DE69214471T2

DE69214471T2 - Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Probe

Info

Publication number: DE69214471T2
Application number: DE69214471T
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Hoshi; Takeshi Miyazaki; Matsuomi Nishimura; Toshikazu Ohnishi; Hidehito Takayama; Kazumi Tanaka
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-01-18
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 1997-04-24
Anticipated expiration: 2012-01-18
Also published as: DE69214471D1; US5380490A; EP0495519A3; EP0495519A2; EP0495519B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Messung einer Probe zum qualitativen oder quantitativen Nachweisen einer Substanz in der Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1, wie sie aus der EP-A-117 988 bekannt ist, sowie ein Verfahren zum Messen einer Substanz in einer Probe unter Verwendung dieser Vorrichtung.

Zugehöriger Stand der Technik

Als Verfahren zum Nachweisen einer sogenannten immunaktiven Substanz in einer Probe, beispielsweise eines Antigens oder Antikörpers, der an einem spezifizierten Antikörper oder Antigen gebunden ist, ist ein Verfahren bekannt, bei dem die immunaktive Substanz für Trägerpartikel sensibilisiert wird (Latexpartikel, Glaspartikel, Keramikpartikel, Kaolin, Ruß, galertartige Partikel wie Erythrocyt und andere tierische Blutkomponenten und dergleichen), und die Trägerpartikel werden mit Proben in einem flüssigen Medium zum Reagieren gebracht. Es wird der Aggregatzustand der Trägerpartikel in der Reaktionslösung beobachtet und mit bloßem Auge verifiziert, um dadurch qualitativ die Substanz nachzuweisen, die speziell an der sensibilisierten Substanz gebunden ist. Für einen quantitativen Nachweis kennt man ein Verfahren, bei dem eine immunaktive Substanz quantitativ in der Weise nachgewiesen wird, daß die Reaktionslösung in einen transparenten Testbehälter eingespritzt wird und weißes Licht oder dergleichen aufgestrahlt wird, um die Intensitätsschwankungen des transmittierten Lichts, der gestreuten Lichtstrahlen und weiterer Komponenten zu messen.
Allerdings ist es bei dem oben erläuterten konventionellen Verfahren schwierig, eine Reproduzierbarkeit zu erzielen, indem man die Bedingungen für die Aggregation konstant macht. Wenn außerdem der Aggregationszustand mit dem bloßen Auge festgestellt wird, mangelt es diesem Nachweis leicht an der Mengenbestimmung. Als Ergebnis sind die Testergebnisse weniger genau und zuverlässig. Da ferner eine mechanische Vibration auf die Reaktionslösung ausgeübt werden sollte, um deren Aggregation zu beschleunigen, wird der Mechanismus der Vorrichtung voluminös und kompliziert. Obschon das Verfahren zum Durchführen eines quantitativen Nachweises mittels Messung des transmittierten Lichtes, des Streulichts und dergleichen zu einer verbesserten quantitativen Genauigkeit beiträgt, ist zu bedenken, daß es Längere Zeit benötigt, um den Test abzuschließen, weil der Aggregatzustand nach der Reaktion zweimal oder noch öfter gemessen werden muß.

