DE69409361T2

DE69409361T2 - Herstellung von liposomen und verfahren zur substanzverkapselung

Info

Publication number: DE69409361T2
Application number: DE69409361T
Authority: DE
Inventors: David Sammuel Collins
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 1998-11-12
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: EP0678017B1; DE69409361D1; CA2153251A1; ES2115343T3; CA2153251C; JPH08505882A; AU8127394A; US5567433A; AU683957B2; US6355267B1; WO1995012387A1; EP0678017A1; DK0678017T3; ATE164515T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Lipidpulver und Liposomen und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen zum Einkapseln von biologisch aktiven Materialien. Die Liposomen sind deshalb brauchbar z.B. für die Arzneimittelverabreichung in vivo und zur Gentherapie sowie als Diagnostika.
Liposomen sind mikroskopisch kleine Vesikel, im allgemeinen kugelförmig, die aus einem oder mehreren Lipidwänden gebildet werden. Die Wände werden hergestellt aus Lipidmolekülen, die dazu neigen, sowohl Doppelschichten zu bilden als auch ihre Oberfläche auf ein Mindestmaß einzuschränken. Die Lipidmoleküle, die ein Liposom bilden, haben hydrophile und lipophile Teile. Nach Kontakt mit Wasser bilden die Lipidmoleküle eine Doppelschichtmembran, in der die Lipidenden der Moleküle in jeder Schicht gegen das Zentrum der Membran gerichtet sind und die gegenüberliegenden polaren Enden die jeweiligen inneren und äußeren Oberflächen der Doppelschichtmembran bilden. Somit stellt jede Seite der Membran eine hydrophile Oberfläche dar, während das Innere der Membran ein lipophiles Medium umfaßt.
Liposomen können in mehrere Kategorien unterteilt werden aufgrund ihrer Gesamtgröße und der Art der lamellaren Struktur. Die Klassifikationen umfassen kleine unilamellare Vesikel (SUV), multilamellare Vesikel (MLV), große unilamellare Vesikel (LUV) und oligolamellare Vesikel. Die SUVs haben einen Durchmesser von etwa 20 bis 50 Nanometer und sie bestehen aus einer einzigen Lipiddoppeischicht, die ein wäßriges Kompartment umgibt. Ein Charakteristikum der SUVs ist, daß eine große Menge des gesamten Lipids, etwa 70%, in der äußeren Schicht der Doppelschicht angeordnet ist. Die häufigsten und leicht herzustellenden Liposomen sind die multilamellaren Vesikel. Während die SUVs Einzelkompartment-Vesikel einer ziemlich gleichmäßigen Größe sind, haben die MLVs stark schwankende Durchmesser bis zu etwa 30.000 Nanometer, und sie haben eine Multikompartment-Struktur, wobei die Liposom- Doppeischichten im allgemeinen organisisiert sind als geschlossene konzentrische Lamellen mit einer wäßrigen Schicht, die jede Lamelle von der nächsten trennt. Große unilamellare Vesikel werden deshalb so bezeichnet, weil sie einen Durchmesser von etwa 600 Nanometer bis 30 Mikron haben. Oligolamellare Vesikel sind Liposomen mittlerer Größe mit einem größeren wäßrigen Raum als MLVs und einem kleineren wäßrigen Raum als LUVS. Oligolamellare Vesikel haben mehr als ein internes Kompartment und möglicherweise mehrere konzentrische Lamellen, aber sie haben weniger Lamellen als MLVs.
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Liposomen bekannt, von denen mehrere in Liposome Technology, G. Gregoriadis, Herausgeber, drei Bände, CRC Press, Boca Raton 1984, oder von Lichtenberg und Barenholz in Methods of Biochemical Analysis, Bd. 33 (1988), 337-462, beschrieben worden sind. Liposomen sind bekannt zum Einkapseln von biologisch aktiven Materialien. Die Herstellungsverfahren, die insbesondere das Einkapseln von DNA durch Liposomen betreffen, und Verfahren, die eine direkte Anwendung auf Liposomen verrnittelte Transfektion haben, wurden von Hug und Sleight, in Biochimica and Biophysica Acta, Bd. 1097 (1991), 1-17, beschrieben.
Bei der Bildung von Liposomen werden das Lösungsmittel und gelöste Moleküle in ihrem Lumen eingefangen. Das eingekapselte Volumen oder das eingefangene Volumen hängt von der Größe der Liposomen, der Lipidzusammensetzung der Vesikel und der ionischen Zusammensetzung des Mediums ab. Die Fraktion des Lösungsmittels, die von Liposomen eingefangen wird, wird als Einkapselungs- oder Einfangwirkung bezeichnet und ist proportional sowohl zur Lipidkonzentration als auch zum Radius des Vesikeis. Die Fraktion des eingefangenen Gelösten innerhalb der Liposomen ist im allgemeinen direkt proportional zu der Fraktion des eingefangenen Lösungsmittels
Obwohl das Einkapseln von biologisch aktiven Materialien in Liposomen ein beträchtliches Potential zur Abgabe derartiger Materialien an Zielstellen im menschlichen Körper hat, ist die Herstellung von eingekapselten Materialien in technischem Ausmaß noch ein Problem. Damit Liposomen in breiterem Umfang für therapeutische Zwecke verwendet werden können, ist es erwünscht, daß das Herstellungsverfahren folgende Bedingungen erfüllt:
1) Es muß ein hohes Ausmaß an Einkapselung erzielt werden;
2) organisches Lösungsmittel oder grenzflächenaktive Verbindungen können vollständig aus dem Endprodukt abgetrennt werden oder ihre Verwendung kann vermieden werden;
3) das Endprodukt ist in einem einfachen Verfahren erhältlich;
4) die Herstellung kann in großem Maßstab durchgeführt werden;
5) die Stabilität der Liposomen unterstützt eine geeignete Lagerungszeit; und
6) während der Herstellung der Liposomen oder der Einkapselung wird das eingekapselte Material weder teilweise noch vollständig denaturiert oder inaktiviert.
Ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen mit einer wasserlöslichen, biologisch aktiven Verbindung unter Anwendung der Lyophilisation (Gefriertrocknung) ist in der US-PS 4,311,712 (Evans et al.) beschrieben. Die Verfasser stellen jedoch fest, daß ihre Verfahren nicht besonders geeignet sind für wäßrige lösliche Materialien. Darüber hinaus erfordert das beschriebene Herstellungsverfahren ein Gemisch des biologisch aktiven Materials mit einem organischen Lösungsmittel. Felgner et al. beschreiben in der EP-B-0 172 007 ebenfalls ein Verfahren, bei dem ein organisches Lösungsmittel einverleibt wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung organischer Lösungsmittel oder Detergentien bei der Bildung von Liposomen zu vermeiden, weil diese Substanzen schwierig abzutrennen sind, gesundheitsschädigend sind oder mit den einzukapselnden biologisch aktiven Molekülen ungünstig in Wechselwirkung treten.
Es ist auch bekannt, daß Liposomen und ihr Inhalt in wäßriger Dispersion verhältnismäßig instabil sind. Dementsprechend zielten mehrere Verfahren zur Herstellung von Liposomen darauf ab, die relativ kurze Lagerzeit bestimmter liposomaler Produkte durch Entwässerung der Dispersion zu erhöhen. Beispielsweise wird die wäßrige Dispersion von eingekapseltem Material unter Bildung eines stabilen Pulvers gefriergetrocknet, das dann über einen längeren Zeitraum gelagert werden kann und aus dem mit Hilfe eines wäßrigen Mediums wieder eine Liposomen-Dispersion hergestellt werden kann; vgl. Schneider et al., US-PS 4,229,360. In der US-PS 4,515,736 (D. Deamer) ist ebenfalls ein Einkapselungsverfahren beschrieben, bei dem Liposomen-Dispersionen in Gegenwart des einzukapselnden Materials getrocknet werden. Während die Lösung zu einem hochviskosen konzentrierten Gemisch getrocknet wird, verschmelzen die einzelnen Liposomen unter Bildung von multilamellaren Strukturen, die das einzukapselnde Material zwischen den Lipidlamellen einfangen. Nach Rehydratisierung entstehen Lipidvesikel, die das Material eingekapselt enthalten. Crowe et al. beschreiben in der US-PS 4,857,319 ein Verfahren zum Konservieren von Liposomen, bei dem ein Gemisch aus Lipidvesikel, dem einzukapselnden Material und einem Disaccharid als Konservierungsmittel gefriergetrocknet wird. Alle diese Verfahren erfordern, daß das biologisch aktive Material der Gefriertrocknung unterworfen wird.
Dem gegenüber ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Material einzukapseln, ohne jedoch das Material derartig drastischen Manipulationen, wie Gefriertrocknung, unterwerfen zu müssen, und deshalb die Möglichkeit der physikalischen Inaktivierung oder des Abbaus des einzukapselnden Materials zu vermindern.
Mayer et al. (US-PS 5,077,056) beschreiben ein Herstellungsverfahren für Liposomen, bei dem kleine Ionen verwendet werden, um Gradienten zu bilden, die die Retention der geladenen biologisch aktiven Verbindungen erhöhen und gegebenenfalls die Liposomen und biobgisch aktiven Substanzen einem Gefrier-Auftau-Verfahren während des Einkapselungsverfahrens zu unterwerfen. Dieses Verfahren, das von Mayer et al. in Biochimica Biophysica Acta, Bd. 817 (1985), 193-196 weiter beschrieben wurde, erzeugt Gefrier- und Auftau-multilamellare Vesikel (FATMLV). Die FATMLV-Methode erfordert, daß das Gefrieren und Auftauen in Gegenwart des einzufangenden Materials erfolgt. Es wurde zwar eine hohe Einfangrate von kleinen Ionen (²²Na&spplus; und Mg&spplus;&spplus;) mit der FATMLV-Methodik gezeigt, doch konnte keine Einkapselung von Makromolekülen erreicht werden.
Somit ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, zu vermeiden, daß das einzukapselnde Material solchen energischen physikalischen Manipulationen unterworfen wird und deshalb die Gefahr der Inaktivierung oder des Abbaus dieses Materials vermindert wird.
Es ist ferner eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein geeignetes Verfahren zur Einkapselung der verschiedensten biologisch aktiven Materialien bereitzustellen, einschließlich Nahrungsmittel oder Nährstoffe, sowie Arzneistoffe, DNA, RNA, mPNA, Nucleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Peptide und Enzyme.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das einfach ist, leicht durchführbar und nicht teuer ist zur großtechnischen Herstellung von Liposomen und eingekapselten Materialien.
Somit betrifft die Erfindung ein Lipidpulver, geeignet zur Bildung von Liposomen, erhältlich durch die Schritte:
a) Hydratisieren einer Lipidmenge in einer wäßrigen Lösung und Mischen, um eine Liposomen-Dispersion in Abwesenheit von organischem Lösungsmittel oder Detergent zu bilden,
b) Aussetzen der Liposomen-Dispersion einem oder mehreren Gefrier- und Auftau-Zyklen, und
c) Dehydratisieren der Liposomen-Dispersion, um ein Lipidpulver zu bilden, und gegebenenfalls
d) Pulverisieren des Lipidpulvers,
und das charakterisiert ist durch Dispergieren nach der Hydratisierung, wobei ein Gemisch unilamellarer und oligolamellarer Vesikel mit einer Größe von 400 bis 800 Nanometer gebildet wird.
Vorzugsweise ist das Lipid eine Kombination aus synthetischen und natürlichen Lipidmolekülen.
Vorzugsweise umfaßt das Lipidpulver zusätzlich ein Füllmittel, das vor dem Schritt c) zugesetzt wird.
