DE69400385T2 - Purified heparin fractions, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft gereinigte Heparin-Fraktionen und genauer Heparin-Fraktionen, die frei von Gruppen N-NQ sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel, die sie enthalten.The present invention relates to purified heparin fractions and more particularly to heparin fractions free from N-NQ groups, a process for their preparation and medicinal products containing them.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Heparin- Fraktionen, die durch Nitrit-Depolyrnerisation erhalten wurden und die praktisch keine Nitroso-Verbindungen enthalten.The present invention relates in particular to heparin fractions obtained by nitrite depolymerization and which contain practically no nitroso compounds.
Es ist bekannt, daß Heparin-Fraktionen durch Nitrit-Depolymerisation erhalten werden, wie dies beispielsweise in den Patentanmeldungen EP-A-0 014 184 und EP-A-0 027 089 beschrieben wird. Verschiedene Heparin-Fraktionen, die durch Nitrit-Depolymerisation hergestellt wurden, sind Wirkstoffe in Arzneimitteln, die allgemein unter der Bezeichnung "Heparine mit niedrigem Molekulargewicht" oder "Heparine mit geringer Molekülmasse" allgemein verwendet werden. Bezüglich Einzelheiten zu Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht, die als Arzneimittel verwendet werden, ihrer quantitativen Bestimmung und ihrem als Verhältnis Sulfatgruppen/Carboxylgruppen ausgedrückten Sulfatierungsgrad kann auf die Veröffentlichung "Héparines de faible masse moleculaire", Pharmeuropa 3 Nr. 3, Oktober 1991, S. 161-165, sowie auf die für das Europäische Arzneibuch (Pharmacopoea Europaea) vorgeschlagene Monographie "Heparina massae molecularis minoris", Februar 1993 (PA/PH/Exp. 3T (92) 93), verwiesen werden. So hergestellte und als Wirkstoffe in Arzneimitteln verwendete Heparine mit niedrigem Molekulargewicht werden in den unter den Nummern FR-A-2478646, EP-A-0037319, EP-A-0076279 und EP-A-0181259 veröffentlichten Patentanmeldungen oder Patenten beschrieben. Sie sind unter den internationalen Freinamen (INN) Nadroparin-Calcium, Dalteparin-Natrium und Reviparin-Natrium bekannt und stellen Wirkstoffe von im Handel befindlichen oder potentiellen Spezialitäten dar. Insbesondere Reviparin-Natrium bildet den Wirkstoff der in Deutschland im Handel befindlichen Spezialität CLIVARIN . Weitere Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die durch Nitrit-Depolymerisation erhalten wurden, liegen ferner in Spezialitäten vor, die der Ärzteschaft in Deutschland (MONO-EMBOLEX NM), in Österreich (SANDOPARIN und TROPARIN ) und in der Schweiz (SAN- DOPARINE ) zur verfügung stehen.It is known that heparin fractions are obtained by nitrite depolymerization, as described, for example, in patent applications EP-A-0 014 184 and EP-A-0 027 089. Various heparin fractions prepared by nitrite depolymerization are active ingredients in pharmaceutical compositions generally used under the name "low molecular weight heparins" or "low molecular mass heparins". For details of low molecular weight heparins used as medicinal products, their quantitative determination and their degree of sulphation expressed as a sulphate group/carboxyl group ratio, reference may be made to the publication 'Héparines de faible masse moleculaire', Pharmeuropa 3 No 3, October 1991, pp. 161 to 165, and to the monograph proposed for the European Pharmacopoeia (Pharmacopoea Europaea) 'Heparina massae molecularis minoris', February 1993 (PA/PH/Exp. 3T (92) 93). Low molecular weight heparins thus prepared and used as active ingredients in medicinal products are listed in the documents referred to under the numbers FR-A-2478646, EP-A-0037319, EP-A-0076279 and EP-A-0181259. They are known under the international nonproprietary names (INN) nadroparin calcium, dalteparin sodium and reviparin sodium and are active ingredients of commercially available or potential specialties. Reviparin sodium in particular is the active ingredient of the specialty CLIVARIN which is commercially available in Germany. Other low molecular weight heparins obtained by nitrite depolymerization are also available in specialties which are available to doctors in Germany (MONO-EMBOLEX NM), Austria (SANDOPARIN and TROPARIN) and Switzerland (SANDOPARINE).
Das Verfahren zur Nitrit-Depolymerisation umfaßt die Bildung von nichtflüchtigen Nitroso-Verbindungen (im folgenden auch als N-NO-Verbindungen oder einfach als N-NO bezeichnet) durch die Addition einer Gruppe -NO an im Heparin oder seinen Fraktionen oder Fragmenten vorliegenden nitrosierbaren Bestandteilen. Obwohl die Menge der in den Heparin- Fraktionen vorliegenden Nitroso-Verbindungen sehr gering ist und sich nicht nachteilig auf ihre Verwendung als Arzneimittel auswirkt, da es sich um nichtflüchtige Verbindungen handelt, umfaßt die Herstellung dieser Produkte in industriellem Maßstab die Handhabung großer Mengen an Pulvern. Ihre gesamte oder praktisch gesamte Vermeidung kann daher nützlich erscheinen, um die Eigenschaften der Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die als Wirkstoffe in pharmazeutischen Spezialitäten verwendet werden, zu vervollkommnen.The nitrite depolymerization process involves the formation of non-volatile nitroso compounds (hereinafter also referred to as N-NO compounds or simply N-NO) by the addition of a -NO group to nitrosatable components present in heparin or its fractions or fragments. Although the amount of nitroso compounds present in heparin fractions is very small and does not affect their use as medicinal products, since they are non-volatile compounds, the manufacture of these products on an industrial scale involves the handling of large quantities of powders. Their total or practically total avoidance may therefore appear useful in order to perfect the properties of low molecular weight heparins used as active ingredients in pharmaceutical specialties.
Bei den Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht, deren mittlere Molekülmasse gering ist, beispielsweise im Fall eines Produkts, das nachfolgend als CY 222 bezeichnet wird (mittlere Molekülmasse im Bereich von 1700 bis 3300 Da), kann der Anteil an Nitroso-Verbindungen höher sein als in Produkten mit einer höheren Molekülmasse. Dieses Produkt entspricht der Definition der Produkte, die in den unter den Nummern FR-2 278 646 und EP-0 037 319 veröffentlichten Patentanmeldungen und Patenten beansprucht werden, und es kann nach den in diesen Anmeldungen oder Patenten beschriebenen Verfahren hergestellt werden.In the case of low molecular weight heparins, the average molecular mass of which is low, for example in the case of a product referred to below as CY 222 (average molecular mass in the range from 1700 to 3300 Da), the proportion of nitroso compounds may be higher than in products with a higher molecular mass. This product corresponds to the definition of the products claimed in the patent applications and patents published under numbers FR-2 278 646 and EP-0 037 319 and it can be prepared by the processes described in those applications or patents.
Aus den obengenannten Gründen ist es daher sehr wünschenswert, Heparin-Fraktionen angeben zu können, die durch Nitrit-Depolymerisation erhalten wurden und die praktisch keine Nitroso-Verbindungen enthalten.For the reasons mentioned above, it is therefore very desirable to be able to specify heparin fractions obtained by nitrite depolymerization which contain practically no nitroso compounds.
In dem Artikel von P.Princz et al. Water Supply 6 (1988) 199-205, wird ein Verfahren zur Beseitigung von Nitraten in Trinkwasser bei gleichzeitiger Sterilisation des Wassers durch Bestrahlung mit UV-Strahlung bei einer Wellenlänge unter 200 nm und vorzugsweise unter 185 nm und bei einem basischen pH-Wert beschrieben. Anhand dieses Dokumentes, das die Behandlung von Wasser betrifft, konnte dennoch nicht vorhergesehen werden, ob eine Bestrahlung mit UV- Strahlung auf ein biologisch aktives Produkt anwendbar ist, ohne Wirkungen hervorzurufen, die für die biologischen und/oder physikochemischen Eigenschaften abträglich sind.The article by P.Princz et al. Water Supply 6 (1988) 199-205 describes a process for eliminating nitrates in drinking water while simultaneously sterilizing the water by irradiating it with UV radiation at a wavelength of less than 200 nm and preferably less than 185 nm and at a basic pH. However, this document, which concerns the treatment of water, did not allow it to be foreseen whether UV radiation could be applied to a biologically active product without causing effects that are detrimental to its biological and/or physicochemical properties.
Es wurde nun festgestellt, daß die vorliegenden Nitroso- Verbindungen fast vollständig entfernt werden können, wenn eine durch Nitrit-Depolymerisation erhaltene Heparin-Fraktion der Einwirkung ultravioletter Strahlung (im nachfolgenden einfach als UV-Strahlung bezeichnet) ausgesetzt wird; man erhält eine gereinigte Heparin-Fraktion mit einem Gehalt an Gruppen N-NO, der gleich oder sogar kleiner dem Gehalt bei natürlichem Heparin ist.It has now been found that the nitroso compounds present can be almost completely removed if a heparin fraction obtained by nitrite depolymerization is exposed to ultraviolet radiation (hereinafter referred to simply as UV radiation); a purified heparin fraction is obtained with a content of N-NO groups equal to or even lower than that of natural heparin.
