DE69312493T2

DE69312493T2 - Varianten des gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer wirkung

Info

Publication number: DE69312493T2
Application number: DE69312493T
Authority: DE
Inventors: William Bennett; Bruce Keyt; Nicholas Paoni
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-06-03
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2013-05-29
Also published as: IL105883A0; DE69312493D1; JPH07507448A; AU4397393A; ES2107041T3; AU664469B2; FI117940B; LU90800I2; NL300050I1; WO1993024635A1; EE03128B1; US5612029A; DE69333127T2; GR3024806T3; NL300050I2; ATE246000T1; DE10199044I2; DK0786257T3; PT786257E; CA2129660C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

I. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten des Gewebeplasminogenaktivators (t-PA) mit im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verlängerter Halbwertszeit im Kreislauf, wobei die Fibrinbindeaffinität im wesentlichen beibehalten wird. Bestimmte Varianten weisen darüber hinaus eine verbesserte fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit auf. Die Erfindung betrifft auch Verfahren und Mittel zur Bildung dieser Varianten sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese umfassen.

II. Beschreibung des Hintergrunds und verwandter Gebiete

Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) ist eine aus mehreren Domänen bestehende Serinprotease, deren physiologische Rolle darin besteht, Plasminogen in Plasmin umzuwandeln und dadurch den Vorgang der Fibrinolyse einzuleiten oder zu beschleunigen.
Das anfängliche klinische Interesse an t-PA wurde aufgrund seiner relativ hohen Aktivität in Gegenwart - im Vergleich zur Abwesenheit - von Fibrin geweckt. t-PA der Wildform ist in Abwesenheit von Fibrin ein schwaches Enzym, doch die Gegenwart von Fibrin steigert seine Fähigkeit, Plasminogen zu aktivieren, deutlich. Ohne Stimulation beträgt die katalytische Wirksamkeit (katalytische Raten konstante (kcat)/Michaelis-Konstante (Km)) von Melanom- oder rekombinantem menschlichem t-PA (Activase -t-PA) zur Aktivierung von Plasminogen etwa 1 nM&supmin;¹S&supmin;¹, während sich in Gegenwart von Fibrin oder Fibrinabbauprodukten diese Wirksamkeit (Pseudoratenkonstante) um einen Faktor von mehreren Hundert vervielfacht. Man geht davon aus, daß sich diese ungewöhnliche biochemische Eigenschaft von t-PA klinisch in einem thrombolytischen Produkt äußert, bei dem die Wahrscheinlichkeit, eine systemische Plasminogenaktivierung hervorzurufen, geringer als bei nicht-fibrinspezifischen Thrombolytika ist (wie z.B. Streptokinase oder Urokinase) [Sobel, B.E. et al., Circulation 69, 983-990 (1984)]. Rekombinanter menschlicher t-PA wird therapeutisch als fibrinolytisches Mittel bei der Behandlung von akutem Myokardinfarkt und Lungenembolie verwendet, wobei beide Zustände üblicherweise das Ergebnis eines Gefäßverschlusses aufgrund eines fibrinhältigen Thrombus sind.
Neben dieser auffallenden Fibrinspezifität weist t-PA mehrere weitere typische Charakteristika auf:
(a) t-PA unterscheidet sich dahingehend von den meisten Serinproteasen, als die Einzelkettenform des Moleküls eine deutliche enzymatische Aktivität aufweist. Gegenüber einigen kleinen Substraten und gegenüber Plasminogen in Abwesenheit von Fibrin besitzt zweikettiger t-PA eine größere Aktivität als einkettiger. In Gegenwart von Fibrin sind allerdings die zwei Formen von t-PA gleichermaßen aktiv [Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-5 (1982); Lijnen et al., Thromb. Haemost. 64, 61-8 (1990); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 5191-5201 (1991)]. Die meistenanderen Serinproteasen bestehen als Zymogene und erfordern proteolytische Spaltung in eine zweikettige Form, um die volle enzymatische Aktivität zu entfalten.
(b) Die Wirkungsweise von t-PA in vivo und in vitro kann durch ein Serpin, PAI-1, gehemmt werden [Vaughan, D.E. et al., J. Clin. Invest. 84, 586-591 (1989); Wiman, B. et al., J. Biol. Chem. 259, 3644-3647 (1984)].
(c) t-PA bindet sich in vitro an Fibrin mit einem Kd im µM-Bereich.
(d) t-PA weist eine rasche in vivo-Ausscheidung bzw. Clearance auf, die durch einen oder mehrere Rezeptoren in der Leber vermittelt wird [Nilsson, S. et al., Thromb. Res. 39, 511-521 (1985); Bugelski, P.J. et al., Throm. Res. 53, 287-303 (1989); Morton, P.A. et al., J. Biol. Chem. 264, 7228-7235 (1989)].
Eine im wesentlichen reine Form von t-PA wurde zuerst durch Collen et al., US-Patent Nr. 4.752.603 vom 21. Juni1988 aus einer natürlichen Quelle erzeugt und auf in vivo- Aktivität untersucht (siehe auch Rijken et al., J. Biol. Chem., 256: 7035 [1981]). Pennica et al. (Nature, 301:214 [1983]) bestimmten die DNA-Sequenz von t-PA und leiteten die Aminosäuresequenz aus dieser DNA-Sequenz ab (siehe US-Patent Nr. 4.766.075 vom 23. August 1988).
Menschlicher t-PA der Wildform besitzt potentielle Stellen für N-gebundene Glykosylierung an den Aminosäurepositionen 117, 184, 218 und 448. Rekombinanter menschlicher t-PA (Activase -t-PA), der durch Expression in CHO-Zellen hergestellt wurde, enthält Berichten zufolge etwa 7 Gew.-% Kohlehydrat, bestehend aus einem mannosereichen Oligosaccharid an Position 117 und komplexen Oligosacchariden an Asn-184 und Asn-448 [Vehar, G.A. et al., "Characterization Studies of Human Tissue Plasminogen Activator produced by Recombinant DNA Technology" Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1986; LI: 551-562]. Es stellte sich heraus daß die Position 218 in nativem t-PA nicht glykosyliert ist. Die Stellen 117 und 448 scheinen immer glykosyliert zu sein, während man annimmt, dass die Stelle 184 in etwa 50% der Moleküle glykosyliert ist. Die t-PA-Moleküle, die an Position 184 glykosyliert sind, werden als Typ I-t-PA bezeichnet und die Moleküle, die an Position 164 nicht glykosyliert sind, werden als Typ II-t-PA bezeichnet. Die umfangreichste Analyse der Kohlehydratstrukturen von aus CHO Zellen stammendem menschlichem t-PA erfolgte durch Spellman et al., J. Biol. Chem. 264 (24)14100-14111 (1989), die zeigten, daß zumindest 17 unterschiedliche Asn-gebundene Kohlehydratstrukturen auf dem Protein nachgewiesen werden konnten. Diese reichten von den mannosereichen Strukturen an Position 117 bis zu mit zwei, drei oder vier Enden versehenen antennenartigen Strukturen vom N-Acetyllactosamin-Typ an den Positionen 184 und 448. Es wurde berichtet, daß t-PA vom Typ I und Typ II an den Positionen Asn-117 und Asn-448 auf identische Weise N-glykosyliert ist, wenn er aus der gleichen Zelllinie isoliert ist. Weitere Details finden sich in Parekh, Raj B. et al., Biochemistry 28, 7644-7662 (1989).
Die Analyse der Sequenz von t-PA ergab, daß das Molekül fünf Domänen besitzt. jede Domäne wurde in bezug auf homologe strukturelle oder funktionelle Bereiche in anderen Proteinen definiert wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Plasminogen, Prothrombin, Fibronectin und Epidermiswachstumsfaktor (EGF). Diese Domänen wurden beginnend mit dem N-Terminus der Aminosäuresequenz von t-PA als Fingerdomäne (F) von Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 44, als Wachstumsfaktordomäne (G) von etwa Aminosäure 45 bis etwa Aminosäure 91 (basierend auf der Homologie mit EGF), als Kringle-1-Domäne (K1) von etwa Aminosäure 92 bis etwa Aminosäure 173, als Kringle-2-Domäne (K2) von etwa Aminosäure 180 bis etwa Aminosäure 261 und als Serinprotease-Domäne (P) von etwa Aminosäure 264 bis zum Carboxylterminus an Aminosäure 527 bezeichnet. Diese Domänen befinden sich im wesentlichen angrenzend zueinander und sind durch kurze "Linker"bereiche miteinander verbunden. Diese Linkerbereiche bringen die Gesamtanzahl an Aminosäuren des reifen Polypeptids auf 527, obwohl manchmal drei zusätzliche Reste (Gly-Ala-Arg) am Aminoterminus gefunden werden. Dieses zusätzliche Tripeptid gilt im allgemeinen als Ergebnis unvollständiger Vorläuferverarbeitung und es ist nicht bekannt, ob es Funktionalität verleiht. Nativer t-PA kann zwischen den Positionen 275 und Position 276 (befinden sich in der Serinprotease-Domäne) gespalten werden, um die zweikettige Form des Moleküls zu bilden.
Jede Domäne trägt in unterschiedlicher Weise zu den gesamten biologisch bedeutsamen Eigenschaften des t-PA-Moleküls bei. Untersuchungen über Domänendeletionen zeigten, daß der Verlust der Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle-2-Domänen zu einer geringeren Affinitätsbindung der t-PA-Variante an Fibrin führt [van Zonneveld, A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4670-4677 (1986); Verheijen, J.H. et al., EMBO J. 5, 3525-30 (1986)], doch aktuellere Ergebnisse mit Substitutionsmutanten deuten darauf hin, daß die Kringle-2-Domäne an der Fibrinbindung weniger beteiligt ist als früher angenommen [Bennett, W.F. et al., J. Biol. Chem. 266: 5191-5201 (1991)]. Die Untersuchungen über Domänendeletionen sprachen von einer Beteiligung der Finger- und Wachstumsfaktordomäne an der Ausscheidung durch die Leber [Collen et al., Blood 71, 216-219 (1988), Kalyan et al., J. Biol. Chem. 263, 3971-3978 (1988); Fu et al., Thromb. Res. 50, 33-41(1988); Refino et al., Fibrinolysis 2, 30 (1988); Larsen et al., Blood 73:1842-1850 (1989); Browne et al., J. Biol. Chem. 263,1599-1602 (1988)). Die Kringle-2-Domäne ist für die Bindung an Lysin verantwortlich. Die Serinprotease-Domäne ist für die enzymatische Aktivität von t- PA verantwortlich und enthält spezifische Bereiche, in denen, wie gezeigt wurde, Mutationen sowohl die Fibrinbindung als auch die Fibrinspezifität beeinflussen (möglicherweise direkte Wechselwirkungen mit Fibrin), und andere Bereiche, in denen nur die Fibrinspezifität geändert wird (möglicherweise indirekte Wechselwirkungen mit Fibrin) (Bennett et al., 1991, s.o.). Untersuchungen mit Mutanten aus stellengerichteten Änderungen weisen auf die Beteiligung der Glykosylierung von t-PA an der Ausscheidung hin [Lau et al., Bio/Technology 5, 953-958 (1987); Lau et al., Bio/Technology 6, 734 (1988)].
Die relativ rasche Ausscheidung von menschlichem t-PA der Wildform aus Plasma ist zwar ein Vorteil für Patienten, die nach einer Thrombolyse sofort behandelt werden müssen, verlangt aber eine kontinuierliche intravenöse Verabreichung, um therapeutische Werte von t-PA im Blut aufrechtzuerhalten. Die empfohlene Gesamtdosis an Activase -t-PA für die thrombolytische Therapie bei akuter Lungenembohe erwachsener Patienten beträgt 100 mg, die als intravenöse Dauerinfusion über einen Zeitraum von 2 Stunden verabreicht werden. t-PA-Derivate mit längerer Plasmahalbwertszeit (langsamere Ausscheidung) könnten als Bolusinjektion verabreicht werden und würden höhere Plasmakonzentrationen ergeben als jene, die mit einer Dauerinfusion von t-PA der Wildform erreichbar sind, was zu einer Verringerung der wirksamen Dosis führen kann. t-PA-Mutanten mit langsamerer Ausscheidung würden bei der Behandlung von Zuständen wie der Thrombose tiefliegender Venen, der Behandlung nach Reperfusion eines lnfarktopfers, der Behandlung von Lungenembohe oder der Behandlung peripherer arterieller Thrombose (peripherer Gefäßerkrankung) große Vorteile bieten.
Die Notwendigkeit von t-PA-Varianten, die in Bolusform verabreicht werden können, wird durch das Interesse in jüngster Zeit an der Bolusverabreichung von menschlichem t-PA der Wildform (insbesondere in einkettiger Form) zur Förderung von früher infarktverbundener Koronararteriendurchgängigkeit und zur Verbesserung des Hilfe bei Myokardinfarkt unterstrichen [Verstraete et al., Lancet 14, 1566-1569 (1989; Neuhaus, JACC 14, 1566-1569 (1989); Khan et al., Am. j. Cardiol. 65, 1051-1056 (1990); Purvis, JA. et al., Am. J. Cardiology 68, 1570-1574 (1991)]. Ergebnisse klinischer Untersuchungen aus jüngster Zeit lassen nicht nur erkennen, daß die intravenöse Bolusverabreichung von menschlichem t-PA der Wildform das Einsetzen thrombolytischer Therapie beschleunigt, sondern auch, daß das rasche Erreichen einer relativ hohen t-PA- Konzentration die Thrombolyse verstärkt [Neuhaus, K.L., s.o., Topol, E.J., J, Am. Coll. Cardiol. 15, 922-924 (1990)].
t-PA-Varianten mit verringerter Ausscheidung wurden durch Deletion einzelner Aminosäuren, Teildomänen oder vollständiger Domänen aus dem Molekül gebildet. Die folgenden Veröffentlichungen sind repräsentative Beispiele für Versuche, die Ausscheidungsrate von t-PA der Wildform durch Deletion eines Teils oder aller Wachstumsfaktor- und/oder Fingerdomänen, gegebenenfalls komhiniert mit anderen Mutationen, zu verringern: Browne et al., 1988, so.; Johannessen et al., Thromb. Haemostas, 63, 54-59 (1990); Colien et al., 1988, so.; Kalyan et al., 1988, so.; Sobel et al., Circulation 81, 1362-73 (1990); Cambier et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 11: 468 (1988); Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 30: 91(1990); Trill et al., Fibrinolysis 4, 131-140 (1990); US-Patent Nr. 4.935.237 (veröffentlicht am 19. Juni 1990); EP-A-241.208 (veröffentlicht am 14. Oktober 1987); EP-A-240.334 (veröffentlicht am 7. Oktober 1987). Eine t-PA-Variante mit einer verdoppelten Kringle-2-Domäne und einer Berichten zufolge verringerten Plasmaausscheidung wurde durch Collen et al., Thromb. Haemost. 65,174-180(1991) geoffenbart.
Eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutions-t-PA-Varianten wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit bewertet, die Ausscheidungsrate zu reduzieren und/oder die Halbwertszeit von t-PA zu erhöhen. Substitutionen in den Aminosäurebereichen 63-72 (und insbesondere an den Positionen 67 und 68) und 42-49 verlängern laut Berichten die Plasmahalbwertszeit von menschlichem t-PA der Wildform [siehe WO-89/12681, veröffentlicht am 28. Dezember 1989, und Ahern et al., J. Biol. Chem. 265, 5540 (1990)]. Die Substitution von Arginin an Position 275 von nativem, reifem t-PA durch Glutaminsäure weist laut Berichten eine Ausscheidungsrate auf, die etwa zweimal langsamer ist als jene von menschlichem t-PA der Wildform [Hotchkiss et al., Thromb. Haemost., 58: 491 (1987)].
Eine weitere Vorgangsweise zur Verringerung der Ausscheidungsrate und/oder Verlängerung der Halbwertszeit von t-PA umfaßt das Komplexieren des t-PA-Moleküls mit einem zweiten Molekül. Beispielsweise wurde berichtet, daß ein t-PA-Polyethylenglykol-Konjugat die Ausscheidungsrate von t-PA reduziert (siehe EP-A-304.311, veröffentlicht am 22. Februar 1 989). Ein monoklonaler Antikörper gegen t-PA verlängert die funktionelle Halbwertszeit von t-PA in vivo, ohne seine Aktivität zu verringern (siehe EP-A-339.505 vom 2. November 1989).
Die Beteiligung von Kohlehydraten an der Ausscheidung von t-PA wurde ebenfalls untersucht. t-PA-Varianten mit anderem Kohlehydratprofil als menschlicher t-PA der Wildform wurden hergestellt und untersucht.
Als Beispiele dieser Vorgangsweise wurden eine oder mehrere der Positionen 60, 64, 65, 66, 67, 78, 79, 80, 81, 82, 103, 105, 107 und 250 durch geeignete Aminosäuren substituiert, um Moleküle mit Glykosylierungsstellen in oder in der Nähe einiger dieser Reste zu schaffen (siehe die am 30. November 1989 veröffentlichte WO-89/11531). Von diesen t-PA-Varianten besaß z.B. die T103N-t-PA-Mutante zusätzliche Glykosylierung eine etwa fünfmal langsamere Ausscheidung als nativer t-PA.
Andere Arbeiten konzentrierten sich auf die Umwandlung der Glykosylierungsstellen von t-PA der Wildform in nichtglykosylierte Stellen. Eine unglykosylierte Variante von t- PA, die aus der Kringle-2- und Protease-Domäne besteht, besitzt laut Berichten eine langsamere Plasmaausscheidung als t-PA der Wildform [Martin et al., Fibrinolysis 4 (Suppl.3): 9 (Abstract 26) (1990)]. Hotchkiss et al. [Thromb. Haemost., 60: 255 (1988)] entfernten selektiv Oligosaccharidreste aus dem t-PA-Molekül und zeigten, daß die Entfernung dieser Reste die Ausscheidungsrate von t-PA verringerte. Diese Forscher sowie Lau et al. [(1987), s.o.; (1988), s.o.] erzeugten auch die t-PA-Variante N117Q (worin Asparagin an Position 117 des menschlichen t-PA der Bildform durch Glutamin substituiert war), um die Glykosylierung an Position 117 zu verhindern. Diese Variante zeigte ähnlich wie jene, die durch enzymatische Entfernung des mannosereichen Oligosaccharids an dieser Position erhalten wurde, eine etwa zweimal langsamere Auscheidungsrate als menschlicher t-PA der Wildform. Siehe auch EP-A-238.304 vom 23. September 1987 und EP-A-227.462 vom 1. Juli 1987.
Außerdem wurden weitere menschliche t-PA-Glykosylierungsvarianten beschrieben und in den folgenden Publikationen berichtet, dass diese mit reduzierte Ausscheidungsraten aufweisen: Ahern et al., s.o. (Q42N, H44E, N117Q-t-PA); Collen et al., (1988), so. [del(C6-186)N 117Q-t-PA und del(C6-186)N 117Q, N184Q, N448Q-t-PA]; Haigwood et al., Prot. Engineer.2, 611 (1989) (N117Q, N184Q-t-PA).
Die Anmelder stellten fest, daß die Verlängerung der Halbwertszeit im Kreislauf von menschlichem t-PA der Wildform durch das Hinzufügen zusätzlicher Glykosylierung an den Aminosäurepositionen 103-105 mit einem Verlust an Fibrinbindeaffinität und/oder Plasmagerinnselauflösungsaktivität einherging. Beispielsweise reduzierte der Austausch von Threonin durch Asparagin an Aminosäureposition 103 von menschlichem t-PA der Wildform die Ausscheidungsrate etwa um das Fünffache, führte aber auch zu einem Verlust der t-PA-Funktion, da die Fibrinbindeaffinität und Aktivität von t-PA deutlich verringert wurden. Obwohl aufgrund der niedrigeren Ausscheidungsrate die Plasmakonzentrationen dieser Glykosylierungsvariante etwa vier- bis fünfmal größer waren als eine äquivalente Dosis von Activase -t-PA, war somit aufgrund der reduzierten Aktivität die Verbesserung bezüglich der Effizienz oder der fibrinolytischen in vivo- Wirksamkeit gering.
Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf erfolgreich durchgeführten Forschungsarbeiten, die zeigen, daß ein Verlust der t-PA-Fibrinbindung aufgrund einer Änderung, deren primäre Funktion die Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften (verringerte Plasmaausscheidung, verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf) von t-PA der Wildform ist, mit einer zusätzlichen Änderung wiederhergestellt werden kann, ohne die langsamere Ausscheidungsrate oder die erreichte verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf zu beeinträchtigen. Die vorliegende Erfindung beruht weiters auf Versuchsdaten, die beweisen, daß die in vivo- (fibrinolytische) Gerinnselauflösungswirksamkeit solcher t-PA-Varianten deutlich gegenüber menschlichem t-PA der Wildform verbessert werden kann, insbesondere wenn die Veränderungen im Glykosylierungsmuster von t-PA mit zusätzlichen spezifischen Änderungen in der t-PA- Proteasedomäne einhergehen. Das Ergebnis sind Moleküle mit gesteigerter fibrinolytischer Wirksamkeit in bezug auf t-PA der Wildform, die auch zu einer rascheren Auflösung von Plasmagerinnseln fähig sind als t-PA der Wildform und zusätzlich eine verbesserte Fibrinspezifität aufweisen können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Anmelder stellten überraschenderweise fest, daß der Verlust an Fibrinbindung, der bei t-PA-Varianten mit langsamer Ausscheidung, die eine zusätzliche Glykosylierungsstelle an den Aminosäuren 103 bis 105 von menschlichem t-PA der Wildform aufweisen, durch Entfernen der funktionellen Kohlehydratstruktur an der Aminosäureposition 117 wettgemacht werden kann. Diese Änderungen erlauben in Kombination die Verlängerung der Halbwertszeit im Kreislauf, ohne die Fibrinbindeaffinität der t-PA- Variante zu beeinträchtigen. Die fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit (Gerinnselauflösung pro Dosiseinheit) von t-PA der Wildform kann auch verbessert werden, besonders wenn eine zusätzliche Änderung, die die Fibrinspezifität verbessert, in das Molekül eingebracht wird.
Demzufolge betrifft die Erfindung t-PA-Varianten, die an einer beliebigen der Positionen 103-105 glykosyliert sind und frei von funktioneller Kohlehydratstruktur an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform sind sowie a) eine verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf aufweisen, während die, Fibrinbindeaffinität von menschlichem t-PA der Wildform im wesentlichen beibehalten wird, oder b) eine im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verbesserte fibrinolytische in vivo- Wirksamkeit besitzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen solche t-PA-Varianten zumindest eine ähnliche Fibrinbindung wie menschlicher t-PA der Wildform auf.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzen solche t-PA-Varianten im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform eine verbesserte fibrinolytische in vivo- Wirksamkeit.
Neben dem Kohlehydrat an Aminosäurerest 117 des nativen t-PA-Moleküls behalten die t-PA-Varianten der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die funktionelle Kohlehydratstruktur an Positionen, die im menschlichen t-PA der Wildform glykosyliert sind, bei.
Die zusätzliche Glykosylierungsstelle befindet sich vorzugsweise an der Aminosäureposition 103 oder 105 von menschlichem t-PA der Wildform.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Glykosylierung N-gebunden, und die resultierenden Varianten enthalten ein Asparagin an einer beliebigen der Aminosäurepositionen 103-105 als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thrtripeptidylsequenz, worin X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, das die Glykosylierung verhindert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befindet sich die N-gebundene zusätzliche Glykosylierungsstelle an der Aminosäureposition 103 oder 105 des menschlichen t-PA der Wildform.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Entfernung der funktionellen Kohlehydratstruktur an Aminosäure 117 durch stellengerichtete Mutagenese der zugrundeliegenden DNA des Glykosylierungssignals Asn-X-Ser/Thr (worin X wie oben definiert ist). In den resultierenden t-PA-Varianten ist Asparagin an Position 117 der Aminosäuresequenz von t-PA der Wildform durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise Glutamin, ersetzt.
In einer weiteren Ausführungsform besitzen die Varianten der vorliegenden Erfindung eine im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verbesserte Fibrinspezifität.
Die Fibrinspezifität kann z.B. durch Einbringen einer zusätzlichen Änderung im Aminosäurebereich 296-302 oder 274-277 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform verbessert werden. Die Änderung ist vorzugsweise die Substitution jeder der Aminosäuren an den Positionen 296-299 durch Alanin oder der Austausch der Aminosäuren, die an Positionen 274-277 des t-PA der Wildform vorhanden sind (Phenylalanin, Arginin, lsoleucin, Lysin), durch Leucin, Histidin, Serin bzw. Threonin.
In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für die oben beschriebenen Varianten kodieren, repl izierbare Expressionsvektoren, die solche DNA- Sequenzen in einer transformierten Wirtzelle exprimieren können, transformierte Wirtzellen und ein Verfahren, das das Kultivieren der Wirtszellen umfaßt, um die für die t-PA-Varianten kodierenden DNAs zu exprimieren.
In einer weiteren Ausüihrungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Gefäßzustands bzw. einer Gefäßerkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Varianten im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung e einer Gefäßerkrankung oder eines Gefäßzustands in einem Säugetier, umfassend das Verabreichung einer wirksamen Menge der t-PA-Varianten an das Säugetier.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das den Verlust der Fibrinbindeaffinität aufgrund des Hinzufügen zusätzlicher Glykosylierung an einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle an einer beliebigen der Positionen 103-105 der menschlichen t-PA-Sequenz der Wildform durch zusätzliches Entfernen der funktionellen Kohlehydratstruktur an Aminosäureposition 117 im wesentlichen wettmacht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die Figuren 1 und 2 zeigen die Wirkung der Mutationen der vorliegenden Erfindung auf die Fibrinbindung der resultierenden t-PA-Varianten. Der Verlust an Fibrinbindung aufgrund einer zusätzlichen Glykosylierung an Aminosäureposition 103 von menschlichem t-PA der Wildform konnte durch die Entfernung der Kohlehydratstruktur an Position 117 des menschlichen t-PA-Moleküls der Wildform wettgemacht werden.
Die Figuren 3, 4, 5 und 6 zeigen die Ergebnisse des in vivo-Gerinnselauflösungsassays, der in einem arteriovenösen Shunt-Thrombolyse-Kaninchenmodell durchgeführt wurde.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

