DE69323913T2

DE69323913T2 - Moleküle für iontophoretische Verabreichung

Info

Publication number: DE69323913T2
Application number: DE69323913T
Authority: DE
Inventors: Randal A. Hoke; Burton H. Sage
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Vyteris Inc
Priority date: 1992-01-22
Filing date: 1993-01-12
Publication date: 1999-10-14
Anticipated expiration: 2013-01-13
Also published as: JP2506543B2; US5494679A; JPH05345727A; CA2087087A1; AU665046B2; EP0552878B2; CA2087087C; EP0552878A2; AU3190593A; EP0552878A3; ES2130219T3; DE69323913D1; EP0552878B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung liegt im Bereich der Peptid- und Proteinarzneimittelllieferung. Insbesondere liegt die Erfindung im Bereich der iontophoretischen Peptid- und Proteinarzneimittelllieferung.

HINTERGRUND

Die neuen Entwicklungen in der Molekularbiologie haben große Mengen von geeigneten Peptiden und Proteinen zur Verfügung gestellt. Nicht nur sind vorhergehend geringe Mengen von bestimmten Peptiden und Proteinen jetzt in großen Mengen verfügbar, sondern neue und modifizierte Formen von Peptiden und Proteinen sind leicht verfügbar. In Verbindung mit neuer Verfügbarkeit hat sich die biologische und therapeutische Bedeutung von Peptiden und Proteinen erhöhter Schätzung erfreut.
Peptide und Proteine sind besonders empfänglich in Bezug auf Abbau, wenn durch andere Wege als parenteral verabreicht. Diese nicht parenteralen Verabreichungswege unterwerfen die Peptide und Proteine gastrointestinaler Inkompatibilität (z. b. Abbau durch proteolytische Enzyme) und hepatitischem "ersten Durchgangs-" Metabolismus zusätzlich zu dem Erzeugen variierender Konzentrationsmengen des Peptids oder Proteins im Blut (d. h. zirkulierende Spiegel). Die traditionellen nicht parenteralen Verabreichungswege sind deshalb äußerst oft unwirksam.
Parenterale Verabreichung wird üblicherweise benötigt, therapeutische Spiegel von Peptiden und Proteinen zu erzielen. Jedoch sind Peptide und Proteine inhärent kurz wirkend, wodurch häufige Injektionen benötigt werden. Die häufigen Injektionen setzen einen Patienten zusätzlichem Schmerz und potentieller Unverträglichkeit und Gesundheitsrisiken aus.
Alternatives Mittel, Peptid- und Proteinarzneimittel zu verabreichen, ist ein aktiver Forschungsbereich. Ein bemerkenswertes Mittel für Peptid- und Proteinarzneimittelllieferung ist Iontophorese. Iontophorese bezieht sich auf den Transport ionischer löslicher Stoffe durch biologische Membranen unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Iontophoretische Arzneimittelzufuhr hat die Fähigkeit, die gastrointestinalen und hepatitischen "ersten Durchgangs-" Hindernisse zu umgehen, die enterale Wege der Peptid- und Proteinverabreichung relativ gering wirksam machen. Iontophorese muß jedoch noch weit verbreiteten Erfolg in der Peptid- und Proteinzufuhr zeigen. Es sind jedoch Proteine und Peptide die geeignet für elektrolytische Lieferung sind, in dem U. S. Patent 4 940 456 und in dem U. S. Patent 4 878 892 beschrieben worden.
Jedoch sind Verfahren zum Liefern von Peptiden und Proteinen durch Iontophorese noch lästig und erfordern viele Schritte und Zugaben von nicht zugehörigen Materialien die für einfache und wirksame iontophoretische Lieferung nicht gut geeignet sind. Peptide und Proteine für iontophoretische Lieferung und Verfahren zum Modifizieren von Peptiden und Proteinen für iontophoretische Lieferung sind noch meistens ungeeignet.

ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Erfindung liefert Peptide und Proteine für iontophoretische Lieferung.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen modifizierte Peptide und Proteine für iontophoretische Lieferung.
Andere Ausführungsformen umfassen Verfahren zum Herstellen eines Patches zum Liefern von Peptiden und Proteinen durch Iontophorese und Patche, die Peptide und Proteine für die Lieferung durch Iontophorese umfassen.
Spezifische Ausführungsformen umfassen die Behandlung von Krankheitszuständen und Beschwerden durch iontophoretische Lieferung von Petiden und Proteinen.
Die Vorteile der iontophoretischen Lieferung sind viele. Die Erfindung liefert ein Mittel für die schnelle Lieferung und schnelle Beendigung der Protein- und Peptidverabreichung. Ein Peptid oder Protein mit einer kurzen Aktivitätsperiode ist auch durch Praktizieren der vorliegenden Erfindung lieferbar. Die Erfindung beseitigt auch die Möglichkeit für Überdosieren oder Unterdosieren eines Peptids oder Proteins. Die Probleme, die mit den gastrointestinalen und hepatitischen "ersten Durchgangs" Systemen verbunden sind, die mit oraler Verabreichung verbunden sind, werden auch beseitigt. Und die Risiken und Schwierigkeiten, die parenteralen Therapien innewohnen, werden vermieden. Wie in diesem Dokument verwendet, bezieht sich "Patient" auf Lebewesen einschließlich Menschen, Haustiere wie Hunde und Katzen, lebendes Inventar wie Rinder. Pferde. Schafe. Schweine, Ziegen und Kaninchen, Labortiere wie Mäuse und Ratten und Zootiere wie exotische Arten. Der Begriff "Patch", wie in diesem Dokument verwendet, bezieht sich auf die Vielzahl von Behältnismitteln für Arzneimittellieferung durch Iontophorese im allgemeinen, wie spezifisch für Peptide und Proteine. Derartige Mittel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Bandagen, vorgefüllte passive Arzneimittellieferungs-Patche, vorgefüllte iontophoretische Arzneimittellieferungs-Vorrichtungen, vorgefüllte aktive Arzneimittellieferungs-Patche und wiederverwendbare iontophoretische Arzneimittelzufuhrvorrichtungen. umfassend ein Arzneimittelreservoir, das wiederverwendbar oder wiederfüllbar ist.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Haut pH gegenüber der Hauttiefe.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines Hautlappenexperiments, das iontophoretische Lieferung eines sulfatierten Insulins zeigt.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines Hautlappenexperiments, das iontophoretische Lieferung von LHRH zeigt.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Bildung eines LHRH Promedikaments

