DE19616540A9 - Verwendung von von Willebrand-Faktor und pharmazeutische Zubereitung - Google Patents
Verwendung von von Willebrand-Faktor und pharmazeutische ZubereitungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines von Willebrand Faktor (vWF) mit einer verlängerten biologischen Halbwertszeit zur Herstellung einer Präparation zur Stabilisierung von Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII:C) in einem Säugetier. Außerdem wird eine pharmazeutische Präparation zur Verfügung gestellt, enthaltend einen biologisch aktiven FVIII:C/vWF-Komplex mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, welcher Komplex einen vWF mit einer verlängerten biologischen Halbwertszeit enthält.
Description
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Präparation enthaltend einen biologisch aktiven FVHI:C/vWF-Komplex
sowie eine neue Verwendung eines von-Willebrand-Faktor-Präparates und ein diagnostisches Set zur Bestimmung eines
Defektes der Hämostase in einem Patienten.
Der vWF liegt in Humanplasma als heterogenes Homomultimere vor, mit einem Molekulargewicht von 450 kD bis
zu mehr als 10 000 kD. Der vWF dient als Trägerprotein für den Gerinnungsfaktor VIII und trägt zur Adhäsion von Blutplättchen
an das Endothel von verletzten Blutgefäßen bei.
Bei der Hämophilie (Bluterkrankheit) ist die Blutgerinnung durch Mangel an bestimmten plasmatischen Blutgerinnungsfaktoren
gestört. Bei der Hämophilie A beruht die Blutungsneigung auf einem Mangel an Faktor VIII bzw. einem
Mangel an vWF. Die Behandlung der Hämophilie A erfolgt durch Ersatz des fehlenden Gerinnungsfaktors durch
Faktorenkonzentrate aus Blutkonserven, z. B. durch intravenöse Infusion von Faktor VIII, eines vWF/Faktor-VJJJ-Komplexes
oder von vWF.
Es gibt mehrere Krankheitsbilder, die auf Unter- oder Überproduktion des von-Willebrand-Faktors zurückzuführen
sind. So führt z. B. eine Überproduktion von vWF zur vermehrten Neigung von Thrombosen, wohingegen eine
Unterversorgung mit vWF eine vermehrte Blutungsneigung oder verlängerte Blutungszeit zur Folge hat.
Das von-Willebrand-Syndrom kann sich in mehreren Erscheinungsformen
manifestieren. Alle Formen zeichnen sich durch eine verlängerte Blutungszeit aus, die durch ein
absolutes Fehlen eines funktionellen vWF begründet sein können. Der Mangel an vWF kann auch eine phänotypische
Hämophilie A hervorrufen, da der vWF ein wesentlicher Bestandteil des funktionellen Faktor VIII-Komplexes ist. In
diesen Fällen ist die Halbwertszeit des Faktor VIII derart verringert, daß er seine spezielle Funktionen in der Blutgerinnung
nicht wahrnehmen kann.
Patienten mit vw-Krankheit weisen einen Mangel an funktionell aktiven vWF auf, als Ursache für Blutungen. Zur
Therapie der vW-Krankheit werden vor allem therapeutisehe
Plasmakonzentrate vorgeschlagen, die den vWF enthalten. Der von Plasma stammende vWF (pdvWF) weist jedoch
eine veränderte Multimerenverteilung auf. Die hochmolekularen Multimeren werden während des Herstellungsprozesses abgebaut, weshalb eine verringerte hämostatische
Wirkung des Plasmakonzentrats vermutet wird. Für den Abbau der hochmolekularen vWF-Multimeren werden vor allem
lösliche bzw. an Blutplättchen oder Leukocyten gebundene Proteasen verantwortlich gemacht. (Mannucci et al.
Blood 83, 3018-3027 (1994).
Zur Vermeidung von Problemen, die mit der Herstellung von pdvWF in Zusammenhang stehen, wurde bereits die
Herstellung von rekombinantem vWF (rvWF) durch Fermentation von rekombinanten Zellen vorgeschlagen. Fischer
et al. (FEBS Letters 351, 345-348 (1994)) beschreiben die Expression des vWF Wildtyps in CHO-Zellen. Die
cDNA für vWF wurde in der EP-O 197 592 beschrieben. Der hergestellte rvWF wurde auf seine Molekularstruktur untersucht.
Eine gelelektrophoretische Untersuchung hat gezeigt, daß die Multimerenstruktur des rvWF mit der idealen Struktür
des pdvWF übereinstimmt, wobei die hochmolekularen Strukturen ebenfalls nachgewiesen werden konnten. Jedoch
wurde gefunden, daß der rvWF nicht in die Triplett-Struktur aufgetrennt wird, welche für den pdvWF charakteristisch
ist. Diese Triplett-Struktur enthält eine prominente Bande und zwei oder mehr Satellitenbanden, welche in einem
Komplex mit der prominenten Bande des pdvWF auftreten.
Die großtechnische Herstellung von rvWF wird von Schlokat et al. (Thrombosis and Haemostasis 73, Abstr. 993
(1995)) beschrieben. Der in CHO-Zellen hergestellte rvWF wurde chromatographisch gereinigt, wobei keine Reduktion
der spezifischen Ristocetin-Kofaktoraktivität erfolgte. Durch die Co-expression des Enzyms Furin wurde die Prozessierung
des Pro-Proteins zum reifen rvWF erreicht. Die erhaltene Ristocetin-Kofaktoraktivität war für alle untersuchten
Klone relativ hoch, L B. 70 Einheiten pro Einheit ν WF-Antigen.
Die Ristocetin-Kofaktoraktivität des vWF wird üblicherweise gemäß einer Vorschrift von Weiss et al. (Journal of
Clinical Investigation 52, 2708-2716 (1973)) bestimmt. Dabei wird die Aktivität des vWF als Cofaktor für die Ristocetin
induzierte Aggregation von Blutplättchen untersucht.
Diese Aktivität dient als Mass für die Wirksamkeit des vWF zur Behandlung der vw-Krankheit. Von Fricke et al.
(Thrombosis and Haemostasis 70, 351-356 (1993)) wurde in einem Plasmastandard der World Health Organisation
(WHO) für Faktor VIJJ und vWF ein sehr hohes Verhältnis von 0,92 Ristocetin-Kofaktoraktivität (RCoF) zu vWF-Antigen
(vWF:Ag) gefunden.