Es wurde ferner festgestellt, daß die UV-Strahlung unter den angewandten Bedingungen die Struktur der Heparin-Fraktionen nicht verändert, die alle ihre biologischen und physikochemischen Eigenschaften behalten.It was also found that UV radiation under the conditions used does not alter the structure of the heparin fractions, which retain all their biological and physicochemical properties.
Nach einem ihrer Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung daher durch Nitrit-Depolymerisation erhaltene Heparin-Fraktionen mit einem Gehalt an Gruppen N-NO von höchstens 500 Teilen pro 1 Milliarde Teile (parts per billion, ppb), vorteilhaft von höchstens 150 ppb, vorzugsweise von höchstens 100 ppb und noch bevorzugter von 50 ppb, wobei der Gehalt von 50 ppb die bei heutigem Kenntnisstand minimale quantifizierbare Menge ist. Die Fraktionen sind vorzugsweise Heparine mit niedrigem Molekulargewicht.According to one of its aspects, the present invention therefore relates to heparin fractions obtained by nitrite depolymerization having a content of N-NO groups of at most 500 parts per billion (ppb), advantageously of at most 150 ppb, preferably of at most 100 ppb and even more preferably of 50 ppb, the content of 50 ppb being the minimum quantifiable amount at the current state of knowledge. The fractions are preferably low molecular weight heparins.
Nach einem vorteilhaften Aspekt betrifft die Erfindung ein gereinigtes, durch Nitrit-Depolymerisation erhaltenes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, und zwar ein depolymerisiertes Heparin, das durch Nitrit-Depolymerisation eines natürlichen Heparins aus der Darmschleimhaut von Schweinen oder Rinderlunge oder eines beliebigen anderen Heparins, das aus Gewebe oder Organen von davon verschiedenen Tieren gewonnen wurde, erhalten ist und folgende Eigenschaften aufweist:According to an advantageous aspect, the invention relates to a purified low molecular weight heparin obtained by nitrite depolymerization, namely a depolymerized heparin obtained by nitrite depolymerization of a natural heparin from the intestinal mucosa of pigs or bovine lungs or any other heparin obtained from tissues or organs of animals other than these, and having the following properties:
- die mittlere Molekülmasse ist kleiner als 8000 Da,- the average molecular mass is less than 8000 Da,
- mindestens 60 % aller Bestandteile weisen eine mittlere Molekülmasse von weniger als 8000 Da auf,- at least 60% of all components have an average molecular mass of less than 8000 Da,
- die Anti-Faktor-Xa-Aktivität ist nicht geringer als 60 IU/mg,- the anti-factor Xa activity is not less than 60 IU/mg,
- das Verhältnis von Anti-Faktor-Xa-Aktivität zu Anti- Faktor-IIa-Aktivität ist nicht kleiner als 1,5,- the ratio of anti-factor Xa activity to anti-factor IIa activity is not less than 1.5,
- der Gehalt an Gruppen N-NO beträgt höchstens 500 ppb, vorteilhaft 150 ppb, vorzugsweise 100 ppb und noch bevorzugter 50 ppb,- the content of N-NO groups is not more than 500 ppb, advantageously 150 ppb, preferably 100 ppb and even more preferably 50 ppb,
wobei das depolymerisierte Heparin in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes vorliegt, vorzugsweise als Natrium- oder Calciumsalz.wherein the depolymerized heparin is in the form of a pharmaceutically acceptable salt, preferably as a sodium or calcium salt.
Die Anti-Faktor-Xa-Aktivität und das Verhältnis der Anti- Faktor-Xa-Aktivität zu Anti-Faktor-II-Aktivität werden bezogen auf den internationalen Standard der Heparine mit niedrigem Molekulargewicht bestimmt: Referenz OMS 1-85/600.The anti-factor Xa activity and the ratio of anti-factor Xa activity to anti-factor II activity are determined relative to the international standard of low molecular weight heparins: reference OMS 1-85/600.
Die obengenannte mittlere Molekülmasse wird entsprechend der für das Europäische Arzneibuch vorgeschlagenen Monographie (5 obengenannte Referenz) bestimmt.The average molecular mass mentioned above is determined according to the monograph proposed for the European Pharmacopoeia (5 reference mentioned above).
In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "frei von Gruppen N-NO" verwendet, um die Heparin-Fraktionen oder die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die durch Nitrit-Depolymerisation erhalten wurden und die höchstens 500 ppb, vorteilhaft höchstens 150 ppb, insbesondere höchstens 100 ppb und vorzugsweise höchstens 50 ppb Gruppen N- NO enthalten, zu charakterisieren. Mit dem Ausdruck "Bestandteile" wird die Gesamtheit der Moleküle bezeichnet, aus denen das Heparin mit niedrigem Molekulargewicht besteht.In the present description, the expression "free of N-NO groups" is used to characterize the heparin fractions or low molecular weight heparins obtained by nitrite depolymerization and containing at most 500 ppb, advantageously at most 150 ppb, in particular at most 100 ppb and preferably at most 50 ppb of N-NO groups. The expression "constituents" refers to all the molecules that make up the low molecular weight heparin.
Die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die frei von Gruppen N-NO sind und einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen, weisen bei der Mehrzahl ihrer Bestandteile am nicht reduzierenden Ende eine 2-O-Sulfo-α-L-idopyranosuronsäure-Struktur, am reduzierenden Ende eine 6-O- Sulfo-2,5-anhydro-D-mannit-Struktur und einen Sulfatierungsgrad auf, der sich nicht wesentlich von dem Sulfatierungsgrad natürlichen nichtfraktionierten Heparins unterscheidet. Der Sulfatierungsgrad liegt im Bereich von 2 bis 2,5 und vorzugsweise von 2,0 bis 2,3.The low molecular weight heparins free of N-NO groups which are the subject of the present invention have, in the majority of their constituents, a 2-O-sulfo-α-L-idopyranosuronic acid structure at the non-reducing end, a 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitol structure at the reducing end and a degree of sulfation which does not differ significantly from the degree of sulfation of natural unfractionated heparin. The degree of sulfation is in the range from 2 to 2.5 and preferably from 2.0 to 2.3.
Vorteilhafte erfindungsgemäße Heparine mit niedrigem Molekulargewicht weisen veränderliche Verteilungen der Molekülmasse auf, wobei die Molekülmasse von 90 % ihrer Bestandteile im Bereich von 2000 bis 10000 Da, vorzugsweise von 2000 bis 9000 Da und vorteilhaft von 2000 bis 8000 Da liegt. Die Heparine weisen im übrigen eine überwiegende Molekülmasse im Bereich von 3000 bis 6000 Da und vorzugsweise von 4000 bis 5000 Da auf.Advantageous low molecular weight heparins according to the invention have variable molecular mass distributions, with the molecular mass of 90% of their components being in the range from 2000 to 10000 Da, preferably from 2000 to 9000 Da and advantageously from 2000 to 8000 Da. The heparins otherwise have a predominant molecular mass in the range from 3000 to 6000 Da and preferably from 4000 to 5000 Da.
Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugtes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht weist eine überwiegende Molekülmasse im Bereich von 1700 bis 3300 Da auf, wobei die Molekülmasse von 90 % seiner Bestandteile im Bereich von 1000 bis 8000 Da liegt.Another low molecular weight heparin preferred according to the invention has a predominant molecular mass in the range of 1700 to 3300 Da, with the molecular mass of 90% of its components being in the range of 1000 to 8000 Da.
Mit dem Ausdruck "überwiegende Molekülmasse" wird die Molekülmasse der Bestandteile des Heparins bezeichnet, die dem Peak des chromatographischen Profils entsprechen, das durch Ausschlußchromatographie unter Verwendung eines UV-Detektors bei einer Wellenlänge von = 205 nm erhalten wird.The term "predominant molecular mass" means the molecular mass of the components of heparin corresponding to the peak of the chromatographic profile obtained by exclusion chromatography using a UV detector at a wavelength of = 205 nm.
