DE69333088T2

DE69333088T2 - Humanisierte antikörper gegen fc rezeptoren für immunglobulin g auf menschlichen mononuklearen phagozyten

Info

Publication number: DE69333088T2
Application number: DE69333088T
Authority: DE
Inventors: R. Philip TEMPEST; William J. Harris; J. Frank CARR
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1992-11-04
Filing date: 1993-11-04
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2013-11-05
Also published as: AU694723B2; US6500931B1; CA2148578A1; JPH08506481A; GB9223377D0; EP0668924B1; DE69333088D1; CA2148578C; EP0668924A1; JP3888643B2; ATE244766T1; AU5542894A; WO1994010332A1; DK0668924T3

Description

Grundlagen
Humane Fcγ-Rezeptoren (Fcγ) (ein Überblick ist in Fanger, M. W. et al. (1989) Immunology Today 10: 92–99 gegeben), von denen es drei strukturell und funktionell verschiedene Typen gibt (d. h. FcγRI, FcγRII, FcγRIIn, sind gut charakterisierte Zelloberflächen-Glycoproteine, die Phagocytose oder Antikörper-abhängige Cytotoxizität (ADCC) von Immunglobulin G (IgG) opsonierten Zielen vermitteln. Es sind Antikörper hergestellt worden, die gegen FcγR aus verschiedenen Gründen gerichtet sind, z. B. Zielen von Immunotoxinen auf einen bestimmten Ziel-Zelltyp, oder szintigraphische Darstellung eines bestimmtem Ziel-Zelltyps. Die Antikörper sind typischerweise murine Antikörper gewesen.
Marine monoklonale Antikörper sind manchmal für humantherapeutische Anwendungen erwünscht, weil die Antikörper in großen Mengen gereinigt werden können und frei von verunreinigenden Humanpathogenen, wie beispielsweise das Hepatitis-Virus oder humane Immunschwäche-Virus, sind. Marine monoklonale Antikörper sind in manchen Humantherapien eingesetzt worden, allerdings sind aufgrund der Entwicklung einer Immanantwori auf „fremde" murine Proteine die Ergebnisse nicht immer die erwünschten. Die Immunantwort ist als eine humane anti-Maus Antikörper oder HAMA-Antwori bezeichnet worden (Schroff, R. et al., (1985), Cancer Res. 45, 879–885) und ist ein Zustand, der Serumkrankheit im Menschen auslöst und zu einer raschen Entfernung der murinen Antikörper aus dem menschlichen Blutkreislauf führt. Es ist gezeigt worden, dass die Immunantwort im Menschen sowohl gegen die variable als auch konstante Region des murinen Immunglobulins gerichtet ist.
Die rekombinante DNA-Technologie hat die Möglichkeit eröffnet, Antikörper mittels Ersetzen spezifischer Immunglobulin-Regionen von einer Spezies durch Immunglobulin-Regionen von einer anderen Spezies zu verändern. Neuberger et al. (Patentanmeldung nach Vertrag über die Zusammenarbeit auf dem Gebiet des Patentwesens, Nr. PCT/GB85/00392 – WO 86/01533) beschreiben ein Verfahren, womit die komplementären variablen Domänen der schweren und leichten Kette eines IgG-Moleküls von einer Spezies mit den komplementären konstanten Domänen der schweren und leichten Kette des Ig von einer anderen Spezies kombiniert werden können. Dieses Verfahren kann angewandt sein, um die Domänen der murinen konstanten Region zu ersetzen, um einen „chimären" Antikörper zu erschaffen, der in der Humantherapie verwendet werden kann. Ein wie von Neuberger et al. beschrieben hergestellter Antikörper besäße den Vorteil, dass er die humane Fc-Region für eine effiziente Stimulation der Antikörper-vermittelten Effektor-Funktionen wie beispielsweise Komplementbindung besäße, hätte aber noch immer das Potenzial, eine Immunantwort im Menschen gegen die murinen („fremde") variablen Regionen auszulösen.
Winter (Britische Patentanmeldung, Nummer GB2188538A) beschreibt ein Verfahren zur Veränderung von Antikörpern durch Substitution der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) mit denjenigen einer anderen Spezies. Dieses Verfahren kann zur Substitution der CDRs von den murinen Domänen der variablen Region von einem monoklonalen Antikörper mit erwünschten Bindungseigenschaften (zum Beispiel für ein Humanpathogen) in humane Domänen der schweren und leichten Kette der variablen Region des Ig angewandt sein. Diese veränderten variablen Regionen des Ig können dann mit konstanten Regionen von humanem Ig kombiniert werden, um Antikörper zu schaffen, die bis auf die substituierten murinen CDRs in der Zusammensetzung vollständig human sind. Die von Winter beschriebenen „neugeformten" oder „humanisierten" Antikörper lösen verglichen mit chimären Antikörpern aufgrund der beträchtlich verringerten murinen Komponenten eine beträchtlich verminderte Immunantwort in Menschen aus. Außerdem sollte die Halbwertzeit der veränderten Antikörper im Blutkreislauf die Halbwertzeit der natürlichen Antikörper erreichen. Allerdings führt, wie Winter es darlegte, das bloße Ersetzen der CDRs durch komplementäre CDRs von einem anderen Antikörper, der für ein Antigen wie beispielsweise ein virales oder bakterielles Protein spezifisch ist, nicht immer zu einem veränderten Antikörper, der die erwünschte Bindungskapazität beibehält. In der Praxis wechselwirken manche Aminosäuren im Gerüst der variablen Region des Antikörpers mit den Aminosäure-Resten, die die CDRs bilden, so dass Aminosäüre-Substitutionen in den variablen Regionen des humanen Ig wahrscheinlich zur Wiederherstellung der Antigenbindung erforderlich sein können.