I. DEFINITIONEN

Die Ausdrücke "t-PA", "menschlicher t-PA" und "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator" beziehen sich auf menschlichen exogenen (gewebeartigen) Plasminogenaktivator mit fibrinolytischer Aktivität, der typischerweise eine Struktur mit fünf Domänen aufweist (Finger-, Wachstumsfaktor-, Kringle-1-, Kringle-2 und Proteasedomäne), aber auch weniger Domänen oder Wiederholungen einiger seiner Domänen aufweisen kann, wenn er nach wie vor als thrombolytisches Mittel wirkt. Der t-PA besteht mindestens aus einer Proteasedomäne, die Plasminogen in Plasmin umwandeln kann, und einem N-terminalen Bereich, von dem man annimmt, daß er zumindest teilweise für die Fibrinbindung verantwortlich ist. Diese Ausdrücke umfassen somit Polypeptide, die diese funktionellen Domänen als Teil der Aminosäuresequenz des Polypeptids enthalten. Biologisch aktive Formen von t-PA können durch rekombinante Zellkultursysteme in Formen hergestellt werden, die die zwei funktionellen Bereiche des Moleküls und beliebige andere Abschnitte von t-PA umfassen, die ansonsten für die Quelle des t-PA nativ sind. Man beachte, daß natürliche Allelvariationen bestehen und in Individuen auftreten können, wie sich dies durch eine oder mehrere Aminosäuredifferenzen in der Aminosäuresequenz von t-PA jedes Individuums zeigt.
Die Ausdrücke "t-PA der Wildform", "nativer t-PA", "menschlicher t-PA der Wildform" und "nativer menschlicher t-PA" beziehen sich auf menschlichen t-PA mit Nativsequenz, d.h. jenen, für den die cDNA-Sequenz aus dem US-Patent Nr. 4.766.075 vom 23. August 1988 kodiert. Die Aminosäurestellenzahlen oder -positionen im t-PA- Molekül sind gemäß US-Patent Nr. 4.766.075. Der t-PA kann aus jeder beliebigen nativen Quelle stammen. Außerdem kann der t-PA aus jedem rekombinantem Expressionssystem stammen, einschließlich z.B. aus chinesischen Hamstereierstockzeilen (CHO-Zellen) oder menschlichen 293-Embryonierenzellen.
Die Ausdrücke "Fibrinbindung" und "Fibrinbindeaffinität" beziehen sich auf die Fähigkeit des t-PA-Moleküls, Fibringerinnsel in herkömmlichen Fibrinbindeassays zu binden, z.B. gemäß dem Verfahren von Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925 (1982) oder seiner in Beispiel 2 geoffenbarten modifizierten Version.
Die Ausdrücke "(t-PA) biologische Aktivität", "biologisch aktiv", "Aktivität" und "aktiv" beziehen sich auf die Fähigkeit des t-PA-Moleküls, Plasminogen in Plasmin umzuwandeln, wie dies im S-2251-Assay in Gegenwart eines Plasmagerinnsels oder in Gegenwart von Fibrin, im S-2288-Assay, dem Plasmagerinnselauflösungsassay, oder anderen geeigneten Assays gemessen wird. Der oder die Assay(s) kann/können in Gegenwart oder Abwesenheit potentieller Aktivitätsmodulatoren wie z.B. Fibrin, Fibrinogen, Plasma und/oder Plasmagerinnsel durchgeführt werden.
Die Ausdrücke "fibrinolytische Aktivität", "thrombolytische Aktivität" und "Gerinnselauflösungsaktivität" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Fähigkeit eines t-PA-Moleküls, ein Gerinnsel aufzulösen - ob aus gereinigtem Fibrin oder Plasma, unter Anwendung eines beliebigen, auf dem Gebiet bekannten in vitro-Gerinnselauflösungsassays wie z.B. des Assays zur Lyse gereinigter Gerinnsel von Carlson, R.H. et al., Anal. Biochem. 168, 428-435 (1988) Lind seiner modifizierten Form gemäß Bennett, W.F. etal., 1991, s.o.
Die Ausdrücke "spezifische fibrinolytische Aktivität", "spezifische thrombolytische Aktivität" und "spezifische Gerinnselauflösungsaktivität" beziehen sich auf die Gerinnselauflösung durch eine gleichbleibende, "steady state"-Plasmamenge, die durch jeden auf dem Gebiet bekannten in vitro-Gerinnselauflösungsassay wie z.B. einen der oben angeführten Assays bestimmt wird.
Die Ausdrücke "fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit", "thrombolytische in vivo- Wirksamkeit" und in vivo-Gerinnselauflösungswirksamkeit" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Gerinnselauflösung pro Dosiseinheit t-PA. Die "fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit" wird durch jedes bewährte Tiermodell des Gerinnselauflösungsassays bestimmt, z.B. durch das Lungenembolie-Hamstermodell (Collen, D. et al., 1991, so.) und das Jugularvenenthrombose-Kaninchenmodell [Collen, D. et al., J. Clin. Invest. 71, 368 (1983)]. Eine besonders bevorzugte Version des letzteren Modells ist weiter unten im Beispielteil beschrieben.
Der Ausdruck "die Fibrinbindung(saffinität) im wesentlichen beibehalten" (im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform) und grammatikalische Varianten dieser Phrase bedeuten hierin, daß die Fibrinbindeaffinität (offenkundiger Kd-Wert) des t-PA- Variantenmoleküls innerhalb des etwa Zweifachen der Fibrinbindeaffinität (Kd-Wert) für menschlichen t-PA der Wildform liegt, wie durch den gleichen Assay bestimmt wurde. Der Ausdruck "deutlich verbesserte Fibrinbindung" bezieht sich auf eine mehr als vierfache Zunahme der Fibrinbindeaffinität (scheinbarer Kd-Wert) einer t-PA-Variante, die durch das Einbringen einer zusätzlichen Mutation oder Mutationengruppe hervorgerufen wird. Der Ausdruck "verbesserte fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit" im Vergleich zu t-PA der Wildform bezieht sich auf die vergleichbare in vivo- Gerinnselauflösung, die durch die Verabreichung einer t-PA-Variante mit höchstens etwa einem Drittel der Dosis von t-PA der Wildform erzielt wird.
Die Ausdrücke "Ausscheidungs- bzw. Clearancerate" oder "Ausscheidung" bzw. "Clearance" beziehen sich auf die Rate, mit der das t-PA-Molekül aus dem Blutstrom entfernt wird. Die Ausscheidung(srate) wird in bezug auf nativen t-PA gemessen, sodaß eine verringerte Ausscheidung(srate) anzeigt, daß die t-PA-Variante langsamer ausgeschieden wird als nativer t-PA, und eine erhöhte Ausscheidung(srate) anzeigt, daß die t-PA-Variante rascher ausgeschieden wird als nativer t-PA.
Der Ausdruck "Fibrinspezifität" bezieht sich auf die Aktivität einer Mutante, die ein höheres Verhältnis von fibrinabhängiger spezifischer Aktivität zu fibrinogenabhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay aufweist als menschlicher rt-PA der Wildform, wobei das Verhältnis vorzugsweise zumindest 1,5 beträgt.
Der Terminus "Plasmagerinnselspezifität" bezieht sich auf die Aktivität einer Mutante, die ein höheres Verhältnis von plasmagerinnselabhängiger spezifischer Aktivität zu plasmaabhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay aufweist als rt-PA der Wildform, wobei das Verhältnis yorzugsweise zumindest 1,5 beträgt.
Die Ausdrücke "Zymogen", "zymogen" und "zym ogene Aktivität" werden hierin laut der Definition von WO-90/02798 vom 22. März 1990 verwendet. Gemäß dieser Definition ist das völlige Fehlen enzymatischer Aktivität keine Notwendigkeit.
Der Ausdruck "frei von funktioneller Kohlehydratstruktur an Aminosäureposition 117 von menschlichem t-PA der Wildform" bedeutet die vollständige Entfernung des Kohlehydrats an Aminosäurerest 117, z.B. wenn das Glykosylierungssignal durch stellengerichtete Mutagenese zerstört wird (Erklärung weiter unten), oder die fast vollständige Entfernung, z.B. durch Behandlung mit einer Endoglycosidase, wodurch z.B. ein intakter, an Asn 117 gebundener N-Acetylglucosaminrest übrig bleiben kann.
Die Ausdrücke "Aminosäure" und "Aminosäuren" beziehen sich auf alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Diese Definition umfaßt Norleucin, Ornithin und Homocystein. Die Aminosäuren werden entweder durch aus einem oder aus drei Buchstaben bestehenden Bezeichnungen identifiziert:
Asp D Asparaginsäure
Thr T Threonin
Ser S Serin
Glu E Glutaminsäure
Pro P Prolin
Gly G Glycin
Ala A Alanin
Cys C Cystein
Ile I Isoleucin
Leu L Leucin
Tyr Y Tyrosin
Phe F Phenylalanin
His H Histidin
Lys K Lysin
Arg R Arginin
Trp W Tryptophan
Val V Valin
Met M Methionin
Gln Q Glutamin
Asn N Asparagin
Diese Aminosäuren können nach der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden in zwei große Gruppen eingeteilt, geladen und ungeladen. Jede dieser Gruppen ist in Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:

I. Geladene Aminosäuren

Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin

II. Ungeladene Aminosäuren

Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Nichtpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
Die Ausdrücke "Änderung", "Aminosäuresequenzänderung", "Variante" und "Aminosäuresequenzvariante" beziehen sich auf t-PA-Moleküle mit einigen Unterschieden in ihren Aminosäuresequenzen im Vergleich zu nativem t-PA. Üblicherweise besitzen die Varianten zumindest 80% Homologie mit jenen Domänen von nativem t-PA, die in ihrer Struktur beibehalten werden, wobei sie vorzugsweise zu zumindest etwa 90% homolog mit soichen Domänen sind. Die Glykosylierungsvarianten von t-PA, die in den Schutzbereich der Erfindung fallen, enthalten gegebenenfalls auch Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen - zusätzlich zu jenen, die aus den beschriebenen Änderungen im Glykosylierungsmuster von t-PA resultieren.
t-PA-Substitutionsvarianten sind jene, bei denen zumindest ein Aminosäurerest in der nativen t-PA-Sequenz entfernt und eine andere Aminosäure an der gleichen Position an seiner Stelle eingefügt wurde. Die Subsitution kann einfach sein, d.h. es wurde nur eine Aminosäure im Molekül substituiert, oder sie kann mehrfach sein, d.h. zwei oder mehrere Aminosäuren wurden im gleichen Molekül substituiert.
Beträchtliche Änderungen in der Aktivität des t-PA-Moleküls können durch Substituieren einer Aminosäure mit einer Seitenkette, die sich hinsichtlich Ladung und/oder Struktur wesentlich von jener der nativen Aminosäure unterscheidet, erzielt werden. Man kann erwarten, daß diese Art der Substitution die Struktur des Polypeptidrückgrats und/oder die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls im Substitutionsbereich beeinflußt.
Moderate Änderungen der Aktivität des t-PA-Moleküls würden sich durch Substituieren einer Aminosäure mit einer Seitenkette ergeben, die eine ähnliche Ladung und/oder Struktur aufweist wie jene des nativen Moleküls Man kann erwarten, daß diese als konservative Substitution bezeichnete Art von Substitution weder die Struktur des Polypeptidrückgrats noch die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls im Substitutionsbereich wesentlich verändert.
t-PA-Insertionsvarianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar angrenzend an eine Aminosäure an einer bestimmten Position im nativen t- PA-Molekül insertiert sind. "Unmittelbar angrenzend an eine Aminosäure" bedeutet, daß sie entweder mit der funktionellen α-Carboxy- oder α-Aminogruppe der Aminosäure verbunden sind. Die Insertion kann aus einer oder mehreren Aminosäuren bestehen. Üblicherweise besteht die Insertion aus einer oder zwei konservativen Aminosäuren. Aminosäuren mit einer ähnlichen Ladung und/oder Struktur wie die an die Insertionsstelle angrenzenden Aminosäuren werden als konservativ bezeichnet. Alternativ dazu umfaßt die vorliegende Erfindung die Insertion einer Aminosäure mit einer Ladung und/oder Struktur, die sich wesentlich von den an die Insertionsstelle angrenzenden Aminosäuren unterscheidet.
Deletionsvarianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren im nativen t- PA-Molekül entfernt sind. Üblicherweise sind in Deletionsvarianten eine oder zwei Aminosäuren in einem bestimmten Bereich des t-PA-Moleküls entfernt.
Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Bezeichnungen für t-PA-Aminosäuresequenzvarianten sind unten beschrieben. Die Stelle einer bestimmten Aminosäure in der Polypeptidkette von t-PA ist durch eine Zahl identifiziert. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition in der Aminosäuresequenz des reifen menschlichen t-PA- Polypeptids der Wildform, wie dies in US-Patent Nr. 4.766.075 vom 23. August 1988 geoffenbart ist. In der vorliegenden Anmeldung werden ähnlich positionierte Reste in t- PA-Varianten mit diesen Zahlen bezeichnet, obwohl die tatsächliche Restenummer aufgrund von Deletionen oder Insertionen im Molekül nicht so numeriert ist. Dies ist z.B. bei stellengerichteten Deletions- oder Insertionsvarianten der Fall. Die Aminosäuren werden mittels des Einbuchstabencodes identifiziert. Substituierte Aminosäuren werden durch Identifizieren der Aminosäure aus der Wildform auf der linken Seite der Zahl, die die Position in der Polypeptidkette dieser Aminosäure angibt, und Identifizieren der substituierten Aminosäure auf der rechten Seite der Zahl gekennzeichnet.
Beispielsweise ergibt der Austausch der Aminosäure Threonin (T) durch Asparagin (N) an der Aminosäureposition 103 des menschlichen t-PA-Moleküls der Wildform eine als T103N-t-PA bezeichnete t-PA-Variante. In ähnlicher Weise bezeichnet man die t-PA- Variante, die durch zusätzliche Substitution von Asparagin (N) durch Glutamin (Q) an der Aminosäureposition 117 des menschlichen t-PA-Moleküls der Wildform erhalten wird, als T103N, N117Q-t-PA.
Deletionsvarianten werden durch Anführen des Aminosäurerests und der Aminosäureposition an beiden Enden der Deletion (einschließlich) sowie des griechischen Buchstabens Delta "Δ" links von den angegebenen Aminosäuren gekennzeichnet. Beispielsweise würde eine t-PA-Variante, die eine Deletion der Aminosäuren 296-299 enthält, als ΔK296-H297-R298-R299-t-PA bezeichnet werden, worin K, H und R für die Aminosäuren Lysin, Histidin bzw. Arginin stehen. Die Deletion einer einzelnen Aminosäure, z.B. K296, würde als ΔK296 bezeichnet werden. t-PA-Insertionsvarianten werden durch Verwendung von Klammern "[ ]" um die eingefügten Aminosäuren identifiziert, wobei die Insertionsstelle durch Angabe der Position der Aminosäure auf beiden Seiten der Insertion) gekennzeichnet wird. Beispielsweise würde eine Insertion der Aminosäure Alanin (A) zwischen Glutaminsäure an Position 94 und Asparaginsäure an Position 95 als E94[A]D95 bezeichnet werden. Zur besseren Übersichtlichkeit wird ein Komma "," verwendet, um mehrere Mutationen voneinander zu trennen, die in einem einzigen Molekül auftreten; ein Strichpunkt ";" wird gesetzt, um einzelne konstruierte t-PA-Molekülvarianten zu trennen, wenn mehrere t-PA-Molekülvarianten gemeinsam angeführt sind.
Die Ausdrücke "DNA-Sequenzkodieren", "DNA-Kodieren" und "Nukleinsäurekodieren" beziehen sich auf die Reihenfolge oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Desoxyribonukleinsäurestrangs. Die Reihenfolge dieser Desoxyribonukleotide bestimmt die Reihenfolge der Aminosäuren entlang der Polypeptidkette. Die DNA- Sequenz kodiert somit für die Aminosäuresequenz.
Die Ausdrücke "replizierbarer Expressionsvektor" und t-Expressionsvektor" beziehen sich auf ein üblicherweise doppelstrangiges DNA-Stück, dem möglicherweise ein Stück fremde DNA eingesetzt wurde. Fremde DNA wird als heterologe DNA definiert, d.h. DNA, die in der Wirtzelle nicht natürlich vorkommt. Der Vektor dient dazu, die fremde oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtzelle zu transportieren. Sobald er sich in der Wirtzelle befindet, kann sich der Vektor unabhängig von der chromosomalen Wirt- DNA replizieren und mehrere Kopien des Vektors und seiner eingefügten (fremden) DNA können gebildet werden. Außerdem enthält der Vektor die notwendigen Elemente, die die Translation der fremden DNA in ein Polypeptid ermöglichen. Es können somit viele Moleküle des Polypeptids, für das die fremde DNA kodiert, rasch synthetisiert werden.
Nukleinsäure wird "operabel verbunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise wird DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit einer für ein Polypeptid kodierenden DNA verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor bzw. Enhancer wird operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindestelle wird operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", daß die verbundenen DNA-Sequenzen angrenzend sind und - im Falle eines Sekretionsleaders - angrenzend sind und sich in Lesephase befinden. Verstärker müssen allerdings nicht angrenzend sein. Die Verbindung erfolgt durch Ligieren an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden synthetische Oligonukleotidadapter oder -linker gemäß herkömmlicher Verfahren verwendet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Termini "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" austauschbar verwendet und alle diese Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft.
Die Ausdrücke "transformierte (Wirt)Zelle", "Transformant" und "transformiert" beziehen sich auf die Einbringung von DNA in eine Zelle. Die Zelle wird als "Wirtzelle" bezeichnet. Die eingebrachte DNA liegt üblicherweise in Form eines Vektors vor, der ein insertiertes DNA-Stück enthält. Die eingebrachte DNA-Sequenz kann aus der gleichen Sequenz wie die Wirtzelle oder einer anderen Spezies als die Wirtzelle stammen oder eine Hybrid-DNA-Sequenz sein, die fremde und homologe DNA enthält. Die Ausdrücke "Transformanten" und "transformierte (Wirt)Zelle" umfassen die primäre vorliegende Zelle und daraus stammende Kulturen, ungeachtet der Anzahl an Transfers. Man beachte, daß aufgrund beabsichtiger oder unbeabsichtigter Mutationen möglicherweise nicht die gesamte Nachkommenschaft einen exakt identischen DNA-Inhalt aufweist. Die Mutantennachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Eigenschaft aufweisen, nach der in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind enthalten.
"Plasmide" werden mit einem kleingeschriebenen p bezeichnet, nach dem ein alphanumerischer Ausdruck steht. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich in uneingeschränktem Maße erhältlich oder mittels publizierter Verfahren aus solchen verfügbaren Plasmiden konstruierbar. Außerdem sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bekannt und für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.

