DE69232693T2 - Glialmitogene faktoren, ihre herstellung und verwendung - Google Patents
Glialmitogene faktoren, ihre herstellung und verwendungInfo
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf neue Polypeptide, die in Vertebratenarten vorkommen, wobei diese Polypeptide mitogene Wachstumsfaktoren sind, die z. B. eine Aktivität auf in Kultur gehaltene Schwann-Zellen aufweisen. Die Erfindung betrifft auch unter anderem ein neues Isolierungsverfahren, das solche Faktoren hervorbringen kann, und die therapeutische Anwendung solcher Faktoren. Die Erfindung umfasst ferner nützliche Peptide, die für solche Faktoren charakteristisch sind.
- Die Gliazellen von Vertebraten stellen das spezialisierte Bindegewebe der zentralen und peripheren Nervensysteme dar. Zu wichtigen Gliazellen gehören Schwann-Zellen, welche Myelinscheiden um die Axone von Neuronen herum bereitstellen, wodurch einzelne Nervenfasern gebildet werden. Schwann-Zellen ergeben eine Scheidenwirkung durch Ausbilden von konzentrischen Membranschichten um benachbarte Neuronenaxone herum, die sie umwinden, während sie sich um die Axone herum entwickeln. Diese Myelinscheiden sind ein empfindliches Element von vielen Nervenfasern und eine Beschädigung der Schwann-Zellen oder eine Störung des Wachstums und der Entwicklung kann mit einer erheblichen Demyelinierung oder Nervendegeneration einhergehen, die für eine Reihe von Erkrankungen und Störungen des peripheren Nervensystems charakteristisch sind. Bei der Entwicklung des Nervensystems ist ersichtlich, dass Zellen verschiedene Faktoren zum Regeln ihrer Teilung und ihres Wachstums benötigen, und in den letzten Jahren wurden verschiedene solche Faktoren identifiziert, darunter einige, von denen festgestellt wurde, dass sie eine Wirkung auf die Teilung oder Entwicklung von Schwann-Zellen haben.
- So beschreiben Brockes et al. unter anderem in J. Neuroscience, 4 (1984), Nr. 1, 75-83 einen Proteinwachstumsfaktor, der in Extrakten aus Rinder-Hirn- und Hypophysengewebe vorkommt, welcher glialer Wachstumsfaktor (GGF) genannt wurde. Dieser Faktor stimulierte in Kultur gehaltene Ratten-Schwann-Zellen zur Teilung gegen ein Hintergrundmedium, das zehn Prozent fötales Kälberserum enthielt. Es wurde auch beschrieben, dass der Faktor ein Molekulargewicht von 31000 aufwies und leicht dimerisierte. In Meth. Enz., 147 (1987), 217-225 beschreibt Brockes einen Schwann-Zell-basierten As say für den Faktor und unterstreicht, dass bei der Reinigung des Faktors die Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Trifluoressigsäure als Ionenpaar-Reagenz vermieden werden muss, wenn die biologische Aktivität erhalten bleiben soll.
- Der Artikel von Brockes et al., oben, in J. Neuroscience beschreibt Verfahren zum Reinigen von GGF bis zur offensichtlichen Homogenität. Kurz gesagt, umfasst ein beschriebenes Reinigungsverfahren in großem Maßstab die Extraktion der lyophilisierten Rinder-Vorderlappen und die Chromatografie des dadurch erhaltenen Materials unter Verwendung einer NaCl-Gradientenelution von CM-Cellulose. Anschließend wird eine Gelfiltration mit einer Ultrogel-Säule durchgeführt, gefolgt von einer Elution von einer Phosphocellulosesäule und schließlich einer kleinformatigen SDS-Gelelektrophorese. Alternativ wurde das CM-Cellulose-Material direkt auf eine Phosphocellulosesäule aufgetragen, Fraktionen von der Säule wurden vereinigt und durch präparative native Gelelektrophorese gereinigt, gefolgt von einer abschließenden SDS-Gelelektrophorese.
- Brockes et al. bemerken, dass in zuvor beschriebenen Gelfiltrationsexperimenten (Brockes et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 8374-8377) beobachtet wurde, dass der Hauptpeak der Wachstumsfaktoraktivität mit einem Molekulargewicht von 56000 wanderte, wogegen in dem ersten der vorstehend beschriebenen Verfahren die Aktivität überwiegend bei einem Molekulargewicht von 31000 beobachtet wurde. Es wird berichtet, dass das GGF-Dimer infolge der Gradientenelution von CM-Cellulose in diesem Verfahren weitgehend entfernt wird.
- In PNAS, 82 (1985), 3930-3934 beschreiben Benveniste et al. einen aus T-Lymphozyten gewonnenen, das gliale Wachstum verstärkenden Faktor. Dieser Faktor weist unter reduzierenden Bedingungen eine Änderung des scheinbaren Molekulargewichts auf SDS- Gelen auf.
- In Nature, 348 (1990), 257-260, beschreiben Kimura et al. einen Faktor, den sie Schwannom-Wachstumsfaktor (SDGF) nennen, der aus einem Ischiasnervenscheidentumor erhalten wurde. Die Autoren geben an, dass SDGF den Einbau von mit Tritium markiertem TdR in in Kultur gehaltene Schwann-Zellen unter Bedingungen nicht stimuliert, bei denen im Gegensatz dazu eine teilweise gereinigte Hypophysenfraktion, die GGF enthält, aktiv ist. SDGF hat ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 31000 und 35000.
- In J. Cell. Biol., 110 (1990), 1353-1360, beschreiben Davis et al. das Screening einer Reihe von Mitogen-Kandidaten. Es wurden Ratten-Schwann-Zellen verwendet, wobei die ausgewählten Kandidatensubstanzen auf ihre Fähigkeit zum Stimulieren der DNA- Synthese in den Schwann-Zellen in Gegenwart von 10% FCS (fötales Kälberserum) mit und ohne Forskolin untersucht wurden. Einer der untersuchten Faktoren war die GGF- Carboxymethylcellulose-Fraktion (GGF-CM), welche in Gegenwart von FCS mit und ohne Forskolin mitogen war. Die Arbeit zeigte, dass in Gegenwart von Forskolin unter anderem der Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) ein potentes Mitogen für Schwann-Zellen war, wobei zuvor angenommen wurde, dass PDGF keine Wirkung auf Schwann-Zellen ausübt.
- Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind neue gliale Wachstumsfaktoren, welche sich von bekannten Faktoren einschließlich der vorstehenden unterscheiden, wobei diese Faktoren für Schwann-Zellen gegen einen Hintergrund von fötalem Kälberplasma (FCP) mitogen sind. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung dieser Faktoren und ein verbessertes Verfahren zum Definieren der Aktivität dieser und anderer Faktoren bereit. Die therapeutische Anwendung der Faktoren ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung.
- Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen basischen Polypeptidfaktor oder Teil davon bereit, der durch Hydroxylapatit-HPLC erhältlich ist und eine die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimulierende mitogene Aktivität aufweist und, wenn er unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität nach 10 Wochen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält, wobei der basische Polypeptidfaktor ein Molekulargewicht von 30 kD bis 36 kD aufweist und von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die in Fig. 22 gezeigt ist.
- Vom Umfang der Erfindung umfasst wird ein basischer Polypeptidfaktor mit einer die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimulierenden mitogenen Aktivität, einem Molekulargewicht von ungefähr 30 kD bis ungefähr 36 kD, welcher in seiner Aminosäuresequenz eine beliebige oder mehrere der folgenden Peptidsequenzen einschließt:
- Die Erfindung stellt auch einen basischen Polypeptidfaktor oder Teil davon bereit, der durch Hydroxylapatit-HPLC erhältlich ist und die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimuliert und, wenn er unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität nach 10 Wochen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält, wobei der basische Polypeptidfaktor ein Molekulargewicht von 55 kD bis 63 kD aufweist und von einer DNA-Sequenz, wie sie in einer der Fig. 28a, 28b oder 28c gezeigt ist; oder von der DNA-Sequenz, die durch die Nukleotide 281-557 der in Fig. 28a gezeigten Sequenz wiedergegeben wird, kodiert wird.
- Vom Umfang der Erfindung umfasst wird ein basischer Polypeptidfaktor mit einer die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimulierenden mitogenen Aktivität, einem Molekulargewicht von ungefähr 55 kD bis ungefähr 63 kD, welcher in seiner Aminosäuresequenz eine beliebige oder mehrere der folgenden Peptidsequenzen einschließt
- Die vorstehend angegebenen Peptidsequenzen, 12, die von dem Polypeptidfaktor mit dem kleineren Molekulargewicht herrühren, und 9, die von dem Polypeptidfaktor mit dem größeren Molekulargewicht herrühren, können unter anderem als Sondenausgangsmaterialien für Polypeptidfaktoren der Erfindung, zum Untersuchen, Isolieren oder Herstellen solcher Faktoren (oder entsprechender Gensequenzen) aus einer Reihe verschiedener Arten oder zum Herstellen solcher Faktoren durch Rekombinationstechnologien und bei der Erzeugung entsprechender Antikörper durch herkömmliche Technologien, vorzugsweise monoklonaler Antikörper brauchbar sein, welche ihrerseits nützliche Untersuchungswerkzeuge in Bezug auf die vorliegenden Faktoren sind und möglicherweise Arzneimittel sind.
- Die Verfügbarkeit von kurzen Peptiden aus den hoch gereinigten Faktoren der Erfindung hat es möglich gemacht (wie man später hier sieht), dass weitere Sequenzen bestimmt werden.
- So umfasst die Erfindung außerdem einen Polypeptidfaktor mit mitogener Aktivität auf Gliazellen, der eine Aminosäuresequenz einschließt, die kodiert wird von:
- (a) einer DNA-Sequenz, die in einer der Fig. 28a, 28b oder 28c gezeigt ist;
- (b) einer DNA-Sequenz, die in Fig. 22 gezeigt ist;
- (c) der DNA-Sequenz, die durch die Nukleotide 281-557 der Sequenz, die in Fig. 28a gezeigt ist, wiedergegeben wird; oder
- (d) einer DNA-Sequenz, die an eine beliebige der DMA-Sequenzen gemäß (a),
- (b) oder (c) hybridisierbar ist.
- Wenngleich die vorliegende Erfindung nicht auf einen bestimmten Satz von Hybridisierungsbedingungen beschränkt ist, ergibt das folgende Protokoll eine allgemeine Anleitung, welche, falls dies gewünscht wird, befolgt werden kann:
- So können DNA-Sonden bis zu einer hohen spezifischen Aktivität (ungefähr 10&sup8; bis 10&sup9; ³²P.dmp/ug) durch Nick-Translation oder durch PCR-Reaktionen gemäß Schowalter und Sourer (Anal. Biochem., 177. 90-94,1989) markiert werden und durch Entsalzen auf G-150 Sephadex-Säulen gereinigt werden. Die Sonden können denaturiert werden (10 Minuten in siedendem Wasser, gefolgt von Eintauchen in Eiswasser), anschließend zu Hybridisierungslösungen aus 80% Puffer B (2 g Polyvinylpyrrolidin, 2 g Ficoll-400, 2 g Rinderserumalbumin, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 58 g NaCl, 1 g Natriumpyrophosphat, 10 g Natriumdodecylsulfat, 950 ml HzO), enthaltend 10% Dextransulfat, mit 10&sup6; dpm ³²P pro ml zugegeben werden und über Nacht (sagen wir 16 Stunden) bei 60ºC inkubiert werden. Die Filter können dann bei 60ºC gewaschen werden, zuerst 15 Minuten in Puffer, gefolgt von drei 20-Minuten-Waschungen in 2 · SSC, 0,1% SDS, und anschließend einer 20 Minuten langen Waschung in 1 · SSC, 0,1% SDS.
- In anderer Hinsicht umfassen die Polypeptide der Erfindung:
- (a) einen basischen Polypeptidfaktor, welcher, wenn er aus Rinderhypophysenmaterial erhalten wird, ein beobachtetes Molekulargewicht, unter reduzierenden Bedingungen oder auch nicht, von ungefähr 30 kD bis ungefähr 36 kD bei einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtstandards aufweist:
- Lysozym (Hühnereiweiß) 14400
- Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 21500
- Carboanhydrase (vom Rind) 31000
- Ovalbumin (Hühnereiweiß) 45000
- Rinderserumalbumin 66200
- Phosphorylase B (Kaninchenmuskel) 97400;
- wobei der Faktor eine die Teilung von Ratten-Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimulierende mitogene Aktivität aufweist und, wenn er unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität nach 10 Wochen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält; und
- (b) einen basischen Polypeptidfaktor, welcher, wenn er aus Rinderhypophysenmaterial erhalten wird, ein beobachtetes Molekulargewicht, unter nichtreduzierenden Bedingungen, von ungefähr 55 kD bis ungefähr 63 kD bei einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtstandards aufweist:
- Lysozym (Hühnereiweiß) 14400
- Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 21500
- Carboanhydrase (vom Rind) 31000
- Ovalbumin (Hühnereiweiß) 45000
- Rinderserumalbumin 66200
- Phosphorylase B (Kaninchenmuskel) 97400;
- wobei dieser Faktor eine die Teilung von Ratten-Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem Kälberplasma stimulierende mitogene Aktivität aufweist und, wenn er unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität nach 4 Tagen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält.
- Nur aus Gründen der Bequemlichkeit der Beschreibung werden die Faktoren dieser Erfindung mit niedrigerem Molekulargewicht und höherem Molekulargewicht nachstehend als "GGF-I" bzw. "GGF-II" bezeichnet.
- Es wird darauf hingewiesen, dass die angegebenen Grenzen des Molekulargewichtsbereichs nicht genau sind, sondern einer leichten Variation unterliegen, die unter anderem von dem Ausgangsmaterial des jeweiligen Polypeptidfaktors abhängt. Eine Variation von sagen wir ungefähr 10% würde beispielsweise für Material aus einem anderen Ausgangsmaterial nicht unmöglich sein.
- Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist eine isolierte DNA mit einer Sequenz, die für ein Polypeptid mit einer mitogenen Aktivität auf Gliazellen kodiert und umfasst:
- (a) eine DNA-Sequenz, die in einer der Fig. 28a, 28b oder 28c gezeigt ist;
- (b) eine DNA-Sequenz, die in Fig. 22 gezeigt ist;
- (c) die DNA-Sequenz, die durch die Nukleotide 281-557 der Sequenz, die in Fig. 28a gezeigt ist, wiedergegeben wird; oder
- (d) eine DNA-Sequenz, die an eine beliebige der DNA-Sequenzen gemäß (a), (b) oder (c) hybridisierbar ist.