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind nicht auf das Praktizieren mit irgendeinem bestimmten iontophoretischen System oder Vorrichtung beschränkt. Im allgemeinen umfassen iontophoretische Vorrichtungen mindestens zwei Elektroden, eine elektrische Energiequelle (beispielsweise eine Batterie) und mindestens ein Reservoir. welches das zu liefernde Protein oder Polypeptid enthält. Verschiedene iontophoretische Vorrichtungen sind bekannt, wie diejenigen, die in P. Tyle, Pharmaceutical Research 3 : 318 (1986) offenbart sind.
Das Reservoir oder ähnliche Struktur, die das zu liefernde Peptid oder Protein enthält, kann in der Form irgendeines Materials sein, das geeignet zum Herstellen des Kontakts zwischen der Iontophoreseeinheit und der Haut ist. Geeignete Materialien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Schäume, Gele und Matrixen.
Iontophoresegele können Karaya-Gummi, andere Polysaccharidgele oder ähnliche hydrophile wäßrige Gele sein, die sich dazu eignen, Ionen zu tragen. Spezifische Beispiele derartiger Gele umfassen Polyvinylalkohol, Polymethylpyrrolidin. Methylcellulose. Polyacrylamid, Polyhemas, Polyhemaderivate und dergleichen. Die ausgewählte Matrix sollte nicht reizende Eigenschaften, um Reizen der Haut oder des Gewebes des Patienten zu vermeiden, geeignete Leitfähigkeitseigenschaften, um guten elektrischen Kontakt mit der Haut oder dem Gewebe zu erhalten, und die Fähigkeit haben, als ein Trägermedium für die Peptide und Proteine zu wirken.
Andere Mittel zum Liefern von Peptiden und Proteinen umfassen ein Patch, enthaltend das Peptid oder Protein wie wiederverwendbare oder wiederfüllbare iontophoretische Vorrichtungen.
Es ist gut bekannt, daß beim Passieren durch die Haut von dem äusseren Stratum corneum zu der inneren Basalmembran das Arzneimittelmolekül pH Werte von gerade unterhalb 5,0 bis zum physiologischen pH Wert von 7,3 antreffen wird, wie in Fig. 1 gezeigt (siehe beispielsweise Siddiqui et al., "Facilitated Transdermal Transport of Insulin", Journal of Pharmaceutical Sciences (1987) 76 : 4. Seite 341). Wenn der isoelektrische Punkt zwischen pH 5,0 und pH 7,3 liegt, wird das Molekül an irgendeinem Punkt während der Passage zu der Haut eine Region antreffen, wo der lokale pH dem isoelektrischen Punkt gleicht. An diesem Punkt wird das Molekül eine Null-Netto-Ladung haben. Weil das Molekül das Bewegen einer Ladung während Iontophorese benötigt (wie von Elektroosmose unterschieden), hat das Molekül an diesem Punkt wenig Beweglichkeit aufgrund des elektrischen Feldes, und das Iontophoreseverfahren ist inoperabel. Deshalb gewährleistet ein isoelektrischer Punkt außerhalb des Bereichs von pH 4,0 bis pH 7,3 bei einer elektrostatischen Ladung von mindestens plus oder minus 1 (absolute Größe 1), daß im wesentlichen alle Moleküle an allen Orten in der Haut eine Nettoladung haben und sich somit aufgrund von Iontophorese bewegen werden. Ein isoelektrischer Punkt außerhalb von 3-8,3 ist bevorzugt.
Beispielsweise hat natürliches Insulin einen isoelektrischen Punkt von 5,3. Wenn es in ein Reservoir bei pH 7 gesetzt würde, würde es eine negative Ladung haben und würde sich von negativ geladenen Elektroden weg bewegen. Da es sich in die Haut bewegt, wird es eine der Stellen erreichen, wo der pH Wert 5,3 beträgt. An diesem Punkt wird keine Kraft auf das Molekül von dem elektrischen Feld sein, weil das Molekül ungeladen ist. Ferner kann an tieferen Stellen in der Haut der pH (Fig. 1) niedriger sein. Wenn das Molekül zu diesem Punkt diffundierte, würde es positiv geladen werden und sich somit zurück zu der Hautoberfläche bewegen. An Stellen weniger tief in der Haut kann der pH Wert höher sein. Wenn das Molekül zu dieser Tiefe diffundierte, würde es eine negative Ladung haben und sich jetzt weg von der Hautoberfläche bewegen. Somit hat die Natur eine Situation geschaffen, wo das Insulin sich bei einer Tiefe fokussieren kann. Letztendlich ist das Molekül an seinem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich. Somit wird das Molekül nicht nur an einer Stelle fokussiert sein, es wird dazu tendieren, auszufällen.