Die Erfindung betriff weiterhin ein neues Verfahren zur Herstellung des Lipidpulvers. Das Verfahren umfaßt das Hydratisieren und Mischen einer Lipidmenge in einer wäßrigen Lösung unter Bildung einer Liposomen-Dispersion in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels oder Detergens; Aussetzen der Liposomen-Dispersion einem oder mehreren Gefrier- und Auftau-Zyklen; Dehydratisieren der Liposomen-Dispersion unter Bildung eines Lipidpulvers und gegebenenfalls Pulverisieren des Lipidpulvers durch Vermahlen.
Das Lipidpulver eignet sich sowohl zur längeren Lagerung und Wiederherstellung von Liposomen und zum Einkapseln von biologisch aktivem Material. Das Lipidpulver wird in Gegenwart des biologisch aktiven Materials hydratisiert, und dabei wird das Material in den rekonstituierten Liposomen eingekapselt. Das Verfahren kann auch den Schritt der Mikrofluidisierung der wiederhergestellten Liposomen und/oder den Schritt der Trennung von eingekapseltem biologisch aktiven Material von nicht eingekapseltem biologisch aktiven Material umfassen.
Das Lipid kann ein einziges oder eine Kombination synthetischer und natürlicher Lipidmoleküle sein. Außerdem kann das Verfahren die Kombination der Liposomen-Dispersion mit einem Füllmittel vor der Dehydratisierung und Bildung des Lipidpulvers umfassen. Das Gewichtsverhältnis von Füllmittel zu Lipid beträgt etwa 0,1:1 bis 2:1.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Einkapseln der verschiedensten biologisch aktiven Substanzen bzw. Materialien zur Verfügung. Dabei ist es nicht erforderlich, das einzukapselnde Material energischen physikalischen Manipulationen zu unterwerfen. Deshalb ist die Gefahr der Inaktivierung oder des Abbaus dieses Materials vermindert. Weiterhin wird die Verwendung organischer Lösungsmittel oder Detergentien zur Bildung der Liposomen vermieden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Verbesserung der Lipid-Hydratation nach Zugabe eines Füllmittels.
Figur 2 zeigt das SDS-Polyacrylamidgel- (SDS-PAGE) Wanderungsmuster von Liposomeneingekapseltem Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor.
Figur 3 zeigt die Abgabegeschwindigkeit von eingekapseltem Material in Serum.
Figur 4 zeigt die Abgabegeschwindigkeit von eingekapselten Calcein-Material in Serum bei Verwendung verschiedener Liposomenzusammensetzungen.
Figur 5 zeigt die in vivo-Abgabegeschwindigkeit von eingekapseltem Material.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das Interesse an Liposomen als Träger von Makromolekülen beruht auf ihrer Fähigkeit, verschiedenste Materialien (Substanzen) einzuschließen und zu schützen und diese Materialien, funktionell intakt und in ausreichender Menge, an eine größere Anzahl verschiedener Zelltypen abzugeben.
Der Ausdruck Liposom, wie er hier verwendet wird, umfaßt jede Lipid-Doppelschichtstruktur, die aus geschlossenen konzentrischen Lamellen besteht, die eines oder mehrere wasserhaltige Kompartimente einschließt. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung werden in der Regel aus Phospholipiden hergestellt, doch können auch andere Moleküle ähnlicher Gestalt und Dimensionen, die sowohl einen hydrophoben als auch einen hydrophilen Rest aufweisen, verwendet werden. Für die Zwecke der Erfindung werden alle diese geeigneten Liposomenbildenden Moleküle hier als Lipide bezeichnet. Zur Herstellung der Liposomen können eine oder mehrere natürlich vorkornmende und/oder synthetische Lipidverbindungen verwendet werden.
Liposomen können anionisch, kationisch oder neutral sein, je nach Wahl der hydrophilen Gruppe. Bei Verwendung z.B. einer Verbindung mit einer Phosphat- oder Sulfatgruppe sind die erhaltenen Liposomen anionisch. Bei Verwendung von Aminogruppen-enthaltenden Lipiden haben die Liposomen eine positive Ladung und sind deshalb kationische Liposomen.
Typische Beispiele für Phospholipide oder Lipidverbindungen zur Herstellung von Liposomen der Erfindung sind Phospholipid-verwandte Materialien, wie Phosphatidylcholin (Lecithin), Lysolecithin, Lysophosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Phosphatidylethanolamin (Cephalin), Cardiolipin, Phosphatidinsäure, Cerebroside, Dicetylphosphat, Phosphatidylcholin und Dipalmitoylphosphatidylglycerin. Weitere Phosphor-freie Lipide umfassen z.B. Stearylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, Acetylpalmitat, Glycerinricinoleat, Hexadecylstearat, Isopropylmyristat, amphotere Acrylpolymerisate, Fettsäuren, Fettsäureamide, Cholesterin, Cholesterinester, Diacylglycerin, Diacylglycerinsuccinat und dergleichen.
Erfindungsgemäß wird ein geeignetes Lipid oder eine Lipidkombination in einem wäßrigen Medium hydratisiert und nach irgendeiner geeigneten Methode gemischt, z.B. durch Ultraschallbehandlung oder Behandlung des Gemisches in einem Starmix. Es entstehen die anfänglichen Liposomen, z.B. eine Dispersion von unilamellaren Vesikeln. Die Lipsomen Dispersion wird in Abwesenheit irgendwelcher organischer Lösungsmittel oder Detergentien gebildet. Die Liposomen-Dispersion wird sodann einem oder mehreren Zyklen des Gefrierens und Auftauens unterworfen, um z.B. eine Suspension von multilamellaren Vesikeln zu bilden. Beispielsweise können zwei bis fünf Zyklen des Gefrierens und Auftauens zur Herstellung der Suspension verwendet werden. Nach den Gefrier- und Auftauzyklen wird die Liposomen Dispersion unter Bildung eines Lipidpulvers dehydratisiert. Das Lipidpulver kann weiter bearbeitet werden durch geeignetes Vermahlen oder Pulverisieren. Das erhaltene Lipidpulver ist besonders stabil und kann längere Zeit gelagert werden. Dies ermöglicht die Herstellung großer Mengen, die dann gegebenenfalls gelagert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Liposomen mit einem Füllmittel vor der Dehydratisierung vermischt und sodann das Lipidpulver hergestellt.
