waren, hergestellt. mAk 3.A9 gehört zur IgG1 kappa Unterklasse wie mit einem mAk Isotypisierungskit, bei dem mit anti-Maus isotyp-spezifische Antikörper beschichtete Träger (Innogenetics, Antwerpen, Belgien) verwendet werden, bestimmt wurde.

Beispiel 3

Zellverteilungsmuster des monoklonalen Antikörpers 3.A9

Mehrere B, T, Myeloid- und Erythroidzelllinien und gewöhnliche Blutzellen wurden mittels Durchflusscytometrie auf ihre Reaktivität mit mAk 3.A9 getestet.

Zellen und Zelllinien

Die humanen Zell linien (siehe Tabelle 2) wurden in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS, 100 IE/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, kultiviert. Mononukleäre Zellen vom peripheren Blut wurden aus anti-coaguliertem venösen Blut gesunder Freiwilliger mittels Dichtegradienten-Zentrifugation über Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegen) isoliert. Zu diesem Zweck wurde frisches peripheres Blut mit einem gleichen Volumen D'PBS gemischt, sorgfältig auf Lymphoprep unter Verwendung einer Pasteur-Pipette (8 ml verdünntes Blut/6 ml Lymphoprep in einem 15 ml Röhrchen) geschichtet und mit 400 g 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Mononukleäre Zellen wurden aus dem Grenzschicht (zwischen der Probenschicht und der Lymphoprep-Lösung) mit einer Pasteur-Pipette entnommen, einmal mit D'PBS und einmal mit D'PBS/2% FCS gewaschen. Neutrophile wurden von dem Pellet nach Dextran T500 (Pharmacia) Sedimentation und hypotonischer Lyse von kontaminierenden Blutzellen gesammelt: (a) das Pellet (nach Lymphoprep- Zentrifugation von 10 ml verdünntem Bluti erhalten und Granulocyten und Erythrocyten enthaltend) wurde in 10 ml D'PBS resuspendiert und mit Dextran (3% w/v in D'PBS) in einem Verhältnis von 10 ml Zellsuspension zu 15 ml Dextran gemischt; (b) Erythrocyten durften 1 Stunde bei Raumtemperatur sedimentieren; (c) der Überstand wurde zentrifugiert (10 Minuten, 250 g) und einmal mit D'PBS gewaschen; (d) kontaminierende rote Blutzellen wurden mittels hypotonischer Lyse entfernt und (e) resultierende Granulocyten wurden zweimal mit D'PBS und einmal mit D'PBS/2% FCS gewaschen. Erythrocyten wurden durch Entfernen der Buffy-coat nach Zentrifugation (15 Minuten, 200 g) des Gesamtbluts und zweimaligem Waschen (10 Minuten, 600 g) mit D'PBS und einmal Waschen mit D"PBS/2% FCS hergestellt. Plättchen wurden wie folgt gewonnen: (a) Zentrifugation (15 Minuten, 200 g) des Gesamtbluts; (b) Zentrifugation des Überstands (= plättchenreiches Plasma) 5 Minuten mit 1600 g und (c) dreimaliges Waschen (5 Minuten, 1600 g) des Pellets (= Plättchen) mit D'PBS/1% BSA/0,05% EDTA.

