DE69221861T2

DE69221861T2 - Sequenzierung von oligosacchariden

Info

Publication number: DE69221861T2
Application number: DE69221861T
Authority: DE
Inventors: Rajesh Parekh; Sally Prime
Original assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Current assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Priority date: 1991-05-07
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2012-05-08
Also published as: EP0584128B1; DE69221861D1; EP0584128A1; US5427744A; GB9109842D0; JPH06506828A; WO1992019766A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Analyse von Oligosacchariden und im besonderen auf die als Sequenzierung von Oligosacchariden bekannte Analyseform.
Oligosaccharide bilden eine Gruppe chemischer Verbindungen, welche sich aus mehreren, durch glykosidische Verknüpfung miteinander verbundenen Monosaccharideinheiten zusammensetzen. Wichtige Quellen in der Natur vorkommender Oligosaccharide sind Glycoproteine, in welchen entweder durch glykosodische N- Verknüpfung oder glykosodische O-Verknüpfung mit einer Peptidkette verbunde Oligosaccharide vorgefunden werden; diese Oligosaccharide können sich bis zu stark verzweigten Strukturen mit vielen (z.B. über 30) Monosaccharideinheiten verändern.
Bei einer Sequenzanalyse einer unbekannten Oligosaccharidstruktur erfolgt eine einzelne Reaktion mit einem einzelnen Reagens auf einer reinen Probe des unbekannten Oligosaccharids und den analysierten Produkten. Das Reagens wird so gewählt, daß das Reaktionsprodukt das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer partikulären, strukturellen Untereinheit bzw. Untereinheiten, welche in der Probe vorkommen oder nicht vorkommen können, erkennen läßt. Basierend auf den Ergebnissen dieser Analyse kann eine weitere Reaktion mit einem anderen Reagenz, entweder mit weiteren reinen Ausgangsproben oder mit den Produkten der vorherigen Reaktion, vorgenommen werden. Aus der Analyse der zweiten Reaktion können weitere Schlüsse über die Struktur der Oligosaccharid-Ausgangsprobe gezogen werden, wobei der Vorgang sooft wie erforderlich wiederholt werden kann, bis mit den verfügbaren Reagenzien über die ursprüngliche Oligosaccharidstruktur so viele Informationen wie möglich herausgeholt wurden bzw. bis keine reine Probe und von dieser abstammende Produkte mehr zur Verfügung stehen.
Der Endpunkt jeder Analyse einer Oligosaccharidstruktur ist, unabhängig davon, ob das Analysenverfahren sequentiell erfolgt oder nicht, Informationen im Hinblick auf die Oligosaccharidstruktur abzuleiten; diese Informationen beinhalten
(i) den Typ jeder Monosaccharideinheit in dem Oligosaccharid,
(ii) die Reihenfolge, in welcher die Monosaccharide in dem Oligosaccharide angeordnet sind,
(iii) die Position der Verbindungen zwischen den einzelnen Monosaccharideinheiten (z.B. 1-3, 1-4) und folglich jede Verzweigungsstruktur,
(iv) die Orientierung der Verbindung zwischen den einzelnen Monosaccharideinheiten (d.h. ob es sich bei einer Verbindung um eine Alpha- Verbindung oder um eine Beta-Verbindung handelt).
