DE69229784T2

DE69229784T2 - Verfahren zur reinigung und detektion von lipoprotein (a) und assoziiertem cholesterol

Info

Publication number: DE69229784T2
Application number: DE69229784T
Authority: DE
Inventors: Leo J Seman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2012-05-22
Also published as: US5320968A; EP0585387B1; ATE183312T1; EP0585387A4; DE69229784D1; WO1992021015A1; EP0585387A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Verfahren, und genauer ausgedrückt, diagnostische Verfahren zum Messen von Serumanteilen von Lipoprotein (a).

2. Hintergrund der Erfindung

Cholesterin wird im Blut durch lipidhaltige Partikel befördert, die als Lipoproteine bekannt sind. Die wichtigsten dieser Lipoproteine stellen dichtes Lipoprotein (high density lipoprotein, HDL), niedrigdichtes Lipoprotein (low density lipoprotein, LDL), sehr niedrigdichtes Lipoprotein (very low density lipoprotein, VLDL) und Lipoprotein (a) (Lp(a)) dar. Von diesen Komponenten kann HDL-Cholesterin direkt durch Ausfällen aller apoB-haltigen Lipoproteine (VLDL, LDL und Lp(a)) gemessen werden. VLDL ist das einzige beständige Lipoprotein mit Triglycerid als der Hauptlipidkomponente. Es sind gewöhnlich vier Gramm Triglyceride für jedes Gramm Cholesterin in VLDL vorhanden. LDL ist traditionell durch Subtraktion von HDL- und VLDL- Cholesterin vom Gesamtcholesterin bestimmt worden.
Es ist vor kurzem gezeigt worden, daß Lp(a) ein wichtiger cholesterinhaltiger Blutbestandteil ist. Mehrere aktuelle Fallstudien haben gezeigt, daß Plasma Lp(a) bei Testpersonen mit Erkrankungen der Herzkranzarterie und fortgeschrittener Atherosklerose erhöht ist. Lp(a)- Plasmaanteile scheinen vererbt zu werden und schwanken nicht durch Ernährung. Lp(a)-Plasmaanteile können jedoch mit Nikotinsäure und Neomycin verringert werden. Da eine Behandlung möglich ist, stellt Überprüfung der Bevölkerung als Teil einer Gesamtlipidprofilbestimmung einen praktischen Ansatz zum Identifizieren und Verringern dieses Risikofaktors dar.
Lp(a) ist nie als eine cholesterinhaltige Blutkomponente gemessen worden. In der Vergangenheit wurden nur Proteinkomponenten des Lp(a)-Moleküls gemessen. Heute haben die meisten Forscher die Praktik angenommen, die gesamte Masse von Lp(a) durch Schätzung seines einzigartigsten Cholesterin-Apolipoproteins zu berechnen, nämlich apo(a). Lp(a) enthält nicht nur Cholesterin (etwa 25% der Gesamtmasse), es enthält auch apoB&sub1;&sub0;&sub0;, apo(a) und kleine Mengen von Triglycerid und Phospholipid. Apo(a) stellt nur 8%-12% der Gesamtmasse von Lp(a) dar.
Vorhergehend sind mehrere Diagnosetestsätze basierend auf ELISA-Technologie zum Messen von Lp(a) vorgeschlagen worden. Für ELISA-Tests wird ein monoklonaler Antikörper benötigt, um ein einzigartiges Merkmal von Lp(a) zu ermitteln, von dem wenige vorhanden sind. Die einzige Komponente von Lp(a), die einzigartig für Lp(a) ist, sind kleine Regionen innerhalb des apo(a)-Moleküls. Das apo(a)- Molekül in seiner Gesamtheit ist nicht sehr einzigartig, da es aus Regionen besteht, die 78-95% Homologie mit einem anderen Plasmaprotein aufweisen, nämlich Plasminogen. Der größte Teil des apo(a)-Moleküls besteht aus sich wiederholenden Sequenzen von ungefähr 20.000 Dalton, die 78-84% Homologie mit der als Kringel IV bezeichneten Plasminogen-Region aufweisen. Das einzigartigste Merkmal von apo(a) ist sein hoher Kohlehydratgehalt. Kohlehydrat hat jedoch keine sehr antigene Beschaffenheit und es würde nicht erwartet werden, daß es umfassend zu der Entwicklung einzigartiger monoklonaler Antikörper beiträgt. Diese Merkmale machen die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch auf apo(a) und nicht auf Plasminogen reagieren, sehr schwierig.
