DE69133385T2

DE69133385T2 - Verbesserte matrixmetallproteaseinhibitoren

Info

Publication number: DE69133385T2
Application number: DE69133385T
Authority: DE
Inventors: Richard Galardy; Damian Grobelny
Original assignee: Grobelny Damian Watsonia North; Galardy Richard Guilford
Current assignee: Grobelny Damian Watsonia North; Galardy Richard Guilford
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2011-11-22
Also published as: US5189178A; AU662504B2; EP0558648B1; WO1992009556A1; ATE265433T1; AU9095891A; CA2096221A1; EP0558648A1; EP0558648A4; JPH05508163A; JP2736285B2; DE69133385D1

Description

Bereich der Technik
Die Erfindung betrifft Apothekerwaren, welche bei Erkrankungen, die durch ungewollte Collagenaseaktivität gekennzeichnet sind, nützlich sind. Die Erfindung betrifft genauer substituierte oder unsubstituierte Hydroxamate, welche kondensierte oder konjugierte Substituenten vom Bicycloaryltyp einschließen.
Stand der Technik
Es gibt eine Anzahl von Enzymen, die den Abbau von Strukturproteinen bewirken und die strukturverwandte Metallproteasen sind. Diese schließen Fibroblastcollagenase menschlicher Haut, Fibroblastgelatinase menschlicher Haut, Collagenase und Gelatinase aus menschlichem Sputum und humanes Stromelysin ein. Diese sind Zink enthaltende Metallproteaseenzyme, wie es die Angiotensin umwandelnden Enzyme und die Enkephalinasen sind.
Collagenase und verwandte Enzyme sind bei der Vermittlung der Symptomatik einer Anzahl von Erkrankungen, einschließlich rheumatoide Arthritis (Mullins, D. E., et al., Biochim Biophys Acta (1983) 695: 117 bis 214); die Metastasierung von Tumorzellen ibid., Broadhurst, M. J., et al., EP-Anmeldung 0 276 436 (1987), Reich, R., et al., Cancer Res (1988) 48: 3307 bis 3312); und verschiedene ulzeröse Zustände, wichtig. Ulzerierende Zustände in der Kornea können als das Ergebnis von alkalischen Verbrennungen oder als ein Ergebnis von Infektion mit Pseudomonas aeruginosa, Acanthamoeba, Herpes simlex und Vacciniaviren die Folge sein. Andere Zustände, die durch ungewollte Matrixmetallproteaseaktivität gekennzeichnet sind, schließen Periodontalerkrankung, Epidermolysis Bullosa und Scleritis ein.
Angesichts der Rolle von Collagenase bei einer Anzahl von Erkrankungszuständen wurden Versuche unternommen, Inhibitoren für dieses Enzym herzustellen. Eine Anzahl von solchen Inhibitoren sind in den EP-Anmeldungen 0 126 974 (veröffentlicht 1984) und 0 159 396 (veröffentlicht 1985), deren Rechteinhaber G. D. Searle ist, offenbart. Diese Inhibitoren sind sekundäre Amine, die Oxosubstituenten an der Position 2 in beiden Substituenten, welche an den Aminstickstoff gebunden sind, enthalten.
Näher verwandt zu den Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind jene, welche in den U.S. Patenten 4,599,361 und 4,743,587, deren Rechteinhaber auch G. D. Searle ist, offenbart werden. Diese Verbindungen sind Hydroxylamindipeptidderivate, die als einen Teil der Verbindung ein Tyrosin oder einen derivatisierten Tyrosinrest oder bestimmte Analoga davon enthalten.
Andere Verbindungen, die Sulfhydryleinheiten, sowie Reste von aromatischen Aminosäuren, wie Phenylalanin und Tryptophan, enthalten, sind in der PCT-Anmeldung WO 88/06890 offenbart. Einige dieser Verbindungen enthalten auch i-Butyl-Seitenketten.