Durchflusscytometrie-Analyse

Anwesenheit oder Abwesenheit von dem 3.A9 Antigen auf diesen Zelltypen wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz folgendermaßen untersucht. Aliquote von 5 · 10&sup5; - 1 · 10&sup6; Zellen (in 100 ml D'PBS/2% FCS/0,02% NaN&sub3;) wurden mit einer sättigenden Menge (1/250 Endverdünnung von Ascitesflüssigkeit) an mAk 3.A9 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, einmal mit D'PBS/2% FCS/0,02% NaN&sub3; gewaschen, weitere 30 Minuten mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markiertem affinitätsgereinigtem Ziege F(ab')2 anti-Maus Ig (Tago, Burlingame, CA) inkubiert und erneut mit D'PBS/2% FCS/0,02% NaN&sub3; gewaschen. Bei den Plättchen wurde die ganze Prozedur in D'PBS/1% BSA/0.05% EDTA/0,02% NaN&sub3; anstelle von D'PBS/2% FCS/0,02% NaN&sub3; durchgeführt. Die gefärbten Zellen (außer Erythrocyten, die sofort analysiert wurden) wurden dann mit 0,5% Paraformaldehyd in D'PBS fixiert und unter Verwendung von CONSORT 30 Software auf einem FACScan (Becton-Dickinson, Erembodegem, Belgien) analysiert. Fluoreszenz wurde mit logarithmischer Verstärkung bei insgesamt 5000 Zellen gemessen. Wo es möglich war, wurden Lymphocyten und Monocyten basierend auf 2-dimensionalen Lichstreuungs-Charakteristika identifiziert. In einigen Experimenten wurde die Identität dieser Zelltypen mittels Färben mit für Monocyten, T-Zellen und B-Zellen spezifischen mAk (Becton-Dickinson) bestätigt. Hitze-inaktiviertes Kaninchennormalserum (NRS) wurde sowohl beim ersten als auch beim zweiten Inkubationsschritt zugegeben, um eine nichtspezifische Fc gamma Rezeptor Färbung zu vermeiden.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass das 3.A9 Antigen ein nichtverwandtes Antigen ist, das in mäßigen bis großen Mengen auf vielen getesteten Zelltypen vorhanden ist. Nur Erythrocyten, Plättchen, K-562, Daudi und Raji Zellen reagieren nicht mit mAk 3.A9. Ein Vergleich seines Verteilungsmusters mit der "Leucocyte Typing Data Base IV" (Gilks, 1990) ergibt, dass mAk 3.A9 mAk 101-1 D2 und 140-11 ähnelt, die während "The Fourth International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens" in CDw50 zusammengefasst wurden (Hadam et al., 1990). Wie schon vorher erwähnt, ist vor Kurzem veröffentlicht worden, dass das CDw50 Antigen und ICAM-3 ein und dasselbe Molekül sind (Juan et al., 1993).

Beispiel 4

Biochemische Charakterisierung des 3.A9 Antigens

Radiomarkierung von Zelloberflächenproteinen, Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und Autoradiographie

KG-1a Zellen wurden an der Oberfläche durch Lactoperoxidasekatalysierte lodierung markiert. Zu diesem Zweck wurden 5 · 10&sup7; Zellen (in 150 ul D'PBS), 50 ul Lactoperoxidase-Lösung (100 IE/ml) (Calbiochem, La Jolla, CA), 10 ul 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 1,0 mCi Na¹²&sup5;I (Amersham, Buckinghamshire, UK) und 20 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; 4 Minuten bei 30ºC zusammen inkubiert. Zusätzlich wurde 20 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; zugegeben und die Inkubation weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Zellen wurden dann fünfmal in 5 mM Kaliumiodid und 0,02% NaN&sub3; haltiger D'PBS gewaschen. Radioiodierte Zellen wurden in 1,0 ml Lysepuffer (150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 100 mM Iodacetamid, 3 mM EDTA, 1 uM Pepstatin A, 0,03 Trypsin-hemmende Einheiten (TIU)/ml Aprotin, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,1% NaN&sub3; haltigem 50 mM Tris-HCl pH 8,0) lysiert. Nach 15 Minuten bei 4ºC wurde der Extrakt mit 30.000 g 1 Stunde zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde gesammelt und mit Protein A-Sepharose CL-48 (Pharmacia) 2 Stunden bei 4ºC voradsorbiert. Für die Immunpräzipitation wurden 50 ul (2-3 · 10&sup6; Zelläquivalente) iodiertes Lysat mit 10-50 ul geeignet verdünntem mAk 3.A9 gemischt und übernacht bei 4ºC inkubiert. Die gebildeten Antigen-Antikörper Komplexe wurden mit 150 ul 10% Protein A-Sepharose (in Lysepuffer vorgewaschen und zu einer 10% Lösung in 0,1% BSA haltigem Lysepuffer resuspendiert) 3 Stunden bei 4ºC präzipitiert, dreimal in 0,5% Deoxycholat und 0,1% BSA haltigem Lysepuffer gewaschen, in Probenpuffer (enthaltend 15% Glycerin, 3% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,01% Bromphenolblau in 62 mM Tris Puffer pH 6,8 mit oder ohne 5% 2-Mercaptoethanol) (4 Minuten, 95ºC) aufgebrochen und mittels einer eindimensionalen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) gemäß Laemmli (1970) analysiert. Nach Coomassie-Färbung und Trocknen wurden die Gele einer Autoradiographie bei -80ºC mit Röntgenfilm und Verstärkerfolie unterzogen:

