DE69230146T2 - Monoklonale antikörper gegen putative hcv-e2/ns1-proteine und verfahren zu ihrer verwendung - Google Patents
Monoklonale antikörper gegen putative hcv-e2/ns1-proteine und verfahren zu ihrer verwendungInfo
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Antikörper, welche spezifisch an Hepatits C Virus (HCV) binden, und genauer, auf eine Reihe ["panel"] von neuartigen Hybridomzellinien, welche monoklonale Antikörper ausscheiden, welche spezifisch an das putative HCV-Protein E2/NS1 binden, und Verfahren zur Verwendung dieser monoklonalen Antikörper.
- Beschreibungen von Hepatitiserkrankungen, welche Gelbsucht und Icterus verursachen, sind der Menschheit seit der Antike bekannt. Es ist heute bekannt, daß die virale Hepatitis eine Gruppe viraler Erreger mit unterscheidungskräftigen viralen Organisationsproteinstrukturen und Replikationsmodi umfaßt, welche Hepatitis mit unterschiedlichen Schweregraden der Leberschädigung über unterschiedliche Übertragungswege hervorruft. Die akute virale Hepatitis wird klinisch durch gut definierte Symptome der Patienten einschließlich Gelbsucht, Weichheit der Leber und ein erhöhtes Niveau von Lebertransaminasen wie etwa Aspartattransaminase und Alanintransaminase diagnostiziert.
- Derzeit werden serologische Assays verwendet, um weiter zwischen Hepatitis A und Hepatitis B zu unterscheiden. Non-A Non-B Hepatitis (NANBH) ist ein Ausdruck, der zuerst 1975 verwendet wurde, welcher Fälle von Hepatitis nach Transfusionen beschrieb, die weder durch den Hepatitis A Virus noch durch den Hepatitis B Virus verursacht worden waren. Feinstone et al., New Engl. J. Med. 292: 454-457 (1975). Die Diagnose der NANBH wurde primär durch das Mittel des Ausschlusses auf Basis von serologischen Analysen für die Anwesenheit von Hepatitis A und Hepatitis B gestellt. NANBH ist für etwa 90% der Fälle von Heptatitis nach Transfusion verantwortlich. Hollinger et al. in N. R. Rose et al., Verleger, Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 558-572 (1986).
- Versuche, das NANBH-Virus zu identifizieren über den Weg der genomischen Ähnlichkeit zu einem der bekannten Hepatitis Viren haben bislang versagt, was darauf hinweist, daß das NANBH-Virus eine unterschiedliche genomische Organisation und Struktur besitzt. Fowler et al., J. Med. Virol. 12: 205-213 (1983), und Weiner et al., J. Med Virol, 21: 239-247 (1987). Der Fortschritt bei der Entwicklung von Assays zum Nachweis von Antikörpern, welche spezifisch sind für NANBH, wurde beinträchtigt durch Schwierigkeiten bei der Identifizierung von Antigenen, die mit dem Virus assoziiert sind. Wards et al., U. S. Patent Nr. 4,870,076; Wards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6608-6612 (9186); Ohori et al., J. Med. Virol. 12: 161-178(1983); Bradley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6277-6281 (1987); Akatsuka et al., J. Med. Virol. 20: 43-56 (1986).
- Im Mai 1988 führte eine gemeinsame Anstrengung der Chiron Corporation mit den Center for Disease Control zur Identifizierung eines mutmaßlichen NANB-Erregers, dem Hepatitis C Virus (HCV). M. Houghton et al. klonten und exprimierten in E.coli einen NANB-Erreger, der aus dem infektiösen Plasma eines Schimpansen erhalten wurde. Kuo et al., Science 244: 359-361 (1989); Choo et al., Science 244: 362-364 (1989). cDNA (DNA Kopien) Sequenzen aus HCV wurden identifiziert, welche Antigene kodieren, die immunologisch mit Antikörpern reagieren, die bei einer Mehrzahl jener Patienten vorhanden sind, die die klinische Diagnose NANBH aufweisen. Basierend auf den verfügbaren Informationen und auf der molekularen Struktur des HCV, besteht die genetische Ausstattung des Virus aus einer linearen einzelsträngigen RNA (positiver Strang) von einem Molekulargewicht von etwa 9,5 kb, und die ein fortlaufendes translationales offenes Leseraster besitzt. J. A. Cuthbert, Amer. J. Med. Sci. 299: 346-355 (1990). Es ist ein kleines umhülltes Virus, was den Flaviviren ähnelt. Forscher haben Versuche unternommen, den NANB-Erreger durch ultrastrukturelle Veränderungen der Hepatocyten bei infizierten Individuen zu identifizieren. H. Gupta, Liver 8: 111-115 (1988); D. W. Bradley J. Virol. Methods 10: 307-319 (1985). Ähnliche ultrastrukturelle Veränderungen der Hepatocyten wie auch PCR verstärkte HCV RNA-Sequenzen wurden nachgewiesen bei NANBH-Patienten wie auch bei Schimpansen, welche experimentell mit infektiösem HCV-Plasma infiziert wurden. T. Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6441-6444 (1990).
- Es wurden beachtliche serologische Hinweise gefunden, die implizieren, daß HCV der etiologische Erreger der NANBH nach Transfusion ist. H. Alter et al., N. Eng. J. Med. 321: 1494-1500 (1989); Estaben et al., The Lancet: Aug. 5: 294-296 (1989); C. Van Der Poel et al., The Lancet Aug. 5: 297-298 (1989); G. Sbolli, J. Med. Virol. 30: 230-232 (1990); M. Makris et al., The Lancet 335: 1117-1119 (1990). Obwohl der Nachweis von HCV- Antikörpern 70 bis 80% des NANBH infizierten Blutes aus dem Blutversorgungssystem eliminiert, werden die Antikörper wohl eher dann problemlos nachgewiesen, wenn die Erkrankung ein chronisches Stadium erreicht, wogegen nur 60% der Proben aus dem akuten NANBH-Stadium HCV-Antikörper positiv sind. H. Alter et al., New Eng. J. Med. 321: 1994-15000 (1989). Diese Daten zeigten klar die Notwendigkeit zur Identifizierung zusätzlicher HCV- Proteine zur wirksamen Serodiagnose von HCV-Infektionen. Nach dem Klonen und der Expression der strukturellen Proteine CORE und 33C, wurden Antikörperassays der zweiten Generation entwickelt, welche HCV CORE und 33C Proteine verwenden, zusätzlich zu C-100, zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV bei NANB-Patienten. Obwohl die Assays der zweiten Generation eine signifikant erhöhte Nachweissensitivität besitzen, führen das verlängerte Intervall zwischen der HCV-Exposition und dem Antikörpernachweis, und das Fehlen von adäquater Information hinsichtlich des Profils der Immunantwort gegen zahlreiche strukturelle und nicht strukturelle Proteine, zu Fragen hinsichtlich des infektiösen Stadiums des Patienten in der Antikörper negativen Phase während einer NANBH-Infektion. Daher besteht ein Bedürfniss zur Entwicklung von Assaysystemen zur Identifizierung einer akuten Infektion mit HCV und der Anwesenheit von HCV.
- Als weiteren Hintergrund zu der vorliegenden Erfindung beschreiben M. Houghton et al., in WO-A-90/11089 HCV-Peptide, einschließlich Peptiden, welche Epitope enthalten, die zu dem Hüllbereich gehören und welche nützlich sind für HCV-Diagnostika und Impfstoffe. Monoklonale Antikörper gegen solche Peptide sind beschrieben.
- AU-A-68390/90, die der EP-A-0 445 423 entspricht, beschreibt Peptide, welche zumindest ein Epitop eines HCV-Antigens enthalten, und die Verwendung solcher Peptide in Assayverfahren zum Nachweis von HCV-Antikörpern.
- Die vorliegende Erfindung liefert eine Reihe von hochspezifischen und neuartigen monoklonalen Antikörpern, die zum Nachweis von mutmaßlichen HCV E2/NS1 Antigenen verwendet werden können. Die monoklonalen Antikörper binden spezifisch an Proteinsequenzen, die aus dem mutmaßlichen HCV E2/NS1 Gen abgeleitet sind. Die Hybridome, welche diese monoklonalen Antikörper produzieren, sind wie folgt identifiziert: Hybridom H13C113 (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. HB 10857) und Hybridom H23C163 (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. HB 10856).
- Die Spezifität dieser monoklonalen Antikörper ermöglicht die vorteilhafte Identifizierung von HCV-Antigen in dem mutmaßlichen E2/NS1 Bereich, wobei diese Identifizierung nützlich sein kann bei Unterscheidungsstudien wie auch bei der Diagnose und Beurteilung von HCV (NANB) Infektionen.
- In einem bevorzugten Assayformat, wird eine Testprobe, welche HCV-Antigene enthalten kann, mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, an welche ein polyklonaler oder ein monoklonaler anti- HCV E2/NS1 Antikörper oder ein Fragment davon angebunden wurde, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird eine Zeit lang und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, damit sich Antigen/Antikörperkomplexe bilden. Die so gebildeten Komplexe werden dann mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon umfaßt, der für das HCV-Antigen spezifisch ist, der an eine signalerzeugende Verbindung angebunden ist, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite Mischung wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen umgesetzt, welche ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörperkomplexe zu bilden. Entweder der Antikörper, der an die feste Phase angebunden ist, oder jener Antikörper, der an die signalerzeugende Verbindung angebunden ist, ist ein monoklonaler Antikörper, der von einer Hybridomzellinie ausgeschieden wird, gewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben identifizierten hinterlegten Hybridomen. Das Vorhandensein des HCV-Antigen wird bestimmt durch den Nachweis des erzeugten meßbaren Signals. Die Menge des HCV, das in der Testprobe vorhanden ist, und somit die Menge des HCV- Antigens, das auf der festen Phase eingefangen wird, ist proportional zu der Menge erzeugten Signals.