Ein Mittel, welches das Verfahren einer strukturellen Analyse unterstützt, kann als "Sequenzierungsagens" angesehen werden. Handelt es sich bei einem Sequenzierungsagens um ein chemisches bzw. biochemisches Reagens, kann das Sequenzierungsagens als Sequenzierungsreagens betrachtet werden. Beispiele von Sequenzierungsreagenzien sind Enzyme, wobei typische, bei der Sequenzierung von Oligosacchariden verwendete Enzyme in der nachfolgenden Tabelle der Richtlinien für Enzyme angeführt sind. Tabelle - Richtlinien für Enzyme Nachfolgend eine Liste der Enzyme, welche am häufigsten zur Spaltung von Monosacchariden aus N- verbundenen Oligosacchariden verwendet werden und der Richtlinien, welche zeigen, welche Monosaccharide durch jedes dieser Enzyme gespalten werden und vom welchem Teil des Oligosaccharides eine Spaltung erwartet werden kann.
Es wird darauf hingewiesen, daß ein Sequenzierungsagens so gewählt werden kann, daß, wenn es in Kontakt mit einem unbekannten Oligosaccharid gebracht wird, die gewonnenen Produkte das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer partikulären, strukturellen Untereinheit (z.B. einer Monosaccharideinheit) in dem Oligosaccharid (in der späteren Analyse) erkennen lassen. Ferner wird angemerkt, daß durch sequentielle Berührung von entweder Proben des Ausgangsoligosaccharids oder Produkten desselben (durch vorherigen Kontakt der Proben des Oligosaccharids mit einem oder mehreren Sequenzierungsreagenzien erzeugt) mit einem Sequenzierungsreagens die Möglichkeit besteht, daraus abzuleiten, daß das unbekannte Oligosaccharid eine bestimmte Struktur bzw. Strukturen oder keine bestimmte Struktur bzw. Strukturen aufweist.
Das Vorhandensein und die Verknüpfung eines einzelnen Monosaccharids am Endpunkt eines Oligosaccharids können zum Beispiel durch die Fähigkeit eines vorgegebenen Sequenzierungsagenses, wie zum Beispiel eines Enzymes, eine Spaltung der Verknüpfung zu bewirken, bestätigt werden; erfolgt somit eine Spaltung bei Zusammenbringen von Enzym und Oligosaccharid, bestätigt der Nachweis des einzelnen Monosaccharids (von dem Oligosaccharid nun losgelöst) in den Produkten der Reaktion das Vorhandensein des Monosaccharids und definiert die Position und Ausrichtung der Verbindung des Monosaccharids in der ursprünglichen Oligosaccharid-Struktur. Es ist somit durch sequentielle Verwendung mehrerer unterschiedlicher Sequenzierungsagenzien mit spezifischen verbindungsspaltenden Fähigkeiten möglich, in zunehmenden Maße Informationen in Bezug auf die Struktur des Oligosaccharids durch Analyse abzuleiten.
Kann kein einziges Sequenzierungsagens, welches zu einer Zunahme der Informationen im Hinblick auf die Struktur des unbekannten Oligosaccharids führt, nachgewiesen werden, können mögliche Kombinationen von nacheinander verwendeten zwei, drei Agenzien oder mehr in Erwägung gezogen werden; bei jeder Betrachtung kann von der Verwendung eines Agenses, welches nicht zu einem sinnvollen Ergebnis führt, abgesehen werden, obgleich durch die Tatsache, daß es mit dem Oligosaccharid keine Reaktion zur Erzeugung von Produkten eingeht, Schlüsse im Hinblick auf die Struktur des Oligosaccharids gezogen werden können. Ebenso kann eine Kombination von gleichzeitig verwendeten zwei Agenzien oder mehr in Betracht gezogen werden.
Zumn Zwecke dieser Spezifikation kann es sich bei einem Sequenzierungsagens bzw. Reagens um ein Agens bzw. Reagens handeln, welches, wenn es in Kontakt mit einem unbekannten Oligosaccharid gebracht wird, chemische Bindungen entweder spaltet oder herstellt.