Offenbarung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Messen einer Probe der eingangs genannten Art zu schaffen, die in der Lage sind, eine in hohem Maße genaue qualitative und quantitative Bestimmung einer Substanz in einer Probe bei einfachem Aufbau innerhalb kurzer Zeit durchzuführen.
Erreicht wird dies durch den Kennzeichnungsteil des Anspruches 1 bezüglich der Vorrichtung und durch die Merkmale des Anspruchs 7 bezüglich des Verfahrens. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, welches den Aufbau der ersten Ausführungsform gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die ein Probenplättchen veranschaulicht;
Fig. 3A bis 3H stellen angesammelte Partikelgruppen auf dem Probenplättchen und räumliche Spektren dar;
Fig. 4A bis 4C veranschaulichen angesammelte Partikelgruppen auf dem Pro benplättchen und räumliche Spektren;
Fig. 5 ist ein Diagramm des Aufbaus einer zweiten Ausführungsform gemäß der Erfindung;
Fig. 6 ist eine perspektivische Ansicht einer vierten Ausführungsform gemäß der Erfindung;
Fig. 7 ist eine Vertikalschnittansicht der vierten Ausführungsform gemäß Fig. 6;
Fig. 8 ist eine Ansicht, die das Meßprinzip veranschaulicht;
Fig. 9 ist eine Ansicht, die das Meßprinzip veranschaulicht;
Fig. 10 ist eine Ansicht, die schematisch eine fünfte Ausführungsform gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 11 ist eine Ansicht, die schematisch eine sechste Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 12 ist eine Ansicht, die schematisch eine siebte Ausführungsform gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 13 ist eine Schnittansicht, die das optische System veranschaulicht;
Fig. 14 ist ein Diagramm, welches schematisch die Signalverarbeitungseinheit darstellt; und
Fig. 15A und 15B veranschaulichen Beispiele von zu erhaltenden Signalen.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen beschrieben.
Fig. 1 ist eine Skizze, die schematisch den Aufbau einer ersten Ausführungsform der Erfindung darstellt. In Fig. 1 bezeichnet ein Bezugszeichen 1 ein Probenplättchen zur Aufnahme der Trägerpartikel, die eine immunaktive Substanz tragen, beispielsweise einen monoklonalen Antikörper auf opaken unlöslichen Feinteilchen, sowie die Reaktionslösung, in der eine nachzuweisende Objektsubstanz in einem flüssigen Medium zur Reaktion gebracht ist. Eine Halbleiterlaser-Lichtquelle 2 und eine Kollimatorlinse 3 befinden sich auf der optischen Achse gegenüber dem horizontal angeordneten Probenplättchen 1. Eine Linse 4 und ein fotoelektrisches Element 5, wie z.B. ein Primär-CCD-Element, sind auf der optischen Achse hinter dem Probenplättchen 1 angeordnet, um den durch das Probenplättchen 1 hindurch gegangenen Lichtstrahl aufzunehmen. Das Probenplättchen 1 wird so eingestellt, daß es mit der vorderen Brennebene der Linse 4 übereinstimmt, und das fotoelektrische Element 5 ist so eingestellt, daß es mit der hinteren Brennebene der Linse übereinstimmt.
Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die das Probenplättchen 1 veranschaulicht. Das Probenplättchen 1 wird in der Weise hergestellt, daß ein Kreuzfinger-Muster kammförmiger opaker Elektroden 1b und 1c durch Maskierung auf ein Substrat 1a aus Glas oder einem anderen transparenten Material mit Hilfe von fotolithografischen Prozessen übertragen wird. Die kammförmigen Elektroden 1b und 1c sind symmetrisch durch Ätzen und Chromniederschlag gebildet, und die Elektroden 1b und 1c sind von dem Probenplättchen elektrisch isoliert. Beispielsweise sind die Elektroden 1b und 1c derart ausgebildet, daß die Breite zwischen sämtlichen kammförmigen Elektroden 1b und 1c 100 µm beträgt, während die Breite der Elektrode selbst jeweils 20 µm beträgt, während der freie Elektrodenabstand 40 µm und die Gitterkonstante (P), die durch die ausgebildete Elektrode definiert wird, 60 µm beträgt. Die Größe der Elektrodenfläche ist größer als der Strahldurchmesser des Beleuchtungslasers von 10 mm Durchmesser, und ihre Gestalt ist quadratisch mit einer Seitenlänge von annähernd 12 mm. In der Richtung parallel zu den kammförmigen Elektroden 1b und 1c ist das fotoelektrische Element 5 mit seiner Längsrichtung darin orientiert angeordnet.
Zur Steuerung des Systems ist eine Steuerung 6 vorgesehen. Ein Ausgang dieser Steuerung 6 ist an die Halbleiterlaser-Lichtquelle 2 über einen Lasertreiber 7 angeschlossen. Außerdem ist ein Ausgang der Steuerung 6 direkt mit einem Verstärker 9 verbunden, während dieser Ausgang außerdem über einen Wechseloszillator 8 mit dem Verstärker verbunden ist. Der Ausgang des Verstärkers 9 ist an die jeweiligen kammförmigen Elektroden 1b und 1c des Probenplättchens 1 angeschlossen, damit die Wechselspannung, die sich periodisch mit der von dem Verstärker 9 verstärkten Spannung ändert, an die kammförmigen Elektroden 1b und 1c gelegt werden kann. Außerdem ist ein Ausgang der Steuerung 6 über den CCD-Treiber 10 an das fotoelektrische Element 5 angeschlossen. Der Ausgang des fotoelektrischen Elements 5 ist über eine Wellenformbehandlungsschaltung 11 und einen A/D-Wandler 12 an die Steuerung 6 angeschlossen. Ferner ist ein Ausgang der Steuerung 6 auch an ein ROM 17 und ein RAM 18 angeschlossen, die getrennt von dem ROM und dem RAM in einer Anzeige 13, einer Tastatur 14, einem Drucker 15, einem Plattenspeicher 16 und der Steuerung 6 vorgesehen sind.
Bei der vorliegenden Ausführungsform werden Latexpartikel mit einem Querschnitt von 1,0 µm als Trägerpartikel dazu verwendet, eine immunaktive Substanz auf ihrer Oberfläche zu sensibilisieren, und es wird eine immunaktive Substanz in einem flüssigen Medium mit Wasser als Hauptkomponente dispergiert, um ein Reagens zu bilden. Es wird eine Reaktionslösung vorbereitet, indem die Probe und das so gebildete Reagens gemischt werden. Als Latexpartikel werden solche verwendet, die ionische Eigenschaft entweder vom Kation oder vom Anion auf ihrer Oberfläche besitzen. In diesem Zustand, in welchem diese Reaktionslösung in das Substrat 1a des Probenplättchens injiziert wird, werden die Aggregationsbeschleunigung und die Messung über eine vorbestimmte Zeitspanne durch Betätigung der Tastatur 14 gestartet. Wenn die Wechselspannung an die kammförmigen Elektroden 1b und 1c gelegt wird, werden die ionischen Substanzen in der Reak-tionslösung, z.B. die Latexpartikel mit der ionischen Eigenschaft auf ihrer Oberfläche sowie eine weitere ionische Substanz, wie z.B. Ionen in der Lösung, durch die an die Elektroden 1b und 1c angelegte Wechselspannung in Vibration versetzt, wodurch folglich die Aggregation beschleunigt wird. Wenn man nur die Wechselspannung und die Anlegezeit der Spannung konstant macht, läßt sich die Aggregation der Reaktionslösung im wesentlichen konstant einstellen. Möglicherweise kann irgendeine Spannung angelegt werden, wenn die Spannung im Verlauf der Zeit variiert werden kann. Anstelle der Wechselspannung kann möglicherweise eine impulsförmige Spannung angelegt werden.
Der von der Halbleiterlaser-Lichtquelle 2 kommende Lichtstrahl wird auf das Probenplättchen 1 aufgestrahlt, nachdem er von der Kollimatorlinse 3 in ein paralleles Lichtstrahlenbündel umgewandelt wurde, und der durchgelassene Strahl bildet aufgrund der Funktion der Linse 4 auf dem fotoelektrischen Element 5 ein Bild ab.
Auf dem Probenplättchen 1 wird durch die opaken, kammförmigen Elektroden 1b und 1c eine im wesentlichen periodische Struktur gebildet, und das Probenplättchen 1 befindet sich in der vorderen Brennebene der Linse 4, während das fotoelektrische Element 5 in deren hinterer Brennebene liegt. Deshalb ist es möglich, das räumliche Spektrum des Probenplättchens 1 mit Hilfe des auf dem fotoelektrischen Element 5 erzeugten Bildes zu erhalten.