- Alternativ wird entweder (1) eine Indikatorreagenzie, die einen monoklonalen Antikörper, oder ein Fragment davon, der für HCV E2/NSl Antigen spezifisch ist, und die eine signalerzeugende Verbindung umfaßt, zu einem polyklonalen anti-HCV-Antikörper oder Fragment davon, der auf eine feste Phase aufgezogen ist und zu der Testprobe zugegeben, um eine Mischung zu bilden oder es wird (2) ein Indikatorreagenz, das einen polyklonalen Antikörper, der für HCV E2/NS1 Antigen spezifisch ist, oder ein Fragment davon und eine signalerzeugende Verbindung umfaßt, zu einem monoklonalen anti-HCV-Antikörper oder Fragment davon, der auf eine feste Phase aufgezogen ist, und der Testprobe hinzugefügt, um eine Mischung zu bilden. Der monoklonale Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper der von einer Hybridomzellinie ausgeschieden wird, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus den oben identifizierten hinterlegten Hybridomen besteht. Diese Mischung wird eine Zeit lang und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörperkomplex zu bilden. Das Vorhandensein und die Menge von HCV, die in der Testrobe vorhanden sind, und somit die Menge von HCV-Antigen, das auf der festen Phase eingefangen wird, wird festgestellt durch den Nachweis des meßbaren Signals. Die Menge des HCV, welches in der Testprobe vorhanden ist, ist proportional zu der Menge erzeugten Signals.
- Das Vorhandensein von HCV E2/NS Antigen kann in einer Gewebeprobe nachgewiesen werden, indem die Gewebeprobe in Kontakt gebracht wird mit einer Indikatorreagenzie, die eine signalerzeugende Verbindung, angebunden an einen monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet, oder ein Fragment davon, umfaßt, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird inkubiert für eine Zeit und unter Bedingungen, welche ausreichend sind, damit sich Antigen/Antikörperkomplexe bilden. Das Vorhandensein von HCV E2/NS1 Antigen; welches in der Gewebeprobe vorhanden ist, wird festgestellt durch Nachweis des erzeugten Signals.
- Ebenfalls zur Verfügung gestellt sind Testsätze ["Kits"], welche nützlich sind zum Nachweis des Vorhandenseins von HCV NS1 Antigen in Testproben, welche die monoklonalen Antikörper der Erfindung einschließen.
- Fig. 1 ist eine Illustration des Locus der rekombinanten HCV-Proteine auf dem HCV-Genom, welche entweder als Immunogene zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern oder für ihre Charakterisierung verwendet werden.
- Fig. 2 ist eine Westernblotanalyse welche die spezifische Bindung von den monoklonalen Antikörpern H13C113 und H23C163 an HCV NS1 zeigt.
- Fig. 3 ist ein Profil der PEPSCAN Analyse mit überlappenden Hexamerpeptiden (AS 600-720 des HCV) des monoklonalen Antikörpers H13C113, welche die Epitopenspezifität H13C113 gegen HCV zeigt (AS 649-655).
- Fig. 4 ist ein Profil einer PEPSCAN Analyse mit überlappenden Hexamerpeptiden (AS 600-720 des HCV) von monoklonalem Antikörper H23C163, welcher die Epitopenspezifität von H13C163 gegen HCV zeigt (AS 649-655).
- Die vorliegende Erfindung liefert neuartige monoklonale Antikörper gegen das mutmaßliche HCV E2/NS1 Protein, Verfahren zur Verwendung der monoklonalen Antikörper, und Testsätze welche diese monoklonalen Antikörper enthalten.
- Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, welche ausgeschieden werden durch die Hybridomzellinien A. T. C. C. Hinterlegungsnr. HB 10857 und A. T. C. C. Hinterlegungsnr. HB 10856, können in zahlreichen Assaysystemen verwendet werden, um die Anwesenheit, falls vorhanden, von jeglichen HCV E2/NS1 Proteinen in einer Testprobe festzustellen. Fragmente dieser gelieferten monoklonalen Antikörper können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise wird in einem ersten Assayformat ein polyklonaler oder monoklonaler anti-HCV E2/NS1 Antikörper, oder ein Fragment davon oder eine Kombination dieser Antikörper welche auf eine feste Phase aufgezogen worden ist, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, welche HCV E1/NS1 Proteine enthalten kann, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird eine Zeit lang und unter Bedingungen inkubiert, welche ausreichend sind, um Antigen/Antikörperkomplexe zu bilden. Dann wird ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher spezifisch an den HCV E2/NS1 Bereich bindet oder eine Kombination dieser Antikörper, an den/die eine signalerzeugende Verbindung angebunden wurde, mit den Antigen/Antikörperkomplexen in Kontakt gebracht, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite Mischung wird dann für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, welche ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörperkomplexe zu bilden. Entweder ist der Antikörper, der an die feste Phase gebunden ist, oder der Antikörper, der an die signalerzeugende Verbindung angebunden ist, ein monoklonaler Antikörper, ausgeschieden von einer Hybridomzellinie, gewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben identifizierten hinterlegten Hybridomen. Das Vorhandensein von HCV E2/NS1 Antigen, welches in der Testprobe vorhanden ist und, falls vorhanden, auf der festen Phase eingefangen wird, wird festgestellt durch Nachweis des meßbaren Signals, welches durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wird. Die Menge von HCV E2/NS1 Antigen, die in der Testprobe vorhanden ist, ist zum erzeugten Signal proportional.
- Alternativ, werden entweder (1) ein polyklonaler anti-HCV E2/NS1 Antikörper oder Fragment davon, oder eine Kombination dieser Antikörper, welcher/welche an einen festen Träger gebunden ist, die Testprobe und eine Indikatorreagenzie, bestehend aus einem monoklonalen Antikörper oder Fragmenten davon, welcher/welche spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet/binden oder eine Kombination dieser Antikörper an welche eine signalerzeugende Verbindung angebunden wurde, in Kontakt gebracht, um eine Mischung zu bilden, oder es werden (2) ein monoklonaler anti-HCV E2/NS1 Antikörper oder Fragment davon oder eine Kombination dieser Antikörper, welcher/welche an einen festen Träger gebunden ist, die Testprobe und ein Indikatorreagenz, umfassend einen polyklonalen Antikörper oder Fragment davon, welcher spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet, oder eine Kombination dieser Antikörper, an welche eine signalerzeugende Verbindung angebunden wurde, in Kontakt gebracht, um eine Mischung zu bilden. Der monoklonale Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper ausgeschieden von einer Hybridomzellinie gewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben identifizierten hinterlegten Hybridomen. Diese Mischung wird inkubiert eine Zeit lang und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörperkomplexe zu bilden. Das Vorhandensein, falls vorhanden, von HCV E2/NS1 Proteinen, die in der Testprobe vorhanden sind und auf der festen Phase eingefangen werden, wird durch den Nachweis des meßbaren Signals festgestellt, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wurde. Die Menge von HCV-Proteinen, die in der Testprobe vorhanden sind, ist proportional zu dem erzeugten Signal.
- In einem anderen Nachweisverfahren kann jeder der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden beim Nachweis von HCV-Antigenen in fixierten Gewebeabschnitten, wie auch als fixierte Zellen durch immunohistochemische Analyse.
- Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper an Matrizen gebunden werden, ähnlich der CNBr-aktivierten Sepharose und verwendet werden für die Affinitätsreinigung von spezifischen HCV-Proteinen von Zellkulturen oder biologischen Geweben wie etwa Blut und Leber.
- Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können ebenfalls verwendet werden zur Erzeugung von chimerischen Antikörpern zur therapeutischen Verwendung, oder anderen ähnlichen Anwendungen.
- Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon können einzeln bereitgestellt werden, um HCV E2/NS1 Antigene nachzuweisen. Es wird angenommen, daß Kombinationen der monoklonalen Antikörper (und Fragmente davon), die hierin bereitgestellt werden, ebenfalls zusammen als Komponenten in einer Mischung oder einem "Cocktail" von mindestens einem anti- HCV E2/NS1 Antikörper der Erfindung mit Antikörpern gegen andere HCV-Bereiche, welche jeweils unterschiedliche Bindungsspezifitäten besitzen, verwendet werden können. Somit kann dieser Cocktail die monoklonalen Antikörper der Erfindung umfassen, welche gegen HCV E2/NS1 Proteine gerichtet sind, und andere monoklonale Antikörper gegen andere antigenische Determinanten des HCV-Genoms. Beispiele anderer monoklonaler Antikörper, die für diese beabsichtigten Cocktails nützlich sind, umfassen jene gegen HCV C-100, HCV 33C, HCV CORE, HCV NS5 und/oder HCV mutmaßliches ENV, von denen einige beispielsweise in WO 91/08273, WO 92/13892 und WO 92/08738 veröffentlicht sind.
- Dieser Cocktail von monoklonalen Antikörpern, wie hierin beschrieben, würde in den hierin eingehend dargelegten Assayformaten anstelle des monoklonalen Antikörpers gegen HCV E2/NS1 verwendet werden, und wäre damit in der Lage, das E2/NS1 und andere HCV-Antigene nachzuweisen.
- Der polyklonale Antikörper oder das Fragment davon, das in den Assayformaten verwendet werden kann, sollte spezifisch an den mutmaßlichen HCV E2/NS1 Bereich oder andere HCV-Proteine, die in dem Assay verwendet werden, binden, wie etwa das HCV C- 100 Protein, HCV 33C-Protein, HCV CORE, HCV ENV oder HCV NS5 Protein. Der verwendete polyklonale Antikörper ist vorzugsweise ursprünglich von einem Säugetier; vom Menschen, von der Ziege, vom Hasen oder vom Schafstammender anti-HCV polyklonaler Antikörper kann verwendet werden. Am meisten bevorzugt ist als polyklonaler Antikörper ein polyklonaler Hasen-anti-HCV Antikörper. Die polyklonalen Antikörper, die in den Assays verwendet werden, können entweder alleine oder als ein Cocktail von polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da die in den Assayformaten verwendeten Cocktails, zusammengesetzt sind aus entweder monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antikörpern, welche unterschiedliche HCV-Spezifitäten besitzen, wären sie nützlich zur Diagnose, Beurteilung und Prognose von HCV- Infektionen, sowohl als auch zur Untersuchung von HCV- Proteindifferenzierungen und Spezifität.