In ähnlicher Weise würde, wenn das zuvor angegebene Insulinmolekül in ein Reservoir bei pH 4 gesetzt würde, es eine positive Ladung haben und sich von positiv geladenen Elektroden weg bewegen. Wenn es sich in die Haut bewegt, wird es einen der Flecken erreichen, wo der pH Wert 5,3 ist. Wiederum wird an dieser Stelle das elektrische Feld keine Kraft auf das Molekül ausüben. Ferner kann an Stellen tiefer in der Haut der pH Wert höher sein. Wenn das Molekül zu diesem Punkt diffundierte, würde es negativ geladen werden und sich zurück zu der Hautoberfläche aufgrund des elektrischen Feldes bewegen. An Stellen weniger tief in der Haut kann der pH niedriger sein. Wenn das Molekül zu diesem Punkt diffundiert, wird es eine negative Ladung haben und wird sich aufgrund des elektrischen Feldes von der Hautoberfläche wegbewegen. Somit wird sich das Molekül wiederum an einer Stelle fokussieren. Um diese Situation zu vermeiden, sind Moleküle, die an einem Zeichen an allen Stellen der Haut geladen sind, bevorzugt. Mittel, um dieses zu erzielen, sind a) die Verwendung eines nativen Moleküls mit einem isoelektrischen Punkt außerhalb des pH Werts der Haut oder b) die Verwendung eines nativen Moleküls mit einem isoelektrischen Punkt in dem pH Bereich der Haut und modifiziert, um ein Analog mit dessen isoelektrischem Punkt außerhalb des pH Bereichs der Haut. d. h. unterhalb von 4 und oberhalb von 7,3 zu erhalten.
Andere charakteristische Eigenschaften für iontophoretische Lieferung von Peptiden und Proteinen umfassen minimale Größe. Vorzugsweise sollten die Moleküle in der Monomerform vorliegen und das geringst mögliche Molekulargewicht haben. Peptide und Proteine haben große Schwierigkeit, die Stratum-Corneum-Barriere zu durchdringen, wobei viele glauben, daß dieses auf ihrer Hydrophilizität, großen Molekülgrößen und der lipophilen Natur des Stratum-Corneums beruht. Wenn das Molekül eine Neigung hat, Polymere und Aggregate zu bilden, hat dieses die Wirkung des Vervielfachens der Molekülgröße durch den Aggregationsgrad. Der isoelektrische Punkt und die Molekülgröße in Kombination erhöhen den Grad der Beweglichkeit, den ein Peptid oder Protein in Bezug auf iontophoretische Lieferung haben wird.
Zusätzlich sollten die Peptide und Proteine für iontophoretische Lieferung vorzugsweise hohe Löslichkeit, typischerweise größer als 1 mg/ml in Wasser haben (d. h. niedriger Verteilungskoeffizient). Ein Peptid oder Protein mit hoher Löslichkeit in Wasser wird allgemein als hydrophil bezeichnet. Die Peptide und Proteine für iontophoretische Lieferung sollten vorzugsweise sowohl Über-Alles wie lokale Hydrophilizität haben. Während Über-Alles-Hydrophilizität hohe Wasserlöslichkeit bedeutet, bezieht sich lokale Hydrophilizität auf den Grad der Wechselwirkung von Teilen des Moleküls mit lipophilen Resten in der Haut. Hohe lokale Hydrophilizität bedeutet einen geringen Grad von Wechselwirkung mit lipophilen Resten in der Haut, was die Beweglichkeit erhöht, mit der das Molekül durch die Haut geht.
Die Fähigkeit der Peptide und Proteine in Bezug auf iontophoretische Lieferung zum Aufrechterhalten von Bioaktivität wird auch sehr gewünscht. Während Modifikationen zu etwas Verlust an Aktivität führen können, so lange wie das beabsichtigte Ergebnis erzielt wird, ist Verlust von etwas Bioaktivität akzeptabel. Ein Kompromiss zwischen dem Erzielen des wirksamsten lieferbaren Peptids und Proteins und zum Erzielen der bioaktivsten Form eines Peptids und Proteins führt dazu, das Peptid oder Protein mit Eigenschaften zu wählen, die am nächsten zum Erzielen der gewünschten Ziele sind.