Inhibitoren wurden auch für die verwandte Protease Thermolysin offenbart. Diese schließen Hydroxampeptidderivate ein, welche von Nishino, N., et al., Biochemistry (1979) 18: 4340 bis 4347; Nishino, N., et al., Biochemistry (1978) 17: 2846 bis 2850 beschrieben werden. Es ist auch bekannt, dass Tryptophan bei verschiedenen Zuständen therapeutisch wirkt, wobei bei einigen von diesen Collagenase eine Rolle spielt (siehe zum Beispiel JP 57/058626; U.S. 4,698,342; 4,291,048). Auch wurden Inhibitoren von bakteriellen Collagenasen in U.S. 4,558,034 offenbart.
Man fand nun, dass die nachstehend beschriebenen Verbindungen eine überlegene Inhibierungsaktivität im Hinblick auf Matrixmetallproteasen aufweisen. Die Verbindungen der Erfindung tragen zum Repertoire an Mitteln bei, welche für die Behandlung von Zuständen und Erkrankungen verfügbar sind, die durch eine ungewollte Aktivität der Klasse von Proteinen gekennzeichnet sind, welche Strukturproteine zerstören und hier als „Matrixmetallprotease" bezeichnet werden.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt neue Verbindungen bereit, welche als Inhibitoren von Matrixmetallproteasen nützlich sind und welche bei der Behandlung von Zuständen wirksam sind, die durch eine Überaktivität dieser Enzyme gekennzeichnet sind. Zudem können diese Verbindungen zur Reinigung von Matrixmetallproteasen verwendet werden und zum Bestimmen von erhöhten Levels an Matrixmetallproteasen in vivo. Die Verbindungen nutzen die Einbringung von Tryptophan oder anderen kondensierten oder konjugierten bicycloaromatischen Aminosäureresten in einen substituierten oder unsubstituierten Matrixmetallproteaseinhibitor vom Hydroxamatderivattyp.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform Verbindungen der Formel:

wobei R¹ jeweils unabhängig H oder Alkyl (1–8C) ist und R² Alkyl (1–8C) ist, oder wobei die nahegelegenen Reste R¹ und R² zusammengenommen eine Gruppe -(CH₂)_p , wobei p = 3 bis 5, sind;
R³ die Bedeutung H oder Alkyl(1–4C) hat;
R⁴ ein kondensierter oder konjugierter unsubstituierter oder substituierter Bicycloarylmethylenrest ist, wobei das bicyclische System Naphthyl, Indolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Biphenyl, 4-Phenylpyrimidyl oder 3-Phenylpyrimidyl ist und die Substituenten 1 bis 2 Alkylreste (1–4C) und/oder Hydroxy sind, oder ein beliebiges Ringstickstoffatom C1–5 acyliert sein kann;
n gleich 0, 1 oder 2 ist;
m gleich 0 oder 1 ist; und
X die Bedeutung OR⁵ oder NHR⁵ hat, wobei R⁵ die Bedeutung H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1–12C), Aryl (6–12C), Arylalkyl (6–16C), wobei die Substituenten Hydroxyl, Phenylmethoxycarbamyl oder eine Aminogruppe sind, hat; oder
X ein Aminosäurerest oder ein Amid davon ist; oder
X ein Piperidin- oder Morpholinrest ist; und
R⁶ die Bedeutung H oder Niederalkyl (1–4C) hat und R⁷ die Bedeutung H, Niederalkyl (1–4C) oder Acylgruppe hat; und
wobei CONR³ gegebenenfalls eine derartig modifizierte Form aufweist, dass anstatt der Funktionalität -CONR3- die Verbindung stattdessen eine Einheit, ausgewählt aus -CH₂NR³-, -COCHR³-, -CH(OH)NR³-, -CH(OH)CHR³-, -CSCHR³-, -CH=CR³-, -CF=CR³ und -NR³CO-, aufweist.

Diese Verbindungen haben die Fähigkeit, mindestens eine Matrixmetallprotease bei Säugern zu inhibieren. Dementsprechend betrifft die Erfindung in anderen Ausführungsformen Arzneimittel, welche die Verbindungen der Formel 1 oder 2 enthalten, Verfahren zur Inhibierung von Metallproteaseaktivität in vitro unter Verwendung dieser Verbindungen oder der Arzneimittel davon. Auf Matrixmetallproteasen an einem besonders unerwünschten Ort kann abgezielt werden, durch Konjugieren der Verbindungen der Erfindung an einen Zielliganden, der für einen Marker an diesem Ort spezifisch ist, wie ein Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Rezeptorligand.