Ergebnisse

Immunpräzipitation und SDS-PAGE Analyse des 1251-markierten 3.A9 Antigens auf KG-1a Zellen ergab eine Bande mit offensichtlichem Molekulargewicht von 150 kDa, wenn 7,5% Gele unter reduzierenden Bedingungen laufen gelassen wurden (Fig. 1A). Ein etwas geringeres offensichtliches Molekulargewicht wurde unter nichtreduzierenden Bedingungen beobachtet (Fig. 1A). In einigen Experimenten wurden ebenfalls schwache Banden mit > 200 kDA und 80 kDa beobachtet. In einem weiteren Immunpräzipitationsexperiment wurde mAk 3.A9 mit mAk TS2/9 (GD58) (von Dr. T. Springer, Boston, USA, überlassen) (Sanchez et al., Madrid, 1982), CLB-LFA-1/2 (CD11a) (Janssen Biochimica, Beerse, Belgien), CLB-LFA-1/1 (CD18) (Janssen) und HP2/1 (anti-VLA-4) (von Dr. F. Sanchez, Madrid, Spanien, überlassen) verglichen. Aus Fig. 1 B ist ersichtlich, dass das 3.A9 Antigen nicht einem dieser bekannten CD-Antigene entspricht. Diese Daten können sehr gut durch die Vermutung erklärt werden, dass das 3.A9 Antigen ein Molekulargewicht von 150 kDa (die 80 kDa Bande ist ein Abbauprodukt) besitzt. Alternativ könnte das 3.A9 Antigen ein alfabeta Heterodimer sein, wo die 150 kDa Komponente nicht-kovalent mit der 80 kDa Komponente assoziiert ist. Es besteht jetzt Einigkeit, dass das CDw50/ICAM- 3 Antigen ein Molekulargewicht von 116-140 kDa besitzt, abhängig vom getesteten Zelltyp (WO 93114776; Juan et al., 1993). Es sollte allerdings betont werden, dass CDw50 mAk ursprünglich als zwei Banden von 110 und 140 kDa präzipitierend beschrieben wurde (Hadam et al., 1990).