Fig. 3A bis 3H veranschaulichen die Zustände der kammförmigen Elektroden 1b und 1c des Probenplättchens 1 und die angesammelten Partikelgruppen sowie die dazugehörigen räumlichen Spektren, die aus dem fotoelektrischen Element 5 erhalten werden. Fig. 3A zeigt den Zustand der kammförmigen Elektroden 1b und 1c, ohne daß irgendeine Reaktionslösung injiziert wurde. In diesem Fall wird die im wesentlichen periodische Struktur lediglich durch die kammförmigen Elektroden 1b und 1c gebildet, und wie in Fig. 3E gezeigt ist, besitzt das räumliche Spektrum auf dem fotoelektrischen Element 5 nur die Grundfrequenzkomponente fo entsprechend der Gitterkonstanten d. Da in der Praxis die kammförmigen Elektroden 1b und 1c ein rechteckiges Amplitudengitter bilden, sind die Oberwellenkomponenten der Frequenz fo enthalten, wenn auch in extrem schwacher Form. Der Nutzfaktor des Gitters, d.h. die Breite und der Zwischenabstand der Elektroden, ist nicht gleichmäßig, so daß die Oberwellenkomponenten ein moduliertes räumliches Spektrum bilden können, jedoch sind diese Effekte extrem klein und hier vernachlässigt worden. Die diesbezügliche Beschreibung entfällt also.
Wenn eine Probe in dieses Reagens auf dem Probenplättchen injiziert wird, kann der Zustand eingenommen werden, wie er in den Fig. 3A und 3E dargestellt ist, weil unmittelbar nach dem Injizieren der Probe keine Aggregation stattfindet. In der Praxis allerdings sind die Trägerpartikel mit einem Querschnitt von annähernd 1,0 µm auf dem Probenplättchen 1 dispergiert, was eine Streuung des Laserstrahls hervorruft. Als Ergebnis ergibt sich im räumlichen Spektrum eine breite Überlappung eines weißen Rauschens niedrigen Pegels. In Fig. 3E ist dieses Rauschen allerdings nicht dargestellt.
Von einem Oszillator wird auf Befehl seitens der Steuerung 6 über den Verstärker 9 anschließend ein Wechselstromfeld mit Nulldurchgangs-Sinuswellen an den kammförmigen Elektroden 1b und 1c erzeugt. Da die Trägerpartikel positiv geladen sind, wird dadurch die Reaktionslösung L veranlaßt, zu vibrieren, was ihre Aggregation beschleunigt. Fig. 3B zeigt den Zustand, in welchem die aggregierte Partikelgruppe G an der kammförmigen Elektrode 1b dadurch haftet, daß eine negative Spannung an die kammförmige Elektrode 1b und eine positive Spannung an die kammförmige Elektrode 1c gelegt wird, nachdem die Beschleunigung der Ag--gregation durch Vibrieren der Reaktionslösung L über eine vorbestimmte Zeitspanne erfolgt ist. Da in diesem Zustand die opake Aggregationspartikelgruppe G gleichmäßig an der kammförmigen Elektrode 1b haftet, wird ihr räumliches Spektrum im wesentlichen das gleiche wie in dem Fall, daß die Elektrodenbreite der kammförmigen Elektrode 1b groß gemacht wird. Folglich erscheint eine Frequenzkomponente fo/2 entsprechend dem Elektrodenabstand 2d der kammförmigen Elektrode 1b, wie in Fig. 3F gezeigt ist.
Ausgehend von dem in Fig. 3B dargestellten Zustand wird die angelegte Spannung allmählich auf Null reduziert. Dann kann man annehmen, daß die Aggregationspartikelgruppe G zu einer Zwischenposition zwischen den kammförmigen Elektroden 1b und 1c transferiert wurde, und daß ein Gitter mit einer ungefähren Gitterkonstanten d/2 zusätzlich zu der in Fig. 3C dargestellten Frequenzkomponente fo erzeugt wurde. Wird das räumliche Spektrum so, wie es in Fig. 3G dargestellt ist, und es erscheint die Frequenzkomponente 2 fo entsprechend der Gitterkonstante d/2.
Wenn an die kammförmige Elektrode 1b eine positive Spannung gelegt wird, während an die kammförmige Elektrode 1c eine negative Spannung gelegt wird, wird die Aggregationspartikelgruppe G an die kammförmige Elektrode 1c gezogen, wie in Fig. 3D gezeigt ist. In diesem Fall ist die Phase des Beugungslichts unterschiedlich gegenüber dem in Fig. 3B gezeigten Zustand, allerdings wird das räumliche Spektrum das gleiche, so daß die Frequenzkomponente fo/2 erscheint, wie in Fig. 3H gezeigt ist.
Durch Anlegen einer Wechselspannung an die kammförmigen Elektroden 1b und 1c können also die Trägerpartikel elektrisch in Vibration versetzt werden. Damit ist es möglich, das räumliche Spektrum der Aggregationspartikelgruppe G dadurch zu erhalten, daß man seine Position mit der an die kammförmigen Elektroden 1b und 1c angelegten Spannung steigert. Da die Kennwerte und die Menge der immunaktiven Substanz Größe und Betrag der zu erzeugenden Aggregationspartikelgruppe differenzieren, ist es möglich, das Vorhandensein einer gewünschten immunaktiven Substanz qualitativ oder quantitativ dadurch nachzuweisen, daß man das räumliche Spektrum beobachtet, insbesondere den Pegel der Frequenzkomponenten fo, fo/2 und 2 fo. Beim tatsächlichen Nachweis werden die Vergleiche mit vorab aufbereiteten Referenzdaten ausgeführt, aber wenn eine Berechnung in höchst einfacher Weise durchgeführt wird, kann der Datenvergleich unter Verwendung des variierten Abschnitts des räumlichen Spektrums gemäß Fig. 3E als Referenzwert ausgeführt werden. Wenn das in Fig. 3E dargestellte räumliche Spektrum subtrahiert wird von den räumlichen Spektren, die in den in den Fig. 3B bis 3D dargestellten Zuständen gemessen werden, kann der Beitrag der Aggregationspartikelgruppe G zu dem räumlichen Spektrum erhalten werden.
Da die kammförmigen Elektroden 1b und 1c des Probenplättchens 1 im wesentlichen eine periodische Struktur in der Richtung A - B in Fig. 2 aufweisen, ist das räumliche Spektrum auf dem fotoelektrischen Element 5 im wesentlichen achsensymmetrisch in A - B Richtung bezüglich der optischen Achse. Deshalb reicht es aus, wenn das fotoelektrische Element 5 eine eindimensionale Spektralverteilung im wesentlichen auf einer Seite, welche die optische Achse enthält, nachweisen kann, und durch Verringern der Elementezahl ist es möglich, bei höheren Geschwindigkeiten zu lesen. Wenn außerdem die Elementezahl gering ist, läßt sich die Belichtungszahl strecken. Dadurch läßt sich das S/N -Verhältnis verbessern. Außerdem kann die Auflösung dadurch verbessert werden, daß man die Größe pro Element, d.h. die räumliche Abtastfrequenz der Spektralverteilung, kleiner macht, um dadurch eine Verringerung der Fertigungskosten zu erreichen.
Bei der vorliegenden Ausführungsform haben die kammförmigen Elektroden 1b und 1c das opake Chrommuster, jedoch können auch andere Metalle, beispielsweise Gold oder Aluminium, stattdessen verwendet werden. Diese werden dann zu einem optisch stark kontrastierenden Amplituden-Gitter. Ferner ist es möglich, die kammförmigen Elektroden 1b und 1c mit Hilfe eines transparenten Materials wie ITO zu bilden. In diesem Fall kann die durch den Beitrag der kammförmigen Elektroden 1b und 1c in dem räumlichen Spektrum gebildete Komponente entfernt werden. Mit anderen Worten: die Zustände des räumlichen Spektrums gemäß Fig. 3B, 3C und 3D werden so, wie es in den Fig. 4A, 4B bzw. 4C gezeigt ist. Demzufolge kann man ausschließlich die Frequenzkomponente der Aggregationspartikelgruppe G nachweisen und damit die Möglichkeit schaffen, das S/N-Verhältnis ebenso wie die Detektiergenauigkeit zu verbessern.
Da der Brechungsindex des Glassubstrats 1a des Probenplättchens 1 in der Praxis annähernd 1,5 beträgt, während der Brechungsindex von ITO etwa 1,9 beträgt, wird das Probenplättchen 1 zu einem Phasen-Gitter mit einer Phasendifferenz, die proportional ist zu dem Produkt aus der Differenz zwischen beiden Brechungsindizes und der Dicke der kammförmigen Elektroden 1b und 1c, wenn in das Probenplättchen 1 keine Reaktionslösung injiziert wird. Wenn die Reaktionslösung injiziert ist, wird außerdem das Probenplättchen zu einem Phasengitter mit einer Phasendifferenz, die proportional ist zu dem Produkt der Differenz zwischen den Brechungsindizes, der Reaktionslösung und der Dicke der kammförmigen Elektroden 1b und 1c, wenn es eine Differenz zwischen den Brechungsindizes der Reaktionslösung und ITO gibt. Wenn der NA einer Fourier-Transformationslinse groß ist, ist die Intensität des Spektrums des Phasengitters klein, und es gibt kein Problem, obschon sie von dem Modulationsgrad der Phase abhängt. Allerdings ist es wünschenswert, ein Reaktionslösungsmedium auszuwählen, welches die Brechungsindizes der transparenten kammförmigen Elektroden 1b und 1d anpassend berücksichtigt, um ausreichende Effekte bei dieser Ausführungsform zu erhalten.
