DE69220888T2

DE69220888T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren

Info

Publication number: DE69220888T2
Application number: DE69220888T
Authority: DE
Inventors: Robert J Defranco; Charles S Ladd; David H Lloyd
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1991-11-05
Filing date: 1992-11-03
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-11-04
Also published as: JPH05255384A; JP2869837B2; US5462748A; DE69220888D1; EP0541340A3; EP0541340A2; EP0541340B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Geräte und Verfahren zur Synthese von Biopolymeren und insbesondere automatisierte Apparate und Verfahren für derartige Synthesen.
Biopolymere mit einer gewählten Sequenz, wie Polypeptide und Polynucleotide, werden routinemäßig nach Festphasenverfahren synthetisiert, bei denen eine Reihe von gewählten Polymeruntereinheiten nacheinander an eine wachsende Polymerkette addiert werden, die von einem festen Träger getragen wird. Bei einer typischen Polypeptidsynthese wird das Polymere stufenweise ausgehend von einem immobilisierten C-terminalen Rest synthetisiert. In jeder Stufe wird eine neue N-geschützte Aminosäure in Lösung an den festen Träger addiert und durch ihre freie Carboxygruppe mit der freien α-Aminogruppe der Aminosäure (oder des Peptids), die (das) auf dem Träger immobilisiert ist, umgesetzt, um die neue Aminosäure mit dem wachsenden Peptid auf dem Träger zu kuppeln. Der Träger wird dann behandelt, um die N-Schutzgruppe der letzten addierten Aminosäure zu entfernen, und das Verfahren wird stufenweise wiederholt, bis das endgültige Polypeptid vollständig ist.
Ein Polynucleotid,. z. B. ein DNA-Strang, wird auf entsprechende Weise nach Festphasenverfahren durch stufenweise Addition eines gewählten 5'-geschützten Nucleotids an ein Harz, das ein immobilisiertes 3'-Endnucleosid enthält, synthetisiert. Die Gerüstkupplung erfolgt zwischen der freien 5'-OH-Gruppe des immobilisierten Nucleosids und dem aktivierten 3'-Ende des freien Nucleotids. Nach der Kupplungsreaktion wird der Träger behandelt, um die 5'-Endschutzgruppe zu entfernen, und die Reaktionsstufen werden wiederholt, bis das Polynucleotid der gewünschten Sequenz vollständig ist.
Festphasenverfahren für Polypeptid- und Polynucleotidsynthesen können zweckmäßigerweise durch Syntheseautomaten durchgeführt werden, die für die aufeinanderfolgende Zugabe von ausgewählten Untereinheiten, Kupplungsmitteln und Schutzgruppen entfernenden Mitteln in ein Gefäß, das das Festphasenmaterial enthält, ausgelegt sind. Jede Untereinheit-Additionsstufe beinhaltet also (a) die Zugabe einer Schutzgruppen entfernenden Lösung zu dem Festphasen-Gefäß, um Schutzgruppen des letzten addierten Rests auf dem immobilisierten Träger zu entfernen, und (b) die Zugabe der nächsten Untereinheit entweder in aktivierter Form oder in Gegenwart eines Aktivators in das Festphasen-Gefäß, um die Untereinheit an die wachsende Polymerkette auf dem festen Träger zu kuppeln.
Bei einem typischen Betrieb eines Synntheseautomaten wird die Vorrichtung zunächst mit Fläschchen, die die einzelnen Untereinheiten enthalten, die während des Betriebs addiert werden sollen, und mit Schutzgruppen. entfernenden Lösungen und Waschlösungen, die während des Betriebs verwendet werden, beschickt. Die Fläschchen, die einzelnen Untereinheiten enthalten, können in flüssiger Form vorgepackt sein, was es erlaubt, die Untereinheitenlösung ohne weiteres aus dem Fläschchen in das Festphasen-Gefäß zu übertragen. Derartige Fläschchen müssen selbstverständlich auf eine solche Weise gelagert werden, daß Austreten oder Abbau der Untereinheiten oder der Aktivierungskomponenten verhindert werden.
Alternativ dazu können die Fläschchen in einer Trockenform abgepackt sein. Das trockene Material wird entweder manuell vor dem Beschicken der Vorrichtung gelöst, oder es wird, was üblicher ist, während des Betriebs der Vorrichtung durch Zugabe eines gewählten Volumens an Lösungsmittel in die einzelnen Fläschchen gelöst. Eine Beschränkung hinsichtlich des trockenen Materials besteht darin, daß für viele Aminosäuren eine geringe Schüttdichte des Materials das Abmessen und Abpacken des Materials schwierig macht. Außerdem lösen sich einige getrocknete Aminosäuren sehr langsam und erfordem bis zu 30 Minuten Kontaktzeit mit einem zugegebenen Lösungsmittel, bevor die Untereinheit vollständig gelöst ist. Aus diesen Gründen wäre eine Zusammensetzung mit Handhabungs- und Auflösungseigenschaften, die denen der bereits existierenden Reagenzien überlegen sind, nützlich.
Automatisierte Apparate sind für Synthesen von Polypeptiden und Polynucleotiden, wie sie vorstehend beschrieben wurden, gebaut worden; es gibt jedoch viele Probleme, die nicht adäquat gelöst worden sind. Dazu gehört der Bedarf an einer einfachen Benutzung, relativ geringen Instrumentenkosten und geringen Zykluskosten.
Der Bedarf an einer einfachen Benutzung betrifft einen wachsenden Markt, auf dem die Benutzer von Syntheseautomaten keine erfahrenen Peptid- und Polynucleotidchemiker, sondern zunehmend Immunologen, Neurobiologen und Molekularbiologen sowie Vertreter weiterer Disziplinen sind. Diese Benutzer benötigen, da ihnen die spezielle Erfahrung von Peptidchemikern fehlt, einen stärker automatisierten und problemloseren Betrieb als bisher möglich ist.
Es wird auch der Bedarf an einem relativ kleinen Instrument festgestellt, das für die Durchführung von Synthesen mit Ketten von 30 Untereinheiten oder dergl. geeignet ist, was für die meisten Anforderungen der neuen Klasse von Benutzern ausreichend ist. Gleichzeitig besteht, da die Benutzung eines derartigen Instruments möglicherweise nicht so umfangreich ist wie bei einem Instrument in einem Forschungslabor, das sich der Vollzeitherstellung von Makromolekülen durch Peptid- und Polynucleotidchemiker widmet, ein größerer Bedarf an niedrigen Einstiegskosten und sicher ein größerer Bedarf an niedrigen Zykluskosten. Die Zykluskosten sind die Kosten für Untereinheitenmaterialien, Reagenzien und dergl., die beim Synthesebetrieb verwendet werden.
Ein weiterer, bisher nicht ausreichend abgedeckter Bedarf, der die Verwendung eines derartigen Instruments durch Forscher betrifft, die nicht besonders hinsichtlich Peptid- und Polynucleotidsynthesen erfahren sind, ist der Bedarf an der Überwachung der beteiligten Reaktionen. Es ist z. B. bekannt, daß Kupplungsreaktionen gelegentlich unerwartet langsam sind, und es ist beobachtet worden, daß langsamen Kupplungsreaktionen bei Peptidsynthesen häufig langsame Schutzgruppenentfernungsstufen vorausgehen.