Sears beschreibt im US-Patent Nr. 4,126,416 ein Verfahren zum Bestimmen von LDL-Cholesterin, bei dem das LDL selektiv durch ein Pflanzenlektin agglutiniert wird. Pascal (US- Patent Nr. 4,366,244) beschreibt die Ausfällung von LDL- und VLDL-Bruchteilen aus Serum unter Verwendung eines Lektins, vorzugsweise Concanavallin. Keine dieser Verweisstellen offenbart die Isolierung von Lipoprotein (a). Die Doktorarbeit von L. J. Seman (Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Mai 1988) beschreibt die Trennung von Lipoprotein (a) aus einer Mischung von Serumlipoproteinen unter Verwendung von Lektinaffinitätschromatographie; die Rückgewinnung war jedoch unvollständig (etwa 85%) und das zurückgewonnene Lipoprotein (a) enthielt etwa 15% LDL und andere Verunreinigungen.
Es wäre daher nützlich, einen einfachen, verläßlichen Test zum Messen von Lp(a) zur Verfügung zu haben. Aktuelle Verfahren zum indirekten Bestimmen von mit Lp(a) verknüpftem Cholesterin, bei denen zuerst die apo(a)- Konzentrationen bestimmt werden, haben eine Fehlerspanne von + oder - 5%. Dies beruht teilweise auf der Tatsache, daß apo(a) in einer Anzahl von Isoformen existiert, die hinsichtlich ihrer Masse um bis zu 50% variieren können. Das hier offenbarte Verfahren ist eine direkte Bestimmung von Lp(a)-Cholesterin und hat eine Fehlerspanne von + oder - 1%.
Ein Verfahren wird geschaffen für einstufige Reinigung von Lipoprotein (a) in einer ein oder mehrere andere Serumlipoproteine enthaltenden flüssigen Probe, welches die Schritte umfaßt:
a) eine flüssige Probe bei einem pH-Wert von etwa 6,9 bis 7,5 mit einem Lektin enthaltenden Festträger-Reagens in Kontakt zu bringen, wobei das Lektin sich spezifisch an Lipoprotein(a)-Monosaccharideinheiten bindet, die aus N- Acetyl-D-Glukosamin und N-Acetylneuroaminsäure ausgewählt sind,
unter Bedingungen, die zum Binden von Lipoprotein (a) an das trägergebundene Lektin wirksam sind;
b) nicht spezifisch an den Träger gebundenes Material zu entfernen, und wobei das selektiv gebundene Lipoprotein (a) im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt das Lektin ein Weizenkeimagglutinin, Limabohnenagglutinin, Phytohemagglutinin oder Molukkenkrebslektin dar.
In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Analysieren von Lipoprotein (a) in einer Blutfluidprobe durch Analysieren der mit dem Lipoprotein (a) verknüpften Cholesterinmenge, das die zusätzlichen Schritte einschließt,
die Cholesterinmenge in dem Lipoprotein(a) zu analysieren, das an den festen Träger gebunden ist.
Eine bevorzugte Analyse ist für die Bestimmung von mit Lp(a) verknüpftem Cholesterin als ein Verfahren zum Messen von Lp(a) vorgesehen. In dieser Ausführungsform kann das trägergebundene Lp(a) mit einem oberflächenaktiven Stoff, der Lp(a) zerbrechen kann, und Cholesterinoxidase behandelt werden, und das freigesetzte, freie Cholesterin kann durch konventionelle Reaktion mit Cholesterinoxidase und einem Peroxidase/Farbstoffsystem analysiert werden.
Weiter ist eine Analysevorrichtung zur Verwendung beim Analysieren von Lp(a) in einer Blutfluidprobe offenbart. Die Vorrichtung umfaßt eine Festträger-Matrix mit einer Binderegion von angelagerten Lektinmolekülen und eine Matrixstruktur, auf der eine Probe in die Matrix für Bewegung von Probenkomponenten durch die Binderegion eingeführt wird. Die Vorrichtung umfaßt weiter ein Reagenskissen, das Reagenzien zum Freisetzen von Cholesterin aus an den Träger gebundenem Lp(a), und zum Analysieren von freiem Cholesterin enthält.
Diese und andere Ziele und. Merkmale der Erfindung werden deutlicher werden, wenn die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Seitenschnittansicht einer Analysevorrichtung, die gemäß der Erfindung zum Analysieren von mit Lp(a) verknüpftem Cholesterin ausgeführt ist;
Fig. 2 illustriert das selektive Einfangen von Lp(a)- Partikeln in einer Serumprobe in einer Bindereaktion der Analysevorrichtung; und
Fig. 3 zeigt den Betrieb der Analysevorrichtung, um Reagenzien für Cholesterinfreisetzung und Cholesterinanalyse in Kontakt mit in der Binderegion der Matrixvorrichtung immobilisiertem Lp(a) zu bringen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Festträger-Reagens