- Testproben, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die hierin beschrieben sind, untersucht werden können, umfassen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten wie etwa Vollblut, Serum, Plasma, cerbospirale Flüssigkeit, Urin, biologische Flüssigkeiten, wie etwa Zellkulturüberstände, fixierte Gewebeproben und fixierte Zellproben.
- Die "feste Phase" ist nicht kritisch und kann vom Fachmann gewählt werden. So sind Latexpartikel, Mikropartikel, magnetische oder nicht-magnetische Kügelchen, Membranen, Plastikröhrchen, Wände von Mikrotiterkammern, Glas oder Silikonchips und Schafserythrozyten allesamt geeignete Beispiele. Geeignete Verfahren zum Immobilisieren von Peptiden auf festen Phasen umfassen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und ähnliches. Eine "feste Phase", wie hierin verwendet, bezeichnet jegliches Material, welches unlöslich ist oder durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Fangreagenz anzuziehen und zu immobilisieren, ausgewählt werden. Alternativ kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückhalten, welcher die Fähigkeit hat, das Fangreagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz umfassen, welche bezüglich dem Fangreagenz selbst oder einer geladenen Substanz, welche mit dem Fangreagenz konjugiert ist, entgegengesetzt geladen ist. Als eine weitere Alternative kann das Rezeptormolekül jegliches spezifische Bindungsglied sein, welches auf der festen Phase immobilisiert ist (angebunden ist) und welches die Fähigkeit hat, das Fangreagenz durch eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül erlaubt die indirekte Bindung des Fangreagenz an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die feste Phase kann daher Plastik, derivatisiertes Plastik, magnetisches oder nichtmagnetisches Metall, Glas oder die Siliziumoberfläche [sic!] eines Teströhrchens, einer Mikrotiterkammer, eines Blatts, eines Kügelchens, einer Mikropartikel, eines Chips sein, oder sie kann andere Konfigurationen, die den Fachleuten bekannt sind, einnehmen.
- Es wird als innerhalb der Reichweite und des Schutzumfangs der Erfindung liegend angesehen, daß die feste Phase ebenfalls jegliches geeignete poröse Material umfaßt, mit ausreichender Porösität, um den Zugang durch Nachweisantikörper zu gestatten, und die eine geeignete Oberflächenaffinität besitzt, um Antigene zu binden. Mikroporöse Strukturen werden im allgemeinen bevorzugt, aber Materialien mit Gelstruktur im hydrierten Zustand können ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger umfassen folgende:
- natürliche polymerische Kohlenhydrate und ihre synthetisch modifizierten, kreuzvernetzten oder substituierten Derivate, wie etwa Agar, Agarose, kreuzvernetzte Alginsäure, substituierte und kreuzvernetzte Guargummis, Zelluloseester, insbesondere mit Salpetersäure und Carbonsäuren, gemischte Zelluloseester und Zelluloseether;
- natürliche Polymere welche Stickstoff enthalten, wie etwa Proteine und Derivate, einschließlich kreuzvernetzter oder modifizierte Gelatinen;
- natürliche Kohlenwasserstoffpolymere wie etwa Latex und Gummi;
- synthetische Polymere welche hergestellt werden können mit geeigneten porösen Strukturen wie etwa Vinylpolymere, einschließlich Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat und seine partiell hydrolisierten Derivate, Polyacrylamide, Polymethacrylate, Copolymere und Terpolymere der obigen Polykondensate, sowie Polyester, Polyamide und andere Polymere wie etwa Polyurethane oder Polyepoxide;
- poröse anorganische Materialien wie etwa Sulfate oder Carbonate von Erdalkalimetallen und Magnesium, einschließlich Bariumsulfat, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Silicate von Alkali- und Erdalkalimetallen, Aluminium und Magnesium; und Aluminium- oder Siliciumoxide oder -Hydrate wie etwa Lehme, Alumina, Talcum, Kaolin, Zeolith, Silicagel oder Glas (diese Materialien können als Filter mit den obigen polymeren Materialien verwendet werden); und
- Mischungen oder Copolymere der obigen Klassen wie etwa Pfropfcopolymere, die erhalten werden durch das Auslösen der Polymerisierung von synthetischen Polymeren auf einem zuvor existierenden natürlichen Polymer. Alle diese Materialien können in geeigneten Formen verwendet werden, wie etwa als Filme, Blätter, oder Platten, oder sie können auf geeignete inerte Träger, wie etwa Papier, Glas, Plastikfilme oder Stoffe aufgezogen oder angebunden oder laminiert werden.
- Die poröse Struktur von Nitrozellulose hat ausgezeichnete Absorptions- und Adsorptioneigenschaften für eine breite Vielzahl von Reagenzien einschließlich monoklonaler Antikörper. Nylon besitzt ebenfalls ähnliche Charakteristika und ist ebenfalls geeignet.
- Es wird in Betracht gezogen, daß solche porösen festen Träger, die hierin beschrieben sind, vorzugsweise in der Form von Blättern mit einer Dicke von etwa 0,01 bis 0,5 mm, vorzugweise etwa 0,1 mm vorliegen. Die Porengröße kann innerhalb breiter Grenzen variieren, und beträgt vorzugsweise etwa 0,025 bis 15 um (Mikron) insbesondere von etwa 0,15 bis 15 um (Mikron). Die Oberfläche solcher Träger kann durch chemische Verfahren aktiviert werden, die kovalente Bindungen des Antigens oder Antikörpers an den Träger verursachen. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird jedoch im allgemeinen durch Adsorption auf dem porösen Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erreicht. Geeignete feste Träger sind ebenfalls beschrieben in EP-A-0 353 590.
- Das Indikatorreagenz umfaßt eine signalerzeugende Verbindung ("label"), welche in der Lage ist, ein meßbares Signal zu erzeugen, das durch externe Mittel nachweisbar ist, und das an ein spezifisches Bindungsglied für HCV konjugiert (angeheftet) ist. "Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares. Das sind zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Außer daß es ein Antikörperglied eines spezifischen Bindungspaares für HCV sein kann, kann das Indikatorreagenz ebenfalls ein Glied irgendeines spezifischen Bindungspaares sein, einschließlich entweder Hapten-anti-Hapten- Systemen wie etwa Biotin oder Antibiotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lektin, eine komplementäre Nukleotidsequenz, ein Effektor oder ein Rezeptormolekül, ein Enzymcofaktor und ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym und ähnliches. Ein immunreaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper sein, ein Antigen oder ein Antikörper/Antigenkomplex, welcher in der Lage ist, entweder an HCV zu binden, wie in einem Sandwichassay, an das Fangreagenz, wie in einem kompetitiven Assay, oder an das zusätzliche spezifische Bindungsglied, wie in einem indirekten Assay.
- Die zahlreichen signalerzeugenden Verbindungen ("labels"), die in Betracht gezogen werden, umfassen Chromogene, Katalysatoren wie etwa Enzyme, lumineszente Verbindungen so wie Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen wie etwa Acridinium, Phenanthridinium und Dioxetanverbindungen, radioaktive Elemente, und direkte visuelle Markierungen. Beispiele für Enzyme umfassen alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, beta-Galactosidase und ähnliches. Die Auswahl einer bestimmten Markierung ist nicht kritisch, aber sie muß in der Lage sein, ein Signal zu erzeugen, entweder aus sich selbst heraus oder in Konjugation mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen.
- Andere Ausführungen, die zahlreiche andere feste Phasen verwenden, werden ebenfalls in Betracht gezogen und fallen unter den Schutzumfang dieser Erfindung. Beispielsweise können Ionenfangverfahren zur Immobilisierung eines immobilisierbaren Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer, beschrieben in EP-A-0 326 100 und EP-A-0 406 473, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine schnelle immunchemische Lösungsphasenreaktion durchzuführen. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird vom Rest der Reaktionsmischung durch ionische Wechselwirkungen zwischen den negativ geladenen poly-Anion/Immunkomplex und der zuvor behandelten positiv geladenen porösen Matrix abgetrennt und nachgewiesen, und zwar, durch Verwendung zahlreicher signalerzeugender Systeme, die zuvor beschrieben sind, einschließlich jener, die in chemilumineszenten Signalmessungen beschrieben sind [sic!], wie beschrieben in EP-A-0 273 115.
- Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Verwendung in Systemen angepaßt werden, die Mikropartikeltechnologien verwenden, einschließlich in automatisierten und halbautomatisierten Systemen, wobei die feste Phase eine Mikropartikel umfaßt. Solche Systeme umfassen jene, die in EP-A-0 425 633 und EP-A-0 424 634 beschrieben sind.
- Die Verwendung von scanning probe microscopy (SPM) für Immunoassays ist ebenfalls eine Technologie, an welche die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung leicht anpaßbar sind. Bei der scanning probe microscopy, insbesondere bei der Atom-Kraftmikroskopie, wird die Einfangphase, zum Beispiel mindestens einer der monoklonalen Antikörper der Erfindung, an eine feste Phase angehaftet und ein scanning probe Mikroskop wird zum Nachweis von Antigen/Antikörperkomplexen verwendet, die an der Oberfläche der festen Phase vorhanden sein können. Die Anwendung von scanning tunnelling Mikroskopie eliminiert das Bedürfnis für label, die normalerweise in vielen Immunoassaysystemen verwendet werden müssen, um Antigen/Antikörperkomplexe nachzuweisen.