- Die Erfindung umfasst beliebige Modifizierungen oder Äquivalente der vorstehenden zwei Polypeptidfaktoren, welche keine signifikant verringerte Aktivität aufweisen. Zum Beispiel sind Modifizierungen umfasst, bei denen der Aminosäuregehalt oder die Sequenz verändert ist, ohne die Aktivität im Wesentlichen nachteilig zu beeinflussen. Beispielsweise sind in EP-A-109748 Muteine von nativen Proteinen beschrieben, in welchen die Möglichkeit einer unerwünschten -S-S- -Bindung durch Ersetzen jedes Cysteins in der nativen Sequenz, das nicht für die biologische Aktivität erforderlich ist, durch eine neutrale Aminosäure vermieden wird. Die Angaben zur Wirkung und Verwendung, die hier enthalten sind, sollen deshalb entsprechend aufgefasst werden, wobei solche Verwendungen und Wirkungen, die modifizierte oder äquivalente Faktoren wie vorstehend angegeben einsetzen, Teil der Erfindung sind.
- Die neuen Sequenzen der Erfindung eröffnen die Vorteile der Rekombinationstechnologie. Die Erfindung umfasst somit auch die folgenden Aspekte:
- (a) ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz wie vorstehend definiert und in funktioneller Anordnung mit dem Leseraster in einem Vektor unter der Kontrolle einer Kontrollsequenz, welche die Expression dieser Sequenz in ausgewählten Wirtszellen nach der Transformation dieser Zellen durch das Konstrukt ermöglicht (vorzugsweise umfasst diese Kontrollsequenz einen regulierbaren Promotor, z. B. Trp) - es versteht sich, dass die Auswahl eines Promotors und der regulatorischen Sequenzen (sofern vorhanden) von Fachleuten auf dem Gebiet vorgenommen werden kann;
- (b) Wirtszellen, die durch den Einbau eines wie in (a) unmittelbar vorstehend definierten Konstrukts modifiziert sind, so dass die DNA-Sequenz in den Wirtszellen exprimiert werden kann - die Wahl des Wirts ist nicht von entscheidender Bedeutung und die ausgewählten Zellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein und können genetisch modifiziert sein, um das Konstrukt durch im Fachgebiet bekannte Verfahren einzubauen; und
- (c) ein Verfahren zum Herstellen eines für Gliazellen mitogenen Faktors, wie er vorstehend definiert ist, umfassend das Kultivieren der modifizierten Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression dieser DNA-Sequenz ermöglichen, wobei die Bedingungen für eine beliebige bestimmte Ausführungsform von Fachleuten auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnologie leicht bestimmt werden können. Gliazellen-Mitogene, die durch diese Mittel hergestellt sind, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
- Keiner der in dem Stand der Technik beschriebenen Faktoren weist die Kombination von Eigenschaften auf, welche die vorliegenden neuen Polypeptidfaktoren besitzen.
- Wie angegeben setzt der Schwann-Zellen-Assay, der zum Teil verwendet wird, um die vorliegenden Faktoren zu charakterisieren, einen Hintergrund von fötalem Kälberplasma ein. In allen anderen Hinsichten kann der Assay der gleiche sein wie der von Brockes et al. in Meth. Enz., oben, beschriebene Assay, wobei aber 10% FCP 10% FCS ersetzen. Dieser Unterschied der Assaymethode ist bedeutsam, da die Abwesenheit von Plättchen-Faktoren in fötalem Kälberplasma (im Gegensatz zu Serum) eine strengere Definition der Aktivität auf Schwann-Zellen durch Eliminieren der potentiellen Störeffekte von einigen anderen Faktoren ermöglicht.
- Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, wie es vorstehend definiert ist, umfassend das Extrahieren von Vertebratenhirnmaterial, gegebenenfalls Hypophysenmaterial, z. B. Rinderhypophyse, zum Erhalten von Protein, das Unterziehen des resultierenden Extrakts einer chromatografischen Reinigung umfassend Hydroxylapatit-HPLC, und danach einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese und das Sammeln der Fraktion davon, die ein beobachtetes Molekulargewicht von ungefähr 30 kD bis 36 kD aufweist, und/oder der Fraktion, die ein beobachtetes Molekulargewicht von ungefähr 55 kD bis 63 kD aufweist, wenn sie jeweils einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtstandards unterzogen wird:
- Lysozym (Hühnereiweiß) 14400
- Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 21500
- Carboanhydrase (vom Rind) 31000
- Ovalbumin (Hühnereiweiß) 45000
- Rinderserumalbumin 66200
- Phosphorylase B (Kaninchenmuskel) 97400;
- und zwar im Fall der vorstehend erwähnten Fraktion mit kleinem Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen oder auch nicht und im Fall der vorstehend erwähnten Fraktion mit größerem Molekulargewicht unter nichtreduzierenden Bedingungen, wobei die Fraktion(en) eine die Teilung von Ratten-Schwann-Zellen stimulierende Aktivität gegen einen Hintergrund von fötalem Kälberplasma aufweist bzw. aufweisen.
- Vorzugsweise umfasst die chromatografische Reinigung einen Schritt, bei dem das ursprünglich aus Hirnmaterial extrahierte Protein zunächst einer Carboxymethylcellulosechromatografie unterzogen wird, und/oder auch umfassend, dass nach einer Hydroxylapatit-HPLC eine Kationenaustauschchromatografie, Gelfiltration, und/oder Umkehrphasen-HPLC vor der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eingesetzt wird. Auf jeder Stufe in dem Verfahren kann die Aktivität bestimmt werden, wobei der Einbau von radioaktivem Ioddesoxyuridin in Schwann-Zellen als Maß in einem Assay verwendet wird, der allgemein von Brockes in Meth. Enz., oben, beschrieben ist, aber durch Ersetzen von 10% FCS durch 10% FCP modifiziert wird. Wie bereits angemerkt wurde, ist ein solcher Assay ein eigenständiger Aspekt der Erfindung, wenn er allgemein auf den Assay einer beliebigen Substanz im Hinblick auf mitogene Wirkungen auf ZNS- oder PNS- Zellen, z. B. Schwann-Zellen angewandt wird.
- Ein Assay der mitogenen Aktivität auf Gliazellen, in welchem ein Hintergrund von fötalem Kälberplasma eingesetzt werden kann, gegen den die DNA-Synthese in Gliazellen getestet werden soll, die (falls dies der Fall ist) durch eine getestete Substanz stimuliert wird.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische oder tiermedizinische Formulierung umfassend einen beliebigen Faktor, wie er vorstehend definiert ist, formuliert für eine pharmazeutische oder tiermedizinische Verwendung, gegebenenfalls zusammen mit einem annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Excipiens und/oder in Einheitsdosisform. Bei der Verwendung der Faktoren der Erfindung können herkömmliche pharmazeutische oder tiermedizinische Praktiken eingesetzt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen bereit zu stellen.
- So können die Formulierungen dieser Erfindung für eine parenterale Verabreichung, z. B. eine intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, ophthalmische, intraventrikuläre, intrakranielle, intrakapsuläre, intraspinale, intrazisternale, intraperitoneale, topische, intranasale, als Aerosol oder durch Skarifikation erfolgende und auch orale, buccale, rektale oder vaginale Verabreichung angewandt werden.
- Parenterale Formulierungen können in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen vorliegen; für eine orale Verabreichung können die Formulierungen in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen; und für intranasale Formulierungen können sie in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen vorliegen.
- Verfahren zum Herstellen von Formulierungen, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, findet man z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences". Formulierungen für eine parenterale Verabreichung können z. B. als Excipientien steriles Wasser oder Salzlösung, Polyalkylenglycole wie etwa Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs oder hydrierte Naphthaline enthalten. Biokompatible, biologisch abbaubare Lactidpolymere, Lactid/Glycolid-Copolymere oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere können verwendet werden, um die Freigabe der vorliegenden Faktoren zu steuern. Weitere potentiell brauchbare parenterale Verabreichungssysteme für die Faktoren umfassen Ethylen-Vinylacetat-Copolymerteilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen zur Inhalierung können als Excipientien z. B. Lactose enthalten oder können wässrige Lösungen sein, die z. B. Polyoxyethylen-9- laurylether, Glycocholat und Desoxycholat enthalten, oder können ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen oder als Gell, das intranasal aufgetragen werden soll, sein. Formulierungen für eine parenterale Verabreichung können auch Glycocholat für eine buccale Verabreichung, Methoxysalicylat für eine rektale Verabreichung oder Citronensäure für eine vaginale Verabreichung enthalten.
- Die folgenden Faktoren können als die einzigen Wirkstoffe verwendet werden oder können in Kombination mit anderen Wirkstoffen, z. B. anderen Wachstumsfaktoren, welche das Überleben von Neuronen bei neurologischen Erkrankungen erleichtern könnten, oder Peptidase- oder Protease-Inhibitoren verwendet werden.
- Die Konzentration der vorliegenden Faktoren in den Formulierungen der Erfindung variiert in Abhängigkeit von einer Reihe von Punkten, wozu die zu verabreichende Dosis und der Verabreichungsweg gehören.
- Allgemein können die Faktoren dieser Erfindung in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung, die ungefähr 0,1 bis 10% Gew./Vol. Verbindung enthält, für eine parenterale Verabreichung bereitgestellt werden. Allgemeine Dosisbereiche betragen ungefähr 1 ug/kg bis 1 g/kg Körpergewicht pro Tag; ein bevorzugter Dosisbereich beträgt ungefähr 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte Dosierung, die verabreicht werden soll, hängt wahrscheinlich von der Art und dem Ausmaß des Fortschreitens des pathophysiologischen Zustands, der angegangen werden soll, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, der Aufbereitung der Formulierung und dem Verabreichungsweg ab.
- Wie vorstehend angegeben ist, werden Schwann-Zellen (die Gliazellen des peripheren Nervensystems) in Gegenwart der Faktoren der Erfindung zur Teilung stimuliert. Schwann-Zellen des peripheren Nervensystems sind an der Hervorbringung der Myelinscheide um einzelne Nervenfasern herum beteiligt, welche für die korrekte Weiterleitung von elektrischen Impulsen zu Muskeln und von sensorischen Rezeptoren wichtig ist.
- Es gibt eine Vielzahl von peripheren Neuropathien, bei denen Schwann-Zellen und Nervenfasern entweder primär oder sekundär geschädigt sind. Es gibt zahlreiche Neuropathien sowohl von sensorischen als auch motorischen Fasern (Adams und Victor, Principles of Neurology). Die wichtigsten dieser Neuropathien sind wahrscheinlich die Neu ropathien, die mit Diabetes verbunden sind, das Landry-Guillain-Barre-Syndrom, Neuropathien, die von Karzinomen verursacht werden und Neuropathien, die von toxischen Agenzien verursacht werden, von denen einige zum Behandeln von Karzinomen verwendet werden.
- Die Erfindung fasst jedoch die Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen ins Auge, bei denen eine Schädigung des Nervensystems durch irgendeine grundlegende Ursache, z. B. eine Infektion oder eine Verletzung herbeigeführt wurde. Folglich können außer zur Verwendung der vorliegenden Faktoren bei der Behandlung von Störungen oder Krankheiten des Nervensystems, bei denen eine Demyelinierung oder ein Verlust von Schwann-Zellen vorliegt, solche glialen Wachstumsfaktoren bei der Behandlung von Störungen des Nervensystems nützlich sein, welche durch eine Schädigung der peripheren Nerven verursacht wurden. Nach einer Schädigung der peripheren Nerven wird der Regenerationsprozess durch das Wachstum oder die Wiederherstellung von Schwann-Zellen eingeleitet, gefolgt von dem Wachstum der Nervenfaser zurück zu ihrem Ziel. Durch Beschleunigen der Teilung von Schwann-Zellen könnte man den Regenerationsprozess nach einer Schädigung fördern.
- Außerdem gibt es eine Reihe von Tumoren von Gliazellen, von denen wahrscheinlich die Recklinghausen-Krankheit am häufigsten ist, welche ein fleckenartiger kleiner Tumor ist, der durch das übermäßige Wachstum von Gliazellen erzeugt wird. Es wurde auch festgestellt, dass eine Aktivität, die der von GGF sehr ähnelt, in einigen Schwann-Zellen- Tumoren gefunden werden kann, und deshalb ein Inhibitor der Wirkung der vorliegenden Faktoren auf ihre Rezeptoren eine Therapie für die gliale Tumoren ergibt. Die Erfindung schließt somit speziell ein Verfahren für die Prophylaxe oder Behandlung eines glialen Tumors ein, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Substanz umfasst, welche die Bindung eines wie vorstehend definierten Faktors an einen Rezeptor dafür hemmt.
- Im Allgemeinen schließt die Erfindung die Verwendung der vorliegenden Polypeptidfaktoren bei der Prophylaxe oder Behandlung eines beliebigen pathophysiologischen Zustands des Nervensystems ein, an welchem ein für den Faktor empfindlicher oder auf den Faktor reagierender Zelltypus beteiligt ist.
- Die Polypeptidfaktoren der Erfindung können auch als Immunogene zum Herstellen von Antikörpern wie etwa monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Standardmethoden verwendet werden.
- Entsprechend stellt die Erfindung auch einen Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen Polypeptide bereit und solche Antikörper sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese Antikörper können ihrerseits für diagnostische Zwecke verwendet werden. So können Zustände, die möglicherweise mit abnormen Spiegeln des Faktors verbunden sind, unter Verwendung solcher Antikörper verfolgt werden. In vitro-Methoden können verwendet werden, welche Assays an isolierten Proben unter Verwendung von Standardverfahren einsetzen. Es können auch bildgebende Verfahren eingesetzt werden, bei denen die Antikörper z. B. mit radioaktiven Isotopen markiert werden, welche außerhalb des Körpers bildlich dargestellt werden können, wobei Methoden verwendet werden, die beispielsweise auf dem Gebiet der bildgebenden Darstellung von Tumoren eingesetzt werden.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids wie es vorstehend hier beschrieben wurde, oder einer entsprechenden Nukleinsäuresequenz, zum Untersuchen, Isolieren oder Herstellen einer Gliazellen-Mitogens oder einer diesem entsprechenden Gensequenz oder zum Erzeugen eines entsprechenden Antikörpers.
- Die Erfindung umfasst auch die allgemeine Verwendung der vorliegenden Faktoren als Gliazellen-Mitogene in vivo oder in vitro und die Faktoren für eine solche Verwendung. Eine spezifische Ausführungsform ist folglich ein Verfahren zum Erzeugen einer mitogenen Wirkung auf Gliazellen in einem Vertebraten durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Faktors der Erfindung. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein solches Verfahren bei der Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.