Die Erfindung betrifft auch verschiedene andere Verfahren, welche die einzigartigen Eigenschaften dieser Verbindungen nutzen. So betrifft die Erfindung in einer anderen Ausführungsform die Verbindungen der Formeln 1 oder 2, welche an feste Träger konjugiert sind. Diese Konjugate können als Affinitätsreagenzien für die Reinigung einer gewünschten Matrixmetallprotease verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verbindungen von Formel 1 oder 2, welche an eine Markierung konjugiert sind. Da die Verbindungen der Erfindung selektiv an mindestens eine Matrixmetallprotease binden, kann die Markierung zur Bestimmung der Anwesenheit von ungewöhnlich hohen Mengen an Matrixmetallprotease in einer Zellkultur in vivo oder in vitro verwendet werden.
Zudem können die Verbindungen der Formel 1 oder 2 an Träger konjugiert sein, welche die Verwendung dieser Verbindungen bei Immunisierungsprotokollen ermöglichen, wobei Antikörper hergestellt werden, die spezifisch immunreaktiv für die Verbindungen der Erfindung sind. Diese Antikörper sind dann sowohl bei der Therapie als auch bei der Überwachung der Dosierung der Inhibitoren nützlich.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und 2 und neue Zwischenprodukte bei ihrer Herstellung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Wirkung des Inhibitors der Erfindung auf Korneaverbrennungen unter Verwendung eines klinischen Bewertungsverfahrens zeigt.
2 zeigt die entsprechende Wirkung der Verbindung der Erfindung auf Korneaverbrennungen unter Verwendung der Perforation als ein Merkmal.
Arten die Erfindung auszuführen
Die Verbindungen der Erfindung sind Inhibitoren von Matrixmetallproteasen bei Säugern. So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Matrixmetallprotease bei Säugern" jedwedes in Säugerquellen gefundene Enzym, das in der Lage ist, den Abbau von Collagen, Gelatine oder Proteoglycan unter geeigneten Assaybedingungen zu katalysieren. Geeignete Assaybedingungen können zum Beispiel in U.S. Patent 4,743,587 gefunden werden, welches sich auf das Verfahren von Cawston, et al., Anal Biochem (1979) 99: 340 bis 345 bezieht, eine Verwendung eines synthetischen Substrats wird durch Weingarten, H., et al., Biochem Biophys Res Comm (1984) 139: 1184 bis 1187 beschrieben. Jedwedes Standardverfahren zur Analyse des Abbaus dieser Strukturproteine kann natürlich verwendet werden. Die Matrixmetallproteaseenzyme, auf die hier in dieser Erfindung Bezug genommen wird, sind alle Zink enthaltende Proteasen, welche eine ähnliche Struktur wie zum Beispiel humanes Stromelysin oder Fibroblastcollagenase der Haut aufweisen.
Die Fähigkeit von Testverbindungen, die Matrixmetallproteaseaktivität zu inhibieren, kann natürlich in den vorstehend beschriebenen Tests getestet werden. Isolierte Matrixmetallproteaseenzyme können zur Bestätigung der Inhibierungsaktivität der Verbindungen der Erfindung verwendet werden, oder es können Rohextrakte verwendet werden, die den Umfang an Enzymen enthalten, welche zu Gewebeabbau in der Lage sind.
Die Verbindungen der Erfindung können als zwei Komponenten umfassend, die über eine Amid- oder eine modifizierte Amidbindung verknüpft sind, eingestuft werden. Eine Komponente ist ein substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxamatderivat eines Dicarbonsäuregerüsts, wobei die alternierende Carboxylgruppe das Amid oder die modifizierte Bindung mit einer Aminosäure oder einem Analogon davon bildet. Die Aminosäure oder ein Analogon ist der Rest einer Aminosäure oder eines Analogons, der ein kondensiertes oder konjugiertes bicycloaromatisches System, wie einen Tryptophanrest oder einen Naphthylalanylrest, enthält. Dieser Rest kann auch amidiert sein oder er kann durch einen oder zwei zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) ausgedehnt sein. So können die Verbindungen der Erfindung über Umsetzung der entsprechenden nicht derivatisierten Verbindungen, welche Carbonsäuren oder Ester des Dicarboxylrestes sind, mit geeigneten Reagenzien hergestellt werden.