Was also zusätzlich zu einer Zusammensetzung für Untereinheitenmaterialien mit Handhabungs- und Auflösungseigenschaften, die denen der bereits existierenden Reagenzien überlegen sind, benötigt wird, ist ein relativ kostengünstiges, sehr zuverlässiges Instrument, das zur Synthese von Molekülen mäßiger Länge (30 Untereinheiten oder dergl.) mit der Möglichkeit der Überwachung in Verbindung mit der automatischen Einstellung der Zeiteinteilung für die Kupplungsstufen geeignet ist. Außerdem muß das Instrument sehr zuverlässig und einfach zu benutzen sein.
Gemäß einem Aspekt umfaßt die Erfindung eine Polymerzusammensetzung, die ein getrocknetes Polymersubstrat umfaßt, das im Lösungsmittel einer organischen Phase quellbar, jedoch unlöslich ist und das eine interne Polymermatrix aufweist. Biopolymer-Untereinheitenmoleküle sind in der Polymermatrix des Substrats eingeschlossen. Wenn das Substrat durch Kontakt mit einem organischen Lösungsmittel quillt, dann diffundieren die Untereinheitenmoleküle aus der Matrix in das quellende Lösungsmittel.
Das Polymersubstrat kann aus Polystyrol, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon oder Copolymeren davon gebildet werden,. und die Polymere sind mit einem geeigneten Vernetzungsmittel, vorzugsweise mit einer Konzentration zwischen 0,5 und 5,0 Mol-%, vernetzt. Das Substrat ist vorzugsweise zum Quellen in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels auf ein Volumen, das mindestens dem 5- bis 10-fachen seines Trockenvolumens entspricht, imstande.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Substrat Teilchen, die im getrockneten Zustand eine rieselfähige Masse bilden. Ein bevorzugtes Teilchenpolymer ist Polystyrol, das mit 1,0% Divinylbenzol vernetzt ist. Die Polymerteilchen enthalten vorzugsweise eingeschlossene Biopolymer- Untereinheitenmoleküle in einem Gewichtsverhältnis von Biopolymeruntereinheit zu Polymerem von etwa 1:10 bis 2:1, und die Teilchen, die eingeschlossene Biopolymeruntereinheiten enthalten, weisen eine Dichte zwischen etwa 0,5 und 0,6 g/cm³ auf.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich für die Verwendung in einem Polypeptid-Syntheseautomaten bei der Biopolymeruntereinheit in der Zusammensetzung um eine N-geschützte Aminosäure. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich für die Verwendung in einem Polynucleotid-Syntheseautomaten bei der Biopolymeruntereinheit in der Zusammensetzung um ein aktiviertes, 5'-OH-geschütztes Nucleotid.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine Patrone zur Verwendung in einem Festphasen-Syntheseautomaten. Die Patrone umfaßt eine Kammer, die die Polymerzusammensetzung des gerade beschriebenen Typs enthält. Die Patrone umfaßt auch Öffnungen für die Zugabe und Entfernung von Lösungsmittel während des Betriebs.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein automatisches Verfahren zur Festphasensynthese eines Biopolymeren durch aufeinanderfolgende Addition einer Biopolymeruntereinheit an eine wachsende Biopolymerkette, die von einem Festphasenträger getragen wird. Das Verfahren umfaßt die Anordnung einer Patrone zur Abgabe von Untereinheiten des vorstehend beschriebenen Typs in einer Position für die Flüssigkeitsübertragung und die Zugabe eines organischen Lösungsmittels zu der Patrone, so daß bewirkt wird, daß das Polymersubstrat in der Patronenkammer quillt und die Biopolymeruntereinheit in das Lösungsmittel unter Bildung einer Lösung der Untereinheit freisetzt. Die Lösung wird dann in ein Reaktionsgefäß übertragen, das den Festphasenträger enthält.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein automatisiertes System für die Festphasensynthese eines Biopolymeren durch aufeinanderfolgende Addition einer Biopolymeruntereinheit an eine wachsende Biopolymerkette, die von einem Festphasenträger getragen wird. Das System umfaßt eine Mehrzahl von Patronen, wie die, die vorstehend beschrieben wurde, und einen Syntheseautomaten, der die folgenden Elemente umfaßt: (i) einen Patronenhalter, der für das Halten der Patronen ausgelegt ist; (ii) Anschlußstücke, die in eine Position bewegt werden konnen, so daß sie in die Öffnungen einer gewählten Patrone in dem Halter einrasten, wobei eine flüssigkeitsdichte Versiegelung der Öffnungen der Patrone gebildet wird; (iii) einen Mechanismus, um eine gewählte Patrone in dem Halter in eine Übertragungsposition zu bringen, in der die Einrasteinrichtung in die Öffnungseinrichtung der gewählten Patrone einrasten kann; (iv) ein Reaktionsgefäß zur Aufnahme eines Festphasenträgers; und (v) eine Flüssigkeitsübertragungsanordnung zur Übertragung von organischem Lösungsmittel in die Kammer einer gewählten Patrone und zur Übertragung von Lösung aus der Kammer in das Reaktionsgefäß. Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung sind vollständiger ersichtlich, wenn die nachstehende ausführliche Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit der beigefügten Zeichnung gelesen wird.
Figg. 1A-1C sind schematische Darstellungen eines Zusammensetzungsteilchens: (1A) während der Bildung durch Einströmen von Untereinheiten und Entfernung von Lösungsmittel; (1B) in einem trockenen Lagerzustand; und (1C) während des Quellens und der Freisetzung von eingeschlossener Untereinheit;
Figg. 2A und 2B sind schematische Darstellung einer Zusammensetzung, die gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung gebildet wird und vor und nach dem Quellen durch Lösungsmittelzugabe gezeigt ist;
Figg. 3A und 3B sind schematische Darstellungen einer Zusammensetzung, die gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung gebildet wird und vor und nach dem Quellen durch Lösungsmittelzugabe gezeigt ist;
Fig. 4 zeigt eine erfindungsgemäß konstruierte Patrone, die eine getrocknete teilchenförmige Polymerzusammensetzung, wie sie in Fig. 1B gezeigt ist, enthält.
Fig. 5 zeigt einen erfindungsgemäßen Syntheseautomaten;
Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm von Elementen des Syntheseautomaten von Fig. 5, das die speziellen Flüssigkeitsabgabesysteme zeigt;
Fig. 7 ist ein Blockdiagramm der Stromversorgungs-, Elektronik- und Steuerelemente des Syntheseautomaten von Fig. 5; und
Fig. 8 ist eine Reproduktion einer Spur eines Streifenschreibers für die Leitfähigkeit von Schutzgruppenentfernungsreagenzien in einem erfindungsgemäßen Syntheseautomaten.