Die im Stand der Technik beschriebenen vWF-Präparate
enthalten den vWF in proteolytisch abgebauter Form. Die Stabilität dieser Präparate ist dadurch begrenzt. Auch die
Versuche zur Verhinderung der Proteolyse nach Abnahme einer Blutprobe in Gegenwart von entsprechenden Inhibitoren
führten nicht zu einem vWF mit intakter Struktur.
Alle νWF-Konzentrate, die durch Reinigung des Proteins
aus humanem Blutplasma erhalten werden oder in Kontakt mit biologischem Material aus Säugetieren getreten sind,
sind außerdem potentiell mit dem Risiko behaftet, krankheitserregende Moleküle, wie z. B. Viren, vom Plasmaspender
zu enthalten.
Ein weiteres Problem für die vWF Präparate des Stand der Technik liegt in der geringen Halbwertszeit des vWF
nach Verabreichung an einen Patienten. In diesem Zusammenhang mußte auch eine verringerte Halbwertszeit des
FVJJJ:C festgestellt werden. Die Halbwertszeit für exogenen FVJJI:C liegt generell unter der von endogenen FVJJJ:C
und ist im Fall von plasmatischen FVJJJ:C üblicherweise ca. 10 h, im Fall von rekombinantem FVJJI:C nicht mehr als ca.
12 h.
So liegt die Halbwertszeit für ein FVJJI:C/vWF Konzentrat von CENTRE REGIONAL DE TRANSFU-SION SANGUINE
DE LILLE (FRANCE) gemäß Produktbeschreibung 1992 bei 10 bis 14 h; nach Gabe dieses Präparates
konnte ein Anstieg des endogenen FVJJJ:C auf lediglich 1-3 Einheiten pro Milliliter in 24 h beobachtet werden. Für ein
anderes FVJJI:C/vWF enthaltendes Präparat (Haemate® HS Behring) wird die Halbwertszeit mit 7 Stunden bei Typ 3
vW-Krankheit, 12,3 h bei Typ 2A und 13,8 h bei Typ 1 angegeben Die Erfindung stellt sich zur Aufgabe, das Indikationsspektrum
für den vWF zu erweitern und eine verbesserte Pharmakokinetik von Faktor VJJJ in vivo zu erreichen.
Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß FVJJJ:C in vivo besonders gut und lang andauernd stabilisiert werben
kann, wenn von einem vWF mit der hohen Halbwertszeit von mehr als 20 h, vorzugsweise mindestens 30 h, eingesetzt
wird. Als wirksame Komponente kann nicht nur nativer vWF bereitgestellt werden, sondern auch funktionell aktive
Analoge, Derivate, Fragmente und Mutanten. Vorzugsweise wird rekombinanter vWF (rvWF) erfindungsgemäß eingesetzt.
Es ist weiters bevorzugt, eine Fraktion des vWF in der erfindungsgemäßen Präparation zur Verfügung zu stellen.
Der vWF kann durch chromatographische Reinigungsverfahren, insbesondere durch Ionenaustausch und/oder Af-
finitätschromatographie fraktioniert werden, wobei die
Fraktionen gewonnen werden können, die eine hohe Halbwertszeit bzw. anhaltende Erhöhung des Faktor-VIH-Spiegels
in vivo zeigen.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß durch die Verabreichung eines vWF mit verlängerter Halbwertszeit
der FVIILC nicht nur stabilisiert wird, sondern FVIILC
in nachhaltiger Weise endogen induziert wird. Die Induktion des körpereigenen FVHLC spielt vor allem dann eine Rolle,
wenn der Organismus nicht mit exogenem FVHLC belastet werden soll. Im Fall einer vw-Krankheit wird oftmals
gleichzeitig ein Mangel an FVIILC gefunden, obwohl der Patient nicht an Hämophilie A leidet (Pseudohämophilie).
Die Verabreichung des FVIILC wäre daher nicht unbedingt erforderlich, falls durch die Verabreichung des vWF genügend
endogener FVIILC produziert wird.
Eine Art der Pseudohämophilie ist zurückzuführen auf Mutationen im vWF-Molekül im Bereich zwischen 1 und
272, die die Bindung des FVULC beeinträchtigen. Im Fall von vWF Normandi ist beispielsweise eine Punktmutation
für die fehlende Bindungskapazität für FVIILC verantwortlich.
Dementsprechend eignet sich ein vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit zur erfindungsgemäßen Anwendung
an einen Patienten mit angeborenen oder erworbenen Mangel an funktionellem vWF. Erfindungsgemäß werden insbesondere
die folgenden Krankheiten bzw. durch die Krankheiten verursachte Zustände gemäß der Klassifikation von
Sadler et al, Thromb. Haemostasis 74: 161-166 (1995) behandelt.
Darunter finden sich alle vw-Krankheiten, die auf Mutationen des vWF-Moleküls zurückzuführen sind, aber
auch die νW-Krankheiten vom Typ 1, 2, 3, die durch einen
Mangel an vWF gekennzeichnet sind. Diese Krankheiten sind unter den Begriff der funktionellen Störungen des vWF
zu subsumieren.
In einer speziellen Ausführungsform werden Krankheitszustände behandelt, die im Zusammenhang mit dem Auftreten
von Antikörpern gegen vWF bzw. FVIILC stehen.
Die Behandlung kann einerseits prophylaktisch und andererseits therapeutisch vorgenommen werden. Ein Präparat
enthaltend vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit eignet sich insbesondere für die Prophylaxe, z. B. vor einer möglichen
Verletzung des Patienten oder vor einer Operation, welche mehrere Stunden dauert Die Verabreichung des vWF
kann dabei je nach Art der Krankheit mit oder ohne Verabreichung von FVIILC kombiniert werden. Ein FVIILC Gehalt
in der pharmazeutischen Präparation ist vor allem dann wünschenswert, wenn eine akute Blutung rasch gestillt werden
soll. Da die Erhöhung des endogenen FVIILC Gehalts im Blut des Patienten erst nach einigen Stunden relevant
wird, ist eine initiale Verabreichung von FVIILC gemeinsam mit dem νWF vorzuziehen.