Die Wirksamkeit des Sequenzierungsverfahrens hängt entscheidend von der Wahl des in jedem Stadium des Reaktionsverfahrens zu verwendenden Agenses und der Genauigkeit der Interpretation der Ergebnisse jeder Analyse ab. Eine gute Wahl des Agenses erfordert derzeit einen äußerst erfahrenen Operator, welcher die vorliegende Strukturart bereits richtig eingeschätzt hat. Eine schlechte Wahl kann in wenig oder keinen zusätzlichen Informationen, welche sich durch einen einzelnen Versuch ergeben haben, resultieren, wodurch das Verfahren sowohl von dem Zeit- als auch Materialaufwand her unrentabel ist. Auch besteht die Gefahr, daß die Vorurteile des Operators Unklarheiten in der Interpretation der Ergebnisse zur Folge haben. Der Operator kann somit eine einzelne Struktur, welche den Versuchsergebnissen entspricht, zuordnen, während in Wirklichkeit mehr als eine Struktur mit den gleichen Beobachtungen im Einklang stehen. Eine weitere Schwierigkeit besteht in der Definierung der Stelle, an welcher durch die Verwendung der zur Verfügung stehenden Agenzien keine weiteren Informationen mehr erhalten werden können.
Die Sequenzierung von Oligosacchariden kann durch Kenntnisse des Biosynthese-Stoffwechselweges, welchen der Aufbau der Oligosaccharid-Strukturen nach sich zieht, begünstigt werden.
Somit ist es zum Beispiel bei N-verbundenen Oligosacchariden (N- Glykane) bekannt, daß eine charakteristische Kernstruktur vorliegt und Monosaccharide nur in bestimmten, genau definierten Reihenfolgen und Verzweigungsmustern zugegeben werden können. Diese Kenntnis kann zur Bildung des Begriffes 'Basis'- bzw. 'Kern'-Strukturen für Oligosaccharide angewandt werden, aus welchen Substrukturgruppen erzeugt werden können, indem spezifische Umwandlungen auf den 'Basis'-Strukturen vorgenommen werden.
In den beigefügten Zeichnungen sind in den Figuren 1 bis 3 jeweils drei 'Basis'-Strukturen dargestellt. Die gezeigten 'Basis'-Strukturen stellen nicht sämtliche Strukturmöglichkeiten bei N-Glykanen dar, sondern sind lediglich als Beispiele anzusehen.
Bei diesen Strukturen stellt die zur Erzeugung der Substrukturen in Anspruch genommene Umwandlung eine sukzessive Deletion terminaler Monosaccharide dar. Somit können zahlreiche Substrukturen gebildet werden, wobei von einer 'Basis'-Struktur ausgegangen wird und zum Beispiel Monosaccharide auf jede mögliche Art sukzessiv gestrichen werden. Es sind mehrere, unterschiedliche Muster der Deletion von Monosacchariden möglich, welche eine große Anzahl, von den 'Basis'-Strukturen ableitbare Substrukturen ergeben. Die Anzahl Substrukturen, welche aus den drei dargestellten 'Basis'-Strukturen durch Umwandlung gebildet werden kann, ist somit sehr groß.
Bei Durchführung einer Analyse eines unbekannten Oligosaccharids erlaubt eine Erstanalyse ein erstes Urteil dahingehend, daß das Oligosaccharid einer partikulären Substrukturgruppe angehört. Dieses führt zu dem Begriff "Kandidat-Struktur", welcher sich hier auf eine Struktur bezieht, welche die Substrukturgruppe als möglichen Kandidaten mit der gleichen Struktur wie das unbekannte Oligosaccharide aufweist.
Wenn zum Beispiel das zu sequenzierende Oligosaccharid von einem durch Verwendung von Enzympeptid-N-Glycosidase F von einem Glycoprotein freigesetzten Oligosaccharidgemisch gereinigt wurde, kann davon ausgegangen werden, daß es sich bei dem Oligosaccharid um ein N-Glycan und bei seiner Struktur wahrscheinlich um eine der Substrukturen handelt, welche, wie die in den Figuren 1 bis 3 dargestellten, aus den 'Basis'- Strukturen gebildet wurden.