A. Polymerzusammensetzung

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist als eine Lagerform einer Biopolymeruntereinheit zur Verwendung bei der Zufuhr einer gegebenen Menge der Untereinheit in Lösungsform in einem automatisierten Biopolymersyntheseapparat ausgelegt.
Die Zusammensetzung ist allgemein bei 10 in Figg. 1A-1C gezeigt, die ein Teilchen 12 der Zusammensetzung zeigen. Das Teilchen wird aus einem Polymersubstrat 14 gebildet, das in einem gewählten organischen Lösungsmittel, wie N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (Methylenchlorid) oder Chloroform, das sich für die Festphasenuntereinheiten-Additionsreaktionen bei Biopolymersynthesen eignet, quellbar ist. Das Substrat ist aus vernetzten Polymerfilamenten, wie Filamenten 16, gebildet, die eine Matrix 18 bilden, durch die Biopolymeruntereinheitenmoleküle, wie Untereinheitenmoleküle 20, frei diffundieren können, wenn sich das Substrat in einem gequollenen Zustand befindet.
Eine Reihe von Polymeren eignen sich für die Verwendung in der Erfindung. Diese Polymeren umfassen Polystyrol, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon sowie Copolymere daraus. Die Polymeren sind durch Einschluß eines Vernetzungsmittels in die Polymerzusammensetzung leicht vernetzt, vorzugsweise in einem Molprozentsatz von etwa 0,5 bis 5. Eine bevorzugte Polymerzusammensetzung besteht aus Polystyrol, das mit 1% Divinylbenzol vernetzt ist.
Allgemeiner ist jedes Polymere, das in einer vernetzten Matrix in Lösungsmitteln, wie DMF, Methylenchlorid oder Chloroform, die bei Festphasenbiopolymersynthesen verwendet werden, quellbar und unlöslich ist und das eine Untereinheitendiffusion durch die Polymermatrix in einem gequollenen Substratzustand erlaubt, geeignet. Vorzugsweise beträgt das gequollene Volumen des Polymeren (im Quellungslösungsmittel) mindestens das 5- bis 10-fache seines Trockenvolumens.
Polymere Teilchen, die für die Bildung der Zusammensetzung verwendet werden, dienen einer Erhöhung der Gesamtschüttdichte und verbessern damit die Fließeigenschaften des getrockneten Biopolymeruntereinheitenreagenzes, so daß eine zuvor abgewogene Menge der Untereinheit leichter in ein Fläschchen gefüllt werden kann. Eine bevorzugte Form des Substrats sind Polymerkügelchen, vorzugsweise mit einem Durchmessergrößenbereich eines Durchmessers von mindestens 50 µm und vorzugsweise im Bereich von 75 bis 200 µm, und zwar in getrockneter Form. Polystyrolkügelchen mit der gewünschten Polymerzusammensetzung, Quellbarkeit und Teilchengröße in getrockneter Form sind im Handel erhältlich von Eastman Kodak, Biorad oder Polymer Lab.
Fig. 1A erläutert ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung, d. h. zur Beladung des Substrats mit den Biopolymeruntereinheiten. Eine Lösung der Untereinheiten in einem geeigneten Lösungsmittel 22, wie einem der vorstehend erwähnten organischen Lösungsmittel, wird mit den Polymerteilchen in einem Mischgefäß gemischt. Die Konzentration der Teilchen ist derart, daß eine Aufschlämmung gebildet wird, die relativ viskos sein kann, nachdem die Teilchen gequollen sind. Die Konzentration der Polymeruntereinheiten in der Lösung wird so gewählt, daß ein gewünschtes Endgewichtverhältnis von Untereinheit/getrocknetes Substrat vorzugsweise zwischen etwa 1:10 bis 2:1 erzielt wird. Für die Verwendung in einem Polypeptidsyntheseautomaten sind die Biopolymeruntereinheiten vorzugsweise N-geschützte Aminosäuren, typischerweise eine der 20 natürlichen L-Aminosäuren mit geschützten α-Amingruppen und geschützten Carboxy-, Hydroxy-, Thiol- und Aminseitenkettengruppen. Für die Verwendung in einem Polynucleotidsyntheseautomaten sind die Untereinheiten typischerweise aktivierte 5'-geschützte Nudeotide, wie eines der vier DNA-Desoxynucleosid-3'-phosphoramidite mit einer 5'-Dimethoxytrityl-Blockierungsgruppe.
Während der Bildung der Zusammensetzung dringen die Untereinheitenmoleküle in die Matrices der gequollenen Teilchen ein, wobei es zu einer Gleichgewichtseinstellung zwischen der Hauptphase der Suspension und dem eingeschlossenen Matrixvolumen kommt. Gleichzeitig wird Lösungsmittel von den Teilchen entfernt, was zunehmend mehr Untereinheitenmoleküle in das eingeschlossene Volumen zwingt. Die Lösungsmittelentfernung wird unter Rühren durchgeführt, bis die Teilchen vollständig getrocknet sind und im wesentlichen die Gesamtmenge der Untereinheiten in den Teilchen eingeschlossen oder damit assoziiert ist.
Fig. 1B zeigt ein getrocknetes Teilchen 12b in der Zusammensetzung nach der vollständigen Entfernung des Lösungsmittels. Wie vorstehend angegeben wurde, liegt die Teilchengröße im getrockneten Zustand vorzugsweise zwischen etwa 50 und 200 µm und ist um ein Mehrfaches kleiner als im gequollenen Zustand. Die getrockneten Teilchen weisen eine bekannte Menge an Untereinheit, bezogen auf das Zusammensetzungsgewicht, auf und bilden eine rieselfähige Teilchenzusammensetzung, die ohne weiteres in bekannten Gewichtsmengen von einem Gefäß in ein anderes übertragen werden kann. Die Herstellung einer Teilchenzusammensetzung, die eingeschlossene, Fmoc-geschützte L-Aminosäure enthält, wird ausführlich in Beispiel 1 dargestellt.
Fig. 1C zeigt, wie die Teilchen in der Zusammensetzung bei der Bildung einer Lösung von Biopolymeruntereinheitenmolekülen beim Betrieb eines Syntheseautomaten verwendet werden. Dabei wird ein geeignetes Lösungsmittel, wie Lösungsmittel 24, in ein Fläschchen 26 gegeben, das die beladenen Teilchen, wie Teilchen 12c, enthält. Wenn die Teilchen im Lösungsmittel quellen, dann diffundieren Untereinheiten, die in den Teilchenmatrices eingeschlossen sind, wie Untereinheiten 20, hinaus in das Lösungsmittel. Beim schließlich erreichten Gleichgewicht ist die Konzentration an Untereinheiten im Medium der Hauptphase in dem Fläschchen gleich der in der eingeschlossenen Matrix. Vorzugsweise stellt das gequollene Harz nicht mehr als etwa 20-50% und insbesondere nicht mehr als etwa 5-20% des Gesamtvolumens des Lösungsmittels im Extraktionssystem dar. Dies stellt sicher, daß im Gleichgewicht das Medium der Hauptphase mindestens 50-80% und insbesondere mindestens etwa 80-95% der Gesamtmenge an extrahierbaren Biopolymeruntereinheitenmolekülen enthält. Dementsprechend werden mindestens etwa 50-80% der in der getrockneten Zusammensetzung enthaltenen Untereinheiten und insbesondere etwa 80-95% im Medium der Hauptphase gewonnen.
Bei einem typischen automatisierten Polypeptid-Synthesebetrieb ist die Zusammensetzung so ausgelegt, daß etwa 0,075 mMol Aminosäure in etwa 1 ml Lösung der Hauptphase bereitgestellt werden. Bei einem typischen automatisierten Polynucleotid-Synthesebetrieb ist die Zusammensetzung in dem Fläschchen so ausgelegt, daß etwa 1 µMol aktiviertes Nucleotid in 0,5 ml Lösung der Hauptphase bereitgestellt wird.
Lösungsmittel, die sich für die gerade beschriebene Quell- und Extraktionsstufe eignen, umfassen Lösungsmittel, die das Quellen erleichtern, ohne die Polymerteilchen zu lösen, und die mit der Synthesereaktion, an der die Biopolymeruntereinheit teilnehmen soll, kompatibel sind. Gemäß einer Ausführungsform, bei der N-α-geschützte Aminosäuren einer Peptidsynthesereaktion unter Anwendung der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Chemie zugeführt werden, ist Dimethylformamid (DMF) ein geeignetes Lösungsmittel. Aktivierungsmittel, die mit der Polypeptidreaktion kompatibel sind, können der Polymerzusammensetzung zusammen mit dem Lösungsmittel zugesetzt werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können Aminosäuren in aktivierten Formen, wie symmetrische Anhydride, Pentafluorphenylester und aktive 1-Oxo-2-hydroxydihydrobenzotriazin-Ester zugesetzt werden.
Ein Aktivierungsmittel, das bei der vorstehend erwähnten Fmoc-basierten Peptidsynthese verwendet werden kann, ist Hydroxy-O-benzotriazol-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU), wozu eine äquivalente Menge an Hydroxy-O-benzotriazol (HOBT) und 2 Äquivalente an Diisopropylethylamin. (DIEA) gegeben werden. Eine weitere geeignete Lösungsmittel/Aktivator- Lösung ist Dichlormethan (DMC) /Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) für die tert.-Butyloxycarbonyl (t-Boc)-basierte Peptidsynthese. Ein Lösungsmittelsystem, das für das vorstehend erwähnte HBTU/HOBT/DIEA-Aktivatorsystem geeignet ist, ist Dimethylformamid (DMF)/N-Methylpyrrolidon (NMP)/Dimethylsulfoxid (DMSO) für die Fmoc-basierte Peptidsynthese. Weitere Lösungsmittel/Aktivator-Kombinationen sind ebenfalls möglich, und optimale Kombinationen für eine gegebene Synthesereaktion hängen von der Art der Synthese und dem Typ des chemischen Kupplungssystems, das bei der Synthese verwendet wird, ab.
Bei einer Teilchenzusammensetzung, die aus den vorstehend beschriebenen Polystyrolkügelchen gebildet wird und die eine ausgewählte 5'-OH-DMT-geschützte, 3'-Phosphoramidit-desoxyribonucleosid-Untereinheit enthält, ist Acetonitril ein geeignetes Lösungsmittel. Weitere geeignete Lösungsmittel sind Methylenchlorid und Acetonitril/Methylenchlorid-Gemische.
In einer Teilchenzusammensetzung mit einem Gewichtsverhältnis von L-Aminosäure:Polymeres von 1:2 liegt die Zeit, die erforderlich ist, damit eine Aminosäure im Gleichgewicht in die Hauptphase übertritt, für 50 mg Zusammensetzung, die in 1 ml DMF suspendiert ist, zwischen etwa 1 und 5 Minuten bei Raumtemperatur, und zwar abhängig von der speziellen Aminosäure und dem Polymermaterial. Nach der Gleichgewichtseinstellung wird das Hauptphasenmedium aus dem Fläschchen entfernt, und zwar vorzugsweise durch ein Filtrationsmedium, um es in einer Untereinheiten-Additionsreaktion in einem Syntheseautomaten zu verwenden, wie es nachstehend beschrieben wird.
Die Figg. 2A und 2B erläutern eine Zusammensetzung 32, die gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung gebildet wird. Gemäß dieser Ausführungsform weist die Zusammensetzung ein folienartiges Polymersubstrat 36 auf, das eine Auskleidung oder Beschichtung 38 auf den Seiten eines Fläschchens 34 bildet. Das Substrat enthält eingeschlossene Untereinheitenmoleküle, wie Moleküle 40, und weist eine Polymerzusammensetzung ähnlich der Zusammensetzung 10, die vorstehend beschrieben wurde, auf. Die Substratauskleidung weist eine Dicke in getrockneter Form vorzugsweise zwischen etwa 25-100 µm auf. Das Substrat wird mit einer gewählten Menge an Untereinheit wie vorstehend durch Lösungsmittelentfernung aus einer Lösung der Untereinheit in einem Lösungsmittel, das zum Quellen des Polymers imstande ist, beladen.
Fig. 2B erläutert den Zustand der Zusammensetzung 32 während der Freisetzung der Untereinheit, wenn ein geeignetes Reaktionslösungsmittel 40 in das Fläschchen gegeben wird. Wenn das Substrat im zugegebenen Lösungsmittel quillt, dann diffundieren eingeschlossene Untereinheiten durch die Substratmatrix und in das Medium der Hauptphase, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Die erhaltene Untereinheitenlösung wird dann zur Verwendung bei einer Untereinheiten-Additionsreaktion abgezogen.
Die Figg. 3A und 3B erläutern eine Zusammensetzung 42, die gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung gebildet wird. Gemäß dieser Ausführungsform weist die Zusammensetzung ein filamentartiges Substrat 44 auf, das an den Wänden eines Fläschchens 46 angebracht sein kann, wie es gezeigt ist. Das Substrat, das eingeschlossene Untereinheitenmoleküle enthält, weist eine Polymerzusammensetzung ähnlich der vorstehend beschriebenen auf. Die Filamentdicke in getrockneter Form liegt vorzugsweise zwischen etwa 25-200 µm. Das Substrat wird mit Untereinheitenmolekülen wie vorstehend beladen. Fig. 3B erläutert die Zusammensetzung nach der Substratquellung und der Freisetzung von Untereinheiten für die Verwendung bei der Herstellung einer Untereinheitenlösung für eine Festphasenbiopolymersynthese.