Vereinigungen von Aminosäuren beziehen sich auf die Mannigfaltigkeit von natürlich auftretenden modifizierten Formen von Peptiden und Proteinen und auf synthetische Kombinationen von aminosäureähnlichen Resten, welche alle biologische Aktivität haben können. Alle Vereinigungen von Aminosäuren sind geeignet für die Verwendung oder geeignet für die Modifikation für iontophoretische Lieferung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung. Promedikamentformen und andere Formen, wo die biologische Aktivität verbleibt, und ihre Fähigkeit, durch Iontophorese geliefert zu werden, erhöht wird, werden auch in Betracht gezogen. Spezifische Beispiele von geeigneten Peptiden und Proteinen umfassen: Cardiovaskulär-aktive Peptide und Proteine wie beispielsweise Angiotension II Antagonist. Antriopeptins, Bradykinin und Gewebe-Plasminogen-Aktivator. ZNS aktive Peptide und Proteine wie beispielsweise Cholecystokinin (CCK-8 oder CCK-32), Delta Schlafinduzierendes Peptid (DSIP), B-Endorphin, melanozyteninhibierender Faktor-I, melanozytenstimulierendes Hormon, Neuropeptid Y und Nervenwachstumsfaktor, GI-aktive Peptide und Proteine wie beispielsweise Gastrin-Antagonist. Neurotonie (Neurotension), Pankreasenzyme, Somatostatin und deren Analoge wie Octreotid. Immunmodulierende Peptide und Proteine wie beispielsweise Bursin, Koloniestimulierungsfaktor. Cyclosporin, Enkephaline, Interferon, Muramyldipeptid, Thymopoietin und Tumor-Nekrose-Faktor. Metabolismus modulierende Peptide und Proteine wie beispielsweise Humanwachstumshormon. Gonadotropine, Insulin, Calcitonin und deren Analoge wie beispielsweise Elcatonin, luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Oxytocin. Thyrotropin freisetzendes Hormon (TRH), Calcitonin Gen verwandter Faktor und Vasopressine. Polypeptidwachstumsfaktoren wie beispielsweise epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), insulinartige Wachstumsfaktoren I & II (IGF-I & II). Inter-Leukin-2 (T- Zellenwachstumsfaktor) (II-2), Nervenwachstumsfaktor (NGF). Thrombozytenwachstumsfaktor (PDGF), Transformationswachstumsfaktor (Typ I oder alpha) (TGF), von Knorpel abstammender Wachstumsfaktor, Koloniestimulierungsfaktoren(CSFs), Endothelialzellenwachstumsfaktoren (ECGFs), Erythropoietin, von Augen abstammende Wachstumsfaktoren(EDGF), von Fibroblasten abstammender Wachstumsfaktor (FDGF), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), Gliawachstumsfaktor (GGF), von Osteosarkom abstammender Wachstumsfaktor (ODGF), Thymosin und Transformationswachstumsfaktor (Typ II oder β) (TGF).
Die Fähigkeit, ein Peptid oder Protein zu seiner minimalen Größe zu modifizieren, ist leicht erzielbar. Es ist beispielsweise bekannt, daß Humanwachstums- Hormonfreisetzungsfaktor (hGRF) ein vierundvierzig aminosäurenlanges Peptid (hGRF(1-44)- NH&sub2;)) ist, das hohe Wirkung mit dem gelöschten Carboxyende zeigt (hGRF(1-29)-NH2), siehe A. M. Felix. Pharmaceutical Technology Mai 1991 (Seite 28). Im allgemeinen sind kleinere Teile von großen Peptiden durch direkte Synthese verfügbar. Diese Fragmente können dann in Bezug auf entsprechende Bioaktivität getestet werden. Traditionellerweise werden Fragmentpeptide "eines zur Zeit" durch automatisierte Festphasensynthese synthetisiert. Kürzlich sind, jedoch schnelle Verfahren von Mehrfachpeptidsynthese verfügbar geworden. welches dieses Verfahren erleichtert (Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 5131.