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet ein Festträger- Reagens zum selektiven Einfangen von Lp(a) in einer Fluidprobe, die andere Lipoproteine so wie LDL, VLDL und HDL enthält. Das Festträger-Reagens umfaßt einen festen Träger und daran befestigt, vorzugsweise durch kovalente chemische Befestigung, ein Lektin, das sich speziell an GlcNAc oder NANA bindet, die hervortretende Reste in Lp(a) darstellen. Diese Gruppe von Lektinen umfaßt zum Beispiel Weizenkeimagglutinin, Phytothemagglutinin, Limabohnenagglutinin und Molukkenkrebslektine. Alle diese Lektine sind von gewerblichen Lieferanten erhältlich.
Befestigung von Lektinen an einem festen Träger kann gemäß bekannten Derivatisierungsverfahren durchgeführt werden. Aktivierbare Perlen (z. B. Agarose, Acrylamid oder Glas) sind als das feste Substrat bevorzugt. Eine Vielzahl bekannter Verfahren sind zur Verwendung beim Befestigen eines Proteins (z. B. eines Lektins) an einer Perlenstruktur bekannt. Das üblichste Verfahren für die kovalente Befestigung eines Proteins an einer Perle ist, die Perle unter Verwendung eines jeglichen einer Anzahl chemischer Mittel zu verwenden und anschließend das Protein an die Perlen zu binden. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Allgemein können die Perlen unter harten Bedingungen ohne jegliche Verringerung der Kopplungsleistung aktiviert werden, wodurch die Verwendung einer Reihe von Aktivierungsprotokollen ermöglicht wird.
Die Herstellung aktivierter Perlen ist verhältnismäßig kostengünstig, und viele der Kopplungsverfahren erbringen eines Verbindung, die für einen breiten Bereich von Denaturierungsbedingungen stabil ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß eine Anzahl aktivierter Perlen im Handel erhältlich sind. Eine Alternative besteht in der Aktivierung von Lektin selbst; die Besonderheit des Lektins für Lp(a) kann jedoch durch eine solche Behandlung nachteilig beeinflußt werden. Tabelle 1 stellt eine Teilliste aktivierbarer Perlentypen, funktioneller Gruppen und von Aktivierungsverbindungen dar. Von den in Tabelle 1 aufgeführten Verfahren ist Cyanbromid-Aktivierung die am häufigsten verwendete. Cyanbromid bietet ein hohes Kopplungsvermögen, und ein. umfangreicher Literaturkörper ist bezüglich der Technik entwickelt worden. Tabelle 1
Ein weiteres Verfahren für die Befestigung eines Lektins an einem Säulenfüllmaterial besteht in der Kopplung des Lektins mit einem bifunktionellen Reagens, wobei sich eine Gruppe an eine passende Gruppe in dem Lektin bindet und die andere frei bleibt, um die funktionelle Gruppe an das feste Substrat zu binden. Für indirekte Kopplung gewöhnlich verwendete Reagenzien sind die wasserlöslichen Carbodiimide so wie: (1) 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid HCl (EDAC oder EDCI) oder 1-Cyclohexyl-3-(2- Morpholinethyl)-Carbodiimid-Metho-p-Toluol-Sulfonat (CMIC oder CMCI); (2) die Kondensationswirkstoffe für Peptidsynthese so wie N-Ethoxycarbonyl-2-Ethoxy-1,2- Dihydroquinolin (EEDQ); (3) Glutaraldehyd oder (4) Periodat.
Nachdem die Proteine aktiviert sind, werden sie an die Säulenfüllungsperlen gebunden. Durch Carbodiimide und Kondensationsreagenzien aktivierte Proteine werden sich an Carboxylsäure binden, während die durch Glutaraldehyd und Periodat aktivierten Antikörper sich an Amine binden werden. Zusätzlich zu den hier spezifisch aufgeführten Kopplungsverfahren sind den Fachleuten in diesem Bereich andere Verfahren gut bekannt.
Im Falle von festen Perlenpartikeln, können die Perlen als eine wässerige Puffersuspension gebildet werden und zu einer Säule übertragen werden, die für Affinitätschromatographie geeignet ist, z. B. eine halbdurchlässige Sperre am Boden der Säule aufweist. Wenn sich die Kolloide aus der Suspension absetzen, wird ein Bett gebildet. Zwischenraum existiert innerhalb des Säulenbetts, entweder zwischen den Perlen oder durch Poren in den Perlen, welcher den Fluß von Protein durch das Säulenbett mit dem Puffer ermöglicht. Daher ist der Oberflächenbereich, an dem das Affinitätsreagens befestigt ist, außerordentlich hoch für ein jegliches gegebenes Säulenvolumen (verglichen, zum Beispiel, mit Befestigung eines Affinitätsreagens an einer mikro-geschweißten Platte oder einer Membran). Es ist nicht nur der Oberflächenbereich extrem hoch, sondern es kann auch eine Säule für kontinuierlichen Probenfluß ausgeführt werden, wodurch Reinigung von einem relativ großen Volumen (im Verhältnis zum Säulenvolumen) vereinfacht wird.
An aktivierte Perlen gebundenes Lektin kann auch verwendet werden, um Lp(a) in einem konstant vermischenden Schlamm aus Lektinperlen mit löslichem Lp(a) zu binden, im Gegensatz zu ihrer Verwendung in einer Affinitätssäule. Nach Inkubation in dem Schlamm für eine zweckdienliche Zeitspanne müssen die Perlen jedoch gesammelt und vor Elution von gebundenem Lp(a) gewaschen werden. Die Säule ist bevorzugt, da sie keine solche Handhabung erfordert.
Verfahren zum Befestigen von Proteinen an solchen Substraten sind im Stand der Technik gut bekannt. In einer Ausführungsform zur Verwendung in einer Trockenkissenanalyse zum Analysieren von mit Lp(a) verknüpftem Serumcholesterin (im folgenden beschrieben) stellt das Festträger-Substrat eine Glasfaser-Filtermatrix dar. Verfahren zum Aktivieren von Glasfasern (oder Modifizieren der Glasfaseroberfläche, so daß sie reaktive Gruppen enthält), und zum kovalenten Befestigen von Proteinen an den modifizierten Fasern, sind gut bekannt.