- Ein weiterer allgemeiner Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Faktors der Erfindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Nervenkrankheit oder nervösen Störung oder für eine neurale Regeneration oder Reparatur.
- Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist die Verwendung der Faktoren der Erfindung in kompetitiven Assays zum Identifizieren oder Quantifizieren von Molekülen mit Rezeptorbindungseigenschaften, die denen der Polypeptide entsprechen. Die Polypeptide können markiert sein, gegebenenfalls mit einem radioaktiven Isotop. Ein kompetitiver Assay kann sowohl Antagonisten als auch Agonisten des relevanten Rezeptors identifizieren.
- In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines jeden der Faktoren der Erfindung in einem Affinitätsisolierungsverfahren, gegebenenfalls einer Affinitätschromatografie, zur Abtrennung eines jeweiligen entsprechenden Rezeptors bereit. Solche Verfahren zur Isolierung von Rezeptoren, die bestimmten Proteinen entsprechen, sind im Fachgebiet bekannt, und eine Reihe von Methoden steht zur Verfügung und kann auf die Faktoren der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Zum Beispiel wird im Hinblick auf IL-6 und IFN-Gamma der Leser auf Novick, D. et al., J. Chromatogr.; 1990, 27. Juni; 510. 331-7 verwiesen, im Hinblick auf Gonadotropin-freisetzendes Hormon wird Hazum, E., J. Chromatogr.; 1990, 27. Juni; 510. 233-8 erwähnt, im Hinblick aufG-CSF wird Fukunaga, R., et al. J. Biol. Chem.; 1990, 15. August; 265(23), 14008- 15 erwähnt, im Hinblick auf vasoaktives intestinales Peptid wird Couvineau, A., et al., J. Biol. Chem.; 1990, 5. August; 265(22), 13386-90 erwähnt, im Hinblick auf IL-2 wird Smart, J. E., et äl., J. Invest. Dermatol.; 1990, Juni; 94 (6. Erg.), 158S-163S erwähnt, und im Hinblick auf menschliches IFN-Gamma wird Stefanos, S., etal., J. Interferon Res.; 1989, Dec., 9(6), 719-30 erwähnt.
- Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung nicht beschränken, sondern sie zweckmäßig erläutern und spezielle Anleitung für wirksame präparative Methoden ergeben.
- Wie man aus nachstehendem Beispiel 3 ersieht, weisen die vorliegenden Faktoren eine mitogene Aktivität auf eine Reihe von Zelltypen auf. Die Aktivität in Bezug auf Fibroblasten deutet ein Wundreparaturvermögen an und die Erfindung umfasst diese Verwendung. Die vorstehenden allgemeinen Angaben der Erfindung in Bezug auf Formulierungen und/oder Arzneimittel und ihre Herstellung sollten eindeutig so verstanden werden, dass sie zweckdienliche Produkte und Verwendungen umfassen. Dies ist eindeutig eine vernünftige Erwartung für die vorliegende Erfindung mit Bezug unter anderem auf Berichte über ähnliche Aktivitäten für FGFs. Es kann z. B. Sporn et al., "Peptide Growth Factors and their Receptors I" Seite 396 (Baird und Bohlen) in dem Abschnitt mit der Überschrift "FGFs in Wound Healing and Tissue Repair" erwähnt werden.
- In den beigefügten Abbildungen:
- beziehen sich die Fig. 1 bis 8 auf nachstehendes Beispiel 1 und werden nachstehend kurz beschrieben:
- Fig. 1 ist das Profil für ein Produkt von einer Carboxymethylcellulose-Chromatografie;
- Fig. 2 ist das Profil für ein Produkt von einer Hydroxylapatit-HPLC;
- Fig. 3 ist das Profil für ein Produkt von einer Mono-S-FPLC;
- Fig. 4 ist das Profil für ein Produkt von einer Gelfiltrations-FPLC;
- Fig. 5 und 6 sind die Profile für die zwei teilweise gereinigten Polypeptidprodukte von einer Umkehrphasen-HPLC; und
- Fig. 7 und 8 sind Dosis-Response-Kurven für die GGF-I- und GGF-II-Fraktionen von einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines fötalen Kälberserum- oder eines fötalen Kälberplasma-Hintergrunds;
- Fig. 9 bis 12 zeigen Peptide, die von GGF-I und GGF-II abgeleitet sind (siehe nachstehendes Beispiel 2), wobei die Fig. 10 und 12 speziell neue Sequenzen zeigen:
- In Fig. 10, Tafel A, sind die Sequenzen von GGF-I-Peptiden gezeigt, die verwendet werden, um degenerierte Oligonukleotidsonden und degenerierte PCR-Primer zu konstruieren. Einige dieser Sequenzen in Tafel A wurden auch zum Konstruieren von synthetischen Peptiden verwendet. Tafel B zeigt die neuen Peptide, welche für die Konstruktion von degenerierten Sonden oder degenerierten PCR-Primern zu kurz waren (weniger als 6 Aminosäuren);
- In Fig. 12, Tafel A, sind die Sequenzen von GGF-II-Peptiden gezeigt, die zum Konstruieren von degenerierten Oligonukleotidsonden und degenerierten PCR-Primern verwendet wurden. Einige dieser Sequenzen in Tafel A wurden auch zum Konstruieren von synthetischen Peptiden verwendet. Tafel B zeigt die neuen Peptide, welche für die Konstruktion von degenerierten Sonden oder degenerierten PCR-Primern zu kurz waren (weniger als 6 Aminosäuren);
- Die Fig. 13 bis 20 beziehen sich auf nachstehendes Beispiel 3 und zeigen verschiedene Aspekte der mitogenen Aktivität von Faktoren der Erfindung;
- Die Fig. 21 bis 28(a, b und c) beziehen sich auf nachstehendes Beispiel 4 und werden nachstehend kurz beschrieben:
- Fig. 21 führt die degenerierten Oligonukleotidsonden auf, welche aus den neuen Peptidsequenzen, die in Fig. 10, Tafel A, und Fig. 12, Tafel A, aufgeführt sind, konstruiert wurden;
- Fig. 22 zeigt einen Abschnitt der mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gensequenz von dem rekombinanten Rindergenomphagen GGF2BG1, welche die Bindungsstelle der degenerierten Oligonukleotidsonden 609 und 650 enthält (siehe Fig. 21). Gezeigt sind der kodierende Strang der DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz in dem dritten Leseraster. Die Sequenz von Peptid 12 von Faktor 2 (fett) ist Teil eines 66 Aminosäuren umfassenden offenen Leserasters (Nukleotide 75-272);
- Fig. 23 führt die degenerierten PCR-Primer (Tafel A) und einzigartigen PCR-Primer (Tafel B) auf, die in Experimenten zum Isolieren von Segmenten der kodierenden Sequenzen von Rinder-GGF-II verwendet wurden, die in RNA aus dem Hypophysenhinterlappen vorhanden sind;
- Fig. 24 fasst die neun verschiedenen benachbarten Rinder-GGF-II cDNA-Strukturen und Sequenzen zusammen, welche in PCR-Amplifikationsexperimenten unter Verwendung der Liste von Primern in Fig. 7, Tafeln A und B, an RNA aus dem Hypophysenhinterlappen erhalten wurden. Die obere Linie der Figur zeigt eine schematische Darstellung der Exonsequenzen, welche zu den cDNA-Strukturen beitragen, welche charakterisiert wurden;
- Fig. 25 ist eine physikalische Karte des rekombinanten Rinderphagen von GGF2BG1. Das Rinderfragment hat eine Länge von ungefähr 20 kb und enthält zwei Exons (fett) des Rinder-GGF-II-Gens. Restriktionsstellen für die Enzyme XbaI, Spe I, Ndel, EcoRI, KpnI und SstI wurden auf dieser physikalischen Karte angeordnet. Schraffierte Abschnitte entsprechen Fragmenten, die zur Sequenzierung subkloniert wurden;
- Fig. 26 zeigt schematisch die Struktur von drei alternativen Genprodukten des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens. Exons sind in der Reihenfolge ihrer Entdeckung als A bis E aufgeführt. Die alternativen Spieissmuster 1, 2 und 3 erzeugen drei überlappende abgeleitete Proteinstrukturen (GGF2BPP1, 2 und 3), welche in den verschiedenen Fig. 28 dargestellt sind;
- Fig. 27 vergleicht die GGF-I- und GGF-II-Sequenzen, die in den abgeleiteten Proteinsequenzen, die in Fig. 28a, 28b und 28c gezeigt sind, identifiziert wurden, mit den neuen Peptidsequenzen, die in den Fig. 10 und 12 aufgeführt sind. Die Figur zeigt, dass sechs der neun neuen GGF-II-Peptidsequenzen in diesen abgeleiteten Proteinsequenzen wiedergegeben sind. Zwei Peptidsequenzen, die GGF-I-Sequenzen entsprechen, sind ebenfalls vorhanden;
- Fig. 28a zeigt die DNA-Sequenz des kodierenden Strangs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der cDNA, die aus dem Spleissmuster Nr. 1 erhalten wird, das in Fig. 26 gezeigt ist. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens kodiert ein Protein mit einer Länge von 207 Aminosäuren. Die fett gedruckten Peptide waren die Peptide, die aus den in Fig. 10 und 12 angegebenen Listen identifiziert wurden. Potentielle Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA);
- Fig. 28b zeigt die DNA-Sequenz des kodierenden Strangs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der cDNA, die aus dem Spieissmuster Nr. 2 erhalten werden, das in Fig. 26 gezeigt ist. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens kodiert ein Protein mit einer Länge von 264 Aminosäuren. Die fett gedruckten Peptide wa ren die Peptide, die aus den in Fig. 10 und 12 angegebenen Listen identifiziert wurden. Potentielle Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA);
- Fig. 28c zeigt die DNA-Sequenz des kodierenden Strangs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der cDNA, die von dem Spieissmuster Nr. 3 erhalten werden, das in Fig. 26 gezeigt ist. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens kodiert ein Protein mit einer Länge von 258 Aminosäuren. Die fettgedruckten Peptide waren die Peptide, die aus den in den Fig. 10 und 12 angegebenen Listen identifiziert wurden. Potentielle Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA); und
- Die in den Fig. 28a, 28b und 28c gezeigten DNA-Sequenzen sind selbst weitere Aspekte dieser Erfindung; und die Erfindung umfasst ferner Polypeptide, die von diesen Sequenzen kodiert werden;
- Die Fig. 29 bezieht sich auf nachstehendes Beispiel 6 und zeigt ein Autoradiogramm einer Kreuzhybridisierungsanalyse von mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gensequenzen gegen eine Reihe von Säuger-DNAs auf einem Southernblot. Der Filter enthält Bahnen von mit Eco RI-verdauter DNA (5 Mikrogramm pro Bahn) von den in der Figur aufgeführten Arten. Die Sonde weist eine einzige starke Bande in jeder DNA-Probe nach, darunter ein vier kb-Fragment in der Rinder-DNA, wie es von der physikalischen Karte in Fig. 25 vorhergesehen wird. Es werden auch Banden mit relativ geringer Intensität beobachtet, welche verwandte DNA-Sequenzen wiedergeben könnten. Die stark hybridisierende Bande von jeder der anderen Säuger-DNA-Proben gibt vermutlich das GGF-II- Homologe von diesen Arten wieder.
- Im nachstehenden Beispiel 1 wurden, sofern nichts arideres angegeben ist, alle Arbeitsgänge bei 4ºC durchgeführt und mit Bezug auf die Fig. 1 bis 6 wurde die Aktivität auf jeder Stufe unter Verwendung der Methoden von Brockes (Meth. Enz., oben) mit den folgenden Modifizierungen bestimmt. So wurde beim Herstellen von Schwann-Zellen 5 uM Forskolin zusätzlich zu DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium), FCS und GGF zugegeben. Die in dem Assay verwendeten Zellen waren fibroblastenfreie Schwann- Zellen mit einer Passagenzahl von weniger als 10 und diese Zellen wurden aus den Kolben mit Trypsin entfernt und in Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden in einer Menge von 3,3 tausend Zellen pro Mikrovertiefung ausplattiert. [¹²&sup5;I]IUdR wurde für die letzten 24 Stunden nach der Zugabe der Testlösung zugegeben. Der Hintergrundeinbau (unstimulierte Einbau) in jeden Assay betrug weniger als 100 cpm und der maximale Einbau betrug das 20- bis 200-fache über dem Hintergrund je nach der Schwann-Zellen-Charge und der Passagenzahl.
- Im Fall der GGF-I- und GGF-II-Fraktionen von einer Umkehrphasen-HPLC, wie es nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden auch zwei Dosis-Response-Kurven für jeden Faktor angefertigt, wobei genau das vorstehende Verfahren für eine der Kurven für jeden Faktor verwendet wurde und das vorstehende Verfahren, bei dem das Assay-Verfahren nur durch Ersetzen von fötalem Kälberserum durch fötales Kälberplasma modifiziert wurde, verwendet wurde, um die andere Kurve für jeden Faktor zu erhalten. Die Ergebnisse sind in den Fig. 7 und 8 angegeben.
- 4000 gefrorene ganze Rinderhypophysen (ca. 12 kg) wurden über Nacht aufgetaut, kurz mit Wasser gewaschen und anschließend in einem gleichen Volumen von 0,15 M Ammoniumsulfat chargenweise in einem Waring Blender homogenisiert. Das Homogenat wurde mit 1,0 M HCl auf pH 4,5 gebracht und bei 4900 g 80 Minuten lang zentrifugiert. Jegliches Fettmaterial in dem Überstand wurde durch Leiten des Überstands durch Glaswolle entfernt. Nachdem der pH des Überstands unter Verwendung von 1,0 M NaOH auf 6,5 gebracht worden war, wurde festes Ammoniumsulfat zugegeben, um eine 36% gesättigte Lösung zu ergeben. Nach mehreren Stunden Rühren wurde die Suspension bei 4900 g 80 Minuten lang zentrifugiert und (JET Niederschlag verworfen. Nach der Filtration durch Glaswolle wurde weiteres festes Ammoniumsulfat zu dem Überstand zugegeben, um eine 75% gesättigte Lösung zu ergeben, welche nach mehreren Stunden Rühren nochmals 80 Minuten lang bei 4900 g zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in ca. 2 l 0,1 M Natriumphosphat pH 6,0 resuspendiert und gegen 3 · 40 l des gleichen Puffers dialysiert. Nach dem Bestätigen, dass die Leitfähigkeit des Dialysats unter 20,0 m Siemens lag, wurde es auf eine Bioprocess-Säule (120 · 113 mm, Pharmacia) aufge geben, die mit Carboxymethylcellulose (CM-52, Whatman) gepackt war, und zwar mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml·min&supmin;¹. Die Säule wurde mit 2 Volumina 0,1 M Natriumphosphat pH 6,0, gefolgt von 2 Volumina 50 mM NaCl und schließlich 2 Volumina 0,2 M NaCl, beide in dem gleichen Puffer, gewaschen. Während des abschließenden Schrittes wurden 10 ml (5 Minuten) Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 73 bis einschließlich 118 wurden vereinigt, gegen die 10 Volumina von 10 mM Natriumphosphat pH 6,0 zweimal dialysiert und durch 60 Minuten lange Zentrifugation bei 100000 g geklärt.