- Der Einsatz von SPM zur Überwachung von spezifischen Bindungsreaktionen kann auf viele Weisen geschehen. In einer Ausführungsform ist ein Glied eines spezifischen Bindungspartners (die analytspezifische Substanz, welche der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an eine Oberfläche angebunden, die fürs Scannen geeignet ist. Die Anbindung der analytspezifischen Substanz kann durch Adsorption an einem Teststück bewerkstelligt sein, das eine feste Phase einer Plastik- oder Metalloberfläche umfaßt, gemäß Verfahren, die Fachleuten bekannt sind. Es kann auch die kovalente Anbindung eines spezifischen Bindungspartners (analytspezifische Substanz) an ein Teststück verwendet werden, wobei das Teststück eine feste Phase aus derivatisiertem Plastik, Metall, Silicium oder Glas umfaßt. Kovalente Anbindungsverfahren sind den im Fachgebiet bewanderten bekannt und umfassen eine Vielzahl von Mitteln, um spezifische Bindungspartner irreversibel an das Teststück anzubinden. Falls das Teststück Silicium oder Glas ist, muß die Oberfläche vor der Anbindung des spezifischen Bindungspartners zunächst aktiviert werden. Aktivierte Silanverbindungen wie etwa Triethoxyaminopropylsilan (verfügbar von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Triethoxyvinylsilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), und (3-Mercapto-propyl)- trimethoxysilan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) können verwendet werden, um reaktive Gruppen einzuführen, wie etwa jeweils Amino-, Vinyl und Thiol. Solche aktivierten Oberflächen können verwendet werden, um den Bindungspartner direkt anzubinden (in den Fällen von Amino oder Thiol) oder die aktivierte Oberfläche kann weiter zur Reaktion gebracht werden mit Linkem wie etwa Glutaraldehyd, Bis(succinimidyl)suberat, SPP, 9-Succinimidyl-3-[2-Pyridyldithio]propionat), SMCC (Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat), SIAB (Succinimidyl[4-jodacetyl]aminobenzoat) und SMPB (Succinimidyl-4-[1-maleimidophenyl]butyrat) um den Bindungspartner von der Oberfläche abzutrennen. Die Vinylgruppe kann oxidiert werden, um ein Mittel für die kovalente Anbindung zu liefern. Sie kann ebenfalls verwendet werden als ein Anker für die Polymerisierung von zahlreichen Polymeren wie etwa Polyacrylsäure, die zahlreiche Anknüpfungspunkte für spezifische Bindungspartner liefern kann. Die Aminooberfläche kann zur Reaktion gebracht werden mit oxidierten Dextranen von unterschiedlichen Molekulargewichten, um hydrophile Linker von unterschiedlicher Größe und Kapazität zu liefern. Beispiele für oxidierbare Dextrane umfassen Dextran T-40 (Molekulargewicht 40.000 Daltons), Dextran T-110 (Molekulargewicht 110.000 Daltons), Dextran T-500 (Molekulargewicht 500.000 Daltons), Dextran T-2M (Molekulargewicht 2.000 000 Daltons) (welche alle verfügbar sind von Pharmacia, Piscatawa, N. J.), oder Ficoll (Molekulargewicht 70.000 Daltons) (verfügbar von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ebenfalls können Polyelektrolytwechselwirkungen verwendet werden, um einen spezifischen Bindungspartner auf einer Oberfläche eines Teststückes zu immobilisieren, unter Verwendung von Techniken und Chemismen, die in EP-A-0 326 100 und EP-A-0 406 473 beschrieben sind.
- Das bevorzugte Verfahren der Anbindung geschieht durch kovalente Mittel. Nach der Anbindung eines spezifischen Bindungspartners kann die Oberfläche weiter behandelt werden mit Materialien wie etwa Serum, Proteinen oder anderen blockierenden Agenzien, um unspezifische Bindung zu minimieren. Die Oberfläche kann ebenfalls gescannt werden, entweder am Herstellungsort oder am Verwendungsort, um ihre Eignung für Assayzwecke zu überprüfen. Der Scanning Vorgang soll nicht die spezifischen Bindungseigenschaften des Teststücks verändern.
- Obwohl die vorliegende Erfindung die Bevorzugung des Einsatzes von festen Phasen beschreibt, wird in Betracht gezogen, daß die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in nicht-Festphasenassaysystemen verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind den Fachleuten auf dem Fachgebiet bekannt und werden als unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet.
- Es wird in Betracht gezogen, daß die Reagenzie, die für den Assay verwendet wird, geliefert werden kann in der Form eines Testsatzes mit einem oder mehreren Behältern wie etwa Phiolen oder Flaschen, wobei jeder Behälter ein getrenntes Reagenz enthält, wie etwa einen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail von monoklonalen Antikörper, Nachweisreagenzien und Waschreagenzien, die in dem Assay verwendet werden.
- Die folgenden Beispiel zeigen die Vorteile und die Nützlichkeit dieser Erfindung zur Serodiagnose von HCV durch die Beschreibung von Verfahren für die Entwicklung, Charakterisierung, die Epitopkartierung ["epitope mapping"] und die klinische Anwendung dieser monoklonalen Antikörper. Die Verfahren, die zur Entwicklung von monoklonalen Antikörpern verwendet wurden, folgen Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind und welche detailliert in Köhler und Milstein, Nature 256: 494 (1975) beschrieben und in J. G. R. Hurrel, Herausgeber: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boco Ratan, FL (1982) zusammengefaßt sind. Ein weiteres Verfahren zur Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, welches auf dem Köhler und Milsteinverfahren basiert, ist jenes von L. T. Mimms et al., Virology 176: 604-619 (1990).
- Immunogene Domänen des E2/NS1 Bereiches des HCV-Genoms, enthaltend AS 600-720 (Sequenzidentifikationsnr. 1) wurden mittels PEPSCAN-Analyse kartiert ("mapped"). Ein PEPSCAN Kit wurde von Cambridge Research Bioscience (Valley Stream, New York, U. S. A.) gekauft, um eine Serie von überlappenden Hexamerpeptiden zu synthetisieren (Überlappungsbereich von fünf Aminosäuren) beinhaltend HCV AS 600-720 (Sequenzidentifikationsnr. 1), auf derivatisierten Polypropylenpins, die vom Hersteller geliefert wurden. Die Synthesevorschrift, die mit dem Kit geliefert wurde, wurde für die Synthese dieser Peptide exakt befolgt. Kurz gesagt, wurden die Polypropylenpins, welche das F-moc β-Alanin als Endgruppen- Aminosäure enthielten, entschützt mit 20%igem (v/v) Piperidin in Dimethylformamid (DMF) über einen Zeitraum von 30 Minuten. Die Pins wurden gewaschen mit DMF (1 · 5 Min.), Methanol (4 · 2 Min.) gefolgt von einem abschließenden Waschgang mit DMF (1 · 5 Min.). F- moc aktive Ester von Aminosäuren wurden hergestellt in 30 mM Konzentration in 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in DMF. Die Aminosäuren wurden eingefüllt (175 ul) in die Kammern von 96 Kammer-Mikrotiterplatten, die mit dem Kit geliefert wurden, in der gewünschten Sequenz, beginnend am Carboxyterminus. Die entschützten Pins wurden abgesenkt in die Aminosäurelösungen und bei Raumtemperatur (RT) über Nacht inkubiert. Nach der DMF- Methanol-Waschsequenz, wie oben beschrieben, wurden die Entschützungs-, Wasch- und Kupplungsschritte wiederholt, bis alle Aminosäuren in jeder der Peptidsequenzen gekoppelt waren. Nach einem abschließenden Entschützungsschritt, wurden die terminalen Aminosäuren acetyliert, indem die Pins mit DMF Essigsäureanhydrid. Triethylamin bei 5 : 2 : 1 (v/v/v) 90 Minuten bei RT inkubiert wurden. Nach der DMF/Methanolwaschsequenz wurden die Pins luftgetrocknet. Vor der serologischen Analyse wurde die abschließende Seitenkettenentschützung und Neutralisation durchgeführt, indem die Pins mit Trifluoressigsäure. Phenol. Ethandithiol bei 95 : 2,5 : 2,5 (v/G/v) behandelt wurden. Die Pins wurden gewaschen mit Dichlormethan (2 · 2 Min.), 5% Diisopropylethylamin/Dihlormethan (1 · 5 Min.) und Dichlormethan (1 · 5 Min.). Schließlich wurden die Pins luftgetrocknet, mit Wasser gewaschen, in Ethanol 18 Stunden lang eingelegt, getrocknet und entwässert im Gefrierschrank gelagert.
- FAB-Dimere von IgG, aufgereinigt aus Seren von Individuen, welche seropositiv waren für Antikörper gegen HCV-Proteine, wurden als der primäre Antikörper verwendet für die serologische Analyse dieser Peptide, unter Verwendung des EIA Verfahrens, das durch den Hersteller empfohlen wird. Kurz gesagt wurde der primäre Antikörper auf eine geeignete Konzentration in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, die 0,1% Tween-20® (Bio-Rad, Richmond, CA), 1% Ovalbumin (verfügbar von Sigma, St. Louis, MO.), und 1% Rinderserumalbumin (verfügbar von Sigma) enthält. Die Peptidpins wurden über Nacht bei 4ºC mit dem primären Antikörper inkubiert. Nach mehreren Waschvorgängen mit PBS/Tween-20®, wurden die Pins 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit der geeignet verdünnten Ziegen anti-Maus HRPO inkubiert. Als Farbentwicklungsreagenz wurde Azido-di-3-ethylbenzthiazodinsulfonat, gelöst in einem Phosphat-Citratpuffer, der Wasserstoffperoxid enthielt, verwendet. Die optische Dichte der entwickelten Farbe wurde bei 405 nm nach der Inkubation der Pins mit dem Entwicklungsreagenz über 15-20 Minuten gemessen. Basierend auf der Reaktivität dieser Seren beim EIA wurden vier Aminosäuresequenzen (AS 607-627) Sequenzidentifikationsnr. 2), AS 643-663 (Sequenzidentifikationsnr. 3), AS 666-683 (Sequenzidentifikationsnr. 4) und AS 671-691 (Sequenzidentifikationsnr. 5) als die immunogenen Domänen identifiziert, wie in EP-A-0 445 423 beschrieben.
