DE69327697T2

DE69327697T2 - Oberflächenaktive Peptide, Verfahren zur ihrer Herstellung und diese produzierende Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69327697T2
Application number: DE69327697T
Authority: DE
Inventors: Tadayuki Imanaka; Shoji Sakurai
Original assignee: Nikko Bio Technica Co Ltd
Current assignee: Nikko Bio Technica Co Ltd
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 2000-08-31
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: JP2775573B2; EP0593058A3; EP0593058A2; DE69327697D1; JPH06184194A; US5344913A; EP0593058B1

Description

Hintergrund der Erfindung

I. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen mit Oberflächenaktivität, ein Verfahren diese herzustellen und neue Mikroorganismen, die diese produzieren.

II. Beschreibung des Standes der Technik

Biosurfactants (hier auch als "BS" bezeichnet), die aus lebenden Organismen stammen, haben Strukturen und Funktionen, die sich von denen synthetischer oberflächenaktiver Mittel unterscheiden. Da die Gerüste der meisten bekannten Biosurfactants aus Lipopeptiden oder Glycolipiden aufgebaut sind, sind sie Detergenzien, die in hohem Maße bioabbaubar sind. Auf der anderen Seite hemmen sie das Wachstum mancher Bakterien. Ferner erwartet man, dass durch Kultivierung von BS-herstellenden Bakterien in Erdöllagen des Bodens die Rückgewinnung eines Drittels Erdöl erzielt werden kann.
Obwohl zahlreiche Biosurfactants bekannt sind, eingeschlossen Surfactin (Arima, K. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 31 488-494 (1968); Parkinson, M. et al., Biotechnology Advances 3(1), 65-83 (1985)), ist es wünschenswert, ein Biosurfactant höherer Oberflächenaktivität als die der bekannten Biosurfactants bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, sowohl einen neuen Verbindungstyp mit hoher Oberflächenaktivität bereitzustellen, der mit Hilfe eines Mikroorganismus erhältlich ist, als auch die Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens und eines neuen Mikroorganismus, der den neuen Verbindungstyp herstellt.
Die Erfinder stellten intensive Studien an, wobei sie ein neues Bakterium fanden, das zur Gattung Arthrobacter gehört, und daß dieses neue Bakterium einen neuen Verbindungstyp mit einer hohen Oberflächenaktivität herstellt. Den Erfindern gelang die Isolierung einer neuen Verbindung und die Bestimmung ihrer chemischer Struktur, womit sie die vorliegende Erfindung vervollständigten.
Der neue Verbindungstyp gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die allgemeine Formel
verkörpert, worin der Rest R der N-terminalen Acylgruppe für einen gesättigten oder ungesättigten C&sub5;-C&sub1;&sub5;-Alkylrest steht; und worin die C-terminale Aminosäure des Peptidylteils durch eine Esterbindung mit dem α- oder dem β-Kohlenstoffatom der N-terminalen Acylgruppe verbunden ist. Die Erfindung umfasst auch die funktionalen Äquivalente dieser Verbindungen, bei denen einzelne Aminosäuren hinzugefügt, ersetzt oder gestrichen wurden, ohne dadurch die Oberflächenaktivität der Verbindungen nachteilig zu beeinflussen. Zum Beispiel kann die N-terminale Acylgruppe von aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten, geraden oder verzweigtkettigen, natürlichen oder synthetischen Carboxylsäuren abgeleitet sein, die in α- oder β-Position hydroxyliert sind. R kann deshalb für eine aliphatische, gesättigte oder ungesättigte, gerade oder verzweigtkettige C&sub5;-C&sub1;&sub5;-, vorzugsweise C&sub5;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe stehen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, dargestellt durch die Formel (I):
und deren funktionelle Äquivalente, bei denen Aminosäurereste hinzugefügt, ersetzt oder gestrichen wurden, ohne dadurch die Biosurfactant-Aktivität der Verbindung nachteilig zu beeinflussen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung liefert die vorliegende Erfindung eine Verbindung gemäß Formel (II):
und deren funktionelle Äquivalente, bei denen einzelne D- und/ oder L-Aminosäurereste hinzugefügt, gestrichen oder durch ihre korrespondierende L- und/oder D-Form ersetzt wurden.
Ein weiterer Gegenstand betrifft sowohl Mikroorganismen, die eine der oben definierten Verbindungen herstellen, als auch Mutanten oder Varianten dieser Mikroorganismen.
Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Mikroorganismus um Arthrobacter sp. Nr. 38 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4435.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der oben offenbarten Verbindung, umfassend die Schritte der Kultivierung eines Bakteriums, das zur Gattung Arthrobacter gehört, das eine oben definierte Verbindung unter Bedingungen produziert, die die Herstellung dieser Verbindung gestatten; Isolierung der Verbindung aus der Kultur; und gegebenenfalls Ersetzen der N-terminalen Acylgruppe gegen eine andere Acylgruppe oder gegebenenfalls Umwandeln der N-terminalen Acylgruppe unter Bildung einer anderen Acylgruppe. Die Umwandlungen können nach Methoden ausgeführt werden, die aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Vorzugsweise wird einer der oben genannten Bakterienstämme in dem beanspruchten Verfahren verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der beanspruchten Verbindungen als oberflächenaktive Mittel. Da die erfindungsgemäßen Verbindungen eine höhere Oberflächenaktivität pro Molekül besitzen, als irgendein bekanntes Biosurfactant, erwartet man, dass das erfindungsgemäße Biosurfactant als hochwirksames Detergenz verwendet wird, das hochgradig bioabbaubar ist.