EP-A-0.255.249 zeigt monoklonale Maus-Antikörper gegen einen humanen FCγ-Rezeptor und die Herstellung bispezifischer Moleküle, enthaltend die bereits erwähnten monoklonalen Maus-Antikörper an anti-Ziel Antikörper gebunden. Präziser, diese Patentbeschreibung legt monoklonale Antikörper und bispezifische Moleküle offen, die einen Fc-Rezeptor erkennen und binden, z. B. ein FcγR (z. B. FcγRI (CD64), FcγRII oder FcγRIII), der auf der Oberfläche einer Effektorzelle, zum Beispiel ein Makrophage, an einer Stelle vorhanden ist, die nicht von dem Fc- Rezeptor eines endogenen Immunglobulins gebunden ist. Die bispezifischen Moleküle beinhalten zusätzlich einen zweiten Teil, der an ein Ziel-Epitop, z. B. eine Krebszelle oder ein Mikroorganismus, bindet. Die Patentbeschreibung legt außerdem Effektorzellen offen, umfassend eine an das oben beschriebene bispezifische Molekül gebundene Effektorzelle, so dass die Effektorzelle mit dem Ziel-Epitop in Kontakt gebracht ist. Therapeutische und prophylaktische Anwendungen der monoklonalen Antikörper, bispezifischen Moleküle und Effektorzellen sind offengelegt.
Riechmann et al. in Nature, 332, 1988, Seite 323–327, legt humanisierte Antikörper gegen das CAMPATH-1 Antigen offen, das ein mit dem Fcγ-Rezeptor vollkommen nicht verwandtes Antigen ist, und Verfahren zur Herstellung der zuvor erwähnten humanisierten Antikörper.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft für einen Fc-Rezeptor (FcR) spezifische humanisierte Antikörper. Die humanisierten Antikörper besitzen wenigstens einen Teil einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR), die von einem nichthumanen Antikörper, z. B. murinen, abstammt, wobei die übrigen Teile menschlichen Ursprungs sind. Die Verwendung eher humanisierter Antikörper als muriner Antikörper in der Humantherapie sollte einige der mit der Verwendung von einigen murinen monoklonalen Antikörpern einhergehenden Schwierigkeiten vermindern, da nur die substituierten CDRs für das Immunsystem eines Humanwirts fremd sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung für einen FcR spezifischer humanisierter Antikörper als Bestandteile von Heteroantikörpern, bifiunktionalen Antikörpern oder Immunotoxinen. Der für einen FcR spezifische humanisierte Antikörper kann auf die selbe Weise und für die selben Zwecke wie sein entsprechendes murines Gegenstück verwendet sein. Zum Beispiel kann der humanisierte anti-Fc-Rezeptor-Antikörper dieser Erfindung zur Behandlung von Krebs, Allergien und Infektionsen und Autoimmunkrankheiten verwendet sein. Diagnostische Anwendungen der Antikörper umfassen ihre Verwendung in Assays auf FcRI-Levels und Assays auf Substanzen, die FcR-Levels beeinflussen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 vergleicht die Aminosäure-Sequenz von murinem 022 VH (SEQ ID NR: 3) mit der Aminosäwure-Sequenz von humanisierter auf NEWM basierender VH (022 NMVH (SEQ ID NR: 1) und humanisierter auf KOL basierender VH (022 KLVH (SEQ ID NR: 2).
2 vergleicht die Aminosäure-Sequenz von murinem 022 VK (022 MUVK) (SEQ ID NR: 28) mit humanisierter auf REI basierender VK (022 HuVK) (SEQ ID NR: 4).
3 ist eine Darstellung des Vektors, der für Expression des Gens der humanisierten oder chimären 022 schweren Kette verwendet ist.
4 ist eine Darstellung des Vektors, der für Expression des Gens der humanisierten oder chimären 022 kappa Kette verwendet ist.
5 zeigt die Bindung der Test-Antikörper in dem Enzym-gebundenen Immunoassay, der im Beispiel beschrieben ist.
Genaue Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanisierten Antikörper, der für einen Fc-Rezeptor spezifisch ist. Der humanisierte Antikörper ist aus einem humanem Antikörper mit wenigstens einem Teil einer komplementaritäts bestimmenden Region (CDR), die von einem nicht-humanem Antikörper abstammt, gebildet. Der Teil ist so ausgewählt, dass er dem humanen Antikörper eine Spezifität für einen humanen Fc-Rezeptor verleiht. Der humanisierte Antikörper hat CDRs, die von einem nicht-humanem Antikörper abstammen, und die übrigen Teile des Antikörper-Moleküls sind menschlichen Ursprungs.
Der Antikörper kann ein vollständiges Antikörper-Molekül mit vollständiger schwerer und leichter Kette oder ein beliebiges Fragment davon, z. B. Fab oder (Fab')₂ Fragment, sein. Der Antikörper kann außerdem ein Dimer der leichten oder schweren Kette oder ein beliebiges minimales Fragment davon sein, wie beispielsweise ein Fv oder ein Einzelketten-Konstrukt, wie es in Ladneret al. (U. S. Patent, Nr. 4.946.778, erteilt am 7. August 1990) beschrieben ist.
