DE69232310T2

DE69232310T2 - Expression von aktivem menschlichem Protein C im Milchdrüsengewebe transgener Tiere

Info

Publication number: DE69232310T2
Application number: DE69232310T
Authority: DE
Inventors: William N. Drohan; John L. Johnson; William H. Velander; Tracy D. Wilkins
Original assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 1991-01-11
Filing date: 1992-01-07
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: CA2099562A1; CA2099562C; JPH06507307A; US5589604A; EP0591219A1; AU1228592A; WO1992011757A1; EP0591219A4; EP0591219B1; ATE211177T1; DE69232310D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von natürlichen und modifizierten Formen des menschlichen Gerinnungsfaktors Protein C. Sie betrifft insbesondere ein transgenes Tier, in dessen genomische DNS ein exogenes Gen stabil eingebaut ist, das speziell im Brustdrüsengewebe exprimiert wird, so daß das Protein C in die vom Tier produzierte Milch sezerniert wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Protein C ist eine wichtige Komponente des Gerinnungssystems und hat eine starke gerinnungshemmende Aktivität. Das Protein ist in seiner aktiven Form eine Serinprotease, die die Faktoren Va und Villa proteolytisch inaktiviert.
Das menschliche Protein C (hPC), ein über Disulfidbrücken verknüpftes 62 kD Heterodimer, bestehend aus einer leichten Kette mit 25 kD und einer schweren Kette mit 41 kD, zirkuliert als inaktives Zymogen im Plasma. An der Endothel- Zelloberfläche wird es durch eingeschränkte Thrombin- Proteolyse in Gegenwart von Thrombomodulin zum aktiven Protein C (APC) aktiviert; die Spaltung einer Arg-Leu-Bindung im aminoterminalen Bereich der schweren Kette setzt ein Peptid mit 12 Aminosäuren frei. Siehe allgemein Gardiner & Griffin in PROGRESS IN HEMATOLOGY, Bd. XIII auf Seite 265- 278 (Brown, Grune und Stratton, Inc. 1983).
Mehrere Bereiche des Moleküls haben wichtige Auswirkungen auf die Funktion als Antigerinnungsmittel bei der Regulation der Hämostase. Der aminoterminale Abschnitt der leichten Kette enthält die neun γ-Carboxyglutaminsäure-(Gla)-Reste, die für eine calciumabhängige Membranbindung und eine funktionelle Aktivierung erforderlich sind. Eine weitere posttranslationale Modifikation ist die β-Hydroxylierung des Asparaginsäurerests 71, der möglicherweise für eine calciumabhängige Membranbindung erforderlich ist, die unabhängig von der Bindungsaktivität der Gla-Bereiche ist.
Es gibt eine Reihe von klinischen Situationen, bei denen sich Protein C als nützlich erweisen kann. Es kann als Ersatztherapie in homozygot defizienten Kindern dienen, die an Purpura fulminans neonatalis leiden. Andere Leiden umfassen Patienten mit einer vorangegangenen Krankengeschichte mit Warfarin-induzierter Hautnekrose, welche eine zusätzliche Warfarin-Therapie benötigen, Heparin-induzierte Thrombocytopenie, septischen Schock zur Verhinderung intravaskulärer Gerinnung und Organschädigung, und es läßt sich zur fibrinolytischen Therapie verwenden, da Protein C tPA vor Plasma-Inhibitorproteinen schützen kann. Tabelle 1 zeigt eine Abschätzung der Anzahl einzelner Fälle mit verschiedenen klinischen Syndromen, die sich durch gereinigtes Protein C behandeln lassen. Da bis vor kurzem nicht genug Material aus dem Plasma für klinische Studien verfügbar war, beruhen diese Daten notwendigerweise auf einer unvollständigen Bestimmung des therapeutischen Potentials für Protein C.
Das Gen für das menschliche Protein C wurde genauso wie das Protein-C-Gen aus Rind kloniert und sequenziert. Siehe Forster et al., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 82 : 4673 (1985); US-Patent Nr. 4 775 624. Es wird als inaktive Vorstufe synthetisiert, die während der Sekretions- und Aktivierungsprozesse mehrere Proteolyse-Ereignisse durchläuft. Zuerst wird eine Signalsequenz bei der Sekretion proteolytisch entfernt. Ein zweites Proteolyse-Ereignis entfernt das Dipeptid Lys156 Arg157, wobei das inaktive Zymogen erhalten wird, ein doppelsträngiges, über Disulfidbrücken gebundenes Protein, das aus einer leichten Kette mit 155 Aminosäuren und einer schweren Kette mit 262 Aminosäuren besteht. Das Zymogen wird durch ein letztes Proteolyse-Ereignis aktiviert, bei dem die Reste 158-169 entfernt werden. Hieraus geht das aktive Protein C hervor, eine Serinprotease mit leistungsfähiger gerinnungshemmender Aktivität, Beckmann et al., Nucleic Acids Res. 13 : 5233 (1985). TABELLE 1
Neben der proteolytischen Prozessierung durchläuft menschliches Protein C mehrere posttranslationale Modifikationen. Am herausragendsten unter diesen Modifikationen ist die γ- Carboxylierung der ersten neun Glutaminsäurereste in Protein C durch ein Vitamin-K-abhängiges Enzym. DiScipio & Davie, Biochemistry 18 : 899 (1979). Für die Antigerinnungsaktivität ist eine Gamma-Carboxylierung erforderlich, die mit einer Ca²&spplus;-abhängigen Membranbindung einhergeht. Die Anti- Gerinnungsaktivität von Protein C variiert direkt mit dem Ausmaß der γ-Carboxylierung, und die höchsten Aktivitätsgrade werden nur erzielt, wenn die γ-Carboxylierung der sechsten und siebten Glutaminsäurereste erfolgt. Zhang & Castellino, Biochemistry 29 : 10829 (1990).
Protein C wird zudem durch β-Hydroxylierung von Asparaginsäure 71 posttranslational modifiziert. Drakenberg et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 80 : 1802 (1983). Die Betahydroxylierung kann für die Protein-C-Aktivität wichtig sein. Seine Funktion ist zwar nicht bekannt, jedoch wird angenommen, daß es an der γ-Carboxyglutaminsäure-unabhängigen Ca²&spplus;- Bindung beteiligt ist. Es kann zudem für eine vollständige gerinnungshemmende Aktivität erforderlich sein.
Das menschliche Protein C ist ebenfalls glycosyliert. Kisiel, J. Clin. Invest. 64 : 761 (1979). Es enthält vier potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen, und zwar an den Stellen Asn97, Asn248, Asn313 und Asn329. Die ersten drei Signale entsprechen den Konsensusglycoslyierungssequenzen Asn-X-Ser/Thr und werden aktiv glykosyliert. Es gibt ein atypisches Glycosylierungssignal bei Asn329, Asn- X-Cys-Ser. Das Asn329-Signal ist in Protein C aus Rind glycoslyiert, jedoch ist bisher nicht bekannt, ob Asn329 in menschlichem Protein C glycosyliert ist. Miletich et al., J. Biol. Chem. 265 : 11397 (1990). Das Muster und das Ausmaß der Glycosylierung kann die physiologische Aktivität von Protein C verändern.
Bis vor Kurzem wurde menschliches Protein C für eine experimentelle und therapeutische Verwendung ausschließlich aus menschlichem Plasma gewonnen. Die Menge des aus menschlichem Serum gewinnbaren Proteins ist aber leider eingeschränkt. Zudem rufen Produkte, die aus menschlichem Serum stammen, Schwierigkeiten hinsichtlich Verläßlichkeit, Reinheit und Sicherheit hervor.
Die Expression therapeutischer Proteine durch DNS- Rekombinationstechnik ist eine interessante Alternative zur Plasmaproduktion von Protein C, und zwar dahingehend, daß sie die Gefahr einer potentiellen Kontamination mit aus dem Blut stammenden Viren eliminiert, und sie stellt theoretisch eine unerschöpfliche Quelle für das Produkt bereit. Die Komplexität der posttranslationalen Modifikationen, wie sie vorstehend erörtert sind, hat jedoch die Produktion kommerziell verwendbarer Mengen eines geeignet aktiven Protein C durch Expression in einem heterologen Wirt problematisch gemacht.
Es ist tatsächlich nicht möglich, Vitamin-K-abhängige Proteine, wie Protein C, in hinreichend großen Mengen in aktiver Form zu produzieren, trotz der Bemühungen, dies mit einer Reihe von Expressionssystemen zu erreichen. Siehe Grinnell et al., in Band 11 von ADVANCES IN APPLIED BIOTECHNOLOGY SERIES, Kapitel 3 (Gulf Publishing Co.). Insbesondere jede Aussicht, Protein C in den Brustdrüsen eines transgenen Tiers zu exprimieren und das Protein in die Milch zu sezernieren, siehe z. B. US-Patent Nr. 4 873 316 (1989), wird von der Tatsache überschattet, daß das Protein C gewöhnlich in der Leber produziert wird. Sogar die aus menschlicher Leber stammenden HepG2-Zellinien produzieren aberrante Formen von Protein C. Marlar & Fair (1985)
Diesbezüglich wurde beobachtet, daß eine Maus-Brustdrüsen- Epithelzellinie (C-127), die mit einem Papilloma-Virus- Vektor (BPV-Vektor) aus Rind, der die cDNS für menschliches Protein C trug, Protein C exprimierte, das nur zu 30 bis 40% aktiv war. Eine weitere Analyse ergab, daß das Protein C verminderte Mengen γ-Carboxyglutaminsäure und wenig, falls überhaupt, β-Hydroxyasparaginsäure enthielt. Suttie et al., Thrombosis Res. 44 : 129 (1986). Diese Experimente zeigen, daß die Maus-Brustdrüsen-Epithelzellen nicht sämtliche posttranslationalen Modifikationen durchführen können, die zur Gewinnung eines geeignet aktiven Protein C nötig sind. Dies wiederum läßt zweifeln, wie wahrscheinlich sich Protein C aus der Milch eines Säugetiers gewinnen läßt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, das in seiner Milch rekombinantes Protein C produziert, welches einen signifikant höheren Prozentsatz an aktivem Protein umfaßt, als bisher erreicht wurde.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Protein C in kommerziell nutzbaren Mengen mit Hilfe eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers.