Der Dicarbonsäurerest in Formel 1 enthält mindestens ein und in manchen Fällen zwei oder mehr chirale Zentren. Jede Konfiguration an einem chiralen Zentrum ist in der Erfindung eingeschlossen, da es Gemische von Verbindungen sind, welche die zwei möglichen Konfigurationen an jedem Chiralitätspunkt enthalten. Jedoch wurde im Allgemeinen gefunden, dass eine bestimmte Konfiguration an jedem dieser chiralen Zentren bevorzugt ist. In ähnlicher Weise kann bei den Verbindungen von Formel 2 die Doppelbindung entweder in der cis- oder der trans-Konfiguration vorliegen. Auch in diesem Fall ist die eine oder andere Konfiguration für eine spezielle Gruppe von Ausführungsformen bevorzugt. Der Kohlenstoff, an den R⁴ gebunden ist, ist in beiden Formeln chiral. Obwohl beide Konfigurationen in der Erfindung eingeschlossen sind, ist jene, welche einer L-Aminosäure entspricht, bevorzugt.
Die Amidbindung, die als -CONR³- in den Verbindungen der Formeln 1 und 2 gezeigt ist, kann eine „modifizierte isosterische" Form aufweisen. Die Verbindungen der Erfindung, bei welchen dies der Fall ist, sind bevorzugt, wenn orale Verabreichung gewünscht ist. Mit „modifizierter isosterischer Form" ist gemeint, dass anstatt der Funktionalität -CONR³- die Verbindung stattdessen eine Einheit, ausgewählt aus -CH₂NR³-, -CH-NR³, -COCHR³-, -CH(OH)NR³, -CH(OH)CHR³-, -CSCHR³-, -CH=CR³-, CF=CR³ und -NR³CO-, aufweist.
So wie es hier verwendet wird, hat „Alkyl" seine herkömmliche Bedeutung als ein geradkettiger, verzweigter oder cyclischer gesättigter Kohlenwasserstoffrest, wie Methyl, Ethyl, Isobutyl, Cyclohexyl, t-Butyl. Die Alkylsubstituenten der Erfindung weisen die Anzahl an angegebenen Kohlenstoffatomen auf, die mit 1 oder 2 Substituenten substituiert sein können. Substituenten sind jene, welche nicht die Aktivität der Verbindung beeinflussen, nämlich Hydroxyl, „CBZ", Amino. Ary1 betrifft aromatische Ringsysteme, wie Phenyl, Naphthyl, Pyridyl, Chinolyl, Indolyl; Arylalkyl betrifft Arylreste, welche über einen Alkylrest mit der angegebenen Position verknüpft sind. In allen Fällen kann der Arylteil substituiert oder unsubstituiert sein. „Acyl" betrifft einen Substituenten der Formel RCO-, wobei R wie vorstehend definiert Alkyl oder Arylalkyl ist. Die Anzahl der Kohlenstoffatome im Acylrest beträgt normalerweise 1 bis 15; da jedoch der Acylsubstituent in vivo in einfacher Weise hydrolysiert wird, ist die Natur des Rests relativ unwichtig.
Bei den Verbindungen von Formel 1 schließen bevorzugte Ausführungsformen für R¹ und R² jene ein, wo jedes R¹ die Bedeutung H oder Me hat und R² ein Alkyl mit 3–8C, insbesondere Isobutyl, 2-Methylbutyl oder Isopropyl, ist. Besonders bevorzugt ist Isobutyl. Bevorzugt sind auch jene Verbindungen von Formel 1 oder 2, wo n=1 oder m=1.
Bei den Verbindungen der beiden Formeln 1 und 2 sind bevorzugte Ausführungsformen von R³ H und Methyl, insbesondere H.