B. Patronen

Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine Patrone zur Verwendung in einem Festphasen-Syntheseautomaten zur Abgabe einer gewählten Menge an Biopolymeruntereinheiten in Lösungsform an eine Untereinheiten-Additionsreaktionskammer. Eine beispielhafte Patrone ist bei 50 in Fig. 4 gezeigt. Die Patrone ist so ausgelegt, daß sie automatisch durch ein Paar von Anschlußstücken 52, 54 in den Syntheseapparat einrastet, so daß das Fläschchen mit einer Flüssigkeitsübertragungsanordnung in dem Apparat zur Übertragung von Flüssigkeit in die Patrone und aus der Patrone verbunden wird, wie es nachstehend erörtert wird. Anschlußstück 52, das repräsentativ ist, umfaßt einen Kopf 56 mit einer ringförmigen Dichtung 58, die einen Teil einer Flüssigkeitsdichtung bildet, wenn das Anschlußstück in die Patrone eingerastet ist. Die Dichtung wird durch Bewegung der beiden Anschlußstücke aufeinander zu in Positionen des abdichtenden Einrastens mit der Patrone gebildet. Die beiden Anschlußstücke werden hier auch als Anpassungsvorrichtung bezeichnet.
Patrone 50 umfaßt ein Fläschchen oder einen Behälter 64, der eine innere Kammer 65 bildet, die eine Polymerzusammensetzung, wie sie in Abschnitt A beschrieben wurde, enthält. Gemäß der gezeigten Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine Teilchenzusammensetzung 66, die aus getrockneten Polymerteilchen, wie Teilchen 68, besteht. Es ist darauf hinzuweisen, daß andere Polymerzusammensetzungen, wie die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen vom Folien- oder Filamenttyp, ebenfalls geeignet sind. Eine typische Patrone weist ein Behältervolumen von etwa 0,5 ml auf und enthält etwa eine Menge an Untereinheiten, die etwa 0,075 mMol Aminosäureuntereinheiten oder etwa 1 µMol aktiviertem Polynucleotid entspricht. Der Behälter ist vorzugsweise aus Polyethylen oder einem ähnlichen flexiblen Kunststoff gebildet.
Die Patrone ist mit Einlaß- und Auslaßöffnungen oder Öffnungsvorrichtungen 70, 71 ausgestattet, durch die Lösungsmittel in die Patrone eingeführt bzw. daraus entfernt wird. Die Einlaßöffnung 70, die repräsentativ ist, wird von einer zentralen Öffnung 72 in einem Ende des Behälters gebildet und ist von einer porösen Membran 73 abgedeckt, die wirksam Teilchen in getrockneter oder gequollener Form filtert, wenn Lösungsmittel durch den Filter geleitet wird. Jedes Ende des Fläschchens, wie das Ende, das dem Anschlußstück 52 gegenübertritt, ist mit einer ringförmigen Rippe, wie einer Rippe 74, ausgestattet, die in die ringförmige Dichtung des gegenüberliegenden Anschlußstücks unter Bildung einer flüssigkeitsdichten Versiegelung eingreift, wenn das Anschlußstück in die abdichtende Position bewegt wird.
Es ist darauf hinzuweisen, daß eine Zusammensetzung vom Folien- oder Filamenttyp, die an den Wänden des Fläschchens befestigt ist, möglicherweise keine Filtermembran erfordert, um die Zusammensetzung innerhalb des Fläschchens vor und nach dem Quellen zu halten. Ferner kann die Öffnungsvorrichtung eine einzelne Öffnung zur Aufnahme eines Anschlußstücks, das sowohl der Zufuhr als auch der Entfernung von Lösungsmittel aus demBehälter dient, umfassen.

C. Biopolymersyntheseautomat

Fig. 5 ist eine orthographische Ansicht eines Biopolymersyntheseautomaten oder Apparats 81, der erfindungsgemäß konstruiert ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Syntheseautomat 81 hauptsächlich für die Peptidsynthese verwendet. Der Syntheseautomat umfaßt einen Patronenhalter 83, der sich auf einem Drehkarussell 85 befindet, um Patronen des in Abschnitt B mit Bezug auf Fig. 4 beschriebenen Typs abzugeben, wobei Patrone 50 ein Beispiel ist. Die Patronen tragen Untereinheitenmaterialien in einer Polymerzusammensetzung, wie sie im vorstehenden Abschnitt A beschrieben wurde.
Der Patronenhalter bewegt sich durch eine Ladestation 87, die Anschlußstücke 52 und 54 (Fig. 4) aufweist, um in die gegenüberliegenden Enden der Untereinheiten abgebenden Patronen einzurasten, so daß Lösungsmittel durchströmen kann, um Untereinheitenmaterial, das bei der Synthesereaktion verwendet werden soll, zu extrahieren. Patronen, die spezielle Untereinheiten tragen, werden typischerweise in dem Karussell der Reihe nach am Umfang eingesetzt, bevor das Syntheseverfahren eingeleitet wird, und beim Betrieb werden die Patronen an die Ladestation 87 in der erforderlichen Reihenfolge für die gewünschte Synthese abgegeben.
Lösungsmittel, das durch eine Abgabepatrone auf dem Karussell geleitet wird, wird zu einem Reaktionsgefäß 89, das in einem Aussparungsbereich 90 angeordnet ist, geleitet und durchgeleitet. Das Reaktionsgefäß enthält typischerweise (für Peptidsynthesen) einen C-terminalen-.Rest auf einem festen Polymerträger, wie es vorstehend beschrieben wurde. Gefäße 91 und 93 sind Teil des Flüssigkeitsübertragungssystems und spielen eine Rolle bei der wirksamen und wiederholbaren Übertragung. Die Anordnung zur Übertragung von Flüssigkeit in eine Patrone und aus einer Patrone unter Einschluß der Anschlußstücke 52, 54, die in die Öffnungen einer Patrone einrasten, wird hier hier auch als Flüssigkeitsübertragungsvorrichtung bezeichnet und umfaßt eine Übertragungsstruktur, die nachstehend im Abschnitt D beschrieben wird.
Der Syntheseautomat umfaßt ein Mikroprozessor-basiertes Steuerungssystem mit einem Steuerpult 95. Das Steuerpult umfaßt Eingabevorrichtungen, wie eine numerische Tastatur 97 und Soft-Keys 98, die mit einer Auswahl verbunden sind, die auf einer Anzeigevorrichtung 99 zur Anzeige von Menüs für einen Bediener angezeigt wird. Ein Bereich 101 weist eine Anzahl von Gefäßen zur Lagerung und Bereitstellung verschiedener Reagenzien, die bei dem Syntheseverfahren verwendet werden, auf. Die Beschaffenheit und die Verbindung dieser Gefäße werden ausführlicher im nachstehenden Abschnitt D beschrieben.