Genaue Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung;
Fig. 2 zeigt ein NMR-Spektrum der Fettsäure, die durch Hydrolyse der erfindungsgemäßen Verbindung erhalten wurde;
Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm, das man dadurch erhalten hat, daß man das Hydrolysat der erfindungsgemäßen Verbindung einer Reversed-Phase-Chromatographie unterworfen hat;
Fig. 4 zeigt die Struktur des Peptids jeden Peaks, die durch Aminosäureanalyse jedes der in Fig. 3 gezeigten Peaks hergeleitet wurde;
Fig. 5 zeigt die Oberflächenaktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindung und einer Verbindung eines Vergleichsbeispiels bei verschiedenen Konzentrationen; und
Fig. 6 zeigt die Oberflächenspannungen der erfindungsgemäßen Verbindung und einer Verbindung eines Vergleichsbeispiels bei verschiedenen Konzentrationen.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Arthrobacter sp. Nr. 38 (im Folgenden auch als "Stamm Nr. 38" bezeichnet) wurde als ein Stamm aus dem Erdboden nahe des Sagara- Erdölfeldes in Shizuoka, Japan, isoliert, der den größten emulgierbaren Randsaum auf L-Agar-Medium, auf das Öl gegeben wurde, bildete, d. h. als ein Biosurfactant-produzierender Stamm. Stamm Nr. 38 besitzt die folgenden mykologischen Eigenschaften:
(1) Wachstumstemperatur: 25-37ºC
(2) Idealtemperatur: 30ºC
(3) streng aerobes gram-positives Bakterium
(4) Sporenbildung: keine
(5) in Kultur wird ein typischer Stäbchenkokkenkreis beobachtet
(6) weist Mobilität auf
(7) Säurebeständige Färbung: negativ
(8) seine Zellwand enthält Lysin.
Aus den oben beschriebenen mykologischen Eigenschaften wurde Stamm Nr. 38 als zur Gattung Arthrobacter gehörig identifiziert. Stamm Nr. 38 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (früher Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science and Technology, in 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, am 14. Oktober 1992 hinterlegt und die Hinterlegung wurde in eine Internationale Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag am 5. Oktober 1993 umgewandelt. Die Hinterlegungsnummer der Internationalen Hinterlegung ist FEEM BP-4435.
Die bevorzugte neue erfindungsgemäße Verbindung hat die durch die oben beschriebene Formel (I) dargestellte chemische Struktur. Die Verbindung (im Folgenden auch als "BS-38" bezeichnet) wird von einem Mikroorganismus herstellt und weist eine Oberflächenaktivität auf, so dass die Verbindung ein Biosurfactant ist. Demgemäß kann die Verbindung als oberflächenaktives Mittel verwendet werden.
Wie im Detail in den folgenden Beispielen beschrieben, besitzt BS-38 eine höhere Oberflächenaktivität pro Molekül als Surfactin, das die höchste Oberflächenaktivität aller üblichen Biosurfactants besitzt.
BS-38 kann durch Kultivierung von Stamm Nr. 38 und durch Gewinnung der Verbindung aus dem Kulturüberstand erhalten werden. Die Gewinnung kann durch eine übliche Methode unter Anwendung von Chromatographie und/oder Ultrafiltration erfolgen. Ein spezielles Beispiel der Gewinnung von BS-38 wird in den untenstehenden Beispielen beschrieben. Stamm Nr. 38 kann z. B. in L-Medium kultiviert werden, vorzugsweise bei 30ºC. Durch 24-stündiges Kultivieren von Stamm 38 im L-Medium bei 30ºC wird BS-38 im Kulturüberstand hergestellt. Die Menge des im Kulturüberstand hergestellten BS-38 beträgt etwa 30 mg pro 11 Kulturflüssigkeit.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand einiger Beispiele beschrieben. Es sollte beachtet werden, dass die Beispiele nur zur Veranschaulichung dienen und nicht in irgendeiner einschränkenden Weise interpretiert werden dürfen.

