DE69331550T2 - Klonierung und expression von biologisch aktiver alpha-galaktosidase a - Google Patents

Klonierung und expression von biologisch aktiver alpha-galaktosidase a

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Description

    1. EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung biologisch aktiver humaner α-Galactosidase (α-Gal A), wobei die Herstellung die Klonierung und die Expression der codierenden Gensequenz der α-Gal A in eukaryotischen Expressionssystemen beinhaltet, die eine korrekte posttranslationale Modifizierung und eine korrekte Prozessierung des Expressionsprodukts gewährleisten.
  • Die Erfindung wird hier anhand von Arbeitsbeispielen veranschaulicht, bei denen hohe Spiegel an α-Gal A in Säugetier-Expressionssystemen erzeugt wurden. Das gemäß der Erfindung hergestellte α-Gal-Enzym kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, die Enzymersatztherapie des Fabry-Syndroms, industrielle Prozesse, die die Hydrolyse von α-D-Galactosylresten oder Glycokonjugaten beinhalten, und die Umwandlung des Antigens der Blutgruppe B auf Erythrozyten in das Antigen der Blutgruppe 0 gehören.
    • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In den früher 70iger Jahren zeigten verschiedene Forscher die Existenz von zwei Isoenzymen der α-Galactosidase, die als A und B bezeichnet wurden, und die die α-galactosidischen Bindungen in 4-MU- und/oder p-NP-α-D-Galactopyranosiden hydrolysieren (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237- 249; Romeo et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266; Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; und Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. und Valle, D., Hrsg., S. 1751-1796, McGraw Hill, New York). In Geweben beruhten ungefähr 80%-90% der gesamten Aktivität an α-Gaiactosidase (α-Gal) auf einer thermolabilen, mit Myoinosit hemmbaren Isoform der α-Gal A, während ein relativ thermostabiles Enzym, α-Gal B, für den Rest verantwortlich war. Die zwei "Isozyme" konnten durch Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Ionenaustausch-Chromatographie voneinander getrennt werden. Nach einer Behandlung mit Neuraminidase waren die elektrophoretische Beweglichkeit und die α-Werte der α-Gal A und α-Gal B ähnlich (Kint, 1971; Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644), was zunächst nahe legte, dass die beiden Enzyme zwei unterschiedlich glycosylierte Produkte des gleichen Gens sind. Die Beobachtung, dass die gereinigten Glycoprotein-Enzyme ähnliche physikalische Eigenschaften besaßen, wozu ähnliche Molekulargewichte (~46 Kilodalton), Homodimer-Strukturen und Aminosäure-Zusammensetzungen gehörten, zeigte ebenfalls ihre Strukturverwandtschaft an (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200; Callahan et al., 1973, Biochem. Med. 7: 424-431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411-1417; Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; Kusiak et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184-190; Dean et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001-10005; und Bishop et al., 1980, in Enzyme Therapy in Genetic Disease 2, Desnick, R. J., Hrsg., S. 17-32, Alan R. Liss Inc., New York). Jedoch zeigte der anschließende Nachweis, dass polyklonale Antikörper gegen α-Gal A oder α-Gal-B nicht mit dem jeweils anderen Enzym kreuzreagierten (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200; und Schram et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144), dass bei Hemizygoten mit dem Fabry- Syndrom nur die Aktivität der α-Gal A fehlte (Kint, 1971; Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633- 644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249; Romeo et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266; Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. und Valle, D., Hrsg., S. 1751-1796, McGraw Hill, New York, und Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200), und dass die Gene für α-Gal A und -B auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert waren (Desnick et al., 1989, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C. R., Beaudet, A. L. Sly, W. S. und Valle, D., Hrsg., S. 1751-1796, McGraw Hill, New York; deGroot et al., 1978, Hum. Genet. 44: 305-312) eindeutig, dass diese Enzyme genetisch unterschiedlich waren.
    • 2.1. α-GAL A UND DAS FABRY-SYNDROM
  • Beim Fabry-Syndrom, eine lysosomalen Speicherkrankheit, die aus der fehlenden Aktivität der α-Gal A resultiert, führte die Identifizierung des Enzymdefektes 1967 (Brady et al., 1967, N. Eng. J. Med. 276: 1163) 1969 bzw. 1970 zu den ersten In-vitro- (Dawson et al., 1973, Pediat. Res. 7: 684-690) bzw. therapeutischen In-vivo-Versuchen (Mapes et al., 1970, Science 169: 987), die α-Gal A zu ersetzen. Diese sowie nachfolgende Tests (Mapes et al., 1970, Science 169: 987; Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326 und Brady et. al., 1973, N. Engl. J. Med. 289: 9) zeigten die biochemische Wirksamkeit eines direkten Enzymersatzes bei dieser Krankheit. Hemizygot betroffenen Patienten wurden über einen Zeitraum von vier Monaten wiederholt Injektionen der gereinigten α-Gal A (100 000 U/Injektion) aus der Milz und dem Plasma verabreicht (Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326).
  • Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass a) die Plasma-Clearance der Milzform 7-mal schneller erfolgte als die der Plasmaform (10 min gegenüber 70 min), b) im Vergleich zur Milzform des Enzyms die Plasmaform eine 25-fach höhere Absenkung des Plasma-Substrats über einen ausgeprägt längeren Zeitraum (48 Stunden gegenüber einer Stunde) bewirkte, c) es keine Hinweise auf eine immunologische Reaktion auf sechs Dosen der beiden Formen gab, die intravenös über einen Zeitraum von vier Monaten an zwei betroffene hemizygote Patienten verabreicht worden waren, und d) Hinweise darauf erhalten wurden, dass im Gewebe gespeichertes Substrat nach der Absenkung durch die Plasmaform, aber nicht durch die Milzform des Enzyms, in die Zirkulation abgegeben wurde. Somit führte das zugeführte Enzym nicht nur zu einer Absenkung der Substratform im Kreislauf (einem Hauptort der Akkumulation), sondern sie mobilisierte möglicherweise auch das zuvor gespeicherte Substrat aus anderen Depots in die Zirkulation für eine anschließende Clearance. Diese Studien zeigten das Potenzial für eine Eliminierung oder signifikante Verminderung der pathologischen Glycolipid-Speicherung durch einen wiederholten Enzymersatz.
  • Die biochemische und klinische Wirksamkeit eines Enzymersatzes beim Fabry-Syndrom wurde jedoch aufgrund des Mangels an ausreichenden Mengen des menschlichen Enzyms für adäquate Dosierungen und Langzeituntersuchungen nicht gezeigt.
    • 2.2. DAS α-GAL-A-ENZYM.
  • Das α-Gal-A-Enzym des Menschen hat ein Molekulargewicht von ungefähr 101 000 Da. Bei der SDS-Gelelektrophorese wandert es als eine Bande von ungefähr 49 000 Da, was anzeigt, dass das Enzym ein Homodimer ist (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). Die α-Gal A wird als ein Vorläufer von 50 500 Da synthetisiert, der phosphorylierte, gegenüber Endoglycosidase H empfindliche Oligosaccharide enthält. Dieser Vorläufer wird innerhalb von 3-7 Tagen nach seiner Synthese zu einer reifen Form von ungefähr 46 000 Da prozessiert. Die Zwischenprodukte dieser Prozessierung wurden nicht definiert (Lemansky et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062). Wie viele lysosomalen Enzymen wird die α-Gal A über den Mannose-6-phosphat-Rezeptor in das Lysosom transferiert. Das wird durch die hohe Sekretionsrate dieses Enzyms in Mucolipidose-II-Zellen sowie in Fibroblasten, die mit NH&sub4;Cl behandelt wurden, angezeigt.
  • Vom Enzym wurde gezeigt, dass es 5-15% über Asn verknüpfte Kohlenhydrate enthält (Ledonne et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 224: 186). Von der Gewebeform dieses Enzyms wurde gezeigt, dass sie ~52% Oligosaccharide mit hohem Mannose-Gehalt und 48% Oligosaccharide vom komplexen Typ enthält. Der Typ mit dem hohen Mannose-Anteil co-eluierte bei der Bio-Gel-Chromatographie mit Man&sub8;&submin;&sub9;GlcNAc, während die Oligosaccharide vom komplexen Typ zu zwei Kategorien gehören, die 14 und 19-39 Glucose-Einheiten enthalten. Bei der isoelektrischen Fokussierung werden, in Abhängigkeit von der Quelle des gereinigten Enzyms (Gewebeform oder Plasmaform), viele Formen dieses Enzyms beobachtet. Nach Behandlung mit Neuraminidase wird jedoch nur eine Bande beobachtet (pl = 5,1), was zeigt, dass diese Heterogenität auf unterschiedlichen Ausmaßen der Sialylierung beruht (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). Bei anfänglichen Versuchen, die vollständige für α-Gal A codierende cDNA zu exprimieren, wurden verschiedene prokaryotische Expressionsvektoren eingesetzt (Hantzopoulos und Calhoun, 1987, Gene 57: 159; loannou, 1990, Ph.D. Thesis, City University of New York). Obwohl eine Expression in Mikroorganismen erreicht wurde, wie aus Enzymtests mit intakten E.-coli-Zellen und einem Wachstum auf Melibiose als Kohlenstoffquelle hervorging, wurde das menschliche Protein nur in niedrigen Mengen exprimiert, und es konnte nicht aus den Bakterien gereinigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das rekombinante Enzym aufgrund des Fehlens der normalen Glycosylierung und/oder der Anwesenheit cytoplasmatischer oder periplasmatischer Proteasen instabil war.