D. Übertragungsmechanismen und Verfahren

Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm, das Flüssigkeitsleitungen, Ventile und mechanische Darstellungen von Patronen für den in Fig. 5 gezeigten Syntheseapparat umfaßt. Der Betrieb des Systems wird nachstehend mit Bezug auf Fig 6 und für die Peptidsynthese unter Anwendung der Fmoc-Chemie als ein Beispiel beschrieben.
Vor dem Beginn der Peptidsynthese des vorliegenden Beispiels wird ein Reaktionsgefäß 89, das eine Fmoc-Aminosäure, die an einen Polystyrolträger gebunden ist, enthält, in den Apparat geladen. Die immobilisierte Aminosäure ist der Ausgangspunkt für die gewünschte Peptidkette. Ein abspaltbarer Linker ist zwischen dem C-terminalen Rest und dem Polystyrol angeordnet, so daß das Peptid, das sich bei der sequentiellen Synthese ergibt, von dem Träger entfernt werden kann. Für die Fmoc-Synthese stellt Hydroxymethylphenoxyacetyl (HMPA) einen geeigneten Linker dar. Das Reaktionsgefäß weist im wesentlichen die gleiche physikalische Form wie die in Fig. 4 gezeigte Untereinheiten-Abgabepatrone 50 auf, und zwar mit oberen und unteren Öffnungen mit geeigneten Filtern, und es ist mit oberen und unteren Flüssigkeitsleitungen 103 und 105 mittels Luer-Anschlußstücken verbunden.
Im Strömungspfad unmittelbar unterhalb des Reaktionsgefäßes befindet sich eine Leitfähigkeitsmeßzelle 107 unter Einschluß von zwei goldbeschichteten Scheiben, die durch einen dünnen, nicht leitfähigen, inerten Polymerabstandshalter getrennt sind. Die Scheiben sind mit elektrischen Leitungen verbunden, um ein Potential anzulegen und die Leitfähigkeit der durch die Zelle tretenden Lösung zu untersuchen.
Patronen, die Fmoc-Aminosäuren in der Zusammensetzung, die in Teil A beschrieben wurde, enthalten, werden in das Karussell 85 am Umfang in der Reihenfolge eingesetzt, in der sie addiert werden sollen, um den Zusammenbau der gewünschten Peptidkette zu erreichen. Die Anordnung am Umfang vereinfacht den Betrieb des Systems, indem Patronen in einer vorher gewählten Reihenfolge präsentiert werden; sie ist jedoch nicht erforderlich, solange das System so programmiert ist, daß das Karussell rotiert wird, so daß Patronen mit Aminosäuren in der Reihenfolge, die für eine gewählte Synthese erforderlich ist, präsentiert werden.
Reagenzien, die für die Fmoc-Chemie im vorliegenden Beispiel verwendet werden, umfassen Piperidin (Pip.) in Gefäß 109, Dimethylformamid (DMF) in Gefäß 111, 2-(1H-Benzotriazol- 1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU)- Reagenz in Gefäß 113 und Diisopropylethylamin (DIEA) in Gefäß 115. Das HBTU-Reagenz in Gefäß 113 wird so hergestellt, daß es auch eine äquivalente Menge an 1-Hydroxy-O-benzotriazol (HOBt) enthält. Es gibt weitere Lösungen, die verwendet, jedoch in der Figur nicht gezeigt werden, z. B. für das Waschen von Leitungen und anderer Elemente zwischen Übertragungen, und diese Lösungen werden in weiteren Gefäßen, wie Gefäß 117, die mit dem System verbunden sind, gelagert.
Jedes Reagenzgefäß ist mit einer Inertgaszufuhr 119 durch ein manuell betriebenes Ventil 121 verbunden. Die Gaszufuhr wird im vorliegenden Beispiel auf etwa 5 psi eingestellt. Die Gefäße sind mit den Hauptfluidleitungen des Systems über magnetisch betreibbare Ventilblöcke verbunden. In einer vorbereitenden Stufe werden die Reagenzflaschen gefüllt, verschlossen und unter Druck gesetzt.
Das Flüssigkeitsübertragungssystem des Syntheseautomaten umfaßt Gefäße 91 und 93, die im Zusammenhang mit der unter Druck stehenden Inertgaszufuhr 123 verwendet werden, um Reagenzgemische durch Patronen in dem Karussell und durch die Reaktionsgefäße zu übertragen.
Vor einer Kupplungsreaktion muß die Fmoc-Schutzgruppe entfernt werden (Schutzgruppenentfernung), um eine Addition des nächsten Rests an die wachsende Peptidkette. zu erlauben. Dies wird durch gleichzeitige Abgabe von Piperidin und DMF, die durch das Reaktionsgefäß zum Abfall strömen, erreicht. Piperidin wird gründlich aus dem System gewaschen, bevor der nächste Aminosäurerest extrahiert wird, um eine vorzeitige Schutzgruppenentfernung des nächsten Rests zu vermeiden. Die Fmoc-Gruppe wird in Form eines Piperidin-dibenzofulven-Addukts entfernt.
Um eine Kupplungsreaktion einzuleiten, wird ein Gemisch aus HBTU (mit einem Gehalt an HOBT), DMSO und NMP in Gefäß 93 durch cyclische Ventilfunktionen in den Ventilblöcken 125 und 127 hergestellt. Um dies zu erreichen, ist es erforderlich, Gefäß 193 über Ventil 129 zu entlüften. Zum Beispiel kann Leitung 131 hin zu Leitung 128 durch Ventilblock 127 geöffnet werden, Leitung 128 zu Leitung 135 durch Ventilblock 125 und Leitung 135 zu Leitung 137 durch Ventilblock 139. DMF strömt dann aus Gefäß 111 im Gefäß 93 unter dem Einfluß des Gasdrucks, der aus der Gaszufuhr 119 zugeführt wird, wobei Gefäß 93 entlüftet wird. Die Menge an Flüssigkeit (Volumen), die in Gefäß 93 strömen soll, ist eine Funktion der Zeit bei dem eingestellten Druck.
Auf entsprechende Weise werden auch DIEA in NMP und DMSO in Gefäß 93 geleitet, bis das erforderliche Gemisch erreicht ist. Mit diesem beispielhaften Gemisch im Gefäß 93 und einer ersten Untereinheitenabgabepatrone 151 in der Beladungsstation 87 werden Translationselemente in der Beladungsstation aktiviert, um Anschlußstücke 52 und 54 (vgl. Fig. 4) vorzuschieben, die Teil der Beladungsstation sind, um in die Untereinheitenabgabepatrone 151 einzurasten, so daß Flüssigkeit durch die Patrone über Leitungen 143 und 141 treten kann.
Ventil 129 wird so geschaltet, daß Gefäß 93 mit der Gaszufuhr 123 verbunden wird, Ventil 145 wird so geschaltet, daß Gefäß 91 entlüftet wird, Leitung 137 wird mit Leitung 143 über Ventilblock 139 verbunden, und Leitung 141 wird mit Leitung 147 über Ventilblock 149 verbunden. In diesem Zustand wird das Gemisch in Gefäß 93 von oben nach unten durch die Untereinheitenpatrone 151 und in das Gefäß 91 übertragen. Wenn das gesamte Reagenzgemisch übertragen ist, dann werden die Ventile in den Blöcken 139 und 149 so geschaltet, daß der Strömungsweg durch die Ventilblöcke geschlossen wird, das Ventil 145 wird so geschaltet, daß Gefäß 91 unter Druck gesetzt wird, Ventil 129 wird so geschaltet, daß Gefäß 93 entlüftet wird, und das Reagenzgemisch wird aus Gefäß 91 in Gefäß 93 über Leitung 153 übertragen. Mit dem Reagenzgemisch im Gefäß 93 ist der Zyklus abgeschlossen und kann bei Bedarf wiederholt werden.
DMF quillt das Verbundmaterial in der Untereinheitenabgabepatrone, wobei die Fmoc-Aminosäure in das Reagenzgemisch freigesetzt wird, und die anderen Chemikalien aktivieren die Aminosäure unter Bildung eines Derivats, das leicht mit der α-Aminogruppe der wachsenden Peptidkette (in diesem Fall mit dem immobilisierten C-terminalen Rest im Reaktionsgefäß) reagiert.
Da ein Durchgang durch die Patrone möglicherweise nicht ausreicht, um die Gesamtmenge der Untereinheitenaminosäure in dem Verbundmaterial in der Patrone freizusetzen und zu aktivieren, werden mehrere Zyklen entsprechend der vorstehenden Beschreibung durchgeführt, wobei die Hauptmenge des Reagenzgemisches, das die aktivierte Aminosäure enthält, sich schließlich im Gefäß 93 befindet. 10 bis 15 Übertragungszyklen sind typischerweise ausreichend. Die gebrauchte Patrone wird mit DMF und anschließend mit einem flüchtigen Lösungsmittel gewaschen und mit Gas durch geeignete Schaltung der Ventile getrocknet, bevor ein Übergang zur nächsten Patrone erfolgt. Für das Waschen verwendete Lösungsmittel und andere Abfallflüssigkeiten werden über Ventilblock 139 oder 149 in Abfallbehälter, die in Fig. 6 gezeigt sind, geleitet.
Nach "Extraktivierung" (Extraktion und Aktivierung) wird das Reagenzgemisch, das die aktivierte Aminosäure enthält, durch Reaktionsgefäß 89 geleitet, um die Aminosäureuntereinheit mit der wachsenden Peptidkette zu kuppeln. Dieser Strömungszyklus erfolgt im wesentlichen in der gleichen Weise wie die Strömung durch die Untereinheitenabgabepatrone, mit der Ausnahme, daß Ventile in den Ventilblöcken 139 und 149 so eingestellt werden, daß Leitung 137 mit Leitung 103 und Leitung 147 mit Leitung 105 verbunden wird. Die Strömung erfolgt wiederum von oben nach unten.
Im Fall des Strörnens des Gemisches durch das Reaktionsgefäß ist der Strom von oben nach unten eine Hilfe, um die Blasenbildung zu vermeiden, die die Leitfähigkeitsüberwachung stören würde, und auch um eine Trennung des Harzes in der Reaktionskammer zu vermeiden, was unerwünschte Variablen einführen würde. Außerdem wird nicht das gesamte Gemisch in einem einzigen Zyklus aus Gefäß 93 in Gefäß 91 übertragen, da dies bewirken würde, daß die Leitfähigkeitszelle an einem bestimmten Punkt geleert würde. Ein einzelner Übertragungszyklus wird beendet, wobei ein kleines Volumen an Gemisch im Gefäß 93 verbleibt, und anschließend wird das Gemisch in Gefäß 91 direkt in Gefäß 93 übertragen, wie es vorstehend für den Extraktionsschritt beschrieben wurde, bevor ein neuer Übertragungszyklus eingeleitet wird.
Wichtige Faktoren sind der Grad der Quellung des Harzträgers im Reaktionsgefäß und die Konzentration der aktivierten Aminosäure. 10 bis 30 Minuten Zykluszeit sind typischerweise erforderlich, um die Kupplung zu bewirken, wobei jeder Zyklus etwa 10 Sekunden ausmacht. Die tatsächliche Länge, die einer Kupplungsstufe gewidmet wird, wird durch Überwachung unmittelbar vor der Schutzgruppenentfernungsstufe bestimmt, wie es im nachstehenden Abschnitt F mit dem Titel "Überwachung" beschrieben ist.
Nach der Kupplung muß die Fmoc-Schutzgruppe entfernt werden (Schutzgruppenentfernung), um eine Addition des nächsten Rests an die wachsende Peptidkette zu erlauben. Dies wird durch gleichzeitige Abgabe von Piperidin und DMF, die durch das Reaktionsgefäß zum Abfall strömen, bewirkt. Piperidin wird gründlich aus dem System gewaschen, bevor der nächste Aminosäurerest extrahiert wird, um eine vorzeitige Entfernung der Schutzgruppen des nächsten Rests zu vermeiden. Die Fmoc-Gruppe wird in Form eines Piperidin-dibenzofulven- Addukts entfernt.
Die vorstehenden Verfahren werden für anschließende Aminosäurereste, die aus dem Verbundmaterial in nachfolgenden. Untereinheitenabgabepatronen extrahiert werden, wiederholt, bis das geplante Peptid vollständig ist, wobei zu diesem Zeitpunkt das Reaktionsgefäß aus dem Apparat entnommen wird. Es können auch geeignete Reagenzgemische hergestellt und durch die Reaktionskammer geleitet werden, um die Peptidkette von dem festen Träger abzuspalten.