Der humane Antikörper der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger humaner Antikörper sein, der nicht-humane CDRs zu behalten vermag. Der bevorzugte humane Antikörper stammt von bekannten Proteinen NEWM und KOL für variablen Regionen der schweren Kette (VHs) und REI für variable Regionen der Ig kappa Kette (VKs) ab. Diese Proteine sind detailliert in den Beispielen unten beschrieben.
„Komplementaritätsbestimmende Region" (CDR) ist eine in der Technik bekannte Ausdrucksform und die zum Nachweis der CDRs innerhalb der beschriebenen Sequenzen angewandte Technik ist ebenfalls eine herkömmliche Technik.
Der Teil der nicht-humanen CDR, der in den humanen Antikörper inseriert ist, ist so ausgewählt, dass er hinreichend ist, ein Binden des humanisierten Antikörpers an den Fc-Rezeptor zu erlauben. Ein hinreichender Teil kann durch Inserieren eines Teils der CDR in den humanen Antikörper und Testen der Bindungskapazität des geschaffenen humanisierten Antikörpers unter Anwendung des Enzym-gebundenen Festphasen-Immunoassays (ELISA), der in den Beispielen unten beschrieben ist, ausgewählt sein.
Alle CDRs eines bestimmten humanen Antikörpers können durch wenigstens einen Teil einer nicht-humanen CDR ersetzt sein oder nur einige der CDRs können durch nicht-humane CDRs ersetzt sein. Es ist nur notwendig, die Anzahl an CDRs, die für ein Binden des humanisierten Antikörpers an den Fc-Rezeptor erforderlich sind, zu ersetzen. Die als Beispiel dienende nicht-humane CDR stammt von einem murinen Antikörper ab, insbesondere stammt die CDR von einem monoklonalen Antikörper (mAk), mAk 22, ab. Der mAk 22 Antikörper ist für den Fc-Rezeptor spezifisch und ist außerdem in der U.S. Patentanmeldung, Nr. 07/151.450, jetzt US-A-4.954.617 und US-A-5.635.600, und in Fanger et al. (US Patent, Nr. 4.954.617, erteilt am 4. September 1990) beschrieben.
Die CDRs stammen von einem nicht-humanen Antikörper ab, der für einen humanen Fc-Rezeptor spezifisch ist. Die CDRs können von bekannten Fc-Rezeptor-Antikörpern abstammen wie beispielsweise diejenigen, die in Fanger et al., Patentanmeldung und erteiltes Patent oben genannt, (nachstehend Fanger et al.) diskutiert sind. Die CDR kann von einem Antikörper abstammen, der an den Fc-Rezeptor an einer Stelle bindet, die nicht von humanem Immunglobulin G blockiert wird. Der Antikörper kann ebenfalls für den Hochaffinitäts-Fc-Rezeptor für humanes Immunglobulin G spezifisch sein. Beispiele für Antikörper, von denen die nichthumanen CDRs abstammen können, sind mAk 32 und mAk 22. Die humanisierten mAk 22 Antikörper produzierende Zelllinie ist bei der American Type Culture Collection am 4. November 1992 unter der Bezeichnung HA022CL1 hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer CRL 11177.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls bifunktionale Antikörper oder Heteroantikörper mit wenigstens einer humanisierten Antigenbindungsregion, die von einem humanisierten anti-Fc-Rezeptor-Antikörper abstammt, und wenigstens einer Antigenbindungregion, die für ein Ziel-Epitop spezifisch ist. Die humanisierte Antigenbindungsregion kann von einem wie oben beschriebenen humanisierten anti-Fc-Rezeptor-Antikörper abstammen. Bifunktionale und Heteroantikörper mit einem für einen Fc-Rezeptor spezifischen Antikörper-Teil sind detailliert in Fanger et al., US 4.954.617 beschrieben.
Es sollte zu verstehen sein, dass die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung auf die selbe Weise verwendet sein können, z. B. wie Bestandteile von Immunotoxinen oder Heteroantikörpern, wie ihre entsprechenden nicht-humanisierten Gegenstücke, wie es von Fanger et al. (US-A-4.954.617) beschrieben ist. Die humanisierten Antikörper besitzen außerdem die gleichen Anwendungsmöglichkeiten wie ihre nicht-humanisierten Gegenstücke.
Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann mit einem beliebigen Verfahren hergestellt sein, das in der Lage ist, wenigstens einen Teil einer CDR eines humanen Antikörpers durch eine CDR zu ersetzen, die von einem nichthumanen Antikörper abstammt. Winter beschreibt ein Verfahren, das zur Herstellung der humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung angewandt sein kann (UK Patentanmeldung GB 2188638A, eingereicht am 26. März 1987). Die humanen CDRs können durch nicht-humane CDRs unter Verwendung einer Oligonucleotidortsspezifischen Mutagenese, wie unten in den Beispielen beschrieben, ersetzt sein.
Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann, wie in der kurzen Erläuterung unten beschrieben, hergestellt sein. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung ist in den Beispielen angegeben. Es ist zu verstehen, dass ein Fachmann in der Lage ist, bekannte herkömmliche Techniken durch die unten beschriebenen Techniken zu ersetzen, um dadurch die selben Ergebnisse zu erzielen. Die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit dem folgenden Verfahren hergestellt sein:

(a) Konstruktion mit Hilfe herkömmlicher Techniken eines Expressionsvektors, enthaltend ein Operon mit einer DNA-Sequenz, die eine schwere Kette eines Antikörpers codiert, in der die CDRs und diejenigen minimalen Teile der Gerüstregion der variablen Domäne, die für das Beibehalten der Antikörperbindungsspezifität erforderlich sind, von einem nicht-humanen Immunglobulin abstammen, und die übrigen Teile der Antikörper-Kette von einem humanen Immunglobulin abstammen, wobei dadurch der Vektor der Erfindung hergestellt ist;
(b) Konstruktion mit Hilfe herkömmlichen Techniken eines Expressionsvektors, enthaltend ein Operon mit einer DNA-Sequenz, die eine leichte Kette eines Antikörpers codiert, in der die CDRs und diejenigen minimalen Teile der Gerüstregion der variablen Domäne, die für das Beibehalten einer Bindungsspezifität des Donor-Antikörpers erforderlich sind, von einem nicht-humanen Immunglobulin abstammen, und die übrigen Teile der Antikörper-Kette von einem humanen Immunglobulin abstammen, wobei dadurch der Vektor der Erfindung hergestellt ist
(c) Transfektion des Expressionsvektors in eine Wirtszelle mit Hilfe herkömmlicher Techniken, um die transfizierte Wirtszelle der Erfindung herzustellen: und
(d) Kultivierung der transfizierten Zelle mit Hilfe herkömmlicher Techniken, um den veränderten Antikörper der Erfindung herzustellen.

Die Wirtszelle kann mit den beiden Vektoren der Erfindung cotransfiziert sein, wobei der erste Vektor ein Operon enthält, das ein von der leichten Kette abstammendes Polypeptid codiert, und der zweite Vektor ein Operon enthält, das ein von der schweren Kette abstammendes Polypeptid codiert. Die beiden Vektoren enthalten verschiedene selektierbare Marker, aber sonst sind sie bis auf die schwere und leichte Kette des Antikörpers codierenden Sequenzen vorzugsweise identisch, um soweit wie möglich eine gleiche Expression der Polypeptide der schweren und leichten Kette sicherzustellen. Alternativ kann ein einziger Vektor verwendet sein, wobei der Vektor die Sequenzen enthält, die die Polypeptide sowohl der leichten als auch schweren Kette codieren. Die für die leichte und schwere Kette codierenden Sequenzen können cDNA oder genomische DNA oder beides umfassen.
Die für die Expression des veränderten Antikörpers der Erfindung verwendete Wirtszelle kann entweder eine Bakterienzelle, wie beispielsweise Escherichia coli, oder eine eukaryotische Zelle sein. Insbesondere kann eine Säugerzelle eines für diesen Zweck wohl definierten Typs wie beispielsweise eine Myelomzelle oder eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters verwendet sein.
Die allgemeinen Verfahren, mit denen die Vektoren der Erfindung konstruiert sein können, Transfektionsverfahren, die zur Herstellung der Wirtszelle der Erfindung erforderlich sind, und Kultivierungsverfahren, die zur Herstellung des Antikörpers der Erfindung von derartigen Wirtszellen erforderlich sind, sind herkömmliche Techniken. Ebenso können die humanisierten Antikörper der Erfindung, sobald sie hergestellt sind, gemäß Standardverfahren der Technik, einschließlich Querstrom-Filtration, Ammoniumsulfat-Fällung, Säulen-Affinitätschromatographie, Gel-Elektrophorese und ähnlichen, gereinigt werden.
Es ist zu verstehen, dass die humanisierten Antikörper dieser Erfindung die selben Leistungen zeigen, die ähnlich oder gleich derjenigen von nicht-humanisierten Versionen der selben Antikörper sind. Bemerkenswert ist ebenfalls, dass die humanisierten Antikörper dieser Erfindung für die Entwicklung und Synthese entweder von Peptid- oder Nichtpeptid-Verbindungen (Mimetika) verwendet sein können, die für die gleiche Therapie wie der Antikörper zweckdienlich wären (Saragobi et al., Science 253: 792–795 (1991)), wobei der Inhalt durch Quellenangabe als eingefügt gilt.
Die folgenden Beispiele dienen als nähere Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sollten keinesfalls als Beschränkung zu verstehen sein.
BEISPIELE
Die in den folgenden Beispielen erforderlichen Restriktions- und Modifikationsenzyme, Plasmide und anderen Reagenzien und Materialien wurden aus kommerziellen Quellen erhalten, außer anderes ist angegeben.
In den folgenden Beispielen, außer anderes ist angegeben, war die gesamte rekombinante DNA-Methodologie durchgeführt, wie in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1982) Eds. T. Maniatis et al., herausgegeben von Cold Spring Harbor Press Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben.