B. Binden von Lp(a) an den Träger.

Eine flüssige Probe, die Lp(a) oder mit Lp(a) verknüpftes Cholesterin enthält, wird mit dem Festträger-Reagens unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Bindung von Lp(a) an das Lektin zweckdienlich sind. Die flüssige Probe und das Substrat werden voneinander getrennt und der Träger kann gewaschen werden, um nicht spezifisch gebundene Komponenten zu entfernen. Lp(a) wird dann von dem Lektin freigesetzt oder zerbrochen, um einzelne Komponenten so wie Cholesterin freizusetzen, wie im folgenden beschrieben werden soll.
Ein breiter Bereich von Bedingungen ist für das selektive Binden von Lp(a) an das trägergebundene Lektin geeignet, solange der pH-Wert der Säule zwischen 6,9 und 7,5 beträgt. Der optimale pH-Bereich für die Verwendung des Weizenkeimagglutinins beträgt etwa 6,9 bis 7,5. Wie in der folgenden Erläuterung anhand eines Beispiels gezeigt ist, wurde überraschend wirksame Reinigung von anderen Lipoproteinen bei einem pH-Wert von etwa 7,4 erreicht. Die Ionenkonzentration der flüssigen Lösung liegt vorzugsweise innerhalb physiologischer Grenzen (d. h. weniger als 400 mM). Es gibt einen breiten Bereich von Temperaturen, bei denen sich Lp(a) wirksam an Weizenkeimagglutinin bindet. Zum Beispiel sind die hier beschriebenen Verfahren erfolgreich bei Temperaturen in einem Bereich von 4-37ºC durchgeführt worden.
Nach dem Schritt, in dem Lp(a) an das Festträger-Reagenz gebunden wird, kann das Trägerreagens mit einer Waschlösung gewaschen werden, um das nicht spezifisch gebundene Material zu entfernen. Die Eigenschaften der Waschlösung (z. B. pH-Wert, Ionenkonzentration, etc.) werden so ausgewählt, daß die spezifische Bindungswechselwirkung zwischen dem Lektin und Lp(a) nicht zerstört wird.
Nach dem Waschschritt kann das Lp(a) von dem Trägerreagens durch konventionelle Verfahren freigesetzt werden. Zum Beispiel kann das gebundene Lp(a) freigesetzt werden, indem das feste Substrat mit einer Lösung mit Eigenschaften (z. B. pH-Wert oder Ionenkonzentration) in Kontakt gebracht wird, welche zum Zerstören der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Lp(a) und dem Lektin dienen. Alternativ kann das gebundene Lp(a) freigesetzt werden, indem das feste Substrat mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die ein Molekül enthält, welches mit Lp(a) für Lektinbindung konkurriert. Ein Beispiel eines solchen Moleküls zur Verwendung mit den oben aufgeführten bevorzugten Lektinen ist N-Acetyl-D-Glukosamin oder N-Acetylneuroaminsäure. Eine konzentrierte Lösung aus einem solchen Konkurrenzmolekül führt, wenn sie mit an ein bevorzugtes Lektin gebundenem Lp(a) in Kontakt gebracht wird, zu der Freisetzung von Lp(a) von dem festen Substrat.
Das Verfahren zum Isolieren von Lp(a) vollständig frei von anderen Lipoproteinen, kann eingestellt werden, um eine Vielzahl von Zielen zu erreichen. Zum Beispiel kann die Menge von an Lektin gebundenem Lp(a), das von dem festen Substrat gelöst wird, zum Berechnen der Konzentration des Lp(a) in der flüssigen Probe verwendet werden. Viele epidemiologische Studien aus Europa und Nordamerika haben festgestellt, daß, wenn Plasmamengen von Lp(a) 0,20 g/l überschreiten, ein beträchtlich höheres Risiko von Herz- und Gehirngefäß-Atherosklerose vorhanden ist (siehe z. B. Hegels, Can. J. Cardiol. 5: 263-265).
Freigesetztes Lp(a) kann zum Beispiel durch eines einer Vielzahl von Festphasen-Analyseformaten analysiert werden, die ein reportermarkiertes Anti-Lp(a)- oder Lektinreagens für spezifische Bindung an Lp(a) verwenden. Alternativ kann das Lp(a) direkt analysiert werden, ohne es aus dem Festträger-Reagens zu eluieren. Bei einem Analyseformat wird das gebundene Lp(a) mit einem reportermarkierten Anti- Lp(a)-Antikörper, so wie mit Peroxidase markiertem Anti- Lp(a), zur Reaktion gebracht und der feste Träger wird anschließend hinsichtlich gebundenem Reporter untersucht.
Bei einer anderen allgemeinen Ausführungsform wird auf dem Festträger-Reagens eingefangenes Lp(a) indirekt analysiert, indem die Menge von mit gebundenem oder freigesetztem Lp(a) verknüpftem Cholesterin gemessen wird. Dies kann durch konventionelle Verfahren zum Bestimmen von Cholesterinkonzentrationen erreicht werden, die den Fachleute gut bekannt sind. Solche Verfahren umfassen zum Beispiel die enzymatischen Analysen mit Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase, wie im folgenden beschrieben werden soll.