Das gereinigte CY 222, das als Natriumsalz eines depolymerisierten Heparins, das durch Depolymerisation eines natürlichen Heparins aus der Darmschleimhaut von Schweinen mit salpetriger Säure erhalten wurde, definiert ist und folgende Eigenschaften aufweist:Purified CY 222, which is defined as the sodium salt of a depolymerised heparin obtained by depolymerisation of a natural heparin from the intestinal mucosa of pigs with nitrous acid and has the following characteristics:
- die überwiegende Molekülmasse liegt im Bereich von 1700 bis 3300 Da, wobei 90 % der Bestandteile eine Molekülmasse im Bereich von 1000 bis 8000 Da besitzen,- the predominant molecular mass is in the range of 1700 to 3300 Da, with 90% of the components having a molecular mass in the range of 1000 to 8000 Da,
- der überwiegende Teil der Bestandteile weist am nicht reduzierenden Ende eine 2-O-Sulfo-α-L-idopyranosuronsäure- Struktur und am reduzierenden Ende eine 6-O-Sulfo-2,5- anhydro-D-mannit-Struktur auf,- the majority of the components have a 2-O-sulfo-α-L-idopyranosuronic acid structure at the non-reducing end and a 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitol structure at the reducing end,
- der Sulfatierungsgrad beträgt etwa 2,1,- the degree of sulfation is about 2.1,
- die Anti-Faktor-Xa-Aktivität beträgt 60 bis 80 IU/mg,- the anti-factor Xa activity is 60 to 80 IU/mg,
- die Anti-Faktor-IIa-Aktivität ist nicht größer als 25 IU/mg, genauer 10 bis 15 IU/mg,- the anti-factor IIa activity is not greater than 25 IU/mg, more precisely 10 to 15 IU/mg,
- der Gehalt an Gruppen N-NO ist höchstens gleich 100 ppb (1 10&supmin;&sup7; mg Nitroso-Verbindungen pro Milligramm Produkt), vorzugsweise höchstens 50 ppb (5 10&supmin;&sup8; mg Nitroso-Verbindungen pro Milligramm Produkt),- the content of N-NO groups is not more than 100 ppb (1 10⁻⁷ mg of nitroso compounds per milligram of product), preferably not more than 50 ppb (5 10⁻⁷ mg of nitroso compounds per milligram of product),
stellt eine nach der vorliegenden Erfindung bevorzugte Heparin-Fraktion dar.represents a preferred heparin fraction according to the present invention.
Die Heparin-Fraktionen der vorliegenden Erfindung, die frei von Gruppen N-NO sind, (Heparine mit niedrigem Molekulargewicht) werden nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt.The heparin fractions of the present invention which are free of N-NO groups (low molecular weight heparins) are prepared according to a further aspect of the present invention.
So betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von Heparin-Fraktionen mit höchstens 500 ppb Gruppen N-NO, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Lösung einer durch Nitrit-Depolymerisation erhaltenen Heparin-Fraktion UV-Strahlung ausgesetzt wird.Thus, the present invention further relates to a process for the preparation of heparin fractions containing at most 500 ppb N-NO groups, which is characterized in that an aqueous solution of a heparin fraction obtained by nitrite depolymerization is exposed to UV radiation.
Als Ausgangsprodukt kann eine beliebige durch Nitrit-Depolymerisation erhaltene Heparin-Fraktion verwendet werden. Ein solches Ausgangsprodukt enthält im allgemeinen einen Gehalt an Gruppen N-NO im Bereich von 1000 bis 20000 ppb.Any heparin fraction obtained by nitrite depolymerization can be used as the starting product. Such a starting product generally contains a content of N-NO groups in the range of 1000 to 20000 ppb.
Die Bestimmung der Gruppen N-NO wird mit der Methode von B. Pignatelli et al. durchgeführt, die in Analyst 114, September 1989, S. 1103-1108, und in Analyst 112, Juli 1987, S. 945-949, beschrieben und an Heparin und seine Fraktionen und vorzugsweise an Heparine mit niedrigem Molekulargewicht angepaßt ist.The determination of the N-NO groups is carried out using the method of B. Pignatelli et al., described in Analyst 114, September 1989, pp. 1103-1108, and in Analyst 112, July 1987, pp. 945-949, and adapted to heparin and its fractions, and preferably to low molecular weight heparins.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an einem in Wasser gelösten Heparin mit niedrigem Molekulargewicht von pharmazeutischer Qualität oder auch während der industriellen Herstellung nach dem Schritt der Nitrit-Depolymerisation und vor der Abtrennung des reinen Produkts von pharmazeutischer Qualität durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht von pharmazeutischer Qualität verwendet.The process of the present invention can be carried out on a low molecular weight heparin of pharmaceutical grade dissolved in water or even during industrial production after the nitrite depolymerization step and before the separation of the pure pharmaceutical grade product. Preferably, a low molecular weight heparin of pharmaceutical grade is used.
Als Ausgangsprodukt für das erfindungsgemäße Verfahren kann daher ein beliebiges Heparin mit niedrigem Molekulargewicht verwendet werden, das durch Nitrit-Depolymerisation erhalten wurde. Um einen maximalen Wirkungsgrad des Verfahrens zu erhalten, ist es vorteilhaft, Lösungen von depolymerisiertem Heparin zu verwenden, die frei von Mikropartikeln in Suspension sind. Die Gegenwart von Mikropartikeln kann von einer schlechten Lösung des depolymerisierten Heparins, verschiedenen Verunreinigungen oder auch von Rückständen von während der Depolymerisation oder während der Reinigung verwendeten Reaktanten herrühren. Die verschiedenen Lösungen von depolymerisiertem Heparin werden daher vorzugsweise einer vorangehenden Filtrierung unterzogen.As a starting material for the process according to the invention, any low molecular weight heparin obtained by nitrite depolymerization can therefore be used. In order to obtain maximum efficiency of the process, it is advantageous to use solutions of depolymerized heparin that are free of microparticles in suspension. The presence of microparticles can be caused by a poor solution of the depolymerized heparin, various impurities or residues of reactants used during depolymerization or purification. The various solutions of depolymerized heparin are therefore preferably subjected to prior filtration.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ausgesprochen wirksam und flexibel, da es eine einfache, schnelle und sichere Beseitigung der Nitroso-Verbindungen erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren ruft ferner keinerlei Modifizierung der Struktur der Heparin-Fraktion hervor, deren biologische und physikochemische Eigenschaften vollkommen identisch bleiben.The process of the present invention is extremely effective and flexible, since it allows for a simple, rapid and safe elimination of the nitroso compounds. The process of the invention also does not cause any modification of the structure of the heparin fraction, whose biological and physicochemical properties remain completely identical.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem eine wäßrige Lösung von 5 bis 15 % (M/V) der durch Nitrit-Depolymerisation erhaltenen zu reinigenden Heparin-Fraktion und vorzugsweise des Heparins mit niedrigem Molekulargewicht mit einem UV-Bestrahlungssystem mit bei einer wellenlänge von 180 bis 350 nm und vorzugsweise 254 nm bei einer Temperatur von 5 bis 50 ºC, vorteilhaft 15 bis 35 ºC, bestrahlt wird.The process of the present invention can be carried out by irradiating an aqueous solution of 5 to 15% (w/v) of the heparin fraction to be purified, and preferably of the low molecular weight heparin, obtained by nitrite depolymerization, with a UV irradiation system at a wavelength of 180 to 350 nm and preferably 254 nm at a temperature of 5 to 50 °C, advantageously 15 to 35 °C.
Der pH-Wert der Lösung ist leicht sauer oder leicht basisch und liegt insbesondere im Bereich von 3 bis 8, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8.The pH of the solution is slightly acidic or slightly basic and is in particular in the range of 3 to 8, preferably in the range of 5 to 8.
Die Dauer der Bestrahlung hängt vom verwendeten Bestrahlungssystem, der Stärke der Strahlung und der Menge der in der Heparin-Fraktion vorliegenden zu beseitigenden Gruppen N-NO ab. Sie beträgt etwa 2 bis 30 min, wenn auch nach 9 bis 15 min die Reinigung im allgemeinen praktisch abgeschlossen ist.The duration of the irradiation depends on the irradiation system used, the intensity of the radiation and the amount of N-NO groups to be eliminated in the heparin fraction. It is approximately 2 to 30 minutes, although after 9 After 15 minutes the cleaning is generally practically completed.
Als UV-System kann entweder ein statisches System oder ein dynamisches System, in dem die Lösungen der Heparin-Fraktionen um die UV-Quelle zirkulieren können, in Betracht kommen. Dynamische Systeme werden bevorzugt. In letzterem Fall kann die UV-Quelle mit einem zylindrischen Rohr (Vorrichtung vom "geschlossenen" Typ) oder einem Kanal (Vorrichtung vom "offenen" Typ) kombiniert sein. Als Vorrichtung vom "geschlossenen" Typ kann der Sterilisator UV JR1-50 (KATADYN) oder eine beliebige andere, äquivalente Vorrichtung verwendet werden.The UV system can be either a static system or a dynamic system in which the solutions of the heparin fractions can circulate around the UV source. Dynamic systems are preferred. In the latter case, the UV source can be combined with a cylindrical tube (a "closed" type device) or a channel (a "open" type device). The "closed" type device can be the sterilizer UV JR1-50 (KATADYN) or any other equivalent device.
Fig. 1 zeigt einen Schnitt durch eine Vorrichtung vom "geschlossenen" Typ. Diese Vorrichtung besteht aus einer UV- Lampe (1), um die ein Quarzmantel (2) angebracht ist. Die Lösungen, die die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, zirkulieren um die UV-Lampe, die durch den Quarzmantel geschützt ist (Mantel der zirkulierenden Flüssigkeit (3)). Sie werden durch einen Einlaß (4), der sich an einem Ende der UV-Lampe befindet, zugeführt, wobei sich der Auslaß (5) am anderen Ende der UV-Lampe befindet.Fig. 1 shows a section through a device of the "closed" type. This device consists of a UV lamp (1) around which a quartz mantle (2) is placed. The solutions containing the low molecular weight heparins circulate around the UV lamp, which is protected by the quartz mantle (circulating liquid mantle (3)). They are fed through an inlet (4) located at one end of the UV lamp, with the outlet (5) located at the other end of the UV lamp.