Im folgenden wird das Steuerverfahren des gesamten Systems beschrieben.
Wenn gemäß Fig. 1 durch Betätigen der Tastatur 14 in die Steuerung 6 das Meßbeginnsignal eingegeben wird, werden entweder von der Tastatur 14, dem Plattenspeicher 16, dem ROM 17 oder dem RAM 18 Daten in die Steuerung 6 eingegeben, wobei diese Daten eine Probe beinhalten, die Gegenstand des Nachweises ist, weiterhin den Korndurchmesser der Trägerpartikel als Information über die verwendeten Trägerpartikel beinhalten, außerdem die optischen Kennwerte wie z.B. den Ladezustand, den Brechungsfaktor und das Absorptionsvermögen, eine Tischträgerdichte, eine optimale Wechselstromfrequenz, eine Spannungsamplitude, Anlegezeit und dergleichen, und die Daten weiterhin den Aufbau zwischen den Elektroden 1b und 1c, das Substratmaterial, den Widerstand, die Kapazität und die Resonanzfrequenz als Information über das Probenplättchen 1 sowie weitere Information beinhalten. Anschließend wird die optische Meßbedingung anhand der diese Informationsteile enthaltenden Daten bestimmt. Auf der Grundlage der Frequenz der Wechselstromspannung im Rahmen dieser Meßbedingung sowie der Amplitude zur Zeit des Anlegens der Spannung steuert die Steuerung 6 den Oszillator 6 und den Verstärker 9 in der Weise, daß die Wechselspannung zwischen die kammförmigen Elektroden 1b und 1c gelegt wird, während der Lasertreiber 7 so gesteuert wird, daß eine optimale Menge Laserlicht geliefert wird; der CCD-Treiber 10 wird so gesteuert, daß die Belichtungszeit des fotoelektrischen Elements 5 eingestellt wird. Die Verteilung des räumlichen Spektrums des auf das fotoelektrische Element projizierten Gitterbildes wird von dem fotoelektrischen Element 5 unter Steuerung durch den CCD-Treiber 10 umgesetzt in zeitlich serielle elektrische Signale, und im Anschluß an die von der Wellenformbehandlungsschaltung 11 vorgenommene Korrektur werden diese Signale über den A/D- Wandler 12 in die Steuerung 6 eingegeben, um die qualitative und quantitative Auswertung vorzunehmen. Deren Ergebnis wird über die Anzeige 13, den Drucker 15, den Plattenspeicher 16, das RAM 18 und dergleichen ausgegeben. An dieser Stelle kann es möglich sein, die Daten mit Hilfe einer Kommunikationseinrichtung von außen zu empfangen oder sie nach außen hin zu senden.
In der Wellenformbehandlungsschaltung 11 wird nach Bedarf eine Abtast-Haltung, eine Filterung, eine Empfindlichkeitskorrektur des fotoempfindlichen Elements 5 und für das Ausgangssignal des fotoelektrischen Elements 5 eine Dunkelstromkorrektur, eine Abschaltungskorrektur des optischen Systems ausgeführt. Es ist bevorzugt, dafür zu sorgen, daß die Messung wiederholt werden kann, indem man die Menge des Laserlichts seitens der Halbleiterlaser-Lichtquelle und die Belichtungszeit des fotoelektrischen Elements 5 so variiert, wie es gemäß den von dem A/D-Wandler 12 kommenden und von der Steuerung 6 untersuchten Daten erforderlich ist. Außerdem kann es möglich sein, einen weiteren D/A-Umsetzer zwischen die Steuerung 6 und den Verstärker 9 einzufügen.
Hierbei kann man als Meßverfahren die Möglichkeit nutzen, zeitliche Änderungen und Ansprechverhalten auf Pseudo-Einschwingvorhänge dadurch zu messen, daß man die Messung jedesmal dann wiederholt, wenn die Zeitintervalle der Schwingung und die Aggregation fein unterteilt werden, zusätzlich zu der Messung im Anschluß an die auf das Probenplättchen 1 für eine vorbestimmte Zeitdauer unter bestimmten Bedingungen aufgebrachte Vibration. Dies wird weiter unten noch beschrieben.
Fig. 5 zeigt den grundlegenden Aufbau einer zweiten Ausführungsform, bei der es sich um eine modifizierte Variante der oben erläuterten Ausführungsform handelt. In Fig. 5 bezeichnen die gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 1 die gleichen Elemente.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird anstelle des bei der ersten Ausführungsform verwendeten fotoelektrischen Elements 5 ein Teil-Sensor 19 verwendet, bei dem Sensorzellen 19a bis 19d, welche vier Teil-PIN-Fotodioden in gepackter Anordnung enthalten, in der hinteren Brennebene der Linse 4 angeordnet. Das Ausgangssignal des Teil-Sensors 19 wird auf einen Verstärker 20 gegeben, und das Ausgangssignal des Verstärkers 20 gelangt auf einen A/D-Wandler 21. Das Ausgangssignal des A/D-Wandlers 21 wird auf die Steuerung 6 gegeben, das Ausgangssignal der Steuerung 6 wird über einen D/A-Wandler 22 an einen Verstärker 9 gegeben. Der übrige Aufbau ist der gleiche wie bei der ersten Ausführungsform, die entsprechenden Teile sind in Fig. 5 nicht dargestellt.
Der Sensor 19a befindet sich an einer solchen Stelle, daß er den Beugungslichtstrahl Nullter Ordnung erfaßt, während jede der Sensorzellen 19b, 19c und 19d an einer Stelle angeordnet ist, an der sie jeweils die vorerwähnten Frequenzkomponenten 2 fo, fo und fo/2 detektiert, so daß die Möglichkeit besteht, lediglich die Leuchtstärke jeder Frequenzkomponente wirksam zu detektieren. Der zu der von dem Teil-Sensor 19 ausgegebenen Leuchtstärke proportionale Strom wird zur Datenverarbeitung über den A/D-Wandler 21 in die Steuerung 6 eingegeben, nachdem er einer Strom-/Spannungs-Umwandlung, einer Spannungsamplitudenbearbeitung, einer Filterung und dergleichen seitens des Verstärkers 20 unterzogen wurde.
Während es bei der vorliegenden Ausführungsform nicht möglich ist, einer Situation zu entsprechen, in der die Elektrodenabstände des Probenplättchens 1 unterschiedlich sind oder die räumliche Spektralverteilung aufgrund extrem unterschiedlicher Aggregationsbedingungen variiert, läßt sich in wirksamer Weise auch allein das Signal mit der erforderlichen Frequenzkomponente detektieren. Das Ergebnis besteht darin, daß der Aufbau der Vorrichtung und die Signalverarbeitung einfacher werden. Es kann möglich sein, die Selektivität der Detektier- Spektralbereiche dadurch zu verbessern, daß man eine Blende, ein Nadelloch oder dergleichen vor dem Teil-Sensor 19 anordnet, so, wie es für diesen Zweck erforderlich ist.
Bei den oben erläuterten Ausführungsformen werden die Aggregationsbedingungen dadurch konstant gehalten, daß man an die kammähnlichen Elektroden eine einen spezifischen Zustand aufweisende Wechselspannung während einer vorbestimmten Zeitspanne anlegt. Dann erfolgt das optische Detektieren in einem statischen Zustand, in welchem eine Gleichspannung angelegt wird, um die Aggregatzustände in einem Gleichgewichtszustand oder einem Halb-Gleichgewichtszustand zu detektieren. Bei einer dritten Ausführungsform der Erfindung hingegen, die weiter unten erläutert wird, erfolgt eine Probenmessung dynamisch, indem die Änderungen des Übergangs-Ansprechverhaltens bei der Aggregation erfaßt werden. Hierzu wird als Bezugnahme auf die oben verwendeten Zeichnungen verwiesen.