    • 2.3. LYSOSOMALE ENZYME: BIOSYNTHESE UND TARGETING
  • Lysosomale Enzyme werden an membrangebundenen Polysomen im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Jedes Protein wird als ein größerer Vorläufer synthetisiert, der ein hydrophobes aminoterminales Signalpeptid enthält. Dieses Peptid interagiert mit einem Signalerkennungsteilchen, einem 11S-Ribonukleoprotein, und initiiert dadurch den vektoriellen Transport des entstehenden Proteins über die Membran des endoplasmatischen Retikulums in das Lumen (Erickson et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 11224; Erickson et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun. 115: 275; Rosenfeld et al., 1982, J. Cell Biol. 93: 135). Lysosomale Enzyme werden durch den En-Block-Transfer eines großen vorgeformten Oligosaccharids, Glucose-3, Mannose-9, N-Acetylclucosamin-2, von einem Lipid-verknüpften Zwischenprodukt auf einen Asn-Rest der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr im entstehenden Polypeptid cotranslational glycosyliert (Kornfeld, R. & Kornfeld, S., 1985, Annu. Rev. Biochem. 54: 631). Im endoplasmatischen Reticulum wird das Signalpeptid abgespalten, und die Prozessierung des Asn-verknüpften Oligosaccharids beginnt mit dem Ausschneiden von drei Glucose-Resten und einer Mannose aus der Oligosaccharid-Kette.
  • Die Proteine bewegen sich über vesikulären Transport in den Golgi-Apparat, wo sie eine Reihe von posttranslationalen Modifizierungen durchlaufen und für das richtige Targeting für spezifische Bestimmungsorte sortiert werden: Lysosomen, Sekretion, Plasmamembran. Während der Bewegung durch den Golgi-Apparat wird die Oligosaccharid-Kette auf sekretorischen und Membran-Glycoproteinen zum Sialinsäure-haltigen komplexen Typ prozessiert. Zwar durchlaufen einige der Oligosaccharid-Ketten auf lysosomalen Enzyme eine ähnliche Prozessierung, aber die meisten durchlaufen eine Reihe anderer Modifizierungen. Die wichtigste Modifikation ist der Erwerb von Phosphomannosyl-Resten, die als essentielle Komponente beim Prozess des Targeting dieser Enzyme in die Lysosomen dient (Kaplan et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2026). Dieser Erkennungsmarker wird durch die aufeinanderfolgende Aktivität von zwei Golgi-Enzymen erzeugt. Zuerst überträgt die N-Acetylglucosaminylphosphotransferase N-Acetylglucosamin-1-phosphat vom Nukleotidzucker Uridindiphosphat-Nacetylglucosamin auf bestimmte Mannose-Reste auf lysosomalen Enzymen, wodurch ein Phosphodiester-Intermediat entsteht (Reitman & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256: 4275; Waheed et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 12322). Dann entfernt die N-Acetylglucosamin-1- phosphodiester-α-N-acetylglucosaminidase den N-Acetylglucosamin-Rest, wodurch das Erkennungssignal Mannose-6-phosphat freigelegt wird (Varki & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256: 9937; Waheed et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 5717).
  • Nach der Erzeugung der Phosphomannosyl-Reste binden die lysosomalen Enzyme an Rezeptoren für Mannose-6-phosphat (M-6-P-Rezeptoren) im Golgi-Apparat. Auf diese Weise bleiben die lysosomalen Enzyme intrazellulär und werden von den Proteinen abgetrennt, die für eine Sekretion bestimmt sind. Der Komplex aus Ligand und Rezeptor verlässt dann über ein Vesikel den Golgi-Apparat und wird dann einer prälysosomalen Verarbeitung zugeführt, wo durch die Ansäuerung des Kompartiments der Liganden abdissoziiert (Gonzalez-Noriega et al., 1980, J. Cell. Biol. 85: 839). Der Rezeptor kehrt dann in den Golgi-Apparat zurück, während die lysosomalen Enzyme zu Vesikeln verpackt werden, wobei sie primäre Lysosomen bilden. Ungefähr 5-20% der lysosomalen Enzyme wandern nicht zu den Lysosomen und werden, vermutlich versehentlich, sekretiert. Ein Teil dieser sekretierten Enzyme kann durch den M-6-P- Rezeptor wieder eingefangen werden, der auf der Zelloberfläche vorkommt, und internalisiert und den Lysosomen zugeführt werden (Willingham et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6967).
  • Es wurden zwei Mannose-6-phosphat-Rezeptoren identifiziert. Ein Glycoprotein von 215 Kilodalton wurde aus verschiedenen Geweben gereinigt (Sahagian et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 4289; Steiner & Rome, 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 681). Die Bindung dieses Rezeptors ist unabhängig von divalenten Kationen. Es wurde noch ein zweiter M-6-P-Rezeptor isoliert, der sich vom Rezeptor von 215 Kilodalton dadurch unterscheidet, dass er divalente Kationen benötigt. Deshalb wird dieser Rezeptor der Kationen-abhängige (M-6-PcD) genannt, während der Rezeptor von 215 Kilodalton der Kationen-unabhängige genannt wird (M-6-PCl). Der M-6-PCD-Rezeptor ist offenbar ein Oligomer aus drei Untereinheiten mit einem Molekül der Untereinheit vom 46 Kilodalton.
    • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Herstellung großer Mengen humaner α-Gal A durch das Klonieren und das Exprimieren der für α-Gal A codierenden Sequenz in Expressionssystemen mit eukaryotischen Wirtszellem. Die hier beschriebenen Expressionssysteme mit Säugetier-Wirtszellen gewährleisten die richtige cotranslationale und posttranslationale Sialylierung, die für die richtige Prozessierung und Sortierung des Expressionsproduktes benötigt wird, so dass ein aktives Enzym erzeugt wird. Ebenfalls beschrieben wird die Expression von Fusionsproteinen der α-Galactosidase A, die leicht gereinigt werden können. Diese Fusionsproteine sind so konstruiert, dass die α-Galactosidase-A-Einheit leicht vom Fusionsprotein abgespalten und gewonnen werden kann.
  • Mittels der hier beschriebenen Verfahren wird die rekombinante α-Gal A von den gentechnologisch veränderten Wirtszellen sekretiert, so dass sie in guter Ausbeute aus dem Kulturmedium gewonnen werden kann. Die gemäß der Erfindung erzeugte α-Gal A kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, die Behandlung des Fabry-Syndroms, die Umwandlung der Blutgruppe B in die Blutgruppe 0 oder beliebige kommerzielle Prozesse gehören, bei denen eine hydrolytische Abspaltung von α-D-Galactosyl-Resten aus Glycokonjugaten vorkommt.
  • Außerdem beschreibt diese Erfindung ein Verfahren, durch das Proteine, die normalerweise intrazellulär vorkommen, überexprimiert und aus rekombinanten Säugetierzelllinien sekretiert werden.
    • 3.1. DEFINITIONEN
  • Die folgenden Begriffe und Abkürzungen, wie sie hier verwendet werden, haben die im Folgenden angegebene Bedeutung:
  • α-Galactosidase A α-Gal A
  • α-N-Acetylgalactosaminidase α-GaINAc
  • Basenpaar(e) bp
  • Chinese hamster ovary CHO
  • komplementäre DNA cDNA
  • Zählereignisse pro Minute cpm
  • Desoxyribonukleinsäure DNA
  • Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium DMEM
  • fötales Kälberserum FCS
  • Kilobasenpaare kb
  • Kilodalton KDa
  • Mannose-6-phosphat M-6-P
  • Methotrexat MTX
  • 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactosid 4-MU-α-Gal
  • 4-Methylumbellifeeryl-α-N-acetylgalactosaminid 4-Mu-α-GaINAc
  • Mikrogramm ug
  • Mikrometer um
  • Nanogramm ng
  • Nanometer nm
  • Nukleotid nt
  • p-Nitrophenyl-α-N-acetylgalactosaminid pNP-α-GaINAc
  • Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAGE
  • Polymerase-Kettenreaktion PCR
  • Ribonukleinsäure RNA
  • Natriumdodecylsulfat SDS
  • Einheiten U
    • 4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1A-1C. Vollständige cDNA-Sequenz der humanen α-Gal. Die aus einer Peptid- Mikrosequenzierung erhaltenen Aminosäuresequenzen der N-terminalen Peptide, Cyanogenbromid-Peptide (CB) und tryptischen Peptide (T) sind durch Unterstreichungen angegeben. Die Unterschiede gegenüber der aus der cDNA vorhergesagten Sequenz sind gezeigt. Die vier vermuteten N-Glycosylierungsstellen sind bezeichnet, und die 3'-Terminationssignale sind durch eine hochgestellte Linie bezeichnet.
  • Fig. 2A-2B. Plasma-Clearance nach der intravenösen Verabreichung an Mäuse der rekombinanten humanen sekretierten α-Galactosidase A, die α2,6-Silalinsäure-Reste (Δ--Δ) enthielt, sowie der nicht-α2,6-sialylierten Glycoform ( -- ), obere Abbildung, im Vergleich mit der Plasma-Clearance dieser Glycoformen nach Behandlung mit saurer Phosphatase. Jeder Punkt stellt den Mittelwert der Werte aus zwei unabhängigen Injektionen dar. Die T1/2-Werte wurden durch Extrapolation abgeschätzt.
  • Fig. 3. Gewebeverteilung verschiedener Formen der rekombinanten humanen sekretierten α-Gal A nach intravenöser Verabreichung an Mäuse. Jeder Punkt stellt den Mittelwert der Werte aus zwei unabhängigen Injektionen dar.
    • 5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung biologisch aktiver α-Gal A durch das Klonieren und Exprimieren der codierenden Nukleotidsequenzen des Enzyms in eukaryotischen Expressionssystemen. Die erfolgreiche Expression und Erzeugung dieses gereinigten biologisch aktiven Enzyms, wie sie hier beschrieben und exemplarisch dargestellt wird, ist aus verschiedenen Gründen besonders bedeutsam. Beispielsweise führten in der Vergangenheit Versuche, die vollständige, für α-Gal A codierende cDNA unter Verwendung verschiedener prokaryotischer Expressionsvektoren zu exprimieren, zur Expression des Enzyms, wie anhand von Enzymtests mit intakten mikrobiellen Wirtszellen und anhand des Wachstums auf Melibiose als Kohlenstoff-Quelle gezeigt wurde. Jedoch wurde das humane Enzym nur in niedrigen Mengen exprimiert und konnte nicht aus den Bakterien gereinigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das in mikrobiellen Systemen exprimierte rekombinante Enzym aufgrund des Fehlens der normalen Glycosylierung und/oder des Vorkommens endogener cytoplasmatischer oder periplasmatischer Proteasen instabil war.
