DE69233669T2

DE69233669T2 - Bakterielle nitroreduktase zur reduzierung von cb 1954 und analogen davon in eine zytotoxische form

Info

Publication number: DE69233669T2
Application number: DE69233669T
Authority: DE
Inventors: Gillian Salisbury ANLEZARK; Roger Salisbury MELTON; Roger Salisbury SHERWOOD; Thomas Carshalton CONNORS; Frank Sutton FRIEDLOS; Michael Sutton JARMAN; Richard Sutton KNOX; Anthony Sutton MAUGER; Caroline Joy Sutton SPRINGER
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2012-10-24
Also published as: JP2005040136A; JPH07501692A; ATE349534T1; US5977065A; AU2776992A; EP0540263A1; JP4115514B2; CA2122036C; CA2122036A1; AU681337B2; US5780585A; JP3995666B2; ES2279506T3; WO1993008288A1; EP0638123A1; DE69233669D1; EP0638123B1; US5633158A

Description

Diese Erfindung betrifft die Kontrolle von neoplastischem Gewebewachstum und beschäftigt sich insbesondere mit der Bereitstellung von neuen Anti-Tumor-Wirkstoffen und mit Enzymen, die in der Lage sind, Prodrugs in Anti-Tumor-Wirkstoffe zu überführen.
Das Alkylierungsmittel 5-(Aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamid (nachstehend als CB 1954 bezeichnet) ist seit fast 20 Jahren als interessante experimentelle Verbindung mit einer einzigartigen selektiven Wirkung bekannt. Obwohl CB 1954 strukturell relativ nah mit zahlreichen anderen bekannten Alkylierungsmitteln verwandt ist, welche ein relativ breites Band an Aktivität aufweisen, weist CB 1954 in vivo und in vitro beträchtliche Aktivität gegen Walker-Tumorzellen auf, jedoch dachte man, dass es gegen andere Tumoren praktisch inaktiv wäre.
Kürzlich wurde entdeckt, dass die selektive Wirkung von CB 1954 auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass es per se kein Antitumormittel ist, sondern ein Prodrug für ein Antitumormittel, das aus CB 1954 durch ein Nitroreductase-Enzym aus der Walker-Zelle erzeugt wurde. Es wurde gezeigt, dass diese Nitroreductase aus der Walker-Zelle ein Enzym ist, das aus anderen Quellen bekannt ist und das eine NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon) ist, die als EC.1.6.99.2 klassifiziert ist – siehe Robertson et al., J. Biol. Chem. 261, 15794–15799 (1986).
Im Zuge früherer Untersuchungen mit CB 1954 wurde festgestellt, dass das Walker-Zellen-Enzym EC.1.6.99.2 die Fähigkeit aufwies, die 4-Nitrogruppe von CB 1954 zum entsprechenden Hydroxylamin zu reduzieren, und dass das resultierende 5-(Aziridin-1-yl)-2-nitro-4-hydroxylaminobenzamid das aktive Antitumormittel darstellte.
Die Verwendung von Prodrugs stellt ein klinisch äußerst wertvolles Konzept in der Krebstherapie dar, insbesondere wenn das Prodrug unter Einfluss eines Enzyms, das an einen monoklonalen Antikörper gebunden werden kann, welcher an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, in einen Anti-Tumor-Wirkstoff überführt werden soll, wobei die Kombination eines solchen Prodrugs mit einem Konjugat aus Enzym und monoklonalem Antikörper einen äußerst wirkungsstarken klinischen Wirkstoff darstellt.
EP-A 0 330 432; Knox et al., Biochem. Pharm., Band 37, Nr. 24, 4671–4677, und Knox et al., Biochem. Pharm., Band 37, Nr. 24, 4661–4669, beschreiben jeweils die Verbindung CB 1954 (5-(Aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamid) und das Nitroreductase- (NR-) Enzym von Walker-Tumorzellen sowie die Entdeckung, dass das in den Walker-Tumorzellen vorhandene Nitroreductase- (NR-) Enzym auf CB 1954 wirkt, wodurch man eine besonders aktive Spezies, das 4-Hydroxylamino-Analogon, erhält.
Bryant et al., J. Biol. Chem., Band 266, Nr. 7, 4126–4130, beschreiben das Klonieren, die Nucleotidsequenz und die Expression in E. coli. eines Nitroreductase-Enzyms von Enterobacter cloacae.
EP-A 0 441 218 beschreibt Anti-Tumor-Prodrugs, die ortho-/para-Disulfidbenzylcarbamate und -carbonate sind.
EP-A 0 441 218 beschreibt anthrazyklische Glycosil-Prodrugs, die offenbar als Teil von ADEPT für Krebs eingesetzt werden können.
Die Erfinder haben nun neue Nitroreductasen entdeckt, die von bakteriellen Quellen erhältlich sind und nicht nur deshalb von Interesse sind, weil sie in der Lage sind, CB 1954 in einen aktiven Anti-Tumor-Wirkstoff zu überführen, sondern auch, weil sie, anders als EC.1.6.99.2, in der Lage sind, CB-1954-Analoga, die ebenfalls Prodrugs sind, in aktive Anti-Tumor-Wirkstoffe zu überführen.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, in dem CB 1954 (100 μM) und ein reduzierter Cofaktor (500 μM) mit dem Enzym (2 mg/ml) E.-coli-Nitroreductase (A) oder 25 μg/ml Walker-DT-Diaphorase (B) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) in Luft bei 37 °C inkubiert wurden. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden aliquote Teile (10 μl) auf eine Partisil-SCX-HPLC-Säule (240 × 4,7 mm) injiziert und mit 100 mM NaH₂PO₄ isokratisch (2 ml/min) eluiert. Das Eluat wurde fortlaufend in Bezug auf Adsorption bei 320, 260 und 360 nm untersucht, und die Konzentration von CB 1954 wurde durch die Integration des Peaks berechnet, der dieser Verbindung auf der HPLC-Spur entsprach.
2 zeigt die Bildung von Actinomycin D (AMD) während der Inkubation eines AMD-Prodrugs mit einer Nitroreductase der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt die Bildung von Mitomycin C (MC) während der Inkubation eines MC-Prodrugs mit einer Nitroreductase der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die In-vitro-Bindung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Enzym-Konjugats an Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Nitroreductase bereit, die von einem Bakterium erhältlich ist und folgende Eigenschaften aufweist, wie durch die von Escherichia coli B und Bacillus amyloliquefaciens isolierten Beispiele veranschaulicht:

1. Es handelt sich um ein Flavoprotein mit einem Molekulargewicht im Bereich von 20–60 Kilodalton.
2. Es erfordert entweder NADH oder NAD(P)H oder Analoga davon als Cofaktor.
3. Es weist eine Km für NADH oder NAD(P)H im Bereich von 1–100 μM auf.
4. Es ist in der Lage, eine oder beide der Nitrogruppen von CB 1954 und Analoga davon zu einer zytotoxischen Form, z.B. Hydroxylamin, zu reduzieren.

Die erfindungsgemäßen Nitroreductasen kommen natürlich in den Zellen von E. coli B, E. coli C und anderen E.-coli-Stämmen, z.B. K12-Typ, sowie in anderen gramne gativen Organismen, wie z.B. Thermus aquaticus, und grampositiven Bakterien, wie z.B. Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus caldotenax, vor. Sie können von solchen Zellen gewonnen werden, indem die Zellen zerstört werden und die Zellinhalte chromatographischer Trennung unterzogen werden und die Nitroreductase isoliert wird.
Die Nitroreductase der vorliegenden Erfindung von E. coli B wurde beispielsweise zur Homogenität gereinigt – siehe Tabelle 1 – und einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, deren Ergebnisse in Tabelle 2 angeführt sind. Die obere Sequenz zeigt die von der von Salmonella typhimurium erhaltenen 219-mer-Nitroreductase abgeleitete Aminosäuresequenz, wie von Watanabe et al., Nucl. Acids Res. 18, 1059 (1990), beschrieben. Die untere, fettgedruckte Sequenz zeigt die Sequenz der Bromcyan-Fragmente der E.-coli-B-Nitroreductase als Beispiel der vorliegenden Erfindung, welche ein bestimmtes Maß an Homogenität, aber ausreichend Unterschiede aufweist, um zu bestätigen, dass es sich um Nitroreductase handelt, die sich von der von Watanabe et al. beschriebenen und den kürzlich beschriebenen Enterobactercloacae-Nitroreductasen (siehe Bryant et al., J. Biol. Chem. 266, 4126 (1991)) oder der Walker-Zellen-Nitroreductase unterscheidet, und dass es sich um ein Enzym handelt, über das zuvor noch nicht berichtet wurde.