R⁴ ist ein kondensiertes oder konjugiertes bicycloaromatisches System, welches über eine Methylengruppe mit dem Molekül verknüpft ist. Mit „kondensiertes oder konjugiertes bicycloaromatisches System" ist ein aus zwei Ringen bestehendes System mit aromatischem Charakter gemeint, welches zudem ein oder mehrere Heteroatom(e), wie S, N oder O, enthalten kann. Wenn ein Heteroatom, wie N, eingeschlossen ist, kann das System, da es einen Teil von Formel (1) oder (2) bildet, eine Acyl-Schutzgruppe (1-5C), die am Stickstoffatom angefügt ist, enthalten. Das bicyclische System ist ein kondensiertes aromatisches System, nämlich Naphthyl, Indolyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl, oder ein konjugiertes System, wie Biphenyl, 4-Phenylpyrimidyl oder 3-Phenylpyridyl. In allen Fällen kann jedwede verfügbare Position des kondensierten oder konjugierten bicyclischen Systems zur Anfügung über das Methylen verwendet werden. Das kondensierte oder konjugierte aromatische System kann zudem mit 1 bis 2 Alkylresten (1–4C) und/oder Hydroxy substituiert sein oder ein beliebiges Stickstoffatom kann acyliert sein. Bevorzugte Acylierung ist Acetylierung.
Bevorzugte Ausführungsformen von R⁴ schließen 1-(2-Methylnaphthyl)methylen; 1-Chinolylmethylen; 1-Naphtylmethylen; 2-Naphtylmethylen; 1-Isochinolylmethylen; 3-Isochinolylmethylen; 3-Thionaphthenylmethylen; 3-Cumaronylmethylen; 3-(5-Methylindolyl)methylen; 3-(5-Hydroxyindolyl)methylen; 3-(2-Hydroxyindolyl)methylen; Biphenylmethylen und 4-Phenylpyrimidylmethylen und die substituierten Formen davon ein.
Viele dieser Substituenten als ein Teil eines Aminosäurerests werden in Greenstein und Winitz, „Chemistry of the Amino Acids" (1961) 3: 2731 bis 2741 (John Wiley & Sons, NY) beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform von R⁴ ist 3-Indolylmethylen oder sein N-acyliertes Derivat, d. h. die Ausführungsform, wobei die „C-terminale" Aminosäure ein Tryptophanrest oder eine geschützte Form davon ist. Eine bevorzugte Konfiguration des Kohlenstoffatoms, an das R⁴ gebunden ist, ist die, welche L-Tryptophan entspricht.
Bevorzugte Ausführungsformen von X sind jene der Formel NHR⁵, wobei R⁵ die Bedeutung H, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1–12C) oder Arylalkyl (6–12C) hat. Besonders bevorzugte Substituenten an R⁵ sind eine Hydroxylgruppe oder ein Phenylmethoxycarbamyrest (CBZ). Zudem kann die Verbindung durch Ausführungsformen ausgedehnt werden, wobei X ein zusätzlicher Aminosäurerest, insbesondere ein Glycylrest, ist, der wie beschrieben auch amidiert sein kann.
Therapeutische Verwendung der Verbindungen der Erfindung
Wie vorstehend im Abschnitt des Standes der Technik dargelegt wurde, ist eine Anzahl von Erkrankungen bekannt, welche durch ein Überaktivität oder unerwünschte Aktivität einer Matrix-zerstörenden Metallprotease vermittelt werden. Diese schließen Tumormetastasierung, rheumatoide Arthritis, Hautentzündung, Ulzeration, insbesondere der Kornea und Reaktion auf Infektion ein. Folglich sind die Verbindungen der Erfindung bei einer Therapie hinsichtlich der Zustände, bei welchen diese ungewollte Aktivität eine Rolle spielt, nützlich.
Die Verbindungen der Erfindung können deshalb zu Arzneimitteln zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung dieser Zustände formuliert werden. Pharmazeutische Standardformulierungstechniken werden verwendet, wie jene, welche in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, letzte Ausgabe offenbart werden.