Zum Einkapseln von Material wird eine geeignete Menge des Lipidpulvers mit dem Material zusammengebracht. Das Lipidpulver wird nach irgendeiner geeigneten Methode hydratisiert und bildet ein Gemisch von unilamellaren und oligolamellaren Vesikeln einer Größe von 400- 800 nm. Beispielsweise wird die Kombination hydratisiert durch Behandeln des Gemisches in einer Rotovap-Apparatur oder durch Rühren des Gemisches unter vermindertem Druck. Das hydratisierte Lipid-Material-Gemisch wird sodann gegebenenfalls mikrofluidisiert, um das Lipid und das gelöste Material vollständig zu mischen und das gelöste Material einzukapseln. Sodann kann das Liposomen-eingekapselte biologisch aktive Material von restlichem nichteingekapseltem Material abgetrennt werden. Beispielsweise kann das Gemisch zentrifugiert oder gegen destilliertes Wasser oder gepufferte Kochsalzlösung unter Verwendung einer Dialysemembran dialysiert werden.
Wie vorstehend beschrieben, liefert das erfindungsgemäße Verfahren ein Gemisch von unilamellaren und oligolamellaren Vesikeln. Der Nachweis, daß ein Gemisch von Vesikeln erzeugt wird, beruht auf einem Vergleich des tatsächlich eingefangenen Volumens (ml Gelöstes pro mmol Lipid) mit dem theoretisch eingefangenen Volumen (berechnet aus dem durchschnittlichen Durchmesser der Liposomen und der Lipidkonzentration). Da das eingefangene Volumen immer etwas geringer ist als das theoretische Volumen, muß der interne wäßrige Raum der Liposomen kleiner sein, als er für ein unilamellares Liposom des gleichen Durchmessers zu erwarten ist. Deshalb muß mindestens ein Teil der Liposomen eine oder mehrere Lipid- Doppelschichten enthalten.
Eine wichtige Stufe bei der Bildung von Liposomen ist die Lipid-Hydratation. Die kombinierten Stufen der vorliegenden Erfindung fördern eine vollständige Hydratisierung des Lipids und somit ein vollständiges Kontaktieren des Lipids mit der wäßrigen Phase, die das einzufangende Material (Solut) enthält. Das hohe Ausmaß an Hydratation führt zu einem außergewöhnlich starken Einfangen der wäßrigen Phase. Gefrier-Auftau-Zyklen werden zusammen mit einem geeigneten Mischverfahren verwendet, um das Lipid mit der wäßrigen Phase zu mischen und die Lipid-Kopfgruppen der wäßrigen Phase vollständig auszusetzen. Die vorste hend beschriebene FATMLV-Methode liefert sowohl multilamellare als auch multivesikulare Liposomen mit Einfangvolumina im Bereich von 1-6 ul/umol Lipid. Demgegenüber werden im erfindungsgemäßen Verfahren unilamellare und oligolamellare Liposomen mit Einfangvolumina im Bereich von 20-30 ul/umol Lipid gebildet.
Die Zugabe eines Füllmittels vor der Dehydratisierung der Liposomendispersion erreicht zwei wichtige Aspekte der Liposomen-Produktion, nämlich leichte Handhabung und rasche Dispergierung. Die Verwendung des Füllmittels führt zur Bildung eines flockigen Pulvers nach der Dehydratisierung der Liposomen-Dispersion. Das erhaltene Lipidpulver ist wesentlich leichter handzuhaben als das wachsartige Pulver, das in Abwesenheit eines Füllmittels gebildet wird. Es wurde auch gefünden, daß das Füllmittel die Dispergierung des Lipids in getrocknetem Zustand verbessert. Diese Eigenschaft vermindert die Neigung des Lipids, bei der Hydratation zu aggregieren und erhöht den Kontakt der wäßrigen Phase mit den Lipid- Kopfgruppen, wodurch sowohl die Hydratation als auch das Einfangen des Soluts verbessert wird.
Beispiele für geeignete Füllmittel im erfindungsgemäßen Verfahren sind Mannit, Sorbit, Lactose, Glucose, Succrose, Trehalose, Glycin, Arginin, Gelatine, Hydroxyethylstärke, Albumin und Xylit. Es können auch andere Materialien verwendet werden, wenn ihr Zusatz zur Bildung eines Lipidpulvers führt, das leicht abzuwiegen und handzuhaben ist und das verbesserte Dispersionscharakteristika aufweist. Das Gewichtsverhältnis von Füllmittel zu Lipid beträgt vorzugsweise etwa 0,1:1 bis 2:1. Besonders bevorzugt ist ein Gewichtsverhältnis von etwa 1:1. Das Gewichtsverhältnis wird so eingestellt, daß die Stabilität der Liposomen verbessert wird. Zum Beispiel wird das Mengenverhältnis so eingestellt, daß das Innere der Liposomen nicht hyperosmotisch ist gegenüber der äußeren Flüssigkeit, wie Serum.
Die Mikrofluidisierung der erfindungsgemäß hergestellten Liposomen verbessert die Liposomen-Herstellung in größerem Maßstab. Der Mikrofluidizer (Microfluidics Corporation) verwendet eine Wechselwirkungskammer mit einer festen Geometrie. Deshalb ist die Geometrie des Flusses durch die Kammer konstant, solange der Druck konstant ist. Der Hersteller garantiert eine Produktionsvergrößerung ("linearly"), die einzige Beschränkung ist die Größe des Pumpsystems.