Da jedoch eine Substrukturgruppe sehr groß sein kann, ist es wünschenswert, die Größe der Kandidatstruktur-Anfangsgruppe soweit wie möglich zu reduzieren. Ein Weg, an dieses Problem heranzugehen, ist, eine in gewisser Weise von der Struktur abhängige Eigenschaft der zu sequenzierenden Probe in Erwägung zu ziehen. Beispiele solcher Eigenschaften sind:
i) das Molverhältnis jedes Monosaccharids (Kompositionsanalyse)
ii) die Retentionszeit der Probe auf einer chromatographischen Säule, welche in Glucose- Einheiten ausgedrückt werden kann
Diese Eigenschaften kännen für jede Substruktur kalkuliert werden, wobei lediglich die Strukturen, deren Eigenschaften denen der zu sequenzierenden Probe entsprechen, zwecks weiterer Berücksichtigung als Kandidaten für die unbekannte Struktur zurückzuhalten sind.
Das Vorhandensein und die Verknüpfung (sowohl Position als auch Ausrichtung) eines partikulären Monosaccharids am Endpunkt eines Oligosaccharids können bestätigt werden, wenn bekannt ist, daß ein vorgegebenes Enzym eine Spaltung des Monosaccharids (und nichts anderes) bewirkt. Erfolgt eine Spaltung, so bestätigt der Nachweis des Monosaccharids in den Reaktionsprodukten das Vorhandensein der Verknüpfung in der Ausgangsstruktur.
Bei jedem als Sequenzierungsreagens verwendeten Enzym kann einwandfrei festgestellt werden, welche Monosacchariden aus einer partikulären Oligosaccharid-'Basis'-Struktur gespalten werden. Die für eine solche Spaltung geltenden Richtlinien für eine Anzahl von Enzymen sind in der obigen Tabelle 'Richtlinien für Enzyme' dargelegt. Durch Anwenden der Richtlinien, zum Beispiel für jede Kandidatenstruktur, ist es möglich, für jede Kandidatenstruktur die Monosaccharide zu bestimmen, welche gespalten werden, indem der Reihe nach jedes Enzym mit dieser in Berührung gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung sieht eine Möglichkeit der Optimierung der Verwendung von Sequenzierungsagenzien vor, wobei die Ergebnisse eindeutig interpretiert werden und die Stelle bestimmt wird, an welcher keine weitere Sequenzierung mit den zur Verfügung stehenden Reagenzien möglich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Apparatur zur Sequenzierung eines unbekannten Oligosaccharids vorgesehen, welche eine erste Vorrichtung aufweist, um eine Oligosaccharid- Strukturgruppe zu deduzieren, welcher, wovon ausgegangen wird, das unbekannte Oligosaccharid angehört, eine zweite Vorrichtung vorsieht, um die Auswirkung der Anwendung jedes Sequenzierungsagenses auf jede Oligosaccharid-Strukturgruppe zu simulieren, sowie eine dritte Vorrichtung aufweist, um das Sequenzierungsagens bei Anwendung desselben auf das unbekannte Oligosaccharid in gleicher Weise zwecks Abgabe optimaler Strukturinformationen zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zur Sequenzierung eines unbekannten Oligosaccharids vor, wonach das unbekannte Oligosaccharid analysiert, eine Oligosaccharid- Strukturgruppe, welcher, wovon ausgegangen wird, das unbekannte Oligosaccharid angehört, deduziert, die Auswirkung der Anwendung jedes Sequenzierungsagenses auf jede Oligosaccharid- Strukturgruppe simuliert und das Sequenzierungsagens bei Anwendung desselben auf das unbekannte Oligosaccharid in gleicher Weise zwecks Abgabe optimaler Strukturinformationen bestimmt wird, wobei das Sequenzierungsagens Anwendung findet und die tatsächlichen Versuchsergebnisse mit den erwarteten Ergebnissen verglichen werden.