In den nachfolgenden Beispielen wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

dCTP	Desoxycytidintriphosphat
dATP	Desoxyadenosintriphosphat
dGTP	Desoxyguanosintriphosphat
dTTP	Desoxythymidintriphosphat
DTT	Dithiothreitol
C	Cytosin
A	Adenin
G	Guanin
T	Thymin
PBS	Phosphat-gepufferte Saline
PBST	Phosphat-gepufferte Saline mit 0,05% Tween 20^® (pH 7,5)

Beispiel 1- Herstellung von humanisierten Antikörpern, die für einen Fc-Rezeptor spezifisch sind
Die Quelle der Donor-CDRs, die zur Herstellung des humanisierten Antikörpers verwendet wurde, war der murine monoklonale Antikörper mAk 22, der für den Fc-Rezeptor spezifisch ist. Eine mAk 22 Hybridom-Zelllinie (022WCL-1) wurde etabliert. Cytoplasmatische RNA wurde aus der mAk 22 Zelllinie unter Anwendung des von Favoloro et al. (Methods in Enzymology 65, 718–749 (1980)) beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die cDNA wurde unter Verwendung von Primern für Igel und konstante kappa Region synthetisiert. Der Primer CG1FOR wurde für die variable Region der schweren Kette (VH) verwendet und der Primer CK2FOR wurde für die Ig kappa Kette der variablen Region (VK) verwendet. Die cDNA-Synthese-Reaktionsmischungen bestanden aus 1 μg RNA, 0,5 μM CG1FOR oder CK2FOR, jeweils 250 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 mM Tris HCl (pH 7,5), 75 mM KCl, 10 mM Dithiothreitol, 3 mM MgCl₂ und 20 μ RNAguard^® (von Pharmacia, Milton Keynes, U. K. erworben) in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die Proben wurden zwei Minuten auf 72°C erhitzt und langsam auf 37°C gekühlt. Moloney-Maus-Leukämie-Virus reverse Transcriptase (100 μl- von Life Technologies, Paisley, U. K. erworben) wurde zu den Proben gegeben und die Transcriptase enthaltenden Proben wurden 60 Minuten bei 42°C inkubiert.
VH und VK cDNAs wurden dann unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion, wie von Saiki et al. beschrieben Science 239, 487–491 (1988)), amplifiziert. Die in den obigen Schritten verwendeten Primer waren die folgenden:
Die zwecks Erleichterung der Klonierung in die Primer eingefügten Restriktionsstellen sind unterstrichen.
Die PCR-Amplifikation muriner Ig DNA wurde unter Anwendung der von Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833–3838 (1989) beschriebenen Methodologie ausgeführt. Für eine PCR-Amplifikation von VH bestanden die DNA/Primer-Mischungen aus RNA/cDNA Hybrid (10 μl) und je 25 pmol CG1FOR und SHIBACK oder SH2BACK. Für eine PCR-Amplifikation von VK bestanden die DNA/Primer-Mischungen aus RNA/cDNA Hybrid (10 μl) und je 25 pmol CH2FOR und VK1BACK, VK5BACK, VK6BACK, VK7BACK. dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 250 μM), 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 60 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (w/v) Gelatine, 0,01% (v/v) Tween 20, 0,01% (v/v) NP40 und 2,5 μ Amplitaq (von Cetus, Beaconsfield, U. K. erworben) wurden zu den Proben in einem Endvolumen von 50 μl gegeben. Die Proben wurden 25 bis 30 thermischen PCR-Cyclen mit 94°C 30 Sekunden, 55°C 30 Sekunden, 72°C eine Minute und einem Endschritt von fünf Minuten bei 72°C unterzogen.
Die amplifizierten VH und VK cDNAs wurden auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt laufen gelassen und mittels Elutip-d^® Säulenchromatographie (von Schleicher und Schüll, Anderman, Walton, U. K. erworben) für Klonierung und Sequenzierung gereinigt. Die gereinigten VH cDNAs wurden mit Eco I oder Pst I und Hind III geschnitten und in M13mp18 und mp19 (von Pharmacia, Milton Keynes, U. K. erworben) kloniert. Die gereinigten VK cDNAs wurden mit Pvu II oder Eco I und Hind III geschnitten und in M13mp18 und mp19 kloniert. Für allgemeine Methodologien zur Klonierung siehe Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Die resultierende Klon-Sammlung wurde mit dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung von T7 DNA-Polymerase (von Pharmacia, Milton Keynes, U. K. erworben) sequenziert, wie von Sauger et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1979)).
Von den Sequenzen der 022 VH und VR Domänen wurden die CDR-Sequenzen unter Bezugnahme auf die Datenbank von Kabat et al. („Sequences of Proteins of Immunological Interest" US Departement of Health and Human Services, US Government Printing Office) bestimmt und für ein Computer-gestütztes Alignment mit anderen VH und VK Sequenzen verwendet.
Transfer der murinen 022 CDRs an humane Gerüste wurde mittels Oligonucleotid-ortsspezifische Mutagenese erreicht, wie von Nakamaye et al. beschrieben (Nucleic. Acids. Res. 14, 9679–9687 (1986)). Die Primer waren wie folgt:
Der Primer für NMVHCDR1 wurde erweitert, um eine Änderung der NEWM Reste Ser 27 Thr 28 zu Phe 27 Ile 28 zu enthalten. Der Primer für NMVHCDR2 wurde erweitert, um eine Änderung des NEWM Restes Val 71 zu Arg 71 zu enthalten.
Die für Mutagenese von VHs eingesetzten DNA-Templates umfassten humane Gerüstregionen von dem kristallographisch aufgeklärten Protein NEW, von Saul et al. beschrieben (J. Biol. Chem. 53, 585–597 (1978)), oder KOL, von Schmidt et al. beschrieben (Z. Physical. Chem. 364, 713–747 (1974)). Die für Mutagenese von VKs eingesetzten DNA-Templates umfassten humane Gerüstregionen von dem kristallographisch aufgeklärten Protein REI, von Epp et al. beschrieben (Eur. J. Biochem. 45, 513–524 (1974)).