II. ALLGEMEINE VERFAHREN

A. Auswahl von Varianten

Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O- gebunden. "N-gebunden" bezieht sich auf die Befestigung der Kohlehydratgruppe an der Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen, Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X jede beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist, sind Erkennungssequenzen zur enzymatischen Befestigung der Kohlehydratgruppe an der Asparaginseitenkette. O-gebundene Glykosylierung ist die Befestigung einer der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an einer Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin auch an O-gebundener Glykosylierung beteiligt sein können.
Glykosylierungsmuster für durch Säugetiere produzierte Proteine sind ausführlich in "The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control", Putnam, F.W., Hg., 2. Ausgabe, Bd. 4, Academic Press, New York, 1984, insbesondere S. 271-315, beschrieben. In diesem Kapitel werden asparagingebundene Oligosaccharide einschließlich ihrer Unterteilung in zumindest drei Gruppen, die als komplexe, mannosereiche und Hybridstrukturen bezeichnet werden, sowie glykosidisch gebundene Oligosaccharide besprochen.
Glykosylierungsmuster für durch Hefe produzierte Proteine sind ausführlich durch Tanner und Lehle, Biochim. Biophys. Acta, 906(1), 915-944(1987) beschrieben.
Typische N-gebundene Glykosylierungsmuster von aus Säugetierzellen und Hefe gebildeten Proteinen werden in Fig. 1 von WO-89/1 1531 vom 30. November 1989 verglichen.
Voruntersuchungen über die Kohlehydratstrukturen von nativem, aus Bowes- Melanomzellen gereinigtem t-PA (Melanom-t-PA, mt-PA) zeigten das Vorhandensein von mannosereichen Oligosacchariden an Position Asn 117 auf, wobei sich Oligosaccharide des Komplextyps an den Positionen Asn 184 und Asn 448 befanden [Pohl et al., Eur. J. Biochem. 170, 69-75 (1987)]. In t-PA vom Typ I sind alle drei N- gebundenen Positionen mit Kohlehydrat substituiert, während in t-PA vom Typ II kein Kohlehydrat an Position 184 befestigt ist; daher ist diese Position nur in etwa 50% der nativen t-PA-Moleküle glykosyliert. Ein ausführlicher Bericht [Parekh et al., Biochemistry 28, 7644-7662 (1989)] bestätigte diese Zuordnungen und zeigte überdies, daß 30% der Oligosaccharide sulfatiert waren.
Die Oligosaccharide für rekombinanten, aus transfizierten chinesischen Hamstereierstockzellen (CHO-Zel len) gereinigten t-PA der Wildform (rt-PA oder Activase-t-PA) wurden ebenfalls bestimmt [Speliman et al., J. Biol. Chem. 264, 14100- 14111 (1989)]; es stellte sich heraus, daß sie ein ähnliches Glykosylierungsmuster aufwiesen: mannosereiche Oligosaccharide an Asn 117, komplexe Oligosaccharide an Asn 184 und Asn 448, wobei die Asn 184-Stelle nur in 50% der Moleküle glykosyliert war.
Die Varianten der vorliegenden Erfindung müssen zumindest eine Aminosäuresequenz enthalten, die das Potential besitzt, Glykosylierung durch N- oder O-gebundene Bindung an einer der Aminosäurepositionen 103, 104 und 105 des menschlichen t-PA der Wildform zu ermöglichen.
Wird N-gebundene Glykosylierung angestrebt, ist die Glykosylierungsstelle in der Variante eine Tripeptidylsequenz mit der Formel Asparagin-X-Serin oder Asparagin-X- Threonin, worin Asparagin der Akzeptor ist und X eine beliebige der 20 genetisch kodierten Aminosäuren mit Ausnahme von Prolin ist, das bekanntermaßen die Glykosylierung verhindert. Siehe Struck, D.K. und Lennarz, W.J. in "The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans", W.J. Lennarz Hg., Plenum Press, 1980, S. 35; Marshall, R.D. Biochem. Soc. Symp. 40, 17 (1974); und Winzer, R.J. in "Hormonal Proteins and Peptides", Li, C.I. Hg., Academic Press, New York, 1973, S. 1-15. Die vorliegenden Aminosäuresequenzvarianten werden entweder durch Insertieren der geeigneten Aminosäure(n) an der oder den geeigneten Stelle(n), um die Glykosylierung zu bewirken (z.B. durch Zugabe des Asparagin-X-Serin/Threonin-Tripeptids nach Position 103, um die Oberflächenschleife zu vergrößern und mehr freizulegen) oder durch Substituieren der geeigneten Aminosäure(n) anstelle der die Aminosäure(n) an der oder den geeigneten Stelle(n), um die Glykosylierung zu bewirken, modifiziert.
Bei Anwendung von O-gebundener Glykosylierung tritt eine O-glykosidische Verbindung in Tierzellen zwischen N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose und einer der verschiedenen Hydroxyaminosäuren, am häufigsten Serin oder Threonin, doch in einigen Fällen auch mit einem 5-Hydroxyprolin- oder 5-Hydroxylysinrest, der sich im geeigneten Bereich des Moleküls befindet, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine N-gebundene Glykosylierungsstelle an den Aminosäurepositionen 103-105 von nativem menschlichem t-PA hinzugefügt. Für O-gebundene Glykosylierung werden eine oder mehrere Aminosäuren in diesen Bereichen durch Serin-, Threonin- oder 5-Hydroxylysinrest ersetzt oder ergänzt.
Derartige t-PA-Varianten sind in WO-89/11531, s.o., geoffen bart.
Die erfindungsgemäßen t-PA-Varianten sind weiters dadurch gekennzeichnet, daß ihnen die funktionelle Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 fehlt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die funktionelle Kohlehydratstruktur an allen anderen Aminosäurepositionen, die im nativen t-PA-Molekül glykosyliert sind, beibehalten. Eine solche selektive Entfernung der funktionellen Kohlehydratstruktur an Position 117 wird vorzugsweise durch Aminosäuresubstitution zumindest eines Rests im Asn-Ser-Ser-Glykosylierungssignal an den Positionen 117-119 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform erzielt. In einer besonders bevorzugten Variante wird Asparagin (N) an Aminosäureposition 117 durch eine andere Aminosäure ersetzt, wobei der bevorzugte Substituent Glutamin (Q) ist (siehe z.B. oben erwähnte EP- 238.304 und WO-89/04368).
In bevorzugten Varianten der vorliegenden Erfindung ist Threonin an Position 103 oder für Serin an Position 105 durch Asparagin substituiert sowie Alanin an Position 107 von nativem menschlichem t-PA durch Serin substituiert; Asparagin (N) an Position 117 ist durch eine andere Aminosäure ersetzt, wobei der bevorzugte Substituent Glutamin (Q) ist.
Die vorliegenden Plasminogenaktivatoren enthalten zusätzlich zu den obigen Modifikationen im Glykosylierungsmuster von nativem t-PA auch gegebenenfalls Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Resten in anderen Bereichen der nativen t-PA-Sequenz, um bestimmte Eigenschaften des Moleküls zu verbessern. Solche Modifikationen sind auf dem Gebiet bekannt. Ein allgemeiner Überblick über Plasminogenaktivatoren und ihre Derivate der zweiten Generation findet sich in Harris, Protein Engineering, 1: 449-458 (1987) und Linen, H.R. und Colien, D., Thromb. Haemost. 66(1) 88-110 (1991). Andere Zusammenfassungen von t-PA-Varianten finden sich in Pannekoek et al., Fibrinolysis, 2:123-132 (1988); Ross et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, Bd. 23, Kapitel 12 (1988), sowie Higgins und Bennett, 1990, s.o.
Beispielsweise ist eine Möglichkeit zur weiteren Steigerung der Ausscheidungsrate und/oder Halbwertszeit die Entfernung eines Teils oder der gesamten Finger- und/oder Wachstumsfaktordomäne aus den erfindungsgemäßen t-PA-Varianten. Alternativ oder zusätzlich dazu können die vorliegenden t-PA-Varianten Resistenz gegenüber proteolytischer Spaltung an oder um die Aminosäuren 275 und 276 und/oder Aminosäuremodifikationen in der mutmaßlichen Lysinbindestelle der Kringle 2-Domäne von t-PA aufweisen.
Es wurde als besonders wünschenswert erachtet, t-PA-Varianten bereitzustellen, die neben ihrer langsameren Plasmaausscheidung fibrinspezifischer sind als t-PA der Wildform. Solche t-PA-Varianten wirken bevorzugter an der Stelle des Fibringerinnsels als unmodifizierter t-PA und es wird erwartet, dass diese daher zumeist zu einer Milderung der Nebenwirkungen üihren, die mit der Aktivierung von Plasminogen im Kreislauf in Zusammenhang stehen, d.h. weniger starken und häufigen Blutungskomplikationen.
Die Fibrinspezifität der t-PA-Varianten der vorliegenden Erfindung können durch beliebige zusätzliche auf dem Gebiet bekannte Änderungen verbessert werden.
Um ihre Fibrinspezifität zu steigern, kann eine erfindungsgemäße t-PA-Variante beispielsweise an den Aminosäurepositionen 296-302, vorzugsweise 296-299, der Serinprotease-Domäne weiter mutiert werden. In einer bevorzugten Variante ist jede der Aminosäuren Lysin (K), Histidin (H), Arginin (R), Arginin (R) an den Positionen 296-299 des t-PA der Wildform durch Alanin ersetzt. In einer anderen bevorzugten Variante sind die Arginine an den Positionen 298 und 299 beide durch Glutaminsäure ersetzt. In einer weiteren bevorzugten Variante sind Lysin (K), Histidin (H) und Prolin (P) an den Aminosäurepositionen 296, 297 und 301 des t-PA der Wildform zusätzlich durch Glutamin (Q), Asparagin (N) bzw. Serin (S) ersetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fibrinspezifität der erfindungsgemäßen t-PA-Varianten durch Ersetzen von Phenylalanin (F), Arginin (R), Isoleucin (I) und Lysin (K) an den Aminosäurepositionen 274, 275, 276 und 277 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform durch die Aminosäuren Leucin (L), Histidin (H), Serin (S) bzw. Threonin (T) gesteigert. Die letztere Änderung führt zu einem Verlust der Plasminspaltungsstelle; daher weisen die Varianten im wesentlichen eine einkettige Form auf.
Außerdem können die Moleküle der vorliegenden Erfindung substituiert sein oder Deletionen an bestimmten Positionen aufweisen, um zusätzliche erwünschte Eigenschaften wie z.B. eine zymogene Beschaffenheit zu verleihen. Diese Positionen umfassen im menschlichen t-PA z.B. die Substitution von Lysin, Histidin und Glutaminsäure durch Alanin an den Positionen 416-418 und die Substitution von Glutaminsäure, Arginin, Lysin und Glutaminsäure an den Positionen 426, 427, 429 und 430 durch Alanin, wie dies z.B. in WO-90/02798 vom 22. März 1990 beschrieben ist.
Beispiele für geeignete Mehrfachmutanten sind: T103N, N117Z-t-PA; S105N, A107S, N117Z-t-PA; T103N, N117Z, KHRR (296-299)AAAA-t-PA; S105N, A107S, N117Z, KHRR (296-299)AAAA-t-PA; 1103N, N117Z, R298E, R299E-t-PA; S105N, A107S, N117Z, R298E, R299E-t-PA; T103N, N117Z, K296Q, H297N, P301S-t-PA; S105N, A107S, N117Z, K296Q, H297N, P301S-t-PA; T103N, N117Z, FRIK(274-277)LHST-t-PA; S105, A107S, N117Z, FRIK(274-277)LHST-t-PA, worin Z eine beliebige der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Ausnahme von Asparagin (N) ist. Besonders bevorzugt sind die t-PA-Varianten, in denen an Position 117 Asparagin (N) durch Glutamin (Q) ersetzt ist.