- Jede dieser vier Sequenzen und eine zusätzliche Sequenz, welche die Kombination der beiden am meisten immunogenen Sequenzen war (AS 643-683) (Sequenzidentifikationsnr. 6), wurden synthetisiert durch eine schrittweise Festphasensynthese, beginnend am Carboxyterminus durch ein Verfahren ähnlich demjenigen, das in E. Gross und T. Heinhofer, Herausgeber, Barany und Merrifield, The Peptides 2: 1284, Academic Press, New York, New York beschrieben ist. Basierend auf der EIA Reaktivität einer Reihe von HCV positiven Seren, wie in der U. S. Patentanmeldung Nr. 610 180 offenbart, die zuvor durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wurde, wurde das Peptid 643-683 (Sequenzidentifikationsnr. 6) als das Immunogen für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen HCV NS1 gewählt. Fig. 1 zeigt die Lokalisierung dieser Peptide auf dem HCV-Genom.
- Weibliche Balb/c Mäuse wurden mit etwa 50 ug des rohen Peptids 643-683 (HCV AS 643-683, Sequenzidentifikationsnr. 6) unter Verwendung des RIBI Adjuvanssystems immunisierz (RIBI Immunochemicals Res., U. S. A.). Am Tage eins erhielten die Mäuse 50 ug des Peptids mit jeweils 50 ug Trehalosedimycolat (TDM) und M. Phlei in einer Pufferemulsion, hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die folgenden Immunisierungen wurden an den Tagen 18, 34, 42 und 63 durchgeführt. Den Mäusen wurde an den Tagen 25 und 77 Blut entnommen, und die Immunantwort wurde mittels EIA unter Verwendung von Mikrotiterplatten, welche mit den Immunogen beschichtet waren, untersucht. Den Mäusen wurden mindestens acht Wochen Ruhe vor der Fusion zugestanden.
- Die Immunantwort auf das immunisierende Antigen wurde durch Mikrotiter EIA untersucht. Die Kammern von Mikrotiterplatten wurden mit 100 ul gereinigtem synthetischem Peptid (AS 643-683, Sequenzidentifikationsnr. 6) auf 0,1 M Bicarbonatpuffer bei pH 9,5 beschichtet. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) welche ebenfalls 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,05% Tween-20® (verfügbar von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) enthielt, wurden freie Stellen mit 1% BSA in Bicarbonatpuffer bei pH 9,5 abgedeckt. Nach einem abschließenden Waschvorgang würden die Platten bei 4ºC gelagert. Die Seren von nativen oder immunisierten Mäusen wurden seriell in 100 ul von Verdünnungspuffer verdünnt, welcher 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 20%iges normales Ziegenserum, 10%iges fetales Kalbsserum, 5 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 mM Tris, 0,2% Tween-20®, und Natriumazid als Konservierungsstoff (bei pH 6,8) enthielt. Die verdünnten Seren wurden mit dem Antigen über (3) Stunden bei 37ºC umgesetzt. Die Platten wurden gewaschen und 100 ul von entsprechend verdünntem Ziegen anti-Maus IgG (schwer [h] und leicht [1] Kette), Meerrettichperoxidase (HRPO)-konjugierter Antikörper (Jackson Immunochemicals, West Grove, PA) wurde hinzugefügt. Die Platten wurden bei 37ºC (2) Stunden lang inkubiert. Nach einem abschließenden Waschvorgang wurden 100 ul o-Phenylendiamin: 2 HCL (OPD) Farbreagenz hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 10 bis 30 Minuten durchgeführt und dann gestoppt durch den Zusatz von /ml 1N H&sub2;SO&sub4;. Die Absorbtion bei 492/600 nm wurde aufgezeichnet, sie erwies sich als direkt proportional zu der Menge von spezifischem Antikörper, der an das Antigen gebunden war.
- Nachdem demonstriert worden war, daß spezifischer anti-HCV Antikörper in vernünftigen Titern in Seren von immunisierten Mäusen vorhanden war, wurde den Mäusen gestattet, wenigstens acht Wochen vor einem pre-Fusionsboost mit Antigen zu ruhen. Der vor-Fusionsantigenboost wurde dann durch intravenöse (1 V) Schwanzveneninjektion von etwa 40 ug des jeweiligen gereinigten HCV synthetischen Peptid (Sequenzidentifikationsnr. 6) durchgeführt. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet, und ihre Milzen, welche anti-HCV Antikörper produzierende Zellen enthielten, wurden in einzelne Zellen zerrissen. Diese Einzelzellsuspensionen wurden mit 0,83% NH&sub4;Cl behandelt, um rote Blutzellen zu entfernen, und diese Suspensionen wurden dann mit SP2/0 Zellen in einem 10 : 1 (SP2/0: Milzzellen) Verhältnis gemischt. Die gemischten Zellen wurden zentrifugiert, einmal mit serumfreiem Medium gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Fusogen Polyethylenglykol (PEG) wurde verwendet, um Hybride aus den Immunspendermilzzellen mit der Myelomazellinie SP2/0 (HRPT negativ) zu bilden, nach Kohler und Milstein, Nature 356: 494 (1975) und zusammengefaßt in J. G. R. Hurrel, Herausgeber Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boco Ratan, FL (1982). Kurz gesagt wurde die Fusion der Milz und SP2/0 Zellen durchgeführt, indem das Pellet zu 40%igem PEG (ATCC, MG 1300-1600) in serumfreiem Iscoe's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) für zwei Minuten ausgesetzt wurde. Das PEG und die Zellsuspension wurden langsam verdünnt durch den Zusatz von 20 ml von serumfreiem IMDM über einem Zeitraum von 5 Minuten, gefolgt durch das Aufsammeln der Zellen durch Zentrifugation. Der Überstand wurde dekantiert und ersetzt durch 30 ml IMDM, welche 20%iges fetales Rinderserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) mit HAT (Hypoxanthen, Aminopterin und Thymidin) Medien enthielten, um Hybridome zu selektieren. Milzzellen von einer nicht immunisierten BABB/c Maus wurden ebenfalls als Nährschicht hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 0,1 ml/Kammer auf drei 96-Kammern Gewebekulturplatten aufgezogen. Zusätzliche 0,1 ml HAT-Medium wurden jeder Kammer drei Tage später hinzugefügt. In wöchentlichen nachfolgenden Intervallen wurde eine Hälfte des Mediums durch IMDM ersetzt, welches 20%iges FBS mit HT (Hypoxanthen und Thymidin) enthielt, und den Hybriden wurde gestattet, weitere sieben bis vierzehn Tage zu wachsen.
- Es wurde herausgefunden, daß einige Hybride aus Milzzellen zusammengesetzt waren, welche Antikörper gegen HCV produzierten, fusioniert mit SP2/0 Zellen. Kurz gesagt förderte das Fusogen die Fusion von Milzzellen und SP2/0 Zellmembranen, welche ein Heterokaryon bildeten, das Kerne von beiden Zellen enthielt. Zufällig formte die dissimilare Kernfusion einen einzelnen Nukleus, der in der Lage war, synchrone Mitose durchzuführen. Als die fusionierten Zellen sich trennten, stabilisierte sich das Hybrid, indem Chromosomen von jedem Nukleus verloren gingen. Die fusionierten Zellen wurden auf mehrere 96-Kammerplatten bei 10&sup5; bis 10&sup6; Zellen pro Kammer aufgezogen. Die Hybridzellen, die aus SP2/0 : Milzzellfusionen gebildet worden waren, wurden selektiv vermehrt, indem sie in HAT-Medium kultiviert wurden. Alle nicht verwendeten SP2/0 oder SP2/0 : SP2/0 fusionierten Zellen wurden durch Aminopterin am Wachstum gehindert, und unfusionierte Milzzellen oder Milz : Milz fusionierte Zellen starben in der Kultur ab. Nur SP2/0 : Milzzellhybride wuchsen in dem HAT Selektionsmedium an.
- Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Kulturflüssigkeiten von Kammern, die Hybridomzellwachstum enthielten, auf das Vorhandensein eines monospezifischen Antikörpers wie folgt untersucht. Jeder der Hybridomüberstände der NS1 Fusionen wurde durch das EIA-Verfahren, beschrieben in Beispiel 1, mit dem synthetischen Peptid AS 643-683 (Sequenzidentifikationsnr. 6) getestet, das auf die feste Phase aufgezogen worden war. Hybridomkulturflüssigkeiten, welche spezifisch mit dem Immunogen reagierten, z. B. mit HCV Protein mit der Sequenzidentifikationsnr. 6, wurden zum Klonen durch das limitierende Verdünnungsverfahren unter Verwendung der Richtlinien, beschrieben durch J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: principles and Practices, Academic Press, New York (1983) ausgewählt. Die Kulturüberstände von geklonten Proben wurden erneut durch EIA mit den Immunogenen getestet, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, zur Bestätigung der monospezifischen Reaktivität gegenüber der HCV-Proteinsequenz. Klone mit der stärksten Reaktivität, spezifisch gegen das synthetische Peptid, wurden zur Expansion und weiteren Analyse ausgewählt.