- Hydroxylapatit-HPLC ist keine Methode, die bisher zum Isolieren von glialen Wachstumsfaktoren verwendet wurde, sie hat sich aber in dieser Erfindung als besonders wirksam erwiesen.
- Das von der vorstehenden CM-Cellulose-Chromatografie erhaltene Material wurde durch ein 0,22 um Filter (Nalgene) filtriert und bei Raumtemperatur auf eine Hydroxylapatit-Hochleistungssäule (50 · 50 mm, Biorad), die mit einer Vorsäule (15 · 25 mm, Biorad) ausgestattet war und mit 10 mM Kaliumphosphat pH 6,0 äquilibriert worden war, aufgegeben. Eine Elution bei Raumtemperatur erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml·Minute&supmin;¹, wobei der folgende programmierte lineare Gradient verwendet wurde:
- 6,0 ml (3 Minuten) Fraktionen wurden während der Gradientenelution gesammelt. Die Fraktionen 39-45 wurden vereinigt und gegen 10 Volumina von 50 mM Natriumphosphat pH 6,0 dialysiert.
- Die Mono S-FPLC ermöglichte die Herstellung eines konzentrierten Materials für eine nachfolgende Gelfiltration.
- Jegliches partikuläres Material in dem vereinigten Material von der Hydroxylapatit-Säule wurde durch eine klärende Zentrifugation bei 100000 g während 60 Minuten entfernt, bevor es auf eine präparative HR 10/10 Mono S-Kationenaustauschersäule (100 · 10 mm, Pharmacia) aufgegeben wurde, welche dann zu 50 mM Natriumphosphat pH 6,0 bei Raumtemperatur mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml·Minute&supmin;¹ reäquilibriert wurde. Unter diesen Bedingungen wurde gebundenes Protein eluiert, wobei der folgende programmierte lineare Gradient verwendet wurde:
- 1 ml (1 Minute) Fraktionen wurden während dieses Gradientenprogramms gesammelt. Die Fraktionen 99 bis einschließlich 115 wurden vereinigt.
- Mit diesem Schritt begann die Trennung der zwei Faktoren der Erfindung vor der abschließenden Aufreinigung, wobei angereicherte Fraktionen hergestellt wurden.
- Für die Zwecke dieses Schritts wurde eine präparative Superose 12 FPLC-Säule (510 · 20 mm, Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers gepackt. Um diese Säule zu standardisieren, erfolgte eine Messung der theoretischen Bodenzahl gemäß den Anweisungen des Herstellers, welche einen Wert von 9700 theoretischen Böden ergab.
- Das von der Mono S - Säule eluierte vereinigte Material (Pool) wurde bei Raumtemperatur in 2,5 ml-Aliquots auf diese Säule in 50 mM Natriumphosphat, 0,75 NaCl pH 6,0 (zuvor durch eine C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Säule (Sep-pak, Millipore) geleitet) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml·Minute&supmin;¹ aufgegeben. 1 ml (0,5 Minuten) Fraktionen wurden von 35 Minuten, nachdem jede Probe auf die Säule aufgegeben worden war, an gesammelt. Die Fraktionen 27 bis 41 (GGF-II) und 42 bis einschließlich 57 (GGF-I) von jedem Chromatografielauf wurden vereinigt.
- (E) Umkehrphasen-HPLC
- Die GGF-I- und GGF-II-Pools von den vorstehenden Superose 12-Chromatografieläufen wurden jeweils in drei gleiche Aliquots geteilt. Jedes Aliquot wurde auf eine 08- Umkehrphasen-Säule (Aquapore RP-300 7 u C8 220 · 4,6 mm, Applied Biosystems) aufgegeben, die durch eine Vorsäulenpatrone (RP-8, 15 · 3,2 mm, Applied Biosystems) geschützt wurde und auf 40ºC mit 0,5 ml·Minute&supmin;¹ äquilibriert worden war. Das Protein wurde unter diesen Bedingungen eluiert, wobei der folgende programmierte lineare Gradient verwendet wurde:
- 200 ul (0,4 Minuten) Fraktionen wurden in siliconisierten Röhrchen (Multilube tubes, Bioquote) von 15,2 Minuten nach dem Beginn des programmierten Gradienten an gesammelt.
- In diesem Schritt wurden Protein-Molekulargewichtstandards, im niedrigen Bereich, Katalognummer 161-0304 von Bio-Rad Laboratories Limited, Watford, England eingesetzt. Die tatsächlich verwendeten Proteine und ihre Molekulargewichtstandards sind vorstehend aufgeführt worden.
- Die Fraktionen 47 bis 53 (GGF-I) und die Fraktionen 61 einschließlich 67 (GGF-II) von den Umkehrphasen-Läufen wurden einzeln vereinigt. 7 ul des vereinigten Materials wurden in einem gleichen Volumen von 0,0125 M Tris-Cl, 4% SDS, 20% Glycerin und 10% β-Mercaptoethanol für GGF-I 5 Minuten lang gekocht und auf ein 11%iges Polyacrylamid-Leammli-Gel mit einem 4%igen Sammelgel aufgegeben und bei konstanter Spannung von 50 V 16 Stunden lang laufen gelassen. Dieses Gel wurde dann fixiert und angefärbt, wobei ein Silberfärbungs-Kit (Amersham) verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen sind die Faktoren jeweils als etwas diffuse Bande bei den relativen Molekulargewichten 30000 bis 36000 Dalton (GGF-I) und 55000 bis 63000 Dalton (GGF-II), definiert durch Molekulargewichtsmarker, sichtbar. Aus der Gelfärbung geht hervor, dass es eine kleine Anzahl von anderen Proteinarten gibt, die in äquivalenten Mengen zu den GGF-I- und GGF-II-Arten in dem Material, das von den Umkehrphasen-Läufen vereinigt wurde, vorhanden sind.
- Stabilitätsdaten wurden für die vorliegenden Faktoren in Gegenwart von Trifluoressigsäure wie folgt erhalten:
- Material von der Umkehrphasen-HPLC, in Gegenwart von 0,1% TFA und Acetonitril, wurde innerhalb von 12 Stunden nach der Beendigung des Säulenlaufs und anschließend nach einer 10-wöchigen Inkubation bei 4ºC getestet. Im Anschluss an die Inkubation wies der GGF-I mindestens 50% der Aktivität des Materials auf, das direkt nach der Säule getestet wurde.
- Material von der Umkehrphasen-HPLC, in Gegenwart von 0,1% TFA und Acetonitril und bei -20ºC aufbewahrt, wurde nach dem Auftauen und einschließend nach 4 Tagen Inkubation bei 4ºC getestet. Im Anschluss an die Inkubation wies der GGF-II mindestens 50% der Aktivität des frisch aufgetauten Materials auf.
- Es versteht sich, dass die in den vorstehenden Untersuchungen verwendete Trifluoressigsäurekonzentration die in der Umkehrphasen-Chromatografie am häufigsten verwendete ist.
- Aminosäuresequenzanalysenstudien wurden unter Verwendung von hoch gereinigtem Rinderhypophysen-GGF-I und GGF-II durchgeführt. Der herkömmliche Einbuchstabencode wurde zum Beschreiben der Sequenzen verwendet. Peptide wurden durch Lysylendopeptidase- und Protease VS-Verdaue erhalten, welche an reduzierten und carboxymethylierten Proben erfolgten, wobei der Lysylendopeptidase-Verdau von GGF-II an Material durchgeführt wurde, das von der 55-65 kD-Region einer 11% SDS-PAGE eluierte (MG bezogen auf die vorstehend erwähnten Marker).
- Ingesamt 21 Peptidsequenzen (siehe Fig. 9) wurden für GGF-I erhalten, von denen 12 Peptide (siehe Fig. 10) in aktuellen Proteindatenbanken nicht vorhanden sind und deshalb einzigartige Sequenzen darstellen. Insgesamt 12 Peptidsequenzen (siehe Fig. 11) wurden für GGF-II erhalten, von denen 10 Peptide (siehe Fig. 12) in aktuellen Proteindatenbanken nicht vorhanden sind und deshalb einzigartige Sequenzen darstellen (eine Ausnahme ist Peptid GGF-II 06, welches identische Sequenzen in vielen Proteinen aufweist, welche in Anbetracht der kleinen Zahl von Resten wahrscheinlich keine Bedeutung haben). Diese neuen Sequenzen entsprechen sehr wahrscheinlich Teilen der wahren Aminosäuresequenzen von GGFs I und II.
- Besondere Aufmerksamkeit kann auf die Sequenzen von GGF-I 07 und GGF-II 12 gelenkt werden, welche eindeutig in hohem Maße verwandt sind. Die Ähnlichkeiten deuten darauf hin, dass die Sequenzen von diesen Peptiden nahezu sicher diejenigen der zu geordneten GGF-Arten sind und es höchst unwahrscheinlich ist, dass sie von verunreinigenden Proteinen herrühren.
- Außerdem ist in Peptid GGF-II 02 die Sequenz X S S vereinbar mit der Anwesenheit eines N-verknüpften Kohlenhydratbestandteils an einem Asparagin in der durch X bezeichneten Position.
- Im Allgemeinen bedeutet in den Fig. 9 und 11 X einen unbekannten Rest, der einen Sequenzierzyklus wiedergibt, bei dem eine einzelne Position nicht mit Sicherheit bestimmt werden konnte, entweder weil es mehr als ein Signal gleicher Größe in dem Zyklus gab oder weil kein Signal vorhanden war. Ein Stern bezeichnet diejenigen Peptide, wo die letzte bestimmte Aminosäure der letzten Aminosäure entspricht, die in diesem Peptid vorhanden ist. In den übrigen Peptiden war die Signalstärke nach der letzten bestimmten Aminosäure nicht ausreichend, um die Sequenzbestimmung bis zum Ende dieses Peptids fortzusetzen. Die rechte Spalte gibt die Ergebnisse einer Computerdatenbanksuche unter Verwendung der GCG-Paket-FASTA- und TFASTA-Programme zum Analysieren der NBRF- und EMBL-Sequenzdatenbanken wieder. Der Name eines Proteins in dieser Spalte bedeutet die Identität eines Teils seiner Sequenz mit der bestimmten Peptidaminosäuresequenz, wobei maximal zwei Fehlpaarungen erlaubt sind. Ein Fragezeichen bedeutet drei erlaubte Fehlpaarungen. Die verwendeten Abkürzungen sind wie folgt:
- HMG-1 High Mobility Group-Protein-1
- HMG-2 High Mobility Group-Protein-2
- LH-alpha Luteinisierendes Hormon-alpha-Untereinheit
- LH-beta Luteinisierendes Hormon-beta-Untereinheit
- Die mitogene Aktivität einer hoch gereinigten Probe, die sowohl GGFs I als auch II enthielt, wurde unter Verwendung eines quantitativen Verfahrens untersucht, welches das Untersuchender DNA-Synthese, Zellmorphologie, Zellzahl und Expression von Zellantigenen in einer einzigen Mikrokultur gestattet. Diese Methode wurde durch Modifzierung eines Verfahrens erhalten, das zuvor von Muir D et al. Analytical Biochemistry 185, 377- 382, 1990 angegeben wurde. Die hauptsächlichen Modifizierungen sind: 1) die Verwendung von nichtbeschichteten Mikrotiterplatten, 2) die Zellzahl pro Vertiefung, 3) die Verwendung von 5% fötalem Rinderplasma (FBP) anstelle von 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 4) die Dauer der Inkubation in Gegenwart von Mitogenen und Bromdesoxyuridin (BrdU), welche gleichzeitig zu den Kulturen zugegeben wurden. Außerdem wurde die Zellmonoschicht vor dem Fixieren nicht gewaschen, um den Verlust von Zellen zu vermeiden, und die Inkubationsdauer von monoklonalem Maus-anti-BrdU-Antikörper und Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (IgG)-Antikörper wurde verdoppelt, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen. Der Assay, der für Schwann-Zellen des Ischiasnervs von Ratten optimiert ist, wurde auch für verschiedene Zelllinien nach geeigneten Modifizierungen der Zellkulturbedingungen verwendet.
- Am Tag 1 wurden gereinigte Schwann-Zellen auf nichtbeschichteten Platten mit 96 Vertiefungen in 5% FBP/Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) ausplattiert (5000 Zellen/Vertiefung). Am Tag 2 wurden GGFs oder andere Testfaktoren sowie BrdU in einer Endkonzentration von 10 um zu den Kulturen zugegeben. Nach 48 Stunden (Tag 4) wurde der BrdU-Einbau durch Absaugen des Mediums beendet und die Zellen wurden mit 200 ul/Vertiefung von 70%igem Ethanol 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit Wasser gewaschen und die DNA durch Inkubation mit 100 ul 2 N HCl 10 min bei 37ºC denaturiert. Nach der Absaugung wurde zurückbleibende Säure durch Füllen der Vertiefungen mit 0,1 M Boratpuffer, pH 9,0, neutralisiert und die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 50 ul Blockierungspuffer (PBS, enthaltend 0,1% Triton · 100 und 2% normales Ziegenserum) 15 min bei 37ºC behandelt. Nach dem Absaugen wurde monoklonaler Maus-anti-BrdU-Antikörper (Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50 ul/Vertiefung, 1,4 ug/ml verdünnt in Blockierungspuffer) zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nichtgebundene Antikörper wurden durch drei Waschungen in PBS, das 0,1% Triton X-100 enthielt, entfernt und Peroxidase-konjugierter Ziegen-Antimaus-IgG-Antikörper (Dako Corp., Santa Barbara, Ca) (50 ul/Vertiefung, 2 ug/ml verdünnt in Blockierungspuffer) wurde zugegeben und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach drei Waschungen in PBS/Triton und einer abschließenden Spülung in PBS erhielten die Vertiefungen 100 ul/Vertiefung von 50 uM Phosphat/Citratpuffer, pH 5,0, der 0,05% des lösli chen Chromogens o-Phenylendiamin (OPD) und 0,02% 0 enthielt. Die Reaktion wurde nach 5-20 min bei Raumtemperatur beendet, indem 80 ul von jeder Vertiefung auf eine saubere Platte pipettiert wurden, die 40 ul/Vertiefung von 2 N Schwefelsäure enthielt. Die Extinktion wurde bei 490 nm aufgezeichnet, wobei ein Plattenlesegerät (Dynatech Labs.) verwendet wurde. Die Assayplatten, welche die Zellmonoschichten enthielten, wurden zweimal mit PBS gewaschen und immunzytochemisch für BrdU-DNA angefärbt durch Zugeben von 100 ul/Vertiefung des Substrats Diaminobenzidin (DAB) und 0,02% H&sub2;O&sub2;, um ein unlösliches Produkt zu erzeugen. Nach 10-20 min wurde die Färbungsreaktion durch Waschen mit Wasser angehalten und BrdU-positive Kerne beobachtet undausgezählt, wobei ein umgekehrtes Mikroskop verwendet wurde. Gelegentlich wurden negative Kerne mit 0,001% Toluidinblau gegengefärbt und wie vorstehend angegeben gezählt.