Die Abtrennung von restlichem nicht-eingekapseltem Material von dem Liposomen-eingekapselten Material kann erwünscht sein, je nach dem Material und dem Verwendungszweck. Sofern eine Abtrennung zweckmäßig ist, kann jedes geeignete Abtrennverfahren verwendet werden. Beispielsweise können die Zusammensetzungen durch Zentritugation, Dialyse, Säulenchromatographie oder tangentiale Strömungsfiltration getrennt werden. Die Verwendung der Dialyse zur Abtrennung von nicht-eingekapseltem Material ist ein mildes Verfahren, das nicht zu einem Lecken der Liposomen führt und leicht für großtechnische Zwecke verwendet werden kann.
Es ist ersichtlich, daß das einzelne Mischen, die Dehydratation, die Größenbildung und die Abtrennungsmethoden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedes geeignete Verfahren umfassen können. Das Gefriertrocknungsverfahren ist zwar ein geeignetes Verfahren zur Dehydratation, doch eignen sich auch andere Verfahren, wie Vakuumtrocknen, Sprühtrocknen und Trocknen im Stickstoffstrom. Deshalb sind die speziellen Methoden, die nachstehend hier beschrieben sind, für die einzelnen Schritte in den folgenden Beispielen keine kritischen Bedingungen für das erfindungsgemäße Verfahren.
Die wesentlichen Vorteile der erfindungsgemäßen Verkapselungsmethode im Vergleich zu anderen Verfahren sind ihre milden Bedingungen und ihre Einfachheit. Die Erfindung ermöglicht nicht nur eine hohe Einfangrate, sondern ist auch sehr milde und führt zu keiner nachweisbaren Aggregation oder Abbau der einzükapselnden Materialien. Das Verfahren wird deshalb vorteilhaft verwendet zum Einkapseln von biologisch aktiven Materialien, die empfindlich sind gegenüber einem oder mehreren der Manipulationen für die herkömmliche Liposomenherstellung und Einkapselungsverfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit Erfolg zum Einkapseln von Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), Konsensus-Interferon (IFN), Schweinewachstumshormon (pGH) und Antisense-Oligonucleotiden verwendet. Es wurde eine Einkapselung von bis zu 80-90% G-CSF und IFN erreicht. Bei Ohgonudeotiden wurde eine Einkapselung von mindestens 40% erreicht. Die Erfindung ist geeignet zum Einkapseln von Cytokinen der allgemeinen Struktur, wie sie von Hill et al., PNAS Bd. 90 (1993), 5167-5171, beschrieben sind. Diese Cytokine sind beispielsweise GM- CSF, M-CSF, HGH, PGH und IL-2, bei denen es sich um relativ instabile Proteine handelt, insbesondere G-CSF und PGH. Das erfindungsgemäße Verfahren ist so milde, daß diese Materialien ohne Abbau eingekapselt werden können.
Einzigartig für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Kombination der Bildung einer Lipo somen-Dispersion, Aussetzen der Liposomen-Dispersion einem oder mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen und anschließender Dehydratation, Durchführung dieser Schritte ohne Kombination des einzukapselnden Materials mit der Liposomen-Dispersion. Somit werden erfindungsgemaß Liposomen hergestellt, ihre Volumina werden maximiert und es wird ein lagerfähiges Lipidpulver erzeugt für die spätere Rekonstitution und das Einkapseln des gewünschten Materials. Bisher war es nicht bekannt, daß die Vorteile der Geffler-Auftau-Zyklen nicht die Dehydratation der Liposomen-Dispersion sowie die anschließende Hydratation des Lipidpulvers mit dem biologisch aktiven Material beeinträchtigen. Auch wurde nicht erkannt, daß die vereinigten Stufen, in bevorzugter Reihenfolge, in Abwesenheit des einzukapselnden Materials durchgeführt werden können. Außerdem besteht keine Notwendigkeit der Verwendung eines organischen Lösungsmittels oder anderer chemischer Manipulationen, bei denen ein Abbau oder eine Zerstörung des einzukapselnden Materials erfolgen könnte. Weiterhin wird ein labiles Material, wie biologisch aktives Material, nicht den extremen physikalischen Manipulationen unterworfen, die bei der Bildung des Lipidpulvers auftreten.
Die Erfindung hat mehrere zusätzliche Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Einkapselungsverfahren und verschiedene unerwartete Ergebnisse. Ein Problem bei den bekannten Liposomen-Herstellungsverfahren ist die Schwankung von Ansatz zu Ansatz. Im erfindungsgemäßen Verfahren können getrocknete Lipidpulver im voraus in großen Ansätzen hergestellt und gelagert werden, z.B. unter Stickstoff bei -20ºC, bis sie verwendet werden. Überraschenderweise führt das Verfahren auch zur Bildung von großen Liposomen, die eine große Menge an wäßriger Phase einfangen können und dies ohne das eingekapselte Material extremen Manipulationen, z.B. Ultraschallbehandlung, oder organischen Lösungsmitteln auszusetzen. Die erzeugten Liposomen sind größer als die, die nach herkömmlichen Verfahren erzeugt werden, z.B. wie in der US-PS 4,735,788 beschrieben, und deshalb haben die Liposomen ein größeres wasserhaltiges Kompartiment und eine höhere Einfangleistung. Es war auch unerwartet, daß die Dehydratation der erhaltenen Liposomen-Dispersion unter Bildung eines Lipidpulvers und die spätere Rekonstitution der Liposomen aus diesem Lipidpulver Liposomen mit verbesserter Einkapselungsleistung erzeugt. Dies wird auch in den nachstehenden Beispielen gezeigt.
Die erfindungsgemäß hergestellten Liposomen haben auch eine hohe Stabilität, z.B. niedriges Austreten des eingefangenen Inhalts, und sie eignen sich als Depots mit verzögerter Abgabe zur in vivo-Abgabe von biologisch aktiven Materialien. Biologisch aktive Materialien, die erfindungsgemäß eingekapselt sind, zeigen nach subkutaner Injektion eine langsame Abgabe aus den Liposomen über mehrere Tage.