B. Konstruktion von Varianten

Das Hinzufügen einer zusätzlichen Glykosylierung zum nativen t-PA-Molekül und die Entfernung von funktioneller Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 können durch jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren erfolgen.
Die chemische und enzymatische Kupplung von Glycosiden an Proteine kann unter Verwendung einer Vielzahl aktivierter Gruppen durchgeführt werden, wie dies z.B. durch Alpin und Wriston in CRC Crit. Rev. Biochem. S. 259-306 (1981) beschrieben ist. Die Vorteile der chemischen Kopplungsverfahren liegen darin, daß sie relativ einfach sind und kein kompliziertes enzymatisches Instrumentarium benötigen, das für die natürliche O- und N-gebundene Glykosylierung erforderlich ist. je nach angewendeter Kupplungsmethode können der oder die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freien Carboxylgruppen wie z.B. jene von Glutamin- und Asparaginsäure, (c) freien Sulfhydrylgruppen wie z.B. jenen von Cystein, (d) freien Hydroxylgruppen wie z.B. jenen von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatischen Resten wie z.B. jenen von Phenylalanin, Tyrosin, oder Tryptophan oder (f) der Amidgruppe von Glutamin befestigt werden. Diese Verfahren sind in WO-87/05330 (veröffentlicht am 11. September 1987) beschrieben.
Die Kohlehydratstruktur an Aminosäureposition 11 7 von nativem menschlichem t-PA kann z.B. durch die Verwendung einer Endoglycosidase wie z.B. Endoglycosydase H (Endo-H) zum Großteil entfernt werden. Endo-H ist nur zur (teilweisen) Entfernung von mannosereichen und Hybridoligosacchariden fähig. Unter geeigneten Bedingungen kann Endo-H demzufolge die mannosereiche Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 (Asn) von nativem t-PA (zum Großteil) entfernen, ohne die komplexen Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 funktionell zu beeinflussen. Diese Behandlung erfolgt durch an sich bekannte Verfahren, z.B. gemäß dem Verfahren von Tarentino et al., J. Biol. Chem. 249, 811(1974), Trimbe et al., Anal. Biochem. 141, 515 (1984) und Little et al., Biochem. 23, 6191(1984).
Die erfindungsgemäßen t-PA-Varianten werden vorzugsweise durch Mutieren der DNA- Sequenz, die für t-PA der Wildform kodiert, und Exprimieren der mutierten DNA- Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle konstruiert.
Die Modifikation, die geeignete(n) Aminosäure(n) im nativen Molekülen zu ändern oder einzufügen, sodaß die erwünschten Sequenzvariationen bewirkt werden, wird durch jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren durchgeführt, z.B. durch stellengerichtete Mutagenese oder Ligation der geeigneten Sequenz in die für das relevante Protein kodierende DNA (Beschreibung folgt).
Während jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Durchführung stellengerichteter Mutagenese in Frage kommt, wie dies z.B. durch Sambrook et al., [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)] geoffenbart ist, ist die oligonukleotidgerichtete Mutagenese das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der t-PA-Varianten der Erfindung. Dieses auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren [Adelman et al. DNA, 2: 183 (1983), Sambrook et al., s.o.] eignet sich besonders zur Bildung von Substitutionsvarianten, kann aber auch dazu verwendet werden, bequem Deletions- und Insertionsvarianten herzustellen.
Die Oligonukleotide werden mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren ohne Schwierigkeiten synthetisiert, z.B. durch jene, die durch Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978] beschrieben sind.
Mutanten mit mehr als einer substituierten Aminosäure können auf unterschiedliche Weise gebildet werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander angeordnet sind, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonukleotids mutiert werden, das für alle erwünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Wenn jedoch die Aminosäuren in einem bestimmten Abstand voneinander angeordnet sind (z.B. getrennt durch mehr als zehn Aminosäuren), ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonukleotid zu erzeugen, das für alle erwünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei Alternativverfahren angewendet werden. Im ersten Verfahren wird ein getrenntes Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure gebildet. Die Oligonukleotide werden dann gleichzeitig an die einstrangige Templat-DNA anneliert, und der zweite DNA-Strang, der vom Templat synthetisiert wird, kodiert für alle erwünschten Aminosäuresubstitutionen. Das alternative Verfahren umfaßt zwei oder mehrere Mutagenese-Durchgänge, um die erwünschte Mutante zu erzeugen.
Ein weiteres Verfahren zur Bildung von Mutationen in der DNA-Sequenz, die für t-PA der Wildform oder eine auf dem Gebiet bekannte Molekülvariante kodiert, z.B. um eine neue Glykosylierungsstellte gemäß der vorliegenden Erfindung einzubringen, umfaßt das Spalten der für das t-PA-Ausgangsmolekül kodierenden DNA-Sequenz an der geeigneten Position durch Spaltung mit Restriktionsenzymen, das Gewinnen der richtig gespaltenen DNA, das Synthetisieren eines Oligonukleotids, das für die für Glykosylierung und Flankierungsbereiche erwünschte Aminosäuresequenz kodiert, wie z.B. Polylinker mit stumpfen Enden (oder anstelle von Polylinkern das Spalten des synthetischen Oligonukleotids mit den Restriktionsenzymen, die auch dazu verwendet werden, die für t-PA kodierende DNA zu spalten, wodurch kohäsive Termini geschaffen werden), und das Ligieren der synthetischen DNA in den Rest des t-PA kodierenden Strukturgens.
Die PCR-Mutagenese ist ebenfalls geeignet, um die t-PA-Varianten der vorliegenden Erfindung zu bilden; siehe z.B. US-Patent Nr. 4.683.195, veröffentlicht am 28. Juli 1987, und "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., Hg., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Bd. 2, Kapitel 15, 1991.
Die für die t-PA-Varianten der Erfindung kodierende cDNA wird zur weiteren Klonierung oder Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert.
Zweckmäßige Vektoren werden mittels herkömmlicher Verfahren für rekombinante DNA gebildet. Isolierte Plasmide und DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten, und in einer spezifischen Reihenfolge miteinander ligiert, um die erwünschten Vektoren zu bilden.
Nach der Ligation wird der Vektorm mit dem nun insertierten fremden Gen in eine geeignete Wirtszelle transformiert. Die transformierten Zeilen werden durch Wachstum auf einem Antibiotikum ausgewählt, üblicherweise Tetracyclin (tet) oder Ampicillin (amp), gegen die sie aufgrund der Gegenwart von tet- und/oder amp-Resistenzgenen auf dem Vektor resistent gemacht wurden. Wenn das Ligationsgemisch in eine eukaryotische Wirtzelle transformiert wurde, können transformierte Zellen durch das DHFR/MTX-System ausgewählt werden. Die transformierten Zellen werden in Kultur gezüchtet und die Plasmid-DNA (Plasmid bezieht sich auf den an das Fremdgen von Interesse ligierten Vektor) dann isoliert. Dieses Plasmid-DNA wird dann durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung analysiert. Das DNA-Sequenzieren erfolgt im allgemeinen entweder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).
Prokaryoten sind die bevorzugten Wirtzellen für die anfänglichen Klonierungsschritte der vorliegenden Erfindung. Sie eignen sich besonders zur raschen Herstellung großer Mengen an DNA, zur Bildung einstrangiger DNA-Template, die zur stellengerichteten Mutagenese verwendet werden, zum gleichzeitigen Screenen zahlreicher Mutanten und zum DNA-Sequenzieren der hergestellten Mutanten. Zweckmäßige prokaryotische Wirtzellen umfassen E.coli K12 Stamm 294 (ATCC-Nr. 31.446), E. coli Stamm W3110 (ATCC-Nr. 27.325), E. coli X1776 (ATCC-Nr. 31-537) und E. coli B; viele andere Stämme von E. coli wie z.B. HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 und zahlreiche andere Spezies und Gattungen von Prokaryoten können aber ebenso verwendet werden. Natürlich sind dies nur veranschaulichende - und nicht einschränkende - Beispiele.
Plasmidvektoren, die Replicon- und Steuersequenzen enthalten, die aus einer mit der Wirtzelle verträglichen Spezies stammen, werden mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor besitzt üblicherweise eine Replikationsstelle, Markergene, die für phenotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen, einen oder mehrere Promotoren und einen Polylinkerbereich, der mehrere Restriktionsstellen zur Insertion von Fremd-DNA enthält. Typischerweise zur Transformation von E. coli verwendete Plasmide umfassen pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 und Bluescript M12, von denen alle in den Abschnitten 1.12-1.20 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind. Viele andere geeignete Vektoren sind auch erhältlich. Diese Vektoren enthalten Gene, die für Ampicillin- und/oder Tetracyclinresistenz kodieren, wodurch die mit diesen Vektoren transformierten Zellen in der Gegenwart dieser Antibiotika wachsen können.
Die am häufigsten in prokaryotischen Vektoren verwendeten Promotoren umfassen die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198:1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8: 4057 [1980]; EPO Anmeldung Veröff. Nr. 36.776) sowie das alkalische Phosphatase- System. Diese kommen zwar am häufigsten zur Anwendung, doch wurden auch andere mikrobielle Promotoren verwendet und Details über ihre Nukleotidsequenzen veröffentlicht, wodurch sie Fachleute auf dem Gebiet funktionell in Plasmidvektoren ligieren können (siehe Siebenlist et al., Celi, 20: 269 [1980]).
Zur Expression der erfindungsgemäßen t-PA-Varianten werden eukaryotische Wirte wie z.B. eukaryotische Mikroben (Hefe) und multizelluläre Organismen (Säugetierzellkulturen) verwendet.
Saccharomyces cerevisiae bzw. herkömmliche Backhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtmikroorganismen. Es sind jedoch einige andere Gattungen, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und für die vorliegenden Zwecke geeignet, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP-139.383, veröffentlicht am 2. Mai 1985]; Kluyveromyces-Wirte (US-PS 4.943.529; Fleer et al., s.o.) wie z.B. K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178); K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., s.o.), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia [EP-402.226]; Pichia pastoris [EP-183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesii [EP-244.234]; Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)]; Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis [EP-394.538, veröffentlicht am 31. Oktober 1990]; und filamentöse Pilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO-91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991] und Aspergillus- Wirte wie z.B. A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)] und A. niger [Kelly und Hynes, EMBO J., 4: 475- 479 (1985)].
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3- Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 [1978]) wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Gluocose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden auch die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen 3' von der zu exprimierenden Sequenz in den Expressionsvektor ligiert, um für die Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind der Promotorbereich für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme im Zusammenhang mit dem Stickstoffstoffwechsel und die obige Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der einen hefeverträglichen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zellkulturen aus multizellulären Organismen können zur Durchführung der Erfindung als Wirte verwendet werden. Es kommen zwar sowohl Wirbeltierzellkultur als auch Zellkulturen von Wirbellosen in Frage, doch sind Wirbeltierzellkulturen, insbesondere Säugetierkulturen, vorzuziehen. Beispiele geeigneter Zelllinien sind die durch SV40 transformierte Affenn ieren-CVI-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonennierenlinie 2935 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 [1977]); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]), Mäuse- Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243 [1980]), Affennierenzellen (CVI-76, ATCC CCL 70); Nierenzelle afrikanischer Grüner Meerkatzen (VERO-76; ATCC CRL- 1587); menschliche Eierstockkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL 51); Rattenhepatomzellen (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol., 85:1 [1990]); und TRI-Zeilen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44 [1982]). Expressionsvektoren für diese Zeilen umfassen üblicherweise (falls erforderlich) DNA-Sequenzen für einen Replikationsursprung, einen Promotor, der sich vor dem zu exprimierenden Gen befindet, eine Ribosomenbindestel le, eine RNA-Spleißstelle, eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminationsstelle.
Die in Säugetierexpressionsvektoren verwendeten Promotoren sind oft viralen Ursprungs. Diese viralen Promotor stammen oft aus dem Polyomvirus, Adenovirus2 und am häufigsten aus dem Simianvirus 40 (SV40). Das SV40-Virus enthält zwei Promotoren, die als früher und später Promotor bezeichnet werden. Diese Promotoren sind besonders geeignet, da sie leicht als ein DNA-Fragment, das auch den viralen Replikationsursprung enthält, aus dem Virus erhalten werden können (Fiers et al., Nature, 273: 113 [1978]). Kleinere oder größere SV40-DNA-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, sofern sie die etwa 250 bp große Sequenz umfassen, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist, erstreckt.
Alternativ dazu können auch Promotoren, die auf natürliche Weise mit dem Fremdgen assoziiert sind (homologe Promotoren) verwendet werden, sofern sie mit der zur Transformation ausgewählten Wirtzelllinie verträglich sind.
Ein Replikationsursprung kann aus einer exogenen Quelle wie z.B. SV40 oder einem anderen Virus (z.B. Polyom, Adeno, VSV, BPV) erhalten und in den Kloniervektor insertiert werden. Alternativ dazu kann der Replikationsursprung durch den chromosomalen Wirtzellreplikationsmechanismus bereitgestellt werden. Wenn der das Fremdgen enthaltende Vektor in das Wirtzellenchromosom integriert wird, reicht der letztere oft aus.
Zufriedenstellende Mengen an menschlichem t-PA werden durch transformierte Zellkulturen produziert. Die Verwendung einer sekundären DNA-Kodiersequenz kann jedoch die erzeugten Mengen steigern. Die sekundäre Kodiersequenz umfaßt typischerweise das Enzym Dihydrofolatreductase (DHFR). Die Wildform von DHFR wird normalerweise durch die Chemikahe Methotrexat (MTX) gehemmt. Das Ausmaß der DHFR-Expression in einer Zelle variiert je nach Menge des den kultivierten Wirtzellen zugegebenen MTX. Ein zusätzliches Merkmal von DHFR, das es zu einer besonders geeigneten sekundären Sequenz macht, ist die Tatsache, daß es als Selektionsmarker zum Identifizieren transformierter Zeilen verwendet werden kann.