Die Aminosäuresequenz der E.-coli-B-Nitroreductase der Erfindung kann auch vom Sequenzieren der Nucelotide in dem Nitroreductasegen abgeleitet werden, und diese Sequenzen werden untenstehend in Tabelle 3 angeführt. Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 3 wurde verwendet, um die Sequenzprotokolle im Anhang zu erstellen.
Unter Verwendung der Informationen aus Tabelle 3 kann eine erfindungsgemäße Nitroreductase durch die Expression der für die Nitroreductase kodierenden DNA in einem geeigneten Expressionsvektor, der in einer Wirtszelle enthalten ist, und durch das Gewinnen der Nitroreductase hergestellt werden. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein bakterieller, ein Hefe-, ein Insekten- oder ein Säugetierexpressionsvektor sein, und die Wirtszelle wird so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel ist.
Wie oben erläutert sind die neuen Enzyme der vorliegenden Erfindung in der Lage, eine Nitrogruppe in verschiedenen Substratmolekülen zu reduzieren, und die Erfinder haben festgestellt, dass die Enzyme aufgrund ihrer Fähigkeit, die Nitrogruppe von verschiedenen p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivaten von zytotoxischen Verbindungen zu reduzieren, besonders nützlich sind, um dann "selbst-immolative" Verbindungen zu erhalten, die sich automatisch zersetzen, um zytotoxische Verbindungen freizusetzen.
Bei dem vorliegenden Ansatz ist es besonders interessant, dass die Zytotoxizität von verschiedenen zytotoxischen Verbindungen, die Amino- oder Hydroxysubstituenten umfassen, insbesondere aromatische Amino- oder Hydroxysubstituenten, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivate der Amino- oder Hydroxygruppe hervorbringen, die eine deutlich geringere Zytotoxizität aufweisen als die Stammamino- oder -hydroxyverbindung. Demnach ist es möglich, die p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivate als Prodrug in einem System des oben erläuterten Typs, in dem das Prodrug unter Einfluss eines Enzyms, das an einen monoklonalen Antikörper gebunden werden kann, der wiederum an das tumorassoziierte Antigen bindet, in einen Anti-Tumor-Wirkstoff überführt wird, einzusetzen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung neue Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel bereit:
worin R¹ und R² so ausgewählte Gruppen sind, dass die Verbindungen R¹NH₂ und R²OH zytotoxische Verbindungen sind.
Vorzugsweise sind die Verbindungen R¹NH₂ und R²OH aromatische zytotoxische Verbindungen, und die Verbindungen R¹NH₂ können eine beliebige der bekannten Stickstofflostverbindungen sein, beispielsweise basierend auf p-Phenylendiamin. Demnach kann die Verbindung R¹NH₂ folgende sein:
oder Analoga dieser Verbindung mit der allgemeinen Struktur IV
worin R' und R'' = H, F oder CH₃ sind, und insbesondere worin
R' = H und R'' = CH₃;
oder R' = CH₃ und R'' = H;
oder R' = H und R'' = F;
oder R' = F und R'' = H ist.
Eine weitere Art einer zytotoxischen Aminoverbindung, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, sind Verbindungen, wie z.B. Actinomycin D, Doxorubicin, Daunomycin und Mitomycin C. Die Strukturen der von Actinomycin D, Doxorubicin und Mitomycin C abgeleiteten Prodrugs sind untenstehend als V, VI bzw. VII angeführt.
Ähnliche p-Nitrobenzyloxy-Derivate können bei dem Aminosubstituenten anderer Actinomycine und anderer zytotoxischer Verbindungen des oben erläuterten Typs hergestellt werden.
Zusätzlich zu der Bildung von p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivaten bei der Aminogruppe an einer zytotoxischen Verbindung können ähnliche Derivate bei der Hydroxygruppe, insbesondere bei einer phenolischen Hydroxygruppe einer zytotoxischen Verbindung, hergestellt werden. Hier wird die Aufmerksamkeit auf die phenolischen Stickstofflostverbindungen gerichtet, und eine spezifische, erfindungsgemäße Verbindung dieses Typs hat folgende Formel:
In einem weiteren Aspekt der Erfindung haben die Erfinder bestimmt, dass die neuen Enzyme der vorliegenden Erfindung nicht nur in der Lage sind, zumindest eine der Nitrogruppen von CB 1954 zu reduzieren, sondern auch zumindest eine der Nitrogruppen von bestimmten CB-1954-Analoga, z.B. Descarboxamido-CB-1954 (1-Aziridin-1-yl-2,4-dinitroenzamid – bekannt als CB 1837) und N,N-Dimethyl-CB-1954 [N,N-Dimethyl-(5-aziridin-1-yl-2,4-dinitrobenazmid) – auch bekannt als CB 10–107]. Die neuen Enzyme der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls in der Lage, die Nitrogruppen von anderen aromatischen Nitroverbindungen, wie z.B. 5-Chlor-2,4-dinitrobenzamid; 3,5-Dinitrobenazmid; 3-Nitrobenzamid; 4-Nitrobenzamid und 5-Nitro-2-furaldehydsemicarbazon (Nitrofurazon), zu reduzieren.
Wie oben erläutert sind die Nitroreductasen der vorliegenden Erfindung in der Lage, CB 1954 in 2-Hydroxylamino-4-nitro-5-(aziridin-1-yl)benzamid umzusetzen, welches einen aktiven Anti-Tumor-Wirkstoff darstellt.
Wie oben angeführt sind die neuen, erfindungsgemäßen p-Nitrophenylbenzyloxy-Verbindungen der Formeln I und II insofern interessant, als dass sie im Vergleich mit den zytotoxischen Verbindungen R¹NH₂ oder R²OH, von welchen sie abgeleitet sind, eine reduzierte Zytotoxizität aufweisen und als dass sie in der Lage sind, als Substrat für die erfindungsgemäße Nitroreductase zu dienen. Wenngleich die vorliegende Erfindung für ihre Definition nicht von der exakten Wirkungsweise der Nitroreductase auf die Verbindung der Formel I oder II abhängt, wird angenommen, dass die Nitrogruppe des p-Nitrophenylbenzyloxycarbonyl-Rests in die entsprechende Amino- oder Hydroxylaminogruppe überführt wird und dass die resultierende p-Aminobenzyloxycarbonyl- oder p-Hydroxylaminobenzyloxycarbonyl-Verbindung unter den Reaktionsbedingungen, die für die enzymatische Reduktion zur Freisetzung der zytotoxischen Verbindung und zur Bildung von p-Aminobenzyl-Alkohol oder p-Hydroxylaminobenzyl-Alkohol und Kohlendioxid als Nebenprodukte gemäß dem folgenden Reaktionsschema eingesetzt werden, automatisch abgebaut wird:
Die erfindungsgemäßen p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Verbindungen werden herkömmlicherweise durch an sich bekannte chemische Syntheseverfahren hergestellt. Die zytotoxischen Amin- oder Hydroxyverbindungen können beispielsweise mit 4-Nitrobenzylchlorfomiat unter wasserfreien Bedingungen in der Gegenwart eines Chlorwasserstoffakzeptors, insbesondere eines Alkylamins, wie z.B. Triethylamin, umgesetzt werden. Diese Reaktion kann in einem trockenen organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, erfolgen, und die resultierende, erfindungsgemäße Ver bindung der Formel I oder II kann von dem organischen Lösungsmittel durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. Chromatographie, isoliert werden.
Eines der angenehmsten Verfahren zur Herstellung der neuen, erfindungsgemäßen Nitroreductase ist es, das Material aus den Zellinhalten von Bakterien, wie z.B. E. coli B, zu gewinnen. Alternativ dazu ist es möglich, das Gen, das aus den Bakterien isoliert werden kann und für das gewünschte Enzym kodiert, zu klonieren und das klonierte Gen in einem geeigneten Vektorsystem in eine andere Wirtszelle zu transferieren, von der aus oder in der es exprimiert werden kann.