  • Bemühungen, dieses Enzym in eukaryotischen Expressionssystemen zu exprimieren, waren aus verschiedenen Gründen ähnlich schwierig. Die α-Gal A ist ein lysosomales Enzym, das durch ein "Housekeeping"-Gen codiert wird. Das primäre Translationsprodukt wird intensiv modifiziert und prozessiert, was eine komplexe Reihe von Ereignissen erfordert, zu denen eine Abspaltung einer Signalsequenz, eine Glycosylierung, Phosphorylierung und Sialylierung gehören, die nur durch geeignete Wirtszellen bewirkt werden können. Außerdem ist es, da das Expressionsprodukt für das Lysosom bestimmt, das intrazellulär verbleibt, recht überraschend, dass die hier beschriebenen Verfahren die Sekretion eines korrekt prozessierten, biologisch aktiven Moleküls ermöglichen.
  • Die gemäß der Erfindung hergestellte biologisch aktive α-Gal A hat verschiedene Anwendungen, von denen die wahrscheinlich bedeutsamste ihre Verwendung bei der Enzymersatztherapie einer lysosomalen Speicherkrankheit, des Fabry-Syndrom, ist. Beispielsweise kann der Stoffwechseldefekt in kultivierten Fibroblasten von Patienten mit dem Fabry-Syndrom in vitro durch die Zugabe exogener α-Gal A zum Kulturmedium korrigiert werden. Darüber hinaus haben begrenzte klinische Versuche an Menschen die biochemische Wirksamkeit des Enzymersatzes für die Depletierung des zirkulierenden Substrats vor seiner Ablagerung in Gefäßen gezeigt. Jedoch konnten vor der vorliegenden Erfindung keine großen Mengen an biologisch aktiver, gereinigter humaner α-Gal A für eine Verwendung in Ersatztherapien erzeugt werden. Die gemäß der Erfindung erzeugte α-Gal A hat auch verschiedene industrielle Einsatzmöglichkeiten, beispielsweise in beliebigen Prozessen, bei denen die Hydrolyse von α-D-Galactosylglycokonjugaten vorkommt, die Umwandlung der Blutgruppe B in die Blutgruppe 0 etc., wie hier beschrieben wird.
  • Die Erfindung wird, ausschließlich für den Zweck dieser Beschreibung, in die folgenden Abschnitte unterteilt: a) die codierende Sequenz der α-Gal-A; b) die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Expression der für das Enzym codieren Sequenz steuert; c) die Transfektion geeigneter Wirtszellen, die fähig sind, die primären Transkripte zu replizieren, zu translatieren und korrekt zu prozessieren, um so ein biologisch aktives Genprodukt zu exprimieren; und d) die Identifizierung und/oder Reinigung des so erzeugten Enzyms. Nachdem ein Transformant identifiziert wurde, der hohe Spiegel des biologisch aktiven Enzyms exprimiert, umfasst die Durchführung der Erfindung die Vermehrung und die Verwendung dieses Klons zur Herstellung und Reinigung biologisch aktiver α-Gal-A.
  • Die Erfindung wird hier anhand von Beispielen demonstriert, bei denen cDNAs der α-Gal A kloniert und in einem Säugetier-Expressionssystem exprimiert wurden. Es werden auch Modifikationen der codierenden cDNA-Sequenzen beschrieben, die die Ausbeute verbessern und die Reinigung erleichtern, ohne die biologische Aktivität zu beeinträchtigen. Weiterhin werden Modifikationen der Wirtszellen beschrieben, die die Expression sialylierter und einer asialylierter Glycoformen des Enzyms ermöglichen, die beide leicht gereinigt werden können.
  • Verschiedene Aspekte der Erfindung werden genauer in den folgenden Unterabschnitten und in den folgenden Beispielen beschrieben. vorkommt
    • 5.1. DIE FÜR DIE α-GAL A CODIERENDE SEQUENZ
  • Die codierende Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der α-Gal A sind in den Fig. 1A-1C dargestellt. Diese Nukleotidsequenz, oder Fragmente oder funktionelle Äquivalente von ihr, kann bzw. können zur Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle verwendet werden, die die Expression des Enzymproduktes oder funktionell aktiver Peptide oder funktioneller Äquivalente von ihm in geeigneten Wirtszellen steuern.
  • Aufgrund der degenerierten Natur der Nukleotidsequenz können anderen DNA-Sequenzen, die im wesentlichen für die gleichen Aminosäuresequenzen, wie sie in den Fig. 1A-1C dargestellt sind, codieren, bei der Durchführung der Erfindung für das Klonieren und die Expression der α-Gal A eingesetzt werden. Zu derartigen Abwandlungen gehören Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotid-Reste, die zur einer Sequenz führen, die für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt codiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäure-Resten innerhalb der Sequenz aufweisen, die zu einer stummen Veränderung führen, wodurch ein biologisch aktives Produkt erzeugt wird. Derartige Aminosäure-Substitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeiten hinsichtlich der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilie, der amphipathischen Natur der beteiligten Reste und/oder auf der Basis kristallographischer Daten durchgeführt werden. Beispielsweise gehören zu den negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; zu den positiv geladenen Aminosäuren gehören Lysin und Arginin; zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlicher Hydrophilie gehören die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
  • Die codierenden Sequenzen für die α-Gal A können auf bequeme Weise aus genetisch veränderten Mikroorganismen oder Zelllinien erhalten werden, die die für das Enzym codierenden Sequenzen enthalten, wie die hier beschriebenen hinterlegten Ausführungsformen. Alternativ können die genomischen Sequenzen oder die cDNAs der codieren Sequenzen dieser Enzyme aus humanen genomischen oder cDNA-Bibliotheken erhalten werden. Entweder genomische oder cDNA-Bibliotheken können aus DNA-Fragmenten hergestellt werden, die aus menschlichen Zellen gewonnen wurden. Die Fragmente, die für die α-Gal A codieren, können durch das Screenen derartiger Bibliotheken mit einer Nukleotidsonde identifiziert werden, die im wesentlichen komplementär zu einem beliebigen Abschnitt der in Fig. 1A-1C dargestellten Sequenz ist. Tatsächlich können DNA-Sequenzen, die durch die Polymerase-Kettenreaktion erzeugt werden, verknüpft werden, um die vollständige Sequenz zu bilden. Es können zwar Abschnitte der codierenden Sequenzen eingesetzt werden, aber Klone mit der vollständigen Länge, d. h. diejenigen, die die gesamte codierende Region der α-Gal A enthalten, können für eine Expression günstiger sein. Alternativ können die in den Fig. 1A-1C dargestellten codierenden Sequenzen durch die Anfügung von Sequenzen verändert werden, die verwendet werden können, um das Ausmaß der Expression und/oder die Reinigung zu erleichtern.
  • Es können weitere Substrate für eine enzymatische Spaltung sowie Bindungsproteine gentechnologisch in ähnliche Konstrukte zur Erzeugung der α-Gal A eingefügt werden, die leicht gereinigt und in ihrer biologisch aktiven Form freigesetzt werden kann.
  • Es können Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, für die Isolierung der DNA, die Erzeugung der geeigneten Restriktionsfragmente, die Konstruktion von Klonen und Bibliotheken und für das Screenen von Rekombinanten verwendet werden. Bezüglich einer Übersicht über derartige Techniken siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, N. Y., Kapitel 1-18.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung könnte die codierende Sequenz der Fig. 1A-1C als ganzes oder zum Teil unter Verwendung chemischer Verfahren, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden; siehe beispielsweise Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea & Horn, 1980, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucchi & Carruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; und Chow und Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817.
  • Die humane α-Gal A ist ein homodimeres Glycoprotein. Die vollständige cDNA der α-Gal A sagt eine reife Untereinheit von 398 Aminosäuren voraus. Die Aminosäuresequenz zeigt insgesamt eine Homologie von ungefähr 50% mit der humanen α-N-Acetylgalactosaminidase (α-Gal-B). Homologiesuchen in Computer-Datenbanken zeigten kurze Abschnitte einer Homologie der α-Gal A mit den Aminosäure-Sequenzen der Mel-1 der Hefe und der Mel-A von E. coli (siehe Fig. 1D-1F). Es ist wahrscheinlich, dass diese konservierten Regionen für die Enzymkonformation, die Stabilität, die Assoziation der Untereinheiten und/oder die Katalyse wichtig sind. Es wird somit bevorzugt, solche konservierten Bereiche nicht abzuändern. Es können jedoch bestimmte Modifikationen in der codierenden Sequenz vorteilhaft sein. Beispielsweise könnten die vier N-verknüpften Konsensussequenzen für die Glycosylierungs- selektiv weggelassen werden, wodurch die Glycosylierung des Enzyms verändert und die Phosphorylierung, Sialylierung, Sulfatierung usw. betroffen würde. Derartige modifizierte Enzyme können veränderte Eigenschaften hinsichtlich der Clearance und des Targeting haben, wenn sie Fabry- Patienten injiziert werden.
  • Oligosaccharid-Modifikationen können nützlich für das Targeting der α-Gal A für eine effektive Enzymtherapie sein. Einige Beispiele derartiger Modifikationen werden unten detaillierter beschrieben. Frühere Studien zeigten, dass die Plasma-Glycoform der α-Gal A, die höher sialyliert ist als die Milz-Glycoform, bei Fabry-Patien hinsichtlich der Depletierung des toxischen, akkumulierten zirkulierenden Substrates wirkungsvoller war (Desnick et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326-5330). Studien, die die gereinigten Glycoformen des Enzyms aus der Milz und dem Plasma charakterisierten, ergaben nur bezüglich ihrer Oligosaccharid-Einheiten Unterschiede (Desnick et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326-5330). Somit können Bemühungen um ein Targeting des rekombinanten Enzyms für eine wirkungsvolle Behandlung des Fabry-Syndroms durch die Modifikation der N-Glycosylierungsstellen unterstützt werden.