In Fig. 1 wird die sinusförmige Ausgangswelle eines Wechseloszillators 8 über den Verstärker 9 bei einem Befehl seitens der Steuerung 6 an das Probenplättchen 1 gelegt, um den Aggregationsvorgang zu beschleunigen. In einem Zustand, in welchem die Aggregationsreaktion sich noch in ihrem Anfangsstadium unmittelbar nach Anlegen der Spannung befindet, zeigt das Probenplättchen 1 den in Fig. 3A dargestellten Zustand, bei dem das von dem fotoelektrischen Element 5 erhaltene räumliche Spektrum das in Fig. 3E dargestellte Aussehen hat. Wenn die Aggregationsreaktion fortzuschreiten beginnt, treten die in den Fig. 3B, 3C, 3D und 3B dargestellten Zustände für jede der Phasen π/2; π, 3π/2 und π der Sinuswelle in Erscheinung. Da nun die optische Dichte der Aggregationsgruppe G mit Verstreichen der Zeit zunimmt, nimmt der Spitzenwert des räumlichen Spektrums (Fig. 3F, 3G und 3H und 3F) progressiv bei jeder Phase der Sinuswelle zu.
Um diese Änderung zu erfassen, wird das Ausgangssignal von dem fotoelektrischen Element 5 synchron mit jeder Phase der Sinuswelle des Wechseloszillators 8 bei der vorliegenden Ausführungsform abgezogen, oder es wird das Ausgangssignal des fotoelektrischen Elements 5, welches mit der Phase der Sinuswelle synchronisiert ist, abgezogen, indem die Lichtquelle 2 veranlaßt wird, impulsförmiges Licht mit einer geeigneten Phase zu emittieren, so daß das Licht synchron mit der Sinuswelle abgenommen werden kann. Durch Auswerten der so erhaltenen Daten ist es möglich, das Übergangs-Ansprechverhalten der Aggregationsreaktion zu messen.
Genauer gesagt: es wird möglich, die Steigung oder den Wendepunkt der Übergangs-Ansprechkurve dadurch zu erhalten, daß man zeitlich beispielsweise die Spitze der Frequenz 2f&sub0; in Fig. 3G verfolgt, welche den Zustand des räumlichen Spektrums zeigt, der der Phase 3π/2 der Sinuswelle entspricht, oder daß man die Verbesserung der Meßgenauigkeit der Probe auf der Grundlage der verkürzten Zeitspanne für die Probenmessung und Übergangs-Ansprechverhalten-Kennwerte realisiert, indem man eine einfache Schwellenwertauswertung durchführt. Außerdem kann es möglich sein, die Zuverlässigkeit der Probenmessung dadurch zu steigern, daß man eine Gesamtbeurteilung in der Weise vornimmt, daß man das Übergangs-Ansprechverhalten des Spektrums in einer Mehrzahl von Phasenzuständen der Sinuswelle auswertet. Wenn hierbei lediglich das Übergangs- Ansprechverhalten eines bestimmten Spektrums ausgewertet werden soll, ist es immer noch möglich, eine solche Auswertung mit dem in Fig. 5 gezeigten Aufbau der Probenmeßvorrichtung durchzuführen.
Die bisher erfolgte Beschreibung betrifft den Fall, daß die Frequenz, die Amplitude und dergleichen der sinusförmigen Wechseispannung, die an die kammförmigen Elektroden angelegt wird, konstant sind, allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Bedingungen beschränkt. In anderen Worten: Es ist in hohem Maße wünschenswert, eine derartige Anordnung zu treffen, daß die Aggregationsbedingungen im Echtzeitbetrieb gesteuert werden, während man die Frequenzen, Phasen und Amplituden der sinusförmigen Spannung ändert oder moduliert, die nach Maßgabe des Ansprechverhaltens angelegt wird. Wenn sich z.B. zeigt, daß die Aggregationsreaktion in ihrer Beschleunigung langsamer ist, läßt sich die Aggregationsreaktion dadurch beschleunigen, daß man die Amplitude und/oder die Frequenz der angelegten Spannung erhöht. Wenn sich hingegen zeigt, daß die Messung der Ansprechensverhaltens-Kennlinie deshalb schwierig ist, weil die Aggregationsreaktion zu schnell abläuft, läßt sich diese Situation dadurch korrigieren, daß man die Amplitude und/oder die Frequenz der angelegten Spannung verringert.
Wenn außerdem mehrere Proben separiert werden sollen, ist es wirksam, die Differenz der Übergangs-Ansprechkennwerte auszuwerten. Wenn in diesem Fall die Zeit-Frequenz-Antworten in bezug auf die an die Aggregationspartikelgruppe G angelegte Spannung bei den Proben unterschiedlich sind, ist es möglich, die Meßgenauigkeit der Proben noch mehr zu verbessern, indem man das Ausgangssignal des Wechseloszillators 8 als gewobbelte Wellenformen gestaltet, oder man die mehreren Frequenz in Form überlappender Wechselstromwellenformen realisiert.
Natürlich gibt es Ansprechverzögerungen bezüglich der Wellenformen der angelegten Spannung, die sich aus dem Transfer der Testpartikelgruppe G zwischen den kammförmigen Elektroden ergeben. Allerdings ist es möglich, diese dadurch auszuwerten, daß man den Zustand eines gewünschten räumlichen Spektrums dadurch erzeugt, daß man die Meß-Synchroniserung korrigiert. Fügt man hingegen solche Verzögerungen dem Auswertungsparameter als weitere Übergangs- Ansprechgröße hinzu, so ist es sogar möglich, die Probenmessung noch genauer durchzuführen.
Bei der oben dargestellten Probenmeßvorrichtung läßt sich die auf dem Substrat befindliche Reaktionslösung durch die Wechselspannung in Vibration versetzen, die an die kammähnlichen Elektroden gelegt wird, um die Aggregation zu beschleunigen. Durch Regulieren der angelegten Spannung und Anlegezeit in konstanter, vorbestimmter Weise lassen sich die Aggregationsbedingungen unveränderlich halten. Nachdem die Beschleunigung der Aggregation abgeschlossen ist, oder während die Aggregation noch beschleunigt wird, wird das durch die kammförmigen Elektroden, auf denen sich die Reaktionslösung befindet, gebildete Spektrum ermittelt, um dadurch aufgrund seiner Änderungen das Vorhandensein der immunaktiven Substanz in der Probe qualitativ oder quantitativ nachzuweisen. Man kann also mit Hilfe eines einfachen Aufbaus die Aggregation praktisch beliebig durch elektrische Steuerung beschleunigen, ohne daß irgendeine mechanische Vibration benötigt wird, und ebenso läßt sich die Prüfzeit verkürzen. Durch Steuern der an die kammförmigen Elektroden angelegten Wechselspannung ist es auch möglich, das räumliche Spektrum optisch in einem Zustand zu erhalten, in welchem die Aggregationspartikelgruppe G irgendeine Lage einnimmt. Dies hat den Vorteil, daß der Detektiervorgang exakter durchführbar ist.
Im folgenden werden weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Fig. 6 ist eine Ansicht des Aufbaus einer vierten Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 7 ist eine Vertikalschnittansicht in Richtung A und B in Fig. 6. Auf einem flachen, aus transparentem Material gefertigten Substrat 31 ist in enger Nachbarschaft ein keilförmiges Abdeckelement 32 aus transparentem Material mit einem Hohlraum 32a in der mittleren Innenseite des Substrat angeordnet, wobei von dem Hohlraum 32a ein räumlicher Abschnitt gebildet wird. Wie in Fig. 7 gezeigt ist, ist dieser Hohlraum 32a derart ausgebildet, daß die Höhe des lichten Abstands zwischen dem oberen Abschnitt des Hohlraums 32a und dem Substrat sich allmählich und gleichmäßig in der Richtung A nach b verringert, wobei der vertikale Abstand DB am Ende der Öffnung des Hohlraums geringer ist als der Durchmesser der verwendeten Trägerpartikel. Der vertikale Abstand DA am Ende der Öffnung in A-Richtung ist um ein Mehrfaches bis annähernd mehrere hundert Mal breiter als der vertikale Abstand DB, damit die aggregierten Partikel hindurch gelangen können. Auf der Oberfläche des Hohlraums 32a und der dieser gegenüberliegenden Oberseite des Substrats 31 sind kammförmige Elektroden 33a bzw. 33b ausgebildet. Diese kammförmigen Elektroden 33a und 33b sind einander versetzt gegenüberliegend angeordnet, wie es in Fig. 7 gezeigt ist. Nun werden fluoreszierende Trägerpartikel oder angefärbte Trägerpartikel vorbereitet. Dann wird eine immunaktive Substanz für diese Partikel sensibilisiert. Die so vorbereiteten Partikel werden mit einem Reagens und in einem flüssigen Medium mit Wasser als Hauptkomponente dispergierten Proben gemischt, um ein Gemisch zu erzeugen. Wenn dieses Gemisch L in den lichten Raum zwischen dem Substrat 31 und dem Hohlraum 32a von der Seite A her injiziert wird, wandert das Gemisch L aufgrund von Oberflächenspannung in Richtung B, wo der vertikale Abstand zunehmend geringer wird, wie in Fig. 8 dargestellt ist. Aufgrund dieser Oberflächenspannung erhalten die Trägerpartikel F eine in Richtung Ff gerichtete Kraft. Außerdem besitzt die immunaktive Substanz im allgemeinen eine polare Gruppe, wenn sie sich in einem flüssigen Medium befindet. Folglich wird diese Substanz von einer Kraft eines elektrischen Feldes beeinflußt. In ähnlicher Weise werden die Trägerpartikel F, auf die die immunaktive Substanz sensibilisiert ist, durch die Kraft eines elektrischen Feldes beeinflußt. Allerdings ist es auch möglich, den Trägerpartikeln F vorab eine Polarität zu verleihen.