Vorzugsweise sieht die vorliegende Erfindung die Durchführung einer Erstanalyse vor, um dadurch zumindest eine Grundstruktur (wie hierin definiert), aus welcher die Oligosaccharid- Strukturgruppe gebildet werden kann, zu bestimmen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert eine anfängliche Kandidaten-Strukturgruppe und erlaubt die Durchführung einer Berechnung, um die Durchführung des höchst wirksamen Versuches auf einen bestimmten Zeitpunkt festzulegen. Mit den Ergebnissen dieses Versuches unvereinbare Strukturen werden sodann aus der bestehenden Gruppe eliminiert und der nächste Versuch auf den verbleibenden Strukturen basierend festgelegt. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis mit den vorgegebenen Sequenzierungsagenzien keine weitere Eliminierung möglich ist.
Durch Durchführung einer erschöpfenden Suche unter den bekannten Reaktionsprodukten aller Kandidatenstrukturen mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Sequenzierungsreagenzien besteht die Möglichkeit, das optimale Sequenzierungsreagens bzw. Gruppen bzw. Gemische aus Sequenzierungsreagenzien so zu bestimmen, daß die größtmögliche Anzahl Kandidatenstrukturen durch Durchführung der Reaktion mit diesem Reagens und Bestimmung der Produkte eliminiert werden kann.
Um die Durchführung des höchst wirksamen Versuches festzulegen, sind die bekannten Ergebnisse zu berücksichtigen, wobei jedes der zur Verfügung stehenden Reagenzien auf die verbleibenden Kandidatenstrukturen angewandt wird.
Nehmen wir zum Beispiel an, daß die Analyse der Erstzusammensetzung zeigt, daß das unbekannte Oligosaccharid einer als [A, B, C, D] bezeichneten Kandidaten-Strukturgruppe angehört und die Enzyme 1, 2, 3, 4 die verfügbaren Sequenzierungsreagenzien darstellen. Die Ergebnisse der Anwendung dieser Enzyme auf diese Strukturen können vorausgesagt werden, indem Enzym-Richtlinien, wie zum Beispiel die in der obigen Tabelle 'Richtlinien für Enzyme' dargelegten, der Reihe nach für jede Struktur befolgt werden. Die Richtlinien könnten zum Beispiel erkennen lassen, daß Enzym 1 die Monosaccharid- Mannose aus jeder der Kandidatenstrukturen wie folgt spaltet:
Kandidat A, Enzym 1 spaltet 1 Mannose
Kandidat B, Enzym 1 spaltet 1 Mannose
Kandidat C, Enzym 1 spaltet 0 Mannose
Kandidat D, Enzym 1 spaltet 2 Mannose
Nehmen wir zum Beispiel an, daß die kompletten Ergebnisse, jedes Enzym für jede Kandidatenstruktur einzusetzen, wie folgt lauten:
Die in diesem Beispiel zu beantwortende Frage ist, welche Kandidatengruppe [A, B, C, D], wenn überhaupt vorhanden, die tatsächliche Struktur der unbekannten Probe darstellt. Es ist festzustellen, welches der zur Verfügung stehenden Sequenzierungsreagenzien (in diesem Beispiel die Enzyme 1 bis 4) das beste ist, um diese Frage zufriedenstellend zu beantworten. Dieses erfolgt durch Berücksichtigung eines aus den Daten obiger Tabellen abgeleitetes Analysenergebnisses(a) für jedes Enzym. Ein Analysenergebnis teilt die Kandidatenstrukturen in Subgruppen ein, wobei sämtliche Elemente einer Subgruppe, gemessen in der Anzahl der bei Reaktion mit dem Enzym gespaltenen Monosaccharide, das gleiche Ergebnis ergeben.
Ebenso kann für jedes Analysenergebnis (a) eine Analysenentropie (b) kalkuliert werden, um ein numerisches Maß der Wirksamkeit jedes Enzymes zu erhalten. Die Analysenentropie (b) stellt die Summe sämtlicher Subgruppen in einem Analysenergebnis (a) der Formel