Wenn ein dynamisches System verwendet wird, muß der Durchsatz der Lösungen der Heparin-Fraktionen, mit dem sie um die UV-Lampe zirkulieren, auf geeignete Weise angepaßt werden, um eine Bestrahlungsdauer zu erhalten, die zur Beseitigung der Nitroso-Verbindungen notwendig ist. Die verschiedenen Parameter, die hier eingehen können, sind der Durchmesser des zirkulierenden Flüssigkeitstroms, die Abmessung und/oder Stärke der UV-Quelle, die Konzentration der wäßrigen Lösung mit der Heparin-Fraktion und die Menge der in der Heparin-Fraktion enthaltenen, zu beseitigenden Nitroso-Verbindungen.When a dynamic system is used, the flow rate of the heparin fraction solutions circulating around the UV lamp must be suitably adjusted to obtain the irradiation time necessary to eliminate the nitroso compounds. The various parameters that can be taken into account are the diameter of the circulating liquid flow, the size and/or power of the UV source, the concentration the aqueous solution with the heparin fraction and the amount of nitroso compounds contained in the heparin fraction to be eliminated.
Die Heparin-Fraktion oder vorzugsweise das so erhaltene Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, das frei von Gruppen N-NO ist, kann mit herkömmlichen Verfahren wiedergewonnen werden.The heparin fraction or preferably the low molecular weight heparin thus obtained, which is free of N-NO groups, can be recovered by conventional methods.
Wenn als Ausgangsprodukt ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht von bereits pharmazeutischer Qualität verwendet wird, ist es ausreichend, das Produkt in Wasser zu lösen, den pH-Wert der Lösung auf 3 bis 8 und vorzugsweise 5 bis 8 einzustellen und die Lösung dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu unterziehen.When a low molecular weight heparin of already pharmaceutical quality is used as the starting product, it is sufficient to dissolve the product in water, adjust the pH of the solution to 3 to 8 and preferably 5 to 8 and subject the solution to the process of the present invention.
Als Ausgangsprodukt kann ferner ein nichtfraktioniertes natürliches Heparin, vorzugsweise in Salzform, insbesondere Heparin-Natrium und vorzugsweise aus der Darmschleimhaut von Schweinen, verwendet werden. In diesem Fall stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Schritt bei der Herstellung des gereinigten Endprodukts, das frei von Gruppen N-NO ist, nach der Nitrit-Depolymerisation dar. Das gesamte Verfahren ausgehend von Heparin stellt einen letzten Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.It is also possible to use as starting material a non-fractionated natural heparin, preferably in salt form, in particular heparin sodium and preferably from the intestinal mucosa of pigs. In this case, the process of the present invention represents a step in the preparation of the purified final product, free of N-NO groups, after nitrite depolymerization. The entire process starting from heparin represents a final subject of the present invention.
Nach einem weiteren ihrer Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Heparins mit niedrigem Molekulargewicht mit einem Gehalt an Gruppen N-NO von höchstens 500 ppb, vorteilhaft von höchstens 150 ppb, vorzugsweise von höchstens 100 ppb und noch bevorzugter von höchstens 50 ppb durch Nitrit-Depolymerisation, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:According to another of its aspects, the present invention also relates to a process for preparing a low molecular weight heparin having a content of N-NO groups of at most 500 ppb, advantageously of at most 150 ppb, preferably of at most 100 ppb and even more preferably of not more than 50 ppb by nitrite depolymerisation, which is characterised by the following steps:
(a) Behandlung einer Lösung von nichtfraktioniertem Heparin-Natrium in Wasser einer Konzentration von 5 bis 15 % (M/V) mit einer Alkalinitritlösung und vorzugsweise einer Natriumnitritlösung in einer Menge von 15 bis 69 g Nitrit pro Kilogramm eingesetzten Heparins in Gegenwart von Salzsäure bei einem pH-Wert von 1 bis 5 und vorzugsweise 1,5 bis 4 während einer Dauer von 20 bis 50 min, Reduktion des so erhaltenen Produkts, vorzugsweise in alkalischem Medium, mit 5 bis 20 g Natriumborhydrid pro Kilogramm anfänglich eingesetzten Heparins, Vernichten von überschüssigem Natriumborhydrid mit Salzsäure, ggf. Neutralisation des Reaktionsmediums, sowie Fällung mit Ethanol und ggf. einmalige oder mehrmalige Fraktionierung des so erhaltenen Heparins mit niedrigem Molekulargewicht mit Alkohol,(a) treating a solution of unfractionated heparin sodium in water at a concentration of 5 to 15% (M/V) with an alkali nitrite solution and preferably a sodium nitrite solution in an amount of 15 to 69 g of nitrite per kilogram of heparin used in the presence of hydrochloric acid at a pH of 1 to 5 and preferably 1.5 to 4 for a period of 20 to 50 minutes, reducing the product thus obtained, preferably in an alkaline medium, with 5 to 20 g of sodium borohydride per kilogram of heparin initially used, destroying excess sodium borohydride with hydrochloric acid, optionally neutralizing the reaction medium, and precipitation with ethanol and optionally fractionating the low molecular weight heparin thus obtained once or several times with alcohol,
(b) Bestrahlung der so erhaltenen Lösung mit UV-Strahlung,(b) irradiating the solution thus obtained with UV radiation,
(c) ggf. chromatographische Reinigung und Isolierung des depolymerisierten gereinigten Heparin-Natriums ohne Gruppen N-NO durch Fällung mit Natriumchlorid und Ethanol und ggf.(c) if necessary, chromatographic purification and isolation of the depolymerized purified heparin sodium without N-NO groups by precipitation with sodium chloride and ethanol and if necessary.
(d) Überführung des Natriumsalzes in ein anderes pharmazeutisch akzeptables Salz.(d) converting the sodium salt into another pharmaceutically acceptable salt.
Nach einem bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem CY 222, das als Natriumsalz eines depolymerisierten Heparins definiert ist, das durch Depolymerisation eines natürlichen Heparins aus der Darmschleimhaut von Schweinen mit salpetriger Säure erhalten wurde und folgende Eigenschaften aufweist:In a preferred aspect, the present invention relates to a process for the preparation of purified CY 222, which is defined as the sodium salt of a depolymerized heparin obtained by depolymerization of a natural heparin from the intestinal mucosa of pigs with nitrous acid and has the following properties:
- die überwiegende Molekülmasse liegt im Bereich von 1700 bis 3300 Da,- the predominant molecular mass is in the range of 1700 to 3300 Da,
- 90 % der Bestandteile besitzen eine Molekülmasse im Bereich von 1000 bis 8000 Da,- 90% of the components have a molecular mass in the range of 1000 to 8000 Da,
- der überwiegende Teil der Bestandteile weist am nicht reduzierenden Ende eine 2-O-Sulfo-α-L-idopyranosurosäure- Struktur und am reduzierenden Ende eine 6-O-Sulfo-2,5- anhydro-D-mannit-Struktur auf,- the majority of the components have a 2-O-sulfo-α-L-idopyranosuroic acid structure at the non-reducing end and a 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitol structure at the reducing end,
- der Sulfatierungsgrad beträgt etwa 2,1,- the degree of sulfation is about 2.1,
- die Anti-Faktor-Xa-Aktivität beträgt 60 bis 80 IU/mg,- the anti-factor Xa activity is 60 to 80 IU/mg,
- die Anti-Faktor-IIa-Aktivität ist nicht größer als 25 IU/mg,- the anti-factor IIa activity is not greater than 25 IU/mg,
- der Gehalt an Gruppen N-NO ist höchstens gleich 100 ppb und vorzugsweise höchstens 50 ppb,- the content of N-NO groups is not more than 100 ppb and preferably not more than 50 ppb,
wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:the method being characterized by the following steps:
(a) Behandlung einer wäßrigen Lösung von nichtfraktioniertem natürlichem Heparin-Natrium mit Salzsäure und einem Alkalinitrit in einer Menge von 3,5 bis 4 Gew.-%, bezogen auf das eingesetzte Heparin, wobei der pH-Wert sauer gehalten wird und das Vorliegen von Nitritionen bis zur negativen Reaktion überwacht wird, anschließendes Alkalischmachen, Reduktion mit Natriumborhydrid und Isolierung des depolymerisierten Produkts durch Ausfällung mit Ethanol in neutralem Medium und anschließendes(a) treating an aqueous solution of unfractionated natural heparin sodium with hydrochloric acid and an alkali nitrite in an amount of 3.5 to 4% by weight, relative to the heparin used, keeping the pH acidic and monitoring the presence of nitrite ions until a negative reaction, then alkalineifying, reducing with sodium borohydride and isolating the depolymerized product by precipitation with ethanol in a neutral medium and then
(b) Vorbeileiten einer wäßrigen Lösung des so erhaltenen Produkts bei einem pH-Wert von etwa 7 an einem UV-Bestrahlungssystem von 254 nm, anschließende Einführung der erhaltenen Lösung oben in eine Ionenaustauschersäule und Gewinnung des Endprodukts nach Spülen der Säule mit Wasser bei einem pH-Wert von etwa 7 durch Ausfällung mit Natriumchlorid und Ethanol.(b) passing an aqueous solution of the product thus obtained at a pH of about 7 through a UV irradiation system at 254 nm, then introducing the solution obtained into the top of an ion exchange column and recovering the final product after rinsing the column with water at a pH of about 7 by precipitation with sodium chloride and ethanol.