  • Es könnten auch die 5'-untranslatierten und codierenden Bereiche der Nukleotidsequenz verändert werden, um die Translationseffizienz der mRNA der α-Gal A zu verbessern. Beispielsweise könnte der Ersatz des Guanosins in der Position +4 der cDNA der α-Gal A durch ein Cytosin die Translationseffizienz der mRNA der α-Gal A 5- bis 10-fach erhöhen (Kozak, 1987, J. Mol. Biol. 196: 947-950).
  • Außerdem könnten, basierend auf röntgenkristallographischen Daten, Sequenzveränderungen vorgenommen werden, um die Stabilität des Proteins zu verbessern, beispielsweise durch das Einführen von Disulfid-Brücken in den geeigneten Positionen und/oder das Deletieren oder Ersetzen von Aminosäuren, von denen vorhergesagt werden kann, dass sie eine Instabilität des Proteins verursachen. Das sind nur Beispiele von Modifikationen, die gentechnologisch in das α-Gal-A-Enzym eingeführt werden können, um ein aktiveres und stabileres Protein oder mehr Enzymprotein zu erzeugen oder sogar um die katalytische Spezifität des Enzyms zu verändern.
    • 5.2. ERZEUGUNG REKOMBINANTER α-GAL-A
  • Zur Expression einer biologisch aktiven α-Gal A wird die für das Enzym codierende Sequenz, ein funktionelles Äquivalent oder eine modifizierte Sequenz, wie es im Abschnitt 5.1. oben beschrieben wurde, in einen geeigneten Säugetier-Expressionsvektor eingefügt, d. h. einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für eine Transkription und Translation der insertierten codierenden Sequenz in geeigneten Säugetier-Wirtszellen enthält, d. h. Zellen, die die zelluläre Maschinerie und die Elemente für die richtige Prozessierung, d. h. Signalpeptid- Abspaltung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Sialylierung und Protein-Sortierung enthalten. Wenn sie Menschen verabreicht werden sollten diese Expressionsprodukte in den richtigen Geweben wirken und keine schädlichen immunologischen Reaktionen hervorrufen.
    • 5.2.1. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN UND HERSTELLUNG VON TRANSFEKTANTEN
  • Es können Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die codierende Sequenz der α-Gal A sowie geeignete Steuersignale für die Transkription und die Translation enthalten. Zu diesen Verfahren gehören eine Rekombination in vitro und eine genetische Rekombination; siehe z. B. die Techniken, die bei Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., Kapitel 12, beschrieben wurden.
  • Es können verschiedene Säugetier-Expressionssysteme eingesetzt werden, um die für die α-Gal A codierende Sequenz zu exprimieren. Prokaryotische Systeme bieten zwar den klaren Vorteil, dass sie leicht zu manipulieren sind und ohne große Kosten in großem Umfang eingesetzt werden können, aber ihr großer Nachteil bezüglich der Expression der α-Gal A liegt in ihrer Unfähigkeit, die exprimierten Säugetier-Proteine korrekt posttranslational modifizieren zu können. Säugetier-Expressionssysteme ermöglichen eine korrekte Modifizierung. Säugetierzellen, die die zelluläre Maschinerie für das richtige Prozessieren des primären Transkripts, die Glycosylierung, die Phosphorylierung und vorteilhafterweise die Sekretion des Genproduktes besitzen, sollten als Wirtszellen für die Expression der α-Gal A verwendet werden. Zu solchen Wirtszelllinien können, ohne auf sie beschränkt zu sein, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293, WI38 etc. gehören. Alternativ können Wirtszellen, die einen Teil, aber nicht die gesamte zelluläre Maschinerie besitzen, die für die optionale Prozessierung des primären Transkripts und/oder die posttranslationale Prozessierung und/oder die Sekretion des Genproduktes erforderlich ist, modifiziert werden, um die Prozessierungsfähigkeiten der Wirtszelle zu verbessern.
  • Beispielsweise kann eine rekombinante Nukleotidsequenz, die für ein Peptidprodukt codiert, das eine Prozessierungsfunktion ausübt, die die Wirtszelle zuvor nicht ausüben konnte, gentechnologisch in die Wirtszelllinie eingefügt werden. Eine derartige Sequenz kann entweder zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle cotransfiziert werden, oder sie kann in dem rekombinanten Konstrukt enthalten sein, das für das interessierende Gen codiert. Alternativ können Zelllinien, die diese Sequenz enthalten, erzeugt werden, die dann mit dem interessierenden Gen transfiziert werden.
  • Es sollten geeignete Säugetier-Expressionsvektoren verwendet werden, um die Expression der α-Gal A in der gewählten Wirtszelle zu steuern. Beispielsweise könnten wenigstens zwei grundsätzliche Ansätze für das Design von Vektoren auf der Basis des SV40-Systems verfolgt werden. Der erste besteht darin, den frühen Bereich des SV40 durch die interessierenden Gene zu ersetzen, während der zweite darin besteht, den späten Bereich zu ersetzen (Hammarskjold et al., 1986, Gene 43: 41). Vektoren, bei denen der frühe oder der späte Bereich ersetzt sind, können auch in vitro mit der geeigneten SV40-Mutante komplementiert werden, die den frühen oder den späten Bereich nicht aufweist. Eine derartige Komplementierung führt zu Rekombinanten, die in infektiöse Capside verpackt werden und die das α-Gal-A-Gen enthalten. Dann kann eine permissive Zelllinie zur Erzeugung des rekombinanten Proteins infiziert werden. Vektoren auf der Basis des SV40 können auch in Studien zur transienten Expression verwendet werden, wobei die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn die Vektoren in COS-Zellen (CV-1, Origin of SV40), Derivat der CV-1-Zellen (Nierenzellen der Grünen Meerkatze) eingeführt werden, die eine einzige Kopie eines SV40 Genoms mit defektem Origin, das in das Chromosom integriert ist, enthalten. Diese Zellen synthetisieren aktiv das große T-Antigen (SV40), wodurch sie die Replikation eines beliebigen Plasmids, das den Replikationsursprung des SV40 enthält, initiieren.
  • Zusätzlich zum SV40 kann fast jedes molekular klonierte Virus oder Retrovirus als Klonierungs- oder Expressionsvehikel verwendet werden. Virale Vektoren, die auf verschiedenen Retroviren (von Vögeln oder der Maus), Adenoviren, dem Vaccinia-Virus (Cochran et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 19) und dem Polyoma-Virus basieren, können für die Expression verwendet werden. Andere klonierte Viren, wie JC (Howley et al., 1980, J. Virol. 36: 878), BK und die humanen Papillomviren (Heilman et al., 1980, J. Virol. 36: 395) bieten das Potenzial, als eukaryotische Expressionsvektoren eingesetzt zu werden. Beispielsweise kann, wenn Adenovirus-Expressionsvektoren verwendet werden, die für α-Gal A codierende Sequenz mit einem Komplex ligiert werden, der die TranskriptionlTranslation des Adenovirus steuert, beispielsweise der späten Promotorsequenz und der dreiteiligen Leader-Sequenz. Dieses schimärische Gen kann dann mittels In-vitro- oder In-vivo-Rekombination in das Genom des Adenovirus eingefügt werden. Die Insertion in einen nicht-essentiellen Bereich des viralen Genoms (beispielsweise den Bereich E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und imstande ist, das humane Enzym in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3655-3659). Alternativ kann der 7,5- K-Promotor des Vaccinia-Virus verwendet werden (siehe beispielsweise Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931). Besonders interessant sind Vektoren, die auf dem Rinderpapillomvirus basieren (Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 486). Diese Vektoren besitzen die Fähigkeit, als extrachromosomale Elemente zu replizieren. Kurz nach dem Eintritt dieser DNA in Mauszellen vermehrt sich das Plasmid auf ungefähr 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Die Transkription der insertierten cDNA erfordert nicht die Integration des Plasmids in das Chromosom des Wirts, wodurch eine hohe Expression erhalten wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression verwendet werden, indem dem Plasmid ein selektiver Marker eingefügt wird, beispielsweise das neo-Gen. Eine hohe Expression kann auch durch die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie des Metallothionein-IIA-Promotors, des Heat- Shock-Promotors etc. erzielt werden.
  • Für eine langfristige Produktion rekombinanter Proteine in hoher Ausbeute wird eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise kann man gentechnologisch konstruierte Zellen nach der Einführung der fremden DNA 1 bis 2 Tage lang in einem Anreicherungsmedium wachsen lasen und sie dann auf ein selektives Medium umstellen. Statt Expressionsvektoren zu verwenden, die den viralen Replikationsursprung enthalten, können die Wirtszellen mit der α-Gal A oder mit DNA transformiert werden, die durch geeignete Steuerelemente der Expression gesteuert werden (beispielsweise Promotor, Enhancer, Sequenzen, Terminatoren der Transkription, Polyadenylierungsstellen, etc.) sowie einen selektierbaren Marker. Der selektierbare Marker im rekombinanten Plasmid bewirkt eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und unter Ausbildung von Foci zu wachsen, die wiederum kloniert und zu Zelllinien vermehrt werden können. Es können verschiedene Selektionssysteme verwendet werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, die Gene der Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und der Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) gehören, die in tk&supmin;-, hgprt&supmin;- bzw. aprt&supmin;-Zellen eingesetzt werden können. Ebenso kann eine Resistenz gegen Antimetaboliten eingesetzt werden als Basis der Selektion auf die Gene dhfr, das eine Resistenz gegen Methotrexat bewirkt (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, das eine Resistenz gegen Mycophenolsäure bewirkt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; neo, das eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 bewirkt (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); sowie hygro, das eine Resistenz gegen Hygromycin bewirkt (Santerre et al., 1982, Gene 30: 147). Kürzlich wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das es Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, dass es Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047); und ODC (Ornithindecarboxylase), die eine Resistenz gegen den Ornithindecarboxylase-Hemmstoff 2-(Difluormehtyl)-DL-ornithin, DMFO, bewirkt (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.).
    • 5.2.2. IDENTIFIZIERUNG VON TRANSFEKTANTEN ODER TRANSFORMANTEN, DIE DAS α-GAL-A-PRODUKT EXPRIMIEREN
  • Die Wirtszellen, die die für α-Gal A codierende Sequenz enthalten und die das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können über wenigstens vier generelle Ansätze identifiziert werden: a) DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen; c) die Bestimmung des Ausmaßes der Transkription, wie sie anhand der Expression der mRNA-Transkripte der α-Gal A in der Wirtszelle bestimmt wird, und d) den Nachweis des Genprodukts, das mittels eines Immunoassays oder über seine biologische Aktivität gemessen wird.