- Zellen von Flow Labs wurden in DMEM, das mit 10% FCS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10% CO&sub2; in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle zwei Tage mit Nahrung versorgt oder subkultiviert. Für einen mitogenen Assay wurden die Zellen mit einer Dichte von 5000 Zellen/Vertiefung in komplettem Medium ausplattiert und eine Woche inkubiert, bis die Zellen konfluent und ruhend waren. Das serumhaltige Medium wurde entfernt und die Zellmonoschicht zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen. 100 ul serumfreies Medium, das Mitogene enthielt, und 10 um BrdU wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 48 Stunden lang inkubiert. Messungen der Dosis-Response auf GGFs und Serum oder PDGF (als positive Kontrolle) wurden durchgeführt.
- Zellen von European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) wurden in Glasgow Modified Eagle Medium (GMEM), das mit 5% Tryptosephosphatbrühe, 5% FCS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle zwei bis drei Tage mit Nahrung ver sorgt oder subkultiviert. Für einen mitogenen Assay wurden die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen/Vertiefung in komplettem Medium 24 Stunden ausplattiert. Das serumhaltige Medium wurde anschließend entfernt und nach dem Waschen mit serumfreiem Medium durch 100 ul 0,1% FCS enthaltendes GMEM oder GMEM allein ersetzt. GGFs und FCS oder bFGF als positive Kontrollen wurden gleichzeitig mit 10 um BrdU zugegeben und 48 Stünden lang inkubiert. Die Zellkulturen wurden anschließend wie für Schwann-Zellen beschrieben weiterverarbeitet.
- Zellen, die bei der Passage 39 erhalten wurden, wurden in DMEM, das 5% FCS, 5% Pferdeserum (HS), Penicillin und Streptomycin enthielt, bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10% CO&sub2; in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle drei Tage mit Nahrung versorgt oder subkultiviert. Für einen mitogenen Assay wurden die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen/Vertiefung in komplettem Medium ausplattiert und 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde das Medium durch ein Gemisch aus 1 : 1 DMEM und F12-Medium, das 0,1% FCS enthielt, nach dem Waschen in serumfreiem Medium ersetzt. Anschließend wurden Messungen der Dosis-Response auf GGFs, FCS und aFGF durchgeführt und die Zellen wurden durch den ELISA weiten/erarbeitet, wie es vorstehend für die anderen Zelltypen beschrieben ist.
- Zellen von ECACC wurden in RPMI 1640, das mit 10% HS, 5% FCS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, in mit Collagen beschichteten Kolben bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO&sub2; in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle drei Tage mit Nahrung versorgt, indem 80% des Mediums ersetzt wurden. Für einen mitogenen Assay wurden die Zellen mit einer Dichte von 3000 Zellen/Vertiefung in komplettem Medium auf mit Collagen beschichtete Platten ausplattiert (50 ul/Vertiefung Collagen, Vitrogen Collagen Corp., verdünnt 1 : 50, 30 min bei 37ºC) und 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde anschließend durch frisches RPMI allein oder 1 uM Insulin oder 1% FCS enthaltendes RPMI ersetzt. Messungen der Dosis-Response auf FCS/HS (1 : 2) als positive Kontrolle und auf GGFs wurden wie vorstehend beschrieben durch geführt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen fixiert und der ELISA wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
- Alle in diesem Beispiel wiedergegebenen Versuche wurden unter Verwendung einer hoch gereinigten Probe von einem Superose 12 Chromatografie-Aufreinigungsschritt (siehe Beispiel 1, Abschnitt D), welche ein Gemisch aus GGF-I und GFF-II (GGFs) enthielt, durchgeführt.
- Zunächst wurden die mit dem BrdU-Einbau-Assay erhaltenen Ergebnisse mit dem klassischen mitogenen Assay für Schwann-Zellen verglichen, der auf dem [125]I-UdR- Einbau in die DNA von sich teilenden Zellen beruht, der von J. P. Brockes (Methods Enzymol. 147: 217, 1987) beschrieben ist.
- Fig. 13 zeigt den Vergleich von Daten, die mit den zwei Assays erhalten wurden, welche unter den gleichen Zellkulturbedingungen (5000 Zellen/Vertiefung, in 5% FBP/DMEM, 48 Stunden lang in Gegenwart von GGFs inkubiert) durchgeführt wurden. Wie deutlich gezeigt ist, sind die Ergebnisse vergleichbar, aber der BrdU-Einbau-Assay scheint etwas empfindlicher zu sein, was durch die Verschiebung der Kurve zur linken Seite der grafischen Darstellung, d. h. zu niedrigeren Konzentrationen von GGFs nahegelegt wird.
- Wie unter dem Abschnitt "Verfahren" beschrieben ist, können, nachdem die immunreaktive BrdU-DNA durch Ablesen der Intensität des löslichen Produkts der OPD- Peroxidasereaktion quantitativ bestimmt worden ist, die ursprünglichen Assayplatten, die Zellmonoschichten enthalten, die zweite Reaktion eingehen, welche das unlösliche DAB-Produkt zur Folge hat, welches die BrdU-positiven Kerne anfärbt. Die Mikrokulturen können dann unter einem umgekehrten Mikroskop untersucht werden und die Zellmorphologie und die Zahl der BrdU-positiven und negativen Kerne kann beobachtet werden.
- In Fig. 14a und Fig. 14b wird die Immunreaktivität der BrdU-DNA, die durch das Ablesen der Extinktion bei 490 nm ausgewertet wird, mit der Zahl der BrdU-positiven Kerne und mit dem prozentualen Anteil der BrdU-positiven Kerne an der Gesamtzahl der Zellen pro Vertiefung, die in den gleichen Kulturen gezählt werden, verglichen. Die Standardabweichungen betrugen weniger als 10%. Die zwei Auswertungsmethoden weisen eine sehr gute Korrelation auf und die Diskrepanz zwischen den Werten bei der höchsten Dosis von GGFs kann durch das unterschiedliche Ausmaß der DNA-Synthese in Zellen erklärt werden, die als BrdU-positiv nachgewiesen wurden.
- Der BrdU-Einbau-Assay kann deshalb weitere nützliche Information über die biologische Aktivität von GGFs auf Schwann-Zellen liefern, wenn er mit dem [125]I-UdR-Einbau- Assay verglichen wird. Zum Beispiel zeigen die in Fig. 15 wiedergegebenen Daten, dass GGFs auf Schwann-Zellen einwirken können, so dass die DNA-Synthese induziert wird, aber bei niedrigeren Dosen die Zahl der negativen Zellen erhöht wird, die in der Mikrokultur nach 48 Stunden vorhanden sind.
- Der Assay wurde auf verschiedene Zelllinien unterschiedlicher Herkunft angewandt. In Fig. 16 werden die mitogenen Reaktionen von Schwann-Zellen und Swiss 3T3-Fibroblasten auf GGFs verglichen; trotz der schwachen Reaktion, die in 3T3-Fibroblasten erhalten wird, wurden einige eindeutig BrdU-positive Kerne in diesen Kulturen entdeckt. Parallel dazu wurden Kontrollkulturen in Gegenwart von verschiedenen Dosen von FCS oder menschlichem rekombinanten PDGF durchgeführt, welche zeigten, dass die Zellen auf geeignete Stimuli reagieren konnten (nicht gezeigt).
- Die Fähigkeit von Fibroblasten, auf GGFs zu reagieren, wurde außerdem unter Verwendung der BHK 21 C13-Zelllinie untersucht. Diese Fibroblasten, die aus der Niere gewonnen werden, weisen keine Kontakthemmung auf oder erreichen keinen Ruhezustand, wenn sie konfluent sind. Deshalb wurden die Versuchsbedingungen so geplant, dass eine sehr niedrige Hintergrundproliferation vorhanden war, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen in Frage zu stellen. Die GGFs weisen eine signifikante mitogene Aktivität auf BHK21 C13-Zellen auf, wie durch Fig. 17 und Fig. 18 gezeigt ist.
- Fig. 17 zeigt den BrdU-Einbau in DNA durch BHK 21 C13-Zellen, die durch GGFs in Gegenwart von 0,1% FCS stimuliert sind. Die gute mitogene Reaktion auf FCS deutet darauf hin, dass die Zellkulturbedingungen nicht beschränkend waren. In Fig. 18 ist der mitogene Effekt von GGFs als die Zahl von BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen und als die Gesamtzahl von Zellen, die pro Vertiefung gezählt wurden, wiedergegeben.
- Die Daten geben zwei Versuche wieder, die doppelt durchgeführt wurden; mindestens drei Felder pro Vertiefung wurden ausgezählt. Wie für Schwann-Zellen beobachtet wurde, erhöhen GGFs zusätzlich zu einer proliferativen Wirkung bei niedrigen Dosen auch die Zahl der überlebenden nichtreagierenden Zellen. Der prozentuale Anteil von BrdUpositiven Zellen ist proportional zu den zunehmenden Mengen an GGFs, die zu den Kulturen zugegeben wurden. Die Gesamtzahl von Zellen nach 48 Stunden in Gegenwart von höheren Dosen von GGFs ist mindestens verdoppelt, was bestätigt, dass die GGFs die DNA-Synthese und Proliferation in BHK21 C13-Zellen induzieren. Unter den gleichen Bedingungen wiesen Zellen, die 48 Stunden lang in Gegenwart von 2% PCS gehalten wurden, eine ungefähr sechsfache Zunahme auf (nicht gezeigt).
- C6-Gliomzellen haben ein brauchbares Modell zum Untersuchen der Eigenschaften von Gliazellen geliefert. Der exprimierte Phänotyp scheint von der Zellpassage abhängig zu sein, wobei die Zellen in einem frühen Stadium einem Astrozyten-Phänotyp und in späteren Stadien (nach Passage 70) einem Oligodendrozyten-Phänotyp stärker ähneln. Die C6-Zellen, die in diesen Versuchen verwendet wurden, waren Zellen von Passage 39 bis Passage 52. C6-Zellen sind eine stark proliferierende Population, deshalb wurden die Versuchsbedingungen so optimiert, dass ein sehr niedriger Hintergrund des BrdU- Einbaus erhalten wurde. Die Gegenwart von 0,1% Serum war nötig, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, ohne die mitogenen Reaktionen wesentlich zu beeinflussen, was die Dosis-Response auf FCS erkennen lässt (Fig. 19).
- In Fig. 20 sind die mitogenen Reaktionen auf aFGF (Fibroblastenwachstumsfaktor) und GGFs als der prozentuale Anteil des maximalen BrdU-Einbaus wiedergegeben, der in Gegenwart von FCS (8%) erhalten wird. Die Werte sind Mittelwerte von zwei Versuchen, die doppelt durchgeführt wurden. Die Wirkung der GGFs war vergleichbar mit der Wirkung einer reinen Präparation von aFGF. aFGF wurde als spezifischer Wachstumsfaktor für C6-Zellen beschrieben (Lim R. et al., Cell Regulation 1: 741-746,1990) und aus diesem Grund wurde er als positive Kontrolle verwendet. Die direkte Zählung von BrdU-positiven und negativen Zellen war aufgrund der hohen Zelldichte in den Mikrokulturen nicht möglich.
- Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Zelllinien wiesen PC12-Zellen keine offensichtliche Reaktionsfähigkeit auf GGFs auf, wenn sie unter Kulturbedingungen behan delt wurden, in welchen PC12 auf Seren reagieren könnten (Gemisch aus FCS und HS, wie es routinemäßig zur Zellhaltung verwendet wird). Nichtsdestoweniger scheint die Zahl der pro Vertiefung ausplattierten Zellen das Verhalten von PC12-Zellen zu beeinflussen und deshalb sind weitere Versuche erforderlich.
- Die Isolierung und Klonierung der GGF-II-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Peptidsequenzinformation und eines Bibliothekscreenings wurden so durchgeführt, wie es nachstehend angegeben ist. Es versteht sich, dass die Peptide der Fig. 9 und 10 als der Ausgangspunkt für die Isolierung und Klonierung von GGF-I-Sequenzen durch Befolgen der hier beschriebenen Methoden verwendet werden können. In Tat zeigt die Fig. 21 mögliche degenerierte Oligonukleotidsonden für diesen Zweck und Fig. 23 führt mögliche PCR-Primer auf. Die DNA-Sequenz und die Polypeptidsequenz sollten durch diese Mittel wie bei GGF-II erhältlich sein und das gleiche gilt für die DNA-Konstrukte und Expressionsvektoren, die eine solche DNA-Sequenz enthalten, Wirtszellen, die durch den Einbau solcher Konstrukte/Vektoren genetisch verändert sind, und Protein, das durch Kultivieren solcher Wirtszellen erhältlich ist. Die Erfindung fasst einen solchen Gegenstand ins Auge.