Zwei Formen von DHFR stehen zur Verwendung als Sekundärsequenzen zur Verfügung - DHFR der Wildform und MTX-resistente DHFR. Die Art der in einer bestimmten Wirtzelle verwendeten DHFR hängt davon ab, ob die Wirtzelle einen DHFR-Mangel aufweist (sodaß sie entweder sehr geringe Werte an DHFR endogen erzeugt oder überhaupt keine funktionelle DHFR erzeugt). Zelllinien mit DHFR-Mangel wie z.B. die durch Urlaub und Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 [1980]) beschriebene CHO-Zelllinie werden mit DHFR-Kodiersequenzen der Wildform transformiert. Nach der Transformation exprimieren diese Zelllinien mit DHFR-Mangel funktionelle DHFR und können in einem Kulturmedium wachsen, dem die Nährstoffe Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlen. Nichttransformierte Zellen überleben in diesem Medium nicht.
Die MTX-resistente Form von DHFR kann als Mittel zur Auswahl transformierter Wirtzellen in jenen Wirtzellen verwendet werden, die endogen normale Mengen an funktioneller DHFR erzeugen, die MTX-empfindlich ist. Die CHO-K1-Zelllinie (ATCC Nr. CL 61) besitzt diese Eigenschaften und ist demnach eine zu diesem Zweck geeignete Zelllinie. Die Zugabe von MTX zum Zellkulturmedium ermöglicht das Wachsen nur von Zellen, die mit der für die MTX-resistente DHFR kodierenden DNA transformiert sind. Die nichttransformierten Zellen können in diesem Medium nicht überleben.
Die zur Bildung der Varianten der Erfindung verwendeten Säugetierwirtzellen können in einer Vielzahl an Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien wie z.B. Ham's F10 (Sigma), das Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) eignen sich zum Kultivieren der Wirtzellen. Darüber hinaus kommen die durch Ham und Wallace (Meth. Enz., 58: 44 [1979]), Barnes und Sato (Anal. Biochem., 102: 255 [1980]), US-Patente Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762 oder 4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; und US-Patent Nr. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtzellen in Frage. Alle diese Medien können im Bedarfsfall mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z. B. Insul in, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (z.B. HEPES), Nucleosiden (z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (z.B. Gentamycin), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Jeder andere notwendige Zusatz kann auch in geeigneten Konzentrationen vorhanden sein, die für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sind.
Viele eukaryotische Proteine, die normalerweise aus der Zelle sekretiert werden; enthalten eine endogene Signalsequenz als Teil der Aminosäuresequenz Diese Sequenz dient als Signal für den Export des Proteins aus der Zelle über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat. Die Signalsequenz befindet sich typischerweise am Aminoterminus des Proteins und weist eine Länge von etwa 13 bis etwa 36 Aminosäuren auf. Obwohl die tatsächliche Sequenz unter den Proteinen variiert, enthalten alle bekannten eukaryotischen Signalsequenzen zumindest einen positiv geladenen Rest und einen sehr hydrophoben Abschnitt von 10-15 Aminosäuren (üblicherweise reich an den Aminosäuren Leucin, lsoleucin, Alanin, Valin und Phenylalanin) in der Nähe der Mitte der Signalsequenz. Die Signalsequenz fehlt normalerweise in der sekretierten Form des Proteins, da sie durch eine auf dem endoplasmatischen Retikulum angeordnete Signalpeptidase während der Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum abgespalten wird. Das Protein mit seiner noch befestigten Signalsequenz wird oft als "Präprotein" oder unreife Form des Proteins bezeichnet.
Es enthalten aber nicht alle ausgeschiedenen Proteine eine aminoterminale Signalsequenz, die abgespalten wird. Einige Proteine wie z.B. Ovalbumin enthalten eine Signalsequenz, die sich in einem inneren Bereich des Proteins befindet. Diese Sequenz wird während der Translokation normalerweise nicht gespalten.
Proteine, die man normalerweise im Zytoplasma vorfindet, können für die Sekretion bereitgemacht werden, indem eine Signalsequenz mit dem Protein verbunden wird. Dies geschieht problemlos durch Ligieren von für eine Signalsequenz kodierender DNA an das 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA und anschließendes Exprimieren dieses Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtzelle. Die für die Signalsequenz kodierende DNA kann als Restriktionsfragment aus jedem Gen erhalten werden, das für ein Protein mit einer Signalsequenz kodiert. Somit eignen sich hierin je nach Art der zur Durchführung der Erfindung verwendeten Wirtzelle prokaryotische, Hefe- und eukaryotische Signalsequenzen. Die für den Signalsequenzabschnitt des Gen kodierende DNA wird mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und dann in die für das zu sekretierende Protein kodierende DNA, d.h. t-PA, ligiert.
Die Auswahl einer funktionellen Signalsequenz erfordert, daß die Signalsequenz von der Wirtzellensignal-Peptidase erkannt wird, sodaß die Abspaltung dieser Signalsequenz und die Sekretion des Proteins erfolgen. Die DNA und Aminosäuresequenz, die für den Signalsequenzabschnitt mehrerer eukaryotischer Gene kodieren, einschließlich z.B. das menschliche Wachstumshormon, Promsulin und Proalbumin, sind bekannt (siehe Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York [1988], S. 769) und können als Signalsequenzen in zweckmäßigen eukaryotischen Wirtzellen verwendet werden. Hefesignalsequenzen, z.B. saure Phosphatase (Arima et al., Nuc. Acids Res., 11: 1657 [1983]), Alphafaktor-alkalische Phosphatase und Invertase können dazu dienen, um die Sekretion aus Hefewirtzeflen zu lenken. Prokaryotische Signalsequenzen aus Genen, die z.B. für Lamb oder OmpF (Wong et al., Gene 68: 193 [1988]), MalE, PhoA oder β-Lactamase kodieren, sowie andere Gene können dazu verwendet werden, Proteine aus prokaryotischen Zellen ins Kulturmedium zu lenken.
Ein alternatives Verfahren zur Bereitstellung eines Proteins von Interesse mit einer Signalsequenz, sodaß es sekretiert werden kann, besteht in der chemischen Synthese der für die Signalsequenz kodierenden DNA. Bei diesem Vefahren werden beide Stränge eines für die ausgewählte Signalsequenz kodierenden Oligonukleotids chemisch synthetisiert und dann miteinander anneliert, um ein Duplex zu bilden. Das doppeistrangige Oligonukleotid wird dann mit dem 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA ligiert.
Das Konstrukt, das die DNA enthält, die für das Protein mit der daran ligierten Signalsequenz kodiert, kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Dieser Expressionsvektor wird in eine geeignete Wirtzelle transformiert und das Protein von Interesse exprimiert und sekretiert.
Kulturen von Säugetierwirtzellen und anderen Wirtzellen, die keine starren Zellmembransch ranken besitzen, werden üblicherweise nach dem Calciumphosphatverfahren transformiert, das ursprünglich durch Graham und Van der Eb (Virology, 52: 546 [1978]) beschrieben wurde, und modifiziert (siehe Abschnitte 16.32-16.37 von Sambrook et al., s.o.). Andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen wie z.B. Polybrene (Kawai und Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:11 72 [1984]), Protoplastenfusion (Schaffner, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 2163 [1980], Elektroporation (Neumann et al., EMBO J., 1: 841 [1982]) und direkte Mikroinjektion in Kerne (Capecchi, Cell, 22: 479 [1980]) kommen ebenfalls in Frage.
Hefewirtzellen werden im allgemeinen unter Anwendung des Polyethylenglykol- Verfahrens transformiert (siehe Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 [1978]).
Prokaryotische Wirtzellen oder andere Wirtzellen mit starren Zellwänden werden vorzugsweise gemäß dem Calciumchloridverfahren transformiert, das in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., s.o., beschrieben ist. Alternativ dazu kann zur Transformation dieser Zellen die Elektroporation verwendet werden.
Die t-PA-Variante wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als sekretiertes Protein gewonnen, obwohl sie auch aus Wirtzelllysaten gewonnen werden kann, wenn sie direkt ohne Sekretionssignal exprimiert wird. Wenn die Variante in einer rekombinanten Zelle von nichtmenschlichem Ursprung exprimiert wird, ist die Variante somit vollkommen frei von Proteinen menschlichen Ursprungs. Es ist allerdings notwendig, die Variante von rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die in bezug auf Protein im wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um insbesondere Zellbruchstücke zu entfernen.
Die Variante wird dann von kontaminierenden löslichen Proteinen gereinigt, z.B. durch Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolausfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatografie auf Silika oder auf einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällen; oder Gelelektrophorese. Ein Protease-Hemmstoff der die t-PA-Aktivität nicht beeinflußt, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann auch dazu dienen, den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antibiotika können enthalten sein, um das Wachstum hinzukommender Kontaminanten zu verhindern. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß für nativen t-PA geeignete Reinigungsverfahren möglicherweise Modifikationen erfordern, um Änderungen der Beschaffenheit von t-PA oder seiner Varianten bei Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die t-PA-Variante ausgeschieden, die geerntete Zellkulturflüssigkeit diafiltriert und die t-PA-Variante mittels Lysin- Affinitätschromatografie gereinigt. Alternativ dazu kann der Überstand der Zellkultur über eine mit PBS präkonditionierte Säule aus Glasperlen, an die polyklonaler Anti-t-PA- Ziegen-A6-Antikörper gekoppelt ist, geschickt werden gefolgt von Äquilibrieren der Säule mit einem Puffer und Elution der t-PA-Variante.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen zu bilden, wobei das t-PA-Produkt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt wird. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co., Oslo et al., Hg., beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge der t-PA- Variante, z.B. in der Größenordnung von etwa 0,5 bis etwa 5 mg/ml, gemeinsam mit einer zweckmäßigen Menge an Träger, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen zu bilden, die sich zur wirksamen Verabreichung an den Patienten eignen. Die t-PA-Variante kann parenteral an Patienten, die an kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden, oder durch andere Verfahren verabreicht werden, die ihre wirksame Zufuhr in den Blutstrom gewährleisten.
Zusammensetzungen, die sich zur klinischen Verabreichung der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendeten t-PA-Varianten besonders eignen, umfassen sterile wäßrige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver wie z.B. lyophilisiertes Protein. Typischerweise wird auch eine zweckmäßige Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Ein Puffer wie z.B. Argininbase in Kombination mit Phosphorsäure ist auch typischerweise in einer geeigneten Konzentration enthalten, um einen geeigneten pH- Wert, im allgemeinen von 5,5 bis 7,5, aufrechtzuerhalten. Zusätzlich oder alternativ dazu kann eine Verbindung wie z.B. Glycerin in der Formulierung enthalten sein, um die Haltbarkeit zu steigern.
Dosierungen und erwünschte Arzneimittelkonzentrationen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung variieren und hängen von der jeweiligen Variante und dem jeweiligen angepeilten Verwendungszweck ab. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung liegt klarerweise im Kompetenzbereich des Arztes, besonders im Hinblick auf die langen Erfahrungen mit der Verabreichung von rekombinantem menschlichem t-PA der Wildform. Aufgrund ihrer verlängerten Plasmahalbwertszeit eignen sich die erfindungsgemäßen t-PA-Varianten besonders zur Bolusverabreichung. Gemäß einer bevorzugten Verabreichungsart werden die erfindungsgemäßen t-PA- Varianten in einer anfänglichen intravenösen Bolusdosis verabreicht, die den t-PA- Ausscheidungsmechanismus im wesentlichen sättigt, gegebenenfalls gefolgt von weiteren Bolus- und/oder intravenösen Dauerverabreichungen. Für Varianten mit biologischer Aktivität, die mit jener von t-PA der Wildform vergleichbar ist, beträgt die bevorzugte Gesamtdosis etwa 100 mg. Aktivere Varianten erzielen die gleiche Wirkung bei niedrigeren Dosierungen. Varianten mit verbesserter Fibrinspezifität können bei höheren Dosierungen verabreicht werden, ohne das Risiko von Blutungskomplikationen beträchtlich zu steigern.
Als allgemeine Regel kann man festlegen, daß Dosierung und Dosierungsrate gleich hoch oder höher als in aktuellen klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer, thrombolytischer Mittel sein können, z.B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis in einem Zeitraum von 1,5 bis 12 Stunden bei menschlichen Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembohe usw. leiden.
Beispielsweise sind bei der Behandlung von Tiefvenenthrombose oder peripherer Gefäßerkrankung "Bolus"dosierungen in der Größenordnung von etwa 0,05 bis etwa 0,2 mg/kg im allgemeinen bevorzugt, wobei darauffolgende Verabreichungen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis etwa 0,2 mg/kg sind, um einen recht konstanten Blutwert zu halten, vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 3 µg/ml.
Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform wird ein Fläschchen, das 50 mg t-PA, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, mit 50 ml sterilem Injektionswasser rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen einer 0,9%-igen Natriumchloridinjektion vermischt.
Die t-PA-Varianten der Erfindung eignen sich auch zur Verhinderung von Fibrinablagerung oder Verwachsungsbildung oder -wiederbildung. Eine Ausführungsform dieser Verwendung ist in EPO-297.860 vom 4. Januar 1989 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt diese Art von Behandlung die topische Verabreichung einer Zusammensetzung an einer Stelle potentieller Fibrin- oder Verwachsungsbildung, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge der t-PA-Variante in einer gering löslichen Form umfaßt, die an dieser Stelle über einen Zeitraum von etwa drei Tagen bis zwei Wochen kontinuierlich freigesetzt wird. Typischerweise wird die t-PA- Variante bei einer Dosierung verabreicht, die ausreicht, um die Fibrinablagerung oder Bildung von Verwachsungen nach Operationen, Infektionen, Traumen oder Entzündungen zu verhindern. Üblicherweise reicht diese Menge von 0,02 mg/g Gel bis zu 25 mg/g Gel, vorzugsweise von 0,20 mg/g Gel bis etwa 2,5 mg/g Gel, am bevorzugtesten von 0,25 mg/g Gel bis etwa 1,0 mg/g Gel. Jede t-PA-Variante, die zur Verhinderung von Verwachsungsbildung und/oder Fibrinablagerung verwendet wird, wird typischerweise in einem halbfesten, schleimigen, pharmazeutisch inerten Träger formuliert, um das Enzym an die Stelle potentieller Verwachsungsbildung zu bringen. Der Träger enthält langkettige Kohlenwasserstoffe oder Pflanzenöle und Wachse aus Gemischen modifizierter gesättiger und ungesättigter Fettsäureglyceride. Beispiele sind haibfeste Vehikel wie z.B. raffinierte Naturvaseline oder halbsynthetische Glyceride, Polyhydroxylösungsmittel wie z.B. Glycerin, langkettige Kohlenwasserstoffe, biologisch abbaubare Polymere oder Liposome.
Die folgenden Beispiel veranschaulichen lediglich die derzeit beste Durchführungsart der Erfindung, schränken diese aber nicht ein.