Um die enzymatische Reduktion von CB 1954 und seiner Analoga mit den neuen Enzymen der vorliegenden Erfindung hervorzurufen, ist es erforderlich, dass ein Cofaktor in dem Reaktionssystem vorhanden ist. Die Fähigkeit des Enzyms der vorliegenden Erfindung, diese Reduktion hervorzurufen, kann experimentell unter Verwendung von NADH oder HAD(P)H als Cofaktor demonstriert werden, jedoch kann der Einsatz von solchen Cofaktoren in der klinischen Praxis problematisch sein, da insbesondere NAD(P)H durch andere Enzyme, die im Körper vorhanden sind, leicht oxidiert wird und die Cofaktoren nicht ausreichend selektiv zwischen den verschiedenen Säugetier- und Nicht-Säugetier-Enzymen sind. Die Erfinder haben festgestellt, dass das Ribosid von 1,4-Dihydronicotinsäure in der Nitroreductasereduktion von CB 1954 und dessen Analoga als Cofaktor zumindest ebenso wirksam ist, und außerdem ist dieses aufgrund seiner Selektivität für die erfindungsgemäße E.-coli-Nitroreductase für den klinischen Einsatz besser geeignet, wodurch seine Integration in ein Mehrkomponentensystem des unten beschriebenen Typs besonders wertvoll ist.
Das Ribosid von 1,4-Dihydronicotinsäure, das in der vorliegenden Erfindung als Cofaktor eingesetzt werden kann, ist eine neue Verbindung und ist Teil der vorliegenden Erfindung. Es kann aus handelüblichem Nicotinsäure-Ribotid hergestellt werden, welches zunächst durch enzymatische Dephosphorylierung, z.B. unter Verwendung einer alkalischen Phosphatase, in das entsprechende Ribosid überführt wird. Das durch diese enzymatische Dephosphorylierung oder durch chemische Synthese, un ter Einsatz des von Jarman, J. Chem. Soc (c), 918–920 (1969), beschriebenen Verfahren, erhaltene Ribosid kann dann, z.B. unter Verwendung eines Alkalimetallhydrosulfits, reduziert werden, wodurch man 1,4-Dihydronicotinsäure-Ribosid erhält.
Eine der wichtigsten praktischen Anwendungen der neuen Enzyme der vorliegenden Erfindung ist, dass sie gemeinsam mit Nitroverbindungen, die Prodrugs für Anti-Tumor-Wirkstoffe darstellen, eingesetzt werden können und so ein System für Krebschemotherapie bereitstellen, wobei der Patient nur, so weit wie möglich, begrenzt in den Regionen, in welchen es zu einer Wechselwirkung zwischen dem Prodrug und der erfindungsgemäßen Nitroreductase kommt, dem zytotoxischen Wirkstoff ausgesetzt wird. Demnach wird hierin ein Chemotherapieverfahren und ein System für Chemotherapie beschrieben, welches den gemeinsamen Einsatz der Nitroreductase der vorliegenden Erfindung mit einer Nitroverbindung, die ein Prodrug für eine zytotoxische Verbindung darstellt, umfasst.
Die angenehmste oder eine der angenehmsten Arten für den Einsatz des Systems der vorliegenden Erfindung ist es, die erfindungsgemäße Nitroreductase an ein Targeting-Mittel, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, der an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, zu binden.
Wie hierin verwendet verstehen Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" nicht nur einfach als Antikörper, die durch traditionelle Hybridomtechniken hergestellt werden, sondern auch Antikörper und deren Varianten, die durch Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Diese umfassen beispielsweise humanisierte Antikörper, wie jene mit einer konstanten Region von einem menschlichen Antikörper, der auf eine nicht-menschliche variable Antikörperregion übertragen ist (siehe z.B. EP-A 0 120 694), chimäre Antikörper, wie jene mit nicht-menschlichen komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), die in ein Gerüst von menschlichen variablen Regionen eingefügt sind (siehe z.B. EP-A 0 239 400), und einkettige Antikörper. Fragmente solcher monoklonaler Antikörper, die ihre Zielbindungsaktivität beibehalten, werden auch von der allgemeinen Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" abgedeckt. Zu diesen gehören Fab'- und F(ab')₂-Fragmente.
Die Auswahl des monoklonalen Antikörpers wird natürlich von der Natur des Zieltumors beeinflusst, aber zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung kann auf den Anti-CEA-Antikörper A₅B₇ verwiesen werden.
Als Alternative zur Verwendung eines monoklonalen Antikörpers ist auch vorstellbar, andere Targeting-Mittel, an die die erfindungsgemäße Nitroreductase bindet, einzusetzen. Es ist beispielsweise bekannt, dass bestimmte lösliche Makromoleküle für das passive Tumor-Targeting von bestimmten Tumortypen eingesetzt werden können. Viele feste Tumoren weisen eine Gefäßanordnung auf, die für Makromoleküle hyperpermeabel ist. Wenngleich die Gründe dafür nicht vollständig bekannt sind, führt es dazu, dass solche Tumoren zirkulierende Makromoleküle selektiv akkumulieren können. Es wird angenommen, dass der gesteigerte Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR-Effekt) für den Wirkmechanismus von SMANCS (Styrol/Maleinsäureanhydrid-Neocarzinostatin) verantwortlich ist, welche in Japan regulär für die Behandlung von Hepatomen klinisch eingesetzt werden. Eine weitere Art von Konjugaten, die in Bezug auf ihre Anti-Krebs-Aktivität untersucht werden, sind N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Copolymer-Anthracyclin-Konjugate (L. Seymour, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9 (2), 135–187 (1992)). Demnach können Konjugate eines Polymers, wie z.B. Styrol/Maleinsäureanhydrid oder N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Copolymer, und die erfindungsgemäße Nitroreductase statt Konjugaten eines monoklonalen Antikörpers und Enzyms eingesetzt werden.
Mit diesem System ist es möglich, im Verlauf einer Krebschemotherapie dem Patienten, der dieser Behandlung bedarf, die Nitroverbindung, welche das Prodrug für die zytotoxische Verbindung darstellt, und das Enzym/Targetingmittel-Konjugat zu verabreichen. Das Prodrug und das Konjugat können gleichzeitig verabreicht werden, jedoch wird es in der klinischen Praxis oft als vorteilhaft erachtet, das Enzym/Wirkstoff-Konjugat vor dem Prodrug, z.B. bis zu 72 Stunden davor, zu verabreichen, um dem Enzym/Wirkstoff-Konjugat die Möglichkeit zu geben, sich in der Region des Tumor ziels zu lokalisieren. Wenn so verfahren wird, besteht die Tendenz, dass nach der Verabreichung des Prodrugs dieses nur in den Regionen in den zytotoxischen Wirkstoff überführt wird, in welchen das Enzym/Wirkstoff-Konjugat lokalisiert ist, d.h. in der Region des Zieltumors, wodurch die Beschädigung von gesunden Zellen durch eine verfrühte Freisetzung des zytotoxischen Wirkstoffs minimiert wird.
Das Ausmaß der Lokalisierung des Enzym/Wirkstoff-Konjugats (als Verhältnis der lokalisierten zu den frei zirkulierenden aktiven Konjugaten) kann durch einen Einsatz der in WO 89/10140 beschriebenen Clearance- und/oder Inaktivierungssysteme weiter verbessert werden. Dies umfasst, üblicherweise nach der Verabreichung des Konjugats und vor der Verabreichung des Prodrugs, die Verabreichung einer Komponente (einer "zweiten Komponente"), die in der Lage ist, so an einen Teil des Konjugats zu binden, dass das Enzym inaktiviert wird und/oder die Clearance des Konjugats aus dem Blut beschleunigt wird. Eine solche Komponente kann einen Antikörper gegen die erfindungsgemäße Nitroreductase umfassen, welcher in der Lage ist, das Enzym zu inaktivieren.
Die zweite Komponente kann an ein Makromolekül, wie z.B. Dextran, ein Lipsom, Albumin, Makroglobulin oder Erythrozyten der Blutgruppe 0, so gebunden sein, dass die zweite Komponente davon abgehalten wird, das Gefäßkompartiment zu verlassen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die zweite Komponente eine ausreichende Anzahl an kovalent gebundenen Galactose-Resten oder Resten anderer Zucker, wie z.B. Lactose oder Mannose, enthalten, so dass sie das Konjugat im Plasma binden kann, aber gemeinsam mit dem Konjugat durch Rezeptoren für Galactose oder andere Zucker in der Leber aus dem Plasma entfernt werden kann. Die zweite Komponente sollte so verabreicht und ihre Verwendung sollte so geplant werden, dass sie in keinem messbaren Ausmaß in den extravaskulären Raum des Tumors eindringt, wo sie das lokalisierte Konjugat vor und während der Verabreichung des Prodrugs inaktivieren könnte.