- Degenerierte DNA-Oligomer-Sonden wurden durch Rücktranslation der Aminosäuresequenzen (erhalten von den Peptiden, die aus gereinigtem GGF-Protein erzeugt wurden) in Nukleotidsequenzen konstruiert. Die Oligomere gaben entweder den kodierenden Strang oder den nichtkodierenden Strang der DNA-Sequenz wieder. Wenn Serin, Arginin und Leucin in der Oligomerkonstruktion enthalten waren, wurden zwei getrennte Synthesen durchgeführt, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden. Zum Beispiel wurde Serin entweder von TCN oder AGY wie in 537 und 538 oder 609 und 610 kodiert. Eine ähnliche Kodonaufspaltung erfolgte für Arginin oder Leucin (z. B. 544, 545). DNA-Oligomere wurden an einem Biosearch 8750 4-Säulen-DNA-Synthesegerät unter Verwendung der β-Cyanoethylchemie synthetisiert, wobei die Synthese im 0,2 Mikromol-Maßstab erfolgte. Die Oligomere wurden von der Säule (500 Ångström-CpG-Harze) abgespalten und die Schutzgruppen wurden in konzentriertem Ammoniumhydroxid 6-24 Stunden lang bei 55-60ºC entfernt. Die Oligomere, deren Schutzgruppen entfernt worden waren, wurden unter Vakuum (Speedvac) getrocknet und durch Gelelektrophorese in Gelen aus 15% Acrylamid (20 Mono: 1 Bis), 50 mM Tris-Borat-EDTA-Purfer, der 7 M Harnstoff enthielt, aufgereinigt. Volllängen-Oligomere wurden in den Gelen durch UV-Shadowing nachgewiesen, anschließend wurden die Banden ausgeschnitten und die DNA-Oligomere 4-16 Stunden lang unter Schütteln in 1,5 ml H&sub2;O eluiert. Das Eluat wurde getrocknet, in 0,1 ml H&sub2;O wieder aufgelöst und Extinktionsmessungen erfolgten bei 260 nm. Die Konzentrationen wurden nach der folgenden Formel bestimmt:
- (A&sub2;&sub6;&sub0; · Einheiten/ml) (60,6/Länge = x uM)
- Alle Oligomere wurden durch Zugabe von H&sub2;O auf eine Konzentration von 50 uM eingestellt.
- Degenerierte Sonden, die wie vorstehend konstruiert wurden, sind in Fig. 21 gezeigt.
- PCR-Primer wurden durch die im Wesentlichen gleichen Verfahren hergestellt, welche für Sonden verwendet wurden, jedoch mit den folgenden Modifizierungen. Linker aus dreizehn Nukleotiden, die Restriktionsstellen enthielten, wurden an den 5'-Enden der degenerierten Oligomere zur Verwendung beim Klonieren in Vektoren eingebaut. Die DNA-Synthese erfolgte im 1 Mikromol-Maßstab unter Verwendung von 1000 Ångström- CpG-Harzen und Inosin wurde in Positionen verwendet, wo alle vier Nukleotide normalerweise in degenerierte Sonden eingearbeitet wurden. Die Aufreinigung der PCR- Primer umfasste eine Ethanolfällung im Anschluss an eine Aufreinigung durch Gelelektrophorese.
- Eine Rinder-Genom-DNA-Bibliothek wurde von Stratagene (Katalognummer: 945701) gekauft. Die Bibliothek enthielt 2 · 10&sup6; 15-20 kb Sau3A1 partielle Rinder-DNA- Fragmente, die in den Vektor Lambda Dashil kloniert waren. Eine Rinder-GesamthirncDNA-Bibliothek wurde von Clonetech (Katalognummer: BL 10139) gekauft. Komplementäre DNA-Bibliotheken wurden aus mRNA, die aus Rinder-Gesamthirn, aus Rinderhypophyse und aus Rinderhypophysenhinterlappen hergestellt war, aufgebaut (In Vitro gen; Stratagene). In Vitrogen stellte zwei cDNA-Bibliotheken her: eine Bibliothek befand sich in dem Vektor Lambda gt10, die andere im Vektor pCDNAI (eine Plasmidbibliothek). Die Stratagen-Bibliotheken wurden in dem Vektor Lambda unizap hergestellt. Insgesamt enthielten die cDNA-Bibliotheken 14 Millionen primäre rekombinante Phagen.
- Die Rindergenombiblikothek wurde auf den E. coli K12-Wirtsstamm LE392 auf 23 · 23 cm Platten (Nung) mit 150000 bis 200000 Phagenplaques pro Platte ausplattiert. Jede Platte stellte ungefähr ein Rindergenomäquivalent dar. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die Platten abgekühlt und Replikafilter wurden gemäß den Verfahren von Grunstein und Hogness [PNAS (USA (1975) 72: 3961)] hergestellt. Vier Plaquelifts wurden von jeder Platte auf ungeladene Nylonmembranen (Fall Biodyne A oder MSI Nitropure) hergestellt. Die DNA wurde durch 5 Minuten langes Vernetzen unter UV-Licht oder durch zwei Stunden langes Backen bei 80º unter Vakuum auf den Membranen immobilisiert.
- DNA-Sonden wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) mit Gamma 32P ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mmol) gemäß den Angaben der Lieferfirmen markiert. Kurz gesagt wurden 50 umol degeneriertes DNA- Oligomer in Gegenwart von 600 uCi γ-32P-ATP und 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet, ein Gelelektrophorese- Ladepuffer wurde zugegeben und anschließend wurden radioaktiv markierte Sonden durch Elektrophorese gereinigt. 32P-markierte Sonden wurden aus den Gelplatten ausgeschnitten und in Wasser eluiert. Alternativ wurden DNA-Sonden mittels PCR-Amplifikation durch Einbau von α-32P-dATP oder α-32P-dCTP gemäß dem Protokoll von Schowalter und Sommer, Anal. Biochem. 177: 90-94 (1989) markiert. Die in PCR-Reaktionen markierten Sonden wurden durch Entsalzen an Sephadex G-150-Säulen gereinigt.
- Ein Prähybridisierung und Hybridisierung wurde in G MC-Puffer (0,52 M NaPi, 7% SDS, 1% BSA, 1,5 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml tRNA) durchgeführt. Das Waschen erfolgte in Puffer A Oligowash (160 ml 1 M Na&sub2;HPO4, 200 ml 20% SDS, 8,0 ml 0,5 M EDTA, 100 ml 5 M NaCl, 3632 ml H&sub2;O). Charakteristisch erweise wurden 20 Filter (jeweils 400 cm²), welche Replikakopien von zehn Rindergenomäquivalenten darstellten, in 200 ml Hybridisierungslösung mit 100 umol degenerierter Oligonukleotidsonde (128- 512-fach degeneriert) inkubiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 5ºC unter der minimalen Schmelztemperatur, die für die degenerierte Sonde berechnet wurde, erfolgen gelassen. Die Berechnung der minimalen Schmelztemperatur nimmt 2ºC für ein AT- Paar und 4ºC für ein GC-Paar an.
- Die Filter wurden in wiederholt gewechseltem Oligowash bei den Hybridisierungstemperaturen 4 bis 5 Stunden lang und schließlich in 3,2 M Tetramethylammoniumchlorid, 1% SDS zweimal 30 min lang bei einer Temperatur gewaschen, die von der Länge der DNA-Sonde abhing. Für 20-mere betrug die abschließende Waschtemperatur 60ºC. Die Filter wurden auf einem Röntgenfilm (Kodak XAR5) angebracht und dieser anschließend unter Verwendung von Verstärkerfolien (Dupont Cronox Lightening Plus) belichtet. Gewöhnlich war eine drei bis fünf Tage dauernde Belichtung des Films bei minus 80ºC ausreichend, um doppelte Signale in diesen Bibliothekscreens nachzuweisen.
- Im Anschluss an die Analyse der Ergebnisse konnte das Material von den Filtern abgelöst und sie mit neuen Sonden verwendet werden. Die Ablösung der Filter erfolgte durch Inkubieren durch zwei aufeinanderfolgende Zyklen von fünfzehn Minuten in einem Mikrowellenofen bei voller Leistung in einer Lösung von 1% SDS, die 10 mM EDTA pH 8 enthielt. Die Filter wurden für mindestens drei bis vier Zyklen der Ablösung und erneuten Aufbringung verschiedener Sonden verwendet.
- Diese Verfahren befolgten das Standardprotokoll, wie es in Recombinant DNA (Maniatis et al 2: 60-2: 81) beschrieben ist.
- Rekombinante Phagen-DNA-Proben (2 Mikrogramm) wurden in Übereinstimmung mit den Bedingungen verdaut, die von der Lieferfirma der Restriktionsendonuklease (New England Biolabs) empfohlen werden. Im Anschluss an eine vierstündige Inkubation bei 37ºC wurden die Reaktionsprodukte in Gegenwart von 0,1 M Natriumacetat und 3 Volumina Ethanol gefällt. Gefällte DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 75% Ethanol gespült und getrocknet. Alle resuspendierten Proben wurden auf Agarosegele geladen (charakteristischerweise 1% in TAE-Puffer; 0,04 M Tris-Acetat, 0,002 M EDTA). Die Gele wurden bei 1 Volt pro Zentimeter 4 bis 20 Stunden lang laufen gelassen. Zu Markern gehörten Lambda Hind III DNA-Fragmente und/oder φX174HaeIII DNA- Fragmente (New England Biolabs). Die Gele wurden mit 0,5 Mikrogramm/ml Ethidiumbromid angefärbt und fotografiert. Für ein Southernblotting wurde die DNA zuerst in dem Gel durch Behandlung mit 0,125 N HCl depuriniert, in 0,5 N NaOH denaturiert und in 20 · SSC (3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumcitrat) auf ungeladene Nylonmembranen überführt. Das Blotting erfolgte 6 Stunden bis zu 24 Stunden, dann wurden die Filter in, 1 M Tris NaOH pH 7,5, 0,15 M Natriumchlorid neutralisiert, anschließend kurz in 50 mM Tris-Borat EDTA gespült. Zum Vernetzen wurden die Filter zunächst in transparente Kunststofffolie eingewickelt, anschließend wurde die DNA-Seite 5 Minuten lang ultraviolettem Licht ausgesetzt. Die Hybridisierung und Waschung erfolgte wie für das Bibliothekscreening beschrieben (siehe Abschnitt 2 dieses Beispiels). Für die Hybridisierungs-Analyse zum Bestimmen, ob ähnliche Gene in arideren Arten vorkommen, wurden leichte Modifizierungen vorgenommen. Der DNA-Filter wurde von Clonetech (Katalognummer 7753-1) gekauft und enthält 5 Mikrogramm von mit EcoRI verdauter DNA aus verschiedenen Arten pro Bahn. Die Sonde wurde durch PCR-Amplifikationsreaktionen wie in Abschnitt 2 vorstehend beschrieben markiert und Hybridisierungen erfolgten in 80% Puffer B (2 g Polyvinylpyrrolidin, 2 g Ficoll-400, 2 g Rinderserumalbumin. 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 58 g NaCl, 1 g Natriumpyrophosphat, 10 g Natriumdodecylsulfat, 950 ml H&sub2;O), der 10% Dextransulfat enthielt. Die Sonden wurden durch zehn Minuten langes Kochen und anschließendes schnelles Abkühlen in Eiswasser denaturiert. Die Sonde wurde zu dem Hybridisierungspuffer mit 10&sup6; dpm 32P pro ml zugegeben und über Nacht bei 60ºC inkubiert. Die Filter wurden bei 60ºC zunächst in Puffer B, gefolgt von 2 · SSC, 0,1% SDS, anschließend in 1 · SSC, 0,1% SDS gewaschen.
- Für Versuche mit hoher Stringenz erfolgten die abschließenden Waschungen in 0,1 · SSC, 1% SDS und die Temperatur stieg auf 65ºC. Southernblotdaten wurden verwendet, um eine Restriktionskarte des genomischen Klons herzustellen und um anzugeben, welche Subfragmente an die GGF-Sonden hybridisierten (Kandidaten für das Subklonieren).
- DNA-Verdaue (z. B. 5 Mikrogramm) wurden auf 1% Agarosegele geladen und anschließend geeignete Fragmente nach der Anfärbung aus den Gelen ausgeschnitten. Die DNA wurde durch Adsorption auf Glasperlen, gefolgt von einer Elution unter Verwendung des von der Lieferfirma (Bio 101) beschriebenen Protokolls gereinigt. Zurückgewonnene DNA-Fragmente (100-200 ng) wurden in linearisierte dephosphorylierte Vektoren, z. B. pT3T7 (Ambion), welcher ein Derivat von pUC18 ist, ligiert, wobei T4-Ligase (New England Biolabs) verwendet wurde. Dieser Vektor trägt das E. coli β-Lactamase- Gen, folglich können Transformanten auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert werden. Der Vektor liefert der Wirtszelle auch die β-Galactosidase-Komplementierung, deshalb können Nichtrekombinanten (blau) unter Verwendung von Isopropylthiogalactosid und Bluogal (Bethesda Research Labs) nachgewiesen werden. Ein Teil der Ligierungsreaktionen wurde verwendet, um blaue kompetente E. coli K12 XL1-Zellen (Stratagene Katalognummer: 200236) zu transformieren und anschließend wurden die Transformanten auf LB-Platten, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten, selektiert. Weiße Kolonien wurden selektiert und Plasmidminipräparationen wurden für den DNA- Verdau und für die DNA-Sequenzanalyse hergestellt. Selektierte Klone wurden erneut getestet, um festzustellen, ob ihr DNA-Insert mit den GGF-Sonden hybridisierte.
- Doppelsträngige Plasmid-DNA-Template wurden aus doppelsträngigen Plasmiden, die aus 5 ml-Kulturen isoliert wurden, gemäß Standardprotokollen hergestellt. Die Sequenzierung erfolgte durch das Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren, wobei Sequenase 2.0 und ein Didesoxynukleotid-Sequenzier-Kit (US Biochemical) gemäß dem Protokoll der Hersteller [eine Modifizierung von Sangeret al. PNAS; USA 74: 5463 (1977)] verwendet wurde. Alternativ erfolgte die Sequenzierung in einem DNA-Thermozykler (Perkin Eimer, Modell 4800) unter Verwendung eines Zyklus-Sequenzier-Kits (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) und wurde gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt, wobei ein am 5'-Ende markierter Primer verwendet wurde. Die Sequenzprimer waren entweder die mit den Sequenzier-Kits gelieferten oder wurden in Überstimmung mit der aus den Klonen bestimmten Sequenz synthetisiert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf 0,4 mm dicke Sequenziergele aus 6% Polyacrylamid gela den und aufgetrennt. Die Gele wurden getrocknet und ein Röntgenfilm damit belichtet. Charakteristischerweise wurde 35S eingebaut, wenn Standard-Sequenzier-Kits verwendet wurden, und ein mit 32P am Ende markierter Primer wurde für Zyklus- Sequenzierungs-Reaktionen verwendet. Die Sequenzen wurden in einen DNA- Sequenzeditor von der Unterseite des Gels bis zur Oberseite (5'- nach 5'-Richtung) abgelesen und die Daten wurden unter Verwendung von Programmen analysiert, die von Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin) geliefert wurden.