Bei der Bewältigung der vorstehenden Aufgaben wurde gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein transgenes nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, das eine exogene DNS-Sequenz enthält, die stabil in seinem Genom integriert ist, wobei die exogene DNS-Sequenz einen Promotor umfaßt, der funktionsfähig an eine DNS-Sequenz gebunden ist, welche ein Polypeptid mit Protein-C-Aktivität und ein Signal-Peptid codiert, wobei der Promotor spezifisch in Brustdrüsenzellen, insbesondere Brustdrüsen-Epithelzellen aktiv ist, und das Signalpeptid bei der Steuerung der Sekretion des Protein C in die Milch des transgenen nichtmenschlichen Säugetiers wirkt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein Promotor aus saurem Molkenprotein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Protein C bereitgestellt, mit den Schritten
(A) Bereitstellen eines nicht-menschlichen transgenen Säugetiers, gekennzeichnet durch eine exogene DNS-Sequenz, die stabil in seinem Genom integriert ist, wobei die exogene DNS-Sequenz einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die ein Polypeptid mit Protein C-Aktivität und ein Signalpeptid codiert, wobei der Promotor in Milchdrüsenzellen spezifisch aktiv ist, und das Signalpeptid die Sekretion von Protein C in die Milch des transgenen Säugetiers steuert;
(B) Gewinnen von Milch aus dem transgenen Tier;
(C) Sammeln der Milch; und
(D) Isolieren des Polypeptids aus der Milch.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das transgene Säugetier eine Maus, ein Kaninchen, ein Schwein, ein Schaf, oder eine Ziege.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Produzieren von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren mit den Schritten
(A) Bereitstellen eines Gemischs, das ein genetisches Konstrukt enthält;
(B) Unterwerfen des Gemischs einer Anionenaustausch- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, so daß man ein gereinigtes genetisches Konstrukt enthält; und anschließend
(C) Mikroinjektion einer wäßrigen Pufferlösung, die das gereinigte genetische Konstrukt enthält, in einen nichtmenschlichen Tierembryo. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Schritt (B) das Auftragen des Gemisches auf eine Anionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Säule, das Eluieren des genetischen Konstrukts von der Säule und anschließendes Unterwerfen des genetischen Konstrukts einer zweiten Anionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachstehenden eingehenden Beschreibung ersichtlich.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung von WAPpCI, einem Konstrukt, das eine cDNS enthält, die menschliches Protein C codiert, und die in ein intaktes Gen für das saure Maus-Molkenprotein (WAP) an der einzigen Kpn1-Stelle inseriert ist.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Primerpaare für die Polymerasekettenreaktion (PCR), die sich zum Nachweisen von DNS für WAP-Protein C in transgenen Tieren eignen;
Fig. 3 zeigt ein Schaubild, das die Ergebnisse eines Enzymimmungssays (ELISA) von menschlichem Protein C in Milch aus einer transgenen Maus darstellt.
Fig. 4 zeigt ein Schaubild, das die Ergebnisse eines APTT- Assays zur Bestimmung der Anti-Gerinnungsaktivität von Protein C in Molke aus einer transgenen Maus darstellt.
Fig. 5 zeigt ein Schaubild, das die Ergebnisse der Ca²&spplus;- abhängigen und der Ca²&spplus;-unabhängigen ELISAs zum Einfangen von leichter Kette darstellt, welche zeigen, daß die γ- Carboxyglutaminsäure in menschlichem Protein C in Molke aus der transgenen Maus Y52 derjenigen in Protein C aus menschlichem Serum ähnelt.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Trotz der vergangenen Fehlschläge bei der Expression von rekombinantem Protein C mit geeignet hoher Aktivität in verschiedenen Expressionssystemen, einschließlich transformierten Brustdrüsenzellen, hat man entdeckt, daß sich rekombinantes Protein C, gekennzeichnet durch einen hohen Prozentsatz an aktivem Protein, aus der Milch von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren gewinnen läßt, die erfindungsgemäße DNS enthalten. Erfindungsgemäße transgene nicht-menschliche Säugetiere werden durch Einbringen von Protein-C-codierender DNS in entwickelnde Embryos hergestellt, so daß die DNS stabil in die DNS der Keimlinienzellen des reifen Tiers eingebracht wird und normal mendelnd vererbt wird.
Erfindungsgemäß kann DNS über eine Reihe von Maßnahmen in die Embryos eingebracht werden, so daß nicht-menschliche transgene Säugetiere erhalten werden. Totipotente oder pluripotente Stammzellen lassen sich z. B. durch Mikroinjektion, calciumphosphat-vermittelte Fällung, Liposomenfusion, Retrovirusinfektion oder durch andere Maßnahmen transformieren. Die transformierten Zellen lassen sich dann in Embryos einbringen und einbauen, so daß transgene nichtmenschliche Säugetiere erhalten werden. Bei einem bevorzugten Verfahren lassen sich wachsende Embryos mit Retrovirusvektoren infizieren, und aus den infizierten Embryos lassen sich transgene Tiere erhalten. Bei dem am meisten bevorzugten Verfahren werden die erfindungsgemäßen DNS in die Embryonen injiziert, vorzugsweise im Ein-Zell-Stadium, die sich dann in reife, nicht-menschliche transgene Säugetiere entwickeln können.
Geeignete Protein-C-codierende DNS, die derart zur Produktion von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren verwendet wird, läßt sich mit menschlichem Lebergewebe als Quelle zur Klonierung des hPC-Gens erhalten. Die Protein-Ccodierende DNS läßt sich im richtigen Leseraster mit geeigneten regulatorischen Signalen fusionieren, wie eingehender nachstehend beschrieben ist, so daß ein genetisches Konstrukt erhalten wird, das dann bspw. durch Vermehrung in einem Bakterienvektor gemäß herkömmlicher Praxis amplifiziert wird.
Das amplifizierte Konstrukt wird anschließend aus dem Vektor geschnitten und zur Verwendung bei der Mikroinjektion gereinigt. Die Reinigung erfolgt gewöhnlich mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), das das Konstrukt von der Verunreinigung aus dem Bakterienvektor und von Polysacchariden befreit, die gewöhnlich zugegen sind, wenn andere Verfahren, wie herkömmliche Agarose- Elektroelution, eingesetzt werden. Das bevorzugte HPLC- Verfahren umfaßt das Sorbieren des Konstrukts auf einen Anionenaustausch-HPLC-Träger und selektives Eluieren des Konstrukts von dem Träger, vorzugsweise mit einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung, wodurch die Verunreinigungen aus dem Vektor eliminiert werden. (Die Elution kann durch andere Maßnahmen erfolgen, wie mit einem pH-Wert-Gradienten). Alternativ, aber weniger bevorzugt, kann das ausgeschnittene Konstrukt durch Ultrazentrifugation durch einen wäßrigen Saccharosegradienten gereinigt werden.
Da das Konstrukt vorzugsweise eine Minimalmenge Verunreinigungen enthält, ist mehr als eine HPLC-Runde oder eine andere Reinigung vorteilhaft. Insbesondere die Verwendung von HPLC-gereinigter DNS zur Mikroinjektion, wie vorstehend beschrieben, ermöglicht bemerkenswert hohe Transformationsfrequenzen, und zwar in der Größenordnung von 20% oder mehr bei Mäusen und Schweinen.
Sämtliche milchproduzierenden Tiere, d. h. sämtliche nichtmenschlichen Säugetiere, eignen sich für den erfindungsgemäßen Gebrauch. Bevorzugte Säugetiere umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine, Schafe, Ziegen und Kühe, besonders bevorzugt Mäuse, Schweine, Schafe und Kühe und ganz besonders bevorzugt derzeit Mäuse, Schweine und Schafe.
Erfindungsgemäß geeignete DNS-Konstrukte stellen eine DNS- Sequenz bereit, die das Protein C codiert, welches funktionsfähig an sämtliche cis-wirkenden Signale gebunden ist, die für eine brustdrüsengewebespezifische Expression von Protein C, posttranslationale Modifikation von Protein C, Sekretion von Protein C in die Milch und eine vollständige biologische Aktivität von Protein C notwendig sind.
Erfindungsgemäß geeignete DNS umfassen genomische oder komplementäre DNS, die natürlich vorkommendes Protein C codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden DNS eingesetzt, die menschliches Protein C codieren, einschließlich cDNS und genomischen DNS. Protein-C-codierende DNS von anderen Arten lassen sich ebenfalls einsetzen, wie Protein C, das von Ratten, Schweinen, Schafen, Kühen und Schimpansen codiert wird.