Für Indikationen, die systemisch zu behandeln sind, ist es bevorzugt, dass die Verbindungen injiziert werden. Diese Zustände schließen rheumatoide Arthritis und Tumormetastasierung ein. Die Verbindungen können für Injektion unter Verwendung von herkömmnlichen Exzipienten für solche Zwecke, wie physiologische Salzlösung, Hank-Lösung und Ringer-Lösung, formuliert werden. Eine Injektion kann intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan sein. Dosierungshöhen liegen in der Größenordnung von 0,1 μg/kg Empfänger bis 1 mg/kg Empfänger, abhängig natürlich von der Natur der Zustandes, der Natur des Empfängers, der besonderen Ausführungsform der gewählten Verbindungen der Erfindung und der Natur der Formulierung und dem Verabreichungsweg.
Zusätzlich zur Verabreichung durch Injektion können die Verbindungen der Erfindung auch zu Zusammensetzungen für transdermale oder transmukosale Abgabe durch Einschließen von Mitteln, welche eine Penetration dieser Gewebe bewirken, wie Salze der Gallensäure, Fusidinsäurederivate und Cholsäure, formuliert werden. Die Verbindungen der Erfindung können auch in Abgabesystemen auf Liposomenbasis und in Formulierungen für topische und orale Verabreichung verwendet werden, abhängig von der Natur des Zustandes, der zu behandeln ist. Orale Verabreichung ist besonders vorteilhaft für jene Verbindungen, wobei die Einheit -CONR³- in einer modifizierten isosterischen Form vorliegt. Diese Verbindungen widerstehen der hydrolytischen Wirkung des Verdauungstrakts. Orale Formulierungen schließen Sirupe, Tabletten und Kapseln ein oder die Verbindung kann in Lebensmitteln oder Saft verabreicht werden.
Die Inhibitoren der Erfindung können auf spezielle Orte abzielen, wo sich die Matrixmetallprotease angesammelt hat, durch die Verwendung von Zielliganden. Zum Beispiel, um die Inhibitoren auf eine in einem Tumor enthaltene Matrixmetallprotease zu fokussieren, wird der Inhibitor an einen Antikörper oder ein Fragment davon konjugiert, der mit einem Tumormarker immunreaktiv ist, so wie dies im Allgemeinen bei der Herstellung von Immunotoxinen allgemein verstanden wird. Der Zielligand kann auch ein Ligand sein, welcher für einen Rezeptor geeignet ist, der auf dem Tumor vorhanden ist. Jedweder Zielligand, der spezifisch mit einem Marker des beabsichtigten Zielgewebes reagiert, kann verwendet werden. Verfahren zum Koppeln der Verbindung der Erfindung an den Zielliganden sind bekannt und sie sind ähnlich zu jenen, welche nachstehend zum Koppeln an einen Träger beschrieben werden. Die Konjugate werden wie vorstehend beschrieben formuliert und verabreicht.
Für örtliche Zustände ist topische Verabreichung bevorzugt. Zum Beispiel kann zur Behandlung von ulzeröser Kornea eine direkte Aufbringung einer Formulierung als Augentropfen oder Aerosol auf das betroffene Auge verwendet werden. Für Korneabehandlung können die Verbindungen der Erfindung auch als Gele oder Unguenta formuliert werden, oder sie können in Collagen oder einem hydrophilen Polymerschild eingebracht werden. Die Materialien können auch als eine Kontaktlinse oder ein Reservoir oder als eine subkonjunktivale Formulierung eingesetzt werden. Zur Behandlung von Hautentzündung wird die Verbindung lokal oder topisch, in einem Gel, einer Paste, einer Salbe oder einem Unguentum aufgebracht. Die Art der Behandlung spiegelt somit die Beschaffenheit des Zustandes und geeignete Formulierungen sind für jeden gewählten Weg auf dem Fachgebiet verfügbar.