  • Beim ersten Ansatz wird die Anwesenheit der für α-Gal A codierenden Sequenz im Expressionsvektor durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen, die Nukleotidsequenzen enthalten, die der für α-Gal A codierenden Sequenz homolog sind, wie sie im wesentlich in der Fig. 1A-1C gezeigt ist, oder Teilen oder Derivaten davon.
  • Beim zweiten Ansatz kann das rekombinante System aus Expressionsvektor/Wirt basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter "Markergen"-Funktionen identifiziert werden (beispielsweise der Aktivität der Thymidinkinase, der Resistenz gegenüber Antibiotika, der Resistenz gegenüber Methotrexat, des Transformations-Phänotyps, der Bildung von Einschlusskörpern im Baculovirus etc.). Beispielsweise können, wenn die für α-Gal A codierende Sequenz in eine Sequenz eines Marker-Gens des Vektors insertiert ist, Rekombinanten, die die für die α-Gal A codierende Sequenz enthalten, über das Fehlen der Markergen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen tandemartig zusammen mit der Sequenz der α-Gal A unter die Kontrolle des gleichen oder eines anderen Promotors gebracht werden, der verwendet wird, um die Expression der für die α-Gal A codierenden Sequenz zu steuern. Die Expression des Markers als Reaktion auf eine Induktion oder Selektion zeigt die Expression der für α-Gal A codierenden Sequenz an.
  • Beim dritten Ansatz kann die transkriptionelle Aktivität der für α-Gal A codierenden Region mittels Hybridisierungsassays bestimmt werden. Beispielsweise kann RNA isoliert und durch eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Sonde analysiert werden, die homolog zu einer für die α-Gal A codierenden Sequenz oder speziellen Abschnitte von ihr ist, wie sie im wesentlichen in Fig. 1A-1C gezeigt ist. Alternativ können die gesamten Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und bezüglich einer Hybridisierung mit derartigen Sonden getestet werden.
  • Beim vierten Ansatz kann die Expression des α-Gal-A-Proteinproduktes immunologisch untersucht werden, beispielsweise mittels Western-Blots, Immunoassays wie Radioimmun- Präzipitierung, Enzym-linked Immunoassays und dergleichen. Der letztendliche Test bezüglich eines Erfolges von Expressionssystemen beinhaltet jedoch den Nachweis des biologisch aktiven des α-Gal-A-Genprodukts. Da die Wirtszelle das Genprodukt sekretiert kann das zellfreie Medium, das von den kultivierten transfizierten Wirtszellen erhalten wird, bezüglich einer α-Gal-A-Aktivität untersucht werden. Es können verschiedene Tests verwendet werden, um eine α-Gal-A-Aktivität nachzuweisen, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, gehören: a) Tests, die die synthetischen fluorogenen oder chromogenen α-D-Galactoside wie 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranosid einsetzen (Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Invest. 81: 157); b) Tests, die die radioaktiv markierten oder fluoreszenzmarktierten natürlichen Substrate einsetzen, beispielsweise tritiiertes Globotriaosylceramid oder Pyrendodecanoyl-sphingosin-trihexosid (Bishop und Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307); und c) Tests, die X-α-gal einsetzen.
    • 5.2.3. REINIGUNG DES α-GAL-A-GENPRODUIC S
  • Nachdem ein Klon identifiziert worden ist, der hohe Spiegel der biologisch aktiven α-Gal A produziert, kann der Klon vermehrt und zur Erzeugung großer Mengen des Enzyms verwendet werden, das unter Verwendung von Techniken gereinigt werden kann, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind und zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, eine Immunaffinitätsreinigung, chromatographische Verfahren einschließlich einer Hochleistungsflüssigchromatographie und dergleichen gehören. Da das Enzym durch die kultivierten Zellen sekretiert wird kann die α-Gal A leicht aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
  • Wie in den Arbeitsbeispielen unten demonstriert wird, wurde rekombinante α-Gal A aus dem rohen Medium durch Affinitätschromatographie mit α-GaINH&sub2;-C&sub1;&sub2; Sepharose, gefolgt von einer hydrophoben Chromatographie auf Octyl-Sepharose und einer Gel-Filtration auf einer Superose-6-Säule von 100 cm, gereinigt. Das rekombinante Enzym war nach dem Gelfiltrationsschritt im wesentlichen homogen und zu > 98% rein, wie mittels SDS-PAGE bestimmt wurde.
  • Humane rekombinante α-Gal A wurde aus dem Medium der CHO-Zelllinie DG5.3, von der gezeigt wurde, dass sie den größten Teil des rekombinanten Enzyms sekretiert, bis zur Homogenität gereinigt. Wenn serumfreies Medium verwendet wurde, war das Kulturmedium dieses Klons stark mit α-Gal A angereichert, die mehr als 95% des gesamten extrazellulären Proteins ausmachte. Somit konnte eine Reinigung bis zur Homogenität mit lediglich drei chromatographischen Schritten erreicht werden. Innerhalb von drei Monaten wurde mehr als ein halbes Gramm des Enzyms erzeugt, und ein Teil davon wurde zur Reinigung von 280 mg mit einer Ausbeute von 80% eingesetzt, wobei nur Ausrüstung im Labormaßstab verwendet wurde. Bemerkenswerterweise wies das rekombinante Enzym die volle enzymatische Aktivität auf, mit einer spezifischen Aktivität, die gleich derjenigen des früher gereinigten humanen Enzyms war (Bishop et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta. 525: 399; Bishop und Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). Das rekombinante Enzym war imstande, ein Analoges des natürlichen Substrats Globotriaosylceramid zu erkennen und wirksam zu spalten.
  • Wenn die codierende Sequenz der α-Gal A gentechnologisch so verändert wird, dass sie für ein spaltbares Fusionsprotein codiert, kann die Reinigung der α-Gal A leicht über Affinitätsreinigungstechniken erzielt werden.
  • Im einzelnen wurde die "Overlap-Extension"-Methode (Ho et al., 1989, Gene 77: 51; Kadowaki et al., 1989, Gene 76: 161) eingesetzt, um die vollständige cDNA der α-Gal A mit der Protein-A-Domäne E von Staphylococcus aureus zu fusionieren. Nach der Transfektion durch Elektroporation war die Aktivität der α-Gal A in COS-1-Zellextrakten 6- bis 7-fach erhöht. Außerdem sekretierten die transfizierten Zellen beträchtliche Mengen des Fusionsproteins in das Kulturmedium (400 U/ml). Das sekretierte Fusionsprotein wurde schnell über einen einzigen IgG-Affinitätsreinigungsschritt gereinigt. Das gentechnologische Einfügen einer Konsensussequenz für eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch die Collagenase zwischen diese beiden Polypeptide erleichterte die Spaltung des Fusionsproteins, so dass das gereinigte humane α-Gal-A-Polypeptid leicht über einen zweiten IgG-Reinigungsschritt von der Protein-A- Domäne getrennt werden konnte. Interessant war die Tatsache, dass das Fusionskonstrukt α-Gal-Aktivität behielt, was wahrscheinlich anzeigte, dass das Polypeptid des Enzyms die aktive homodimere Konfiguration bildete, obwohl der Carboxylterminus mit weiteren 56 Resten der Protein-A-Domäne verbunden war. Das COS-1-Zellen, die mit einem α-Gal-A-Konstrukt transfiziert wurden, ähnliche Expressionsspiegel und eine ähnliche Verteilung zwischen den Zellen und dem Medium aufweisen, sieht es so aus, dass die Protein-A-Domäne weder die Faltung noch die richtige Prozessierung dieses lysosomalen Enzyms stört. Außerdem hemmte die Anwesenheit des dimerisierten α-Gal-A-Polypeptids die Bindung der Protein-A-Domäne an die IgG-Affinitätssäule nicht. Die Einfügung der Erkennungssequenz von vier Resten für die Collagenasespaltung zwischen das α-Gal-A- und das Protein A-Polypeptid ermöglichte die Spaltung des Fusionsproteins, wobei nur zwei Reste des Collagens an jedem der beiden Polypeptide zurück blieben.
  • Die Leichtigkeit der Konstruktion der cDNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion, der Transfektion und der Reinigung des exprimierten Proteins ermöglicht die Isolierung einer kleinen, aber ausreichenden Menge an α-Gal A für eine Charakterisierung der physikalischen und kinetischen Eigenschaften des Enzyms. Bei Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese oder natürlich vorkommender mutierter Sequenzen stellt dieses System einen guten Ansatz zur Bestimmung der Auswirkung einer veränderten Primärstruktur auf die Funktion des Proteins bereit. Fusionskonstrukte, bei denen die Protein-A-Domäne E dem Aminoterminus voransteht bzw. dem Carboxylterminus folgt, können ebenfalls konstruiert werden um zu bestimmen, welches Fusionskonstrukt die biologische Funktion des Proteins und seine Fähigkeit zur Bindung an IgG am wenigsten, wenn überhaupt, stört.
  • Bei Einsatz dieses Aspektes der Erfindung kann jede beliebige Spaltstelle oder jedes beliebige Substrat für eine enzymatische Abspaltung gentechnologisch zwischen die α-Gal-A- Sequenz und ein zweites Peptid oder Protein eingeführt werden, das einen Bindungspartner besitzt, der für eine Reinigung verwendet werden könnte, beispielsweise jedes beliebige Antigen, für das eine Immunaffinitätssäule hergestellt werden kann.