E. Systemelektronik und Steuerung

Fig. 7 ist ein Blockdiagramm der Stromzufuhr- und Steuerungsfunktionen des erfindungsgemäßen Syntheseautomaten. Allgemein sind Steuerungsdatenkommunikationspfade zwischen Elementen gezeigt, und Stromversorgungsverbindungen sind nicht gezeigt, wobei jedoch die Stromversorgung 155 als Teil des Diagramms gezeigt ist. Die Stromversorgungsverbindungen sind herkömmlicher Art.
Die Steuereinrichtung 157 ist eine Motorola 68000-basierte Steuerungskarte, wobei sie jedoch auch auf anderen verfügbaren Mikroprozessoren basieren kann. Die Steuereinrichtung handhabt Eingaben über eine Tastatur 97 und Soft- Keys 98 (vgl. auch Fig. 5) und zeigt Menüs und andere benutzergerichtete Informationen auf einer Anzeigevorrichtung 99 an. Die Steuereinrichtung ist mit einer Schnittstellenkarte 159 gekoppelt, die die Steuereinrichtungsausgabe in diskrete Signale übersetzt, um die Solenoide der magnetisch betriebenen Ventile des Syntheseautomaten sowie den Motorantrieb und den Dekodiererschaltung 161, die das Karussell 85 antreiben (Fig. 5 und Fig. 6), zu steuern. Die Steuereinrichtung sendet geeignete Daten, um das Karussell um jeweils eine Patronenposition zu bewegen, und die Motorantriebsschaltung stellt die erforderliche Ausgabe für Schrittmotor 160 bereit. Ein Kodierer 162 auf dem Karussell führt Positionsinformationen zurück zur Schaltung 161 und damit zur Steuereinrichtung.
Eine Überwachungsschaltung 163 ist mit einer Leitfähigkeitsmeßzelle 107 (ebenfalls in Fig. 6 gezeigt) gekoppelt, um die Leitfähigkeit in Lösung von Reagenzgemischen zu messen, die durch das Reaktionsgefäß des Syntheseautomaten treten und eine Ausgabe auf einem Streifenschreiber 165 bereitzustellen. Die Ausgabe der Überwachungseinrichtung wird auch einem A/D- Wandler 167 zur Verfügung gestellt. Die Überwachung der Lösungen, die durch das Reaktionsgefäß treten, und die Verwendung der erhaltenen Daten werden ausführlicher im nachstehenden Abschnitt F dargestellt.
Die mit dem System bereitgestellte Software weist menübasierte Routinen zur Darstellung von Auswahlmöglichkeiten auf der Anzeigevorrichtung 99 auf, die ein Benutzer durch Drücken eines entsprechenden Soft-Keys aus der Gruppe 98 auswählt. Einige Auswahlmöglichkeiten stellen Submenüs dar, und einige erfordern Sollwerte, die der Benutzer über die Tastatur 97 eingibt. Es gibt eine automatische Betriebsart, die über das Menüsystem eingeleitet wird und den Betrieb startet und alle Stufen, die erforderlich sind, um Aminosäuren, die in Patronen auf dem Karussell bis zu einer maximalen Anzahl von Positionen auf dem Karussell (in der bevorzugten Betriebsart 30 Positionen) bereitgestellt werden, zu extraktivieren, zu kuppeln und von Schutzgruppen zu befreien.
Es gibt auch Einstellungsverfahren und Verfahren zum Abschalten und Anfahren sowie manuelle Betriebsanleitungen, die für den Benutzer zur Verfügung stehen. In der automatischen Betriebsart gibt es eine einzigartige Möglichkeit, die Daten der Überwachungseinrichtung während des Betriebs zur Steuerung nachfolgender Stufen heranzuziehen, was ausführlicher im nachstehenden Abschnitt F, der der Überwachung gewidmet ist, beschrieben wird.