Die genaue Dosierung muss selbstverständlich durch die jeweiligen Ärzte für den jeweiligen Patienten bestimmt werden und wird umgekehrt durch die genaue Natur des Prodrugs und des zytotoxischen Wirkstoffs, der aus dem Prodrug freigesetzt werden soll, gesteuert, jedoch kann eine allgemeine Orientierung zur Verfügung gestellt werden. Eine Chemotherapie dieser Art umfasst gewöhnlicherweise die parenterale Verabreichung des Prodrugs und des Enzym/Wirkstoff-Konjugats, und die Verabreichung auf intravenösem Weg ist oft die praktischste Form.
In Anbetracht der Art und Weise, auf welche die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet werden sollen, werden hierin auch pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die das Enzym, vorzugsweise an ein Targeting-Mittel, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, konjugiert, der in der Lage ist, an ein tumorassoziiertes Antigen zu binden, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren, gewöhnlicherweise einen für parenterale Verabreichung geeigneten, Träger oder Verdünner umfassen.
Es werden hierin ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die eine oder mehrere erfindungsgemäße p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Verbindungen der Formel I, II, V, VI oder VII gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren, gewöhnlicherweise einem für parenterale Verabreichung geeigneten, Träger oder Verdünner umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein System für den Einsatz in der Steuerung von Neoplasie in einem menschlichen oder tierischen Individuum bereit, vorzugsweise an ein Targeting-Mittel, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, konjugiert, der an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, gemeinsam mit zumindest einer der p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Verbindungen der Formel I, II, V, VI oder VII, welche ein Prodrug für einen Anti-Tumor-Wirkstoff darstellt, und vorzugsweise einem Ribosid oder Ribotid von Nicotinsäure oder Nicotinamid, welches als Cofaktor für das Enzym wirkt.
Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Neoplasie in einem menschlichen oder tierischen Wirt beschrieben, welcher eine Behandlung erfordert, die die Verabreichung einer wirksamen Menge einer p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Verbindung der Formel I, II, V, VI oder VII, welche ein Prodrug für einen Anti-Tumor-Wirkstoff darstellt, sowie des erfindungsgemäßen Enzmys, vorzugsweise an ein Targeting-Mittel, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, gebunden, der an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, an den Wirt umfasst, wobei das Enzym vorzugsweise gemeinsam mit einem Ribotid oder einem Ribosid von Nicotinsäure oder Nicotinamid als Cofaktor für das Enzym eingesetzt wird.
Die verschiedenen, oben beschriebenen Systeme für den Einsatz bei der Behandlung von Neoplasie umfassen fakultativ die "zweite Komponente" für beschleunigte Clearance wie oben beschrieben. Auf ähnliche Weise umfassen die oben erläuterten Verfahren zur Behandlung von Neoplasie fakultativ als Teil dieses Verfahrens den Einsatz der zweiten Komponente, wobei eine wirksame Menge dieser Komponente nach der Verabreichung des Enzyms verabreicht wird, um das Verhältnis von lokalisiertem zu frei zirkulierendem Enzym zu steigern. Hier kann für weitere spezielle Details in Bezug auf die zweite Komponente auf WO 89/10140 verwiesen werden, und diese Details werden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
BEISPIEL 1
Isolierung und Reinigung eines Nitroreductase-Enzyms von E. coli B.
200 g E.-coli-B-Zellpaste wurde erneut auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aus 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7, umfassend 0,3 M Ammoniumsulfat, suspendiert. Die Zellen wurden unter Einsatz eines MSE-Soniprep-150-Desintegrators (3 × 20 sek mit voller Leistung mit 60-sekündigen Intervallen, damit die Hitze abgeleitet werden konnte) mittels Ultraschall gebrochen. Um die Klärung des Extrakts zu unterstützen, wurden DNase (23.000 Kunitz-Einheiten/l) und RNase (2.400 Kunitz-Einheiten/l) vor dem 30-minütigen Zentrifugieren bei 8.000 g zur Entfernung der Zelltrümmer zugesetzt. Der klare, gelbliche Überstand wurde vor der Chromatographie durch einen 0,45-μm-Filter gefiltert.
Der filtrierte Extrakt wurde auf eine Säule (25 × 5 cm) aus Phenyl-Sepharose CL-6B (Pharmacia) in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7, umfassend 0,3 M Ammoniumsulfat, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina Ausgangspuffer wurde die Säule mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, eluiert. Aktive Fraktionen wurden gepoolt und 18 h lang gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, dialysiert, um Spuren von Ammoniumsulfat zu entfernen. Die dialysierten Fraktionen wurden in 50-ml-Aliquoten auf Q-Sepharose-High-Performance in 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4 ml/min aufgetragen. Es erfolgte eine Elution durch einen Gradienten von 0–0,2 M KCl, wobei die Nitroreductase bei 0,1–0,12 M KCl eluiert wurde. Aktive Fraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung einer Säule (32 × 6 cm) aus Sepahdex-G25-Medium in 20 mM Bis-Tris-Propan, pH 7, entsalzt. Diese Fraktionen wurden auf Q-Sepharose-High-Performance (Hi-Load-26/10-Säule, Pharmacia), welche in 20 mM Bis-Tris-Propan, pH 7, äquilibriert worden waren, aufgetragen. Eine Elution erfolgte durch einen Gradienten von 0–0,1 M KCl. Nitroreductase wurde als erster Hauptpeak bei 0,07–0,09 M KCl eluiert.
Die Homogenität des Endprodukts wurde unter Verwendung eines vorgefertigten 8–25%igen Gradientengels für native Polyacrylamidgelelektrophorese (Pharmacia Phastsystem) bestätigt. Die Elektrophorese erfolgte für 75 vh. Die Nitroreductase in rohen und teilweise gereinigten Fraktionen wurde routinemäßig durch ihre Chinonreductase-Aktivität unter Verwendung von Menadion als Substrat, NADH als Cofaktor und Cytochrom C als terminalem Elektronenakzeptor getestet.
Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt von Nitroreductase wurde durch isoelektrische Fokussierung (Pharmacia Phastsystem, Fokussierung für 400 vh) und Chromatofokussierung unter Verwendung einer Mono-P-Säule (Pharmacia Mono P HR5/20, 20 mM Bis-Tris, pH 6,3, und Polypuffer 74, pH 4,0) ermittelt.
Die E.-coli-Nitroreductase wurde als reines Protein mit einem Molekulargewicht von 24 kDa (wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Gelchromatographie bestimmt) isoliert. Ein zweites Protein, das eine Chinonreductase-Aktivität aufwies, aber als Nitroreductase gegenüber CB 1954 inaktiv war, co-eluiert teilweise aus Phenylsepharose und kann von dem aktiven Enzym vollständig durch den Ionenaustauschchromatographieschritt auf Q-Sepharose-High-Performance (siehe Tabelle 1) bei pH 7,6 abgetrennt werden. Die beiden Enzyme unterscheiden sich aufgrund ihres Molekulargewichts (inaktiv: 55 kDa; aktiv: 24 kDa) und ihres isoelektrischen Punkts (inaktiv: 5,2; aktiv: 5,1). Das aktive Protein weist eine gelbe Farbe auf, was auf die Gegenwart eines Flavin-Coenzyms hinweist. Nach dem 20-minütigen Erhitzen auf 70°C konnte dieses Flavin von dem Apoenzym durch Ultrafiltration abgetrennt werden, und es konnte unter Einsatz einer HPLC gezeigt werden, dass es sich um FMN, und nicht um FAD, handelte.
Für die Sequenzanalyse geeignete Fragmente wurden durch den Verdau des Enzyms mit Bromcyan hergestellt. Die aus diesen Verdauen resultierenden Peptide wurden durch eine Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer RP-300-Säule (25 × 4,6 mm) (Brownlee) und eines Lösungsmittelgradienten aus 10–60 % Acetonitril in Wasser mit 0,06 % Trifluoressigsäure in jedem Lösungsmittel gereinigt. Die Sequenzanalyse erfolgte durch einen automatischen Edman-Abbau unter Einsatz eines Applied-Biosystems-470A-Gasphasenproteinsequenzierers (Kelvin Close, Warrington, UK).