    • 5.2.4. CHARAKTERISIERUNG DES REKOMBINANTEN ENZYMS
  • Das gereinigte rekombinante Enzym, das mit den hier beschriebenen Säugetier- Expressionssystemen (beispielsweise dem CHO-Expressionssystem) erzeugt wurde, hatte ein Molekulargewicht, ein pH-Optimum, einen Km und einen isoelektrischen Punkt, die im wesentlichen mit denjenigen des Enzyms identisch waren, das aus menschlichem Plasma gereinigt worden war (Bishop et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 525: 399; Bishop und Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). Die Analyse der Kohlenhydratgruppen dieses Enzyms zeigte die Anwesenheit von drei Oligosaccharid-Ketten am α-Gal-A-Polypeptid. Diese Ketten waren eine Mischung komplexer, hybrider und mannosereicher Typen, wie aus Untersuchungen mit Endoglycosidase und QAE-Sephadex hervorging. Am wichtigsten war, dass das rekombinante Enzym auch insofern der nativen Plasmaform der α-Gal A ähnlich war, als es terminale Sialinsäure-Einheiten aufwies (Bishop und Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). In den oben beschriebenen, begrenzten klinischen Studien wurde gezeigt, dass die Plasmaform des Enzyms bezüglich eines Abbaus von zirkulierendem GbOse&sub3;Cer wirksamer als die Milzform war. Deshalb kann das rekombinante Enzym oder ein modifiziertes rekombinantes Enzym, das, ohne auf diese beschränkt zu sein, Modifizierungen seiner Kohlenhydrat-Ketten oder Aminosäuresequenz beinhaltet, die geeignetste Form für eine Enzymersatztherapie des Fabry- Syndroms darstellen. Tatsächlich wird in den hier gezeigten Beispielen die sättigbare Aufnahme der rekombinanten α-Gal A durch Fabry-Fibroblasten und normale Fibroblasten demonstriert, und es wird gezeigt, dass sie spezifisch durch 2 mM Mannose-6-phosphat gehemmt wird.
  • Außerdem sind die hier beschriebenen CHO-Expressionssysteme für Studien der Zellbiologie der Lysosomen-Biogenese und der Prozessierung der Glycohydrolase sehr vielversprechend. Lichtmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das Cytoplasma der DG5.3- CHO-Zellen sehr stark vakuolisiert war, was auf eine Proliferation lysosomaler Membranen hindeutet und Möglichkeiten bezüglich der Analyse der Lysosomen-Biogenese bietet. Vorläufige Studien haben gezeigt, dass das rekombinante Enzym sehr schnell synthetisiert wird, das endoplasmatische Retikulum innerhalb von 5-10 min nach seiner Synthese verlässt und 46- 60 min später sekretiert wird. Diese schnelle Kinetik der Biosynthese der rekombinanten α-Gal A ermöglicht interessante Studien bezüglich der lysosomalen Enzym-Biosynthese und eröffnet eine Methodik, die bis jetzt nur von viralen Systemen geboten wird. Tatsächlich wird die rekombinante α-Gal A so schnell synthetisiert, dass ein einziger radioaktiver Puls von 3 min ausreicht, um genügend Enzym für diese Studien zu markieren. Die unerwartet spezifische Sekretion lediglich der überexprimierten rekombinanten α-Gal A und nicht anderer lysosomaler Enzyme scheint analog zu der "gene dosage-dependant secretion" zu sein, die von Rothman et al. beschrieben wurde (Stevens et al., 1986, J. Cell Biol. 102: 1551; Rothman et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3248), und sie wirft interessante Fragen auf, die mittels dieses Systems untersucht werden können.
    • 5.2.5. MODIFIZIERTE GLYCOFORMEN DER REKOMBINANTEN α-GAL A FÜR EINE ENZYMTHERAPIE DES FABRY-SYNDROMS
  • Anfängliche Experimente zur Bestimmung der Kinetik der Clearance und der Gewebeverteilung der rekombinanten α-Gal A bei Mäusen zeigten, dass das Enzym zu 50% in der Leber erschien, wobei das restliche Enzym auf viele andere Gewebe verteilt war, einschließlich eines beträchtlichen Anteils in der Niere, im Herzens und in der Haut. Diese Verteilung ist zwar derjenigen ähnlich, die kürzlich für die Plasmaform der humanen α-Gal A bei Mäusen beobachtet wurde, aber es kann angebracht sein, das Enzym für ein verändertes Gewebe- Targeting zu modifizieren. Zu Modifikationen der rekombinanten α-Gal A zur Verbesserung des Gewebe-Targetings gehören eine selektive Deglycosylierung des Komplexes sowie Kohlenhydrat-Gruppen mit hohem Mannose-Anteil, die kovalent am rekombinanten Enzym befestigt sind. Die Erfindung beinhaltet Modifizierungen der Wirtszelle, die eine Expression sialylierter Glycoformen des Enzyms, die leicht gereinigt werden können (siehe Abschnitt 6 unten), ermöglichen. Beispielsweise werden, wenn CHO-Zellen für eine Expression der α-Gal A verwendet werden, die CHO-Zellen mit einem Sialyltransferasegen-Konstrukt cotransfiziert, das den CHO- Zellen die fehlende Funktion bereitstellt, damit sie die sialylierte Glycoform der α-Gal A exprimieren können.
  • Für die Analyse des Schicksals der verschiedenen Glycoformen in vivo, einschließlich von Studien zur Kinetik der Plasma-Clearance und der Gewebeverteilung, kann die rekombinante α-Gal A vor der Modifizierung markiert werden. Beispielsweise kann die rekombinante α- Gal A radioaktiv markiert werden, indem man die DG5.3-CHO -Zellen 24 Stunden lang in Anwesenheit von 50 uCi/ml [³&sup5;S]Methionin (> 1000 Ci/mmol) wachsen lässt. Das sekretierte, radioaktiv markierte Enzym kann aus dem geernteten Medium durch eine Affinitätschromatographie an α-Galactosylamin-Sepharose wie kürzlich beschrieben gereinigt werden. Praktisch 100% des von diesen Zellen sekretierten radioaktiven Proteins bestehen aus α-Gal A, die dann für die sequentielle Erzeugung der Glycoformen verwendet werden kann.
    • 5.3. VERWENDUNGEN DER REKOMBINANTEN α-GAL A
  • Die gereinigten Produkte, die gemäß der Erfindung erhalten werden, können vorteilhaft für eine Enzymersatztherapie bei Patienten eingesetzt werden, die am Fabry-Syndrom, einer lysosomalen Speicherkrankheit, leiden. Alternativ können die gemäß der Erfindung erhaltenen gereinigten Produkte in vitro eingesetzt werden, um α-D-Galactoglycokonjugate in verschiedenen Prozessen zu modifizieren, beispielsweise um Erythrozyten der Blutgruppe B in solche der Blutgruppe O umzuwandeln. Sie können in kommerziellen Prozessen eingesetzt werden, die die Umwandlung von Zuckern erfordern, wie von Raffinose in Saccharose oder von Melibiose in Galactose und Glucose etc. Diese Prozesse werden detaillierter in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.
    • 5.3.1. ENZYMTHERAPIE MIT α-GAL A BEIM FABRY-SYNDROM
  • Was die angeborenen Stoffwechselstörungen angeht, so haben Untersuchungen an Patienten mit lysosomalen Speicherkrankheiten zu einem grundlegenden Verständnis der Biologie der Lysosomen und ihrer Hydrolasen, deren Biosynthese und deren Prozessierung geführt (Rosenfeld et al., 1982, J. Cell Biol. 93: 135; Lemansky et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10129), der Mechanismen ihres Transports zu den Lysosomen (Neufeld et al., 1975, Ann. Rev. Biochem. 44: 357; Sly et al., 1982, J. Cell Biochem. 18: 67; Kornfeld, S., 1986, J. Clin. Invest. 77: 1) sowie ihrer Abhängigkeiten von Cofaktoren (Verheijen et al., 1985, Eur. J. Biochem. 149: 315; d'Azzo et al., 1982, Eur. J. Biochem. 149: 315; Mehl et al., 1964, Physiol. Chem. 339: 260; Conzelman et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3979). Von den über 30 lysosomalen Speicherkrankheiten ist das Fabry-Syndrom ein idealer Kandidat für den Einsatz der gentechnologischen Verfahren, die hier beschrieben werden, zur Überprüfung und Anwendung verschiedener therapeutischer Ansätze in Modellsystemen sowie zur Korrelierung der Wirkungen ortsspezifischer Veränderungen auf die Enzymstruktur und -funktion. Bei der Krankheit ist das Zentralnervensystem nicht betroffen. Somit stellt die Bluthirnschranke kein Hindernis für die Enzymersatztherapie dar. Das defekte Enzym α-Gal A ist ein Homodimer (Bishop und Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307), im Gegensatz zu einigen lysosomalen Enzymen, die verschiedene Untereinheiten aufweisen, wie die β-Hexosaminidase-A (Mahuran et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1602). Somit muss nur ein einziges Genprodukt erhalten werden. Der metabolische Defekt in kultivierten Fibroblasten von Patienten mit dem Fabry-Syndrom wurde in vitro durch den Zusatz des exogenen Enzyms in das Kulturmedium korrigiert (Cline et al., 1986, DNA 5: 37). Es wurden auch atypische Varianten von Patienten mit dem Fabry-Syndrom identifiziert, wobei die betroffenen Männer klinisch symptomfrei sind und eine ausreichende Restaktivität der α-Gal A (3-10%) aufweisen, die sie vor den Hauptmanifestationen der Krankheit schützt (Lemansky et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062; Clarke et al., 1971, N. Engl. J. Med. 284: 233; Romeo et al., 1975, Biochem. Genet. 13: 615; Bishop et al., 1981, Am. J. Hum. Genet. 71: 217A; Bach et al., 1982, Clin. Genet. 21: 59; und Kobayashi et al., 1985, J. Neurol. Sci. 67: 179). Schließlich haben, wie oben angemerkt wurde, begrenzte klinische Studien am Menschen die biochemische Wirksamkeit eines Enzymersatzes für eine Depletierung des zirkulierenden Substrats vor einer Ablagerung im Gefäßsystem sowie die Abwesenheit immunologischer Komplikationen gezeigt (Brady et al., 1973, N. Engl. J. Med. 289; 9; Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326; Bishop et al., 1981, Enzyme Therapy XX: In: Lysosomes and Lysosomal Storage Diseases, Callahan, J. W. und Lowden, J. A. (Hrsg.), Raven Press, New York, S. 381ff; Desnick et al., 1980, Enzyme Therapy XVII: In: Enzyme Therapy in Genetic Disease 2, Desnick, R. J. (Hrsg.), Alan R. Liss Inc., New York, S. 393ff).