Die auf M13 basierenden Templates M13VHPCR1 (für NEWMVH), M13VHPCR2 (für KOLVH) und M13VKPCR2 (für REIVK), die humane Gerüstregionen mit irrelevanten CDRs umfassen, wurden, wie von Riechmann et al beschrieben (Nature 332, 323–327 (1988)), hergestellt. Oligonucleotid-ortsspezifische Mutagenese wurde nach dem folgenden Protokoll ausgeführt. Ein fünffach molarer Überschuss eines jeden phosphorylierten mutagenen Oligonucleotids wurde zusammen mit dem universellen M13 Sequenzierungsprimer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT) (SEQ ID NR: 24) zugegeben. Alle Primen wurden in 20 μl 0,1 M TrisHCl (pH 8,0) und 10 mM MgCl₂ mittels 2 Minuten Erhitzen auf 70– 85°C und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur reassoziiert. 10 mM DTT, 1 mM ATP, jeweils 40 μM dATP, dCTP, dGTP und dTT, 2,5 μ T7 DNA-Polymerase (von United States Biochemicals erworben) und 0,5 μ T4 DNA-Ligase (von Life Technologies, Paisley, U. K. erworben) wurde zu der reassoziierten DNA in 30 μl Reaktionsvolumen gegeben und ein bis zwei Stunden bei 22°–37°C inkubiert. Der neu erweiterte und ligierte Strang wurde über den elterlichen Strang in einer thermostabilen DNA-Polymerase gesteuerten Reaktion unter Verwendung des M13 reversen Sequenzierungsprimers (5'-AACAGCTATGACCATG) (SEQ m NR: 25) bevorzugt amplifiziert. Der reverse Sequenzierungsprimer ist zum elterlichen Strang nicht komplementär. Die 50 μl Reaktionsmischung enthielt 1 μl Extensions/Ligationsprodukt, 25 pmol M13 reverser Sequenzierungsprimer, jeweils 250 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 μ Vent DNA-Polymerase (von New England Biolabs, Bishop's Stortford, U. K. erworben) oder 2,5 μ Amplitaq (von Cetus, Beaconsfield, U. K. erworben) in dem geeigneten Puffer, der vom Enzymhersteller geliefert ist, und wurde dann 30 thermischen Cyclen von 94°C, 30 s, 55°C, 30 s, 75°C oder 72°C, 90 s, und einem Endschritt von 5 min bei 72°C unterzogen. Ein 4 μl Aliquot dieser Probe wurde dann mittels PCR unter Verwendung von M13 universellem und reversem Sequenzierungsprimer in einer 50 μl Reaktionsmischung, enthaltend 25 pmol von jedem Primen, jeweils 250 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 2,5 μ Amplitaq (Cetus) in Puffer des Enzymherstellers, amplifiziert. Amplifizierte DNAs wurden mit HindIII und BamHI verdaut und in M 13mp 19 kloniert und sequenziert.
Mutagenese des M13VHPCR2 KOL VH-Restes Leu71 zu Arg71 erfolgte mit dem Überlappungs/Extensions-PCR-Verfahren von Ho et al. Gene 77, 51–55 (1989)). Die verwendeten überlappenden Oligonucleotide waren 5'-TTTACAATATCGAGACAACAGCAA (SEQ ID NR: 26) und 5'-TTGCTGTTGTCTCTCGATTGTAAA (SEQ ID NR: 27).
Die Aminosäwe-Sequenzen der humanisierten Antikörper wurden mit den bekannten murinen Antikörpern, wie in 1 und 2 gezeigt, verglichen. Die durch CDR ersetzten VH und VK Gene wurden in Expressionsvektoren pSVgpt und pSVhyg, wie in 3 und 4 gezeigt und von Orlandi et al. beschrieben (oben zitiert), kloniert. Die durch CDR ersetzten NEWMVH und KOLVH Gene wurden zusammen mit dem Promotor der Ig schweren Kette, geeigneten Spleißstellen und Signalpeptid-Sequenzen mittels Verdau mit HindIII und BamI aus M13 geschnitten und in den pSVgpt Expressionsvektor, enthaltend den Enhancer der murinen Ig schweren Kette, das gpt-Gen für Selektion in Säugerzellen und Gene für Replikation und Selektion in E. coli, kloniert. Das Plasmid enthält ebenfalls eine konstante Region des humanen IgGI, wie von Takahashi et al. beschrieben (Cell 29, 671–675 (1982)). Die Konstruktion des Expressionsvektors der kappa Kette war im Wesentlichen gleich, außer dass das gpt-Gen durch das Hygromycin-Resistenzgen ersetzt war und eine humane konstante kappa Region enthält (Hieter et al, Cell 22, 197–207 (1980)).
Ungefähr jeweils 5 μg von jedem Expressionsvektor der schweren Kette und 10 μg Expressionsvektor der kappa Kette wurden mit PvuI verdaut. Die DNAs wurden zusammengemischt, mit Ethanol gefällt und in 25 μl Wasser gelöst. Ungefähr 5–10 × 10⁶ NSO-Zellen (von der European Collection of Animal Cell Cultwes, Porton Down, U. K.) wurden bis zur Semikonfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) plus 10% fötales Kälberserum (Mycoclone plus, Gibco, Paisley, Scotland) angezogen, mittels Zentrifugation geerntet und in 0,5 ml DMEM zusammen mit der verdauten DNA in einer Küvette resuspendiert. Nach fünf Minuten in Eis erhielten die Zellen einen einzigen 170 V Puls mit 960 μF (Gene-Pulser^®, Bio-Rad, Richmond, CA) und wurden weitere 20 Minuten in Eis gelassen. Die Zellen wurden dann in 20 ml DMEM + supplementiert mit 10% FCS gegeben und durften 24 bis 48 Stunden regenerieren. Nach dieser Zeit wurden die Zellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen verteilt und Selektivmedium (DMEM, 10% FCS, 0,8 μg/ml Mycophenolsäure und 250 μg/ml Xanthin) wurde zugegeben. Nach drei bis vier Tagen wurden Medium und tote Zellen entfernt und durch frisches Selektivmedium ersetzt. Transfizierte Klone waren 10 Tage später mit bloßem Auge zu erkennen.