Wenn an die kammförmigen Elektroden 33a und 33b eine sich zeitlich ändernde Spannung gelegt wird, wirkt auf die Trägerpartikel F ansprechend auf die Polarität der Elektrode gemäß Fig. 8 eine sich zeitlich ändernde Kraft Fd oder Fu ein. Als Ergebnis werden die Trägerpartikel F in Richtung B entlang einer mit einem Pfeil T bezeichneten Bahn eingeleitet. In ähnlicher Weise wird die immunaktive Substanz in den Proben, die eine Kraft seitens des sich zeitlich ändernden elektrischen Feldes enthält, entsprechend einer durch den Pfeil T bezeichneten Bahn in Richtung B bewegt. Allerdings hat diese Bahn eine andere Amplitude und eine andere Frequenz, weil nun die Polarität oder ihre Stärke, Masse und Durchmesser anders sind.
Daher wird das Umrühren der Trägerpartikel F und der Probe beschleunigt, und gleichzeitig wird die Aggregation beschleunigt, wobei die Trägerpartikel F und das aggregierte Material in Richtung B eintauchen, wo der lichte Abstand geringer wird. Wie in Fig. 9 gezeigt ist, können Partikel F mit kleinem Durchmesser weiter in Richtung B gelangen, während das zusammengeklumpte Material G auf seinem Weg abgefangen wird und nicht weitertransportiert werden kann, was von seiner Größe abhängt.
Der Durchmesser des aggregierten Materials G, der sich durch die Anzahl von Trägerpartikelchen F des aggregierten Materials G bestimmt, und die Anzahl der aggregierten Gruppen G, die in einem gewissen Bereich angesammelt sind, besitzen eine Korrelation mit der Eigenschaft und der Anzahl der immunaktiven Substanz, die in der Reaktionsflüssigkeit L enthalten ist, d.h. dem Aggregationszustand des aggregierten Materials G, welcher durch die Reaktion erzeugt wurde.
Mit der in den lichten Raum eingeströmten Reaktionslösung L wird es also für einen Prüfer möglich, mit dem bloßen Auge in einfacher Weise die Menge von Trägerpartikeln F zu ermitteln und zu erkennen, die von dem lichten Abstand R abgefangen wurden, der gleich dem Durchmesser R der einzelnen Trägerpartikel F ist, ebenso, wie die Position, an der das aggregierte Material G festgehalten wird. Damit läßt sich der qualitative und der quantitative Nachweis der immunaktiven Substanz vornehmen. In der Praxis wird die Kalibrierkurve vorab mit Hilfe der Reaktionslösung L erstellt, wobei die Reaktionslösung mit einer Meß-Probe zur Reaktion gelangt ist, welche die bekannte immunaktive Substanz enthält. Der eigentliche Meßvorgang wird so durchgeführt, daß ein Vergleich mit einer solchen Kalibrierkurve vorgenommen wird.
Es ist möglich, für das Substrat 31 oder das Deckelement 32 ein opakes Material zu verwenden. Außerdem kann es möglich sein, eine Einrichtung vorzusehen für ein einfaches Ablesen, indem eines dieser Teile aus schwarzem oder grauem Material geringer Helligkeit gefertigt wird, wenn die Trägerpartikel F beispielsweise zu einer Gruppe weißer Partikel gehören. Um außerdem der Reaktionslösung L zu ermöglichen, leicht in den lichten Raum einzudringen, kann man ein Material mit gewünschter Affinität bezüglich des flüssigen Mediums für die Reaktionslösung L als Beschichtung auf die Innenfläche des lichten Raums auftragen. Hierdurch ist ein günstigeres Meßergebnis erzielbar. Als Beschichtungsmaterial wird vorzugsweise eine hydrophile Substanz, ein grenzflächenaktives Agens, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid oder ein anderes wasserlösliches Polymer verwendet, wenn das flüssige Medium Wasser ist.
Fig. 10 ist eine Ansicht des Aufbaus einer fünften Ausführungsform der Erfindung.
Auf einem flachen Substrat 31 aus transparentem Material ist ein flaches Deckelelement 32 aus transparentem Material mit einem Hohlraum 32b auf seiner Innenseite in enger Nachbarschaft mit dem Substrat 31 angeordnet, um einen lichten Raum zu bilden. Dieser Hohlraum 32b ist derart angeordnet, daß die Höhe zwischen dem Substrat 31 und dem Hohlraum 32b in vier Stufen in der Richtung von A nach B allmählich kleiner wird. Der vertikale Abstand DB in der Öffnung am Endabschnitt in Richtung B ist kleiner als der Durchmesser der Trägerpartikel F, während der vertikale Abstand DA in der Öffnung am Endbereich in Richtung A um einige bis etwa einige Hundert mal so groß ist wie der vertikale Abstand DB, damit das aggregierte Material hindurchgelangen kann. Flachelektroden 33c und 33d sind auf den Seitenabschnitten des Hohlraums 32b so ausgebildet, daß sie einander zugewandt sind.
Auch bei dieser Ausführungsform wird das Gemisch L von der Stelle A her eingeführt, und wenn eine sich zeitlich ändernde Spannung an die Elektroden 33c und 33d gelegt wird, empfangen die Trägerpartikel F und die immunaktive Substanz in der Probe ebenso wie bei der vierten Ausführungsform eine durch die Oberflächenspannung erzeugte Kraft Ff und Kräfte Fr und Fl aufgrund der sich zeitlich ändernden Polaritäten der Elektroden 33c und 33d. Als Ergebnis werden diese Partikel und die Substanz veranlaßt, in Richtung B vorzurücken, entsprechend der durch einen Pfeil T bezeichneten Bahn, so daß das Verrühren und die Aggregation beschleunigt werden. Dann wird dann aggregierte Material G auf seinem Weg abgefangen, und gleichzeitig wird die Verteilung entsprechend dem jeweiligen Aggregationszustand in der Richtung der vorerwähnten Elektroden abhängig von der Spannung gebildet, die an die Elektroden 33c und 33d angelegt wird, so wie im Fall der ersten und der zweiten Ausführungsform. In ähnlicher Weise lassen sich der qualitative und darüber hinaus der quantitative Nachweis der immunaktiven Substanz vornehmen.
Fig. 11 zeigt den Aufbau einer sechsten Ausführungsform gemäß der Erfindung. Auf einem aus transparentem Material bestehenden, flachen Substrat 31 ist ein flaches Deckelelement 32 aus transparentem Material mit einem Hohlraum 33c in der mittleren Innenseite des Substrats 31 in enger Nachbarschaft zu diesem angeordnet, um wie bei der dritten Ausführungsform einen lichten Raum zu bilden. Der vertikale Abstand des lichten Raums zwischen dem Hohlraum 32c und dem Substrat 31 ist in der Richtung von A nach B allmählich verringert, und von der Stelle des vertikalen Abstands DB, der kleiner ist als der Durchmesser der zu verwendenden Trägerpartikel F, ist der lichte Abstand konstant. Dann ist das Volumen des Freiraums SB mit dem vertikalen Abstand DB im wesentlichen genauso groß oder größer als das Volumen des Freiraums SA, dessen vertikaler Abstand größer ist als der vertikale Abstand DB. Wie bei der vierten Ausführungsform ist der vertikale Abstand DA der Öffnung am Endabschnitt in Richtung A einige bis einige Hundert mal größer als der vertikale Abstand DB, damit das aggregierte Material G hindurchgelangen kann. Auf der oberen Wand des Hohlraums 32c und der gegenüberliegenden Oberseite des Substrats sind die flachen Elektroden 33e und 33f angeordnet, an die eine sich zeitlich ändernde Spannung angelegt wird.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ebenfalls bei Einleiten des Gemisches L in den Freiraum zwischen dem Substrat 31 und dem Deckelelement 32 von der Stelle A her das Gemisch S durch die Oberflächenspannung veranlaßt, in Richtung B einzutauchen, wo der vertikale Abstand schmaler wird, während es eine Kraft seitens des sich zeitlich ändernden elektrischen Feldes von den Elektroden 33a und 33b erhält. Folglich werden wie bei der vierten Ausführungsform das Umrühren und die Aggregation beschleunigt. Dann werden die Trägerpartikel F und das aggregierte Material G an den Stellen abgefangen, die ihrem jeweiligen Durchmesser entsprechen. Folglich kann nur das Gemisch aus dem flüssigen Medium und der Probe zu dem Freiraum SB mit dem vertikalen Abstand DB gelangen. Da das Volumen dieses Freiraums SB groß ist, strömt der Hauptanteil des Gemisches, der nicht für den Nachweis benötigt wird, in diesen Freiraum, so daß es möglich wird, lediglich die abgefangenen Trägerpartikel F und das aggregierte Material G in dem Freiraum SA mit größerem vertikalen Abstand auf einfache Weise nachzuweisen und so die gewünschten Meßergebnisse zu erhalten.