  • In diesen Studien wurden sowohl die Milzform als auch die Plasma-Isoform der α-Gal A intravenös appliziert. Die Halbwertszeit des Isoenzyms aus der Milz in der Zirkulation lag bei ungefähr 10 min. während diejenige des Plasma-Isoenzyms bei ungefähr 70 min lag. Nach jeder Dosis des Milz-Isoenzyms nahm die Konzentration des akkumulierten zirkulierenden Substrats in 15 Minuten maximal ab. Im Gegensatz dazu führte die Injektion des Plasma-Isoenzyms zu einer allmählichen Erniedrigung der Substratspiegel in der Zirkulation über einen Zeitraum von 36 bis 72 Stunden. Da die sekretierte Form der rekombinanten α-Gal A offenbar dem Plasma-Isoenzym ähnlich ist, könnte die sekretierte Form des rekombinanten Enzyms eine langfristige Depletierung und eine Kontrolle der Substratspiegel in der Zirkulation bewirken.
  • Die Dosis der teilweise gereinigten Isoenzyme des Plasmas und der Milz, die in den oben genannten klinischen Studien eingesetzt wurde, lag bei 2000 U/kg Körpergewicht oder einer Dosis, die der Verabreichung von 1 ug/kg des reinen Enzyms entsprach. Da sich diese Dosis als wirksam bei der Verminderung des Spiegels des zirkulierenden Substrats erwies, sollte eine ähnliche Dosis des rekombinanten Enzyms einen ähnlichen Effekt haben. Jedoch könnte das rekombinante Enzym in einer Dosierung von 0,1 ug/kg bis ungefähr 10 mg/kg verabreicht werden, und vorzugsweise von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 2 mg/kg. Die Fähigkeit, gemäß dieser Erfindung große Mengen des rekombinanten Enzyms zu erzeugen, wird die Überprüfung der therapeutischen Wirkung beträchtlich größerer Dosierungen ermöglichen.
    • 5.3.2. IN-VITRO-VERWENDUNGEN DER α-GAL A
  • Die α-Gal A ist eine Galactosyl-Hydrolase, die Aktivität gegenüber verschiedenen Oligosacchariden, Glycoproteinen, Glycopeptiden und Glycolipiden mit terminalen α-galactosidischen Verknüpfungen zeigt. Somit kann das Enzym dazu verwendet werden, diese α-Galactoglycokonjugate in vitro zu modifizieren. Beispielsweise könnte die rekombinante α-Gal A der Erfindung für eine Vielzahl erwünschter Modifizierungen eingesetzt werden, zu denen, ohne auf sie beschränkt zu sein, gehören a) die Umwandlung von Erythrozyten der Blutgruppe B in Zellen, die das Antigen der Blutgruppe 0 exprimieren (Harpaz et al., 1977, Eur. J. Biochem. 77: 419- 426); und b) die Hydrolyse von Stacchyose zu Raffinose, von Raffinose zum Disaccharid Saccharose oder die Hydrolyse von Melibiose zu Galactose und Glucose (Silman et al., 1980, Biotechnol. Bioeng. 22: 533). Derartige Hydrolasen haben kommerzielle Anwendungen, beispielsweise beim Abbau von Molassen als einem Substrat für die Hefezüchtung (Liljestrom- Suominen et al., 1988, Appl. Environ. Micro. 54: 245-249).
    • 6. BEISPIEL: IN-VIVO-MODIFIKATION DER REKOMBINANTEN HUMANEN α-GAL-A- GLYCOSYLIERUNG DURCH α-2.6-SIALYLTRANSFERASE
  • Das hier gebrachte Beispiel beschreibt ein Verfahren, durch das ein rekombinantes humanes α-Gal-A-Enzym in einer Form erzeugt wird, die derjenigen der nativen Plasma- Glycoform des Enzyms stärker ähnelt. Im einzelnen wird humane α-Gal A in CHO-Zelllinien erzeugt, die gentechnologisch so verändert wurden, dass sie ein α-2,6-Sialyltransferase-Gen enthalten, so dass das in diesen Zellen gebildete α-Gal-A-Protein sialyliert ist. Die unten dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das unter Verwendung derartiger Zelllinien erzeugte biologisch aktive α-Gal-A-Enzym eine breitere Gewebeverteilung aufweist, die den therapeutischen Wert dieses rekombinanten α-Gal-A-Enzyms erhöhen kann.
    • 6.1. MATERIALIEN UND METHODEN 6.1.1. KONSTRUKTION DES α-2.6-SIALYLTRANSFERASE-EXPRESSIONSVEKTORS pST26
  • Die cDNA der Ratte von 1,6 kb (ST3), die die vollständige Aminosäuresequenz der β-Galactosid-α-2,6-sialyltransferase codiert (Gal α2, 6ST; Weinstein et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 17735) wurde in die Bam-HI-Stelle des Säugetier-Expressionsvektors pRLDN, eine Spende von Smith, Kline and French Laboratories, kloniert, was zu dem als pST26 bezeichneten Vektor führte. Dieses Konstrukt wurde durch Elektroporation in die CHO-Zelllinie DG5.3- 1000Mx eingeführt, die die humane α-Galactosidase A stark überexprimiert. Klone wurden durch das Wachstum in Medium selektiert, das 500 ug/ml G418 enthielt, um hinsichtlich der Expression des pST26-neo-Gens zu selektieren. Positive Klone wurden einzeln unter Verwendung von Klonierungsringen isoliert, und dann wurden alle bezüglich der Expression der gesamten sekretierten rekombinanten humanen α-Galactosidase A analysiert. Außerdem wurde der prozentuale Anteil der sekretierten rekombinanten α-Galactosidase A bestimmt, der α-2,6- Sialinsäure-Reste enthielt, und zwar mittels Chromatographie auf Sambucus-nigra-Agglutinin (SNA) unter Verwendung einer SNA-Sepharose-Säule, wie es von Lee et al. (1989, J. Biol. Chem. 264: 13848-13855) beschrieben wurde.
    • 6.1.2. SNA-LECTIN-FLUORESZENZMIKROSKOPIE
  • Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden positive DG5.3-1000Mx-ST26-Klone auf 12-mm-Glasdeckgläsern gezüchtet und dann mit SNA, das mit Fluoresceinisocyanat (FITC) markiert war, wie beschrieben gefärbt (Lee et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 13848-13855). Die Zellen wurden in einer frischen Lösung aus 2% para-Formaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,0, 1 h lang bei 23ºC fixiert, und anschließend wurde mit 50 mM NH&sub4;Cl in PBS 30 min lang bei 23ºC geblockt. Die Zellen wurden mit FITC-SNA in einer Konzentration von 25 mg/ml in PBS 30 min lang bei 23ºC inkubiert. Nach einer Waschung in PBS wurden die Deckgläser in 15% Vinol-205-Polyvinylalkohol, 33% Glycerin, 0,1% Natriumazid in 100 mM Tris, pH 8,5, eingebettet. Die Zellen wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop Zeiss-Photomat-III betrachtet und unter Verwendung eines Kodak-Gold-Farbfilms von 25 ASA photographiert.
    • 6.1.3. REINIGUNG RADIOAKTIV MARKIERTER HUMANER α-GAL A MIT UND OHNE α-2.6-SIALINSÄURE-RESTEN
  • Parentale DG5.3.-1000Mx-Zellen und modifizierte DG5.3-ST26.1-Zellen wurden in Rollerflaschen von 1 Liter (-5 · 10&sup8; Zellen) mit 125 ml DMEM, das 10% dialysiertes fötales Kälberserum (GICO, Grand Island, NY) und 500 uCi [³&sup5;S]-Methionin enthielt, gezüchtet. Das radioaktive Medium wurde während dreier Tage täglich ausgetauscht, und das verbrauchte Medium jeder Zelllinie wurde gesammelt, gepoolt und mittels eines Konzentrators mit einer Rührzelle (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Ungefähr 2 mg (4 · 10&sup6; U) des von den DG5.3- 1000Mx- bzw. den DG5.3-100Mx-ST26.1-Zelllinien sekretierten rekombinanten Enzyms wurden jeweils bis zu einer spezifischen Aktivität von 100 cpm/U des Enzyms gereinigt. Die Präparationen der gereinigten und radioaktiv markierten sekretierten rekombinanten α-Galactosidase A (jeweils 0,5 mg) wurden jeweils mit 5 Units der sauren Phosphatase (Sigma) behandelt, und die dephosphorylierten Formen wurden für intravenöse Injektionen verwendet.
    • 6.1.4. IN-VIVO-HALBWERTSZEIT UND GEWEBEVERTEILUNG DER REKOMBINANTEN α-GAL A
  • Zur Bestimmung der Halbwertszeiten im Plasma wurde jede der gereinigten radioaktiv markierten α-Gal-A-Formen in die Schwanzvenen von zwei weiblichen DCI-Mäusen injiziert. Von jedem Tier wurden zu vorher festgelegten Zeiten über einen Zeitraum von 10-20 min Blut aus dem Sinus plexus entnommen. Die Blutproben wurden in einer IEC-Mikrohämatokrit- Zentrifuge zentrifugiert, und 50 ul Plasma wurden für die Zählung zu einer wässrigen Szintillationsflüssigkeit (AquaSol, NEN, Boston, MA) gegeben. Zur Bestimmung der Gewebeverteilung der verschiedenen Enzymformen wurden für jedes Enzym zwei Mäuse 4 Stunden nach der Injektion des Enzyms durch Dekapitation getötet, es wurden ausgewählte Gewebe entnommen, und es wurde die Radioaktivität in verschiedenen Geweben bestimmt und auf das Gewebe- Feuchtgewicht in Gramm bezogen. Jeder Wert stellt den Mittelwert von zwei unabhängigen Experimenten dar.