In Schritt (a) wird als Alkalinitrit Natriumnitrit in den oben angegebenen Anteilen verwendet.In step (a), sodium nitrite is used as alkali nitrite in the proportions given above.
In Schritt (b) des Verfahrens ist das UV-Bestrahlungssystem vorzugsweise mit einer Lampe von 16 W versehen, und die Dauer der UV-Bestrahlung bei 254 nm ist etwa 9 bis 15 min. Es wird ein dynamisches UV-Bestrahlungssystem bevorzugt und insbesondere eine Vorrichtung vom "geschlossen" Typ. Die Konzentration der Lösungen, die der UV-Strahlung ausgesetzt werden, ist vorzugsweise 8 bis 12 % (M/V)In step (b) of the process, the UV irradiation system is preferably provided with a 16 W lamp and the duration of UV irradiation at 254 nm is about 9 to 15 minutes. A dynamic UV irradiation system is preferred and in particular a "closed" type device. The concentration of the solutions exposed to UV radiation is preferably 8 to 12% (W/V)
Nach einem letzten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff eine gereinigte Heparin-Fraktion ohne Gruppen N-NO und vorzugsweise ein gereinigtes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, das vollständig frei von Nitroso-Verbindungen ist, enthält, wie dies oben beschrieben wurde.In a final aspect, the present invention relates to pharmaceutical compositions containing as active ingredient a purified heparin fraction without N-NO groups and preferably a purified low molecular weight heparin completely free of nitroso compounds, as described above.
In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die Heparin-Fraktion in Form eines Lyophilisats oder in Lösung zur subkutanen Injektion in einem biologisch akzeptablen stenlen Lösungsmittel, wie Wasser oder einer physiologischen Lösung, in Ampullen, Fläschchen, vorgefüllten Spritzen oder in Vorrichtungen zur Selbstinjektion vom "Füllfederhalter"- Typ vorliegen. Jede Dosiereinheit der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann 50 bis 50000 IU Anti-Faktor-Xa enthalten.In the compositions according to the invention, the heparin fraction can be in the form of a lyophilisate or in solution for subcutaneous injection in a biologically acceptable solvent such as water or a physiological solution, in ampoules, vials, prefilled syringes or in self-injection devices of the "fountain pen" type. Each dosage unit of the pharmaceutical compositions can contain from 50 to 50,000 IU of anti-factor Xa.
Die erfindungsgemäßen Heparin-Fraktionen können ferner alleine oder im Gemisch mit weiteren Wirkstoffen durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Sie können auch durch intranasale oder intrapulmonale Zerstäubung verabreicht werden.The heparin fractions according to the invention can also be administered alone or in a mixture with other active ingredients by intravenous injection. They can also be administered by intranasal or intrapulmonary nebulization.
Eine nach der vorliegenden Erfindung bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung enthält als Wirkstoff das an Gruppen N-NO freie CY 222, wie oben beschrieben, in Dosiereinheiten von 10 bis 5000 mg CY 222 in Form des Natriumsalzes.A preferred pharmaceutical composition according to the present invention contains as active ingredient the CY 222 free of N-NO groups, as described above, in dosage units of 10 to 5000 mg CY 222 in the form of the sodium salt.
Wie vorstehend angegeben, erfolgt die Bestimmung der Gruppen N-NO nach der Methode von B. Pignatelli et al., die in Analyst 114, September 1989, S. 1103-1108, und in Analyst 114, Juli 1987, 5. 945-949, beschrieben und an Heparin und Heparine mit niedrigem Molekulargewicht angepaßt ist.As indicated above, the determination of the N-NO groups is carried out according to the method of B. Pignatelli et al., described in Analyst 114, September 1989, pp. 1103-1108, and in Analyst 114, July 1987, pp. 945-949, and adapted to heparin and low molecular weight heparins.
Die zu analysierenden Produkte liegen vorzugsweise in Pulverform vor, daher führt man im Falle der Bestimmung der Gruppen N-NO in einer Lösung vorliegenden Produkten vorabeine Lyophilisation der Lösung durch und analysiert anschließend die lyophilisierte Probe.The products to be analyzed are preferably in powder form, therefore, in the case of the determination of the N-NO groups of products present in a solution, the solution is lyophilized beforehand and the lyophilized sample is then analyzed.
Die pro 100 mg Heparin-Fraktion verwendeten Reaktanten sind folgende:The reactants used per 100 mg of heparin fraction are following:
- mit Sulfamidsäure von 20 % (M/V) behandeltes Ethylacetat (Lösung von 200 g Sulfamidsäure in 1000 ml Ethylacetat, die 3 Tage gerührt und vor der Verwendung über Filterpapier filtriert wurde),- ethyl acetate treated with 20% (m/v) sulfamic acid (solution of 200 g sulfamic acid in 1000 ml ethyl acetate, which was stirred for 3 days and filtered through filter paper before use),
- 15-%ige Bromwasserstoffsäure in Essigsäure (kleine bernsteinfarbene Fläschchen mit Polyethylenstopfen, die 5 ml 30%ige Bromwasserstoffsäure enthalten, unter Argon verschlossen wurden und in der Dunkelheit aufbewahrt werden. Bei der Verwendung werden 5 ml reine Essigsäure zugesetzt; man rührt und bewahrt in einem kleinen Behälter in der Dunkelheit auf. Es wird ein Fläschchen pro Dosierungsreihe verwendet),- 15% hydrobromic acid in acetic acid (small amber vials with polyethylene stoppers containing 5 ml of 30% hydrobromic acid, sealed under argon and stored in the dark. When used, add 5 ml of pure acetic acid; stir and store in a small container in the dark. Use one vial per dosing series),
- mit Sulfamidsäure von 5 % (M/V) behandeltes Formamid von 95 % (Lösung von 1 g Sulfamidsäure in 20 ml Formamid, die 5 % gereinigtes Wasser enthält).- 95% formamide treated with 5% (m/v) sulfamic acid (solution of 1 g of sulfamic acid in 20 ml of formamide containing 5% purified water).
- N-Nitroso-di-n-propylamin (NDPA) -Eichlösung 78,62 g reines Ethanol werden in eine ISOPAC-Flasche (Sigma), die 1 g N-Nitroso-di-n-propylamin enthält, über das Septum eingespritzt. Die Konzentration beträgt 10000 ppm NDPA (3379 ppm N-NO). Anschließend verdünnt man 1:100 mit reinem Ethanol und man füllt aliquote Mengen von 0,5 ml in kleine Fläschchen mit Kapselverschluß ein. Die Konzentration beträgt 100 ppm NDPA. Man bewahrt in der Dunkelheit bei +4 ºC auf.- N-nitroso-di-n-propylamine (NDPA) calibration solution 78.62 g of pure ethanol are injected through the septum into an ISOPAC bottle (Sigma) containing 1 g of N-nitroso-di-n-propylamine. The concentration is 10000 ppm NDPA (3379 ppm N-NO). Then dilute 1:100 with pure ethanol and fill aliquots of 0.5 ml into small vials with a cap. The concentration is 100 ppm NDPA. Store in the dark at +4 ºC.
* Eichlösung mit niedriger Konzentration: Bei der Verwendung wird 1:100 in Ethanol und anschließend 1:17 in dem behandelten Formamid verdünnt. Die Konzentration beträgt 0,0588 ppm NDPA oder 19,9 ppb N-NO.* Low concentration calibration solution: When used, dilute 1:100 in ethanol and then 1:17 in the treated formamide. The concentration is 0.0588 ppm NDPA or 19.9 ppb N-NO.
* Eichlösung mit mittlerer Konzentration: Bei der Verwendung wird 1:61 in Ethanol und anschließend 1:11 in dem behandelten Formamid verdünnt. Die Konzentration beträgt 0,149 ppm NDPA oder 50,4 ppb N-NO.* Medium concentration calibration solution: When used, dilute 1:61 in ethanol and then 1:11 in the treated formamide. The concentration is 0.149 ppm NDPA or 50.4 ppb N-NO.
* Eichlösung mit hoher Konzentration: Bei der Verwendung wird 1:10 in Ethanol und anschließend 1:10 in dem behandelten Formamid verdünnt. Die Konzentration beträgt 1 ppm NDPA oder 338 ppb N-NO.* High concentration calibration solution: When used, dilute 1:10 in ethanol and then 1:10 in the treated formamide. The concentration is 1 ppm NDPA or 338 ppb N-NO.
- Zu analysierende Probe- Sample to be analyzed
Die Proben der Heparin-Fraktion werden 12 h bei 60 ºC unter Vakuum mit Phosphorpentoxid getrocknet. 100 mg der Heparin-Fraktion werden in 1 ml behandeltem Formamid gelöst, wonach 30 min mit einer Schütteleinrichtung bewegt wird.The samples of the heparin fraction are dried for 12 hours at 60 ºC under vacuum with phosphorus pentoxide. 100 mg of the heparin fraction are dissolved in 1 ml of treated formamide and agitated for 30 minutes with a shaker.