Beispiel 1: Isolierung von Stamm 38

Stamm 38 wurde durch die folgende Methode isoliert:
Die Erde (etwa 1 g) nahe des Sagara-Erdölfeldes in Shizuoka, Japan, wird in sterilisiertem Wasser (10 ml) suspendiert. Erdöl (40 ul) das im Sagara-Erdölfeld produziert wurde, wird zunächst zu Agar-Medium in einer Petrischale gegeben, um eine Ölplatte zu erhalten. Die Erd-Suspension (0,1 ml) wird auf die so vorbereitete Ölplatte gesprüht. Man inkubiert die Ölplatte 2 Tage bis 1 Woche bei 28 oder 37ºC. Die sich entwickelnden Kolonien werden dann untersucht. Solche, die emulgierende Randsäume um die Kolonie bildeten, wurden als Biosurfactant-herstellende Bakterien isoliert. Stamm Nr. 38 wurde aus der Kolonie isoliert, die den größten Randsaum bildete.

Beispiel 2: Isolierung von BS-38

Stamm Nr. 38 wurde in L-Medium 24 h bei 30ºC kultiviert. BS-38 wurde mit folgender Methode aus dem Kulturüberstand isoliert: Der Kulturüberstand wurde durch Ultrafiltration (Fraktionierungsmolekulargewicht: 10.000) etwa 10-fach konzentriert. Dem Produkt fügte man CaCl&sub2; und HCl zu Konzentrationen von 50 mM bzw. 10 mM zu. Das Produkt ließ man 6 h bei Raumtemperatur stehen und gewann die gebildeten Präzipitate durch Zentrifugation. Zur Lösung der Präzipitate wurden die Präzipitate mit wässriger NaOH-Lösung neutralisiert. Aus dem Produkt wurde die Lipidfraktion mittels Hexan oder Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde durch eine Silicagelsäule und Octadecylsäule aufgereinigt. Die Bedingungen der Chromatographie waren wie folgt. Die Probe wurde mit Chloroform/- Methanol (1 : 1) gelöst und auf die Silicagelsäule C-200 (φ 30 mm · 500 mm) gegeben. Die aktive Fraktion wurde mit Chloroform/Methanol/Wasser (65 : 25 : 4) eluiert, wobei hydrophile Substanzen in der Säule verblieben. Nach dem Trocknen wurde die Probe mit 50% Acetonitril gelöst und weiter mittels einer Octadecyl-4PW HPLC-Säule (Tosoh Corp., Tokyo, Japan) aufgereinigt. Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10% Acetonitril (0,1% TFA) und 90% Acetonitril (0,1% TFA) durchgeführt. Schließlich wurde das gewünschte aufgereinigte Produkt aus der 50%-igen wässrigen Acetonitrillösung 1 Monat bei 4ºC kristallisiert.