C. Lp(a) Analysevorrichtung und Verfahren.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren zum Analysieren von Serum-Lp(a) durch Analysieren der mit trägergebundenem Lp(a) verknüpften Cholesterinmenge verwendet. Eine zum Durchführen des Verfahrens entworfene Analysevorrichtung ist bei 10 in Fig. 1 dargestellt. Die Vorrichtung umfaßt einen Grundteil 12, auf dem eine Fasermatrix 14 in Form eines rechteckigen Streifens 16 gehalten wird. Die Matrix ist eine benetzbare Matrix, so daß auf eine Oberfläche der Matrix aufgebrachte Flüssigkeit durch Kapillarwirkung in und durch die Matrix gesaugt wird. Eine bevorzugte Matrix stellt ein Glasfaserfilter so wie ein GF/D- oder PD008-Filter dar, der durch Whatman geliefert wird und eine Packdichte von etwa 0,16 g/cm³ aufweist. Die Matrix wird auf Seitenabmessungen von etwa 5 · 40 mm und eine Dicke von etwa 1 mm zugeschnitten.
Die linke Endregion der Matrix begrenzt eine Probenauftragsregion 18, an der Probe in die Matrix eingebracht wird. Von hier wird die Probe durch Kapillarwirkung zur rechten Seite in der Figur durch eine Binderegion 20 und in Richtung auf die rechte Endregion der Matrix gezogen. Ein vergrößerter Teil der Binderegion ist in vereinfachter Ansicht in Fig. 2 gezeigt. In dieser Region werden die Fasern, die die Region bilden, so wie Fasern 22, mit Lektinmolekülen (L) so wie dem Molekül 24 derivatisiert, und bilden folglich das Festträger-Reagens in der Vorrichtung.
Die Glasfasern in der Binderegion der Matrix werden mit Lektin gemäß den oben beschriebenen Verfahren derivatisiert. Die Derivatisierungsregion kann auf eine Region des Matrixstreifen begrenzt werden, zum Beispiel durch enges Festklemmen des Streifens auf beiden Seiten der Region während der Derivatisierung, um einen Fluß des Derivatierungsreaktionsfluids über die gewünschte Binderegion hinaus zu verhindern.
Zum Abschluß der Beschreibung der in Fig. 1 gezeigten Analyseeinrichtung endet der Grundteil 12 an seinem rechten Ende in der Figur an einem Block 26, an dem ein Ausleger 28 gehalten wird, der an seinem unteren rechten Endbereich ein Reagenskissen 30 trägt. Das Kissen ist ein fluidabsorbierendes Kissen, so wie ein Glasmatrixkissen, in dem (a) Reagenzien zum Freisetzen von freiem Cholesterin von Lp(a) und (b) Reagenzien zum Analysieren von freiem (nicht verestertem) Cholesterin eingelagert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die freisetzenden Reagenzien einen oberflächenaktiven Stoff, vorzugsweise einen konventionellen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff so wie einen oberflächenaktiven Stoff vom "Tween"- oder Triton-XTM-Typ, welcher wirksam beim Zerreißen von Lp(a) unter der Freisetzung von freien und veresterten Formen von Cholesterin in dem Lp(a)- Partikel ist.