Modifizierte Protein-C-Sequenzen können ebenfalls erfindungsgemäß eingesetzt werden. Geeignete Modifikationen in diesem Zusammenhang umfassen, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die die posttranslationale Prozessierung von Protein C verändern, die die Größe von Protein C verändern, die Protein C oder Bereiche davon mit Bereichen eines anderen Proteins fusionieren, oder die das aktive Zentrum von Protein C verändern. Bevorzugte Modifikationen umfassen diejenigen, die ein aktiviertes Protein C bereitstellen, und diejenigen, die Protein C in Abwesenheit von Thrombomodulin aktivieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden modifizierte Formen von menschlichem Protein C eingesetzt.
Diese Modifikationen lassen sich in Protein C durch Techniken einbringen, die im Fachgebiet bekannt sind, wie die Synthese modifizierter Gene durch Ligation überlappender Oligonukleotide, und durch Einbringen von Mutationen direkt in klonierte Gene, wie u. a. durch Oligonukleotidvermittelte Mutagenese. Die erfindungsgemäß geeigneten ciswirkenden regulatorischen Bereiche umfassen den Promotor, der zur Steuerung der Expression des Protein-C-Gens verwendet wird. Erfindungsgemäß geeignete Promotoren sind in Milchdrüsengewebe aktiv. Besonders geeignet sind Promotoren, die spezifisch in Milchdrüsengewebe aktiv sind, d. h. solche, die unter physiologischen Bedingungen, unter denen Milch synthetisiert wird, in Milchdrüsengewebe aktiver sind als in anderen Geweben. Ganz besonders bevorzugt sind Promotoren, die sowohl spezifisch für Milchdrüsengewebe sind als auch wirksam in Milchdrüsengewebe sind. "Wirksam" bedeutet, daß die Promotoren in Milchdrüsengewebe starke Promotoren sind, die die Synthese großer Mengen Protein für die Sekretion in die Milch fördern.
Von diesen Promotoren sind die Casein-, Lactalbumin- und Lactoglobulinpromotoren bevorzugt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die α-, β- und γ-Casein-Promotoren und die α-Lactalbumin- und β-Lactoglobolin-Promotoren. Bevorzugte Promotoren stammen aus Nagetieren (Maus und Ratte), Schweinen und Schafen, wie insbesondere der β-Casein- Promotor aus Ratte und der β-Lactoglobulin-Promotor aus Schaf. Die am meisten bevorzugten Promotoren regulieren ein Gen für ein saures Molkenprotein (WAP), und der am meisten bevorzugte WAP-Promotor ist der Maus-WAP-Promotor.
Für die Erfindung sind die Signalsequenzen ebenfalls wichtig, die die Sekretion des Proteins in die Milch des transgenen Tiers steuern. In dieser Hinsicht eignen sich sowohl endogene als auch heterologe Signalsequenzen für die Erfindung. Im allgemeinen sind die Signalpeptide der Proteine, die gewöhnlich in die Milch sezerniert werden, für die Erfindung geeignet. Die Signalsequenzen von Proteinen, die in hoher Konzentration in Milch vorkommen, sind besonders bevorzugt, wie die Signalpeptide der Caseine, Lactalbumine und Lactoglobuline, einschließlich aber nicht bechränkt auf Signalpeptide der α-, β- und γ-Caseine und α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin. Insbesondere ist die Signalsequenz von saurem Molkenprotein bevorzugt, und zwar ganz besonders die Signalsequenz des sauren Molkenproteins aus Maus.
Ebenfalls besonders bevorzugt sind die Signalpeptide sezernierter Gerinnungsfaktoren. In diesem Zusammenhang sind die Signalpeptide von Protein C und tPA besonders bevorzugt. Das Sekretionssignal von menschlichem Protein C ist am stärksten bevorzugt.
Von den Sequenzen, die die Transkription regulieren und erfindungsgemäß geeignet sind, sind u. a. neben den vorstehend erörterten Promotorsequenzen, Enhancer, Splicesignale, Transkriptionsterminationssignale und Polyadenylierungsstellen. Besonders geeignete regulatorische Sequenzen steigern die Effizienz der brustdrüsenspezifischen Expression von Protein C in transgenen Tieren.
Besonders geeignet in dieser Hinsicht sind die anderen regulatorischen Transkriptionssequenzen von Genen, die in hohen Mengen in Brustdrüsenzellen exprimiert werden, wie die α-, β- und γ-Caseingene und die vorstehend genannten α- Lactalbumin- und β-Lactoglobulingene. Bevorzugte Quellen für regulatorische Sequenzen in diesem Zusammenhang sind Nagetiere (Mäuse und Ratten), Schweine und Schafe. Beispiele für bevorzugte regulatorische Sequenzen sind diejenigen, die mit dem β-Casein-Gen aus Ratte bzw. dem β- Lactoglobulin-Gen aus Schaf assoziiert sind. Die für die erfindungsgemäße Verwendung am meisten bevorzugten regulatorischen Sequenzen sind mit den Genen für saure Molkenproteine assoziiert. Besonders bevorzugt in diesem Zusammenhang sind regulatorische Sequenzen des sauren Molkenproteins der Maus.
Unter den Sequenzen, die die Translation regulieren, sind neben den vorstehend erörterten Signalsequenzen Ribosomenbindungsstellen und Sequenzen, die die Stabilität der Protein-C-mRNS vergrößern. Besonders geeignet sind die regulatorischen Translationssequenzen von Genen, die in hohen Mengen in Brustdrüsenzellen exprimiert werden. Beispielsweise sind die regulatorischen Sequenzen der α-, β- und γ- Casein-Gene und der α-Lactalbumin- und β-Lactalbumin-Gene bevorzugt, insbesondere solche aus Nagetieren (Mäusen und Ratten), Schweinen und Schafen. Noch stärker bevorzugt sind die regulatorischen Sequenzen der Gene von β-Casein der Ratte und β-Lactoglobulin des Schafs. Die am stärksten bevorzugten erfindungsgemäßen translationsregulatorischen Sequenzen stammen von den Genen für das saure Molkenprotein und das Protein C. Die am stärksten bevorzugten regulatorischen Sequenzen stammen von dem sauren Molkeprotein der Maus und dem menschlichen Protein C, einschließlich menschlichen genomischen Protein-C- und menschlichen Protein-CcDNS-Konstrukten und einschließlich menschlichen Protein-CcDNS-Konstrukten, die Intronsequenzen enthalten.
Besonders für die vorliegende Erfindung geeignet sind Sequenzen, die die posttranslationalen Modifikationen von Protein C vorteilhaft modulieren, so daß das Protein C, das in den erfindungsgemäßen transgenen Tieren produziert wird, aktiv ist. Insbesondere sind die genomischen Sequenzen des menschlichen Protein-C-Gens bevorzugt. Erfindungsgemäß ist daher eine Protein-C-codierende DNS-Sequenz funktionsfähig an cis-wirkende regulatorische Sequenzen geknüpft, die eine effiziente Expression von Protein C in Milch ermöglichen. Die resultierende chimäre DNS wird in einen Säugetier- Embryo eingebracht, wo er in das embryonale Genom eingebaut wird und ein Bestandteil der vererbbaren genetischen Merkmale sämtlicher Zellen wird, einschließlich der Keimlinienzellen des Adulten, der sich aus dem Embryo entwickelt. Das im Brustdrüsengewebe exprimierte und in die Milch eines transgenen Säugetiers sezernierte Protein C, das auf diese Weise erhalten wird, zeigt einen überraschend hohen Prozentsatz an aktivem Protein, wie durch enzymatische und Gerinnungshemmungs-Assays gemessen wurde, die herkömmlich zum Nachweisen von Protein-C-Aktivität verwendet werden, wie ELISAs, Assays für die chromogene Aktivität und Gerinnungshemmungsassays. Mengen an aktivem Protein in der Größenordnung von 80% bis 90% oder mehr sind charakteristisch für das erfindungsgemäß exprimierte Protein C.
Die Gewinnung von Milch aus einem erfindungsgemäßen transgenen Tier wird durch herkömmliche Maßnahmen bewerkstelligt. McBurney et al., J. Lab. Cl in. Med. 64 : 485 (1964). Das in dieser Milch enthaltene Protein C läßt sich durch bekannte Maßnahmen ohne übermäßige Beeinträchtigung der Aktivität reinigen. Ein geeigneter Ansatz zur Reinigung für diesen Zweck ist Immunaffinitätschromatographie. Das exprimierte Protein C läßt sich alternativ aus der Milch durch andere herkömmliche Maßnahmen isolieren, zum Beispiel durch das Verfahren von Kisiel, J. Clin. Invest. 64 : 761 (1979). In jedem Fall wird das erfindungsgemäß in der Milch produzierte Protein C vorzugsweise sobald wie möglich nach der Gewinnung der Milch aus dem transgenen Säugetier isoliert, wodurch jegliche schädlichen Einwirkungen auf die Stabilität des Proteins vermindert werden.
Die Erfindung wird eingehend anhand der nachstehenden veranschaulichenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Zur Expression von Protein C in transgenen Tieren geeignete DNS
Das gesamte Maus-WAP-Gen, einschließlich 2,5 kb der 5'- untranslatierten Sequenz und der 3'-untranslatierten Bereiche, wurde von L. Hennighausen erhalten. Siehe Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12 : 8685 (1984). Die menschliche Placenta-cDNS für menschliches Protein C wurde von C. Shoemacker erhalten.
Standard-DNS-Rekombinationsverfahren wurden eingesetzt, um die Vektoren und Expressionskonstrukte der bevorzugten Ausführungsformen zu erzeugen, sowie für andere Manipulationen an der DNS verwendet, wie nachstehend erläutert ist. Siehe Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Bd. 1-3 (Cold Spring Harbor Press 1989).