- Um größere Mengen von monoklonalen Antikörpern zu erhalten, wurden 10 bis 20 Millionen geklonte Zellen der gewünschten Hybridomazellinien in eine BALB/c Maus inokuliert, die zuvor i. p. (intraperitoneal) mit 0,5 ml Pristan (2,6,10,14- Tetramethylpentadecan) gemäß dem Verfahren behandelt worden war, das in J. G. R. Hurrel, Herausgeber, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boco Ratan, FL (1982) beschrieben ist. Die Pristanbehandlung verstärkte das Wachstum von Mausmyelomahybriden innerhalb des Peritoneums der Maus, und die Ascitesflüssigkeiten, die gebildet wurden, waren reich an monoklonalem Antikörper, ausgeschieden durch die Hybridzellen. Nach der Bildung von geeigneter Ascitesflüssigkeit (ca. sieben Tage), wurden die Mäuse getötet und der Ascites wurde aus dem Peritoneum abgezogen, durch Zentrifugation gereinigt und bei -20ºC gelagert. Die monoklonalen Antikörper aus der Ascitesflüssigkeit wurden gereinigt unter Verwendung von Protein-A Sepharose (gemäß J. G. R. Hurrel Herausgeber, siehe oben). Alle Charakterisierungsverfahren, wie sie hier beschrieben wurden, wurden entweder mit Kulturüberständen, Ascitesflüssigkeiten oder Protein-A gereinigtem IgG durchgeführt.
- Gereinigtes IgG von monoklonalen Antikörper wurde auf Mikrotiterplatten titriert, die mit dem Immunogen (Peptid 643- 683, Sequenzidentifikationsnr. 6) beschichtet waren, wie auch mit Platten, die mit dem gereinigten rekombinanten HCV E2/NS1 Protein PHCV80 (AS 365-731, Sequenzidentifikationsnr. 7) beschichtet worden waren, und zwar gemäß dem EIA Protokoll, das in Beispiel 1 beschrieben ist. Die detaillierte Beschreibung des Klonens und der Expression von pHCV80 ist in Beispiel 6 gegeben. Die EIA Reaktivität der monoklonalen Antikörper dieser Erfindung gegen das Immunogen wie auch gegen das rekombinante HCV E2/NS1 Protein ist in Tabelle 1 beschrieben.
- Ca. 300 ug des HCV Proteins PHCV-80 (AS 365-731, Sequenzidentifikationsnr. 7) wurden mit SDS und 2- Mercaptoethanol bei 95ºC behandelt und einer Elektrophorese in einem 12%igen Polyacrylamid-SDS Gel (Laemmli et al., Nature 227: 680-685 (1970) unterworfen. Die Proteine wurden über Nacht aus dem Gel auf Nitrozellulose durch Elektrophorese bei 100 mAmp transferiert oder in 1-2 Stunden bei 1.0 amp transferiert, in einem Standardtransferpuffer, der 25 mM Tris [(Hydroxymethyl) Aminomethan] 192 mM Glycin, und 2,0% Methanol, pH 8,3 (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 4350-4354 [1979]) umfaßte. Nachdem die Proteine transferiert waren und die Nitrozellulose mit 5%iger Trockenmilch in PBS blockiert worden war, wurde die Nitrozellulose in Streifen geschnitten, wobei jeder Streifen etwa 5 ug des Proteins enthielt, welches dann verwendet wurde, um die Anwesenheit von anti-HCV Antikörper in Testseren (oder anderen Proben) nachzuweisen. Die Reaktionsmischungen bestanden aus einem Nitrozellulosestreifen der über Nacht bei 4ºC mit einer geeigneten Menge von Testprobe in 2,0 ml Puffer (20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,3% Triton X-100® und 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,5, 5% E. coli Lysat und 3% CKS- Lysat inkubiert wurde, Die Streifen wurden mit gepuffertem Detergenz gewaschen (10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,5, 0,1% SDS und 0,5% Triton X-100® enthaltend), gefolgt durch den Zusatz von Ziegen anti-Maus IgG Antikörper, konjugiert an HRPO. Die Streifen wurden eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt durch Waschen mit gepuffertem Detergenz. Schließlich wurde der an das Protein gebundene Antikörper sichtbar gemacht durch den Zusatz von frisch hergestellten HRP Farbreagenzien (Bio-Rad Laboratories, Richmond CA) (120 mg aufgelöst in 40 ml eiskalten Methanol, dann verdünnt in 200 ml Tris gepufferter Kochsalzlösung [TBS] pH 7,8 120 ug von 30%igem Wasserstoffperoxid enthaltend). Fig. 2 zeigt die spezifische Reaktivität der monoklonalen Antikörper dieser Erfindung gegenüber dem HCV E2/NS1 Protein.
- Um nachzuweisen, ob jeder der monoklonalen Antikörper, ein Epitop erkannte, das beim Menschen immunologisch ist, wurde ein Kompetitivassay wie folgt durchgeführt. Jeder der monoklonalen Antikörper wurde in einem Assay getestet, wobei die monoklonalen Antikörper mit einem Humanserum, das für Antikörper gegen E2/NS1 (Sequenzidentifikationsnr. 1) seropositiv war, um die Bindung an das Antigen konkurrierten. Kurz gesagt wurde ein Humanserum von einem Individuum, das mit NANBH infiziert war und stark seropositiv gegenüber Antikörpern gegen E2/NS1 Protein von HCV war, zu dem Reaktionsgemisch mit jedem der monoklonalen Antikörper bei einer abschließenden Konzentration von 10% zugesetzt. Der Mikrotiter EIA wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Inhibition bei der Bindung des monoklohalen Antikörpers an das respektive Protein durch das immune menschliche Serum, die größer war als 50% wurde als kompetitiv angesehen (Die Werte sind in Tabelle 1 gezeigt). Die monoklonalen Antikörper H13C113 und H23C163 wurden nicht signifikant durch Seren von Individuen gehemmt, die für Antikörper gegen HCV E2/NS1 seropositiv waren.
- Die Isotypen von jedem der monoklonalen Antikörper wurden durch die Verwendung eines Isotypisierungskits (Amersham, Arlington Heights, IL) und unter Befolgen der darin eingeschlossenen Anweisungen nachgewiesen. Kurz gesagt wurde der Gewebekulturüberstand [sic!] von jedem monoklonalen Antikörper und von geeigneten Kontrollansätzen bei einer 1 : 5 Verdünnung mit Streifen umgesetzt, die mit spezifischem anti-Isotyp Antikörper beschichtet waren, die in dem oben beschriebenen Kit geliefert worden waren. Die Assayprotokolle wurden genau gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Isotyp jedes monoklonalen Antikörpers der Erfindung ist in TABELLE 1 angegeben.
- Monoklonale Antikörper, die gegen das synthetische Peptid (Sequenzidentifikationsnr. 6) erzeugt worden waren, wurden für den spezifischen Bereich des HCV E2/NSl Proteins wie folgt kartiert ["mapped"] durch (a) die Westernblotreaktivität eines jeden der monoklonalen Antikörper gegenüber Subfragmenten des HCV E2/NS1 Proteins und (b) die Reaktivität gegenüber mehreren synthetischen Peptiden, gewählt aus den jeweiligen Proteinsequenzen durch Mikrotiter-EIA unter Verwendung, des Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Kurz gesagt, es wurden einige individuelle Oligonukleotide, die die AS 365-731 des HCV-Genoms darstellen, ligiert und als drei getrennte EcoRI-BAMHI Subfragmente in den CKS-Fusionsvektor pJO200 geklont. Diese drei Subfragmente wurden als pHCV80 (AS 365-731) (Sequenzidentifikationsnr. 7), pHCV77 (AS 365-579) (Sequenzidentifikationsnr. 8) und pHCV65 (AS 565-731) (Sequenzidentifikationsnr. 9) wie in Fig. 2 gezeigt. Die detaillierten Verfahren zum Klonen und zur Expression des CKS- Fusionsproteins sind in EP-A-0 445 423 und EP-A-0 472 207 beschrieben.
- Zellysate dieser Klone wurden als Antigene zur Westernblotanalyse verwendet, unter Beachtung der Versuchsvorschrift, die in Beispiel 5 für das vorläufige Epitopmapping der monoklonalen anti-NS1 Antikörper beschrieben ist. Fig. 2 zeigt die Bindung der monoklonalen Antikörper H13C113 und H23C163 an rekombinante HCV E2/NS1 Proteinsubfragmente, wobei Bahn 1 (normales Humanserum), Bahn 2 (HCV immunes Humanserum) und Bahn 3 (normales Mausserum) als Kontrolle mit eingeschlossen wurden. Bahn 4 enthält: den Hybridüberstand aus dem H13C113 geklont worden war, Bahn 6 enthält den monoklonalen Antikörper H13C113, Bahn 5 enthält einen Schwesterklon des monoklonalen Antikörpers H13C113 (H13C44), Bahn 10 enthält monoklonalen Antikörper H23C163, wohingegen die Bahnen 8 und 9 Schwesterklone des monoklonalen Antikörpers H23C163 (jeweils H23C41 und H23C41) enthielten. Die Daten zum Epitopmapping mit diesen Subfragmenten sind in Fig. 2 gezeigt. Die monoklonalen Antikörper H13C113 und H23C163 zeigten die Reaktivität mit pHCV80 (Sequenzidentifikationsnr. 7) und pHCV 65 (Sequenzidentifikationsnr. 9), das die Reaktivität mit HCV AS 565-731 (Sequenzidentifikationsnr. 9) anzeigt.