Der isoelektrische Punkt (pI) eines bioaktiven Peptids kann mithilfe verschiedener Verfahren eingestellt werden. Ein Verfahren besteht darin, spezifisch unerwünschte Reste durch wünschenswertere zu ersetzen. Beispielsweise würde man zum Erhöhen des pI eines Peptids negativ geladene Reste wie beispielsweise Glutamat- oder Aspartatreste austauschen, indem man sie durch durch neutrale oder positiv geladene Reste wie beispielsweise Lysin oder Arginin ersetzt. Neutrale Reste wie beispielsweise Glycin und Prolin können durch positiv geladene Reste wie beispielsweise Lysin und Arginin ersetzt werden. Geladene Reste könnten auch geeigneterweise zu den Amino- oder Carboxyenden der Peptidkette durch direkte Festphasensynthese hinzugefügt werden.
Ein weiteres Verfahren umfaßt Entwickeln eines Promedikaments des interessierenden Peptids. Beispielsweise könnten negativ geladene Nebenketten von Asparaginsäure. Glutaminsäure oder dem Carboxyende mit einer neutralen oder positiv geladenen Gruppe verestert werden, welche anschließend in vivo entfernt wird, was die ursprüngliche Peptidstruktur wieder herstellt.
Peptid- und Proteinmodifikationen könnten durch eine Anzahl von Wegen realisiert werden. Direkte chemische Modifikationen sind ein möglicher Weg (siehe Lundblad. R. L., Chemical Reagents For Protein Modification (1991), CRC Press, Boca Raton, FL). Stellengerichtete Mutagenese von Nukleinsäuren und anschließende Expression der Proteine ist ein anderer Weg. Die Verwendung von automatisierten Peptidsynthesetechniken erweitert den Bereich von Möglichkeiten, weil unnatürliche Aminosäuren in das Peptid/Protein eingefügt werden können. Modifikation durch die Verwendung von Enzymen ist ein viertes Verfahren zum Entwickeln von Analogen. Enzyme, welche einen Bereich von Post- Translationsmodifikationen durchführen, sind bekannt. Unter den Protein modifizierenden Enzymen sind Carboxylasen, Phosphatkinasen, Hydroxylasen und Glycosylasen. Die zuvor aufgeführten Modifikationstechniken können entweder allein oder in Kombinationen verwendet werden, um die gewünschten Ergebnisse in Bezug auf den isoelektrischen Punkt, Gesamtladung und Bioaktivität zu erzielen.
Diese Verfahren zum Hinzufügen oder Verändern der Ladungseigenschaften von Peptiden verbessern oft ebenso ihre Löslichkeitseigenschaften. Proteine mit isoelektrischen Punkten außerhalb des Bereichs von 4 bis 7,3 werden wahrscheinlich nicht ausfällen oder während des Durchgangs durch die Haut aggregieren.
Mittel zum Modifizieren von Peptiden und Proteinen unter Erhalten von Molekülen mit positiven Ladungen durch den isoelektrischen Punkt von 4 bis 7,3 umfassen Sulfatierung. Sulfatierte Proteine können mithilfe irgendeiner der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Unter geeigneten Bedingungen sind Sulfonatgruppen spezifisch an aliphatische Hydroxylgruppen wie diejenigen, die auf Serin- und Threoninresten gefunden werden, angefügt. Insulin ist beispielsweise durch Behandlung mit konzentrierter Schwefelsäure entweder allein oder in Verbindung mit einem Dehydratisierungsmittel wie beispielsweise Carbodiimid sulfatiert worden (Reitz. H. C., Ferrel. R. E., Fraenkel-Conrat. H., et al (1946) J. Am. Chem. Soc., 68. 1024-1031 und Cerami, A., Pongor. S., Brownlee. M. (1985) U. S. Patent 4 534 894). Pyridiniumsulfonsäure wurde auch verwendet, Sulfatgruppen in Insulin einzuführen (Sluyterman. L. A. A. E., Kwestroo-Van den Bosch. J. M. (1960) Biochem. et Biophys. Acta. 38, 102-113). Derartige Verfahren sollten auf allen nativen Insulinen wie beispielsweise Mensch, Schwein und Rind, ihren synthetischen Molekülen und Analogen davon arbeiten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die spezifischen Ausführungsformen der in diesem Dokument beschriebenen Erfindung. Wie für Fachleute offensichtlich sein würde, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich.