Bestimmte topische Zustände, die gegenüber einer Behandlung unter Verwendung der Verbindungen der Erfindung empfindlich sind, schließen Magengeschwüre, oberflächliche Wunden jeder Art, Epidermolysis Bullosa, verschiedene Formen von Hautkrebs und Pemphigus ein. Es ist bekannt, dass Collagenase beim Fortschreiten von Magengeschwüren eine Rolle spielt, wie von Hasabe, T., et al.,J Exp Clin Med (1987) 12: 181 bis 190; Ozaki, I., et al., Scand J Gastroenterol Suppl (Norwegen) (1989) 16: 138 bis 141 beschrieben wird. Collagenase wird auch in Wundrandgewebe gefunden, wie von Mullins, D. E., et al., Biochim Biophys Acta (1983) 695: 177 bis 214 berichtet wird, und es ist bekannt, dass Patienten, die eine beeinträchtigte Wundheilung zeigen, im Wundgewebe eine erhöhte Collagenaseaktivität aufweisen. Zum Beispiel zeigte Hennesey, P. J., et al., J Pediat Surg (1990) 25: 75 bis 78, dass dies bei Diabetes der Fall ist; Sank A., et al., Surgery (1989) 106: 1141 bis 1148 zeigte diese gesteigerte Collagenaseaktivität bei Paraplegie, chronischem Nierenversagen und Morbus Cushing. Folglich sind die Collagenaseinhibitoren der Erfindung bei jedwedem ulzerierendem Hautzustand nützlich, einschließlich zum Beispiel bei Dekubitalgeschwüren oder anderen Zuständen, wo die Wundheilung langsam verläuft; andere Zustände, welche gegenüber einer Behandlung mit den Verbindungen der Erfindung empfindlich sind, schließen „Corneal oder Sceral melting" in Verbindung mit Keratomalazie, Skleromalazie perforans und Bindegewebeerkrankungen ein.
Dies ist auch in Bezug auf Wunden der Fall, die im Verlaufe einer medizinischen Behandlung zugefügt werden. Es wurde gezeigt, dass Collagenaseinhibitoren die Festigkeit von Wundnahten und das Wundnahthaltevermögen bei Darmanastomosen bei Ratten steigern (Hogstrom, H., et al., Res Exp Med (1985) 185: 451 bis 455. Andere topische Zustände, die auf Collagenaseinhibitoren der Erfindung ansprechen, schließen Epidermolysis Bullosa ein, wo eine erhöhte Collagenaseaktivität gezeigt wurde (Perez-Tamayo, R., Am J Path (1978) 92: 509 bis 566, Seiten 539 bis 541). Es ist auch bekannt, dass die Collagenaseaktivität im Stroma, welches ein Basalzellenkarzinom umgibt, und überall im Tumorstroma bei einem ulzerösen Basalzellenkarzinom erhöht ist (Childer, S., J. W., et al., J Am Acad Dermatol (1987) 17: 1025 bis 1032).
Zudem sind die Matrixmetallproteaseinhibitoren der Erfindung bei der Behandlung von septischem Schock und bei der Behandlung von Schocklunge (ARDS) nützlich. Die Rolle von Plasmaproteasen bei septischem Schock wurde von Colman, R. C., New Eng J Med (1989) 320: 1207 bis 1210 gezeigt und die Beteiligung von neutrophilen Proteasen sowohl bei septischem Schock als auch bei ARDS wurde von Idell, S., et al., Ann Res Respir Dis (1985) 132: 1098 bis 1105 gezeigt. Im Falle dieser Zustände schützen die Verbindungen der Erfindung direkt das Bindegewebe vor einem Verdau durch Matrixmetallproteasen, genauso wie sie einem Abbau von Collagen vorbeugen, und deshalb schützen sie vor der bekannten Chemotaxis von Neutrophilen gegenüber Collagenfragmenten (Werb, Z., in „Textbook of Rheumatology", Kelley, W. N., et al., Herausg. (1989) W. B. Saunders, Philadelphia, 3. Ausg., Seiten 300 bis 320). Die Verbindungen der Erfindung beugen auch der Inaktivierung von Plasmaproteaseinhibitoren durch Matrixmetallproteasen vor (Werb, Z., vorstehend).
Bei all dem vorstehend Erwähnten können natürlich die Verbindungen der Erfindung alleine oder als Gemische verabreicht werden und die Zusammensetzungen können zudem zusätzliche Arzneistoffe oder Exzipienten einschließen, so wie es für die Indikation geeignet ist.