In dieser Hinsicht ist die Formgebung des vertikalen Abstands DB so lange beliebig, wie sie die Volumenbedingung erfüllt, und man kann in dem Freiraum SB auch ein flüssigkeitsabsorbierendes Element anordnen. Darüber hinaus kann es möglich sein, den vertikalen Abstand DB etwas größer zu machen als den Durchmesser der Trägerpartikel F, und zwar innerhalb eines Grenzbereiches von annähernd dem Zweifachen. In diesem Fall wird nicht zusammengeklumptes Material, d.h. die Trägerpartikel F, nicht abgefangen und in dem Freiraum SB absorbiert. Dann wird es deutlicher und einfacher, die aggregierten von den nichtaggregierten Teilchen zu unterscheiden, so daß es möglich wird, bessere Meßergebnisse zu erzielen.
Fig. 12 zeigt den Aufbau einer siebten Ausführungsform der Erfindung, die den Zweck hat, daß die Zustände der Reaktionslösung automatisch abgelesen werden können. Fig. 13 ist eine Querschnittsansicht des optischen Systems. Das hier verwendete Probenplättchen 50 ist das gleiche wie bei der in Fig. 6 gezeigten vierten Ausführungsform.
Um die fluoreszierenden freien Partikel F und andere, die in den Freiraum auf den Probenplättchen 50 eingeleitet werden, nachzuweisen, ist eine Lichtquelle 51 oberhalb des Probenplättchens 50 vorgesehen, damit die fluoreszierenden Trägerpartikel über das Bandpaßfilter angeregt werden, und außerdem ist ein bildgebendes optisches System 52 mit einer Bilderzeugungslinse, einer Brechkraftfaktor-Linse und dergleichen unterhalb des Probenplättchens 50 angeordnet. Ein optisches Lichtempfangssystem 53 ist an einer Stelle angeordnet, wo das Bild erzeugt wird. In dem optischen Lichtempfangssystem 53 befindet sich in dem inneren Abschnitt eines Rahmens 53a ein CCD-Feld 53b mit fotoempfindlichen Elementen einer Größe von 14 µm x 14 µm, die beispielsweise ein- oder zweidimensional angeordnet sind. Dieses CCD-Feld 53b wird von einer am Rahmen 53a gelagerten Glasschutzplatte 53c geschützt. Das Ausgangssignal jedes fotoempfindlichen Elementes des CCD-Feldes 53b wird über ein Kabel 54 auf eine Signalbehandlungseinheit 55 gegeben. Das Ausgangssignal der Signalbehandlungseinheit 55 wird auf einen Monitor 56 gegeben.
Der innere Aufbau der Signalbehandlungseinheit 55 ist so, wie er in Fig. 14 dargestellt ist, und das Ausgangssignal des CCD-Feldes 53b wird auf die CCD- Treiberschaltung 55a und eine Arithmetikschaltung 55b gegeben. Das Ausgangssignal der CCD-Treiberschaltung 55a gelangt auf die Arithmetikschaltung 55. Das Ausgangssignal der Arithmetikschaltung 55b wird auf eine Anzeigeschaltung 55c gegeben, und deren Ausgangssignal wird auf den Monitor 56 geführt.
Eine immunaktive Substanz, wie z.B. ein monoklonaler Antikörper, wird auf die fluoreszierenden Trägerpartikel F sensibilisiert, die Fluoreszenz abstrahlen. Wenn derartige Trägerpartikel F mit einem Reagens und Probe gemischt werden, die in einem flüssigen Medium mit Wasser als Hauptkomponente dispergiert ist, findet eine Reaktion statt. Dann bildet die Vielzahl von Partikeln der immunaktiven Substanz und des Trägers F aggregiertes Material G. Nach einer ausreichenden Reaktion wird diese Reaktionslösung L in den Freiraum zwischen dem Substrat 41 und dem Hohlraum 42a von der Stelle A in Fig. 15A her eingeleitet. Wie im Fall der oben erläuterten vierten Ausführungsform, werden dann das Umrühren der Trägerpartikel F und der Probe beschleunigt. Gleichzeitig mit der Beschleunigung der Aggregation werden die Trägerpartikel F und deren aggregiertes Material in Richtung B in den Bereich geringeren Freiraums eingetaucht. Die Partikel F, die einen kleineren Durchmesser haben, können tief in Richtung B vordringen, das aggregierte Material G wird allerdings auf seinem Weg wegen seines Durchmessers abgefangen und kann sich nicht weiter bewegen.
An dieser Stelle wird das Fluoreszenzbild der Reaktionslösung L in dem Hohlraum 42a des Probenplättchens 10 von dem bildgebenden optischen System 42 auf das CCD-Feld 53b mit Hilfe des optischen Empfangssystems 53 fokussiert und von der CCD-Treiberschaltung 55a fotoelektrisch umgewandelt. Folglich wird die Ausgangsspannung für jedes fotoempfindliche Element in die Arithmetikschaltung 55b eingegeben.
Fig. 15B zeigt die Ausgangsspannungen für jedes der fotoempfindlichen Elemente entsprechend dem Bild des separierten Zustands gemäß Fig. 15A. Durch das von den freien Partikeln F und dem aggregierten Material G emittierte Fluoreszenzlicht werden die Ausgangsspannungen an den Stellen größer, an denen Partikel und Material gefangen ist. Deren Vorhandensein läßt sich also nachweisen.
In der Praxis erstellt man vorab eine Kalibrierkurve, indem man die Reaktionslösung L mit der gemessenen Probe reagieren läßt, welche die bekannte immunaktive Substanz enthält, und es erfolgt dann für die eigentliche Messung ein Vergleich. Wenn in der Arithmetikschaltung 55b eine Berechnung durchgeführt wird, wird die Verteilung der Maximalwerte der Ausgangsspannungen h1, h2, h3 und h4 und die Amplituden d1, d2, d3 und d4 mit den entsprechenden Werten der Kalibrierkurve verglichen, es ist aber auch möglich, einfach die Anzahl der fotoempfindlichen Elemente auszuzählen, die höhere Ausgangsspannungswerte liefern als ein für einen Vergleich verwendeter Schwellenwert Vs. Das Verarbeitungsverfahren ist nicht auf das oben erläuterte Verfahren beschränkt Die Ergebnisse der arithmetischen Verarbeitung werden über die Anzeigeschaltung 55c auf dem Monitor 56 dargestellt.
Die oben beschriebene Probenmeßvorrichtung ist mit einem Freiraum ausgestattet, der allmählich oder stufenweise von einem maximalen Abstand ausgehend, der ausreichend größer ist als der Durchmesser der Trägerpartikel, schmaler wird bis zu einem minimalen Abstand, der kleiner ist als der Durchmesser der Trägerpartikel. Die Vorrichtung hat einen einfachen Aufbau, da Elektroden auf den Ebenen des Freiraums einander gegenüberliegend ausgebildet sind. Wenn an die Elektroden eine sich zeitlich ändernde Spannung angelegt wird und von der Öffnung mit maximalem Abstand her ein Gemisch eingeleitet wird, werden die Trägerpartikel und das aggregierte Material gerührt und aggregiert durch das so erzeugte elektrische Feld. Aufgrund der Differenzen in dem Abstand des Freiraums werden außerdem die Trägerpartikel, das aggregierte Material, das flüssige Medium und dgl., die unterschiedliche Größe besitzen, getrennt. Damit kann von der transparenten Oberfläche her das Ausmaß der Aggregation der Reaktionslösung ermittelt und klar erkannt werden und durch Vergleichen mit einer vorab erstellten Kalibrierkurve oder dergleichen ist es möglich, den qualitativen oder den quantitativen Nachweis der immunaktiven Substanz in der Probe mit hoher Genauigkeit und einer gewünschten Effizienz durchzuführen.