BEISPIEL 1

Herstellung von monomerem Insulin mit pI > 7

Ein monomeres Insulin wie beispielsweise die Des-Pentapeptid (B26-30) freie Säure oder Amid wird enzymatisch unter Verwenden festgelegter Literaturverfahren hergestellt.
An dieses Basismaterial wird ein Peptid wie beispielsweise Lysyl-Lysin gekoppelt, welches eine geeignete Anzahl von geladenen Gruppen trägt.

Experimentelles

Schweineinsulin (Calbiochem Corp., La Jolla. CA) wird mit Trypsin unter Herstellen des Des-Octapeptid (B23-30) Analogs gespalten. Dieses Material wird an H-Gly-Phe-Phe-NH&sub2; unter Verwenden von Trypsin unterstützter Katalyse in gemischten wäßrig-organischen Systemen unter Verfolgen festgesetzter Verfahren gekoppelt (Nakagawa. S. H., Tager, H. S. (1986) J. Biol. Chem., 261, 7332-7341). Das sich ergebende Des-Pentapeptid (B26-30) Insulin wird mittels Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
Das Dipeptid N-(Boc)-c-Boc-lysyl- -Boc-lysin wird hergestellt durch Koppeln von N-(Boc)- -Boc-lysin-N-hydroxysuccinimidester mit -Boc-lysin in wasserfreiem Dimethylformamid. Die Reaktion wird über Nacht rühren gelassen, im Vakuum verdampft, und in Ethylacetat aufgenommen. Die organische Schicht wird mit wäßriger Zitronensäure, Wasser gewaschen und getrocknet. Das sich ergebende Öl wird mit Hexan trituriert, wobei ein Feststoffprodukt erhalten wird.
Das Dipeptid wird dann an Des-Pentapeptid-Insulin unter Verwenden einer festgesetzten Fragmentkopplungstechnik gekoppelt (Kisfaludy, L., Roberts, J. E., Johnson. R. H., et al. (1970) J. Org. Chem., 35. 3563-3565).
Der Pentafluorphenylester des Dipeptids wird in situ durch Behandlung mit einem Äquivalent des Dicyclohexylcarbodiimid-pentafluorphenol "Komplexes" in Dimethylformamid bei 0ºC hergestellt. Man läßt die Reaktion sich langsam auf Raumtemperatur über einer Dauer von 1 Stunde aufwärmen. Die Lösung wird unter Entfernen des gefällten Dicyclohexylharnstoffs filtriert und zu einer Lösung von Insulin in Dimethylformamid hinzugegeben. Das aktivierte Dipeptid wird in einem 10fachen molaren Überschuß hinzugegeben. Die Lösung wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, zu welcher Zeit Diethylether unter Fällen des Proteins hinzugegeben wird. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugation gewonnen und 1 Stunde lang mit wasserfreier Trifluoressigsäure unter Entfernen der Boc schützenden Gruppen behandelt. Im Anschluß an das Entfernen der Säure im Vakuum wird das Produkt mittels Ionenaustauschchromatographie auf sulfonierter Sepharose in 20% Essigsäure gereinigt, wobei ein Natriumchloridgradient unter Verdünnen der Proteine verwendet wird.
Das Produkt dieser Sequenz von Reaktionen ist ein Insulin-Analog, welches ein Lysyl-Lysin-dipeptid angefügt an die N-terminalen Positionen der A und B Ketten trägt. Der pI dieses Monomeranalogen beträgt 8,4.

BEISPIEL 2

Fehlen von Insulintransport - pI5,3

Die folgenden Beispiele sind unter Verwenden des Schweinehautlappenmodells (J. Riviere et al., Fund. Appl. Toxicol. 7 : 444 (1986) unter Untersuchen des transdermalen Transports durchgeführt worden:
Zwei Hautlappen
Dauer der Iontophorese 4 h bei 0,9 mA DC
Kathodendosierungslösung - reguläres Insulin (Eli Lilly, Idianapolis, IN) > 100
Einheiten/ml, pI 5,3
Anodenlösung 10% physiologische Kochsalzlösung
Elektrodenbereich 4,5 cm² - Porex TM Reservoir mit Ag Siebanode
Stromdichte 200 uA/cm²
Proben von Perfusat, genommen alle 30 Minuten, beginnend mit einer Stunde vor Iontophorese bis 4 Stunden nach Iontophorese. Proben analysiert unter Verwenden von Insulin RIA- empfindlich gegenüber 10 uE/ml (400 Pikogramm/ml)(Cambridge Research. Boston. MA)
Ergebnis- alle Proben hatten Insulinkonzentrationen unterhalb minimal nachweisbarer Spiegel.

BEISPIEL 3

Transport von sulfatiertem Insulin pI = 1,0
Zwei Hautlappen
Iontophoresedauer - 4 Stunden bei 0,9 mA DC
Kathodendosierungslösung - sulfatiertes Insulin (Connought Labs, Toronto, Canada), 100 E/ml, pI - 1,0
Anodenlösung 10% physiologische Kochsalzlösung
Elektrodenbereich 4,5 cm² - Porex TM Reservoir mit Ag/AgCl Siebkathode
Stromdichte 200 uA/cm²
Proben von Perfusat, genommen alle 30 Minuten beginnend mit einer Stunde vor Iontophorese bis vier Stunden nach Iontophorese.
Proben analysiert unter Verwenden von Insulin RIA (Cambridge Research, Boston, MA) empfindlich gegenüber 10 uE/ml (400 Pikogramm/ml).
Ergebnis: siehe Fig. 2 - signifikanter Transport von Insulinanalogem (sulfatiertes Insulin)