Die verwendete Vorrichtung ist in Fig. 2 gezeigt.The device used is shown in Fig. 2.
Die Vorrichtung besteht aus einem 500 ml-Pyrex-Kolben (1), der mit einem auf -15 ºC gekühlten doppelt wirkenden Kühler versehen ist. Dieser ist mit drei in Reihe geschalteten Waschflaschen (3) verbunden, die jede 30 ml 30-%ige Natriumhydroxidlösung enthalten. Letztere sind mit zwei Kühlfallen verbunden, die in Reihe geschaltet sind, wobei eine mit schmelzflüssigem Ethanol bei -120 ºC (4) und die andere mit schmelzflüssigem Isopentan bei -160 ºC (5) versehen wurde. Die beiden Kühlfallen sind schließlich mit einem Chemilumineszenz-Detektor (TEA) Modell 610 (Thermedics Detection Inc.) oder einem äquivalenten Detektor (6) verbunden. Der Detektor ist mit einem Integrator/ Schreiber (7) verbunden.The device consists of a 500 ml Pyrex flask (1) equipped with a double-acting condenser cooled to -15 ºC. This is connected to three wash bottles (3) in series, each containing 30 ml of 30% sodium hydroxide solution. The latter are connected to two cold traps in series, one containing molten ethanol at -120 ºC (4) and the other containing molten isopentane at -160 ºC (5). The two cold traps are finally connected to a chemiluminescence detector (TEA) model 610 (Thermedics Detection Inc.) or equivalent detector (6). The detector is connected to an integrator/recorder (7).
Der Kolben ist an einer Seite mit einem durchbohrten Stopfen (8), durch den eine Kanüle eingeführt werden kann, über die Argon einströmt, und an der anderen Seite mit einer Verschraubung ausgestattet, die mit einem Stopfen versehen ist, der die Anbringung eines Septums vom Typ CPG (9) erlaubt, durch das die Probe eingespritzt wird. Der Argonstrom und das Vakuum, das von der Vakuumpumpe des TEA- Detektors erzeugt wird, treiben das Gas in Richtung TEA- Detektor.The piston is equipped on one side with a pierced plug (8) through which a cannula can be inserted to introduce argon, and on the other side with a screw fitting equipped with a plug allowing the attachment of a CPG type septum (9) through which the sample is injected. The argon flow and the vacuum generated by the vacuum pump of the TEA detector drive the gas towards the TEA detector.
Der TEA-Detektor wird entsprechend den Vorschriften des Herstellers eingestellt, um maximale Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu erreichen.The TEA detector is adjusted according to the manufacturer’s instructions to achieve maximum sensitivity and reproducibility.
Eine Stunde vor der Bestimmung wird die Sauerstoffleitung geöffnet, Druck 2 bar, und der Durchsatz wird mit dem Durchsatzmesser des Detektors TEA 610 (Thermedics Detection Inc.) auf 0,02 eingestellt.One hour before the determination, the oxygen line is opened, pressure 2 bar, and the flow rate is set to 0.02 using the flow meter of the TEA 610 detector (Thermedics Detection Inc.).
Jede Waschflasche wird mit 30 ml 30%iger Natriumhydroxidlösung gefüllt.Each wash bottle is filled with 30 ml of 30% sodium hydroxide solution.
Falle mit -120 ºC: In einen Dewar mit 250 ml Ethanol wird vorsichtig unter Rühren mit einem Holzspatel flüssiger Stickstoff gegossen, bis eine Paste erhalten wird. Falle mit -160 ºC: In einen Dewar mit 250 ml Isopentan wird vorsichtig unter Rühren mit einem Holzspatel flüssiger Stickstoff gegossen, bis eine Paste erhalten wird. Beide Glasfallen werden in den jeweiligen Dewar eingesetzt und in Reihenschaltung an die Leitungen angeschlossen.Trap at -120 ºC: Into a Dewar containing 250 ml of ethanol, carefully pour liquid nitrogen while stirring with a wooden spatula until a paste is obtained. Trap at -160 ºC: Into a Dewar containing 250 ml of isopentane, carefully pour liquid nitrogen while stirring with a wooden spatula. Nitrogen is poured in until a paste is obtained. Both glass traps are placed in the respective Dewar and connected in series to the lines.
50 ml Ethylacetat werden 1 h unter Argon auf Rückflußtemperatur erhitzt, ohne daß der TEA-Detektor angeschlossen ist.50 ml of ethyl acetate are heated to reflux temperature under argon for 1 h without the TEA detector being connected.
In einen mit einem Septum ausgestatteten neuen, sauberen und trockenen Kolben werden 30 ml behandeltes Ethylacetat gegeben; an dem Kolben wird der Kühler angebracht (der Kryostat muß zuvor 2 h bei -15 ºC betrieben werden). Danach wird Kolbenheizung angebracht, und man erwärmt (Stellung 4). Dann wird die Argonleitung angebracht, der Durchsatz auf 0,1 1/min eingestellt und die Dichtigkeit des gesamten Leitungssystems überprüft. Nur der Anschluß an den TEA- Detektor bleibt offen, um einen Überdruck zu vermeiden. Wenn das Ethylacetat Rückflußtemperatur erreicht hat, wird sehr vorsichtig Vakuum angelegt und gleichzeitig der Anschluß am TEA-Detektor wieder dicht gemacht. Das Vakuum baut sich im gesamten System auf und erreicht 2 bis 4 mmHg, wenn sich das System im Gleichgewicht befindet. Die Nullstellung des TEA-Detektors wird auf 10 % der vollen Skala des Integrators/Schreibers eingestellt.30 ml of treated ethyl acetate are placed in a new, clean and dry flask fitted with a septum; the cooler is attached to the flask (the cryostat must have been operated at -15 ºC for 2 hours beforehand). The flask heater is then attached and the system is heated (position 4). The argon line is then attached, the flow rate is set to 0.1 1/min and the tightness of the entire piping system is checked. Only the connection to the TEA detector remains open to avoid overpressure. When the ethyl acetate has reached reflux temperature, a vacuum is applied very carefully and at the same time the connection to the TEA detector is resealed. The vacuum builds up throughout the system and reaches 2 to 4 mmHg when the system is in equilibrium. The zero position of the TEA detector is set to 10% of the full scale of the integrator/recorder.
Über das Septum werden nacheinander 0,5 ml gereinigtes Wasser, 2 ml verdünnte Bromwasserstoffsäure und anschließend nochmals 2 ml verdünnte Bromwasserstoffsäure zugesetzt, wobei zwischen jedem Einspritzen die Rückkehr des Integrators/Schreibers auf die Grundlinie verifiziert wird. Nachdem die Reaktanten in den Kolben eingespritzt sind, wartet man die Rückkehr auf die Grundlinie ab und spritzt 50 µl Eichprobe oder Probe ein. Zwischen jedem Einspritzen wartet man die Rückkehr auf die Grundlinie ab. Bei den Bestimmungen liegen 5 Proben zwischen 2 Eichproben, und man verfährt so, daß der gesamte Vorgang nicht mehr als 60 min dauert.Add 0.5 ml of purified water, 2 ml of dilute hydrobromic acid and then another 2 ml of dilute hydrobromic acid via the septum, verifying the return of the integrator/recorder to the baseline between each injection. After the reactants have been injected into the flask, wait The return to the baseline is measured and 50 µl of calibration sample or sample is injected. Between each injection, the return to the baseline is waited for. In the determinations, there are 5 samples between 2 calibration samples and the entire procedure is carried out in such a way that it does not take more than 60 minutes.
Die Menge an N-NO, in ppb, wird nach der folgenden Formel berechnet:The amount of N-NO, in ppb, is calculated using the following formula:
N-NO in ppb = Fläche Probe x Cs x 0,05 x 44 x 1000/Fläche Eichprobe x 0,05 x 0,1 x 130,2N-NO in ppb = area of sample x Cs x 0.05 x 44 x 1000/area of calibration sample x 0.05 x 0.1 x 130.2
worin bedeuten:where:
- Cs: Konzentration der Eichprobe in ppm NDPA (0,0588 oder 0,149 oder 1 ppm)- Cs: concentration of the calibration sample in ppm NDPA (0.0588 or 0.149 or 1 ppm)
- 0,05: (Zähler) entnommene Mende der Eichprobe (ml)- 0.05: (counter) quantity of calibration sample taken (ml)
- 44: Molekulargewicht N-NO- 44: Molecular weight N-NO
- 1000: Umrechnungsfaktor ppm in ppb- 1000: Conversion factor ppm to ppb
- 0,05: (Nenner) entnommene Menge der Probe (ml)- 0.05: (denominator) amount of sample taken (ml)
- 0,1: entnommene Menge der Probe in Gramm- 0.1: amount of sample taken in grams
- 130,2: Molekulargewicht NDPA.- 130.2: Molecular weight of NDPA.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
In einem Reaktionsgefäß werden 20 kg Heparin-Natrium, das aus der Darmschleimhaut von Schweinen stammt, mit gereinigtem Wasser so gelöst, daß eine Endkonzentration von etwa 10,3 % (M/V) erreicht wird. Der pH-Wert der Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure auf 2,5 eingestellt.In a reaction vessel, 20 kg of heparin sodium, which comes from the intestinal mucosa of pigs, is dissolved with purified water to achieve a final concentration of about 10.3% (M/V). The pH of the solution is adjusted to 2.5 with concentrated hydrochloric acid.