Die Bereitstellung einer pharmazeutischen Präparation enthaltend FVIILC und vWF zur erfindungsgemäßen Anwendung
hat den Vorteil, daß der FVIILC nicht nur in vivo stabilisiert wird, sondern auch in vitro. Im Fall von rvWF ist
die Kombination mit rFVIILC oder einem entsprechenden funktionell aktiven Derivat, Analogen oder Mutanten besonders
vorteilhaft. Die Stabilität des eingesetzten Präparates ist vor allem für Infusionspräparate relevant, welche über
eine Dauer von mehreren Stunden einen Patienten infundiert werden können ohne Risiko der Veränderung des Präparates
und deren Notwendigkeit der Veränderung des Dosierschemas.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß der vWF mit der verlängerten Halbwertszeit die Pharmakokinetischen
Eigenschaften des FVIILC wesentlich verbessert. So kann erfindungsgemäß auch ein Präparat zur Verfügung gestellt
werden, welches den biologisch aktiven FVnLC/vWF-Komplex enthält, dessen verbesserte pharmakokinetische
Eigenschaften, wie eine hohe in vivo "recovery" (Wiederfindung oder biologische Verfügbarkeit) bzw.
eine verlängerte Halbwertszeit in vivo für den FVIILC v.a. zurückzuführen sind auf den Gehalt an vWF mit einer verlängerten
Halbwertszeit. Das erfindungsgemäße FVnLC/vWF-Präparat zeigt im allgemeinen eine biologische
Halbwertszeit des FVIII: C von mehr als 13 h insbesondere
mehr als 17 h, wobei auch Halbwertszeiten von mehr als 25 h möglich sind.
Die in vivo "recovery" des erfindungsgemäßen Präparates ist üblicherweise im Bereich von 90 bis 100%, im Plasma.
Der FVIII: C Anstieg nach Gabe des vWF mit verlängerter Halbwertszeit kann bis auf 6 Einheiten pro Milliliter oder
mehr herbeigeführt werden, während im Kontrollversuch bestätigt werden konnte, daß durch Gabe von Haemate® HS
Behring im Tierversuch lediglich 3 Einheiten pro Milliliter erreicht worden sind.
Für die erfindungsgemäße Anwendung eignet sich vor allem die mature Form des vWF, welcher zum Großteil proteolytisch
prozessiert ist. Vorzugsweise wird der rvWF verwendet, der durch Kontakt mit einer Protease, wie z. B. Furin
oder einer Protease vom Subtilisin-Typ, zumindest 80%, am meisten bevorzugt mehr als 90% bis zu 100%, proteolytisch
prozessiert ist.
Erfindungsgemäß wird der vWF in der Art und Konzentration verabreicht, daß der FVIILC über einen Zeitraum
von mindestens 48 Stunden, vorzugsweise mehr als 72 Stunden in vivo stabilisiert wird. Der FVIILC Gehalt in
vivo gilt dann als stabil, wenn trotz Elimination von endogenen bzw. exogenen FVIILC zumindest 0,1, vorzugsweise
mehr als 0,3, Units pro Milliliter Blut enthalten ist. Dieser Mindestgehalt an FVIILC gewährleistet einen minimalen
Schutz des Patienten vor unerwünschten Blutungen.
Entsprechend der lang andauernden Wirkung des vWF in vivo kann die initiale Dosis verringert werden, daß das pharmazeutische
Präparat erfindungsgemäß ohne Nebenwirkungsreaktionen, wie Thrombosebildung, Thrombozytenaktivierung
oder Thrombozytopänie an einem Patienten verabreicht werden kann.
Die Verabreichung der Präparation kann mehrmals erfolgen, wobei durch die hohe Halbwertszeit des vWF längere
Intervalle möglich sind, beispielsweise Intervalle von mehr als 12 Stunden, vorzugsweise etwa 24 Stunden (tägliche
Verabreichung). Die effektive vWF Menge in der erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Präparation
führt vorzugsweise zu einer Konzentration an vWF, beispielsweise gemessen als Antigen mit einem entsprechenden
ELISA, von mehr als 2 Einheiten/ml Blut über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden, vorzugsweise mehr als
48 Stunden. Die effektive Menge an vWF soll weiters die Blutungscharakteristik normalisieren, d. h. die Blutungsintensität
soll deutlich reduziert werden und ein Blutungsstillstand in kürzester Zeit nach einer Verletzung, insbesondere
in weniger als 15 Minuten, vorzugsweise weniger als 10 Minuten, herbeigeführt werden.
Um die Übertragung von möglicherweise vorhandenen Viren zu verhindern, ist darauf zu achten, daß vorzugsweise
pharmazeutische Präparationen zur Anwendungen kommen, die zur Inaktivierung bzw. Abreicherung von Viren behandelt
sind.
Zur Inaktivierung von Viren eignet sich insbesondere eine Hitzebehandlung in Lösung bzw. in festem Zustand, welche
sowohl lipidumhüllte als auch nicht-lipidumhüllte Viren
verläßlich inaktivieren kann. Beispielsweise wird die erfindungsgemäße Präparation gemäß der EPO 159 311 in festem,
nassem Zustand hitzebehandelt. Andere Verfahren zur
Virus-Inaktivierung umfassen auch die Behandlung mit Detergenzien oder chaotropen Substanzen, beispielsweise gemäß
der EP 0 519 901, WO 94/13329, DE 44 34 538, EP 0 131 740 und WO 90/15613.
Der vWF wird vorzugsweise als hochreines Protein eingesetzt, welches durch ein chromatographisches Reinigungsverfahren
erhalten wird. Die chromatographische Reinigung erfolgt insbesondere durch Ionenaustauschchromatographie
und/oder Affinitätschromatographie. Dafür können u. a. Materialien zum Anionenaustausch, darunter synthetische
Trägermaterialien oder Träger auf Kohlenhydratbasis, mit Liganden, wie DEAE-, TMAE-, QAE-, Q- oder
Aminoalkylgruppen herangezogen werden, bzw. Träger mit immobilisierten Substanzen, die eine spezifische Affinität
für vWF aufweisen. Geeignete Affinitätsmaterialien enthalten beispielsweise Heparin. Dieses Reinigungsverfahren
eignet sich v. a. für die großtechnische Gewinnung des rvWF.