BEISPIEL 1

Rekombinante Produktion der t-PA-Varianten

1. Vektorkonstruktion und Mutagenese

Die neuen t-PA-Varianten der Erfindung wurden im t-PA-Expressionsvektor pRK7-t-PA konstruiert (siehe z.B. WO-90/02798, veröffentlicht am 22. März 1990, und WO- 92/02612, veröffentlicht am 20. Februar 1992). Dieser Vektor, der Mutanten-t-PA oder t- PA der Wildform enthielt, diente zur Transfektion und Expression in menschlichen Embryonennierenzellen (293c).
Die stellengerichtete Mutagenese von t-PA-cDNA erfolgte gemäß dem Verfahren von Taylor et al., Nucl. Acids Res., 13: 8765 (1985) unter Verwendung eines Sets der Amerham Corporation (Katalognummer RPN 1253). Zur Herstellung der erwünschten Mutanten wurden Oligonukleotide der Sequenzen, die für die erwünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren, synthetisiert und als Primer verwendet. Diese Oligonukleotide wurden an einstrangigen pRK7-t-PA anneliert, der durch Standardverfahren gebildet worden war [Viera et al., Meth. Enz., 143: 3 (1987)].
Einige der t-PA-Varianten wurden mittels der Kunkel-Mutagenese gebildet [Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985) und Kunkel, T.A. et al., Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987)].
Ein Gemisch aus drei Desoxyribonukleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wurde mit einem modifizierten Thiodesoxyribocytosin, das als dCTP (aS) bezeichnet wird, das durch den Hersteller des Sets im Set bereitgestellt wurde, kombiniert, und dem einstrangigen pRK7-t-PA zugegeben, an den das Oligonukleotid anneliert wurde.
Nach Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wurde ein DNA-Strang gebildet, der bis auf die mutierten Basen mit pRK7-t-PA identisch war. Außerdem enthielt dieser neue DNA-Strang dCTP (aS) anstelle von dCTP, wodurch er vor Restriktionsendonukleasen-Spaltung geschützt war. Nach dem teilweisen Schneiden des Templatstrangs des doppelstrangigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym wurde der Templatstrang mit Exolil-Nuclease nach dem Bereich gespalten, der das mutagene Oligomer enthielt. Die Reaktion wurde dann abgebrochen, um ein Molekül übrig zu lassen, das nur teilweise einstrangig war. Ein vollständiges doppelstrangiges DNA-Homoduplexmolekül wurde dann durch DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase gebildet.
Die Oligonukleotide, die als Primer verwendet wurden, um pRK7-t-PA-Moleküle zu bilden, sind in nachstehender Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
a Einzellokusmutanten sind t-PA-Varianten, die durch Mutagenese mit einem einzelnen Oligonukleotid unter Verwendung von t-PA der Wildform als Templat hergestellt wurden.
Obwohl die Varianten S105N, A107S-t-PA und KHRR(296-299)AAAA-t-PA Mehrfachmutanten sind, da sie mehr afs eine Aminosäuresubstitution enthalten, wurden sie jeweils nur mit einem Oligonukleotid hergestellt. Dies war möglich, da die substituierten Aminosäuren in unmittelbarer Nähe zueinander in der Polypeptidkette angeordnet sind.
Eine geringfügige Variation der oben beschriebenen Vorgangsweise wurde zur Bildung zusätzlicher Mehrfachmutanten herangezogen. Für die unten beschriebenen Mutanten war die Templat-DNA nicht t-PA der Wildform (pRK7-t-PA). Stattdessen waren die verwendeten Template jene, die zumindest eine Einzelmutation enthielten, d.h. die DNA, die bei der Konstruktion der Mutanten von obiger Tabelle 1 hergestellt wurde. Die als Templat verwendete DNA und das zur Bildung der zusätzlichen Mutationen für jede "Doppellokus"mutante verwendete Oligonukleotid sind in unten angeführter Tabelle 2 aufgelistet. Die DNA-Sequenz jedes Oligonukleotids ist in obiger Tabelle 1 dargelegt. Die Sterne zeigen Varianten an, die die Erfindung veranschaulichen. Tabelle 2
b Doppellokusmutanten wurden mit DNA, die für eine Einzellokusmutante von t-PA kodiert, als Mutagenesetemplat hergestellt.=
Die folgenden Mehrfachmutanten ("Dreifachlokus") wurden im wesentlichen gemäß dem vorherigen Verfahren unter Verwendung der in der Templat-Spalte angeführten Mehrfachmutanten als Template gebildet. Die Sequenz jedes Oligonukleotids ist in obiger Tabelle 1 angeführt. Die Sterne zeigen Varianten an, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Tabelle 3
c Dreifachlokusmutanten wurden mit DNA, die für eine Doppellokusmutante von t-PA kodiert, als Mutagenesetemplat produziert.