    • 6.2. ERGEBNISSE 6.2.1. EINFÜHRUNG VON PST26 IN DG5.3-1000Mx- CHO-ZELLEN UND NACHWEIS DER α-2.6-SIALYLTRANSFERASE-AKTIVITÄT IN G418-SELEKTIERTEN KLONEN
  • Nach der Elektroporation des pST26-Plasmids in DG5.3-1000Mx-CHO-Zellen wurden transformierte Zellen selektiert, die resistent gegen das Antibiotikum G418 waren. Aus dem Pool der resistenten Zellen wurden 10 einzelne Klone isoliert und für weitere Studien vermehrt. Diese Klone wurden als DG5.3-1000Mx-ST26.1 bis ST26.10 bezeichnet. Für den Nachweis des Vorkommens von α-2,6-Sialyltransferase-Aktivität in diesen Zellen wurde jede Zelllinie mit FITC- SNA gefärbt und dann mittels Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Alle zehn der DG5.3-1000Mx-ST26-Zelllinien wurden von dem fluoreszierenden Lectin angefärbt, was anzeigte, dass verschiedene Membran-Glycoproteine der Zellen als Akzeptoren für die exprimierte α-2,6-Sialyltransferase dienten. Im Gegensatz dazu färbte das FITC-Lectin die parentalen DG5.3-1000Mx-Zellen nicht an.
    • 6.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER REKOMBINANTEN HUMANEN SEKRETIERTEN α-2.6-SIALYLIERTEN α-GAL A
  • Man ließ alle zehn DG5.3-1000Mx-ST26-Zelllinien sowie die parentalen DG5.3-1000Mx- Zellen in 100-mm-Kulturgefäßen in der gleichen Zelldichte wachsen. Für jede Zelllinie wurde die Menge der sekretierten humanen α-Gal A pro mg Protein der kultivierten Zellen bestimmt. Die DG5.3.-1000Mx-ST26-Linien sekretierten zwischen 28 und 100% der α-Gal A, die durch die parentale Zelllinie sekretiert wurde (16 000 U/mg Protein, Tabelle XI).
  • Zur Bestimmung des prozentualen Anteils der rekombinanten humanen sekretierten α-Gal A, der α-2,6-Sialinsäure-Reste enthielt, wurde das sekretierte Enzym chromatographisch auf der Säule mit immobilisiertem SNA untersucht, und das gebundene Enzym wurde mit 0,4 M Lactose eluiert. Wie in der Tabelle XI gezeigt ist, wurden bei den einzelnen Klonen 55 bis 100% der aufgetragenen enzymatischen Aktivität spezifisch gebunden und von der Lectin-Säule eluiert. Bemerkenswerterweise erzeugte der Klon DG5.3-1000Mx-ST.1 die größte Menge an rekombinanter α-Gal A, wobei im wesentlichen das gesamte Enzym sialyliert war und an die Säule mit dem immobilisiertem SNA band. Im Gegensatz dazu band die rekombinante α-Gal A, die von den parentalen DG5.3-1000Mx-Zellen sekretiert wurde, kaum oder gar nicht an das für α-2,6-Sialinsäure spezifische Lectin (Tabelle XI). TABELLE XI DG5.3-1000Mx-ST26-CHO-Zelllinien, die humane α-2,6-sialylierte α-Galactosidase A sekretieren
  • * Die Aktivität ist als Units pro mg Zellprotein ausgedrückt. Die Zelllinie DG5.3-1000Mx sekretierte ~16 000 U/mg.
    • 6.2.3 PLASMA-HALBWERTSZEIT UND GEWEBEVERTEILUNG DER α-2.6-SIALYLIERTEN HUMANEN α-GAL A BEI MÄUSEN
  • Um zu bestimmen, ob sich die In-vivo-Clearance der rekombinanten humanen α-2,6- sialylierten α-Gal A von derjenigen des nicht-α-2,6-sialylierten Enzyms unterschied, wurden die beiden Formen Mäusen injiziert, und es wurden ihre Halbwertszeiten in der Zirkulation bestimmt. Wie in der Fig. 2A gezeigt ist, erhöhte die Anwesenheit von α-2,6-Sialinsäure-Gruppen die Halbwertszeit des Enzyms in der Zirkulation von 14 auf fast 30 min. Außerdem erhöhte die Behandlung des α-2,6-sialylierten und des nicht-α-2,6-sialylierten rekombinanten Enzyms mit saurer Phosphatase die In-vivo-Halbwertszeit im Plasma (T1/2) des nicht-α-2,6-sialylierten Enzyms von 14 auf 24 min. während diejenige des mit Phosphatase behandelten α-2,6-sialylierten Enzyms bei ungefähr 28 min gleich blieb (Fig. 2B).
  • Wie in der Fig. 3 dargestellt ist, hatte die Anwesenheit oder Abwesenheit von α-2,6- Sialinsäure-Gruppen und/oder Phosphatresten an den sekretierten Formen der rekombinanten humanen α-Gal A einen ausgeprägten Effekt auf ihre jeweiligen Gewebeverteilungen nach der intravenösen Verabreichung an Mäuse. Bei der α-2,6-sialylierten α-Gal A wurde ein größerer prozentualer Anteil in den Lungen, in der Niere und dem Herzen wiedergefunden als beim nicht- α-2,6-sialylierten Enzym. Im Gegensatz dazu wurde weniger des α-2,6-sialylierten Enzyms in der Milz wiedergefunden. Interessanterweise verteilte sich das α-2,6-sialylierte Enzym, wenn es mit saurer Phosphatase behandelt wurde, in die Leber und die Milz um, und zwar vermutlich in ihre retikuloendothelialen Zellen (Fig. 3). Die Behandlung des nicht-α-2,6-sialylierten Enzyms mit saurer Phosphatase führte zur Wiederfindung von beträchtlich mehr Enzym in den Lungen und dem Herzen als von der nicht mit Phosphatase behandelten Form, während weniger in den Nieren wiedergefunden wurde (Fig. 3).
    • 7. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Die folgenden E.-coli-Stämme, die die aufgeführten Plasmide tragen, wurden bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt, und sie erhielten die folgenden Zugangsnummern:
  • Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Umfang nicht durch die hinterlegten Mikroorganismen eingeschränkt sein, da die hinterlegten Ausführungsformen als Veranschaulichung einzelner Aspekte der Erfindung dienen sollen, und alle beliebigen Mikroorganismen oder Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, sind im Bereich dieser Erfindung enthalten. Tatsächlich werden Fachleuten auf diesem Gebiet zusätzlich zu den hier dargelegten und beschriebenen Modifikationen der Erfindung weitere aus der obigen Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen offensichtlich sein. Derartige Modifikationen sollen in den Bereich der beigefügten Ansprüche fallen.
    • SEQUENCE LISTING
  • (1) GENERAL INFORMATION:
  • (i) APPLICANT: Desnick, Robert J. Bishop, David F. Ioannou, Yiannie A.
  • (ii) TITLE OF INVENTION: Cloning and Expression of Biologically Active alpha-Galactosidase A
  • (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 13
  • (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
  • (A) ADDRESSEE: PENNIE & EDHONDS
  • (B) STREET: 1155 Avenue of the Americas
  • (C) CITY: New York
  • (D) STATE: New York
  • (E) COUNTRY: U.S.A.
  • (F) ZIP: 10036
  • (v) COMPUTER READABLE FORM:
  • (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC compatible
  • (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
  • (vi) CURRENT APPLICATION DATA:
  • (A) APPLICATION NUMBER: US 07/983,451
  • (B) FILING DATE: 30-NOV-1992
  • (C) CLASSIFICATION:
  • (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
  • (A) NAME: Coruzzi, Laura A.
  • (B) REGISTRATION NUMBER: 07/983,451
  • (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 6923-030
  • (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
  • (A) TELEPHONE: 212-790-9090
  • (B) TELEFAX: 212-869-8864/9741
  • (C) TELEX: 66141 PENNIE
  • (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
  • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
  • (A) LENGTH: 1393 base paire
  • (B) TYPE: nucleic acid
  • (C) STRANDEDNESS: double
  • (D) TOPOLOGY: unknown
  • (ii) MOLECULE TYPE: cDNA
  • (ix) FEATURE:
  • (A) NAHE/KEY: CDS
  • (B) LOCATION: 61..1350 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
  • (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
  • (A) LENGTH: 429 amino acids
  • (B) TYPE: amino acid
  • (D) TOPOLOGY: linear
  • (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von humaner α-Galactosidase A, das umfaßt:
(a) Kultivieren einer transformierten Säugetierzelle, die mit einem β-Galactosidase-α-2,6-sialyltransferase-Gen transformiert wurde und die β-Galactosid-α-2,6-sialyltransferase exprimiert, so daß die Zelle zu einer Peptidsialylierung in der Lage ist, und die außerdem eine heterologe chromosomal integrierte Nukleotidsequenz enthält, die humane α-Galactosidase A codiert, die operativ mit einer Nukleotidsequenz assoziiert ist, die die Genexpression reguliert, sowie einem selektierbaren Marker, der von der gleichen oder einer anderen Regulatorsequenz kontrolliert wird, so daß die α-Galactosidase A-Nukleotidsequenz stabil überexpremiert wird und von der Säugetierzelle eine enzymatisch aktive, sialylierte Glycoform des α-Galactosidase-A-Enzyms sekretiert wird; und
(b) Isolieren des enzymatisch aktiven α-Galactosidase-A- Enzyms aus der Säugetier-Zellkultur.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die für α-Galactosidase A codierende Nukleotidsequenz die Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, von Nukleotid Nr. 1 bis 1290 umfaßt.
3. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die für α-Galactosidase A codierende Nukleotidsequenz die Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, von Nukleotid Nr. 91 bis 1290 umfaßt.
4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen viralen Promotor umfaßt.
5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen induzierbaren Promotor umfaßt.
6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die chromosal integrierten Nukleotidsequenzen in Gegenwart einer Selektion amplifiziert werden.
7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der selektierbare Marker Dihydrofolatreduktase ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der selektierbare Marker Dihydrofolatreduktase ist und die Selektion Methotrexat ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, bei dem die Säugetierzelle eine Zelllinie des Ovariums des Chinesischen Hamsters (CHO) ist.
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