Das Vorhandensein von humanem Antikörper im Medium der Vertiefungen, die gpt+ Transfektanten enthielten, wurde unter Verwendung herkömmlicher Techniken mit Enzym-gebundenem Festphasen-Immunoassay (ELISA) gemessen. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Immolon^®, Dynatech, Chantilly, VA) wurden mit 100 ng Ziege anti-human IgG Antikörpern (SeraLab, Crawley, Down, U. K.) in 100 μl 50 mM Carbonat-Puffer, pH 9,6, beschichtet. Nach Waschen mit PBST (Phosphat-gepufferter Saline pH 7,2 mit 0,05% Tween 20) wurde Kulturmedium in 100 μl PBST (5–50 μl) zu jeder Vertiefung 1 Stunde bei 37°C gegeben. Die Vertiefungen wurden dann geleert, mit PBST gewaschen und 100 μl einer 1 : 1000 Verdünnung von Peroxidase-konjugierten Ziege anti-human konstante kappa Region Antikörpern (SeraLab, Crawley, Down, U. K.) wurde 1 Stunde bei 37°C zugegeben. Die Vertiefungen wurden geleert, mit PBST gewaschen und 100 μl OPD Substrat- Puffer (400 μg/ml Q-Phenylendiamin in 24 mM Citrat/42 mM Natriumphosphat, pH 5, und 0,0003% (v/v) H₂O₂) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde nach wenigen Minuten durch Zugabe von 12,5% H₂SO₄ (25 μl) gestoppt und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen.
Die Antikörper sezernierenden Zellen wurden vermehrt und der Antikörper wwde aus dem Kulturmedium mittels Protein A Affinitätschromatographie gereinigt, wie von Harlow and Laue beschrieben (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Das Binden der Antikörper an Antigen wurde mit ELISA gemessen. Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Immolon 1^®, Dynatech, Chantilly, VA) wurden mit 200 ng Ziege anti-human IgM Antikörpern (SeraLab, Crawley, Down, U. K.) in 100 μl 50 mM Carbonat-Puffer, pH 9,6, mindestens 1 Stunde bei 37°C beschichtet. Die Vertiefungen wurden geleert und einmal mit PBST gewaschen und mit 1% BSA in PBS bei Raumtemperatur 30 Minuten blockiert. Die Vertiefungen wurden geleert und mit PBST gewaschen und FcRI/IgM-Fusionsprotein enthaltende Cos-Überstand wurde zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Vertiefungen wurden dann geleert und dreimal mit PBST gewaschen und die Test-Antikörper, verdünnt in 1% BSA/PBS, wurden zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zusätzlich enthielt jede Vertiefung 2 μg human IgGI, lambda Antikörper (Sigma, Poole, U. K.). Die Vertiefungen wurden dann geleert, dreimal mit PBST gewaschen und 40 ng Peroxidase Ziege anti-human konstante kappa Region Antikörper (SeraLab, Crawley, Down, U. K.) in 100 μl 1% BSA/PBS zu jeder Vertiefung gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen geleert, dreimal mit PBST gewaschen und 10 μl HPD-Substrat-Puffer wwde zugegeben. Die Reaktion wwde durch Zugabe von 25 μl 12,5% H₂SO₄ zu jeder Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bei 492 nm gemessen und ist in 5 gezeigt. Die Test-Antikörper waren der irrelevante CDRs enthaltende Antikörper (AA), der vollständig humanisierte auf KOL/REI-basierende Antikörper (KLVHR/HuVK), die Mischungen und Paarungsderivate des humanisierten Antikörpers (KLVHR/MuVK und MuVH/HuVK), der humanisierte auf NEWM/REIbasierende Antikörper (NMVK/HuVK) und der chimäre Antikörper (MuVH/MuVK).
Entsprechungen
Der Fachmann erkennt viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungsformen der hier beschriebenen Erfindung oder vermag diese nur mit Routineexperimenten festzustellen. Derartige Entsprechungen sind beabsichtigt und von den nachfolgenden Ansprüche umfasst.
SEQUENZ-LISTE

Claims

Ein für einen Fc-Rezeptor spezifischer humanisierter Antikörper, umfassend einen humanen Antikörper mit mindestens einem Teil einer komplementaritätsbestimmenden Region, die von einem nicht-humanen, z. B. murinen Antikörper, abstammt, wobei der Teil ausgewählt ist, eine Spezifität des humanisierten Antikörpers für einen humanen Fc-Rezeptor bereitzustellen, und worin besagter Teil von dem humanisierten Antikörper abstammt, der von dem Hybridom mit ATCC Nummer CRL11177 produziert wird.