(1) WAPpC1

Ein als WAPpC1 bezeichnetes DNS-Konstrukt wurde hergestellt, das aus dem gesamten Maus-WAP-Gen mit einer Kopie der menschlichen Protein-C-cDNS bestand, die an der einzigen Kpn1-Stelle, 24 Basenpaare 3' der Transkriptionsstartstelle des WAP-Gens eingebaut war (Fig. 1). Dieses WAP- Protein C-Konstrukt wurde zur Erleichterung weiterer Manipulation in einen Bluescribe-Vektor (Stratagene) ligiert.

(2) WAPpC2

WAPpC2 ähnelt WAPpC1 und umfaßt das gesamte WAP-Gen der Maus und menschliche Protein-C-cDNS, unterschiedet sich jedoch von WAPpC1 dadurch, daß die 5'-flankierenen Sequenzartefakte fehlen, die bei WAPpC1 als Ergebnis der Klonierungsverfahren vorhanden sind, die bei der Herstellung des Konstrukts verwendet wurden. Speziell wurden 33 bp 5' des ATG von Protein C und 118 "A's" am 3' -Ende der Protein-CcDNS durch PCR entfernt, und es wurden neue KpnI-Stellen am 5'- und 3'-Ende eingefügt.

Beispiel 2

Herstellung von DNS für eine Mikroinjektion DNS für die Mikroinjektion wurde gemäß den nachstehend für die DNS aus WAPpC1 beschriebenen Verfahren präpariert.
Das 9 kb WAPpC1-Fragment wurde aus dem Vektor mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten. Nach der Spaltung mit Eco- RI wurde die Lösung, die die WAPpC1-DNS enthielt, auf 10 mM Magnesium, 20 mM EDTA und 0,1% SDS eingestellt und dann mit Phenol/Chloroform extrahiert. DNS wurde aus der wäßrigen Schicht mit 2,5 Volumina Ethanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat bei -20ºC über Nacht gefällt. Nach der Fällung wurde das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet, und in sterilem destillierten Wasser resuspendiert.
Die DNS für die Mikroinjektion wurde über HPLC gereinigt. Die gespaltene DNS wurde mit Isopropanol gefällt und dann in TE-Puffer bei 0,3 ug/ml gelöst. Die Fragmente wurden durch HPLC mit einer Waters GEN FAX PAC HPLC-Säule gereinigt. Die Säule wurde isokratisch mit einem Puffer eingesetzt, der aus 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM Natrium- EDTA, und 0,63 M NaCl bestand. Dies ist die minimale NaCl- Konzentration, die das große Konstruktfragment eluiert und die beste Auflösung des kleineren Vektorfragments ergibt, das unmittelbar vor dem Konstruktfragment eluiert. Etwa 15 ug der gespaltenen DNS wurde auf einmal auf die Säule aufgetragen. Die Konstrukt-Fragment-Proben sämtlicher Chromatographie-Durchgänge wurden dann vereinigt, erneut gefällt, und ein zweites Mal durch die Säule geleitet. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse für Schweine und Mäuse wurden mit HPLC-gereinigter DNS erhalten.
Die DNS-Konzentrationen wurden durch Agarosegel- Elektrophorese durch Färben mit Ethidiumbromid und Vergleich der Fluoreszenzintensität eines Aliquots der DNS mit der Intensität von Standards bestimmt. Die Proben wurden dann auf 10 ug/ml eingestellt und bei -20ºC vor der Mikroinjektion eingestellt.

Beispiel 3

Transgene Tiere

(1) Mäuse

Transgene Mäuse wurden im wesentlichen nach dem von Hogan et al., MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO (Cold Spring Harbor Press 1986) beschrieben Verfahren hergestellt. Die verwendeten Verfahren sind nachstehend umrissen.
Glasnadeln für eine Mikroinjektion wurden mit einer Mikropipetten-Ziehvorrichtung und einer Mikroforge hergestellt. Die Injektionen erfolgten in einem Nikon-Mikroskop mit Hoffmann-Modulations-Kontrastoptik, mit Narashigi-Mikromanipulatoren und einem N&sub2;-getiebenen Pico-Injektor (Narashigi)
Fertilisierte Maus-Embryonen wurden aus den Eileitern von CD-1-Maus-Weibchen mit übermäßig schneller Ovulation chirurgisch entfernt und in M2-Medium überführt. Aus den Embryonen wurden Cumulus-Zellen mit Hyaluronidase bei 300 ug/ml entfernt. Die Embryonen wurden dann in frischem M2- Medium gespült und zur Aufbewahrung bei 37ºC vor der Injektion in M16-Medium überführt.
Nach dem Injizieren der DNS-Lösung in den männlichen Pronukleus wurden die Embryonen in mit Avertin anästhetisierte CD-1-Empfängerweibchen implantiert, indem sie mit vasektomierten Männchen pseudo-schwanger gemacht wurden. Die Embryonen konnten sich entwickeln, und die neugeborenen Mäuse wurden auf die Anwesenheit des Transgens wie nachstehend beschrieben analysiert.