II. Bakterielle Transformation und DNA-Herstellung

Die mutanten t-PA-Konstrukte, die gemäß der obigen Arbeitsvorschrift gebildet wurden, wurden durch das Standard-CaCl&sub2;-Verfahren (Abschnitte 1.76-1.84, Sambrook et al., s.o.) zur Herstellung und Transformation kompetenter Zellen in E. coli-Wirtstamm MM294tonA transformiert. Der E. coli-Stamm MM294tonA (der gegen den T1-Phagen resistent ist) wurde durch Insertion und anschließendes ungenaues Ausschneiden eines Tnlo-Transposons in das tonA-Gen hergestellt. Das Gen wurde dann mittels Transposon-Insertionsmutagenese [Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116:125-159 (1977)] in E. coli-Wirt MM294 (ATCC 31.446) eingefügt.
DNA wurde aus einzelnen Kolonien bakterieller Transformanten durch das Standard- Miniprepverfahren von Maniatis et al., s.o., extrahiert. Die Plasmide wurden durch Hindurchschicken durch eine Sephacryl CL6B-Spinsäule weiter gereinigt und dann durch Sequenzieren und durch Restriktionsendonuklease-Spaltung und Agarosegel- Elektrophorese analysiert.
Alternativ dazu wurde die Sequenz auf einstrangigem Niveau bestimmt, und die doppelstrangigen Plasmide wurden durch ein Qiagen-Plasmidset gemäß den Anweisungen der Lieferfirma aus den bakteriellen Transformanten gereinigt.

III. Transformation menschlicher Embryonennieren-293-Zellen

Menschliche Embryonennieren-293-Zellen wurden bis zu 70% Konfluenz in 6-Napf- Platten gezüchtet. 2,5 µg Plasmid, das für die t-PA-Mutante kodiert, wurden in 150 µl 1 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl&sub2; gelöst. Unter Vortexen wurden 150 µl 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub3;PO&sub4; zugetropft, und 10 Minuten lang bei 25ºC abgewartet, bis sich Niederschlag bildete. Der suspendierte Niederschlag wurde dann den Zellen. in den einzelnen Näpfen der 6-Napf-Platte zugegeben und konnte sich über Nacht im Inkubator absetzen. Das Medium wurde dann abgesaugt und 1 ml 20% Glycerin in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) zugegeben. Dann wurden 3 ml frisches serumfreies Medium zugegeben, und die Zellen wurden fünf Tage lang inkubiert. Das Medium wurde dann gesammelt und untersucht.
Die Transfektion zur Produktion und Reinigung der erfindungsgemäßen t-PA-Varianten in 293-Zellen in großem Maßstab kann z.B. gemäß WO-90/02798, s.o., erfolgen.

IV. Expression und Reinigung in chinesischen Hamstereierstock-(CHO-)Zeilen

Der vielseitig verwendbare Stammvektor pSV1685 (transformierter E. coli-Stamm ATCC Nr. 68.151) diente zur Transfektion und Expression der erfindungsgemäßen t-PA- Varianten in chinesischen Hamstereierstock- (CHO-) Zellen. Die Konstruktion von pSV1685 ist in US-Patent Nr. 5.087.572 vom 11. Februar 1992 geoffenbart.
CHO-dhfr-Zellen (wie z.B. durch Urlaub und Chasin, s.o., beschrieben), die auf nichtselektivem Medium gezüchtet worden waren, wurden mit einem Expressionsvektor aus pSVI685-Basis, in den die für die erwünschte t-PA-Variante kodierende cDNA- Sequenz an der Polylinkerstelle eingefügt worden war, und mit einem dhfr- Selektionsvektor PFD11 [Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495- 2499 (1983)] co-transfiziert; dabei kam das allgemeine Verfahren von Graham und van der Eb, s.o., zur Anwendung. Nach der Transfektion wurden die Zellen selektivem Medium ausgesetzt: entweder a) ohne Glycin, Hypoxanthin und Thymidin oder b) ohne diese Komponenten, aber ergänzt mit Methotrexat bei Konzentrationen von 10 bis 300 nM. Etwa 50 Kolonien wurden für jede Transfektion isoliert, vorzugsweise aus jenen Platten, die den höchsten Selektionsdruck (mit Methotrexat) ausübten. Die Klone wurden in 6-Napf-Platten gezüchtet, um die Expression rekombinanter t-PA-Variante zu analysieren. Konfluente Näpfe wurden serumfreien Produktionsmedium (modifiziert von DMEM/F12 1:1 mit Insulin und Transferrin) 5-6 Tage lang ausgesetzt und der t-PA in der Zellkulturflüssigkeit mittels eines polyklonalen ELISA-Assays quantifiziert. Der am besten produzierende Klon für jede Transfektion wurde für Scale-up und Herstellung gezüchtet. Die Zellen wurden auf das Wachstum in Suspension angepaßt und die t-PA- Varianten unter Verwendung von serumfreiem Medium in Drehkolbenkulturen gebildet. Die geerntete Zellkulturflüssigkeit wurde diafiltriert und die t-PA-Variante mittels Lysin Affinitätschromatografe gereinigt.

BEISPIEL 2

Charakterisierung der t-PA-Varianten

1. t-PA-Quantifizierung

Proteinkonzentrationen wurden routinemäßig durch einen auf Nativsequenz-t-PA standardisierten ELISA bestimmt (siehe EPO-Patent Veröff. 93.619). Proteinreinheit und Homogenität wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (PAGE-SDS) mit dem Puffersystem von Laemmli, Nature, 227: 680 (1970) analysiert. Typischerweise wurden Gele mit einem Gradienten von 10 bis 20% verwendet und die Proteine entweder mit dem Coomassieblau- oder Silberfärbeverfahren von Morrissey, Anal. Biochem., 117: 307 (1981) sichtbar gemacht. Die oben hergestellte t-PA-Variante wurde durch dieses Verfahren als rein und homogen bestimmt.

2. Markierung von t-PA-Varianten für Ausscheidungs- und Bindungsuntersuchungen

Das Mittel zur Markierung der aktiven Stelle wurde durch Chloramin-T-katalysierte Radioiodierung von Tyrosyl-Prolyl-Arginyl-Chlormethylketon (YPRck) durch eine Modifikation des Verfahrens von Hunter und Greenwood [Nature 194, 495-496 (1962) hergestellt. In einer typischen Reaktion wurde 50 µl M Tris-HCl (pH 7,5) 40 µl Na¹²&sup5;I (4 mci; 1,8 nMol) in einem Reaktionsgefäß mit Verschluß zugegeben. Diesem Gefäß wurden 8,3 µl YPRck (1,8 nmol in 12 mM HCl) zugegeben. Die lodierung wurde durch Zugabe von 12,5 µl Chloramin-T (1 mg/ml in 0,1 M NaPi, pH 7.5) eingeleitet. Die Iodierung wurde nach 60 s bei 24ºC mit 25 pl Natriummetabisulfid (1 mg/ml in 0,1 M NaPi, pH 7,5) gequencht. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 2 ml PBS verdünnt, und 20 µl-Aliquote des verdünnten markierten Reagens wurden 1 ml- Aliquoten der Kulturüberstände transient transfizierter 293-Zellen zugegeben. Dieses Gemisch wurde 1 Stunde lang inkubiert und freies ¹²&sup5;I durch Gelfiltration auf einer PD- 10-Säule (Pharmacia) vom proteingebundenem ¹²&sup5;I getrennt. Proteingebundenes ¹²&sup5;I wurde durch Ausfällen mit 10% Trichloressigsäure bestimmt. Diese Markierungsbedingungen wurden für ein 1:1:1 -Molverhältnis von Iod:YPRck:t-PA optimiert. Die spezifische Radioaktivität der mit ¹²&sup5;I-markierten t-PA-Varianten betrug etwa 1 µCi ¹²&sup5;I/µg t-PA.

3. Bewertung der Ausscheidungsrate

Plasmaausscheidung in Mäusen

Die Ausscheidung der t-PA-Varianten wurde durch Radiomarkieren von aus menschlichen Embryonennieren-293-Zellen stammendem Protein, dessen Injizieren in Mäuse und das Messen der Radioaktivität im Blut der Mäuse im Verlauf der Zeit beurteilt. Jeder Versuch umfaßte vier Mäuse. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen unterteilt, wobei beiden Mäusen in einer Gruppe zu vorbestimmten Zeitpunkten Blut entnommen wurde. Die Daten der zwei Gruppen wurden kombiniert und ein Graph der Zeit gegen cpm im Blut aufgetragen. Der Bereich unter der Plasmaausscheidungskurve (AUC) für jede Maus wurde mittels aufeinanderfolgender Trapezoide von 1 bis 40 Minuten errechnet.
In der folgenden Tabelle:
zeigt N die Anzahl an Versuchen zur Bestimmung der Ausscheidungsrate an; stellt MW.± Std.abw. die in ml/min/kg (Körpergewicht) ausgedrückte Ausscheidungsrate dar, errechnet durch den Bereich unter der obigen Plasmaausscheidungskurve;
ist % VK der Variationskoeffizientwert als Prozentsatz;
ist Norm. ein normalisierter Faktor, der das Verhältnis der Ausscheidung für eine t-PA- Variante im Vergleich zur Ausscheidung von (aus 293-Zellen stammendem) t-PA der Wildform darstellt.
Die Sterne zeigen Varianten an, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Tabelle 4 Plasmaausscheidung in Mäusen

Plasmaausscheidung in Kaninchen

Die pharmakokinetische Analyse von t-PA und t-PA-Varianten in Kaninchen erfolgte gemäß der Versuchsvorschrift des in nachstehendem Abschnitt 5 beschriebenen arteriell-venösen Shunt- (AVS-) Thrombolysemodells. Ein 20G-Teflonkatheter mit Strömungsschalter (Viggo) wurde in die mittlere Ohrartene von anästhetisierten weissen männlichen New Zealand-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5-3,5 kg eingesetzt. Ein mit einer Injektionskappe versehener 22G-Katheter wurde in die Randvene des gegenüberliegenden Ohrs eingesetzt. Die Katheter wurden gespült und mit heparin isierter Salzlösung gefüllt verschlossen.
Activase -t-PA oder die t-PA-Varianten wurden als Bolus verabreicht oder über den Venenkatheter infundiert. Die intravenöse Infusion wurde mit einem 15% Ladungsbolus eingeleitet, gefolgt von einer Infusion der verbleibenden 85% der Dosis über einen Zeitraum von 120 Minuten. Verschiedene Dosierungen von Activase-t-PA oder der t- Pavarianten wurden in der AVS-Versuchsvorschrift untersucht: 60 µg/kg, 180 µg/kg und 540 µg/kg. Die Variante T103N, KHRR(296-299)AAAA wurde bei vier Dosierungen getestet: 20 µg/kg, 60 µg/kg, 180 µg/kg und 540 µg/kg. Blutproben wurden nach 30, 60 und 90 min während der Infusionsarbeitsvorschrift entnommen. Proben wurden nach 2, 10, 20, 30, 45, 60, 90 und 120 Nminuten nach der Verabreichung durch Bolusinjektion gezogen. Antikoaguliertes Plasma wurde aus den Blutproben hergestellt und die t-PA- oder t-PA-Variantenkonzentration in Plasma durch einen polyklonalen ELISA bestimmt. Die Werte der Ausscheidungsraten für fünf Tiere wurden bei jeder der Mehrzahl an Dosierungen beurteilt.
Die Plasmaausscheidung der erfindungsgemäßen t-PA-Varianten im Vergleich zu Activaselt-PA und bekannten t-PA-Varianten ist in nachstehender Tabelle 5 veranschaulicht. Der Stern zeigt eine Variante an, die für die vorliegende Erfindung veranschaulichend ist. Tabelle 5 Plasmaausscheidung in Kaninchen (ml(min/kg
a Für jene t-PA-Varianten, die keine Mutationen aufweisen, die mit verringerter Ausscheidung verbunden waren [d.h. Wildform- und KHRR(296-299)AAAA] wurde die Plasmaausscheidung nach einer intravenösen Dauerinfusion des Proteins bewertet. Die stabile Plasmakonzentration der t-PA-Variante wurde zum Abschluß der Infusion mit einem polyklonalen ELISA bestimmt. Die Ausscheidung wurde durch die folgende Beziehung berechnet: Ausscheidung Infusionsrate/stabile Plasmakonzentration. Mittlere Ausscheidungsraten (± Std.abw.) wurden mit Wiederholungsanalysen (n=33 und n = 19) für Activase bzw. KHRR[296-299]AAAA bestimmt.
b t-PA-Varianten mit langsamen Ausscheidungseigenschaften (und Activase -t-PA) wurden in Kaninchen nach Bolusverabreichung des Proteins durch intravenöse Injektion bewertet. Die Plasmakonzentration von t-PA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurde durch einen polyklonalen ELISA ermittelt. Die Ausscheidungsrate wurde mit der folgenden Beziehung errechnet: Ausscheidungsrate = Dosis/Bereich unter der Plasmaausscheidungskurve. Mittlere Ausscheidungsraten (± Std.abw.) wurden mit Wiederholungsanalysen (n=5, 15, 16, 15 und n=10) für Activase ; T103N; T103N, KHRR(296-299)AAAA; N117Q, KHRR(296-299)AAAA; bzw. T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA bestimmt.