Dabei ist zu beachten, daß der vWF in der erfindungsgemäßen Präparation eine ausreichende Resistenz gegenüber
einem proteolytischen Abbau aufweist, daß auf den Zusatz üblicher Stabilisatoren verzichtet werden kann. In Ausnahmefällen
kann aber auch während des Herstellungsverfahrens ein entsprechender Proteaseinhibitor zugesetzt werden,
um die intakte Struktur zu erhalten. Zur weiteren Unterstützung der Stabilität des vWF kann das pharmazeutische Präparat
auch ein Polyalkylenglycol, wie PEG oder Polypropylenglycol, oder Glycerin in einer Konzentration enthalten,
die den vWF nicht präzipitiert und physiologisch verträglich ist.
Die Formulierung der erfindungsgemäß angewandten Präparationen kann in an sich bekannter und üblicher Weise
erfolgen, z. B. mit Hilfe von Salzen und gegebenenfalls Aminosäuren, aber auch in Gegenwart von Tensiden vorgenommen
werden. Vorzugsweise werden Salze, wie z. B. Natriumchlorid oder Calziumchlorid, verwendet und ein pH im
Bereich von 6-8 gewählt. Als Aminosäuren sind Glycin oder Lysin bevorzugt. Ebenso kann ein pharmazeutisch akzeptabler
Puffer gewählt werden. Aufgrund der hohen Stabilität des vWF kann üblicherweise auf die Verwendung von
Stabilisatoren, wie Trägerproteine oder Inhibitoren in der Formulierung verzichtet werden.
Vorzugsweise kommt ein rvWF in einem Präparat zur Anwendung,
welcher nach elektrophoretischer Analyse Multimerenbanden in Abwesenheit von Satellitenbanden zeigt.
Dies entspricht der Struktur eines vWF als nicht-fragmentiertes, also intaktes Protein.
Vorzugsweise zeigt der rvWF im pharmazeutischen Präparat das gesamte Spektrum an Multimeren, insbesondere
auch den vWF mit hohem Molekulargewicht, ähnlich der nativen Multimeren verteilung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der rvWF in einer Form erhalten, die nach Verabreichung an ein
Säugetier das Multimerenmuster mit einer Singulettstruktur beibehält. Eine proteolytische Aufspaltung der Singuletts in
Satellitenbanden bleibt somit aus.
Die bevorzugte Konzentration des vWF in der verabreichungsfertigen
Lösung ist im Bereich von 1 bis 100 Einheiten/ml. Durch die hohe Reinheit des Präparates kann dieses
auch in Konzentrationen bis zu 1000 E/ml formuliert werden. Die Aktivität ist durch die Ristocetin-mediierte Plättchenaggregation
charakterisiert und wird als Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (RCoF) angegeben (siehe dazu Journal of
Clinical Investigation 52, 2708-2716, 1973). Die übliche Dosis für den vWF liegt im Bereich von 40-80 RCoF-Einheiten/kg
in Intervallen von 6^8 Stunden. Als initiale Dosis
kann auch eine höhere Dosis bis zu 200 RCoF gewählt werden.
In einer speziellen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Präparation den
vWF als einzigen wesentlichen Bestandteil. Somit kann diese Präparation im wesentlichen aus hochgereinigtem
vWF bestehen.
Zur Herstellung der pharmazeutischen Präparationen kann der vWF aus Plasma oder einer Plasmapraktion gereinigt
werden, wobei je nach Verwendungszweck die gleichzeitige Anreicherung oder Abreicherung des FVIII: C
zweckmäßig ist. Wenn von einem Zellkulturüberstand ausgegangen wird kann der vWF ebenfalls in Anwesenheit oder
Abwesenheit von FVIItC gereinigt und aufkonzentriert werden. FVHLC kann in diesem Fall entweder dem Zellkulturmedien
zugesetzt werden bzw. von der Zelle coexprimiert werden.
Gemäß der Erfindung wird weiters ein diagnostisches Set zur Bestimmung einer phänotypischen Hämophilie A zur
Verfügung gestellt, welches
a) vWF in einer pharmazeutisch akzeptablen Form und
b) ein Mittel zur Bestimmung der FVIII:C-Aktivität in
einer Blutprobe des Patienten
enthält vorzugsweise wird ein vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit eingesetzt, insbesondere vWF mit einer Halbwertszeit
von mehr als 20 Stunden. rvWF ist für diesen Zweck besonders gut geeignet, da er frei von FVHLC-Aktivität
zur Verfügung gestellt werden kann. Bei einem Patienten mit phänotypischer Hämophilie A verursacht die Verabreichung
eines vWF Präparates den Anstieg des endogenen FVHLC Gehaltes. Dieser Anstieg ist um so signifikanter,
wenn der vWF den FVIII: C in vivo erfindungsgemäß stabilisiert Falls der Patient jedoch an einem Defekt der Hemostase
leidet, der einen Mangel an FVULC verursacht, wie, Hämophilie A, oder falls der Patient Antikörper gegen
FVULC enthält, die einen Mangel an funktionell aktiven FVULC verursachen, bleibt der Anstieg des endogenen
FVHI:C auf. Somit kann der νWF mit der verlängerten
Halbwertszeit zur Herstellung einer Präparation verwendet werden, die die Differenzierung zwischen einer vW-Krankheit
und einer vW-Krankheit mit einem gleichzeitigen Auftreten eines genomischen Defekts mit der folge eines
FVULC Mangels, insbesondere Hämophilie A, verwendet werden.
Das Mittel zur Bestimmung der FVIILC Aktivität ist entweder ein Mittel zur Bestimmung der Blutgerinnungsaktivität,
wobei die Blutgerinnungszeit gemessen wird (Einstufentest oder Zweistufentest), oder aber ein chromogener
Test bzw. ein Test zur Bestimmung von aktiven Blutgerinnungsenzymen, die in Abhängigkeit von der FVIILC Aktivität
einer Probe wirken. Vorzugsweise wird ein chromogener Test zur Bestimmung der FVIILC Aktivität in einer
Plasma- oder Serumprobe gemäß der EP 0 496 723 durchgeführt. Als chromogenes Substrat wird in diesem Fall ein
Substrat für Faktor Xa eingesetzt.