Der Antikörper nach Anspruch 1, worin der Teil ausgewählt ist, eine Spezifität für einen humanen Fc-Rezeptor bereitzustellen, so dass der gebildete humanisierte Antikörper an den Fc-Rezeptor an einer Stelle bindet, die nicht von humanem Immunglobulin G blockiert ist und z. B. ausgewählt ist, eine Spezifität des humanisierten Antikörpers für den Hochaffinitäts-Fc-Rezeptor für humanes Immunglobulin G bereitzustellen.
Der Antikörper nach Anspruch 1, worin der humane Antikörper von Proteinen abgeleitet ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus NEWM, KOL, REI und Kombinationen davon.
Ein bifunktionaler Antikörper oder Heteroantikörper, umfassend: mindestens eine humanisierte Antigenbindungsregion, die von einem humanisierten anti-Fc-Rezeptor-Antikörper abstammt, worin besagte Region von dem humanisierten Antikörper abstammt, der von dem Hybridom mit ATCC Nummer CRL11177 produziert wird, und mindestens eine Antigenbindungsregion, die für ein Ziel-Epitop spezifisch ist.
Der Antikörper nach Anspruch 4, worin die humanisierte Antigenbindungsregion von einem humanisierten anti-Fc-Rezeptor-Antikörper abstammt, die so ausgewählt ist, dass das Binden des humanisierten Antikörpers an den humanen Fc-Rezeptor nicht von humanem Immunglobulin G blockiert ist und z. B. der humanisierte anti-Fc-Rezeptor-Antikörper für den Hochaffinitäts-Fc-Rezeptor für humanes Immunglobulin spezifisch ist.
Humanisierte 22 NSO Zelllinie; ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11177.
Ein humanisierter Antikörper, umfassend: (a) eine Antigenbindungsregion, umfassend (i) mindestens einen Teil einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) von einer schweren oder einer leichten Kette eines für einen humanen Fc-Rezeptor spezifischen murinen Antikörpers; und (ü) diejenigen minimalen Teile der Gerüstregion der variablen Domäne des murinen Antikörpers, die zur Beibehaltung der Bindungsspezifität des murinen Antikörpers erforderlich sind, worin die variable Region von besagter schwerer Kette die in SEQ ID NR: 1 oder 2 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst und die variable Region von besagter leichter Kette die in SEQ ID NR 4: gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst; und (b) Gerüstregionen der variablen Domäne von der schweren und leichten Kette eines humanen Antikörpers, worin besagter humanisierter Antikörperähnliche biologische Wirkungen nach Binden an den humanen Fc-Rezeptor wie seine monoklonale Entsprechung induziert.
Der Antikörper nach Anspruch 7, worin besagter mindestens eine Teil einer komplementaritätsbestimmenden Region von einer schweren oder leichten Kette vom murinen Antikörper von einem nicht-humanen Antikörper abstammt, z. B. mAk (mab) 22, der von der Zelllinie mit ATCC Hinterlegungsnummer CRL11177 produziert wird.
Der Antikörper nach Anspruch 7, der von dem Hybridom mit ATCC Hinterlegungsnummer CRL11177 produziert wird.
Ein für einen humanen Fc-Rezeptor spezifischer humanisierter Antikörper, umfassend eine variable Region der schweren Kette, umfassend eine Aminosäure-Sequenz, die aus der in SEQ II) NR: 2 gezeigten Sequenz besteht, und eine variable Region der leichten Kette, umfassend die in SEQ m NR: 4 gezeigte Aminosäure-Sequenz.
Ein bifunktionaler Antikörper oder Heteroantikörper, umfassend: mindestens eine humanisierte Antigenbindungsregion, umfassend (a) mindestens einen Teil einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) von einer schweren oder einer leichten Kette eines murinen Antikörpers, worin die variable Region von besagter schwerer Kette aus einer in SEQ m NR: 1 oder 2 gezeigten Aminosäure-Sequenz besteht und die variable Region von besagter leichter Kette die in SEQ ID NR: 4 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst; und für einen humanen Fc-Rezeptor spezifisch ist; und (b) diejenigen minimalen Teile der Gerüstregion der variablen Domäne des murinen Antikörpers, die zur Beibehaltung der Bindungsspezifität des murinen Antikörpers erforderlich sind; und Gerüstregionen der variablen Domäne der schweren und leichten Kette eines humanen Antikörpers, worin besagte humanisierte Antigenbindungsregion ähnliche biologische Wirkungen nach Binden an den humanen Fc-Rezeptor wie ihre monoklonale Entsprechung induziert, und mindestens eine Antigen-Bindungsregion, die für ein auf einer Ziel-Zelle vorhandenes Antigen spezifisch ist.
Ein bifunktionaler Antikörper oder Heteroantikörper, umfassend: einen für einen humanen Fc-Rezeptor spezifischen humanisierten Antikörper, umfassend eine variable Region einer schweren Kette, die aus einer in SEQ ID NR: 1 gezeigten Aminosäure-Sequenz und der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Sequenz besteht, und eine variable Region einer leichten Kette, die die in SEQ ID NR: 4 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst; und eine Antigenbindungsregion, die für ein auf einer Ziel-Zelle vorhandenes Antigen spezifisch ist.
Ein bifunktionaler Antikörper oder Heteroantikörper, umfassend: humanisierten Antikörper, der von dem Hybridom mit ATCC Hinterlegungsnummer CRL11177 produziert wird; und eine Antigenbindungsregion, die für ein auf einer Ziel-Zelle vorhandenes Antigen spezifisch ist.