Beispiel 5

Reinigung des 3.A9 Antigens

Präparation der 3.A9 Affinitätssäule

mAk 3.A9 wurde mittels Protein G-Sepharose Affinitätschromatographie (Pharmacia) gereinigt. Ascitesflüssigkeit (1/2 mit PBS, pH 7,2, verdünnt) wurde auf eine Protein G-Sepharose Säule (Bettvolumen 6 ml) aufgetragen und durfte 30 Minuten bei Raumtemperatur wechselwirken. Die Säule wurde mit PBS so lange gewaschen bis kein Protein mehr in der Waschlösung zu detektieren war. Gebundener Antikörper wurde mit 0,1 M Glycin-HCl pH 3,0 eluiert und mit einer hinreichenden Menge an 10x konzentrierter PBS neutralisiert. Gereinigter mAk 3.A9 wurde gegen 0,1 M Boratpuffer pH 8,5 ausgiebig dialysiert und an Reacti-Gel (Pierce) gemäß Herstelleranleitung gekoppelt. Wichtig: Überschüssiges Aceton wurde vom Reacti-Gel Träger mittels vorsichtiges Absaugen durch einen Buchner- Trichter mit Whatman Papier entfernt (b) das Gel wurde rasch einige Male mit eiskaltem 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen, (c) das Gel wurde sofort mit Boratpuffer, der mAk in folgendem Verhältnis (1 ml Gel 14 ml 0,1 M Boratpuffer pH 8,5/4 mg mAk 3.A9) enthielt, gemischt, (d) die Mischung wurde 48 Stunden bei 4ºC rotiert, (e) nach Waschen mit D'PBS wurde das Gel mit 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 inkubiert, um aktiv bleibende Stellen zu blockieren, (f) nach dem Waschen wurde das Gel in D'PBS/0.02% NaN&sub3; bei 4ºC aufbewahrt.

Präparation von 3.A9 haltigem Extrakt

Gefrorene menschliche Milz (80 Gramm) wurde in kleine Stücke geschnitten, in 0,25 M Sucrose/10 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen und bei 4ºC in einem Virtis Mixer (3 · 10 Sekunden zum Trennen 30 ml Fraktionen) in 200 ml des gleichen Puffers homogenisiert. Nach Zentrifugation mit 400 g 10 Minuten wurde der Überstand mit 100.000 g 1 Stunde bei 4ºC ultrazentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde mit 75 ml eiskaltem Lysepuffer (Zusammensetzung des Lysepuffers wie in Beispiel 4 beschrieben, außer dass Iodacetamid weggelassen war) (1 Stunde bei 4ºC unter vorsichtigem Rühren) lysiert. Nach 1 Stunde Ultrazentrifugation mit 100.000 g wurde der Überstand gesammelt. Das 100.000 g Pellet wurde der selben Prozedur unterzogen und beide Überstände vereint.