(2) Schweine

Die Embryonen wurden aus dem Eileiter entnommen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 0,5 ml Embryonentransfermedium (phosphatgepufferte Salzlösung + 10% fötales Kälberserum, Gibco BRL) überführt. Sie wurden dann 12 min bei 16.000 · g RCF (13.450 U/min) in einer Mikrozentrifuge (Allied Instruments, Modell 235C) zentrifugiert. Die Embryonen wurden aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer gezogenen und polierten Pasteurpipette entnommen und in eine 35 mm Petrischale zur Untersuchung überführt. War das Cytoplasma aufgrund von Lipiden immer noch trüb, so daß die Pronuclei nicht sichtbar waren, wurden die Embryonen wiederum 15 min zentrifugiert. Die Embryonen für die Mikroinjektion wurden in einem Mikrotropfen Medium (etwa 100 ml) in die Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale überführt. Silikonöl wurde zum Bedecken des Mikrotropfens und zum Auffüllen des Deckels verwendet, um zu verhindern, daß das Medium verdampft. Der die Embryonen enthaltende Petrischalendeckel wurde unter ein Umkehrmikroskop (Carl Zeiss), das mit einer Heizstufe und Hoffman-Modulationsoptik (200fache Endvergrößerung) ausgerüstet war, gestellt. Eine feingezogene (Kopf Vertikale Pipetten-Ziehvorrichtung, Modell 720) und polierte (Narishige Microforge, Modell MF-35) Mikropipette wurde zur Stabilisierung der Embryonen verwendet, während etwa 1-2 Picoliter HPLC-gereinigte DNS-Lösung, mit etwa 200-500 Kopien DNS-Konstrukt in den männlichen Pronucleus mit einer weiteren fein gezogenen Mikropipette abgegeben wurde. Embryonen, welche das Mikroinjektionsverfahren überlebten, was durch morphologische Untersuchung bewertet wurde, wurden in ein Polypropylenröhrchen (2 mm ID) zum Überführen in das Empfänger-Schwein überführt.

(3) Andere Tiere

Verfahren zur Mikroinjektion anderer Tierarten ähneln den vorstehend beschriebenen Verfahren.

Beispiel 4

Bestimmung von WAP/hPC-Konstrukten in transgenen Tieren mittels PCR.

(1) Präparation von DNS aus transgenen Tieren

DNS läßt sich aus dem Gewebe eines transgenen Tiers irgend einer Art durch das für Mäuse beschriebene Verfahren präparieren.
Ein 5 mm großes Stück aus dem Mausschwanz wurde jungen potentiell transgenen Mäusen in der Entwöhnungsphase (3 Wochen Alter) entnommen, zerkleinert und mit Proteinase K und SDS bei 37ºC über Nacht behandelt. Das Gemisch wurde dann mit DNAse-freier RNAse bei 37ºC 1 bis 2 Stunden inkubiert. Die DNS wurde aus dem Gemisch mit Natriumacetat und Ethanol bei -20ºC über Nacht gefällt, durch Zentrifugation gesammelt, in 70%igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Das getrocknete DNS-Pellet wurde direkt in der PCR eingesetzt. Bei einigen Fällen wurde das Gemisch vor der Ethanolfällung ausgiebig mit Phenol/Chloroform extrahiert.

(2) Oligonukleotid-Sonden für den PCR-Assay

Oligonukleotid-Paare wurden zum Priming der Polymerasekettenreaktionen verwendet, die die Anwesenheit von WAP- Protein-C-Konstrukten in den transgenen Tieren erfaßten. Diese Paare und ihre Extensionsprodukte sind schematisch in Fig. 2 gezeigt. Oligonukleotid-Paare, die den Bereich der WAP-Sequenzen 5' der KpnI-Stelle überbrücken und die endogenen WAP-Sequenzen, die natürlicherweise 3' der KpnI- Stelle liegen, dienten ebenfalls als positive Kontrolle in Mäusen.

(3) PCR-Reaktionsbedingungen und Produktanalyse

Die PCR-Reaktionen wurden mit einer Annealing-Temperatur von 58ºC, einer Denaturierungstemperatur von 94ºC und einer Extensionstemperatur von 72ºC durchgeführt, wobei 100 ng Oligo-Primer und 50 ng (genomische) Matrizen-DNS pro Reaktion verwendet wurden. Es wurden 40 Zyklen bei diesen Temperaturen mit einem PCR-Gerät mit automatischer Temperaturumstellung (M. J. Research) durchgeführt.
Die PCR-Reaktionen wurden durch gelelektrophoretische Auftrennung von 20% der Reaktionsprodukte auf Agarosegelen und Identifizierung der Fragmentgrößen durch Vergleich mit DNS-Markerfragmenten analysiert.

(4) Ergebnisse der PCR-Analyse von transgenen Tieren

Die PCR-Analyse potentiell transgener Mäuse und Schweine, die sich aus Embryonen entwickelten, denen WAPpC1- und WAPpC2-Konstrukte mikroinjiziert wurden, sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß die WAPpC- Konstrukte häufig in die Embryonengenome von Mäusen und Schweinen integriert wurden. Bei 5 der 16 untersuchten Mäuse wurde eine mendelnde Übertragung beobachtet. TABELLE 2

Beispiel 5

Herstellung von Milch und Molke aus transgenen Tieren
(A) Mäuse: Laktierende Mäuse wurden im Durchschnitt dreimal die Woche gemolken. Die Mäuse wurden zuerst etwa 5 Stunden von ihren Jungen getrennt. Sie wurden dann mit 0,4 ml 2,5% Avertin (I. M.) anästhetisiert, und 0,2 ml Oxytocin wurden dann bei 2,5 IU/ml (I. P.) verabreicht, so daß die Milch freigesetzt werden konnte. Eine Melkvorrichtung, bestehend aus einer Vakuumpumpe (2,5 psi) und Spritze mit einer Eppendorf-Spitze wurde zum Überführen der Milch in ein Eppendorf-Röhrchen verwendet. Bei der Gewinnung wurde die Milch auf Eis gestellt, bis sämtliche Proben erhalten waren.
Zur Herstellung der Molke wurde die Milch 1 : 1 mit TS-Puffer (0,03 M Tris pH-Wert 7,4; 0,06 NaCl) verdünnt und in einem TLA-100-Rotor in einer Beckman TL-100 Tisch-Ultrazentrifuge bei 51.000 U/min (89.000 · g) 30 min bei 4ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen auf Eis überführt, und die Molke wurde mit einer 18 Gauge Nadel gesammelt, wobei das Casein-Pellet und die obere Sahne- Schicht im Rörchen belassen wurden. Zur Beseitigung der Festsstoffe oder der Sahne, die bei der anfänglichen Gewinnung mit überführt wurden, wurde die aus der ersten Zentrifugation gewonnene Molke einer zweiten Zentrifugation bei 12.000 U/min 30 min bei 4ºC in einem TMA-4-Rotor in einer Tomy MTX-150 Zentrifuge unterworfen. Nach der zweiten Zentrifugation wurden die Röhrchen auf Eis untergebracht, und die Molke wurde wie zuvor gewonnen.