Beispiel 3: Identifizierung von BS-38 (Teil 1)

Fig. 1 zeigt ein Infrarotspektrum von BS-38. Da sowohl bei 1540 cm&supmin;¹ und 1650 cm&supmin;¹ als auch bei 1730 cm&supmin;¹ Absorptionspeaks beobachtet werden, wurde angenommen, dass es sich bei dieser Verbindung um ein Proteolipid mit einem Lactonring handelt. Ein Massenspektrogramm (FAB-MS) von BS-38 zeigte, dass die Verbindung ein Molekulargewicht von 1354 besitzt. Nach 18-stündiger Hydrolyse von BS-38 mit 6 N HCl bei 110ºC wurde die freigesetzte Fettsäure mit Diethylether extrahiert und der Extrakt mit NMR (Lösungsmittel: CDCl&sub3;) untersucht. Die Ergebnisse dieser NMR werden in Fig. 2 gezeigt. Ein Massenspektrogramm (EI-MS) der oben erwähnten Fettsäure zeigte, dass die Fettsäure ein Molekulargewicht von 188 aufweist. Hieraus ordnete man der Fettsäure die Struktur zu, die durch die untenstehende Formel (III) wiedergegeben wird.
Außerdem wurde BS-38 mit 6 N HCl (0,2 Gew.-% Phenol enthaltend) Stunden bei 110ºC hydrolysiert und seine Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Aus den Ergebnissen dieser Aminosäureanalyse und aus der Tatsache, dass das Molekulargewicht des Peptidteils 1184 (1354 - (188 - 18)) beträgt, folgerte man, dass BS-38 Asparaginsäure, Isoleucin, Threonin, Serin und Leucin in einem molaren Verhältnis von Asp : Ile : Thr : Ser : Leu = 2 : 2 : 1 : 2 : 4 enthält. Darüberhinaus zeigte ein Bindungsscan mittels FAB-MS, dass die Aminosäuren mit Molekulargewichten von (113)-115-101-113-113-87-113-87-113-113-115 in der angegebenen Reihenfolge angeordnet sind. Das Peptid wurde einem Edman-Abbau unterzogen. Aus den Ergebnissen des Edman-Abbaus und der oben erwähnten Aminosäureanalyse ermittelte man die Aminosäuresequenz wie folgt: Leucin-Asparaginsäure-Threonin-Leucin-Leucin-Serin- Leucin-Serin-Isoleucin-Isoleucin-Asparaginsäure. Aus den oben erwähnten Gesamtergebnissen bestimmte man die Struktur von BS-38, die durch die oben beschriebene Formel (I) repräsentiert wird.

Beispiel 4: Identifizierung von BS-38 (Teil 2)

BS-38 wurde mit 11,5 N HCl 3 Stunden bei 37ºC hydrolysiert. Das erhaltene Hydrolysat unterwarf man einer Reversed-Phase-HPLC wobei man das in Fig. 3 gezeigte Chromatogramm erhielt. Die HPLC wurde unter Verwendung von uBONDASPHERETM und unter Anwendung eines linearen Gradienten von 10 Gew.-% wässrigem AcCN (5 min nach Beginn der Chromatographie) bis 90 Gew.-% wässrigem AcCN (35 min nach Beginn der Chromatographie) als Eluat ausgeführt. Die Zuführrate des Eluats betrug 0,5 ml/min. Die Peptide wurden bei einer Wellenlänge von 215 nm nachgewiesen. Man wählt die in Fig. 3 gezeigten Peaks 1 bis 13. Das Gesamtvolumen jedes Peaks wurde vollständig hydrolysiert und man unterzog die Hälfte des Volumens des Produkts einer Aminosäureanalyse. Im Ergebnis enthielt jeder Peak das in Fig. 4 gezeigte Peptidfragment. Diese Ergebnisse entsprechen der in Formel (I) gezeigten chemischen Struktur.
Unter Verwendung der verbleibenden Halbvolumina der Peaks 3, 6, 7, 12 und 13 bestimmte man mittels HPLC die optische Struktur (D- oder L-) jeder Aminosäure. Man heftete optisch aktives (+)-1-(9-Fluonyl)ethylchloroformat (FLEC) (kommerziell erhältlich von Eka Nobel) an jede Aminosäure um ein Diastereoisomer-Derivat zu erhalten und man analysierte das erhaltene Diastereomer-Derivat mit Hilfe üblicher Methoden (Anal. Chem. 59, (1987) 1191-1195). Als Ergebnis ermittelte man, dass BS-38 die durch die folgende Formel (II) gezeigte Struktur besitzt.