BEISPIEL 4

Thyrotropin freisetzendes Hormon (TRH) hat einen pKa von annähernd 6,2. Es trägt abnehmende (positive) Ladung über den pH Bereich 5-7, ist im wesentlichen +1 geladen bei dem niedrigen pH und schreitet voran zum Ungeladensein bei pH 7. Obwohl die Lieferung dieser Verbindung unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes dokumentiert worden ist, zeigten die Flüsse, daß das Arzneimittel passiv durch Konvektion getragen war (Burnette, R. R., et al., J. Pharm. Sci., 75, (1986), 738-743).
Ein Promedikament von TRH, welches eine positive Ladung über dem pH Bereich von 4-7 trägt, kann unter Verwenden der Verfahren von Bundgaard et al., (Pharm. Res., 7. (1990). 885-892) hergestellt werden. Bei einer Modifikation des zitierten Verfahrens wird Cholinchlorformiat (gebildet aus Cholin und Phosgen) an die Stelle der hydrophoben Chlorformiate in dem synthetischen Verfahren gesetzt (siehe Fig. 4). Diese Substitution führt zu einem TRH Promedikament mit einer quaternären Aminfunktionalität, welches eine +1 Ladung bei allen pH Werten aufrechterhält. Diese Verbindung zeigt hohe Wasserlöslichkeit und bleibt über den pH Bereich von 4-7 geladen.

BEISPIEL 5

Iontophoretische Lieferung von LHRH (pI~11) unter Verwenden des Hautlappenmodells von J. Riviere
Elektroden - PorexTM Sandwich 1 cm² mit Ag Anodensieb, hergestellt von Becton Dickinson Research Zentrum
LHRH (Luteinisierungshormon freisetzendes Hormon) Lösung:
1 mg/ml in 154 mM NaCl plus 10 mM MES Puffer pH 6,0
indifferente Elektrodenlösung: NaCL 159 mg/ml
Iontophoresestrom 0,2 mA 3 Stunden lang
Fig. 3 - Durchschnitt ± ISD für sechs Replikathautlappen
Quelle von LHRH: Sigma Chemical Co., St. Louis. MO
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Modifikationen beschrieben worden ist, sind die Details davon nicht als Beschränkungen konstruiert, denn es ist offensichtlich, daß verschiedene Äquivalente. Änderungen und Modifikationen gemacht werden können.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Patches für iontophoretische Lieferung von Vereinigungen von Aminosäuren, welches umfaßt:

Modifizieren der Vereinigungen von Aminosäuren zu einem isoelektrischen Punkt von weniger als 4 oder größer als 7,3 mit einer elektrostatischen Ladung von mindestens plus oder minus 1 über dem pH Bereich von 4,0 bis 7,3.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der isoelektrische Punkt geringer als 3,0 oder größer als 8,3 ist, und die Vereinigungen von Aminosäuren Peptide oder Proteine sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner einen Wasserlöslichkeitsfaktor größer als 1 mg/ml umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Modifizierung durch chemische Modifizierung, Aminosäuresubstitution, Aminosäurezugabe oder Deletion ist.

5. Patch für iontophoretische Lieferung, welches Vereinigungen von Aminosäuren mit einem isoelektrischen Punkt von weniger als 4,0 oder größer als 7,3 mit mindestens einer elektrostatischen Ladung von plus oder minus 1 über dem pH Bereich von 4,0 bis 7,3 umfaßt.

6. Patch nach Anspruch 5, wobei der isoelektrische Punkt geringer als 3,0 oder größer als 8,3 ist, und die Aminosäuren Peptide oder Proteine sind.

7. Patch nach Anspruch 5, welcher ferner einen Wasserlöslichkeitsfaktor größer als 1 mg/ml umfaßt.

8. Patch nach Anspruch 6, in dem die Peptide oder Proteine natürlich vorkommende oder Analoge von natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen sind.

9. Patch nach Anspruch 8, in dem das Peptid Elcatonin oder Octreotid ist.

10. Patch nach Anspruch 8, in dem das Peptid Insulin oder LHRH ist.