-N(i) * log N(i) dar, wobei N(i) die Länge der Subgruppe i, d.h.die Anzahl der Kandidatenstrukturen in der Subgruppe i, bedeutet.
Die obige Datentabelle kann damit mit den Analysenergebnissen (a) und der Analysenentropie (b)
(a) Enzym 1, Subgruppe ([A, B], 1), Subgruppe ([C], 0), Subgruppe ([D], 2)
Entropie 1 = - ( 2 * log2 + 1 * log1 + 1 * log1) = - 0,602
(a) Enzym 2, Subgruppe ([A],1), Subgruppe ([B, C, D], 0)
(b) Entropie 2 = - (1 * log1 + 3 * log3 ) = - 1,431
(a) Enzym 3, Subgruppe ([A, B, C, D], 2)
(b) Entropie 3 = - (4 * log4 ) = - 2,408
(a) Enzym 4, Subgruppe ([A, D],1), Subgruppe ([B, C],2)
(b) Entropie 4 = - (2 * log2 + 2 * log2 ) = - 1,204
erklärt werden.
Die Analysenentropie eines Enzymes stellt ein direktes Maß der Streuung der Strukturen in der Kandidatengruppe unter verschiedenen, möglichen, aus der Anwendung des Enzymes resultierenden Versuchsergebnissen dar. Sind sämtliche Versuchsergebenisse gleich, weist die Analysenentropie einen Minimalwert auf (wie im obigen Beispiel bei Enzym 3), wobei es eindeutig ist, daß keine Möglichkeit besteht, durch Durchführung des Versuches zwischen den Kandidatenstrukturen zu unterscheiden. Sind sämtliche Versuchsergebnisse voneinander verschieden, stellt die Analysenentropie umgekehrt einen Wert von gleich Null dar, bei welchem es sich um den Maximalwert handelt, wobei durch Durchführung des Versuches eindeutig die gesuchte Struktur nachgewiesen wird. Im allgemeinen wird das Enzym mit der maximalen Analysenentropie gewählt, um die größte, statistische Möglichkeit einer schnellen Eliminierung von Strukturen aus der Kandidatengruppe zu bieten. In dem obigen Beispiel würde folglich Enzym 1 gewählt.
Die Analysenentropie stellt bei der Suche nach dem besten Sequenzierungsversuch den primären Auswertungsindex dar. Ein Enzym kann bei dem Suchvorgang unter folgenden Kriterien von weiteren Überlegungen ausgeschlossen werden:
A) wenn das Enzym Monosacchariden nicht von Kandidatenstrukturen abspalten würde;
B) wenn die Analysenentropie geringer als die eines anderen Enzymes ist;
C) wenn das Enzym mehr Monosacchariden spaltet als ein anderes Enzym, welches eine gleiche Analysenentropie aufweist;
D) wenn das Enzym in der Anwendung aufwendiger als ein das gleiche Ergebnis bietendes, anderes Enzym ist.
Sollte bei einer ersten Generationssuche (d.h. Suche auf der Ausgangsprobe) unter Verwendung aller zur Verfügung stehenden Enzyme kein Enzym eine über dem Minimalwert liegende Analysenentropie aufweisen, erfolgt eine zweite Generationssuche (d.h. eine Suche auf dem Rückstand aus der ersten Generationssuche) unter Verwendung von zwei Enzymen, entweder zusammen oder nacheinander, welcher bei nicht zufriedenstellendem Resultat eine dritte Generationssuche, eine vierte Generationssuche usw. folgen, bis der Punkt erreicht ist, an welchem die Kandidatenstrukturen als nicht unterscheidbar angesehen werden, da sämtliche getesteten Enzymgemische alle Kandidatenstrukturen auf einen gemeinsamen Rest reduzieren würden. An dieser Stelle kann zu dem Schluß gekommen werden, daß kein Versuch mit den verfügbaren Sequenzierungsreagenzien die Größe der Kandidaten-Strukturgruppe weiter reduzieren könnte.
Das Verfahren kann als eine Folge logischer Schritte durchgeführt werden, wobei nicht in jedem Fall sämtliche Schritte erfolgen müssen:

1. Initialisierung

1.1 'Basis'-Strukturgruppe spezifizieren;
1.2 Probenzusammensetzung spezifizieren;
1.3 Sämtliche Substrukturen aus den 'Basis'-Strukturen in 1.1 mit der in 1.2 vorgegebenen Zusammensetzung erzeugen. Diese bilden die Kandidaten-Ausgangsstrukturgruppe.

2. Kalkulation

2.1 Nach dem besten Reagens suchen;
2.1.1 Für jedes Reagens ein Analysenergebnis kalkulieren, aus welchem die Anzahl der durch das Reagens aus jeder 'Basis'- Struktur abgespaltenen Monosaccharide hervorgeht;
2.1.2 Die Ergebnisse unter Berücksichtigung der obigen Kriterien A bis D vergleichen und das beste Analysenergebnis auswählen;
2.1.2.1 Liegt kein Analysenergebnis vor, welches zwei Rest-Subgruppen oder mehr aufweist, die bei Verwendung des Reagenses unterschiedliche Ergebnisse zeigen, ist das nächstbeste Analysenergebnis zu wählen.
2.1.2.2 Kann kein Reagens ermittelt werden, welches zwischen den Kandidatenstrukturen unterscheiden kann, wird der Suchvorgang unter Verwendung aller infrage kommenden Gruppen aus zwei, drei oder mehr Reagenzien nacheinander wiederholt. Reagenzien, welche auf keine der Kandidatenstrukturen eine Wirkung ausüben, werden von dem Suchvorgang eliminiert.
Wird eine Gruppe aus einem oder mehreren Sequenzierungsreagenzien nachgewiesen, welche eine über dem Minimalwert liegende Verteilungsentropie produziert, werden diese Versuche sequentiell auf der Probe durchgeführt.

3. Versuch

3.1 Versuch(e), wie oben unter 2. angegeben, durchführen.

4. Ergebnis

Ergebnisse in Bezug auf Voraussagen überprüfen.
4.1 Anzahl der unter Verwendung des empfohlenen Reagenses gespaltenen Monosaccharide mit der Voraussage für jede Subgruppe in dem Analysenergebnis für das Enzym vergleichen.
4.2 Wird die Probe als Teil einer der Struktur-Subgruppen in dem Analysenergebnis insofern nachgewiesen, als diese zu der mit Hilfe des Versuchsergebnisses gespaltenen Anzahl Monosaccharide paßt, könnten weitere Informationen erhalten werden. Es können weitere Kalkulationen durch Neudefinierung der Kandidaten-Strukturgruppe als in dem Analysenergebnis nachgewiesene Struktur- Subgruppe durchgeführt werden.
4.3 Entspricht keine Subgruppe dem Versuchsergebnis, besteht die Wahrscheinlichkeit, daß
i) der Versuch scheiterte oder
ii) die Ausgangsvoraussetzungen in Bezug auf die 'Basis'-Strukturen ungültig waren.