Beispiel 5: Oberflächenaktivität von BS-38

Man bestimmte mittels bekannter Methoden sowohl die Oberflächenaktivität von BS-38 als auch, als Vergleichsbeispiele, die von Surfactin, Triton X-100 (Handelsname) und Natriumdodecylsulfat (SDS) (Japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-211892). So gab man in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 16 cm 40 ml destilliertes Wasser. Zur Ausbildung einer dünnen Membran aus Rohöl über die gesamte Petrischale tropfte man vorsichtig 15 ul Rohöl auf die Wasseroberfläche. Auf die so gebildete dünne Membran gab man langsam 10 ul der zu testenden Probe, so dass das Rohöl emulgiert wurde und dabei einen Kreis bildete. Der längere und kürzere Durchmesser des emulgierten Kreises wurde ausgemessen und die Fläche des emulgierten Kreises errechnet. Je höher die ölemulgierende Aktivität, desto größer war die Fläche des emulgierten Kreises. Folglich kann man durch den Vergleich der Flächen der emulgierten Kreise die ölemulgierenden Aktivitäten der Surfactants vergleichen. Als Testproben wurden wässrige Lösungen der oben erwähnten oberflächenaktiven Mittel, verdünnt auf verschiedene Konzentrationen, verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 und Tabelle 1 unten dargestellt. Tabelle 1: Vergleich der ölemulgierenden Aktivität der Surfactants
Wie in Tabelle 1 zu sehen, ist die Aktivität von BS-38 pro Gewichtseinheit um 1,7-mal höher als die von Surfactin, von dem man sagte, dass es die höchste Aktivität aller bekannten Biosurfactants besitzt. Die Aktivität von BS-38 pro Gewichtseinheit ist mit der von Triton X-100 vergleichbar. Wie aus Tabelle 1 und Fig. 5 ersichtlich, ist darüber hinaus die Aktivität von Surfactin pro Mol mit der von Triton X-100 vergleichbar, während die von BS-38 fast doppelt so hoch wie die von Surfactin oder Triton X-100 ist.

Beispiel 6: pH-Abhängigkeit der ölemulgierenden Aktivität

BS-38 oder Surfactin wurden mit einer wässrigen 0,5 N HCl- oder mit 0,5 N NaOH-Lösung oder mit destilliertem Wasser gelöst und man bestimmte wie in Beispiel 5 die ölemulgierenden Aktivitäten, wodurch die pH-Abhängigkeit der ölemulgierenden Aktivität der Biosurfactants ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: pH-Abhängigkeit der ölemulgierenden Aktivität
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, verringerte sich die Aktivität von Surfactin unter sauren Bedingungen drastisch. Obwohl die Aktivität von BS-38 unter sauren Bedingungen verringert war, war die Verringerung andererseits nicht so groß, wie die von Surfactin.

Beispiel 7: Messung der Oberflächenspannung

Die Oberflächenspannungen von BS-38 und Surfactin wurden unter vielfacher Veränderung der Konzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Aus Fig. 6 bestimmte man die kritische Micellen-Konzentration (CMC). Die CMC von BS-38 betrug 8,0 · 10&supmin;&sup5; M und die von Surfactin betrug 3,0 · 10&supmin;&sup4; M.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel:

worin der Rest R der N-terminalen Acylgruppe für einen gesättigten oder ungesättigten C&sub5;-C&sub1;&sub5;-Alkylrest steht;

und worin die C-terminale Aminosäure der Peptidylgruppe über eine Esterbindung mit dem α- oder β-Kohlenstoffatom der N-terminalen Acylgruppe verbunden ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel (I):

3. Verbindung nach Anspruch 1 der Formeln (II):

4. Mikroorganismus des Genus Arthrobacter, welcher eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 produziert, oder eine Mutante oder Variante davon.

5. Mikroorganismus nach Anspruch 4, nämlich Arthrobacter sp. Nr. 38 (FERM BP-4435).

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man ein Bakterium des Genus Arthrobacter, welches eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 produziert, unter Bedingungen kultiviert, die die Produktion dieser Verbindung gestatten; die Verbindung aus der Kultur isoliert; und gegebenenfalls die N-terminale Acylgruppe durch eine andere Acylgruppe ersetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, durchgeführt unter Verwendung eines Bakterienstammes nach einem der Ansprüche 4 und 5.

8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als oberflächenaktives Mittel.