BEISPIELE

Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet:
conIFN: menschliches Konsensus-Interferon
GM-CSF: rekombinant menschlicher Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
pGH: Schweinewachstumshormon
rhG-CSF: rekombinant menschlicher Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
CHOL: Cholesterin
DM: Dimyristoyl (di-14:0)
DP: Dipalmitoyl (di-16:0)
DS: Distearoyl (di-1 8:0)
PC: Phosphatidylcholin
PE: Phosphatidylethanolamin
PG: Phosphatidylglycerin

Beispiel 1

Vergleich von vier Methoden zur Einkapselung

Die folgende Analyse untersuchte die Ergebnisse herkömmlicher Verfahren zur Herstellung von Liposomen und Einkapselung (Methode 1 und 2) im Vergleich zu den Methoden der vorliegenden Erfindung (Methode 3 und 4). Das biologisch aktive Material war rhG-CSF.

Methode 1:

Chloroformlösungen von DMPG, DSPC und CHOL wurden in einem Molverhältnis von 1:4:5 vereint. Das Lipidgemisch wurde unter Stickstoff bei Normaldruck getrocknet und eine weitere Stunde unter vermindertem Druck entwässert. Es bildet sich ein Lipidfilm. Die Gesamtmenge an Lipid betrug 300 umol. Sodann wurde das Lipid 1 Stunde in rhG- CSF (10 ml einer 4 mg/ml in verdünnter HC1, pH 4,5) bei einer Temperatur oberhalb der Kettenschmelztemperatur (Tm) von DSPC (60ºC) hydratisiert. Die Proben wurden sodann bei 10.000 psi unter Verwendung einer Microfluidics-Apparatur Modell HOS (Microfluidics Corporation, Newton, MA 02164) 10 Zyklen mikrofluidisiert. Nicht-eingekapseltes G-CSF wurde von den entstandenen Liposomen durch Sedimentation der Liposomen bei 100.000 g in einer Beckman-Ultrazentrifuge sedimentiert. Die Menge an eingekapseltem G-CSF wurde mit dem BCA-Proteintest (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) bestimmt.

Methode 2:

Chloroformlösungen der Lipide wurden vereinigt, getrocknet und gemäß Methode 1 unter vermindertem Druck getrocknet. Der Lipidfilm wurde in destilliertem Wasser (10 ml, 60ºC) hydratisiert und bei einer Lipidkonzentration von 30 inmol 10 Minuten in einem Bad- Typ Sonicator (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) mit Ultraschall behandelt. Sodann wurde das hydratisierte Lipid gefriergetrocknet und hierauf in einem Mörser mit Pistill vermahlen. Das vermahlene Lipid wurde in G-CSF hydratisiert und mikrofluidisiert gemäß Beispiel 1. Die Abtrennung von nicht-eingekapseltem G-CSF vom eingekapselten G-CSF wurde durch Dialyse der Proben gegen Wasser (16 1) mit einer Dialysemembran mit einer Trenngrenze von 100.000 Molekulargewicht erreicht. Eingekapseltes G-CSF wurde nach dem BCA-Proteintest gemäß Methode 1 bestimmt.

Methode 3:

Lipidfilme, hergestellt gemäß Methode 1, wurden in Wasser hydratisiert und mit Ultraschall behandelt. Die erhaltenen Dispersionen wurden sodann 3-5 Zyklen von Gefrieren (Trockeneis/Aceton) und Auftauen (37ºC) unterworfen. Sodann wurden die Dispersionen gefriergetrocknet und gemäß Methode 2 vermahlen. Das Lipidpulver wurde anschließend in G-CSF hydratisiert und das Liposomen-eingekapselte Material wurde gemäß Methode 1 mikrofluidisiert. Nicht-eingekapseltes G-CSF wurde vom eingekapselten G-CSF gemäß Methode 2 abgetrennt.

Methode 4:

Gemäß Methode 3 wurden die Lipidproben hergestellt, mit Ultraschall behandelt und den Gefrier-Auftau-Zyklen unterworfen. Vor dem Dehydratisieren wurde als Füllmittel Mannit dem Lipid in einem Gewichtsverhältnis von 1:1 zugesetzt. Die Proben wurden gefriergetrocknet und rehydratisiert gemäß Methode 3. Die Hydratation und Mikrofluidisierung wurde gemäß Methode 1 durchgeführt. Die Proben wurden sodann gemäß Methode 2 dialysiert.
Die Ergebnisse der verschiedenen Herstellungsverfahren sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Werte zeigen die physikalischen Charakteristika der gelagerten Pulver sowie die Einfangwirkung und das Einfangvolumen der erzeugten Liposomen. Tabelle 1 Einkapselung von rhG-CSF
Methode 4 wurde für eine Vielzahl anderer biologisch aktiver Materialien angewandt, um die Eignung der Liposomen-Herstellung und Einkapselungsmethode zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß erfindungsgemäß ein Liposomen- Präparat hergestellt werden kann, das eine sehr hohe Einkapselungsrate erreicht. Tabelle 2 Einkapselung verschiedener therapeutischer Proteine und Oligonucleotide gemäß Methode 4