Beispiel 6

ELISA-Bestimmung von Protein C, das von transgenen Tieren produziert war
Zur Messung der von den transgenen Tieren in ihrer Milch oder Molke produzierten Protein-C-Menge wurde ein ELISA verwendet. In den ELISAs wurden zwei monoklonale Antikörper, 7D7B10 und 12A8, und ein polyklonales Antiserum verwendet, und es konnte eine Reihe anderer Protein-Cspezifischer Antikörper eingesetzt werden. Der monoklonale Antikörper 7D7B10 ist spezifisch für den NH&sub2;-Terminus der leichten Kette von Protein C. 12A8 ist spezifisch für die reaktive Stelle auf der schweren Kette von Protein C. Mikrotiterplatten-Vertiefungen wurden über Nacht bei 4ºC mit 3 ug/ml monoklonalem Antikörper in 50 ul 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH-Wert 8,3, beschichtet. Die Vertiefungen wurden einmal mit TET-Puffer (0,01 M Tris, pH-Wert 7,5; 0,01 M EDTA; 0,02% Tween-20, pH-Wert 7,45) gewaschen und dann mit 1% BSA in PBS blockiert, wobei 400 ul pro Vertiefung für 1 Stunde bei 37ºC verwendet wurde. Die Platten wurden erneut mit TET-Puffer gewaschen (5x), gefolgt von der Zugabe von 100 ul Probenmolke oder normaler Molke, der menschliches Protein C aus dem Plasma zugesetzt worden war, so daß eine Standardkurve erzeugt wurde. Nach fünfmaligem Waschen mit TET-Puffer wurde an Kaninchen-anti-hPC konjugierte Meerrettichperoxidase (HRP), 1 : 1000 in 0,1% BSA/TET verdünnt, und 100 ul wurde in jede Vertiefung gegeben und 2 Std. bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 100 U/min inkubiert. Nach erneutem fünfmaligem Waschen mit TET-Puffer wurden 100 ul Orthophenyldiamin (ODP) von einer durch Lösen einer OPD-Tablette in 20 ml 0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer (pH-Wert 5,0) hergestellten Stammlösung in jede Vertiefung gegeben. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 1 N Schwefelsäure gestoppt. Das Ausmaß der Reaktion wurde durch Messen der Produktabsorption bei 490 nm bestimmt.
Das Ergebnis einer ELISA-Analyse der Milch von einer transgenen Maus (Maus Nr. 5) ist in Fig. 3 dargestellt. Es wurden Standardkurven für einen monoklonalen Antikörper, 12 AB, und einen polyklonalen Kaninchen-Antikörper erhalten, der gegen menschliches Protein C getitert wurde, das durch Immunaffinitätschromatographie über immobilisiertem 7D7B10- Antikörper erhalten wurde. Die Milchprobe, die der transgenen Maus Nr. 5 entnommen würde, enthielt etwa 200 ng/ml Protein C.
Zur Gewährleistung der korrekten Protein-C-Struktur, wie es durch Immunfangen durch zwei verschiedene monoklonale Antikörper, sowie durch ein polyklonales Gemisch der Antikörper bewertet wurde, wurden die Proben verschiedener transgener Mäuse durch ELISAs untersucht. Die Tabelle 2A zeigt im wesentlichen äquivalente Antigenmengen, wie es durch drei verschiedene Immunfang- und Nachweis-Durchläufe über ELISA untersucht wurde. Der Großteil der durch Mikroinjektion von WAPpC1 erhaltenen Mäuse produzierte Antigen-Mengen im Bereich von 1 bis 4 ug/ml. TABELLE 2A
Die Konzentration von menschlichem Protein C in aus transgenen Mäusen erhaltener Molke, sowie in Milch, wurde ebenfalls auf diese Weise bestimmt, wobei äquivalente Ergebnisse erhalten wurden.
Ähnliche Assays wurden routinemäßig zur Untersuchung von Protein C in Milch aus transgenen Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse, die mit dem 7D7B10-Antikörper in ELISAs zum Einfangen leichter Ketten erhalten werden, sind in Tabelle 3 aufgeführt, welche die Protein-C-Konzentration in Milch, die von transgenen Mäusen während der ersten vier Laktationsperioden erhalten wurden, zusammenfaßt. Striche zeigen an, daß kein Test erfolgte. Sämtliche Tiere ergaben signifikante Mengen Protein C in ihrer Milch. Vorläufige Ergebnisse zeigen auch, daß die zweite Laktationsperiode gelegentlich besser als die anderen untersuchten Perioden ist. TABELLE 3 hPC-ELISA-SCREENING (Einfangen der leichten Kette)
Menschliches Protein C in der Milch, das von anderen Arten erhalten wurde, ließ sich durch die gleichen Verfahren messen. Somit wurde Protein C aus menschlichem Plasma, das der Schweine-Milch zugesetzt wurde, genau über den vorstehend beschrieben ELISA gemessen.

Beispiel 7

Assay für die amidolytische Aktivität von Protein C mit dem chromogenen Substrat S-2366
Die Enzymaktivität von Protein C in der Milch transgener Tiere wurde direkt mit einem chromogenen Assay gemessen, der im wesentlichen in Odegaard et al., Haemostasis 17 : 109 (1989) beschrieben ist. Bei diesem Assay wurden Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit dem monoklonalen Antikörper 7D7B10 (50 ug/ml) in 50 ul 0,1 M Bicarbonat-Puffer, pH-Wert 8,6 bei 4ºC, über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann mit TET-Puffer (0,1 M Tris; 0,03 M EDTA; 0,05% Tween- 20) gespült, und mit 400 ul/Vertiefung 1% BSA in PBS blockiert und bei Raumtemperatur 1 bis 1,5 Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit TET-Puffer wurden 50 ul Molkeprobe und 50 ul 0,1 M Tris, pH 7,5, 0,03 M EDTA je Vertiefung zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 3 Mal in TET-Puffer gewaschen. Das gefangene menschliche Protein C wurde durch Zugabe von 120 ul ProtacTM, einem kommerziellen Reagenz, das ein Schlangengiftenzym enthält (12 ml destilliertes Wasser pro Gefäß), 30 ul TSP-Puffer und 0,1% BSA, pH-Wert 7,5 pro Vertiefung, aktiviert. Nach sechs- bis zehnminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 120 ul S-2366 (Kabi-Substrat) bei 25 mg/10,8 ml Tris, pH 7, 8 in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 2 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur oder mehrere Tage bei 4ºC inkubiert. Das Ausmaß der Protein-C- Aktivität in jeder Probe wurde durch Messen der Bildung des Reaktionsprodukts durch Absorption bei 405 nm bestimmt.
Die mit Milch und Molke aus einer transgenenen Maus und mit vereinigter Milch und Molke aus verschiedenen transgenen Mäusen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben, die die Menge und spezifische Aktivität von Protein C in den Proben zeigt. Man beachte, daß die Proben während der ersten Laktationsperiode L1 oder bei einer zweiten und dritten Laktation L2 und L3 erhalten wurden. Die in diesen Assays bestimmte spezifische Aktivität von menschlichem Protein C aus transgenen Mäusen, 205 Einheiten (Units) (U) pro mg, ähnelt der von menschlichem Protein C ähnlicher Reinheit aus natürlichen Quellen. (Eine "Einheit" ist definiert durch Vereinigen von Blut aus vielen Individuen und Bestimmen der Aktivität in 1 ml des vereinigten Bluts). TABELLE 4
* gepoolte Milch der Tage 5-15.
** L2 und L3 der Mäuse Y51, Y52, Y57, R03, R12.

Beispiel 8

Bestimmung von in transgenen Säugetieren produziertem Protein C durch den Gerinnungsassay zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit
Die Aktivität von Protein C wurde ebenfalls in einem Gerinnungszeit-Assay gemessen, nämlich dem Gerinnungsassay zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT). Bei diesem Assay erhielt jede Vertiefung in einem Coag-a-mate-Kunststoff-Behälter 90 ul PC-defizientes Plasma plus 10 ul eines APC-Standards oder einer unbekannten Probe, verdünnt mit Tris/Saline/BSA. Der Behälter wurde dann auf einen Automatikanalysator (APTT-Modus, 240 Sekunden Aktivierung) untergebracht. Der Lauf wurde begonnen, wodurch automatisch 100 ul APTT-Reagenz und 100 ul 0,025 M CaCl&sub2; dazu gegeben wurden. Die mit einer Standard-APC-Präparation erhaltenen Daten wurden an die Gleichung y - ax + b angeglichen, wobei y = Gerinnungszeit und x = APC, was dann zur ur Bestimmung der APC-Menge in der Probe verwendet wurde.
Das Ergebnis eines APTT-Assays von Molke, vereinigt aus transgenen Mäusen, ist in Fig. 4 gezeigt. Die Standardkurven in der Figur korrelieren die durch den APTT-Assay bestimmte Aktivität mit der Menge an aktivem menschlichen Protein C in Maus-Milch oder Maus-Molke. Die Aktivität im APTT-Assay der von der transgenen Maus erhaltenen Molkeprobe entsprach einer Konzentration von etwa 0,57 ug/ml, interpoliert von der Standard-Kurve für menschliches Protein C in Molke. Ein ELISA (nicht gezeigt) der gleichen Molkeprobe erfaßte etwa 0,60 ug/ml menschliches Protein C, als Protein. Innerhalb des normalen Fehlerbereichs dieser Assays ist in transgenen Mäusen produziertes menschliches Protein C so aktiv wie das als Kontrolle verwendete menschliche Protein C.