Präparation von angereichertem affinitätsgereinigtem 3.A9 Antigen Der Extrakt wurde einige Male mit einer Rate von 6-24 ml/Stunde über eine Vorsäule, die 5 ml Reacti-Gel, an dem IgG1 Kontroll mAk gebunden war, enthielt, und nachfolgend über eine Säule, die 18 mg mAk 3,A9, der mit einem Verhältnis von 6 mg/ml an den gleichen Reacti-Gel Träger gebunden war, enthielt, gegeben. Nach Auftragen des Extrakts wurde die Säule mit 10- 20 Säulenvolumina: (a) 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 0,2% NP-40, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF; und (b) 10 mM Tris-HCl pH T,4, 0,2% 3-[(3- Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), 1 mM PMSF; gewaschen. Das Antigen wurde mit 5 Säulenvolumina 50 mM Diethylamin-HCl pH 11.5 bei Vorhandensein von 0,2% CHAPS eluiert. 1 ml Fraktionen wurden von der Diethylamin-Elution in Röhrchen, die hinreichende Mengen an 1 M Glycin-HCl pH 3,0 enthielten, um die Fraktion zu neutralisieren, gesammelt. Aliquote von jeder Fraktion wurden mittels Festphasen indirektem Antikörper-Bindungsassay analysiert, wie im folgenden Absatz beschrieben. ELISA für Detektion von 3.A9 Antigen in Eluat-Fraktionen: 60 ul jeder Eluat-Fraktion (1/60 in 50 mM Na&sub2;COO3/NaHCO&sub3; Puffer pH 9,6 verdünnt) wurde übernacht bei Raumtemperatur in Mikrotiterplatten (Nung) inkubiert. Die Platten wurden dann:
(a) dreimal mit D'PBS gewaschen und zwei Stunden mit DPBS/1% BSA/1% NRS gesättigt;
(b) mit mAk (3.A9, CDw50, anti-ICAM-3, Kontrollen, siehe unten) (1/250 Verdünnung in D'PBS/1% BSA) 2 Stunden unter vorsichtigem Schütteln inkubiert; (c) dreimal mit D'PBS/0,05% Tween-20 gewaschen; (d) mit alkalischer Phosphatase (AP)-markiertem Kaninchen anti-Maus Ig (Dako, Ghent, Belgien) (1/1000 in D'PBS/1% BSA/1% NRS) 1 Stunde inkubiert; (e) zweimal mit D'PBS/0,05% Tween-20 gewaschen; (f) einmal mit AP-Puffer (1 M Diethanolamin pH 9,8, 0,5 mM MgCl&sub2;) gewaschen; und (g) mit Substrat (2 mg para-Nitrofenylphosphat in AP-Puffer) inkubiert. Die OD wurde nach 30 Minuten bei 405 nm mit einem Plattenleser gemessen.
Außer 3.A9 wurden die folgenden anti-ICAM-3 und CDw50 mAk verwendet: CBR-IC3/1 (de Fougerolles und Springer, 1992), CBR-IC3/2 (de Fougerolles et al., 1993), CBR-IC3/3, CBR-IC3/4, CBR-IC3/5, CBR-IC3/6 (mAk CBR- IC3/1, 2, 3, 4, 5, 6 sind in WO 92/22323 beschrieben worden), HP2/19 (Carrera et al., 1988), KS 128 (Fawcett et al., 1992), 152-2D11 (Juan et al., 1993), 140-11 (Vilella et al., 1990), 101-1D2 (Vilella et al., 1990). Zusätzlich wurden die folgenden mAk als Kontrollen verwendet: 1.24 (De Smet et al., 1983), 1.C1 (CD43) (De Smet et al., 1993) und 2.E11 (anti-HLA Klasse I) (De Smet et al., 1993).