Beispiel 2

Zusatz eines Füllmittels zur Erhöhung der Lipid-Hydratation und der Einfangrate

Methode 3 und Methode 4 wurden verglichen im Hinblick auf Lipid-Hydratation, eine kritische Phase bei der Lipid-Herstellung, und Einfang von Material. Proben von DMPG:DSPC:CHOL (Molverhältnis 1:4:5) wurden auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt, und ein Füllmittel, z.B. D-Mannit, wurde einigen Proben in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 zugegeben. Die Proben wurden dehydratisiert und sodann wie vorstehend beschrieben in G-CSF rehydratisiert. Die Hydratisierung wurde bei 37ºC bei einer Lipid-Konzentration von 30 mmol während der in Figur 1 angegebenen Zeiten durchgefülrrt. Aliquots der Liposomen-Suspensionen wurden auf Lipidgehalt nach dem Phosphat-Test (Bartlett et al., J. Biol. Chem., Bd. 234 (1959), 466-468, bestimmt.
Figur 1 zeigt die prozentuale Wiedergewinnung von Material mit und ohne die Zugabe eines Füllmittels. Der Zusatz des Füllmiffels verbesserte die Lipid-Hydratation und die Bildung von Liposomen. Durch Verbesserung der Lipid-Hydratation können größere Mengen an Liposomen in einem gegebenen Volumen gebildet werden und es wird eine größere Menge der wäßrigen Phase eingefangen.

Beispiel 3

Stabilität des eingekapselten Materials

In diesem Beispiel wird erläutert, daß das erfindungsgemäße Verfahren keine Aggregation oder Abbau von eingekapselten Materialien, selbst bei sehr empfindlichen Materialien bei physikalischen und chemischen Manipulationen, bewirkt.
G-CSF, entweder allein oder eingekapselt in DMPG:DSPC:CHOL (Molverhältnis 1:4:5) Liposomen wurde auf einem 10-20% SDS-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen (Reihen 4 und 5) und reduzierenden Bedingungen (Reihen 1 und 2) laufengelassen. 50 ng G- CSF wurden pro Reihe laufengelassen. Das Protein wurde durch Silberfärbung nachgewiesen. Die Ergebnisse der SDS-PAGE des eingekapselten G-CSFS sind in Figur 2 erläutert. (Reihen 1 und 5: G-CSF. Reihen 2 und 4: Liposomen-eingekapseltes G-CSF. Reihe 3: Molekulargewicht-Marker.) Die Ergebnisse zeigen, daß die Liposomen-Einkapselung nicht zu einer Aggregation des eingekapselten Materials führt. Außerdem ist das Verfahren milde und führt zu keiner nachweisbaren Zerstörung oder Wirkungsverlust des biologisch aktiven Materials.

Beispiel 4

Reverse Phase HPLC von eingekapseltem G-CSF

Gemäß Methode 4 eingekapseltes biologisch aktives Material wurde auch der Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unterworfen, um festzustellen, ob die Liposomen-Einkapselungen zu Strukturänderungen im eingekapselten Material führte. Beispielsweise wurde G-CSF allein oder eingekapselt in DMPG:DSPC:CHOL (Molverhältnis 1:4:5) Liposomen durch C4 Reverse-Phase-HPLC unter folgenden Bedingungen untersucht:
Säule: C-4 Kieselsäure
Puffer A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Puffer B: 0,1% Trifluoressigsäure in 90% Acetonitril
Gradient: 0-90% B in 60 Minuten
Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/Minute
Nachweis: 220 Nanometer
30 Microgramm G-CSF wurden pro Test aufgegeben. Liposomen wurden in 40% Methanol 30 Minuten bei 37ºC vor der Chromatographie lysiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Diese Tabelle zeigt, daß das aus den Liposomen freigesetzte G-CSF strukturell identisch ist mit G-CSF, das nicht eingekapselt wurde. Während Proteinfragmente und Aggregate leicht nachweisbar sind bei HPLC als einzelne Peaks, bilden das Kontroll-G-CSF und das aus den lysierten Liposomen freigesetzte G-CSF nahezu identische Peaks. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei der Einkapselung keine Zerstörung oder Aggregation von G-CSF erfolgt. Tabelle 3 Reverse Phase-Chromatographie von Liposomen-eingekapseltem G-CSF

Beispiel 5

Verzögerte Abgabe von eingekapseltem Material

Gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellte Liposomen zeigen eine langsame Abgabe des eingekapselten Materials. Verzögerte Abgabe von eingekapseltem Material wurde in Serum und in vivo nach subkutaner Injektion gefünden.

Calcein-Abgabe:

Liposomen (DPPC; DMPG:DSPC:CHOL; DSPC:CHOL) wurden mit Calcein im wesentlichen gemäß Methode 4 hergestellt. Calcein ist ein selbstlöschender Fluoreszenzfarbstoff (Molekulargewicht 622). Die Liposomen wurden in 80% menschlichem Serum verdünnt und bei 37ºC inkubiert. Die Lipid-Endkonzentration bei der Inkubation betrug 6 mM. Bei den angegebenen Zeiten wurden Aliquots der Proben entnommen und auf 12 uM (1:500) oder weniger verdünnt. Fluoreszenz wurde vor (F) und nach (FT) Zugabe von Triton X- 100 zu einer Endkonzentration von 1% bestimmt. Die prozentuale Abgabe wurde wie folgt berechnet: % Abgabe = 100 (F-FO/FT-Fo), wobei Fo die Fluoreszenz bei der Zeit (oder kein Serum) ist.
Figur 3 zeigt die Abgabe von Calcein in 80% Serum bei 37ºC. Die Ergebnisse zeigen, daß Liposomen mit langsamen Abgabe-Charakteristika erfindungsgemäß hergestellt werden. Liposomen mit diesen Charakteristika eignen sich zur verzögerten Wirkstoffabgabe von biologisch aktiven Materialien in vivo.
Verschiedene Liposomenzusammensetzungen wurden auch auf das Lecken oder die Abgabe von eingekapseltem Material untersucht. Figur 4 zeigt die unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Abgabe (Abgabe von Calcein in vitro) bei unterschiedlichen Lipid-Zusammensetzungen bei der Herstellung der Liposomen der Erfindung.