4. Fibrinbindung

Die gereinigten t-PA-Mutanten aus CHO-Zellen wurden mit I¹²&sup5;-YPRck radiomarkiert und unter Anwendung des folgenden Verfahrens mit löslichem Plasmin in die zweikettige Form umgewandelt. Aliquote (1,5 ml) mit 0,15 µCi I¹²&sup5;-YPRCK-markiertem t- PA (oder Varianten) in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,5% Rinderserumalbumin und 0,01 % Tween 80 wurden mit menschlichem Plasmin (0,09 Caseineinheiten in 15 µl phosphatgepufferter Salzlösung) 2 Stunden lang bei 25ºC unter leichtem Rühren inkubiert. Das restliche Plasmin wurde durch die Zugabe von 0,9 TI-Einheiten in 15 µl phosphatgepufferter Salzlösung mit Aprotinin inhibiert.
Die Fibrinbindung wurde mittels einer Modifikation des Verfahrens von Rijken et al., J. Biol. Chem., 257: 2920-2925 (1982) bewertet. Verdünnungen von mit Lysin-Sepharose behandeltem menschlichem Fibrinogen im Bereich von 0,12 µg/ml bis 8 mg/ml wurden in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. Aliquote von Fibrinogen (50 µl) und von mit I¹²&sup5;-YPRck markiertem t-PA oder Varianten (100 µl) wurden in 1,2 ml Polypropylenröhrchen kombiniert und kurz gemischt. Durch die Zugabe von menschlichem Thrombin (50 µl von 1 Einheit/ml) bildeten sich Fibringerinnsel; diese waren innerhalb von 60 Sekunden sichtbar. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Gerinnsel bei 13000 U/min 5 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Aliquote der Überstände (50 µl) wurden zur Zählung in einzelne Röhrchen überführt. Um die gesamte Radioaktivität zu berücksichtigen, wurden auch die ursprünglichen Polypropylenröhrchen (enthielten die Gerinnsel und die verbleibende Flüssigkeit) gezählt. Die Menge an gebundenem t-PA war die Differenz zwischen Gesamtradioaktivität (Summe aus dem 50 µl-Aliquot und dem das Gerinnsel enthaltenden Röhrchen) und der ungebundenen Radioaktivität, die als das Vierfache der Menge in 50 µl Überstand berechnet wurde.
Die Ergebnisse des Fibrinbindeassays, der mit aus CHO stammendem, gereinigtem, mit Plasmin behandeltem Material durchgerührt wurde, sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. Die numerischen Fibrinbindedaten für zweikettigen t-PA (und t-PA- Varianten) sind in nachstehender Tabelle 6 dargelegt. Die Sterne zeigen Varianten an, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Tabelle 6 Fibrinbindeassay a
a Die mit YPRck markierten Proben von t-PA wurden mit Plasmin behandelt. Dieser Bindeassay mißt die Fibrinaffinität von t-PA in zweikettiger Form.
b "[Fibrin]50" gibt die Konzentration von Fibrin an, die erforderlich ist, um 50% des Probenproteins an Fibrin gebunden zu beobachten.
Ivscheinbarer Kd" stellt die scheinbare Affinitätskonstante der t-PA-Bindung an ein Fibringerinnsel dar und wird durch die mikromolekulare Konzentration von Fibrin ermittelt, die erforderlich ist, um 50% des t-PA zu binden. Das Molekulargewicht des in dieser Berechnung verwendeten Fibrinmonomers betrug 340 kD.
Wie dies aus den obigen Daten und Fig. 1 hervorgeht, führt die T103N-Mutation, die eine (zusätzliche) Glykosylierungsstelle an Position 103 des menschlichen t-PA- Moleküls der Wildform hinzufügt, zu einem deutlichen Verlust der Fibrinbindung. Obwohl gezeigt wurde, daß T103N-t-PA im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform eine etwa um das Drei- bis Fünffache verringerte Ausscheidung aufweist, ist sein therapeutischer Wert aufgrund des Verlusts der Fibrinbindung nicht wesentlich höher.
Wie dies aus den obigen Daten und Fig. 2 ersichtlich ist, wird die Fibrinbindung von T103N-t-PA durch Einbringen einer zweiten Mutation, die zur Entfernung der Glykosylierung von Position 117 des menschlichen t-PA-Moleküls der Wildform führt, wesentlich verbessert. Weiters bewahrt die T103N, N117Q-t-PA-Variante ihre im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform (oder Activase -t-PA) verringerte Ausscheidung bei.
Das Einbringen einer weiteren Mutation an den Positionen 296-299 des menschlichen t- PA-Moleküls der Wildform, die bekanntermaßen eine bemerkenswerte Verbesserung der Fibrinspezifität nach sich zieht [KHRR(296-299)AAAA], ergibt eine Dreifachmutante, die menschlichem t-PA der Wildform aufgrund ihrer deutlich reduzierten Ausscheidungsrate und erhöhten Fibrinspezifität ohne großen Verlust der Fibrinbindung überlegen ist.

5. In vivo-Gerinnselauflösungsassay (Arteriell-venöses Shunt-Thrombolysekaninchen modell)

Gerinnsel wurden ex vivo gebildet, indem 2 ml frisches 70% Kaninchenvollblut (mit 0,15 M NaCl verdünnt) oder mit EDTA entnommenes, plättchenreiches Kaninchenplasma (0,8 x 10&sup6; Plättchen/µl) in den Zylinder einer 0,5 ml-Spritze eingebracht wurden. Menschliches Thrombin und CaCl&sub2; wurden dem plättchenreichen Plasma zugegeben (Endkonzentrationen jeweils 0,2 µg/ml bzw. 15 mM). Aliquote von Vollblut und plättchenreichem Plasma wurden vor der Übertragung in die Spritze mit menschlichem I¹²&sup5;-Fibrinogen versetzt. Eine Baumwollfadenlänge wurde durch den Spritzenzylinder geführt, der als Verankerung der sich bildenden Gerinnsel diente. Nach dem einstündigen Inkubieren der Gerinnsel bei 37ºC wurde der Kolben entfernt, und die Spritzen (eine mit Vollblut und eine plättchenreiche) wurden in silasierte Röhrchen übertragen. Diese wurden an Kathetern angebracht, die zuvor in die Karotisartene und Jugularvene eines 2,5 bis 3,0 kg schweren, weissen New Zealand-Kaninchens implantiert worden waren. Das Blut strömte vom Arterienkreislauf über das Gerinnsel und kehrte über die venöse Seite zurück. Der Blutstrom durch den Shunt betrug etwa 20 ml/min. Activase -t-PA wurde über den Venenkatheter als Infusion über einen Zeitraum von 90 Minuten verabreicht (15% Ladungsdosis). T103N, N117Q, KHRR(296- 299)AAAA wurde als intravenöser Bollis verabreicht. Heparin (300 U/kg) wurde ebenfalls als Bolus bei -10 und 45 Minuten verabreicht. Die Thrombolyse wurde durch einen externen Gammadetektor im 120-minütigen Verlauf des Experiments überwacht. Die relative Wirksamkeit wurde anhand einer halblogarithmischen Auftragung der Dosisreaktionskurven für die Mutanten im Verhältnis zu einer Activase -t-PA- Standardkurve ermittelt. Zum Abschluß eines Versuchstags wurden der Gerinnselkreislauf entfernt und die Katheter mit Salzlösung gespült und mit Heparin gefüllt verschlossen (500 Einheiten/Katheter). Zehn Tiere wurden einmal pro Tag für fünf aufeinanderfolgende Tage verwendet. Die Ergebnisse sind in Figuren 3-6 dargestellt.
Die in vivo-Daten zeigen, daß die Gerinnselauflösung mit dem Dreifachmutanten- T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA-t-PA wesentlich rascher erzielt wird als mit Activase -t-PA - sowohl bei Vollblutgerinnseln als auch bei plättchenreichen Gerinnseln (Figuren 3 und 4). Die Daten zeigen weiters, daß die in vivo-Wirksamkeit von T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA-t-PA bei Vollblutgerinnseln und plättchenreichen Gerinnseln um das Sechsfache bzw. 9,5-fache höher ist als Activase -t-PA (Figuren 5 und 6). Diese numerischen Daten wurden auf der Grundlage paralleler linearer Kurven ermittelt, die an die in Figuren 5 und 6 dargelegten Versuchspunkte angepaßt wurden.

Hinterlegung der Materialien

Mit dem Vektor pSVIB5 transformierte E. coli 294-Zellen wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) am 25. Oktober 1989 hinterlegt und erhielten die ATCC-Zugriffsnummer 68.151. Die Hinterlegung erfolgte gemäß dem Budapester Abkommen über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens (Budapester Abkommen) und den darunter fallenden Bestimmungen. Dies stellt die Aufbewahrung einer lebensfähigen Kultur über einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Hinterlegungsdatum sicher. Der Organismus wird durch die ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens und in Übereinstimmung mit einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC bereitgestellt, was der Öffentlichkeit eine dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur ab Erteilung der einschlägigen US-Patentschrift oder ab Offenlegung einer beliebigen US-amerikanischen oder ausländischen Patentanmeldung (je nachdem, welches der beiden Ereignisse zuerst eintritt) garantiert sowie gewährleistet, daß die Nachkommenschaft einer Person zur Verfügung gestellt wird, die laut Anordnung des U.S. Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC § 122 und den damit in Einklang stehenden Vorschriften des Commissioner (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu berechtigt ist. Alle Einschränkungen hinsichtlich der Verbreitung von ATCC 68.151 wurden mit 11. Februar 1992 außer Kraft gesetzt.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung stimmte zu, daß die hinterlegte Kultur, falls sie beim Kultivieren unter zweckmäßigen Bedingungen sterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, unmittelbar nach einer entsprechenden Benachrichtigung mit einem lebensfähigen Exemplar der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms darf nicht als Erlaubnis ausgelegt werden, die Erfindung entgegen den Rechten durchzuführen, die durch eine beliebige Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen gewährt werden.
Man geht davon aus, daß die obige Beschreibung ausreicht, die Durchführung der Erfindung durch Fachleute auf dem Gebiet zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung wird hinsichtlich ihres Schutzbereichs durch das hinterlegte Konstrukt nicht eingeschränkt. Die Hinterlegung des vorliegenden Materials stellt kein Eingeständnis dar, daß die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzulänglich ist, die praktische Umsetzung eines beliebigen Aspekts der Erfindung einschließlich ihrer besten Durchführungsart zu ermöglichen, und darf nicht solcherart interpretiert werden, daß der Schutzbereich der Patentansprüche auf ihre konkrete Darstellung beschränkt ist.
Zwar wurden hierin bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, doch ist zu beachten, daß die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß die geoffenbarten Ausführungsformen zahlreichen Modifikationen unterzogen werden können, ohne vom Grundgedanken der Erfindung abzuweichen. Alle derartigen Modifikationen sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: GENENTECH, INC.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Glykosylierungsvarianten des Gewebeplasminogenaktivators mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 Kb Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDUNGSDATUM:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALTNERTRETER:
(A) NAME: Dreger, Ginger R.
(B) REGISTRATIONSNUMMER: 33.055
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: 757
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/266-3216
(B) TELEFAX: 41 5/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR.1:
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.1:
TGTGCTCCAA TTGCCCCTGT AGCT 24
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR.2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.2:
GCCACTCTCG GATGTATTCC ACGTGCCCCT 30
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR.3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.3:
CGCGCTGCTT TGCCAGTTGG TGCA 24
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR.4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 36 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.4:
CCGCTCTCCG GGCGACGCCG CGGCCGCGGC AAAGAT 36

Claims

1. Variante des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators (t-PA), die an einer beliebigen der Positionen 103-105 glykosyliert und frei von funktioneller Kohlehydratstruktur an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform ist, wobei die Variante folgendes aufweist: a) eine verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf und eine im wesentlichen beibehaltene Fibrinbindung oder b) eine im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verbesserte fibrinolytische in vivo-Wirksamkeit.

2. Variante nach Anspruch 1, mit verlängerter Halbwertszeit im Kreislauf und im wesentlichen beibehaltener Fibrinbindung im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform.

3. Variante nach Anspruch 2 mit verbesserter Fibrinbindung im Vergleich zu menschlicher t-PA-Variante, die an einer beliebigen der Positionen 103-105 glykosyliert und frei von funktioneller Kohlehydratstruktur an Position 117 von menschlichem t-PA der Wildform ist.

4. Variante nach Anspruch 1 mit im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verbesserter fibrinolytischer in vivo-Wirksamkeit.

5. Variante nach Anspruch 1, die an Position 103 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform glykosyliert ist.

6. Variante nach Anspruch 1, die an Position 105 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform glykosyliert ist.

7. Variante nach Anspruch 1, worin die Glykosylierung an den Positionen 103-107 N- gebunden ist.

8. Variante nach Anspruch 1, worin die Glykosylierung an den Positionen 103-105 O- gebunden ist.

9. Variante nach Anspruch 7 mit Asparagin als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr- Tripeptidylsequenz, worin X jede beliebige Aminosäure außej Prolin ist, an Position 103 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

10. Variante nach Anspruch 9 mit Asparagin an Position 103, Tryptophan an Position 104 und Serin an Position 105 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

11. Variante nach Anspruch 7 mit Asparagin als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr- Tripeptidylsequenz, worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist, an Position 105 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

12. Variante nach Anspruch 11 mit Asparagin an Position 105, Threonin an Position 106 und Serin an Position 107 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

13. Variante nach Anspruch 1 mit einer anderen Aminosäure als Asparagin an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

14. Variante nach Anspruch 13 mit Glutamin, das an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform substituiert ist.

15. Variante nach Anspruch 13, die zusätzlich Asparagin, das an Position 103 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform substituiert ist, als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr-Tripeptidylsequenz aufweist, worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist.

16. Variante nach Anspruch 13, die zusätzlich Asparagin, das an Position 105 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform substituiert ist, als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr-Tripeptidylsequenz aufweist, worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist.

17. Variante nach Anspruch 16, die zusätzlich Serin aufweist, das an Position 107 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA substituiert ist.

18. Variante nach Anspruch 1 mit im Vergleich zu menschlichem t-PA der Wildform verbesserter Fibrinspezifität.

19. Variante nach Anspruch 18, worin die verbesserte Fibrinspezifität durch eine Änderung, die eine andere ist als die Substitution von Arginin durch Asparaginsäure an Position 299 - innerhalb des Aminosäurebereichs 296-302 oder 274-277 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform erzielt wird.

20. Variante nach Anspruch 19, worin die Änderung im Bereich 296-300 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform erfolgt.

21. Variante nach Anspruch 20, worin die Änderung an einer oder mehreren der Positionen 296, 297, 298 und 299 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform erfolgt.

22. Variante nach Anspruch 21, worin die Änderung die Substitution von jeder der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin, Arginin an den Positionen 296, 297, 298 und 299 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform durch Alanin ist.

23. Variante nach Anspruch 19 mit Asparagin als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr- Tripeptidylsequenz an Position 103 und einer anderen Aminosäure als Asparagin an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

24. Variante nach Anspruch 23 mit Asparagin an Position 103, Tryptophan an Position 104, Serin an Position 105 und Glutamin an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

25. Variante nach Anspruch 19 mit Asparagin als Teil einer Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr- Tripeptidylsequenz an Position 105 und einer anderen Aminosäure als Asparagin an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

26. Variante nach Anspruch 25 mit Asparagin an Position 105, Threonin an Position 106, Serin an Position 107 und Glutamin an Position 117 der Aminosäuresequenz von menschlichem t-PA der Wildform.

27. Variante nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus menschlichen t-PA-Varianten, die die folgenden Mutationen aufweisen:

worin Z jede Aminosäure außer Asparagin (N) kennzeichnet.

28. DNA-Sequenz, die für die Variante nach Anspruch 1 kodiert.

29. Replizierbares Expressionsvehikel, das die DNA-Sequenz nach Anspruch 28 enthält und diese in einer geeigneten Wirtzelle exprimieren kann.

30. Wirtzelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 29 transformiert ist.

31. Verfahren, umfassend das Kultivieren der Wirtzellen nach Anspruch 30, um die für die t-PA-Variante kodierende DNA zu exprimieren.

32. Verfahren nach Anspruch 31, das weiters das Gewinnen der Variante aus der Wirtzellkultur umfaßt.

33. Zusammensetzung zur Behandlung eines Gefäßzustands bzw. einer Gefäßerkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

34. t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1-27 zur therapeutischen Verwendung.

35. Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerungs- oder -verwachsungsbildung oder -wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante von Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

36. Verwendung einer t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1-27 bei der Herstellung eines Medikaments zur (a) Behandlung eines Säugetiers mit einem Gefäßzustand bzw. einer Gefäßerkrankung oder zur (b) Verhinderung der Fibrinablagerungs- oder -verwachsungsbildung oder -wiederbildung durch Verabreichen einer wirksamen Menge des Medikaments an einer Stelle potentieller Fibrin- oder - verwachsungsbildung des Säugetiers.

37. Verfahren des im wesentlichen Wiedererhaltens der Fibrinbindeaffinität von menschlichem t-PA der Wildform, die infolge von Glykosylierung an einer beliebigen der Aminosäuren 103-105 vermindert ist, umfassend das Entfernen der funktionellen Kohlehydratstruktur an Aminosäureposition 117.