Aminosäuresequenzanalyse der Nitroreductase
Die wie oben beschrieben isolierte E.-coli-Nitroreductase wurde einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen. Im Gegensatz zu dem aus dem Walker-Tumor isolierten Enzym, EC.1.6.99.2, war die erfindungsgemäße Nitroreductase am N-Terminus nicht blockiert und ergab eine klare N-terminale Sequenz mit 31 Aminosäureresten und ein durch den Verdau mit Bromcyan erzeugtes Peptid mit weiteren 41 Resten. Diese Teilsequenzen werden in Tabelle 2 angeführt.
TABELLE 2 Aminosäuresequenzen des N-Terminus der E.-coli-B-Nitroreductase und eines nach dem Verdau der Nitroreductase mit Bromcyan (fettgedruckt) erhaltenen Polypeptids sowie Vergleich mit der abgeleiteten Proteinsequenz der Nitroreductase von Salmonella typhimurium (Watanabe et al., 1990).
Nucleotidsequenz des Nitroreductase-Gens
Das Nitroreductase-Gen von E. coli wurde kloniert, und seine Nucleotidsequenz wurde durch eine Didesoxysequenzanalyse beider Stränge bestimmt. In Tabelle 3 wird die Nucleotidsequenz des 1167-Basen-Nrul/Pst-Fragments angeführt, welches ein offenes Leserater von 651 Nucleotiden, die für die Nitroreductase kodieren, umfasst. Die mutmaßliche Sequenz von Shine-Dalgarno und das Transkriptionsterminationssignal werden angeführt.
TABELLE 3
BEISPIEL 2
Enzymatische Reduktion von CB 1954.
CB 1954 (100 μM und ebenfalls umfassend [U-³H]-CB-1954 bei 1,6 × 10⁵ dpm pro nmol), NADH oder NAD(P)H (500 μM) wurden mit dem wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen, aktiven Enzym (im Allgemeinen 2 μg/ml E.-coli-Nitroreductase oder 35 μg/ml Walker-NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon) EC 1.6.99.2) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Luft oder Helium inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquoten (10 μl) auf eine Partisphere-SCX-HPLC-Säule (110 × 4,7 mm) injiziert und isokratisch (2 ml/min) mit 100 mM NaH₂PO₄ eluiert.
Das Eluat wurde kontinuierlich in Bezug auf Adsorption bei 310, 260 und 360 nm untersucht, und die Spektren der eluierten Komponenten wurden unter Einsatz eines Diodenmatrixdetektors aufgezeichnet. Proben (0,5 ml) wurden gesammelt, und die Tritiumaktivität jeder Probe wurde durch Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt. Diese Trennungssysteme konnten alle erwarteten Reduktionsprodukte auflösen.
Um die Identität der Reduktionsprodukte weiter zu bestätigen, wurde das oben beschriebene Reduktionsgemisch auch auf eine ODS-5-Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert und mit einem Methanolgradienten (0–30 % linear, 30 min lang, 30–100 % linear, 10 min lang) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7) eluiert (1 ml/min).
Die Reduktion von CB 1954 durch E.-coli-Nitroreductase führte zu der Bildung von zwei Produkten, die sich durch den Vergleich der Retentionszeiten und der spektralen Eigenschaften mit bekannten Standards als 5-(Aziridin-1-yl)-4-hydroxylamino-2-nitrobenzamid und 5-(Aziridin-1-yl)-2-hydroxylamino-4-nitrobenzamid erwiesen. Es wurden keine weiteren CB-1954-Metaboliten gefunden. Als weitere Bestätigung der Bildung der 2- und der 4-Hydroxylamine durch die erfindungsgemäße Nitroreductase wurden 33 μM 4-Hydroxylamin gebildet, als 67 μM CB 1954 durch die Nitroreductase reduziert wurden. Im Gegensatz dazu wurden durch die Reduktion von 50 μM CB 1954 durch die Walker-NAD(P)N-Dehydrogenase (Chinon) 50 μM 4-Hydroxylamin gebildet. Bezogen auf die Anfangsraten der 4-Hydroxylamin-Bildung ist Nitroreductase unter den eingesetzten Standardbedingungen pro mg Protein 31,2-mal aktiver als NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon) (oder 62-mal aktiver durch CB-1954-Reduktion).
Die Reduktionsrate von CB 1954 oder die Produktbildungsrate war gleich, wenn NAD(P)H oder NADH als Cofaktor eingesetzt wurden und wenn die Reduktion unter Helium erfolgte.
Um zu zeigen, dass die Nitroreductase eine zytotoxische Spezies herstellte, erfolgte die Reduktion von CB 1954 in Gegenwart von V79-Zellen, die CB 1954 gegenüber unempfindlich sind. Wie in Tabelle 4 dargestellt, wurde eine deutliche zytotoxische Wirkung in Hamster-V79-Zellen beobachtet – jedoch nur unter den Bedingungen, unter welchen die Nitroreductase CB 1954 reduzierte.
BEISPIEL 3
Substratspezifizität des E-coli-Nitroreductase-Enzyms
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen E.-coli-Nitroreductase, andere Nitroverbindungen als CB 1954 zu reduzieren, wurde durch eine HPLC bestimmt, indem die aus seiner Oxidation resultierende Abnahme der Peakfläche von NADH verfolgt wurde.
Die Experimente erfolgten wie oben beschrieben, jedoch wurden die Aliquoten auf eine Partisphere-SAX-HPLC-Säule (110 × 4,7 mm) injiziert und isokratisch (1 ml/min) mit 75 mM NaH₂PO₄ eluiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 angeführt.
TABELLE 5

Die relativen Reduktionsraten verschiedener Nitrobenzamide und Nitrobenzole mit E.-coli-Nitroreductase-Enzym. Die Reduktionsraten wurden durch die resultierende Oxidation von NADH ermittelt. Alle Reaktionen erfolgten bei 37 °C an Luft, wobei NADH (500 μM) als Elektronendonor diente, bei einer anfänglichen Substratkonzentration von 100 μM.

SUBSTRAT	RELATIVE NADH-OXIDATIONSRATE
	NR
CB 1954	1,0
2,4-Dinitro-5-(2-hydroxyethylamino)benzamid	0,04
2-Amino-5-(aziridin-1-yl)-4-nitrobenzamid	< 0,01
4-Amino-5-(aziridin-1-yl)-4-nitrobenzamid	< 0,01
5-Chlor-2,4-dinitrobenzamid	22,4
3,5-Dinitrobenzamid	75,5
2-Nitrobenzamid	0,06
3-Nitrobenzamid	1,8
4-Nitrobenzamid	5,1
2,4-Dinitrophenol	< 0,01
5-Nitro-2-furaldehydsemicarbazon (Nitrofurazon)	3,6

BEISPIEL 4
Enzymkinetik- und -hemmungsuntersuchungen
Chinonreductase-Aktivitäten wurden mittels eines spektrophotometrischen Verfahrens unter Einsatz von Menadion als Substrat und Cytochrom C als terminalem Elektronenakzeptor, wie in Knox et al, Biochem. Pharmacol. 37, 4671–4677 (1988), beschrieben, getestet. Die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch eine lineare Regressionsanalyse (r > 0,955) und kinetische Parameter, die wie von Roberts et al., Biochem. Pharmacol. 38, 4167–4143 (1989), beschrieben aus den resultierenden Diagrammen bestimmt wurden, ermittelt. Die Proteinkonzentration wurde unter Einsatz eines herkömmlichen, gegen Rinderserumalbumin kalibrierten Protein-Tests (Bio-Rad) bestimmt.
Die kinetischen Parameter für E.-coli-Nitroreductase und Walker-NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon) EC. 1.6.99.2 sind in Tabelle 6 angeführt. Obwohl beide Enzyme vergleichbare Kms für CB 1954 aufweisen, ist die Km der Nitroreductase für NADH etwa 10-mal geringer als der des Walker-Enzyms. Die absoluten Reduktionsraten von CB 1954 (d.h. unter Sättigungsbedingungen) durch die beiden Enzyme werden durch ihre k_catt-Werte ausgedrückt, und dieser ist bei der E.-coli-Nitroreductase 90-mal höher. Menadion wurde ebenfalls als Substrat für beide Enzyme eingesetzt, wobei es zu kleinen Unterschieden in Bezug auf die jeweiligen k_car-Werte kam, obwohl die Km von Nitroreductase für dieses Substrat 60-mal höher war.