In vivo-Abgabe:

Liposomen aus entweder DPPC oder DMPG:DSPC:CHOL; (Molverhältnis 1:4:5) wurden im wesentlichen gemäß Methode 4 hergestellt und enthielten entweder ¹²&sup5;I Tyraminylinulin (bei einer spezifischen Endaktivität von 0,4 x 10&sup6; dpm/ml) oder ¹²&sup5;I-rhg CSF (bei einer spezifischen Endaktivität von 1 x 10 dpm/ml); vgl. ¹²&sup5;I-markiertes Inulin: A convenient marker for deposition of liposome contents in vivo. Sommerman, E.F., Pritchard, pH und Cullis, P.R., Biochem. Biophys. Res. Commerc., Bd. 122(1) (1984), 319-324. Die Lipid-Endzusammensetzung betrug 30 mM. Sprague-Dawley (S.D.)-Ratten wurden subkutan die Lipid-Zusammensetzungen (0,5 ml) injiziert, die in Figur 5 angegeben sind. Die Injektionsstelle wurde markiert. Bei verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden die Ratten geopfert und die Injektionsstelle reseziert und auf restliches 1251 untersucht. Die prozentuale Abgabe wurde wie folgt berechnet: % Abgabe = 100 (1-DPMt/DPMo), wobei DPMt der dpm- Wert an der Stelle zur Zeit t und DPM&sub0; der anfängliche injizierte dpm-Wert (t=0) ist.
Figur 5 zeigt die in vivo-Ab gabe von rhG-CSF und Inulin nach subkutaner Injektion dieser Liposomen-eingekapselten Materialien in Rallen. DPPC-Liposomen ergaben eine ziemlich rasche Abgabe in vivo im Vergleich zu DMPG:DSPC:CHOL, das eine langsamere Abgabe- Kinetik zeigte. Bei beiden Liposomen-Zusammensetzungen zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Abgabe von Inulin oder G-CSF aus den Liposomen.
Der Fachmann ersieht, daß eine Vielzahl von pharmazeutisch verträglichen Trägern verwendet werden kann, um die Verabfolgung der Liposomen zu erleichtern. Die Auswahl eines geeigneten Trägers hängt auch ab vom Verabfolgungsweg.

Claims

1. Ein Lipidpulver, geeignet zur Bildung von Liposomen, erhältlich durch die Schritte

a) Hydratisieren einer Lipidmenge in einer wäßrigen Lösung und Mischen, um eine Liposomen-Dispersion in Abwesenheit von organischem Lösungsmittel oder Detergent zu bilden,

b) Aussetzen der Liposomen-Dispersion einem oder mehreren Gefrier- und Auftau- Zyklen, und

c) Dehydratisieren der Liposomen-Dispersion, um ein Lipidpulver zu bilden, und gegebenenfalls

d) Pulverisieren des Lipidpulvers,

und das charakterisiert ist durch Dispergieren nach der Hydratisierung, wobei ein Gemisch unilamellarer und oligolamellarer Vesikel mit der Größe von 400 bis 800 nm gebildet wird.

2. Lipidpulver nach Anspruch 1, wobei das Lipid eine Kombination aus synthetischen und natürlichen Lipidmolekülen ist.

3. Lipidpulver nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend ein Füllmittel, Zugesetzt vor Schritt c).

4. Ein Verfahren zur Herstellung des Lipidpulvers nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

b) Aussetzen der Liposomen-Dispersion einem oder mehreren Gefrier- und Auftau- Zyklen,

d) Pulverisieren des Lipidpulvers.

5. Verfahren nach Anspruch 4, weiter umfassend das Kombinieren der Liposomen- Dispersion mit einem Füllstoff vor der Dehydratisierung und Bildung des Lipidpulvers.

6. Ein Liposomen-eingeschlossenes biologisches aktives Material mit keiner erkennbaren Aggregation oder Degradation, erhältlich durch Hydratisieren eines Lipidpulvers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Gegenwart eines biologisch aktiven Materials.

7. Verfahren zur Herstellung von Liposomen und Einschließen eines biologisch aktiven Materials darin nach Anspruch 6, umfassend den Schritt der Hydratisierung eines Lipidpulvers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, um wiederhergestellte Liposomen in Gegenwart eines biologisch aktiven Materials zu bilden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend den Schritt der Mikrofluidisierung der wiederhergestellten Liposomen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend den Schritt der Trennung von eingeschlossenem biologisch aktiven Material von nicht-eingeschlossenem biologisch aktiven Material.

10. Verfahren zum Herstellen von Liposomen und Einschließen eines biologisch aktiven Materials darin, umfassend die Schritte:

a) Herstellen einer Dispersion von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) durch Badbeschallung eines Lipids in Anwesenheit von einem wäßrigen Lösungsmittel in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels oder Detergens,

b) Unterziehen der SUVs einem oder mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen, um eine Suspension von multilamellaren Vesikeln (MLV) zu bilden,

c) Kombinieren der MLV-Suspension mit einem Füllmittel, wobei das Gewichtsverhältnis des Lipids:Füllmittel von 0,1:1 bis 2:1 reicht,

d) Gefriertrocknen des Gemisches aus MLV und Fülimittel, um ein Lipidpulver zu bilden,

e) Hydratisieren des Lipidpulvers in einem Solut, so daß dieser eingeschlossen wird, und Mikrofluidisierung des hydratisierten Lipids, wobei das Solut in wiederhergestellten Liposomen eingeschlossen wird, und

f) Abtrennen des nicht-eingeschlossenen Soluts von den Liposomen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das hydratisierte Lipidpulver in 10 Zyklen bei etwa 700 kg/cm (10.000 psi) mikrofluidisiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das nicht-eingeschlossene Solut von den Liposomen durch Dialyse unter Verwendung einer Dialysemembran mit mindestens 100.000 MW Ausschlußgrenze gegen ein geeignetes wäßriges Lösungsmittel abgetrennt wird.