Es ist aber auch möglich die FVIII: C Aktivität mit Hilfe der aPTT (activated partial thromboplastin time) unter Verwendung
eines Faktor VIII Mangelplasmas zu bestimmen. Die aPPT ist ein Beispiel für einen Test, welcher die Aktivierung
der Blutgerinnung mit einem entsprechenden Aktivator vorsieht, worauf das Ausmaß der Blutgerinnung mit
einem entsprechenden Mittel detektiert wird. Das Ausmaß der Blutgerinnung kann beispielsweise durch die Erfassung
der Blutgerinnungszeit (Endpunktbestimmung) oder der Kinetik der Blutgerinnung detektiert werden.
Die Erfindung wird weiters durch die nachfolgenden, die Erfindung nicht limitierende Beispiele näher beschrieben.
ABBILDUNGEN
Abb. 1
Abb. 1
Verlauf der Gerinnungsparameter in einem von Willebrand-defizienten
Schwein nach Behandlung mit dem erfindungsgemäßen vWF-Präparat.
Abb. 2
Verlauf der Gerinnungsparameter in einem von Willebrand-defizienten
Schwein nach Behandlung mit einem plasmatischen vWF/FVHI-Konzentrat.
Abb. 3
Behandlungsschema einer von Willebrand Faktor-immundepletierten Maus.
Abb. 4
Blutungscharakteristik von von Willebrand Faktordefizienten immundepletierten Mäusen nach Behandlung mit
plasmatischem von Willebrand Faktor und dem erfindungsgemäßen Präparat mit je 100 E RCoF/kg Körpergewicht im
Vergleich zu normalen Mäusen und unbehandelten von Willebrand Faktor-defizienten immundepletierten Mäusen.
Herstellung eines rekombinanten von Willebrand Faktors aus CHO-Zellen
Ein CHO-Zellklon, der rekombinanten von Willebrand
Faktor produziert, wird wie in Fischer et al, EEBS. Lett. 351: 345-348, 1994, beschrieben, hergestellt. Durch Transfektion
mit einem für die cDNA humanen Furins kodierenden Vektor (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res.
18: 664, 1990) wurde die Zellinie zur Co-Expression von humanem Furin gebracht. Derartige stabile Zellklone wurden
im Großmaßstab in Perfusionsreaktoren auf Microcarriern fermentiert (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB,
Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994: 267-269).
Die Reinigung wurde durch ein 2-stufiges chromatographisches Verfahren gemäß Thromb. Haemost. 73: 1160,
1995, durchgeführt. Die durch Elution mit Kochsalz desorbierte Fraktion wurde gewonnen und durch Gelfiltration
über Sephadex G25 (Pharmacia) in einen Puffer, enthaltend 5 g/l Na3Citrat · 2H2O, 2 g/l NaCl, 5 g/l Glycin, 5 g/l L-Lysin
· HCl und 0,62 g/l CaCl2 · 2H2O, pH 7,0, umgepuffert.
Die Präparation war charakterisiert durch einen von Willebrand Faktor-Antigengehalt von 36,4 E/ml, gemessen in einem
kommerziellen von Willebrand Faktor-ELISA (Boehringer Mannheim) und durch eine von Willebrand Faktor-Aktivität
von 13,8 E/ml, gemessen mittels Ristocetin-mediierter Plättchenaggregation (Evans et al, Brit. J. Haematol.
37: 289-294,1977).
In vivo-Aktivität und Pharmakokinetik von rekombinantem von Willebrand Faktor in einem homozygoten von Willebrand
Faktor-defizienten Schwein im Vergleich zu porcinem
von Willebrand Faktor
Für die Untersuchung können von Willebrand-defiziente Tiere, wie z. B. die von Roussi et al., Brit. J. Haematol.
90: 661-668 1995, beschriebenen homozygoten von Willebrand-defizienten
Schweine, verwendet werden. In diesem Versuch wurde ein 4 Monate altes, 37 kg schweres, weibliches,
homozygotes von Willebrand-defizientes Schwein eingesetzt. Dieses war charakterisiert durch eine Blutungszeit von über 30 Minuten, gemessen nach der Ohrblutungsmethode
von Samama et al, Thromb. Haemostas. 71: 663-669, 1994, und einen von Willebrand Faktor-Plasmaspiegel
von unter der Nachweisgrenze, sowohl im Antigen-ELISA als auch in der Ristocetincofaktoraktivität bestimmt.
Die Faktor VIII-Aktivität betrug ca. 1 E/ml, gemessen als humaner Faktor VIE im 1-Stufen-Gerinnungstest
(Immuno), 2-Stufen-Gerinnungstest (Immuno), oder chromogenem Faktor VIII-Test (Immunochrom FVIII: C, Immuno).
Unter Narkose wurde dem Schwein eine erfindungsgemäße Präparation, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen
wurde, in einer Dosis von 34 RCoF E/kg Körpergewicht injiziert. Unmittelbar vor der Infusion sowie 30 min.,
1 Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std. und 32 Std. nach Infusion wurden Blutproben genommen, daraus
Citratplasma hergestellt und aus diesem von Willebrand Faktor-Antigen, Ristocetincofaktoraktivität und Faktor VIII
nach den oben genannten drei Testmethoden bestimmt. Die Resultate sind Abb. 1 zu entnehmen. Es zeigte sich, daß
nach etwa 24 Stunden, zu einem Zeitpunkt als keine Ristocetincofaktoraktivität des infudierten Präparates ex vivo
mehr nachweisbar war, eine nachhaltige Verfünffachung des Plasmaspiegels an Faktor VIII eingetreten war. Für das
vWF-Antigen konnte eine biologische Halbwertszeit von 32,4 Stunden errechnet werden.