Ergebnisse

Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, binden 5 (von den 8 anti-ICAM-3 mAk), 3 (von den CDw50 mAk) zusammen mit mAk 3.A9 an das von der 3.A9 Affinitätssäule eluierte Material. Die Spezifität dieser Reaktion ist durch die Tatsache verdeutlicht, dass mAk, die gegen andere wichtige Zelloberflächen- Moleküle, die bekannterweise auf humanen Zellen vorkommen (einschließlich HLA Klasse I und CD43 Antigen) gerichtet sind, kein Binden zeigen.
Zusätzlich wurden Antikörper gegen ICAM-1 (B4H10, Immunotech, Marseille, Frankreich), ICAM-2 (CBR-IC2/1, von de Fougerolles et al., 1992 offengelegt) getestet und als negativ befunden worden.
Als Schlussfolgerung: die Daten in den Beispielen 3, 4 und 5 deuten darauf hin, dass mAk 3.A9 gegen ein Epitop von ICAM-3 oder eines ICAMverwandten Moleküls gerichtet ist.

Beispiel 6

Monoklonaler Antikörper 3.A9 ist auf in vitro THP-1 Schaumzellen hochreguliert

mAk 3.A9 wurde zusammen mit den anderen in Beispiel 5 beschriebenen CDw50 und anti-ICAM-3 mAk mittels Durchflusscytometrie auf drei verschiedenen THP-1 Zellpopulationen gleichzeitig getestet: (a) THP-1 Zellen in RPMI 1640 Medium mit 10% FCS (THP-1) gewachsen; (b) THP-1 Zellen, die 24 Stunden mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M PMA und 0,5 · 10&supmin;&sup7; RA aktiviert wurden und dann 48 Stunden unter Lipid-freien Bedingungen (THP-1 + PMA/RA) wuchsen; und (c) THP-1 Zellen, die 24 Stunden mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M PMA und 0,5 · 10&supmin;&sup7; RA aktiviert wurden und danach 48 Stunden in Medium mit aggregiertem Lipoprotein geringer Dichte (THP-1 Schaum) kultiviert wurden. Details über Herstellung der Schaumzellen sind Beispiel 1 zu entnehmen. Details über indirekte Immunfluoreszenz- Färbemethoden sind Beispiel 3 zu entnehmen.
mAk 3.A9 ist auf einem beträchtlichen Prozenzsatz (> 50%) der in vitro humanen Schaumzellen (als (c) oben bezeichnet) hochreguliert. Diese Hochregulierung kann unterschiedlich sein, erfolgt aber in allen bis heute durchgeführten Experimenten (Fig. 3). Außerdem wie aus Fig. 4 und 5 ersichtlich ist, ist mAk 3.A9 der einzige CDw50 oder anti-ICAM-3 mAk, der auf diesen Schaumzellen hochreguliert ist. Dies würde darauf hindeuten, dass mAk 3.A9 ein einziges Epitop auf dem ICAM-3 Antigen erkennt, oder alternativ gegen ein ICAM-3 verwandtes Molekül gerichtet ist.

Beispiel 7

mAk 3.A9 hemmt die Allo-Antigen-induzierte Proliferation gereinigter T-Zellen

Monocyten-Isolierung und Kultivierung

Buffy-coats, die nach Cytophorese gesunder Spender erhalten wurden, wurden zur Herstellung von Monocyten-Kulturen verwendet. Mononukleäre Zelisuspensionen wurden nach aufschwimmender Dichtezentrifugation von Buffy-coats auf Lymphoprep (Nycomed) erhalten. Die Monocyten-angereicherte E-negative Fraktion wurde von T-Lymphocyten mittels Standardrosettenbildung mit 2-Aminoethylisothio-uroniumbromidhydrobromid (Sigma)-behandelten roten Blutzellen vom Schaf und anschließender Lymphoprep-Sedimentation getrennt. Monocyten wurden weiter mit Hilfe der Kälteaggregationstechnik angereichert. Die Zellsuspension durfte mittels langsamen Rührens bei 4ºC verklumpen.
Zellklumpen wurden von den restlichen Zellen durch eine kurze Zentrifugation getrennt. Monocyten wurden in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS, nichtessentiellen Aminosäuren, 100 IE Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10 mM L-Glutamin und 2 mM Natriumpyruvat, kultiviert.

Reinigung der T-Zellen

Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) wurden von der Buffy-coat mittels Zentrifugation auf Lymphoprep (Nycomed) isoliert. T-Zellen wurden weiter mittels Flüssigkeitsentzug der Monocyten, B-Zellen und NK- Zellen unter Verwendung von Lympho-Kwik T (One Lambda, Los Angeles, CA) gemäß der Herstelleranleitung gereinigt.

Gemischte Lymphocyten-Kulturen

T-Zellen (10&sup5;/Vertiefung) wurden in rundbödigen Kulturplatten (Falcon 3072, Becton und Dickinson, Oxnard, CA) in Gegenwart von autologen oder allogenen Monocyten (10&sup5;/vertiefung) kultiviert. Nach 3 Tagen Kultivierung wurden die Zellen 16 Stunden mit 0,5 uCi [3H]Thymidin (spezifische Aktivität 5 Ci/Mol) gepulst, danach wurden die Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellernters geerntet. [3H]Thymidin-Einbau wurde mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Proliferation wurde dreifach ausgewertet. In Hemmexperimenten wurden die Monocyten mit mAk 84H10 (anti-ICAM-1, Immunotech, Marseille, Frankreich) oder 3.A9 in RPMI Komplettmedium 30 Minuten bei 4ºC vorinkubiert, bevor sie in rundbödige Platten mit 96 Vertiefungen verteilt wurden.