- Offene Leseraster, die in der genomischen DMA entdeckt wurden und welche eine Sequenz enthielten, die für GGF-Peptide kodiert, wurden mittels PCR-Amplifikation von Hypophysen-RNA verlängert. RNA wurde aus gefrorenem Rindergewebe (Pelfreeze) gemäß dem Guanidin-neutrales-CsCI-Chlorid-Verfahren [Chirgwin et al. Biochemistry 18: 5294 (1979).] hergestellt. Polyadenylierte RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose- Säulenchromatografie selektiert [Aviv und Leder PNAS (USA) 69: 1408 (1972)].
- Spezifische DNA-Zielsequenzen wurden amplifiziert, wobei entweder mit Gesamt-RNA oder polyadenylierten RNA-Proben begonnen wurde, welche unter Verwendung des Perkin Eimer PCR/RNA Kit Nummer: N808-0017 in cDNA umgewandelt worden waren. Reverse Transkriptionsreaktionen des ersten Stranges verwendeten 1 ug Templat-RNA und entweder Primer von Oligo dT mit damit verbundenen Restriktionsenzym- Erkennungsstellen-Linkern oder spezifische Antisense-Primer, die von klonierten Sequenzen bestimmt wurden, mit damit verbundenen Restriktionsstellen. Um den zweiten Strang herzustellen, waren die Primer entweder einzigartige Plusstrang-Sequenzen, wie sie in 5'-RACE-Reaktionen [Frohman et. al., PNAS (USA) 85: 8998 (1988)] verwendet wurden, oder es waren Oligo dT-Primer mit damit verbundenen Restriktionsstellen, wenn die zweite Zielstelle durch Tailing von Reaktions Produkten des ersten Strangs mit dATP durch terminale Transferase hinzugefügt worden war (z. B. 5'-RACE-Reaktionen, Frohman et. al., ebenda). Alternativ waren die Primer des zweiten Stranges wie in Anker-PCR-Reaktionen degeneriert und repräsentierten folglich bestimmte Peptidsequenzen.
- Die Amplifikationsprofile folgten dem folgenden allgemeinen Schema: 1) fünf Minuten Soak-File bei 95ºC; 2) Thermozyklus-File von 1 Minute, 95ºC; 1 Minute Absinken auf eine Hybridisierungstemperatur von 45ºC, 50ºC oder 55ºC; Aufrechterhalten der Hybridisierungstemperatur während einer Minute; Anstieg auf 72ºC über eine Minute; Verlängerung bei 72ºC während einer Minute oder während einer Minute plus eine 10- sekündige Auto-Verlängerung; 3) Verlängerungszyklus bei 72ºC, fünf Minuten, und; 4) Soak-File 4ºC für unbestimmte Zeit. Thermozyklus-Files (#2) wurden gewöhnlich 30 Zyklen lang durchgeführt. Sechzehn ul von jeder 100 ul-Amplifizierungsreaktion wurden durch Elektrophorese in 2% Nusiev 1% Agarosegelen analysiert, die in TAE-Puffer bei 4 Volt pro Zentimeter drei Stunden lang laufen gelassen wurden. Die Gele wurden angefärbt, dann auf ungeladene Nylonmembranen übertragen, welche mit markierten DNA-Sonden, die dem Inneren der Primer entsprachen (that were internal to the primers), getestet wurden.
- Spezifische Gruppen von DNA-Amplifikationsprodukten konnten in den Blotting- Versuchen identifiziert werden und ihre Positionen als Richtschnur für die Aufreinigung und Reamplifizierung verwendet werden. Soweit es zweckmäßig war, wurden die verbleibenden Portionen von selektierten Proben auf präparative Gele geladen und dann wurden im Anschluss an die Elektrophorese vier bis fünf Platten mit 0,5 mm Dicke (welche die erwartete Position des spezifischen Produkts umfassten) von dem Gel entnommen. Die Agarose wurde zerkleinert, anschließend 2-16 Stunden bei 40ºC in 0,5 ml Elektrophoresepuffer eingeweicht. Die zerkleinerte Agarose wurde zwei Minuten zentrifugiert und die wässrige Phase in frische Röhrchen überführt. Eine Reamplifizierung erfolgte an fünf Mikrolitern (ungefähr 1% des Produkts) des eluierten Materials unter Verwendung der gleichen Gruppen von Primern und der Reaktionsprofile wie in den ursprünglichen Reaktionen. Wenn die Reamplifizierungsreaktionen beendet waren, wurden die Proben mit Chlorform extrahiert und in frische Röhrchen überführt. Konzentrierte Restriktionsenzympuffer und Enzyme wurden zu den Reaktionen zugegeben, um die in den Linkem vorhandenen Restriktionsstellen zu spalten. Die verdauten PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese gereinigt, anschließend in Vektoren subkloniert, wie es in dem vorstehenden Subklonierungs-Abschnitt beschrieben ist. Die DNA- Sequenzierung erfolgte wie vorstehend beschrieben.
- DNA-Sequenzen wurden assembliert, wobei ein Fragment-Assemblierungsprogramm und die von den GCG-Programmen GelAssemble, Map und Translate abgeleiteten Aminosäuresequenzen Verwendet wurden. Die abgeleiteten Proteinsequenzen wurden unter Verwendung von Word Search untersucht. Die Analyse erfolgte an einem VAX Station 3100-Rechner, der unter VMS 5.1 betrieben wurde. Die Datenbanksuche erfolgte an SwissProt Release-Nummer 21 unter Verwendung der GCG Version 7.0.
- Wie angegeben wurden zum Identifizieren der DNA-Sequenz, die für Rinder-GGF-II kodiert, degenerierte Oligonukleotidsonden aus GGF-II-Peptidsequenzen konstruiert. GGF-II12, ein Peptid, das über einen Lysylendopeptidase-Verdau einer gereinigten GGF-II-Präparation erzeugt wurde (siehe Fig. 11 und 12), wies eine starke Aminosäuresequenzhomologie mit GGF-I 07, einem tryptischen Peptid, das aus einer gereinigten GGF-I-Präparation erzeugt wurde, auf. GGF-II12, wurde somit verwendet, um zehn degenerierte Oligonukleotidsonden zu erzeugen (siehe Oligos 609, 610 und 649 bis 656 in Fig. 21). Eine doppelte Gruppe von Filtern wurden mit zwei Gruppen von Sonden (Gruppe 1 = 609, 610; Gruppe 2 = 649-656) getestet, die für zwei überlappende Abschnitte von GGF-II 12 kodieren. Es wurden 46 Hybridisierungssignale beobachtet, jedoch nur ein Klon hybridisierte an beide Sondengruppen. Der Klon (bezeichnet als GGF2BG1) wurde aufgereinigt.
- Eine Southernblot-Analyse der DNA von dem Phagenklon GGF2BG1 bestätigte, dass beide Gruppen von Sonden mit jener Rinder-DNA-Sequenz hybridisierten, und zeigte ferner, dass beide Sonden mit der gleichen Gruppe vcn DNA-Fragmenten innerhalb des Klons reagierten. Auf der Grundlage dieser Versuche wurde ein 4 kb Eco RI- Subfragment des ursprünglichen Klons identifiziert, subkloniert und teilweise sequenziert. Fig. 22 zeigt die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der ursprünglichen DNA-Sequenz-Ablesungen, welche die Hybridisierungsstellen der Sonden 609 und 650 enthielten, und bestätigten, dass; ein Teil dieser Rindergenom- DNA für das Peptid 12 kodiert (KASLADSGEYM).
- Eine weitere Sequenzanalyse zeigte, dass GGF-II 12 sich auf einem offenen Leseraster mit 66 Aminosäuren (siehe unten) befand, welcher der Brennpunkt für die Isolierung von überlappenden Sequenzen wurde, die ein mutmaßliches Rinder-GGF-II-Gen und einen cDNA wiedergeben.
- Es wurden verschiedene PCR-Verfahren verwendet, um weitere kodierende Sequenzen für das mutmaßliche Rinder-GGF-II-Gen zu erhalten. Gesamt-RNA und Oligo dTselektierte (Poly A enthaltende) RNA-Proben wurden aus der Rinder-Gesamthypophyse, dem vorderen Hypophysenlappen, dem hinteren Hypophysenlappen und dem Hypothalamus hergestellt. Unter Verwendung von Primern aus der in Fig. 23 gezeigten Liste wurdeneinseitige PCR-Reaktionen (RACE) verwendet, um cDNA-Enden sowohl in 3'- als auch 5'-Richtung zu amplifizieren und Anker-PCR-Reaktionen wurden mit degenerierten Oligonukleotidprimern durchgeführt, die weitere GGF-II-Peptide wiedergeben. Fig. 24 fasst die benachbarten DNA-Strukturen und Sequenzen zusammen, die in diesen Versuchen erhalten wurden. Aus den 3'-RACE-Reaktionen wurden drei alternativ gespleisste cDNA-Sequenzen hergestellt, welche kloniert und sequenziert wurden. Eine 5'-RACE-Reaktion führte zur Entdeckung eines weiteren Exons, das eine kodierende Sequenz für mindestens 52 Aminosäuren enthielt. Die Analyse dieser abgeleiteten Aminosäuresequenz offenbarte die Peptide GGF-II-6 und eine Sequenz, die GGF-I-18 ähnlich war (siehe unten). Die Anker-PCR-Reaktionen führten zur Identifizierung von (cDNA) kodierenden Sequenzen von Peptiden GGF-II-1, 2, 3 und 10, die in einem weiteren cDNA-Segment von 300 bp enthalten sind. So enthält dieser Klon Nukleotidsequenzen, die für sechs von insgesamt neun vorhandenen neuen GGF-II-Peptidsequenzen kodieren.
- Das klonierte Gen wurde zunächst durch Konstruieren einer physikalischen Karte von GGF2BG1 charakterisiert, welche uns gestattete, die kodierenden Sequenzen zu positionieren, wie sie gefunden wurden (siehe unten, Fig. 25), DNA-Sonden aus den vorstehend beschriebenen kodierenden Sequenzen wurden verwendet, um weiter DNA-Fragmente zu identifizieren, welche die Exons auf diesem Phagenklon enthielten, und um Klone zu identifizieren, welche in beiden Richtungen überlappen. Das mutmaßliche Rinder-GGF-II-Gen ist in mindestens fünf Exons eingeteilt, aber nur die Exons A und B sind bisher kartiert worden. Die Zusammenfassung der identifizierten benachbarten kodierenden Sequenzen ist in Fig. 26 gezeigt. Die Exons sind (alphabetisch) in der Reihen folge ihrer Entdeckung aufgeführt. Aus den Intron/Exon-Grenzen geht hervor, dass Exon B in cDNAs enthalten sein kann, welche Exon E und Exon A verbinden. Das heißt, Exon B kann nicht herausgespleisst werden, ohne das Lesenaster in Frage zu stellen. Deshalb schlagen wir vor, dass drei alternative Spieissmuster die mutmaßlichen Rinder-GGF-II cDNA-Sequenzen 1, 2 und 3 erzeugen können. Die kodierenden Sequenzen von diesen, die als GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS bzw. GGF2BPP3.CDS bezeichnet werden, sind in den Fig. 28a, 28b bzw. 28c angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der drei cDNAs ist ebenfalls in den Fig. 28a, 28b und 28c angegeben.
- Die drei abgeleiteten Strukturen kodieren für Proteine mit Längen von 207, 258 und 264 Aminosäuren. Die ersten 183 Reste der abgeleiteten Proteinsequenz ist in allen drei Genprodukten identisch. An der Position 184 unterscheiden sich die Klone erheblich. Ein Codon für Glycin GGT in GGF2BPP1 dient auch als Spleissdonor für GGF2BPP2 und GGF2BPP3, welche alternativ an den Exons C und D oder C, c/d und D addieren. Da das GFFIIbPP1-Transkript angrenzend an eine kanonische AATAAA Polyadenylierungssequenz endet, schlagen wir vor, dass dieses trunkierte Genprodukt ein echtes reifes Transkript darstellt. Die anderen beiden längeren Genprodukte weisen beide die gleiche 3'-untranslatierte Sequenz und Polyadenylierungsstelle auf. Interessanterweise kodieren jedoch GGF2BPP2 und GGF2BPP3 für zwei unterschiedliche C-terminale Sequenzen von der gleichen DNA-Sequenz, da das Exon c/d eine Länge von 68 Nukleotiden aufweist. Das heißt, der Abschnitt am Ende wird von zwei überlappenden Leserastem kodiert.
- Alle drei von diesen Molekülen enthalten sechs der neun neuen GGF-II-Peptidsequenzen (siehe Fig. 12) und ein weiteres Peptid ist hoch homolog zu GGF-I-18 (siehe Fig. 27). Dieser Befund ergibt eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass dieses rekombinante Molekül für mindestens einen Teil von Rinder-GGF-II kodiert. Außerdem stimmen die berechneten isoelektrischen Punkte für die drei Peptide mit den physikalischen Eigenschaften von GGF-I und II überein. Da die Molekülgröße von GGF-II ungefähr 60 kd beträgt, sollte die längste der drei cDNAs für ein Protein mit nahezu der Hälfte der vorhergesagten Anzahl von Aminosäuren kodieren. Ähnliche Verfahren wie die vorstehend beschriebenen können verwendet werden, um die übrige Sequenz in dem Volllängenklon zu erhalten.
- Es ist möglich, dass das kürzere Genprodukt, das durch Spieissmuster 1 wiedergegeben wird (siehe Fig. 28a und Beispiele), den GGF-Rezeptor binden kann und keine mitogene Aktivität auf Schwann-Zellen aufweist. So kann es einen natürlichen Inhibitor von GGF-I und GGF-II darstellen. Kürzlich haben Chan et. al. Science 254: 1382, (1991)einen kompetitiven Antagonisten von Hepatozytenwachstumsfaktor identifiziert, der von einem alternativen Transkript kodiert wird, welches ein trunkiertes Molekül ergibt. Deshalb gibt es einen biologischen Präzedenzfall für trunkierte Wachstumsfaktoren, die als natürliche Antagonisten wirken. Ein solches Molekül könnte therapeutisch nützlich sein. Zum Beispiel könnte ein natürlicher Inhibitor zum Behandeln eines Schwannoms oder anderer bösartiger Geschwülste nützlich sein, welche durch eine Überexpression von GGF-I und/oder GGF-II verursacht werden. Vorläufige Hybridisierungs- und DNA- Sequenzdaten deuten daraufhin, dass eine gewisse Spleissvariation irgendwo in dem Gen vorhanden sein kann; so können weitere Spleissvarianten von GGF vorhanden sein, welche die Gesamtzahl auf mehr als drei bringen.