Ebenfalls in einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Analysereagens Cholesterinoxidase, welche wirksam ist, um H&sub2;O&sub2; in der Anwesenheit von freien Cholesterin zu erzeugen, ein Peroxidaseenzym und einen Peroxidasesubstratfarbstoff, der eine deutliche Farbänderung durchmacht, wenn er durch H&sub2;O&sub2; in der Anwesenheit des Peroxidaseenzyms oxidiert wird. Solche Peroxidase/Farbstoffsysteme zum mengenmäßigen Bestimmen von H&sub2;O&sub2;, so wie sie durch ein substratabhängiges Oxidasesystem erzeugt werden, sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die freisetzenden und analysierenden Reagenskomponenten können in dem Kissen durch. Infundieren einer Lösung der Komponenten in das Kissen und konventionelles Trocknen des infundierten Kissens eingelagert werden.
In Betrieb wird eine Blutfluidprobe, so wie eine Serumprobe, auf Region 18 der Matrix aufgetragen, von der das Fluid in und durch die Matrix in Richtung auf die rechte Seite in der Figur gezogen wird. Die Auftragsregion, und der darunterliegende Teil der Matrix dienen daher als ein Mittel zum Einführen einer Probe in die Matrix.
Wenn die Probe durch die Binderegion der Matrix hindurchgeht, binden sich Lp(a)-Partikeln in der Probe, so wie sie bei 31 gezeigt sind, spezifisch an an den Matrixfasern befestigte Lektin (L)-Moleküle, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Zur gleichen Zeit bewegen sich andere Lipoproteinkomponenten, so wie LDL-Partikeln 32 (gefüllte Quadrate), VLDL-Partikeln 34 (gefüllte Kreise) und HDL- Partikeln 36 (leere Kreise) durch die Binderegion in Richtung auf die rechte Endregion des Streifens, wie in Fig. 3 dargestellt ist. Die Bewegung von Fluid durch die Matrix ist daher wirksam, um Lp(a)-Partikeln selektiv an die Festträger-Matrixfasern in der Binderegion der Matrix zu binden, und das Lp(a) von anderen in der Probe enthaltenen Lipoproteinen zu trennen.
Nach dem Binde- und Trennschritt wird der Ausleger 24 betätigt, um das Kissen 30 auf dem Ausleger mit der Binderegion (Festträger-Reagenz) der Matrix in Kontakt zu bringen, wie in Fig. 3 dargestellt ist. Dies ermöglicht es dem Fluid in der Matrix, das Kissen zu benetzen, und eine Lösung aus Reagenskomponenten in dem Kissen zu bilden, die jetzt wie durch Pfeile 38 angezeigt in die benachbarte Binderegion fließen kann, und das Reagens in dem Kissen mit dem gebundenen Lp(a) zu vermischen. Der Ausleger schafft daher ein Mittel, um das Reagenskissen mit der Matrixbinderegion in Kontakt zu bringen.
Die Freisetzungsreagenzien in dem Kissen sind wirksam, wenn sie in die Binderegion eingeführt werden, um Cholesterin von gebundenen Lp(a)-Partikeln freizusetzen, und das freigesetzte Cholesterin in freies Cholesterin umzuwandeln. Das freie Cholesterin wirkt seinerseits als ein Substrat für die Analysereagenskomponenten, so wie Cholesterinoxidase. Freies Cholesterin kann dann mengenmäßig bestimmt werden durch eine kolorimetrische Standardreaktion, so wie eine solche, die die oben genannten Komponenten einschließt.