Ergebnisse

Monocyten sind wichtige Antigen-präsentierende Zellen für Antigenspezifische T-Zellaktivierung. Da das von dem 3.A9 mAk erkannte Antigen konstitutiv auf Monocyten exprimiert ist, haben wir uns die Frage gestellt, ob der 3.A9 Antikörper in der Lage ist, die von allogenen Monocyten induzierte Proliferation zu hemmen, wenn diese mit gereinigten T-Tellen cokultiviert sind. Monocyten (autologe oder allogene) und T-Zellen wurden gereinigt und wie oben beschrieben kultiviert. Monocyten wurden mit mAk 84H10 (anti- ICAM-1, Immunotech, Marseille, Frankreich) oder 3.A9 in komplettem RPMI 30 Minuten bei 4ºC vorkultiviert, bevor sie zu den Platten mit 96 Vertiefungen zur Cokultivierung mit T-Zellen gegeben wurden. Nach 3 Tagen Kultivierung wurden die Zellen 16 Stunden mit 0,5 uCi [3H]Thymidin gepulst, danach wurden die Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellernters geerntet. [3H]Thymidin-Einbau wurde mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Fig. 6 zeigt, dass T-Zellen für Proliferation in Gegenwart allogener Monocyten, aber nicht in Gegenwart autologer Monocyten stimuliert sind. Das Binden von mAk 3.A9 an sein Antigen ICAM-3, aber nicht der anti-ICAM-1 mAk 84H10 führte zu einer starken Hemmung der T-Zellaktivierung, was vermuten lässt, dass das Binden des von mAk 3.A9 erkannten Antigens an einen Liganden auf T-Zellen wichtig für deren Aktivierung ist. Dies bedeutet, dass mAk 3.A9 in vivo verwendet werden könnte, um eine Aktivierung von T- Zellen in klinischen Situationen zu verhindern, wo T-Zellaktivierung in der Krankheitsentstehung beteiligt ist. In einem weiteren Experiment wurde herausgefunden, dass mAk 3.A9 nicht nur an Monocyten band, sondern auch an dendritische Zellen, eine weitere Klasse Antigen-präsentierender Zellen, und dass ebenfalls eine von allogenen dendritschen Zellen induzierte T- Zellproliferation von mAk 3.A9 gehemmt werden kann.