Beispiel 9

Kartieren eines calciumabhängigen Konformationsisomers durch metallabhängige Immunoaffinität
Standard-ELISAs wurden in normaler Mausmilchmolke mit verschiedenen Konzentrationen hPC oder hPC ohne Gla-Bereiche in Gegenwart von 25 mM EDTA durchgeführt. Nach dem Einfangen von 7D7B10 wurde ein Assay, der dies wiederholte, mit 25 mM EDTA durchgeführt, mehrmals mit 25 mM CaCl&sub2; gewaschen, und anschließend erfolgte das vorher beschriebene ELISA-Nachweis-Protokoll. Das de-Gla-Protein blieb zwar an den Einfang-Antikörper in Gegenwart von CaCl&sub2; gebunden, nicht aber der PC-Standard. Es wurde beobachtet, daß sich Molke aus der transgenen Maus Y57 ähnlich zum ycarboxylierten nativen PC verhielt. Dies läßt darauf schließen, daß es ebenfalls γ-carboxyliert ist, wie das native Molekül.

Beispiel 10

Reinigung von menschlichem Protein C aus der Milch transgener Tiere

(1) Herstellung von Molkeproben

Die Milch aus mehreren transgenen WAPpC1-Mauslinien wurde vereinigt, auf Eis gekühlt, 6fach mit 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl pH 7,2 (TBS) (1 ml Milch pro 5 ml TBS) verdünnt und bei 125.000 · g 30 min bei 4ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Molke mit einer Pasteurpipette gesammelt und vereinigt, wobei man sorgfältig darauf achtete, daß die Fettschicht oder das Casein-Pellet nicht zerstört wurden. Aus dem Pool wurden Proben zum späteren Testen entnommen, und die Proben und die vereinigte Molke wurden eingefroren und bei -90ºC aufbewahrt. Menschliches Protein C in den Proben wurde durch ELISA, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Einzelne Molkepools wurden bei 2ºC aufgetaut, vereinigt, und die Menge menschliches Protein C (hPC) im vereinigten Pool wurde durch ELISA bestimmt, wobei der monoklonale Antikörper (MAb) 7D7B10 verwendet wurde. Der vereinigte Pool enthielt etwa 30 ug hPC, bestimmt durch diesen Assay, was innerhalb von 20% der Gesamtmenge lag, die durch Addieren der Bestimmungen der einzelnen Pools lag.
Der vereinigte Pool, etwa 150 ml, wurde gegen Sfach mit reinem Wasser verdünntes 25 mM EDTA-TBS dialysiert (140.000 MW-Ausschlußgrenze). Die dialysierte Molke wurde durch Lyophilisation eingeengt und anschließend mit nanoreinem Wasser wieder verdünnt, so daß eine endgültige Pufferkonzentration, die äquivalent zu 25 mM EDTA in TBS war, sowie ein 5facher Anstieg der Proteinkonzentration erhalten wurde. Die eingeengte Molke enthielt 930 mg Protein, was durch optische Absorption bei 280 nm bestimmt wurde, bei 16 mg/ml.