Dicumarol wurde als Inhibitor der Nitroreductase eingesetzt. In Bezug auf NADH konnten keine kinetischen Parameter gemessen werden. In Bezug auf Menadion war Dicumarol ein nicht-konkurrierender Inhibitor mit einer Ki' von 1,90 ± 0,38 μM.
TABELLE 6 Kinetische Parameter für die E.-coli-B-Nitroreductase und Walker-NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon).
BEISPIEL 5
Die Fähigkeit der E.-coli-B-Nitroreductase, andere Verbindungen als CB 1954 zu einer zytotoxischen Spezies zu aktivieren.
Wie in Tabelle 7 angeführt, wurde in menschlichen MAWI-Zellen durch die Prodrugs CB 1837 und CB 10–107 eine deutliche zytotoxische Wirkung beobachtet, jedoch nur dann, wenn das Prodrug durch das Nitroreductase-Enzym reduziert wurde.
TABELLE 7
Die Wirkung von enzym-aktivierten Prodrugs auf das Überleben von MAWI-Zellen. 1-ml-Volumina MAWI-Zellen (2 × 10⁵/ml) wurden mit 50 μM Prodrug, 500 μM NADH und 10 μg/ml des Enzyms aus Beispiel 1 inkubiert. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen geerntet, und ihre Fähigkeit, Kolonien zu bilden, wurde getestet, und der Überstand wurde mittels HPLC bezüglich der Konzentration des verbleibenden Prodrugs getestet.
BEISPIEL 6
HERSTELLUNG VON 1,4-DIHYDRONICOTINSÄURE-RIBOSID AUS NICOTINSÄU-RE-RIBOSID ODER NICOTINSÄURE-RIBOTID
(i) Herstellung von Nicotinsäure-Ribosid aus Nicotinsäure-Ribotid.
Eine Lösung von Nicotinsäure-Ribotid (Nicotinsäure-Mononucleotid) (Sigma, Poole, UK) (25 mg) in wässrigem Puffer (Tris 100 mM; pH 8,5; MgCl₂; 2,5 ml) wurde mit 2000 Einheiten Alkalinphosphatase, Typ VII-S (100 μl; 20.000 Einheiten/ml) (Sigma) 1 h lang bei 37 °C behandelt. Die alkalische Phosphatase wurde von dem Verdau durch zentrifugale Molekularfiltration (Molekulargewichtsgrenze 10.000; "Centricon 10"; Amicon, High Wycombe, UK) abgetrennt. Verdünnungen (1:100) der Lösung wurden vor und nach dem Verdau mit alkalischer Phosphatase mittels Anionenaustausch-Hochleistungschromatographie (Partisphere-5-SAX-Säule, isokratische Elution mit 0,1 M NaH₂PO₄, pH 5, 1,5 ml/min, 10 μl Injektionsvolumen; mittels UV-Absorption bei 260 nm beobachtet) analysiert. Die Stammverbindung wurde bei einer Retentionszeit von 1,18 min eluiert. Die Untersuchung nach dem Verdau wiesen darauf hin, dass es zu einer vollständigen Überführung gekommen war, wodurch die neue Titelverbindung mit einer Retentionszeit von 0,63 min eluiert wurde, was als Hinweis auf eine Dephosphbrylierung verstanden wurde, durch die man das Ribosid erhielt.
(ii) Reduktion von Nicotinsäure-Ribosid zu 1,4-Dihydronicotinsäure-Ribosid.
Es wurde das Verfahren von Jarman und Searle (1972) übernommen. Das Verfahren wurde auf das wie oben hergestellte Nicotinsäure-Ribosid und auch auf chemisch synthetisiertes Material (Jarman 1969) angewandt. Mit beiden Ausgangsverbindungen aus beiden Ursprungsquellen wurden dieselben Ergebnisse erzielt.
Zu einer wässrigen Lösung von Nicotinsäure-Ribosid (5 ml; 4 mg/ml) wurden 50 mg Natriumcarbonat, 50 mg Natriumbicarbonat und 50 mg Natriumhydrosulfit zugesetzt. Die gestoppte Lösung wurde 1 h lang bei 37 °C inkubiert und das Reduktionsprodukt durch eine präparative Umkehrphasen-HPLC abgetrennt. Die 5 ml wurden auf eine 5-μm-C18-Microsorb-Umkehrphasen-Säule (10 × 250 mm) (Rainin) injiziert und durch einen Methanolgradienten in Wasser (0–100 % 30 min lang), der durch 10 mM NN₄CH₃COO bei pH 5 gepuffert wurde, bei 4 ml/min eluiert. Das Eluat wurde kontinuierlich mittels UV-Absorption und Fluoreszenz beobachtet, und das Reduktionsprodukt (Chromatographie mit Basislinienauflösung bei einer Retentionszeit von 12–13 min) wurde durch sein Absorptionsmaximum bei 326 nm (bei pH 5; 340 nm bei pH-Wert 7) und seine Fluoreszenz (Gilson-121-Fluorometer mit Breitband-Glasfiltern; Anregungszentrum bei 350 nm; Emission bei 450 nm) charakterisiert, wobei die Stammverbindung keine dieser Eigenschaften aufwies. 4 ml Eluate einer 2 mM Lösung (unter Annahme einer ε₃₄₀ von 6200, d.h. die gleiche wie NADH) waren typisch, was auf eine Ausbeute von 2,7 mg, d.h. etwa 13 %, hindeutete. Vor der experimentellen Verwendung wurden die Präparate durch eine analytische HPLC analysiert, und es wurde bestätigt, dass sie im Wesentlichen rein sind.
Literaturverweise:

(i) M. Jarman und F. Searle, Potential Coenzyme Inhibitors-V, Biochem. Pharmacol. 21, 455–464 (1972).
(ii) M. Jarman, 4-Substituted Nicotinic acids and Nicotinamides. Part III. Preparation of 4-Methylnicotinic acid Riboside, J. Chem. Soc. (C), 918–920 (1969).

BEISPIEL 7
Die Fähigkeit von 1 4-Dihydronicotinsäure-Ribosid als Cofaktor für E.-coli-Nitroreductase zu fungieren.
Die Fähigkeit des Nitroreductase-Enzyms, einen synthetischen Cofaktor anstelle von NADH oder NADPH für die Reduktion von CB 1954 zu nutzen, wird in 1 dargestellt. Das Nitroreductase-Enzym kann sowohl 1,4-Dihydronicotinsäure-Ribosid als auch NADH mit gleicher Wirksamkeit als Cofaktoren für die Reduktion von CB 1954 heranziehen. Im Gegensatz dazu kann Walker-DT-Diaphorase diesen synthetischen Cofaktor nicht nutzen. Deshalb stellt 1,4-Dihydronicotinsäure-Ribosid einen selektiven Cofaktor für das E.-coli-Nitroreductase-Enzym dar und kann nicht von Säugetier-DT-Diaphorase genutzt werden.
In den folgenden Beispielen 8–12 bezieht sich "Silicagel" auf Merck Silicagel 60, Mesh 70–230, und Proton-NMR-Spektren wurden bei 300 MHz in CDCl₃ erhalten. Die Temperaturen sind in °C angegeben.
BEISPIEL 8
4-[Bis(2-chlorethyl)aminolphenylcarbaminsäure-4'-nitrobenzylester:
Zu einer gerührten Lösung aus 4-Nitrobenzylchlorformiat (295 mg) in trockenem CHCl₃ (5 ml) wurde eine Lösung aus 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]anilinhydrochlorid (367 mg) und NEt₃ (377 μl) in trockenem CHCl₃ (5 ml) über einen Zeitraum von 5 min zugesetzt. Nach 1 h wurde die Lösung 18 h lang bei 20 ° gelagert und dann eingedampft. Der Rückstand wurde an einer Silicagel-Säule mit CHCl₃ chromatographiert, wodurch man das Titelprodukt als einen gelben Feststoff erhielt, der aus Benzol/Petrolether in Form von Prismen umkristallisiert wurde, Schmelzpunkt 111–112 °C. Ausbeute: 361 mg (64 %). Massenspektrum mit chemischer Ionisation mit CH₄: Ion bei m/z 412 (M + 1, relative Intensität 1,00) zeigt M = 411. C₁₈H₁₉N₂O₄Cl₂ erfordert M = 411 (für Cl³⁵-Isotop). NMR: δ 3,57 (m, 4H, CH₂Cl oder CH₂N), 3,69 (m, 4 H, CH₂Cl oder CH₂N), 5,28 (s, 2H, ArCH₂), 6,65 (d, 4H, ArH), 7,51 (d, 2H, ArH) und 8,23 (d, 2H, ArH).