- Mehrere Aminosäuresequenzen wurden aus unterschiedlichen Bereichen des HCV-Proteins NS1 basierend auf der PEPSCAN- Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewählt. Eine Liste der Peptide, die für das Epitopmapping dieser monoklohalen Antikörper verwendet wurden, ist unten in TABELLE 2 aufgelistet. TABELLE 2 Epitopmapping mit synthetischen Peptiden
- Jedes dieser Peptide wurde auf einem Harzträger durch eine schrittweise Festphasensynthese, ausgehend vom Carboxyendrest, aufgebaut. Ein Verfahren wurde verwendet, das ähnlich demjenigen ist, das in E. Gross und T. Heinehofer, Herausgeber Barary und Merrifield, The Peptides 2: 1284, Academic Press, New York, New York (1980) beschrieben ist, unter Verwendung eines Reaktionsgefäßes eines Applied Biosystems Synthesizers Model 430A. Nach dem Abspalten des Peptids von dem Harz wurde das Peptid mit Diethylether gewaschen und in 40%ige Essigsäurelösung extrahiert. Das rohe Peptid das nach Lyophilisierung der wässerigen Lösung erhalten wurde, wurde; als Antigenziel für die Epitopmappingexperimente verwendet. Kurz gesagt wurde jedes der getesteten Peptide auf Mikrotiterkammern bei einer Konzentration von 10 ug/ml in Bicarbonatpuffer bei pH 9,5 aufgezogen. Der EIA wurde auf die Art und Weise durchgeführt, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Monoklonale Antikörper die eine Reaktivität zeigten, die vierfach höher war als jene der negativen Kontrolle, wurden als positiv angesehen.
- Zusätzlich wurden monoklonale Antikörper gegen HCV NS1 ebenfalls mittels PEPSCAN-Analyse wie in Beispiel 1 beschrieben kartiert. Ein EIA wurde mit jedem der monoklonalen Antikörper gegen HCV NS1 durch die Verfahren durchgeführt, die denjenigen in Beispiel 1 beschriebenen ähnelten, unter Verwendung der Gewebekulturüberstände der monoklonalen Antikörper als primäre Antikörper und Ziegen anti-Maus HRPO als dem sekundären Antikörper mit überlappenden Hexamerpeptiden, die die AS 600-720 (Sequenzidentifikationsnr. 1) des HCV-Genoms einschlossen. Die Daten sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Der monoklonale Antikörper H13C113 und H23C163 reagierten spezifisch mit der Peptidsequenz GDRCDLE (AS 649-655) (Sequenzidentifikationsnr. 10) des HCV-Genoms.
- Junge Kaninchen (3-4 Monate alt und mit einem Gewicht von etwa 2-3 kg) (verfügbar von Hazelton Labs, Denver PA) werden mit 100-150 ug von hoch gereinigtem HCV E2/NS1 synthetischen Peptid oder dem E2/NS1 rekombinanten Proteinen, geklont und exprimiert in entweder eukaryontischen oder prokaryontischen Systemen, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Freund s komplettem Adjuvans durch intra-muskuläre (i. m.) Injektion an vier unterschiedlichen Stellen immunisiert. Nachfolgend werden zwei Immunisierungen in zwei wöchentlichen Intervallen in ähnlicher Weise in Freunds inkomplettem Adjuvans durchgeführt. Die Immunantwort der Kaninchen wird durch EIA und Westernblotanalyse überwacht. Den Kaninchen wird Blut entnommen, wenn eine akzeptable Immunantwort gegen das Protein erreicht ist. Das IgG von dem Immunkaninchenseren wird durch Protein-A Sepharose Affinitätschromatographie gereinigt, d. h. Gemäß Methoden, die im Fachgebiet bekannt sind.
- Kaninchen IgG wird hergestellt, wie dies hierin beschrieben ist und es wird dann auf Polystyrolkügelchen als festen Träger zum Einfangen von E2/NS1 Antigenen in Testproben aufgeschichtet. Die Polystyrolkügelchen werden mit destilliertem Wässer gewaschen und bei 40ºC zwei Stunden lang mit 5-10 ug/ml gereinigtem HCV E2/NS1 synthetischem Peptid kaninchen IgG in einer Pufferlösung (0,1M Tris, 0,5M NaCl, 0,0022% Triton X-100®, pH 8,5) inkubiert. Die Kügelchen werden einmal mit PBS gewaschen und dann in 0, 1% Triton X-100® in PBS über eine Stunde bei 40ºC getränkt. Nach zweimaligem Waschen mit PBS werden die Kügelchen mit 3%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS bei 40ºC etwa eine Stunde überschichtet. Schließlich werden die Kügelchen mit 5%iger Saccharoselösung in PVS überschichtet und unter Stickstoff getrocknet. Humanes polyklonales anti-HCV IgG, aufgereinigt aus Seren von Individuen, die in Bezug auf HCV Antikörper gegen E2/NS1 seropositiv sind, wird ebenfalls auf ähnliche Art und Weise aufgezogen.
- Monoklonale Antikörper, die für HCV E2/NS1 spezifisch sind, werden zur Verwendung als Sonde zum Nachweis von HCV-Proteinen in einer Testprobe durch EIA untersucht. Kurz gesagt, es wird jeder der monoklonalen Antikörper mit dem E2/NS1 Antigen in Anwesenheit von Polystyrolkügelchen inkubiert, die mit polyklonalem anti-HCV Kaninchen IgG beschichtet sind. Die Versuchsvorschrift für den EIA ähnelt jenem, das hier unten beschrieben ist.
- Eine 20 ul Testprobe, von der der Verdacht besteht, daß sie Antigen gegen HCV E2/NS1 Protein enthält, wird auf einem Reaktionsträger mit 504 monoklonalem Antikörper der Erfindung (bei einer Proteinendkonzentration von etwa 5-10 ug/ml, verdünnt in einem Puffer, der 20 mM Tris, 0,1 mM NaCl, 1 mM EDTA, 3,0% BSA, 0,3% Tween-20® und 10% FBS bei pH 7,5 enthält) und mit einem Kügelchen, das mit HCV Kaninchen IgG (hergestellt, wie hier oben beschrieben) beschichtet ist, inkubiert. Über Nacht wird eine Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt, und dann werden die Kügelchen mit destilliertem Wasser gewaschen und 20 ul von geeignet verdünntem Meerrettichperoxidase-markiertem Ziegen anti-Maus IgG (H & L) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) wird hinzugefügt. Die Inkubation mit der markierten Sonde wird bei etwa 40ºC während etwa zwei Stunden durchgeführt. Die Kügelchen werden gewaschen und in Reaktionsröhrchen transferiert, die 300 ul O-Phenlyendiamin (OPD) Farbreagenz enthalten. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur im Dunkeln während etwa 30 Minuten durchgeführt und wird dann durch den Zusatz von /ml 1N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Extinktion wird aufgezeichnet bei 492/600 nm. Eine negative Kontrolleprobe, die zuvor gescreent wurde und die als negativ gegenüber NANBH Infektion bestätigt ist, wird in das Experiment mit einbezogen. Die positive Kontrollprobe besteht aus einer Lösung von synthetischem Peptid von E2/NS1 in der Pufferlösung, die oben beschrieben ist. Dreifache Ansätze von sowohl positiver wie negativer Kontrollprobe werden in jeden Satz der Experimente mit eingeschlossen.
- Um die Wirksamkeit des Antigeneinfangassays zum Nachweis von HCV E2/NS1 in einer Probe festzustellen, werden verschiedene Konzentrationen rekombinanten HCV E2/NS1 synthetischen Peptids, die von 100 ng Peptid/ml bis 100 pg Peptid/ml reichen, in dem Puffer, der oben genannt ist, verdünnt. Das EIA Verfahren, das oben beschrieben ist, wird mit jedem der verdünnten Auswahlglieder ["panel members"] durchgeführt. Für die Zwecke des Vergleiches wird jedes der Auswahlglieder getestet mit (a) polyklonalem anti-HCV Kaninchen Antikörper auf der Festphase und (b) polyklonalem humanem anti-HCV Antikörper auf der festen Phase. Die Wirksamkeit des Assays wird dann durch Auswertung der erhaltenen Daten bestimmt.
- Die Hybridome, die die monoklonalen Antikörper der Erfindung produzieren, werden als Hybridom H13C113 identifiziert, das den monoklonalen Antikörper H13C113 produziert, und als Hybridom H23C163, das den monoklonalen Antikörper H23C163 produziert. Die Hybridome H13C113 und H23C163 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 am 20. August 1991 hinterlegt, und ihnen würden die folgenden Hinterlegungsnummern zugeordnet: Hybridom H13C113 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer HB 10857 zugeordnet, und dem Hybridom H23C163 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer HB10856 zugeordnet.
- So können die neuartigen monoklonalen Antikörper der Erfindung auf eine Vielzahl von Weisen verwendet werden. Diese monoklonalen Antikörper können für die Immunfällung von amplifiziertem Produkt und zum Nachweis von HCV Nukleinsäuremikropartikeln oder für einen Träger verwendet werden, der mit monoklonalem anti-HCV Antikörper beschichtet ist, um Viren oder virale Proteine, die mit HCV RNA assoziiert sind, einzufangen. Dann können Nachweisverfahren für RNA angewendet werden.
- Diese monoklonalen Antikörper können ebenfalls zur Lokalisierung von HCV-Antigenen innerhalb von Zellen unter Verwendung eines monoklonalen HCV Antikörpers, der direkt markiert ist, (Fluoreszenz, kolloidales Gold, usw.) oder unter Verwendung von sekondär markiertem anti-Maus Antikörper verwendet werden. Die Histopathologie von Erkrankungen kann verfolgt werden. Weiterhin wird der Nachweis von nativen oder rekombinanten HCV Antigenen in Seren, Geweben, Zellen, Kulturmedien oder Körperflüssigkeiten unter Verwendung indiviueller monoklonaler Antikörper in einer Sandwichkonfiguration oder einem Cocktail von monoklonalen Antikörpern auf der festen Phase und in dem Nachweissystem ermöglicht.