(2) Immunoaffinitätschromatographie

Das Harz-Immunsorptionsmittel (AffiprepTM), das zur Reinigung von menschlichem Protein C in der Molke transgener Mäuse verwendet wurde, enthielt 3,3 mg 7D7B10 Mab/ml Affiprep-Harz. Das 7d7B10-Affiprep-Harz wurde durch Kontroll- Immunreinigung mit 30 ug aus Plasma stammendem hPC durchgeführt, das der Molke von (nicht transgenen) Kontroll-Mäusen zugesetzt wurde. Etwa die gleiche relative Menge Gesamtprotein wurde auf die Säule geladen (660 mg auf einer 10 ml Affiprep) und ansonsten wie nachstehend beschrieben verarbeitet.
Frisch eingeengte Molke (16 mg/ml, 930 ml Gesamtprotein gemäß Bestimmung durch optische Absorption bei 280 nm) wurde auf 13 ml 7D7B10-Affiprep mit 3,3 mg 7D7B10 Mab/ml Harz 4 Stunden bei 2ºC chargenweise geladen, ohne daß Carrierprotein zugegeben wurde. Die Säule war frisch und die hohe Gesamt-(Hintergrund-)Protein-Beladung wurde für ausreichend angesehen, um die Säule zu konditionieren. Das Harz wurde dann in eine Säule mit 1 cm Durchmesser geladen und mit 25 mM EDTA-TBS gewaschen, bis eine optische Dichte (OD) des 1-Untergrunds bei 280 nm erfaßt wurde (3 Säulenvolumina, um < 0,0005 O. D. zu erhalten).
Die Säule wurde dann mit 25 mM CaCl&sub2; in TBS, pH 7,2, anschließend mit 100 mM CaCl&sub2; in TBS, danach mit 4 M NaCl, danach mit 2 M Na-Thiocyanat bei 0,5 ml/min Eluiert. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina 25 mM EDTA-TBS, 0,02% Natriumazid reäquilibriert.
Sämtliche Peak-Pools wurden in einer 100fachen Verdünnung (in nanoreinem Wasser) von 50 mM Imidazol, 0,1 M NaCl- Puffer mit einem Dialyse-Schlauch mit 14.000 MW Ausschlußgrenze dialysiert, anschließend lyophilisiert und dann unter Verwendung von nanoreinem Wasser auf eine Pufferstärke von 50 mM Imidazol, 0,1 M NaCl eingestellt, was eine 100fache Konzentrierung des Proteins ergab.
Proben dieser Eluatpoolkonzentrate wurden entsprechend dem Verfahren von Laemmli (1970) hergestellt, auf ein 9 · 2 cm großes 4% Stapelgel mit 15 Probentaschen über einem 7,5% Trenngel, (30% : 2,7% bis) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt (SDS- PAGE). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 1,25% Coomassie-Blau-Färbelösung gefärbt.
Die Fläche der Eluat-Peaks, die aus der Immunreinigung von Molke aus WAPpC1-transgenen Mäusen erhalten wurden, ähnelte sehr dem Kontrollversuch mit einer äquivalenten. Menge (aus dem Plasma stammender) Molke aus Kontrollmäusen, der hPC zugesetzt war. Ein Assay von 100fach konzentriertem 25 mM CaCl&sub2;-Eluatprodukt aus WAPpC&sub1;-transgenen Mäusen zeigte eine 40%ige Ausbeute auf der Basis der Densitometrie der SDS- PAGE, gefärbt mit Coomassie-Blau (Ausbeute nicht für die Kontroll-Reinigung bestimmt). Die Gesamt-Peakflächen von Kontroll- und WAPpC1-Molke waren bei sämtlichen. Eluat-Peaks nahezu gleich, einschließlich des 2 M Na-Thiocyanat-Peaks. Etwa 2 ug hPC-Antigen (ELISA mit Immun-Fangen mittels 7D7B10) wurde im Säulendurchlauf nachgewiesen, der mit der EDTA-TBS-Wäsche kombiniert wurde. Etwa 14 ug hPC wurde im 25 mM Ca²&spplus;-Eluat-Pool, weniger als 0,1 ug hPC-Antigen im 100 mM Ca²&spplus;-Eluat-Pool nachgewiesen, kein hPC-Antigen wurde im 4 M NaCl-Pool, etwa 10 ug hPC im 2 M Na-Thiocyanat- Eluatpool nachgewiesen. Somit waren 87% des auf die Säule aufgetragenen hPC-Antigens verantwortlich für das gesamte Antigen, das von den Säuleneluaten gewonnen wurde. Es wurde eine 47%ige Antigenausbeute auf der Basis des hPC-Antigens erhalten, das im 25 mM Ca²&spplus;-Eluat-Peak gewonnen wurde.
Die auf die Säule aufgetragene Ausgangsmolke, das 2 M Natriumcyanat-Eluat, das 25 mM Ca²&spplus;-Eluatprodukt und ein Bezugs-hPC, das aus Plasma vom Amerikanischen Roten Kreuz stammte (Lot #28300277, zur Verfügung gestellt von Dr. Carolyn Orthner), wurden durch SDS-PAGE analysiert, nämlich und nicht reduziert. Der 2M Natriumthiocyanat- und der 25 mM Ca²&spplus;-Eluatpool wurden wie oben beschrieben eingeengt, und 4 ug Antigen auf das Gel in jeder Spur aufgetragen. Die immungereinigte hPC-Bezugsprobe wurde auf das Gel als 4 ug Gesamtprotein, bezogen auf die O. D, bei 280 nm, aufgetragen. Eine Rasterdensitometrie dieses Bezugs-hPC ergab, daß die Probe auf einer nichtreduzierenden SDS-PAGE mehr als 99% rein war, und auf einer reduzierenden SDS-PAGE 71% rein war. Anschließenden, mit dem hPC-Bezugsmaterial durchgeführten Antigen-Assays zufolge ist die Konzentration der Probe derart, daß nur 2,7 ug der Bezugsprobe auf das Gel aufgetragen wurde. Das 25 mM Ca²&spplus;-Eluatprodukt ist mehr als 94% rein auf der Basis der nichtreduzierenden SDS-PAGE und 86% rein auf der Basis der reduzierenden SDS-PAGE. Die Färbeintensität der 25 mM Ca²&spplus;-Eluat-Spuren entspricht unseren vorhergegangenen Erfahrungen mit Auftragsmengen von 4 ug Antigen. Die Banden, die der Bezugs-hPC entsprachen, besaßen gegenüber dem 25 mM Ca²&spplus;-Eluat eine geringere Intensität. Eine leicht aufgeteilte Bande bei etwa 62.000 relativem Molekulargewicht (Mr) wird für die nicht reduzierte Bezugs-hPC und das 25 mM Ca²&spplus;-Eluat beobachtet. Ein Dublett bei etwa 40.000 Mr und eine diffuse Einzelbande bei 22.000 Mr wird für das reduzierte Bezugs-hPC und das 25 mM Ca²&spplus;- Eluat beobachtet. Die beim Bezugs-hPC auftretende Bande bei 22.000 Mr ist etwas diffuser oder heterogener als die ähnliche Bande, die im 25 mM Ca²&spplus;-Eluat der Molke transgener Mäuse erscheint. Der Natriumthiocyanat-Peak zeigte eine Bande über 180.000 Mr in der nicht-reduzierten Probe und mehrere Banden bei 50.000 Mr und 25.000 Mr in der reduzierten Probe.
Die Chromatographie der WAPpC1-Molke war nahezu identisch zum Kontrollauf mit aus Plasma stammendem hPC, das Kontroll-Molke zugesetzt wurde. Die Gesamtflächen und Ausbeuten von hPC in den 25 mM Ca²&spplus;-Eluaten und die Flächen der 2 M Thiocyanat-Peaks waren bei beiden Läufen ähnlich, und somit waren die Bindungseigenschaften der 7D7B10-MAb auf transgenem hPC oder aus Plasma stammendem hPC ähnlich. Dies stimmt mit der Ähnlichkeit überein, die zwischen den plasmastämmigen und den transgenen hPC-Ca²&spplus;-abhängigen Konformationsisomeren über ELISA-Assays unter Verwendung des 7D7B10-Mab zum Immun-Fangen aus Molke gefunden wird. Die Primärstruktur gemäß SDS-PAGE scheint ähnlich zu sein, wobei die Menge der schweren Kette der α-Form und der β-Form für plasmastämmiges und transgenes hPC im wesentlichen gleich ist. Das transgene hPC hat 68% α-Form und 32% β- Form, wohingegen das plasmastämmige Material 69% α-Form und 31% β-Form aufwies. Die leichten Ketten hatten ebenfalls eine ähnliche Größe bei Bezugs- und transgenem hPC. Vorhergehende Erfahrungen mit SDS-PAGE unter Färbung mit Coomassie-Blau von hPC ergaben eine Linearität für beide Ketten über den Bereich von 2-5 ug hPC, die auf das Gel aufgetragen wurden. Viele Elemente der posttranslationalen proteolytischen Prozessierung im Brustdrüsengewebe schienen somit korrekt erfolgt zu sein.
Die Reinheit dieser Läufe zeigt ebenfalls die zufriedenstellende Verwendbarkeit des für das Maussystem entwickelten Immunreinigungsverfahrens. Es wird angenommen, daß die feste Bindung des hPC-Antigens, ermittelt durch ELISA im 2 M-Thiocyanat-Peak der Molke aus transgenen Mäusen (Assay erfolgte nicht beim Kontrollauf), typisch ist für die Ausbeuten für frische Immunsorptionsmittel und nicht auf aberranter hPC-Struktur beruhen. Das Gesamt-Hintergrund-Protein schien die Säule nicht zu konditionieren. Man nimmt daher an, daß die Wechselwirkung mit dem 7D7B10 MAb spezifisch ist. Insgesamt ergibt dieses Zweischrittverfahren einen minimalen Reinigungsfaktor von 27.000 für das aus Mausmilch gewonnene hPC. Ein groß angelegtes Reinigungsverfahren könnte eine Citrat- oder EDTA-Fällung einsetzen, gekoppelt an eine langsame Zentrifugation anstelle des bei Mausmilch eingesetzten Ultrazentrifugationsschritts.
Amidolytische und Gerinnungshemmungs-Assays wurden mit immungereinigter Milch aus transgenen Mäusen durchgeführt. Innerhalb der Empfindlichkeit dieser Assays war die amidolytische und die Anti-Gerinnungsaktivität genauso groß wie bei immungereinigtem Protein C aus dem Plasma. Bei beiden Assay-Typen war die spezifische Aktivität größer als 270 U/mg.

Claims

1. Nicht-menschliches transgenes Säugetier, das eine exogene DNS-Sequenz enthält, die stabil in seinem Genom integriert ist, wobei die exogene DNS-Sequenz einen Promotor aufweist, der wirksam mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die für ein Polypeptid mit Protein-C-Aktivität und ein Signal-Peptid codiert, wobei der Promotor in Milchdrüsenzellen spezifisch aktiv ist und das Signal-Peptid zur Lenkung der Sekretion von biologisch aktivem Protein C in die Milch des transgenen Säugetiers wirksam ist, und wobei die Aktivität etwa 80% bis etwa 100% der Aktivität von menschlichem Protein C gemäß einem üblichen Assay der Protein-C- Aktivität beträgt.

2. Transgenes Säugetier nach Anspruch 1, wobei das Assay ein Assay der Anti-Gerinnungsaktivität von Protein C ist.

3. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein Casein-, Lactalbumin- oder Lactoglobulin-Promotor ist.

4. Transgenes nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei der Promotor ein Promotor von saurem Molkenprotein ist.

5. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid menschliches Protein C ist.

6. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Säugetier eine Maus, Eine Ratte, ein Hase, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege oder eine Kuh ist.

7. Verfahren für die Herstellung von Protein C, das die folgenden Schritte umfaßt:

(A) Bereitstellen eines nicht-menschlichen transgenen Säugetiers, gekennzeichnet durch eine exogene DNS-Sequenz, die stabil in seinem Genom integriert ist, wobei die exogene DNS-Sequenz einen Promotor aufweist, der wirksam mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die für ein Polypeptid mit biologischer Protein-C-Aktivität und ein Signal-Peptid codiert, wobei der Promotor in Milchdrüsenzellen spezifisch aktiv ist und das Signal-Peptid zur Lenkung der Sekretion von biologisch aktivem Protein C in die Milch des transgenen Säugetiers wirksam ist, und wobei die Aktivität etwa 80 bis etwa 100% der Aktivität von menschlichem Protein C gemäß einem üblichen Assay der Protein-C-Aktivität beträgt,

(B) Gewinnen von Milch aus dem transgenen Säugetier,

(C) Sammeln der Milch, und

(D) Isolieren des Polypeptids aus der Milch.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Assay ein Assay der Anti-Gerinnungsaktivität von Protein C ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der Promotor ein Casein-, Lactalbumin- oder Lactoglobulin-Promotor ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der Promotor ein Promotor von saurem Molkenprotein ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Polypeptid menschliches Protein C ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Säugetier eine Maus, eine Ratte, ein Hase, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege oder eine Kuh ist.