Erläuterung anhand eines Beispiels

Weizenkeimagglutinin wurde auf durch CNBr aktivierter SepharoseTM 4B (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Das immobilisierte Weizenkeimagglutinin (wheat germ agglutinin, WGA) wurde mit einer durch Natriumphosphat gepufferten Standard- Salzlösung, pH-Wert 7,4, gewaschen. Menschliches Plasma mit Lp(a)-Konzentrationen (d. h. gesamte Lp(a)-Masse) in einem Bereich von 2 mg/dl bis 80 mg/dl mit Triglyceridkonzentrationen in einem Bereich von 37 mg/dl bis 1850 mg/dl wurden über immobilisierte WGA-4% Agarose (die etwa 6,5-7,6 mg WGA pro ml enthält) gegossen. Die Säulen wurden mit 10 Volumen PBS (pH-Wert 7,4), das 0,3 mM Na&sub2; EDTA enthielt, gewaschen, um Fibrinbildung in dem Plasma zu verhindern. Die Säulen wurden dann mit 2-3 Volumen GlcNAc (100 mM) enthaltendem PBS eluiert.
Lp(a) und Cholesterin wurden in allen Bruchteilen gemessen. Lp(a)-Anteile wurden unter Verwendung des Lp(a) MacraTM- Testsatzes bestimmt, der durch Terumo diagnostics (Elkin, MD) geliefert wird. Cholesterinanteile wurden anhand eines Abbott-Autoanalysators bestimmt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Das gesamte Lp(a) in der Probe wurde in dem eluierten GlnNAc-Volumen ermittelt. Kein Lp(a) wurden in den PBS-Wäschen ermittelt. Die Menge von Lp(a) in den GlcNAc-Eluaten war gleich der in den Ausgangsplasmen gefundenen (wie durch Lp(a) Macra bestimmt). Der Abbot- Autoanalysator ermittelte die gleichen Ergebnisse in der Anwesenheit von 100 mM GlnNAc in PBS, wie in PBS allein. Das in dem GlcNAc-Eluat bestimmte Cholesterin (in mg/dl) betrug durchgehend 25-26% der Gesamtmasse von Lp(a), wie durch Lp(a) Macra berechnet wurde. Das GlcNAc-Eluat enthielt nur einen Prebeta-1-Partikel, der mit reinem Lp(a) gemeinsam migrierte und etwas langsamer als das VLDL in dem gesamten Plasma bei Agarosegelelektrophorese migrierte. Ein Immunoblot dieses Gels zeigte Reaktionsbereitschaft dieses Prebeta 1-Bandes mit Antikörpern zu apoB und eines monoklonalen Antikörpers zu apo(a), der nicht mit Plasminogen (geliefert durch Terumo) kreuzreagiert.
Diese Ergebnisse bestätigen im wesentlichen die Identität zwischen dem mit GlcNAc eluierten Lipoprotein und Lp(a).
Bei einer Testperson mit 35 mg/dl Lp(a)-Masse in Plasma, stellt Lp(a) nur 35% der Gesamtmasse von Proteinen dar, die sich an das WGA binden. Lp(a) ist jedoch das einzige Plasmalipoprotein, das auf der WGA-Agarosesäule zurückgehalten wird.