F. Überwachung

Der automatisierte Peptidaufbau wird durch Fortschritte hinsichtlich der Lösungs- und Aktivierungschemie zuverlässiger; die unvorhersehbare "schlechte" Kupplung aufgrund einer Reihe von Ursachen ist jedoch immer noch möglich. Bei Festphasensynthesen kann man das Harz oder die Reaktionslösung überwachen. Bestehende Instrumente beruhen oftmals auf der Entfernung einer kleinen Harzprobe aus einem Reaktionsgefäß für die spätere Analyse. Harzanalysen sind recht zuverlässig, müssen jedoch typischerweise durchgeführt werden, nachdem die Synthese abgeschlossen ist. Sie bieten daher keine Möglichkeit für einen "on-line"-Nachweis und für die Verwendung bei Echtzeitmodifizierungen des Synthesebetriebs.
Andere Arten der Überwachung erfolgen durch UV-Absorption oder durch Messung der elektrischen Leitfähigkeit. In der vorliegenden Erfindung, die geringe Anfangskosten für das Instrument und geringe Betriebskosten betont, ist die Leitfähigkeitsüberwachung die logische Wahl. Die Anwendung der Leitfähigkeitsüberwachung erfolgt am besten in den Schutzgruppenentfernungsstufen, da HBTU-Lösungen, die bei der Kupplungsreaktion vorhanden sind, inhärent recht leitfähig sind.
Während der Schutzgruppenentfernung unter Verwendung von Piperidin wird eine leitfähige Spezies freigesetzt, wobei angenommen wird, daß es sich um ein Piperidiniumpiperidincarbamat handelt. An die Leitfähigkeitszelle 107 (Fig. 6) wird ein Quadratwellenpotential von etwa 2V bei etwa 100 Hz angelegt.
Der erzeugte Strom wird abgetastet und verstärkt, so daß ein Gleichstromsignal von etwa 0 bis 2 V als Reaktion auf die Leitfähigkeit der Lösung, die durch die Zelle tritt, erzeugt wird. Das Signal wird auf einem Zweistiftstreifenschreiber 165 unter Anwendung des Bereiches von 0 bis 2 V für die Kupplungsstufen und des Bereiches von 0 bis 200 mV für die Schutzgruppenentfernungsstufen aufgezeichnet. Das Signal wird durch den Wandler 167 digitalisiert
Die Digitaldaten aus dem Wandler 167 werden der Steuereinrichtung 157 als Mittelwert über ein festgelegtes Intervall bereitgestellt und mit dem vorherigen Intervall verglichen, um die Änderung der Leitfähigkeit im Verlauf der Zeit zu bestimmen, die nachstehend als Δ bezeichnet wird. Da der gemessene Strom direkt proportional zur Leitfähigkeit ist, ist die Änderung der Leitfähigkeit im Verlauf der Zeit die Steigung der Spur auf dem Streifenschreiber.
Fig. 8 ist eine Reproduktion eines aufgezeichneten Streifens von mehreren Zyklen, die mit dem erfindungsgemäßen Syntheseapparat durchgeführt wurden. Die Zeichnung von Fig. 8 ist nicht der tatsächlich aufgezeichnete Streifen, sondern die künstlerische Wiedergabe einer tatsächlichen Aufzeichnung.
Die Abschnitte der Aufzeichnung, die gerade horizontale Linien bei maximaler Amplitude zeigen, wie der Abschnitt 171, sind während des Kupplungsabschnitts des Zyklus aufgezeichnet worden, wenn die Flüssigkeit, die durch die Leitfähigkeitszelle strömt, recht leitfähig ist. Der Grund für das flache Profil besteht darin, daß die Nadel des Streifenschreibers sich bei der maximalen Auslenkung befindet.
Ein Schutzgruppenentfernungszyklus ist durch eine Zacke, wie Zacke 173, charakterisiert, die rasch ein Maximum erreicht und dann fast ebenso rasch abfällt. Von Interesse bei der Aufzeichnung der Leitfähigkeit für eine Schutzgruppenentfernung ist die Steigung (Δ) der Kurve der fallenden Leitfähigkeit und die Zeit, die erforderlich ist, damit die Steigung im wesentlichen Null erreicht. Wenn Δ = im wesentlichen Null, dann ist die Schutzgruppenentfernung vollständig, und die nächste Stufe im Zyklus kann beginnen. Die Höhe der Leitfähigkeitszacke für die Schutzgruppenentfernung und, wichtiger, die Zeit, damit Δ im wesentlichen Null erreicht, sind wesentlich für eine folgende Kupplungsreaktion.
Es wird angenommen, daß eine langsame Schutzgruppenentfernung, die typischerweise durch eine geringe maximale Leitfähigkeit und eine verlängerte Zeit, bis die Leitfähigkeit im wesentlichen einen konstanten Wert erreicht, charakterisiert ist, eine Funktion eines Phänomens ist, das in Beziehung zur Exposition der wachsenden Peptidkette in der festen Trägermatrix in dem Reaktionsgemäß steht. Eine plausible Erklärung für das Phänomen besteht darin, daß die wachsenden Peptidketten einer Assoziation miteinander unterliegen, wobei der effektive Grad der Vernetzung mit dem Harz erhöht wird. Dies hat die Folge, daß die Diffusionsgeschwindigkeit in die und aus den Harzkügelchen verringert wird. Das Phänomen wird auch bei der UV-Absorptionsüberwachung beobachtet.
Auf jeden Fall wird ein Zusammenhang zwischen einer "langsamen" Schutzgruppenentfernung und der nächsten Kupplungsreaktion beobachtet, die in den meisten Fällen ebenfalls verlangsamt ist. Die Erklärung, daß das Harz einen weniger zugänglichen Zustand annimmt, ist vernünftig und kann den Einfluß auf die folgende Kupplungsreaktion erklären. Die Erfinder nehmen an, daß es nicht erforderlich ist, die Kupplung zu überwachen, wenn die unmittelbar vorausgehende Schutzgruppenentfernung sorgfältig überwacht wird, was den Zustand des Harzes anzeigt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Wert für Δ überwacht und als ein Signal herangezogen, um die Schutzgruppenentfernung zu beenden, wenn Δ = im wesentlichen Null. Der nächste Schritt beginnt dann. Dieser Steuerungsmechanismus wird auch herangezogen, um eine nächste Stufe nach Waschschritten einzuleiten. Die Zeit wird für eine Schutzgruppenentfernungsstufe von einem festgelegten Zeitpunkt nach dem Beginn der Stufe bis Δ = im wesentlichen Null aufgezeichnet und herangezogen, um die Länge der Zeit festzulegen, die der unmittelbar anschließenden Kupplungsreaktion zugeordnet wird. Der Zweck der festgelegten Zeitspanne besteht darin, sicherzustellen, daß die Leitfähigkeitsspur ein Maximum erreicht hat und dann abfällt, da der maximale Wert ebenfalls ein Punkt ist, an dem Δ = Null.
In Fig. 8 ist die Zeit t&sub1; die gemessene Zeit für eine Schutzgruppenentfernung, und die Zeit t&sub2; für eine andere Schutzgruppenentfernung. Es ist ersichtlich, daß t&sub2; erheblich länger als t&sub1; ist und eine erheblich langsamere Schutzgruppenentfernung darstellt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die gemessene Zeit für die Schutzgruppenentfernung mit 4 multipliziert, und das Ergebnis wird von der Steuereinrichtung als die Zeit für die folgende Kupplungsreaktion herangezogen. Der Faktor oder eine andere Beziehung zwischen den beiden Zeiten können vom Benutzer festgelegt und empirisch im Verlauf der Zeit verbessert werden.
Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß es viele Änderungen der beschriebenen Ausführungsformen gibt, die gemacht werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel gibt es eine Reihe von magnetisch betriebenen Ventilblöcken, die verwendet werden können, und es gibt alternative Weisen der Anordnung von Steuereinrichtung und damit verbundener Elektronik, um die erfindungsgemäßen Steuerungsanforderungen zu verwirklichen. Es gibt eine Vielzahl von Syntheseprotokollen, die verwirklicht werden können, und die Untereinheitensequenz ist für die Erfindung nicht beschränkend. Entsprechend ist zwar die bevorzugte Ausführungsform ein System mit relativ wenigen (30 oder dergl.) Positionen für Untereinheitenpatronen; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Merkmale der Erfindung unabhängig von der Anzahl der Positionen zutreffen. Es ist darauf hinzuweisen, daß es viele andere ähnliche Änderungen gibt, die gemacht werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Polymerzusammensetzung für die Biopolymersynthese, welche umfaßt:

ein getrocknetes Polymersubstrat, das (i) in einem organischen Lösungsmittel quellbar aber unlöslich ist, und das (ii) eine interne Polymermatrix aufweist, durch die Untereinheitenmoleküle des Biopolymeren diffundieren können, wenn das Substrat in einem gequollenen Zustand ist; und

Untereinheitenmoleküle des Biopolymeren, die in der Matrix eingeschlossen sind, wobei die Suspension des Substrats in dem Lösungsmittel die Quellung des Substrats und die Diffusion der Untereinheitenmoleküle durch die Matrix in das Lösungsmittel bewirkt.

2. Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 11 worin das Substrat ein vernetztes Polymeres umfaßt, das unter Polystyrol, Polyacrylat, Polymethacrylat, Folyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon und Copolymeren davon ausgewählt ist.

3. Polymerzusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Volumen des Substrats im gequollenen Zustand mindestens das 5- bis 10-fache des Volumens im getrockneten Zustand beträgt.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Substrat quellbare Polymerteilchen umfaßt.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin die Teilchen in getrockneter Form rieselfähig sind.

6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Substrat eine Polymerfolie umfaßt.

7. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Substrat ein Filament umfaßt.

8. Zusammensetzung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, worin die Biopolymeruntereinheit eine N-geschützte Aminosäure ist.

9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die N-geschützte Aminosäure an ihrem Carboxylende für die Reaktion mit einer freien Aminogruppe aktiviert ist.

10. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Biopolymeruntereinheit ein 5'-OH-geschütztes Nukleotid ist.

11. Patrone zur Abgabe von Untereinheiten zur Verwendung mit einem Festphasen-Biopolymersynthese-Apparat, welche umfaßt:

eine Vorrichtung, die eine Kammer begrenzt, die zum Verbinden mit dem Apparat ausgestaltet ist;

eine in der Kammer enthaltene Polymerzusammensetzung gemäß einem der vorherigen Ansprüche;

eine Vorrichtung zum Zurückhalten des Polymersubstrats der Polymerzusammensetzung in der Kammer; und

eine Öffnungsvorrichtung zum Einbringen des Lösungsmittels in die Kammer und zum Entfernen des Lösungsmittels aus der Kammer.

12. Verfahren zur Herstellung einer Biopolymeruntereinheiten enthaltenden Lösung, welches umfaßt:

Zugeben eines organischen Lösungsmittels zu einer Polymerzusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, und

Wiedergewinnen des organischen Lösungsmittels, das Biopolymeruntereinheiten enthält, die von der Polymermatrix der Polymerzusammensetzung freigesetzt worden sind.