- Eine Datenbanksuche hat keine bedeutungsvollen Ähnlichkeiten mit bekannten Proteinsequenzen gezeigt. Dies legt nahe, dass GGF-II das erste Mitglied einer neuen Familie oder Superfamilie von Proteinen ist. Bei Kreuzhybridisierungsstudien (DNA-Blotting- Versuchen) mit anderen Säuger-DNAs haben wir eindeutig gezeigt, dass DNA-Sonden von diesem rekombinanten Rinder-Molekül leicht spezifische Sequenzen in einer Reihe von untersuchten Proben nachweisen können. Eine hoch homologe Sequenz wird auch in menschlicher genomischer DNA nachgewiesen. Das Audioradiogramm ist in Fig. 29 gezeigt. Außerdem zeigt der Blotting-Versuch, dass die Sonde Banden mit geringerer Intensität nachweist, welche verwandte Gene, andere potentielle Mitglieder einer GGF- Familie darstellen könnten.
- Das für GGF-II kodierende Gen kann leicht von Fachleuten aus einer Rinder-Genom- oder Hypophysen-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von einzigartigen Sonden oder Primern, die mit Teilen der hier offenbarten kodierenden Sequenz identisch sind, Moniert werden. Außerdem kann jeder Vertebraten- (einschließlich Menschen-)GGF-II unter Verwendung einer genomischen oder Hypophysen-Bibliothek, die aus den entsprechenden Arten hergestellt ist, und unter Verwendung der vorstehend (für die Rindersequenz) beschriebenen Vorgehensweise kloniert werden.
- So kann eine cDNA-Bibliothek, die unter Verwendung von PolyA-RNA konstruiert wurde, die aus dem Hypophysenhinterlappen isoliert wurde, aus plattiert werden (wie es in Beispiele beschrieben ist) und Plaquelifts können mit radioaktiv markierten Fragmenten von GGF-II-DNA (z. B. dem 4 kb-Fragment, das von einem Verdau von klonierter GGF2BG1-DNA mit Eco RI freigesetzt wird) sondiert werden. Alternativ kann ein einzigartiger synthetischer Sondenprimer aus einer beliebigen GGF 2BG1-Exonsequenz hergestellt, endmarkiert und zum Durchsuchen einer Bibliothek wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben verwendet werden. Eine dritte Vorgehensweise ist die Verwendung von einzigartigen PCR-Primergruppen (die auf ähnliche Weise wie die vorstehend beschriebenen Sonden hergestellt werden) zum Amplifizieren von spezifischen Produkten von einer Vielzahl von Nukleinsäureausgangsmaterialien (z. B. Poly A + RNA, genomische oder cDNA-Bibliotheks-DNA). Diese Produkte können subkloniert und assembliert werden, um eine Volllängensequenz zu erzeugen, die für GGF-II kodiert.
- Die Sequenz von Rinder-GGF-II weist mehrere Stellen auf, welche potentiell von einer Zelle zum Addieren von Kohlenhydrat an das Protein im Anschluss an die Translation der entsprechenden Messenger-RNA verwendet werden können. Die Aminosäuresequenz X (P ausgenommen) NXT/SX (P ausgenommen) ist ein Signal für die Addition ei nes N-verknüpften Kohlenhydratbestandteils und kann potentiell in der Zelle modifiziert werden. Innerhalb des Aminosäureabschnitts von Rest 1 bis 183 (welche den drei abgeleiteten Proteinsequenzen gemeinsam ist) treten potentielle Glycosylierungsstellen viermal auf, nämlich an den Resten 50, 123, 170, 176. Eine fünfte Stelle ist am Rest 183 in GGF2BPP2.PEP und GGF2BPP3.PEP vorhanden. Diese Stelle wird in GGF2BPP1.PEP durch einen alternativen Spieissvorgang entfernt. Die potentiellen Glycosylierungsstellen an den Resten 50 und 123 sind in den GGF-II-Proteinen wahrscheinlich glycosyliert. Dieser Schluss wird aus den Peptidsequenzdaten gezogen. Eine Untersuchung der tatsächlichen Peptidsequenzen umfassend die Reste 50 und 123 (Peptide GGF-II-2 und GGF-I-18) zeigt, dass der mit Kohlenhydrat modifizierbare Rest (N) in jeder Sequenz nicht identifizierbar ist, was nahe legt, dass diese Reste tatsächlich glycosyliert sind und in dem Sequenzierungsverfahren nicht nachgewiesen werden.
- Antikörper, die gegen GGF-II gerichtet sind, können verwendet werden, um GGF-II auf der Proteinebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde ein Teil der GGF-II- Sequenz (Nukleotide 281 bis 653 (Fig. 28a), welche eine Aminosäuresequenz mit 115 Resten kodieren, in einem bakteriellen Fusionsprotein-Expressionssystem exprimiert. Das DNA-Fragment, das dieses Peptid kodiert, wurde in den Vektor pMAL-C2 (New England Biolabs) insertiert und das resultierende Fusionsgen wurde exprimiert und das Protein wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers weiterverarbeitet.
- Das resultierende Fusionsprotein wurde von der Reinigungssäule eluiert, mit dem Enzym Faktor Xa (welcher den GGF-II-Teil des Peptids freisetzt) gespalten und an einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, aus dem Gel ausgeschnitten und zum Immunisieren von Kaninchen verwendet werden. Sera, die im Anschluss an jede Auffrischungsimmunisierung von diesen Kaninchen erhalten werden, können durch Westemblot-Analyse (Burnette, Anal. Biochem. 112: 195-203,1983) von Extrakten getestet werden, die aus Bakterien hergestellt werden, welche die überproduzierenden Plasmide enthalten. Diese Analyse kann zeigen, ob Antikörper erzeugt worden sind, welche das bakteriell produzierte Immunogen erkennen. Die Tiere können solange im munisiert werden, bis eine signifikante positive Reaktion erreicht wird, wie sie in diesem Assay festgestellt wird. Diese Antikörper können auch für diagnostische Zwecke brauchbar sein.
- Um Volllängen-GGFs oder Teile von GGFs zum Testen auf biologische Aktivität zu erhalten, können die Proteine unter Verwendung von klonierter DNA überproduziert werden. Es können verschiedene Vorgehensweisen eingesetzt werden. Eine rekombinante E. coli-Zelle. welche die vorstehend in Beispiel 4 ("Ergebnisse") beschriebenen Sequenzen enthält, kann konstruiert werden. Expressionssysteme wie etwa pNHSa oder pHH16a (Stratagene, Ine) können für diesen Zweck verwendet werden, indem die Verfahren des Herstellers befolgt werden. Alternativ können diese Sequenzen in einen Säugerexpressionsvektor insertiert werden und eine überproduzierende Zelllinie kann konstruiert werden. Als Beispiel kann für diesen Zweck DNA, die einen GGF kodiert, mit einer homologen oder einer fremden Sekretionssignalsequenz verbunden, in Chinese Hamster Ovary-Zellen unter Verwendung des pMSXND-Expressionsvektors exprimiert werden (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263: 3521-3527, 1981). Dieser Vektor, der eine GGF-DNA-Sequenz enthält, kann in CHO-Zellen unter Vorwendung etablierter Verfahren transfiziert werden.
- G418-resistente Klone können in Gegenwart von Methotrexat kultiviert werden, um auf Zellen zu selektieren, welche das dhfr-Gen (enthalten auf dem pMSXN D-Vektor) amplifizieren und dabei die benachbarte GGF-Protein kodierende Sequenz gleichzeitig amplifizieren. Da CHO-Zellen in einem völlig proteinfreien Medium gehalten werden können (Hamilton und Harn. In Vitro 13: 537-547,1977), kann das» gewünschte Protein aus dem Medium aufgereinigt werden. Eine Western-Analyse unter Verwendung der in Beispiel 8 erzeugten Antisera kann verwendet werden, um das Vorhandensein des gewünschten Proteins in dem konditionierten Medium der überproduzierenden Zellen nachzuweisen.
- Das gewünschte Protein kann aus dem E. coli-Lysat oder dem CHO-Zellenkonditionierten Medium unter Verwendung von Verfahren, die in Beispiel 1 beschrieben sind, aufgereinigt werden.
- Das Protein kann an verschiedenen Punkten in dem Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen Westernblot-Assays getestet werden. Alternativ kann der hier beschriebene mitogene Assay für Schwann-Zellen verwendet werden, um das exprimierte Produkt des Volllängenklons oder irgendwelche biologisch aktiven Teile davon zu testen.
Claims (13)
1. Basischer Polypeptidfaktor oder Teil davon, der durch Hydroxylapatit-HPLC
erhältlich ist und eine die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem
Kälberplasma stimulierende mitogene Aktivität aufweist und, wenn er unter
Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität
nach 10 Wochen Inkubation in 0,1% Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält, wobei
der basische Polypeptidfaktor ein Molekulargewicht von 30 kD bis 36 kD aufweist
und von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die in Fig. 22 gezeigt ist.
2. Basischer Polypeptidfaktor oder Teil davon, der durch Hydroxylapatit-HPLC
erhältlich ist und die Teilung von Schwann-Zellen in Gegenwart von fötalem
Kälberplasma stimuliert und, wenn er unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC
isoliert wird, mindestens 50% dieser Aktivität nach 10 Wochen Inkubation in 0,1%
Trifluoressigsäure bei 4ºC beibehält, wobei der basische Polypeptidfaktor ein
Molekulargewicht von 55 kD bis 63 kD aufweist und von einer DNA-Sequenz, wie sie
in einer der Fig. 28a, 28b oder 28c gezeigt ist; oder der DNA-Sequenz, die durch
die Nukleotide 281-557 der in Fig. 28a gezeigten Sequenz wiedergegeben wird,
kodiert wird.
3. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2,
umfassend das Extrahieren von Vertebraten-Hirnmaterial, gegebenenfalls
Hypophysenmaterial, z. B. Rinderhypophyse, zum Erhalten von Protein, Unterziehen
des resultierenden Extrakts einer chromatografischen Reinigung, umfassend
Hydroxylapatit-HPLC, und danach einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und Sammeln der Fraktion davon, die ein beobachtetes Molekulargewicht von
30 kD bis 36 kD aufweist, und/oder der Fraktion, die ein beobachtetes
Molekulargewicht von 55 kD bis 63 kD aufweist, wenn sie jeweils einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese unter Verwendung der folgenden Molekulargewichtstandards
unterzogen wird:
Lysozym (Hühnereiweiß) 14400
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 21500
Carboanhydrase (vom Rind) 31000
Ovalbumin (Hühnereiweiß) 45000
Rinderserumalbumin 66200
Phosphorylase B (Kaninchenmuskel) 97400;
und zwar im Fall der vorstehend erwähnten Fraktion mit kleinerem
Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen oder auch nicht und im Fall der
vorstehend erwähnten Fraktion mit größerem Molekulargewicht unter nicht
reduzierenden Bedingungen, wobei die Fraktion(en) eine die Teilung von Ratten-Schwann-
Zellen stimulierende mitogene Aktivität gegen einen Hintergrund von fötalem
Kälberplasma aufweist bzw. aufweisen; wobei die chromatografische Reinigung
gegebenenfalls einen Schritt einschließt, bei dem das anfänglich aus Hirnmaterial
extrahierte Protein zuerst einer Carboxymethylcellulose-Chromatografie
unterworfen wird, und/oder auch nach einer Hydroxylapatit-HPLC eine
Kationenaustauschchromatografie, Gelfiltration und/oder Umkehrphasen-HPLC einschließt.
4. Isolierte DNA mit einer Sequenz, die ein Polypeptid mit mitogener Aktivität auf
Gliazellen kodiert und umfasst:
(a) eine Sequenz, die in einer der Fig. 28a, 28b oder 28c gezeigt ist;
(b) eine Sequenz, die in Fig. 22 gezeigt ist; oder
(c) die Sequenz, die durch die Nukleotide 281-557 der in Fig. 28a gezeigten
Sequenz wiedergegeben wird.
5. DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA wie in Anspruch 4 definiert und in
funktioneller Anordnung mit dem Leseraster in einem Vektor unter der Kontrolle einer
Kontrollsequenz, welche die Expression dieser Sequenz in ausgewählten
Wirtszellen nach der Transformation dieser Zellen durch das Konstrukt ermöglicht.
6. Wirtszellen, die durch den Einbau eines wie in Anspruch 5 definierten Konstrukts
modifiziert sind, so dass DNA in diesen Wirtszellen exprimiert werden kann.
7. Verfahren zum Herstellen eines für Gliazellen mitogenen Faktors, umfassend das
Kultivieren von modifizierten Wirtszellen, wie in Anspruch 6 definiert, unter
Bedingungen, welche die Expression dieser DNA-Sequenz ermöglichen.
8. Pharmazeutische oder tiermedizinische Formulierung, umfassend ein Polypeptid
wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert, das für eine pharmazeutische oder
tiermedizinische Anwendung formuliert ist, gegebenenfalls zusammen mit einem
annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Excipiens und/oder in
Einheitsdosisform.
9. Polypeptid wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert, zur Verwendung als
Gliazellen-Mitogen.
10. Verwendung eines Polypeptids wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert
(a) zum Herstellen eines Arzneimittels für die Behandlung einer Nervenkrankheit
oder nervösen Störung oder für eine neurale Regeneration oder Reparatur;
oder
(b) als Immunogen zum Erzeugen von Antikörpern, wobei diese Antikörper
gegebenenfalls für diagnostische Zwecke bestimmt sind.
11. Verwendung eines Polypeptids wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert
(a) in einem kompetitiven Assay zum Identifizieren oder Quantifizieren von
Molekülen mit Rezeptorbindungseigenschaften, die denen des Polypeptids
entsprechen, wobei das Polypeptid gegebenenfalls markiert ist, und, falls dies
gewünscht wird, mit einem Radioisotop markiert ist;
(b) in einem Affinitätsisolierungsverfahren, gegebenenfalls einer
Affinitätschromatografie, zur Abtrennung eines entsprechenden Rezeptors; oder
(c) als Gliazellen-Mitogen in vitro.
12. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, oder einer
entsprechenden Nukleinsäuresequenz, beim Untersuchen, Isolieren oder Herstellen
eines Gliazellen-Mitogens oder einer diesem entsprechenden Gensequenz, oder
beim Erzeugen eines entsprechenden Antikörpers.
13. Antikörper gegen ein Polypeptid, wie es in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert
ist.
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