Claims

1. Verfahren für einstufige Reinigung von Lipoprotein (a) über Affinitätschromatographie, wobei das Verfahren umfaßt:

(i) eine Lipoprotein (a) enthaltende flüssige Probe und eine oder mehr andere Serumlipoproteine bei einem pH-Wert von etwa 6,9 bis 7,5 mit einem Festträger-Reagens, das an einem festen Träger befestigtes Lektin enthält, in Kontakt zu bringen, wobei sich das Lektin spezifisch an Lipoprotein (a)-Monosaccharideinheiten bindet, die aus N-Acetyl-D- Glukosamin und N-Acetylneuroaminsäure ausgewählt sind, unter Bedingungen, die zum selektiven Binden von Lipoprotein (a) an das trägergebundene Lektin wirksam sind; und

(ii) nicht spezifisch gebundenes Material von dem festen Träger zu entfernen;

wobei der Lektin enthaltende feste Träger im wesentlichen frei von Proteinen ist, die nicht das selektiv gebundene Lipoprotein (a) darstellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Lektin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Weizenkeimagglutinin, Limabohnenagglutininen, Phytohemagglutinin und Molukkenkrebslektinen besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der feste Träger SepharoseTM 4B aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Entfernen einschließt, den festen Träger zum Entfernen von Lipoproteinen zu waschen, die nicht spezifisch an das Lektin auf dem festen Träger gebunden sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiter Analysieren des selektiv gebundenen Lipoproteins (a) nach Entfernungsschritt (ii) umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Analysieren einschließt, an den festen Träger gebundenes Lipoprotein (a) freizusetzen und das freigesetzte Lipoprotein (a) zu analysieren.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Analysieren einschließt, Cholesterin von dem Lipoprotein (a) freizusetzen und das freigesetzte Cholesterin zu analysieren.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Analysieren einschließt, das Lipoprotein (a) mit Cholersterinesterase und einem oberflächenaktiven Stoff zum Freisetzen von Cholesterin aus dem Lipoprotein (a) zu behandeln, das freigesetzte Cholesterin mit Cholesterinoxidase zum Erzeugen von H&sub2;O&sub2; zur Reaktion zu bringen, und hinsichtlich erzeugtem H&sub2;O&sub2; unter Verwendung eines Peroxidaseenzyms zu analysieren.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiter Isolieren des selektiv gebundenen Lipoproteins (a) durch Eluieren des Lipoproteins (a) von dem festen Träger nach Entfernungsschritt (ii) umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Eluieren umfaßt, den festen Träger mit einer ein Molekül enthaltenden Lösung in Kontakt zu bringen, das mit Lipoprotein (a) für Lektinbindung konkurriert.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Eluieren umfaßt, den festen Träger mit einer Lösung in Kontakt zu bringen, die wirksam zum Zerstören der spezifischen Bindungswechselwirkung zwischen Lipoprotein (a) und dem Lektin ist.