In das Reaktionsgefäß werden 572 g Natriumnitrit gegeben, wobei der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 2,5 gehalten wird.572 g of sodium nitrite are added to the reaction vessel, keeping the pH at 2.5 with concentrated hydrochloric acid.
Die Reaktion der Depolymerisation wird mit einem Kaliumiodid-Stärke-Papier verfolgt. Die Reaktion ist beendet, wenn der Test negativ verläuft. Der pH-Wert der Reaktionslösung wird mit konzentriertem Natriumhydroxid auf 10 eingestellt; dann werden 200 g Natriumborhydrid zugegeben. Man rührt 15 h und stellt dann den pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 3,5 bis 4 ein, um den Überschuß an Borhydrid zu vernichten. Durch Zusatz von konzentriertem Natriumhydroxid wird dann der pH-Wert auf 7 eingestellt. Anschließend wird durch Zusatz von 2 Volumina Ethanol pro Volumen der wäßrigen Lösung gefällt. Man läßt absetzen und entfernt die überstehende wäßrig-alkoholische Lösung. Der Niederschlag wird in 400 1 gereinigtem Wasser gelöst. Dieser Lösung wird Natriumchlorid zugesetzt, bis eine Leitfähigkeit von etwa 20000 µS/cm erreicht wird. Danach wird der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf etwa 4 eingestellt, und der Lösung wird unter Rühren 1 Volumen absolutes Ethanol zugesetzt. Man läßt etwa 60 h absetzen und entfernt anschließend die überstehende wäßrig-alkoholische Lösung. Man erhält so das Nadroparin in Form des Natriumsalzes.The depolymerization reaction is monitored using potassium iodide-starch paper. The reaction is complete when the test is negative. The pH of the reaction solution is adjusted to 10 with concentrated sodium hydroxide; then 200 g of sodium borohydride are added. Stir for 15 hours and then adjust the pH to 3.5 to 4 with concentrated hydrochloric acid to destroy the excess borohydride. The pH is then adjusted to 7 by adding concentrated sodium hydroxide. The mixture is then precipitated by adding 2 volumes of ethanol per volume of the aqueous solution. The mixture is allowed to settle and the supernatant aqueous-alcoholic solution is removed. The precipitate is dissolved in 400 l of purified water. Sodium chloride is added to this solution until a conductivity of about 20,000 µS/cm is reached. The pH is then adjusted to about 4 with concentrated hydrochloric acid and 1 volume of absolute ethanol is added to the solution while stirring. The mixture is allowed to settle for about 60 hours and the supernatant aqueous-alcoholic solution is then removed. This gives nadroparin in the form of the sodium salt.
Der Niederschlag wird nun in gereinigtem Wasser so gelöst, daß eine Lösung von etwa 18 % (M/V), bezogen auf die Menge von anfänglich eingesetztem Heparin-Natrium, erhalten wird; der pH-Wert wird mit konzentriertem Natriumhydroxid auf 7 eingestellt. Die Lösung wird mit einem System filtriert, das mit Filterkartuschen einer Porosität von 0,2 µm ausgestattet ist. Der das Nadroparin-Natrium enthaltenden filtrierten Lösung wird eine Probe entnommen, die nicht nach dem in Schritt B beschriebenen Verfahren (Behandlung mit UV-Strahlung) behandelt wird. Diese Probe wird als "Vergleichsprobe" bezeichnet.The precipitate is then dissolved in purified water to obtain a solution of approximately 18% (W/V) based on the amount of heparin sodium initially used; the pH is adjusted to 7 with concentrated sodium hydroxide. The solution is filtered using a system equipped with filter cartridges with a porosity of 0.2 µm. A sample is taken from the filtered solution containing the nadroparin sodium, which is not treated according to the procedure described in step B (treatment with UV radiation). This sample is called the "control sample".
Zur Behandlung mit UV-Strahlung wird eine Katadyn-Röhre vom Typ JRL-50 mit einem Nutzinhalt von 750 ml verwendet. Die verwendete Wellenlänge beträgt 254 nm. Der Durchsatz wird unter Verwendung von gereinigtem Wasser mit einer Peristalikpumpe vorab geeignet eingestellt (4800 ml/h), um bei einem Durchgang ohne Rückführung eine Dauer der gesamten UV- Exposition von etwa 9 min zu erhalten. Danach wird die zu behandelnde Lösung von Nadroparin-Natrium zugesetzt, und der Kreislauf wird mit gereinigtem Wasser gewaschen, bis das behandelte Produkt vollständig in dem Behälter wiedergewonnen ist, der am Ausgang der Katadyn-Röhre JR1-50 angebracht ist.For UV treatment, a Katadyn tube of the JRL-50 type with a useful capacity of 750 ml is used. The wavelength used is 254 nm. The flow rate is suitably pre-adjusted (4800 ml/h) using purified water with a peristaltic pump in order to obtain a total UV exposure time of about 9 minutes in a non-recirculating pass. The nadroparin sodium solution to be treated is then added and the circuit is washed with purified water until the treated product is completely recovered in the container placed at the outlet of the Katadyn JR1-50 tube.
Die im vorhergehenden Schritt erhaltene Nadroparin-Lösung wird an einer anionischen Säule (0,5 1/kg eingesetztes Heparin-Natrium) gereinigt. Die Leitfähigkeit der gesammelten Lösung wird mit Natriumchlorid auf 10000 bis 20000 µS/cm eingestellt; anschließend werden 1,5 Volumina Ethanol zugesetzt. Man läßt für etwa 41 h absetzen und entfernt dann den Überstand.The nadroparin solution obtained in the previous step is chromatographed on an anionic column (0.5 1/kg of heparin sodium used) The conductivity of the collected solution is adjusted to 10,000 to 20,000 µS/cm with sodium chloride; then 1.5 volumes of ethanol are added. The solution is allowed to settle for about 41 hours and the supernatant is then removed.
Der Niederschlag wird in gereinigtem Wasser gelöst (C = 18 % (M/V), bezogen auf die Menge des eingesetzen Heparin- Natriums), und es wird Calciumchlorid-Hexahydrat zugesetzt (9,63 g/g eingesetztes Heparin-Natrium). Durch Zusatz von 1,5 Volumina Ethanol wird anschließend eine ethanolische Fällung durchgeführt. Der Schritt der Salzbildung mit calciumchlorid-Hexahydrat und der Schritt der Reinigung durch ethanolische Fällung wird wiederholt. Der erhaltene Niederschlag wird bei einer Temperatur von höchstens 60 ºC getrocknet.The precipitate is dissolved in purified water (C = 18% (M/V) based on the amount of heparin sodium used) and calcium chloride hexahydrate is added (9.63 g/g of heparin sodium used). An ethanolic precipitation is then carried out by adding 1.5 volumes of ethanol. The step of salt formation with calcium chloride hexahydrate and the step of purification by ethanolic precipitation are repeated. The precipitate obtained is dried at a temperature not exceeding 60 ºC.
Man erhält so Probe 1.This gives sample 1.
Die in Schritt A erhaltene "Vergleichsprobe" wird ebenso nach dem unter Schritt C beschriebenen Verfahren behandelt, wonach die "Vergleichsprobe" von Nadroparin-Calcium isoliert wird.The "control sample" obtained in step A is also treated according to the procedure described in step C, after which the "control sample" of nadroparin calcium is isolated.
An einer Analysenprobe von Probe 1 und der "Vergleichsprobe" von Nadroparin-Calcium werden physikochemische Analysen und Bestimmungen durchgeführt, um ihre biologische Aktivität zu bestimmen.Physicochemical analyses and determinations are carried out on an analytical sample of Sample 1 and the "reference sample" of nadroparin calcium to determine their biological activity.
Die verschiedenen Ergebnisse sind in den Tabellen I und II angegeben. Tabelle I Physikochemische Versuche Art des Versuchs Probe 1 (UV-Behandlung) Vergleichsprobe (ohne UV-Behandlung) Gruppen N-NO freie Sulfatgruppen pH-Wert der 5%igen Lösung freie NH&sub2;-Gruppen Gewichtsmittel der Molekülmasse (Mn) Zahlenmittel der Molekülmasse (Mn) Molekulargewicht (MG) am Peak Uneinheitlichkeit Tabelle II Biologische Versuche Art des Versuchs Probe 1 (UV-Behandlung) Vergleichsprobe (ohne UV-Behandlung) Anti-Faktor-Xa-Aktivität Anti-Faktor-IIa-AktivitätThe different results are given in Tables I and II. Table I Physicochemical tests Type of test Sample 1 (UV treatment) Control sample (without UV treatment) Groups N-NO Free sulphate groups pH of the 5% solution Free NH₂ groups Weight average molecular mass (Mn) Number average molecular mass (Mn) Molecular weight (MW) at peak Non-uniformity Table II Biological tests Type of test Sample 1 (UV treatment) Control sample (without UV treatment) Anti-factor Xa activity Anti-factor IIa activity
Die in den Tabellen 1 und II angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit UV keinerlei Veränderung des Nadroparins hervorruft, da die verschiedenen physikochemischen und biologischen Eigenschaften der Probe 1, wie das Chromatogramm des Produkts, der Gehalt der verschiedenen Verunreinigungen, die Anti-Faktor-Xa-Aktivität und die Anti- Faktor-IIa-Aktivität sind mit einer Ausnahme mit den Eigenschaften der nicht mit UV-Strahlung behandelten Vergleichsprobe identisch sind. Der Gehalt an Gruppen N-NO der nicht behandelten Vergleichsprobe ist etwa 60 mal höher als der Gehalt an Gruppen N-NO der Probe 1, die der Behandlung mit UV-Strahlung unterzogen wurde.The results given in Tables 1 and II show that the UV treatment does not cause any alteration of the nadroparin, since the various physicochemical and biological properties of Sample 1, such as the chromatogram of the product, the content of the various impurities, the anti-factor Xa activity and the anti-factor IIa activity, are identical to those of the control sample not treated with UV radiation, with one exception. The content of N-NO groups of the non-treated control sample is about 60 times higher than the content of N-NO groups of Sample 1 subjected to UV radiation treatment.