BEISPIEL 9
4-[Bis(2-chlorethyl)aminolphenyl-4'-nitrobenzylcarbonat
Eine Lösung aus 4-Nitrobenzylchlorformiat (58 mg) in trockenem CHCl₃ (1,5 ml) wurden zu einer gerührten, eisgekühlten Lösung aus 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]phenolhydrochlorid (72 mg) und NEt₃ (74 μl) in trockenem CHCl₃ (2 ml) zugesetzt. Nach 18 h bei 21 °C wurde die Lösung eingedampft, und der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule mit CHCl₃/Petrolether (3:2) chromatographiert, um die Titelverbindung zu ergeben, die aus EtOAc/Petrolether als schwach gelbe Prismen umkristallisiert wurde, Schmelzpunkt 77–79 °C (Ausbeute 102 mg). FAB-MS: Ion bei m/z 413 ergibt M = 412 (C₁₈H₁₈N₂O₅Cl₂ erfordert M = 412). NMR (CDCl₃): δ 3,62 (m, NCH₂ oder ClCH₂), 3,69 (m, NCH₂ oder ClCH₂), 5,33 (s, ArCH₂), 6,64 (d, ArH), 7,05 (d, ArH), 7,59 (d, ArH) und 8,25 (d, ArH).
BEISPIEL 10
N-4-Nitrobenzyloxycarbonylactinomycin D:
Actinomycin D (AMD, 41 mg) in MeOH (5 ml) wurde über 10 % Pd/C 2 h lang hydriert und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Lösung aus 4-Nitrobenzylchlorformiat (18 mg) in trockenem CHCl₃ (1,5 ml) unter N₂ aufgelöst, und eine Lösung von NEt₃ (10 μl) in CHCl₃ (1,5 ml) wurde dann zugesetzt. Nach Rühren unter N₂ für 24 h wurde der Katalysator abfiltriert, und die Lösung wurde nach Verdünnen mit MeOH (200 ml) 3 Tage lang belüftet. Die Lösung wurde eingedampft, und das Produkt wurde gereinigt, um AMD durch zwei semi-präparative HPLCs auf einer Umkehrphasen-Säule von an C₁₈ gebundenem Siliciumdioxid mit 1 cm Durchmesser mit einem 50–100%igen Gradienten von MeCN in H₂O zu entfernen. Die Titelverbindung wurde aus Ethylacetat/Petrolether in Form von roten Prismen umkristallisiert. Ausbeute: 31 mg (66 %). Elektrospraymassenspektrum: Ionen bei m/z 1434,5 (M + H) und 1456,4 (M + Na) zeigen M = 1433,5. C₇₀H₉₁N₁₃O₂₀ (geringstes Massenisotop) erfordert M = 1433,65. NMR ergab dieselben Signale wie AMD plus δ 6,71 (d, 1H, ArCH₂), 7,09 (d, 1 H, ArCH₂) und zusätzliche Signale in der aromatischen Region.
BEISPIEL 11
N-4-Nitrobenzyloxycarbonyldoxorubicin VI
Doxorubicinhydrochlorid (2,25 mg) wurde in Dimethylformamid (DMF) (0,3 ml), welches Triethylamin (NEt₃) (0,55 μl) enthielt, gelöst, und eine Lösung aus 4-Nitrobenzyl-4'-nitrophenylcarbonat (1,4 ml) in DMF (0,1 ml) wurde zugesetzt. Nach dreitägigem Rühren im Dunkeln wurde das Gemisch mittels HPLC auf einer C₁₈-Umkehrphasensilicasäule (Durchmesser 1 cm) mit einem Gradienten aus 25- bis 100 MeCN in 0,01 M Formiatpuffer (pH-Wert 4,0) getrennt. Das Eindampfen in Vakuum ergab das Produkt (2,1 mg) in Form eines amorphen roten Pulvers. Elektrospraymassenspektrum: Ion bei 723 (M + H) zeigt M = 722. C₃₅H₃₄N₂O₁₅ erfordert M = 722.
BEISPIEL 12
N-4-Nitrobenzyloxycarbonylmitomycin C
Eine Lösung aus Mitomycin C (36 mg) in Dimethylformamid (DMF) (2 ml), welches NEt₃ (14 μl) enthielt, wurde zu 4-Nitrobenzylchlorformiat (30 mg) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 21 °C 4 h lang gerührt. Nach dem Eindampfen in Vakuum wurde der Rückstand auf einer Silicagel-Säule mit EtOAc chromatographiert, wodurch man die Titelverbindung in Form eines dunkelroten Feststoffs (49 mg) erhielt. Elektrospray-MS: Ion bei 514 (M + H) zeigt M = 513. C₂₃H₂₃N₅O₉ erfordert M = 513.
BEISPIEL 13
Bildung von Actinomycin D durch das Einwirken von Nitroreductase auf Prodrug V:
V (100 μM) und ein Cofaktor (500 μM NADH) wurden mit einem Enzym (2 μg/ml E.-coli-B-Nitroreductase aus Beispiel 1) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) in Luft bei 37 °C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquoten (20 μl) auf eine Microsorb-C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (240 × 4,7 mm) injiziert und isokratisch (1 ml/min) mit 80 % Acetonitril in Wasser eluiert. Das Eluat wurde fortlaufend in Bezug auf Absorption bei 280 nm beobachtet, und die Arzneimittel-Konzentration wurde durch das Integrieren des dieser Verbindung auf der HPLC-Spur entsprechenden Peaks berechnet. Nur in Gegenwart des Enzyms wurde Actinomycin D von dem Prodrug freigesetzt.
Das Verschwinden des Prodrugs N-4-Nitrobenzyloxycarbonylactinomycin D (V) und die Bildung von Actinomycin D während der Inkubation mit E.-coli-B-Nitroreductase aus Beispiel 1 ist in 2 dargestellt.
BEISPIEL 14
Die Bildung von Mitomycin C bei der Einwirkung des Nitroreductase-Enzyms auf Prodrug VII:
Prodrug VII (100 μM) und ein Cofaktor (500 μM NADH) wurden mit einem Enzym (5 μg/ml E.-coli-B-Nitroreductase aus Beispiel 1) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) in Luft bei 37 °C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquoten (10 μl) auf eine Partisphere-C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (150 × 4,7 mm) injiziert und isokratisch (2,0 ml/min) mit 50 % Methanol in Wasser eluiert. Das Eluat wurde fortlaufend in Bezug auf Absorption bei 260 und 340 nm beobachtet, und die Arzneimittel-Konzentration wurde durch die Integration des der Verbindung auf der HPLC-Spur entsprechenden Peaks berechnet.
Das Verschwinden des Prodrugs VII und die Bildung von Mitomycin C während dieser Inkubation ist in 3 dargestellt. Nur in Gegenwart des Enzyms wurde Mitomycin C von dem Prodrug freigesetzt.
BEISPIEL 15
Aktivierung von Prodrug I, worin R¹NH₂ = III, und Prodrug V durch die Nitroreductase:
Die Erzeugung von Zytotoxizität durch das Einwirken der E.-coli-Nitroreductase aus Beispiel 1 auf die Prodrugs 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]phenylcarbaminsäure-4'-nitrobenzylester (I worin R¹NH₂ = III) und N-4-Nitrobenzyloxycarbonylactinomycin D (V) ist in Tabelle 8 angeführt.
TABELLE 8
Die Wirkung von enzym-aktivierten Prodrugs auf das Überleben von V79-Zellen. 1-ml-Volumina V79-Zellen (2 × 10⁵/ml) wurden mit dem Prodrug, 500 μM NADH und 10 μg/ml Enzym inkubiert. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen geerntet, und ihre Fähigkeit, Kolonien zu bilden, wurde getestet. Der Überstand wurde mittels HPLC in Bezug auf die Konzentration des verbleibenden Prodrugs getestet.