Beispiel 8

OKM5 ist ein weiterer monoklonaler Antikörper, der auf THP-1 Schaumzellen hochreguliert ist
Wir haben eine ganze Reihe Antikörper mittels Durchflusscytometrie auf drei verschiedenen Populationen von THP-1 getestet: (a) Zellen in RPMI 10% FCS gewachsen (THP-1); (b) Zellen mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M PMA und 5 · 10&supmin;&sup7; M RA 24 Stunden aktiviert und weitere 48 Stunden unter Lipid-freien Bedingungen gewachsen (THP-1 + PMA/RA); und (c); Zellen mit einer Mischung aus 2 · 10&supmin;&sup7; M PMA und 5 · 10&supmin;&sup7; M RA 24 Stunden aktiviert und weitere 48 Stunden mit aggregiertem LDL gewachsen (THP-1 Schaum). Alle notwendigen Details der Experimente können den Beispielen 1 und 3 entnommen werden.
mAk OKMS (Coulter, Hialeah, FL) war einer von wenigen Marker, der ein verstärktes Binden auf THP-1 Schaumzellen im Vergleich zu THP-1 + PMA/RA zeigte (Fig. 7). Dieses Ergebnis liegt in guter Übereinstimmung mit in vitro Beobachtungen in der atherosklerotischen Plaque. In der Tat ergaben immunhistochemische Untersuchungen von von der Waal et al. (1992) die Anwesenheit von OKMS positiven Zellen im Plaque-Zentrum, was mit Lipid- Akkumulation und lysosomaler Aktivität korrelierte. mAk OKM5 ist in CD36 eingruppiert worden. Es ist offensichtlich, dass das CD36 Antigen als ein Rezeptor für extrazelluläre Matrixkomponenten wie beispielsweise Thrombospondin (Asch et al., 1987) und Collagen (Tandon et al., 1989) dient. Allerdings ist vor kurzem veröffentlicht worden, dass das CD36 Molekül ebenfalls als ein Makrophagen-Rezeptor für oxidiertes LDL fungiert (Endemann et al., 1993). Die Ergebnisse in diesem Beispiel unterstreichen folglich weiter die Ähnlichkeit unseres in vitro Schaumzellmodells mit der in vivo Situation atherosklerotischer Plaques. Tabelle 1: Cholesterol-Akkumulation in THP-1 und K-562 Zellen
GC: Gesamtcholesterol in ug/mg Protein
%CE: % Cholesterylester Tabelle 2
a) %positive Zellen ist folgendermaßen bestimmt: Ein Marker wird so gesetzt, dass bei Verwendung des 1.24 Negativkontroll mAk 3% der Zellen heller sind als der Marker. %positive Zellen mit mAk 3.A9 ist dann % heller als dieser Marker minus 3%.
b) Durchschnittliche Fluoreszenzintensität (auf einer vierdekadischen log-Skala) mit mAk 3.A9 und mit Isotyp-spezifischen Kontroll mAk erhalten sind angegeben.
c) mAk 1.24 ist gegen ein Kaninchen Leukocyten-Oberflächenantigen gerichtet (De Smet et al., 1983) und kreuzreagiert nicht mit humanen Zellen. Er wurde als Negativkontrolle in der Durchflusscytometrie verwendet.

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Claims

1. Ein monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung 3.A9F5E1 und unter der Nr. 93102638 am 26. Oktober 1993 bei der ECACC hinterlegt.

2. Ein Antikörper-Derivat abgeleitet von dem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1, ausgewählt von einem Antikörper-Fragment, einem humanisierten monoklonalen Antikörper, einem einkettigen Antikörper oder einem markierten monoklonalen Antikörper.

3. Eine Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 herstellt.

4. Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung als Medikament.

5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als eine aktive Substanz einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder dessen Derivat nach Anspruch 2.

6. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 oder dessen Derivats nach Anspruch 2 als Wirkstoff zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung irgendeiner der folgenden Erkrankungen: spezifische Entzündung als Reaktion auf einen Zustand aus der Gruppe bestehend aus: Hypersensibilitäts- Spätreaktion, ein Symptom bei Psoriasis, eine Autoimmunerkrankung, Abstoßung eines Organ-oder Gewebetransplanatats, z. B. Knochenmark- oder Nierentransplantat; unspezifische Entzündung als Reaktion auf einen Zustand aus der Gruppe bestehend aus: akutes Lungenversagen (ARDS), multiple Organschädigungssyndrome nach Sepsis, Trauma oder Hämorrhagie, Reperfusionsschädigung von myokardialem oder anderem Gewebe, akute Glomerulonephritis, reaktive Arthritis, Dermatosen mit akut entzündlichen Komponenten, akute eitrige Meningitis oder andere entzündlichen Störungen des zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall), thermische Schädigung, Hämodialyse, Leukopherese, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, nekrotisierende Enterokolitis, mit einer Granulozyten-Transfusion assoziierte Syndrome und Zytokin-induzierte Toxizität, Metastasierung von hämatopoetischen Tumorzellen, extravaskuläre Migratio von virusinfizierten Leukozyten, Asthma.

7. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 oder eines daraus abgeleiteten Derivats nach Anspruch 2 zur Herstellung eines diagnostischen oder in vivo bildgebenden Mittels.

8. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 oder eines daraus abgeleiteten Derivats nach Anspruch 2 zur Herstellung eines spezifischen diagnostischen oder in vivo bildgebenden Mittels bei Atherosklerose.