- Ein-Schritt-Antigenassays, die monoklonale Antikörper gegen nicht überlappende Epitope verwenden, können ebenfalls durchgeführt werden. Einige monoklonale Antikörper können antigenische Epitope erkennen, die nicht von dem infizierten Individuum erkannt werden, und daher kann es möglich sein Serum Antigen zu erkennen, und zwar freies wie auch an menschlichen Antikörper gebundenes. Weiterhin können "kryptische" oder versteckte Antigene oder antigenische Determinanten durch Behandlung der Probe mit einem Detergenz oder reduzierenden Agenz oder beidem aufgedeckt werden. Zum Beispiel kann das CORE- Antigen in einer Capsidform vorliegen, welche von der Virushülle umhüllt ist. Das Entfernen der Hülle mit Detergenzien sollte das CORE-Antigen frei legen. Monoklonale Antikörper können ebenfalls pragmatische Vorteile gegenüber hohen Titern polyklonaler Antikörper liefern, indem sie eine größere Sensitivität des Assays ergeben oder indem sie kürzere Inkubationszeiten erlauben.
- Einige monoklonale Antikörper können eine den Virus neutralisierende Aktivität besitzen. Schließlich sollten monoklonale Antikörper bei der Immunoaffinitätsaufreinigung von nativen viralen und rekombinanten HCV Antigenen und Proteinen nützlich sein.
- Andere Variationen und Anwendungen der Verwendung dieser einzigartigen monoklonalen Antikörper, die hier bereitgestellt werden, umfassen den Nachweis von HCV in Immunkomplexen oder latente und/oder kryptische Antigene, und/oder assoziiert mit viraler Nukleinsäure zum Nachweis der Nukleinsäure durch PCR, LCR oder durch direkte Hybridisierung. TABELLE 1 MONOKLONALE ANTIKÖRPER GEGEN HCV NS1 PROTEIN
- a. pHCV-65 AS 565-731
- b. pHCV-80 AS 365-731
- c. AS Sequenz = Gly-Glu-Arg-Cys-Asp-Leu-Glu
- (1) Allgemeine Information
- (i) Anmelder: MEHTA, SMRITI U.
- JOHNSON, JILL E.
- DAILEY, STEPHEN H.
- DESAI, SURESH M.
- DEVARE, SUSHIL G.
- (ii) Titel der Erfindung: MONOKLONALE ANTIKÖRPER GEGEN MUTMASSLICHE HCV-E2/NS1-PROTEINE UND VERFAHREN ZU IHRER VERWENDUNG
- (iii) Anzahl von Sequenzen: 10
- (iv) Korrespondenzadresse:
- (A) Adressat: Abbott Laboratories D-377/AP6D
- (B) Straße: One Abbott Park Road
- (C) Stadt: Abbott Park
- (D) Staat: Illinois
- (E) Land: USA
- (F) Postleitzahl: 60064-3500
- (v) Computerlesbare Form:
- (A) Mediumtyp: Floppy disk
- (B) Computer: IBM PC kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Programm: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
- (vi) Daten der vorliegenden Anmeldung:
- (A) Anmeldenummer: US 07/748,292
- (B) Anmeldetag: 21. August 1991
- (C) Klassifizierung:
- (vii) Angaben zum Prioritätsdokument:
- (A) Anmeldenummer: US 07/456,162
- (B) Anmeldetag: 22. Dezember 1989
- (vii) Angaben zum Prioritätsdokument:
- (A) Anmeldenummer: US 07/610, 180
- (B) Anmeldetag: 7. November 1990
- (viii) Angaben zum Anwalt:
- (A) Name: Porembski, Priscilla E.
- (B) Registrierungsnummer: 33,207
- (C) Aktenzeichen/Aktennummer: 4767. US. P2
- (ix) Telekommunikationsinformation:
- (A) Telefon: 708-937-6365
- (B) Telefax: 708-937-9556
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 1:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 121 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (C) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 1:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 2:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 21 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 2:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 3:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 21 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid. (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 3:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 4:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 18 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (b) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 4:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 5:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 21 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 5:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 6:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 41 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln '
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 6:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 7:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 621 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 7:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 8:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 414 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 8:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 9:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 463 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 9:
- (2) Information für Sequenzidentitätsnummer 10:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 7 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (C) Strängigkeit: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 10:
Claims (13)
1. Monoklonaler Antikörper, der von der Hinterlegung ATCC Nr. HB
10857 ausgeschieden wird.
2. Monoklonaler Antikörper, der von der Hinterlegung ATCC Nr. HB
10856 ausgeschieden wird.
3. Hybridomzellinie mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB 10857.
4. Hybridomzellinie mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB 10856.
5. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des Hepatitis C
Virus (HCV) in einer Testprobe, die HCV enthalten kann, das
folgende Schritte umfaßt:
a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit wenigstens einem
anti-HCV E2/NS1 Antikörper oder einem Fragment davon, der/das an
einer festen Phase angebunden ist, wobei der Antikörper
spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet, unter Ausbildung einer
Mischung;
b) Inkubation der Mischung eine Zeit lang und unter
Bedingungen, die zur Ausbildung von Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind;
c) In-Kontakt-Bringen der Komplexe mit einem
Indikatorreagenz, das eine signalerzeugende Verbindung umfaßt,
die ein nachweisbares Signal erzeugt, die an einen anti-HCV
E2/NS1 Antikörper oder an ein Fragment davon angebunden ist,
unter Ausbildung einer zweiten Mischung;
d) Inkubation der zweiten Mischung eine Zeit lang und unter
Bedingungen, die zur Ausbildung von
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind; und
e) Bestimmung der Anwesenheit von HCV in der Testprobe durch
den Nachweis des erzeugten meßbaren Signals, wobei die Menge an
in der Testprobe vorhandenem HCV zum meßbaren Signal
proportional ist, wobei der Antikörper, der gegenüber dem HCV
E2/NS1 Antigen nach Schritt (a) oder nach Schritt (c) spezifisch
ist, ein monoklonaler Antikörper ist, der von einer ATCC
Hybridomzellinie ausgeschieden wird, die aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der ATCC Hinterlegung Nr. HB 10857 und der ATCC
Hinterlegung Nr. HB 10856 besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die signalerzeugende
Verbindung aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer
lumineszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung,
einem Enzym und einem radioaktiven Element besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der anti-HCV Antikörper, der
an die feste Phase angebunden ist, ein polyklonaler Antikörper
ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der anti-HCV E2/NS1
Antikörper, der an die feste Phase angebunden ist, ein
monoklonaler Antikörper ist.
9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Indikatorreagenz eine
signalerzeugende Verbindung umfaßt, die an einen polyklonalen
Antikörper angebunden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Indikatorreagenz eine
signalerzeugende Verbindung umfaßt, die an einen monoklonalen
Antikörper angebunden ist.
11. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und Menge von
Hepatitis C Virus (HCV), das in einer Testprobe vorhanden sein
kann, das folgendes umfaßt:
a. In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einem polyklonalen
anti-HCV E2/NS1 Antikörper oder einem Fragment davon, der/das an
eine feste Phase angebunden ist, und mit einem Indikatorreagenz,
das einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon
umfaßt, das spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet, das an eine
signalerzeugende Verbindung angebunden ist, die ein meßbares
nachweisbares Signal erzeugt, unter Ausbildung einer Mischung,
wobei der monoklonale Antikörper ein monoklonaler Antikörper
ist, der von einer ATCC Hybridomzellinie ausgeschieden wird, die
aus der Gruppe gewählt ist, die aus ATCC Hinterlegung Nr. HB
10856 und ATCC Hinterlegung Nr. HB 10857 besteht;
b. Inkubation der Mischung eine Zeit lang und unter
Bedingungen, die zur Ausbildung von
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen führen; und
c. Bestimmung der Anwesenheit von HCV, das in der Testprobe
vorhanden ist, durch den Nachweis des meßbaren Signals als, eine
Anzeige für die Gegenwart von HCV in der Testprobe, wobei die
Menge an HCV, die in der Testprobe vorhanden ist, zum erzeugten
meßbaren Signal proportional ist.
12. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und Menge von
Hepatitis C Virus (HCV), das in einer Testprobe vorhanden sein
kann, das folgendes umfaßt:
a. In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einem monoklonalen
anti-HCV E2/NS1 Antikörper oder einem Fragment davon, der/das an
eine feste Phase angebunden ist, und mit einem Indikatorreagenz,
das einen polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon
umfaßt, das spezifisch an HCV E2/NS1 Antigen bindet, das an eine
signalerzeugende Verbindung angebunden ist, die ein meßbares
nachweisbares Signal erzeugt, unter Ausbildung einer Mischung,
wobei der monoklonale Antikörper ein monoklonaler Antikörper
ist, der von einer ATCC Hybridomzellinie ausgeschieden wird, die
aus der Gruppe gewählt ist, die aus ATCC Hinterlegung Nr. HB
10856 und ATCC Hinterlegung Nr. HB 10857 besteht;
b. Inkubation der Mischung eine Zeit lang und unter
Bedingungen, die zur Ausbildung von
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen führen; und
c. Bestimmung der Anwesenheit von HCV, das in der Testprobe
vorhanden ist, durch den Nachweis des meßbaren Signals als eine
Anzeige für die Gegenwart von HCV in der Testprobe, wobei die
Menge an HCV, die in der Testprobe vorhanden ist, zum erzeugten
meßbaren Signal proportional ist.
13. Assay Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von HCV Antigen in
einer Testprobe, das folgendes umfaßt:
einen Behälter, der mindestens einen monoklonalen Antikörper
oder ein Fragment davon enthält, der/das spezifisch an HCV
E2/NS1 Antigen bindet, wobei der monoklonale Antikörper ein
monoklonaler Antikörper ist, der von einer ATCC Hybridomzellinie
ausgeschieden wird, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus: ATCC
Hinterlegung Nr. HB 10856 und ATCC Hinterlegung Nr. HB 10857
besteht.
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