Zusammenfassung

Es liegt auf der Hand, daß das Ausmaß der durchzuführenden Kalkulation beträchtlich ist. Das Verfahren wird deshalb am besten mit Hilfe eines Computers durchgeführt, wobei ein Programm zur Durchführung der Kalkulationen erstellt werden kann und dem Benutzer die Möglichkeit gegeben werden sollte, die erforderliche Wahl bei der Auswahl der Versuche zu treffen. Die zu fällenden Entscheidungen fallen jedoch im wesentlichen in das Aufgabenfeld eines Fachmannes, weshalb ein spezielles Datenverarbeitungssystem entwickelt wurde, um die jeweiligen, logischen Operationen durchzuführen.
Um die Genauigkeit dieses speziellen Datenverarbeitungssystemes zu testen, wurde ein reines Oligosaccharid unter der in den Figuren 1 bis 3 dargestellten, drei 'Basis'-Strukturen analysiert. Die Gesamtanzahl der aus den drei 'Basis'-Strukturen durch Abspaltung der Monosaccharide von diesen drei Oligosacchariden auf bekannte Weise erzeugten, strukturellen Varianten beträgt etwa 70.000.
Bei der für die Analyse verwendeten Probe handelte es sich um NA2F mit der in Figur 4 dargestellten Zusammensetzung.
Die Analyse der Monosaccharidzusammensetzung der Probe ergab
Mannose = 3
Galactose = 2
GlcNac = 4
Fucose = 1
Es können von einer Zusammensetzung mit diesen Monosacchariden in diesen Verhältnissen vier Gruppen struktureller Möglichkeiten abgeleitet werden; diese vier Strukturen sind konturenmäßig jeweils in den Figuren 5, 6, 7 und 8 dargestellt. Zudem sehen die in diesen Figuren gezeigten Strukturen mehrere Varianten in folgender Anzahl vor
Figur 5 - 9 Varianten
Figur 6 - 18 Varianten
Figur 7 - 12 Varianten
Figur 8 - 6 Varianten
Jede Gruppe weist sämtliche Varianten der Bindungsnumerierung auf, und sowohl Kern- als auch Außenarm-Fucosylation werden erklärt. Die obigen Varianten sehen eine Gruppe von 45 Kandidatenstrukturen vor, was durch das spezielle Datenverarbeitungssystem, welches sukzessiv die Verwendung folgender Enzyme mit den dargestellten Ergebnissen empfahl, bestätigt wurde:
Die Varianten von Figuren 7 und 8 werden durch den ersten Versuch eliminiert, da diese bei Behandlung mit Alpha- Mannosidase Mannose freisetzten, während die mutmaßliche, zu prüfende Probe diese nicht freisetzte. Die Varianten von Figur 6 werden durch den zweiten Versuch, welcher zwei Galactose freisetzte, eliminiert, während das Vorhandensein der Außenarm- Fucoseverzweigung in Figur 6 die Wirkung der Galactosidase auf der Verzweigung blockiert. Schließlich würde von den neun verbleibenden Strukturen von Figur 5 lediglich die dargestellte Struktur bei Reaktion mit den Enzymen in vorgegebener Reihenfolge zwei N-Acetyl-Glucosamine abgeben.
In dieser Sequenz wird die Struktur eindeutig nachgewiesen.

Claims

1. Verfahren zur Sequenzierung eines unbekannten Oligosaccharids, welches vorsieht:

(i) Durchführung einer Analyse des unbekannten Oligosaccharids, um eine strukturabhängige Eigenschaft desselben zu bestimmen;

(ii) Deduktion einer Oligosaccharid-Strukturgruppe aufgrund dieser Eigenschaft, welcher, wovon ausgegangen wird, das unbekannte Oligosaccharid angehört;

(iii) Simulation der Auswirkung der Anwendung jeder Sequenzierungsagenzienfolge auf jede Oligosaccharid- Strukturgruppe;

(iv) Bestimmung des Sequenzierungsagenses in gleicher Weise bei Anwendung desselben auf das unbekannte Oligosaccharid zwecks Abgabe optimaler Strukturinformationen;

(v) Anwendung des Sequenzierungsagenses; sowie

(vi) Vergleichen der Ergebnisse aus den Stufen (iv) und (v).

2. Verfahren nach Anspruch 1, wonach Verfahrensschritt (ii) den Nachweis von zumindest einer Basisstruktur, aus welcher durch größtmögliche Deletion von Monosacchariden aus der Basisstruktur eine Substrukturgruppe erzeugt werden kann, sowie den weiteren Nachweis einer Kandidaten-Strukturgruppe aus der Substrukturgruppe vorsieht, welcher, wovon ausgegangen wird, das unbekannte Oligosaccharid angehört.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wonach in Verfahrensschritt (vii) Strukturen aus der Kandidatengruppe eliminiert werden, welche in Schritt (vi) als unvereinbar dargestellt sind, und das auf den verbleibenden Strukturen basierende, nächste, anzuwendende Sequenzierungsagens bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wonach Verfahrensschritte (v), (vi) und (vii) wiederholt werden, bis keine weitere Eliminierung möglich ist.