Als Kontrolle wurde ein porcines, plasmatisches von Willebrand Faktor-Präparat unmittelbar nach Entnahme der
letzten Blutprobe demselben Schwein in einer Dosis von 45 RCoF E/kg Körpergewicht gegeben. Ebenso wie nach Gabe
des erfindungsgemäßen Präparates wurden zum Zeitpunkt 30 min., Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std.
und 32 Std. nach Infusion Blutproben gezogen, aus diesen Plasma hergestellt und die entsprechenden Faktor VHI/von
Willebrand Faktor-spezifischen Gerinnungsparameter bestimmt. Es zeigte sich, daß es auch hier zu einer Induktion
des Faktor VIII kam, der jedoch bezogen auf den Ausgangswert nach ca. 10 Stunden aber nur den doppelten Wert erreichte
und auch schneller wieder abnahm. Der porcine, plasmatische von Willebrand Faktor zeigte eine Halbwertszeit
von ca. 10 Stunden. Als makroskopischen Parameter für die Normalisierung des im defizienten Tier gestörten Gerinnungssystems
wurde die Blutungszeit bestimmt, die von über 30 Minuten vor Infusion des von Willebrand Faktors
auf ca. 13 Minuten nach Infusion korrigiert werden konnte, wobei dieser Effekt auch noch 32 Stunden nach der Infusion
nachweisbar war. Die Infusion des plasmatischen von Willebrand Faktor führte ebenso zu einer Korrektur der Blutungszeit auf ca. 15 Minuten während die Blutungszeit 24 Stunden
nach der Infusion des plasmatischen von Willebrand Faktor-Präparates bereits wieder dem Ausgangswert entsprach,
also keine Verkürzung feststellbar war.
Pharmakokinetik der Multimere von rekombinantem von
Willebrand Faktor im Schwein
Willebrand Faktor im Schwein
Aus den Plasmaproben des Versuches aus Beispiel 2 wurde die Struktur der von Willebrand Faktor-Multimere
durch SDS-Agarosegelelektrophorese im 2%igen Agarosegel
nach der Methode von Ruggeri et al., Blood 57: 1140-1143, bestimmt. Dabei wurden die von Wille-
brand Faktor-Multimere durch eine immunenzyniatische Färbung nach Aihara et al, Thromb. Haemostas. 55:
263-267, 1986, sichtbar gemacht. Als primärer Antikörper wurde ein Kaninchen-anti-von Willebrand Faktor-Antiserum
(Dakopatts. Glostrup, Denmark) in einer Verdünnung von 1 : 5000 verwendet. Als sekundärer Antikörper diente
ein alkalische Phosphatase-konjugierter, affinitätsgereinigter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG H + L Antikörper (Axell,
Accurate Chemical and Scientific Corp., NY) in einer Verdünnung von 1 : 1000. Die Färbung der Proteinbanden erfolgte
mittels des Nitroblau-tetrazolium-chloridbrom-indolyl-phosphatsubstratsystems.
Vor Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Präparat konnte kein von Willebrand Faktor im Schwein nachgewiesen
werden. Nach Gabe des Präparates zeigte sich, eine für den nativen Zustand atypische Struktur eines aus Singuletts
bestehenden Multimerenmusters, welches auf einen nicht proteolytisch verdauten von Willebrand Faktor zurückzuführen
ist. Diese Struktureigenschaft blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum unverändert, d. h. keine proteolytische
Degradation des Präparates fand statt. Das Präparat wurde allerdings entsprechend der Pharmakokinetik aus der
Zirkulation sukzessive eliminiert Multimere des niedrigsten Molekulargewichtes blieben bis zu 32 Stunden nach Infusion
des Präparates nachweisbar.
In vivo-Aktivität und Pharmakokinetik eines plasmatischen
von Willebrand/Faktor VIII-Konzentrates in einem homozygoten
von Willebrand Faktor-defizienten Schwein
Analog zum Beispiel 2 wurde einem 91 kg schweren weiblichen, homozygoten, vWF-defizienten Schwein ein
humanes, plasmatisches FVIH/vWF-Konzentrat, HAE-MATE
HS 1000 (Fa. Behring), in einer Dosierung von 34 RCoF E/kg KG gegeben. Dieses Präparat ist ein Faktor
VEH- und von Willebrand Faktor-enthaltendes Konzentrat. Entsprechend wurde mit der Gabe des von Willebrand Faktors
dem Schwein eine Dosis von 17 EE FVEEE/kg KG verabreicht.
Unmittelbar vor der Infusion sowie 30 min., 1 Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std. und 32 Std. nach
der Infusion wurden Blutproben genommen, Citratplasma hergestellt und aus diesem von Willebrand Faktor-Antigen,
Ristocetincofaktoraktivität und Faktor VEEE nach den im Beispiel 2 beschriebenen Testmethoden bestimmt. Die Resultate
sind Abb. 2 zu entnehmen. Es zeigte sich, daß etwa 12 Stunden nach der Enfusion des Präparates, zu einem Zeitpunkt,
wo noch ein meßbarer Plasmaspiegel an von Willebrand Faktor-Ristocetincofaktoraktivität nachweisbar war,
die FVEEE-Plasmakonzentration auf das 2,8fache angestiegen
war. Durch externe Zuführung von Faktor VEEE stieg der FVEEE-Spiegel unmittelbar nach der Enfusion um ca. 0,4
E/ml Plasma an. Dies entsprach einer theoretischen Wiederfindungsrate von 94% des infundierten Faktors VEEE.
Für das vWF-Antigen wurde eine biologische Halbwertszeit
von 7,5 Stunden errechnet. Damit zeigte sich eine deutlich kürzere biologische Halbwertszeit des humanen, plasmatischen
von Willebrand Faktors im Vergleich zum rekombinanten von Willebrand Faktor aus Beispiel 2.
Analog zu Beispiel 3 wurde die Multimerenstruktur des von Willebrand Faktors in den Schweineplasmaproben analysiert.
Die schnellere Elimination aus der Zirkulation als die des rekombinanten von Willebrand Faktors konnte auch
hier nachgewiesen werden und war mit den in der Abb. 2 angegebenen Antigenkonzentrationen vergleichbar. Das
Präparat zeigte die für von Willebrand Faktor typische Triplett-Struktur,
die auf eine proteolytische Degradation zurückzuführen ist.
BEESPEEL 5
Vergleich der in vivo-Aktivität eines plasmatischen von
Willebrand Faktor/Faktor VEEE-Konzentrates und eines rekombinanten
von Willebrand Faktors in einer temporär von Willebrand Faktor-defizienten Maus
Weibliche NMRE-Mäuse (ca. 20-30 g) werden verwendet und durch Gabe von 65 mg/kg Pentobarbital narkotisiert.