Die Ergebnisse der Analyse durch elektronenparametrische Resonanz bestätigten im übrigen, daß die Behandlung mit UV- Strahlung keine Freisetzung freier Radikale hervorruft.The results of the electron parametric resonance analysis also confirmed that treatment with UV radiation does not cause the release of free radicals.
In einem Reaktionsgefäß werden 250 g Heparin-Natrium, das aus der Darmschleimhaut von Schweinen stammt, mit gereinigtem Wasser so gelöst, daß eine Endkonzentration von etwa 10,3 % (M/V) erhalten wird. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 2,5 eingestellt. 9,49 g Natriumnitrit werden dann in das Reaktionsgefäß gegeben, wobei der pH-Wert auf 2,5 gehalten wird. Die Reaktion der Depolymensation wird mit einem Kaliumiodid-Stärke-Papier verfolgt; die Reaktion ist beendet, wenn der Test negativ verläuft. Der pH-Wert der Reaktionslösung wird mit konzentriertem Natriumhydroxid auf 10 bis 10,5 eingestellt, und anschließend werden 2,5 g Natriumborhydrid zugesetzt. Man beläßt das Gemisch 15 h unter Rühren und stellt dann den pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 3,5 bis 4 ein, um den Überschuß an Borhydrid zu vernichten. Durch Zusatz von konzentriertem Natriumhydroxid wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Dann fällt man durch Zusatz von 2 Volumina Ethanol pro Volumen Lösung. Man läßt den Niederschlag absetzen und entfernt den Überstand. Man erhält so CY 222 in Form des Natriumsalzes. Das so erhaltene Produkt enthält 3000 bis 10000 ppb Gruppen N-NO (Ergebnisse von 3 Präparaten).In a reaction vessel, 250 g of heparin sodium, which is derived from the intestinal mucosa of pigs, is dissolved with purified water to give a final concentration of about 10.3% (m/v). The pH is adjusted to 2.5 with concentrated hydrochloric acid. 9.49 g of sodium nitrite are then added to the reaction vessel, keeping the pH at 2.5. The depolymerization reaction is monitored using potassium iodide-starch paper; the reaction is complete when the test is negative. The pH of the reaction solution is adjusted to 10 to 10.5 with concentrated sodium hydroxide, and then 2.5 g of sodium borohydride are added. The mixture is left stirring for 15 hours and then the pH is adjusted to 3.5 to 4 with concentrated hydrochloric acid to destroy the excess borohydride. The pH is adjusted to 7 by adding concentrated sodium hydroxide. The mixture is then precipitated by adding 2 volumes of ethanol per volume of solution. The precipitate is allowed to settle and the supernatant is removed. CY 222 is thus obtained in the form of the sodium salt. The product thus obtained contains 3000 to 10000 ppb N-NO groups (results from 3 preparations).
Der Niederschlag aus dem vorhergehenden Schritt wird in gereinigtem Wasser so gelöst, daß eine Endkonzentration von etwa 10 % (M/V) bezogen auf die Menge an eingesetztem Heparin-Natrium, erhalten wird; der pH-Wert wird dann mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 7 eingestellt. Nachdem der Durchsatz der Pumpe eingestellt wurde, wird die so erhaltene Lösung an einem UV-Bestrahlungssystem von 254 nm (System Katadyn JR1-50, mit einer 16 W-Lampe versehen) vorbeigeleitet. Die Dauer der Bestrahlung mit UV-Strahlung beträgt 9 bis 15 min.The precipitate from the previous step is dissolved in purified water to obtain a final concentration of about 10% (m/v) based on the amount of heparin sodium used; the pH is then adjusted to 7 with hydrochloric acid or sodium hydroxide. After adjusting the pump flow rate, the solution thus obtained is passed through a 254 nm UV irradiation system (Katadyn JR1-50 system, equipped with a 16 W lamp). The UV irradiation time is 9 to 15 minutes.
Die nach der Behandlung mit UV-Strahlung erhaltene Lösung wird an einer chromatographiesäule gereinigt, die mindestens 2 1 anionisches Harz pro Kilogramm eingesetztes Heparin-Natrium enthält. Die Leitfähigkeit der gereinigten Lösung wird mit Natriumchlorid auf 30 bis 35 mS/cm eingestellt; der pH-Wert wird mit Salzsäure auf 7 eingestellt. Anschließend werden 2 Volumina Ethanol pro Volumen wäßrige Lösung zugesetzt. Man läßt den Niederschlag absetzen und entfernt den Überstand Der Niederschlag wird in gereinigtem Wasser so gelöst, daß eine Endkonzentration von 20 % (M/V), bezogen auf die Menge des anfänglich eingesetzten Heparin-Natriums, erhalten wird; die Leitfähigkeit der Lösung wird mit Natriumchlorid auf 30 bis 35 mS/cm eingestellt, und der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure oder konzentriertem Natriumhydroxid auf 7 bis 7,5 eingestellt. Man führt dann eine Fällung der Lösung mit 2 Volumina absolutem Ethanol durch und läßt absetzen. Man gewinnt den Niederschlag, wäscht mit Ethanol und trocknet ihn bei einer Temperatur von höchstens 60 ºC. Auf diese Weise wird reines CY 222 erhalten, das als Natriumsalz eines depolymerisierten Heparins, das durch Depolymerisation von Heparin aus der Darmschleimhaut von Schweinen mit salpetriger Säure erhalten wurde, definiert ist und folgende Eigenschaften aufweist:The solution obtained after treatment with UV radiation is purified on a chromatography column containing at least 2 l of anionic resin per kilogram of heparin sodium used. The conductivity of the purified solution is adjusted to 30-35 mS/cm with sodium chloride and the pH is adjusted to 7 with hydrochloric acid. 2 volumes of ethanol per volume of aqueous solution are then added. The precipitate is allowed to settle and the supernatant is removed. The precipitate is dissolved in purified water to give a final concentration of 20% (M/V) relative to the amount of heparin sodium initially used. The conductivity of the solution is adjusted to 30-35 mS/cm with sodium chloride and the pH is adjusted to 7-7.5 with concentrated hydrochloric acid or concentrated sodium hydroxide. The solution is then precipitated with 2 volumes of absolute ethanol and allowed to settle. The precipitate is collected, washed with ethanol and dried at a temperature not exceeding 60 ºC. In this way, pure CY 222 is obtained, which is defined as the sodium salt of a depolymerised heparin obtained by depolymerising heparin from the intestinal mucosa of pigs with nitrous acid and has the following properties:
- die überwiegende Molekülmasse liegt im Bereich von 1700 bis 2200 Da, 90% der Bestandteile besitzen eine Molekülmasse im Bereich von 1000 bis 8000 Da,- the predominant molecular mass is in the range of 1700 to 2200 Da, 90% of the components have a molecular mass in the range of 1000 to 8000 Da,
- der überwiegende Teil der Bestandteile weist am nichtreduzierenden Ende eine 2-O-Sulfo-α-L-idopyranosuronsäure- Struktur und am reduzierenden Ende eine 6-O-Sulfo-2,5- anhydro-D-mannit-Struktur auf,- the majority of the components have a 2-O-sulfo-α-L-idopyranosuronic acid structure at the non-reducing end and a 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitol structure at the reducing end,
- der Sulfatierungsgrad beträgt 2,1,- the degree of sulfation is 2.1,
- die Anti-Faktor-Xa-Aktivität beträgt 60 - 80 IU/mg,- the anti-factor Xa activity is 60 - 80 IU/mg,
- die Anti-Faktor-IIa-Aktivität ist nicht größer als 25 IU/mg,- the anti-factor IIa activity is not greater than 25 IU/mg,
- der Gehalt an Gruppen N-NO liegt unter 50 ppb.- the content of N-NO groups is less than 50 ppb.
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Owner name: SANOFI-SYNTHELABO, PARIS, FR |
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| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: SANOFI-AVENTIS, PARIS, FR |
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| R082 | Change of representative |
Ref document number: 623629 Country of ref document: EP Representative=s name: BEETZ & PARTNER PATENT- UND RECHTSANWAELTE, DE |