BEISPIEL 16
Herstellung und Binden eines Antikörper-Enzym-Konjugats
Ein Antikörper-Enzym-Konjugat aus A5B7-F(ab)₂ und Nitroreductase wurde unter Verwendung der heterobifunktionellen Wirkstoffe Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat (SMPB) zum Einführen von aktiven Maleinimidgruppen in das Immunglobulin und 2-Mercapto-[S-acetyl]essigsäure-N-hydroxysuccinimid (SATA) zur Thiolierung der E.-coli-Nitroreductase hergestellt. Beim Vermischen der Proteine reagieren die Maleinimidgruppen mit den Thiolen und bilden eine Thioether-Bindung. Das eingesetzte Molverhältnis von SMPB:Immunglobulin betrug 10:1, und das Molverhältnis von SATA:Nitroreductase betrug 4:1. Das so hergestellte Antikörper-Enzym-Konjugat wurde von hochmolekularen Aggregaten und nicht gebundenen Komponenten mittels Gelfiltrationschromatographie unter Einsatz einer kalibrierten Superdex-G200-Säule (16 × 700 mm) isoliert. Die Säule wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) äquilibriert und mit demselben Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Fraktionen, die Material umfassten, welches bezogen auf das Molekulargewicht einem 2:1- und 1:1-Konjugat (jeweils 316 kDa bzw. 233 kDa) entsprachen, wurden gepoolt und erneut an derselben Säule chromatographiert, und Proben der gepoolten Fraktionen wurden auf 4-15%igen SDS-PAGE-Gelen (Pharmacia, Phastgels, durchlauf für 60 vh) unter nicht reduzierenden Bedingungen gemeinsam mit Kalibrierungsproteinen laufen gelassen. Das Konjugat war als Material mit Mr 125 kDa (entspricht 1:1 F(ab')₂-Nitroreductase) vorhanden, und Konjugate mit höherem Molekulargewicht waren mit einer geringeren Menge von freiem F(ab')₂ und Nitroreductase vorhanden.
Die enzymatische Aktivität des Konjugats wurde durch einen Routinetest unter Einsatz von CB 1954 als Substrat festgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Konjugat an mit 1 μg/ml CEA-Antigen beschichtete Platten bindet und Bindungsstellen für Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin und sekundäre Kaninchen-Anti-Nitroreductase-Antikörper (4) aufweist. Proben des nicht gebundenen F(ab')₂ und von Nitroreductase wurden eingesetzt, um die Spezifizität der Bindung der sekundären Antikörper zu bestätigen.
Die Bindung der Antikörper wurde unter Einsatz eines standardgemäßen kolorimetrischen Meerretichperoxidase- (HRP-) ELISA-Tests bestimmt, wobei die Ergebnisse bei 405 nm abgelesen wurden. Die verkehrten, nicht ausgefüllten Dreiecke in 4 zeigen, dass gebundenes A5B7-F(ab')₂-Nitroreductase-Konjugat mit einem Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper nachgewiesen werden kann, und die ausgefüllten, verkehrten Dreiecke zeigen, dass das Konjugat auch durch einen Kaninchen-Anti-NR-Antikörper (wobei der Anti-NR-Antikörper mittels eines Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörpers nachgewiesen wird) nachgewiesen werden kann. Die in 4 angeführten Kontrollwerte sind folgende: ausgefüllte Kreise = Bindung von nicht konjugiertem A5B7-F(ab')₂; nicht ausgefüllte Quadrate = mittels Zie gen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin nachgewiesenes A5B7-F(ab')₂-Konjugat; ausgefüllte Quadrate = nur mit Kaninchen-Anti-NR nachgewiesene NR; nicht ausgefüllte Dreiecke = nur mit Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin nachgewiesene NR.
BEISPIEL 17
In-vivo-Toxizität von Prodrugs
Das Actinomycin-D-Prodrug (AMDPD) der Formel V wurde in Bezug auf seine Toxizität in Mäusen getestet. Gruppen mit jeweils 3 Mäusen wurden 1, 10 oder 100 mg/kg Körpergewicht AMPD i.p. verabreicht, und zwei weiteren Gruppen mit jeweils 3 Mäusen wurden 1 und 10 mg/kg Körpergewicht Actinomycin D (AMD) gelöst in Erdnussöl i.p. verabreicht. Eine weitere Gruppe mit 3 Mäusen wurde nicht behandelt, und einer letzten Gruppe mit 3 Mäusen wurde nur Erdnussöl i.p. verabreicht.
Das Körpergewicht der Mäuse wurde über 9 Tage hinweg beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angeführt. Alle mit 10 mg/kg AMD behandelten Mäuse waren an Tag 1 bereits tot. Ein ähnliches Ergebnis wurde mit einer Dosis von 5 mg/kg erzielt. Diese Daten weisen darauf hin, dass AMDPD zumindest 20- bis 100fach weniger toxisch ist als AMD. In der Praxis ist die Toxizität von AMDPD wahrscheinlich noch geringer, da das verwendete AMDPD-Präparat etwa 1 % nicht überführtes AMD umfasst.
TABELLE 9 Toxizität von AMD und AMDPD
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

System zum Einsatz in einer Chemotherapie, zwei Bestandteile umfassend: (i) eine Nitroreductase, die von einem Bakterium erhältlich ist und folgende Merkmale aufweist: 1: es handelt sich um ein Flavoprotein mit einem Molekulargewicht im Bereich von 20–60 Kilodalton; 2: es erfordert entweder NADH oder NAD(P)H oder Analoga davon als Cofaktor; 3: es weist einen Km für NADH oder NAD(P)H im Bereich von 1–100 μM auf; und 4: es ist in der Lage, eine oder beide der Nitrogruppen von CB 1954 und Analoga davon zu einer zytotoxischen Form zu reduzieren; und (ii) eine Verbindung, ausgewählt aus (a) Verbindungen der Formel (I):
worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine zytotoxische Verbindung ist; (b) Verbindungen der Formel (II):
worin R² so gewählt ist, dass die Verbindung R²OH eine zytotoxische Verbindung ist; (c) einer Verbindung der Formel (V):
(d) einer Verbindung der Formel (VI):
(e) einer Verbindung der Formel (VII):
System nach Anspruch 1, worin die Nitroreductase von den Zellen von E. coli B erhältlich ist.
System nach Anspruch 1, worin die Nitroreductase die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
System nach Anspruch 1, worin die Verbindung aus Verbindungen der Formel (I) ausgewählt ist.
System nach Anspruch 4, worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine Stickstofflostverbindung ist.
System nach Anspruch 5, worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine Stickstofflostverbindung der Formel (IV) ist:
worin R' und R'' H, F oder CH₃ sind.
System nach Anspruch 6, worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine Stickstofflostverbindung der Formel (III) ist:
System nach Anspruch 1, worin die Verbindung aus Verbindungen der Formel (V), (VI) und (VII) ausgewählt ist.
System nach Anspruch 1, worin die Verbindung aus Verbindungen der Formel (II) ausgewählt ist.
System nach Anspruch 9, worin R² so gewählt ist, dass die Verbindung R²OH eine phenolische Stickstofflostverbindung ist.
System nach Anspruch 10, worin die Verbindung die Formel (VIII) aufweist:
System nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner assoziiert ist.
System nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nitroreductase an ein Targeting-Mittel für einen Tumor konjugiert ist.
System nach Anspruch 13, worin das Targeting-Mittel ein monoklonaler Antikörper ist, der an ein tumorassoziiertes Antigen bindet.
System nach Anspruch 13, worin die Nitroreductase kovalent an das Targeting-Mittel gebunden ist.
System nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das weiters ein Ribosid von 1,4-Dihydronicotinsäure, gegebenenfalls in Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner, umfasst.
System nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Verbindung der Formel (I):
worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine Stickstofflostverbindung der Formel (IV) ist:
worin R' und R'' H, F oder CH₃ sind.
Verbindung nach Anspruch 18, worin R¹ so gewählt ist, dass die Verbindung R¹NH₂ eine Stickstofflostverbindung der Formel (III) ist:
Formel (IV) ist:
Verbindung der Formel (V), (VI) oder (VII):
Verbindung der Formel (II):
worin R² so gewählt ist, dass die Verbindung R²OH eine phenolische Stickstofflostverbindung ist.
Verbindung nach Anspruch 21 der Formel (VIII):
Nitroreductase, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 18, welches das Umsetzen eines Stickstofflosts der Formel (IV) nach Anspruch 18 mit 4-Nitrobenzylchlorformiat unter wasserfreien Bedingungen umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (V), (VI) oder (VII) nach Anspruch 20, welches das Umsetzen von Actinomycin D, Doxorubicin bzw. Mitomycin C mit 4-Nitrobenzylchlorformiat unter wasserfreien Bedingungen umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) nach Anspruch 21, welches das Umsetzen eines phenolischen Stickstofflosts mit 4-Nitrobenzylchlorformiat unter wasserfreien Bedingungen umfasst.