Anschließend wird die Blutungscharakteristik mit einer modifizierten Methode nach Novak et al., Brit. J. Ha ematol.
69: 371-378, 1988, durch definierte Verletzung der Schwanzspitze bestimmt. Das aus der arterio-venösen Verletzung
der Schwanzspitze austretende Blut wird auf Filtern (Pipetman P5000-Schutzfilter, Gilson) so gesammelt, daß
das Blut direkt den Filter tropfen kann, ohne von diesem durch Kapillarwirkung aufgesogen zu werden, um zu verhindern,
daß ein sich formierendes Blutgerinnsel zerstört wird. Die Filtereinheiten werden alle 2 Minuten gewechselt
und das austretende Blut in Fraktionen gesammelt. Die Blutsammlung wird 16 Minuten fortgesetzt. Danach wird, sofern
die Blutung nicht zum Stillstand gekommen ist, die Wunde verödet. Die Qualifizierung der Blutungscharakteristik
erfolgt durch Extraktion des in Fraktionen auf den Filtern gesammelten Blutes jeweils mit 5 ml 0,04%iger Ammoniumhydroxidlösung
über 5 Stunden. Dabei lysieren die Erythrozyten, die mit dem Blut im Filter gesammelt sind.
Durch eine 10-minütige Ultraschallbehandlung (Sonorex RKlOO, Bandelin electronic, Berlin) wird das Haemoglobin
extrahiert und quantitativ photometrisch bei 416 nm gegen
eine Eichkurve bestimmt. Eine solche kann ermittelt werden indem Mausblutvolumina zwischen 10 μΐ - 1 ml auf die Filter
pipettiert werden, diese wie oben beschrieben extrahiert werden und das entsprechende Haemoglobin photometrisch
bei 416 nm bestimmt wird. Entsprechend lassen sich lineare Eichkurven erstellen, die eine direkte Umrechnung der Haemoglobinkonzentration
auf die Blutmenge pro Filter ermöglichen. Die Blutungscharakteristik wird ermittelt, indem
graphisch die einzelnen Blutfraktionen additiv gegen die Zeit aufgetragen werden. Der Blutungsverlauf einer gesunden
Maus ist unter diesen Bedingungen dadurch charakterisiert, daß in einem Beobachtungszeitraum zwischen 6 min
und Versuchsende kein weiteres Blut aus der künstlich herbeigeführten Verletzung austritt, also die Blutung bereits zuvor
zum Stillstand gekommen ist. En der Graphik zeichnet sich ein derartiger Verlauf durch Parallelität zur x-Achse aus
(siehe Abb. 3).
Mäuse werden nun mit einem anti-von Willebrand Faktor- Enhibitor in einer Dosis von 10 ml/kg Körpergewicht
vorbehandelt. Das anti-von Willebrand Faktor-Enhibitorplasma wird durch Emmunisierung einer ca. 50 kg schweren
1,5 Jahre alten Ziege mit einem von Willebrand Faktor-Präparat wie folgt gewonnen:
1 g Kryopräzipitat wird in 35 ml einer Tris/Lysin-gepufferten
NaCl-Lösung (85 mM) gelöst. Proteine des Prothrombinkomplexes werden durch Adsorption an AIOH3 und
BaSC>4 entfernt. Dazu wird die von Willebrand Faktor/Faktor
VEEI enthaltende Lösung mit 0,1 Gew.-% AlOH3 1 Stunde bei 22°C inkubiert. Anschließend wird der AlOH3-Proteinkomplex
durch Zentrifugation abgetrennt. Der gewonnene Überstand wird weiters mit 0,1 Gew.-% BaSO4
unter Rühren inkubiert und derBaSOzrProteinkomplex neuerlich durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird
anschließend auf pH 6,8 eingestellt und durch Chromatographie über Q-Sepharose® FF (Pharmacia) gereinigt. Der von
Willebrand Faktor-Komplex wird an das in einer Säule ge-
packte Gel adsorbiert; nicht-bindende Proteine werden durch Waschen mit 4 Säulen Volumina des Startpuffers entfernt.
Die Elution der Proteinfraktion wird mit einem Puffer (50 mM Tris/HCl, 500 mM NaCl, pH 6,8) durchgeführt. Das
gewonnene Eluat wird mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 6,8,
auf eine Konzentration von 175 mM NaCl verdünnt und anschließend durch Gelfiltration auf Sepharose® CL6B (Pharmacia)
weiter gereinigt. Die Gelfiltration wird mit einem linearen Fluß von 5,7 cm/h in einer Säule mit 26 mm Durchmesser
und einer Betthöhe von 82 cm durchgeführt. Die Proteinfraktion des Ausschlußvolumens wird bei 280 nm
UV-spektroskopisch detektiert. Der Protein-Peak des Ausschlußvolumens
wird durch Ultrafiltration, mit einem Ultrafilter mit einer Retentionsmasse von 30.000 D konzentriert.
Ein so hergestellter von Willebrand Faktor/Faktor VIII-Komplex hat eine spezifische Aktivität von 173 Ristocetin-Cofaktoreinheiten
(E RCoF) vWF/mg Protein (bestimmt mittels Proteinbestimmung nach Bradford, Anal. Biochem.
72: 248-254, 1976. Die Präparation ist frei an Gerinnungsfaktoren Π, VII, IX, X, XI und XII.