Claims

1.Vorrichtung zum Veranlassen von Trägerpartikeln, die eine spezifisch mit einer spezifischen Substanz reagierende Substanz tragen, mit einer Testprobe zu reagieren, um dadurch die spezifische Substanz anhand von Aggregationszuständen der Trägerpartikel einer Reaktionslösung zu messen, umfassend:

- kammförmige Elektroden in Berührung mit der Reaktionslösung;

- einer Einrichtung zum Anlegen einer sich ändernden Spannung an die Elektroden; und

- eine Detektiereinrichtung zum Nachweisen der Aggregationszustände der Trägerpartikel in der Reaktionslösung,

dadurch gekennzeichnet, daß

die Detektiereinrichtung enthält:

- eine Öffnung zum Einleiten der Reaktionslösung; und

- einen Freiraum, dessen Größe sich kontinuierlich oder stufenweise verringert, und in den die von der Öffnung her eingeleitete Reaktionslösung gelangt, wobei die Elektroden in dem Freiraum ausgebildet sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der Detektiereinrichtung eine Einrichtung zum optischen Nachweisen der in dem Freiraum gefangenen Trägerpartikel aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die veränderliche Spannung eine Wechseispannung ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die veränderliche Spannung eine impulsförmige Spannung ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Detektiereinrichtung aufweist:

eine Einrichtung zum optischen Nachweisen einer räumlichen Spektralverteilung der Elektroden; und

eine Einrichtung zum Ermitteln des Aggregationszustands der Trägerpartikel auf der Grundlage der Spektralverteilung.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Detektiereinrichtung eine Einrichtung zum Ermitteln von räumlichen Spektrum-Änderungen der Elektroden aufweist, welche den Schwankungen der an die Elektroden angelegten Spannung folgen.

7. Verfahren zum Messen einer Substanz in einer Testprobe unter Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte:

- Herstellen einer Reaktionslösung, indem Trägerpartikel, die eine spezifisch mit einer spezifizierten Substanz reagierende Substanz tragen, mit der Testprobe zum Reagieren gebracht werden;

- Beschleunigen der Reaktion durch Anlegen eines sich ändernden elektrischen Felds an die Reaktionslösung; und

- Detektieren von Aggregationszuständen der Trägerpartikel in der Reaktionslösung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Detektier-Schritt das optische Ermitteln eines statischen Zustands der Aggregation im Anschluß an die Reaktions-Beschleunigung umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Detektier-Schritt das optische Ermitteln eines dynamischen Zustands der Aggregation im Zuge der Reaktions-Beschleunigung umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, bei dem die spezifisch mit der spezifizierten Substanz reagierende Substanz einen Antikörper oder ein Antigen enthält.