13. Automatisiertes Verfahren zur Festphasensynthese eines Biopolymeren durch aufeinanderfolgende Zugabe von Biopolymeruntereinheiten zu einer wachsenden Biopolymerkette, die von einem Festphasenträger getragen wird, welches umfaßt:

das Anordnen einer Patrone zur Abgabe von Untereinheiten gemäß Anspruch 11 in einer Position zur Flüssigkeitsüberführung,

das Zugeben eines organischen Lösungsmittels durch die Öffnungsvorrichtung in die Patronenkammer, wodurch das Quellen des Polymersubstrats in der Patronenkammer und das Freisetzen der Biopolymeruntereinheiten in die Lösung unter Bildung einer Untereinheitenlösung bewirkt wird, und

das Überführen der Lösung von Biopolymeruntereinheiten in ein Reaktionsgefäß, das den Festphasenträger enthält.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, welches weiter die Wiederholung der Schritte des Positionierens, des Zugebens und des Überführens mit jeder einer Reihe von Patronen, die eine ausgewählte Untereinheit enthalten, umfaßt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das Zugeben das Verbinden der Öffnungsvorrichtung der Patrone mit einer Anpassungsvorrichtung zur Bildung einer flüssigkeitsdichten Versiegelung um die Öffnungsvorrichtung, die Zuführung des organischen Lösungsmittels durch die Öffnungsvorrichtung in die Patronenkammer und das Entfernen der Lösung von Biopolymeruntereinheiten durch die Öffnungsvorrichtung aus der Patronenkammer umfaßt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Öffnungsvorrichtung ein an gegenüberliegenden Enden der Patrone angeordnetes Paar von Öffnungen und die Anpassungsvorrichtung ein Paar von Anpassungsstücken umfaßt, die mit den Patronenöffnungen verbunden und zwischen den Stellungen des Verbundenseins und Nichtverbundenseins mit den Patronenöffnungen bewegt werden können.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, welches weiter den Schritt zur Bestimmung der Dauer eines Kopplungszyklus während der Synthese des Biopolymeren, wobei die Synthese abwechselnde Zyklen der Kopplung und der Entfernung von Schutzgruppen umfaßt, durch folgende Unterschritte einschließt:

Messen des Abfalls der Leitfähigkeit der Reagenzien zum Entfernen der Schutzgruppen, welche auf den Festphasen-Träger während jedes Zyklus der Entfernung der Schutzgruppen aufgetragen werden;

Messen der Zeitspanne ausgehend von einem vorbestimmten Zeitpunkt, nachdem das Maximum der Leitfähigkeit in jedem Zyklus der Entfernung der Schutzgruppen gemessen wurde, bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Änderung der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit annäherend null ist;

Multiplizieren der gemessenen Zeitspanne mit einem vorbestimmten Multiplikator, wobei eine berechnete Zeitspanne erhalten wird; und

Anpassen der Zeit für den unmittelbar folgenden Kopplungszyklus an die berechnete Zeitspanne durch eine Mikroprozessor-Regelvorrichtung.

18. Automatisiertes System für die Synthese eines Biopolymeren durch aufeinanderfolgende Zugabe von Biopolymeruntereinheiten zu einer wachsenden Biopolymerkette, die von einem Festphasenträger getragen wird, welches umfaßt:

eine Vielzahl von Patronen zur Abgabe von Polymeruntereinheiten gemäß Anspruch 11; und

einen automatisierten Syntheseapparat, der umfaßt:

(i) einen Patronenhalter, der für das Halten einer Vielzahl der Patronen geeignet ist;

(ii) eine Anpassungsvorrichtung, die in eine Stellung bewegt werden kann, die die Verbindung mit der Öffnungsvorrichtung einer ausgewählten Patrone in dem Halter bewirken kann, wobei eine flüssigkeitsdichte Versiegelung mit der Öffnungsvorrichtung gebildet wird,

(iii) eine Bewegungsvorrichtung zum Positionieren einer ausgewählten Patrone in dem Halter in die Überführungsstellung, in der die Anpassungvorrichtung mit der Öffnungsvorrichtung der ausgewählten Patrone verbunden werden kann,

(iv) ein Reaktionsgefäß zum Beinhalten des Festphasen- Trägers, und

(v) eine Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung zum Überführen des organischen Lösungsmittels in die Kammer der ausgewählten Patrone und zum Überführen der Lösung aus der Kammer in das Reaktionsgefäß.

19. System gemäß Anspruch 18, worin die Öffnungsvorrichtung in jeder Patrone Öffnungen an gegenüberliegenden Enden der Patrone aufweist und die Anpassungsvorrichtung-Anpassungsstücke aufweist, die in eine Stellung bewegt werden können, in der die an gegenüberliegenden Enden liegenden Öffnungen der Patrone flüssigkeitsdicht verbunden werden.

20. System gemäß Anspruch 18 oder 19, worin der Halter ein Karussell ist, das Öffnungen zum Aufnehmen und zum Tragen der Patronen aufweist, und die Bewegungsvorrichtung eine Einrichtung zum Drehen des Karussells aufweist, um die in dem Karussell gehaltenen Patronen nacheinander in die Überführungsstellung zu bringen.

21. System gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, worin die Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung ein erstes Flüssigkeitsgefäß, welches mit einer ersten zum Reaktionsgefäß führenden Flüssigkeitsleitung verbunden ist, und ein zweites Flüssigkeitsgefäß umfaßt, welches mit einer zweiten zum Reaktionsgefäß führenden Flüssigkeitsleitung verbunden ist, wobei das zweite Flüssigkeitsgefäß durch eine dritte Flüssigkeitsleitung über ein Ventil mit dem ersten Flüssigkeitsgefäß verbunden ist, die Flüssigkeitsgefäße einzeln unter Druck gesetzt und belüftet werden können und eine Biopolymeruntereinheiten enthaltende Flüssigkeit, die in eines der ersten Flüssigkeitsgefäße abgegeben worden ist, durch Ausüben eines Drucks auf das erste Flüssigkeitsgefäß unter Belüften des zweiten Flüssigkeitsgefäßes durch das Reaktionsgefäß geleitet werden kann.

22. System gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, welches weiter umfaßt:

eine Reaktionsgefäßanordnung, die den Festphasenträger enthält, der die wachsende Polymerkette trägt, wobei die Reaktionsgefäßanordnung Öffnungen zur Verbindung mit den Flüssigkeitsleitungen aufweist;

eine elektrisch regelbare Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung, welche Flüssigkeitsleitungen aufweist&sub1; die mit den Öffnungen des Reaktionsgefäßes so verbunden sind, daß Flüssigkeit durch die Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung durch das Reaktionsgefäß geleitet werden kann,

eine Vorrichtung zur Abgabe von Untereinheiten, welche über ein erstes Magnetventil mit der Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung zur Abgabe ausgewählter Biopolymeruntereinheiten enthaltender Flüssigkeiten in die Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung verbunden ist;

eine Vorrichtung zur Abgabe des Reagenzes, die über ein zweites Magnetventil mit der Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung zur Abgabe der Flüssigkeit, die das Reagens zum Entfernen der Schutzgruppen enthält, in die Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung verbunden ist;

eine Vorrichtung zum Messen der Leitfähigkeit, welche in der Reaktionsgefäßanordnung eine Leitfähigkeitszelle aufweist; und

eine Regelvorrichtung auf der Basis eines Mikroprozessors, die mit den Magnetventilen, der Flüssigkeitsüberführungsvorrichtung und der Vorrichtung zur Überwachung der Leitfähigkeit gekoppelt ist;

wobei die Regelvorrichtung die Regelung der aufeinanderfolgenden Operationen des automatisierten Apparates bewirkt, wobei ausgewählte, geschützte Untereinheiten enthaltende Flüssigkeit und Reagenzien zum Entfernen der Schutzgruppen abwechselnd durch die Reaktionsgefäßanordnung zirkuliert werden, um sequentiell ein Biopolymer zu synthetisieren, wobei die Regelvorrichtung die Leitfähigkeit der Flüssigkeit überwacht, die das Reagens zum Entfernen der Schutzgruppen enthält, die Rate der Änderung der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, die Gesamtzeit mißt, in der die Rate der Änderung der Leitfähigkeit annähernd den Wert Null erreicht, wobei von einem vorbestimmten Zeitpunkt ausgegangen wird, nachdem der Schritt der Entfernung der Schutzgruppen begonnen hat und die Leitfähigkeit einen maximalen Wert erreicht und begonnen hat abzunehmen, und die Zirkulation des Reagenzes zur Entfernung der Schutzgruppen beendet, wenn die Änderung der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit annähernd den Wert Null erreicht, und die Gesamtzeit für die nächste Zirkulation der Untereinheiten enthaltenden Flüssigkeit durch die Reaktionsgefäßanordnung so einstellt, daß sie ein vorbestimmtes Vielfaches der gemessenen Zeit ist.