Mäuse werden nun mit dem anti-von Willebrand Faktor-Inhibtiorplasma
nach dem Schema aus Abb. 4 vorbehandelt. Eine Maus mit derart indizierter temporärer von Willebrand-Defizienz
zeigt bei Infusion von physiologischer Kochsalzlösung in der nachfolgenden Schwanzspitzenblutungscharakteristik
eine stetige Blutung vom Beginn des Meßzeitraumes bis zum Abschluß des Experimentes (siehe Abb. 4). In
diesem Modell des von Willebrand/Jürgens-Syndroms werden nun ein Präparat, enthaltend plasmatischen von Willebrand
Faktor, sowie ein erfindungsgemäßes Präparat auf ihre Wirkung untersucht. Dabei werden in beiden Fällen 100
E vWF Ristocetincofaktoraktivität (RCoF)/kg jeweils als Bolus gegeben. Die Blutungscharakteristik ist der Abb. 4 zu
entnehmen. Überraschenderweise zeigt sich, daß ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes von Willebrand Faktor-Präparat in
diesem Ansatz die Blutungscharakteristik der von Willebrand-defizienten
Maus auf die einer gesunden Maus korrigiert, während das plasmatischen von Willebrand Faktor-Präparat
(IMMUNATE® STIM4, Immuno) in derselben Dosierung zwar eine deutliche Reduktion der Blutungsintensitat
bewirkt, aber zu keinem Blutungsstillstand wie das erfindungsgemäße Präparat führt. Nach Gabe des rekombinanten
von Willebrand Faktor-Präparates und durchgeführter Bestimmung der Blutungscharakteristik wurde den Tieren eine
Blutprobe durch Herzpunktion entnommen. Aus ex vivo Plasmaproben wurde die Mulitmerenzusammensetzung des
infundierten vWF bestimmt. Es zeigte sich, daß die Singulettstruktur
auch nach Infusion über den gesamten Messzeitraum erhalten blieb.
Claims (33)
1. Pharmazeutische Präparation zur anhaltenden Erhöhung
des Blutgerinnungsfaktor-νΐΠ-Spiegels in einem
Säugetier, enthaltend von Willebrand-Faktor (vWF) bzw. eine vWF-Fraktion mit einer verlängerten biologischen
Halbwertszeit.
2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion eine in
vivo-Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden aufweist.
3. Präparation nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der FVHLC eine in vivo-Halbwertszeit
von mehr als 13 Stunden, vorzugsweise mehr als 17 Stunden, aufweist.
4. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion
eine aus Singuletts bestehende Multimerenstruktur zeigt.
5. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion
das gesamte Spektrum an Multimeren, insbesondere auch solche mit hohem Molekulargewicht,
ähnlich der nativen Multimerenverteilung zeigt.
6. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichungsfertige
Lösung den vWF bzw. die vWF-Fraktion in einer Konzentration im Bereich von 1 ist 1000 E/ml enthält.
7. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion
chromatographisch gereinigt ist.
8. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinanter vWF
(rvWF) bzw. eine Fraktion des rvWF enthalten ist.
9. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß rvWF bzw. die rvWF-Fraktion
durch Kontakt mit einer Protease zumindestens 80%, vorzugsweise mehr als 90% bis zu 100%, proteolytisch
prozessiert ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei
der vWF bzw. die vWF-Fraktion mit Faktor VIII komplexiert ist.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor
VHI biologisch aktiv und ein natives Protein bzw. ein
funktionelles Agens, eine Mutante oder ein Derivatist.
12. Verwendung einer Präparation nach Anspruch 1 bis 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
nach Anspruch 10 oder 11.
13. Verwendung eines von Willebrand Faktors (vWF) bzw. einer vWF-Fraktion mit einer verlängerten biologischen
Halbwertszeit zur Herstellung einer Präparation nach Anspruch 1 zur Stabilisierung von Blutgerinnungsfaktor
VHI (FVIILC) in einem Säugetier.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion eine in
vivo-Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden aufweist.
15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation zur Erhöhung des
endogenen Gehalts an FVHI: C geeignet ist.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation an einen
Patienten mit angeborenem oder erworbenem Mangel an funktionellem vWF verabreicht wird.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation an einen Patienten verabreicht
wird, der an funktionellen Störungen des vWF, insbesondere von Willebrand-Krankheit leidet.
18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation an einen Patienten verabreicht
wird, der Antikörper gegen den vWF bzw. FVHLC aufweist.
19. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation an einen Patienten verabreicht
wird, der an phänotypischer Hämophilie A leidet
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation rekombinanten
vWF (rvWF) bzw. eine Fraktion des rvWF enthält
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der rvWF bzw. die rvWF-Fraktion durch
Kontakt mit einer Protease zumindestens 80%, vorzugsweise mehr als 90% bis zu 100%, proteolytisch
prozessiert ist.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in Inter-
13
vallen von mehr als 12 Stunden, vorzugsweise täglich, wiederholt an das Säugetier verabreicht wird.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 22,
dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in Kombination mit einem FVIII: C-Präparat verabreicht wird.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation zusätzlich
FVni:C insbesondere rekombinanten FVIILC enthält.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation zur Stabilisierung
des FVHLC-Gehaltes über einen Zeitraum
von mindestens 48 Stunden geeignet ist.
26. Verwendung von vWF bzw. einer νWF-Fraktion
zur Herstellung einer Präparation zur Bestimmung einer phänotypischen Hämophilie A.
27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation vWF bzw. eine vWF-Fraktion
mit einer Halbwertszeit von mindestens 20 Stunden, insbesondere rvWF, enthält.
28. Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß differenziert wird zwischen einer
von Willebrand-Krankheit und einer Krankheit mit einem gleichzeitigen Auftreten eines genomischen Defekts
mit der Folge eines FVIILC-Mangels, insbesondere Hämophilie A.
29. Diagnostisches Set zur Bestimmung einer phänotypischen Hämophilie A, enthaltend
a) vWF bzw. eine vWF-Fraktion in einer pharmazeutisch akzeptablen Form und
b) ein Mittel zur Bestimmung des FVIII:C-Aktivität in einer Blutprobe des Patienten.
30. Diagnostisches Set nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die νWF-Fraktion frei
von FVIII: C-Aktivität ist.
31. Diagnostisches Set nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß der vWF bzw. die vWF-Fraktion
mit einer Halbwertszeit von mindestens 20 Stunden, insbesondere rvWF, enthalten ist.
32. Diagnostisches
Set nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Bestimmung
der FVni:C-Aktivität ein Reagenz umfaßt, welches einen Aktivator der Blutgerinnung und ein Mittel
zur Detektion der Blutgerinnung enthält
33. Diagnostisches Set nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Detektion der Blutgerinnung
ein chromogenes Substrat enthält, welches spezifisch für den Faktor Xa ist.
Hierzu 4 Seite(n) Zeichnungen
55
60
65
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