Einige der Verbindungen der Erfindung hemmen auch bakterielle Metallproteasen, obwohl im Allgemeinen zu einem geringeren Grad als jenem, der in Bezug auf Metallproteasen bei Säugern auftritt. Einige bakterielle Metallproteasen scheinen weniger von der Stereochemie des Inhibitors abhängig zu sein, wogegen zwischen Diastereomeren bei ihrer Fähigkeit die Proteasen bei Säugern zu inaktivieren wesentliche Unterschiede gefunden wurden. Folglich kann dieses Aktivitätsmuster zur Unterscheidung zwischen den Säuger- und Bakterienenzymen verwendet werden.
Zubereitung und Verwendung von Antikörpern
Die Verbindungen der Erfindung können auch bei Immunisierungsprotokollen verwendet werden, wobei für die Verbindungen der Erfindung immunspezifische Antisera erhalten werden. Da die Verbindungen der Erfindung relativ kleine Haptene sind, werden sie vorteilhafterweise an antigen neutrale Träger, wie das herkömmlich verwendete Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH), oder Serumalbuminträger gekoppelt. Ein Koppeln an einen Träger kann über Verfahren stattfinden, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind; die Funktionalität -COX der Verbindungen der Erfindung bietet eine besonders günstige Stelle zur Anwendung dieser Techniken. Zum Beispiel kann der Rest COX zu einem Aldehyd reduziert werden und über eine Umsetzung mit Seitenkettenaminogruppen in Trägern auf Proteinbasis gekoppelt werden, gegebenenfalls gefolgt von einer Reduktion der gebildeten Imino-Verknüpfung. Der Rest COX, wobei X=OH, kann auch mit Seitenkettenaminogruppen unter Verwendung von Kondensationsmitteln, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder anderen Dehydratisierungsmitteln vom Carbodiimidtyp, umgesetzt werden. Verknüpfungsverbindungen können auch verwendet werden, um die Kopplung zu bewirken; sowohl homobifunktionelle als auch heterobifunktionelle Verknüpfungsverbindungen sind von Pierce Chemical Company, Rockford, IL erhältlich. Die nachstehend in den Beispielen beschriebenen Verbindungen 31 bis 34 sind für eine Kopplung an antigen neutrale Träger über ihre C-terminalen Carboxylgruppen (oder Aminogruppen in Verbindung 32) unter Verwendung von geeigneten Kopplungsmitteln gestaltet.
Der erhaltene immunogene Komplex kann dann in geeignete Säugerempfänger, wie Mäuse, Kaninchen und dergleichen, injiziert werden. Geeignete Protokolle schließen wiederholte Injektion des Immunogens in der Gegenwart von Hilfsstoffen gemäß eines Plans, der die Bildung von Antikörpern im Serum fördert, ein. Die Titer des Immunserums können in einfacher Weise unter Verwendung von Immunassayverfahren gemessen werden, die nun Standard auf dem Fachgebiet sind, wobei die Verbindungen der Erfindung als Antigene verwendet werden.
Die erhaltenen Antisera können direkt verwendet werden oder monoklonale Antikörper können durch Ernten der peripheren Blutlymphocyten oder des Splen des immunisierten Tieres und Kultivieren der Antikörper herstellenden Zellen, gefolgt von einer Identifizierung der geeigneten Antikörper herstellenden Einheiten unter Verwendung von Immunoassaystandardtechniken erhalten werden.
Die polyklonalen oder monoklonalen Zubereitungen sind dann bei der Überwachung von Therapie- oder Vorbeugungsschemata nützlich, bei welchen die Verbindungen der Erfindung eine Rolle spielen. Geeignete Proben, wie jene, die sich von Blut, Serum, Harn oder Speichelflüssigkeit ableiten, können zu verschiedenen Zeiten während des Behandlungsprotokolls unter Verwendung von Immunoassaystandardtechniken, welche die Antikörperzubereitungen der Erfindung verwenden, auf das Vorhandensein des verabreichten Inhibitors getestet werden.
Die Verbindungen der Erfindung können auch an Markierungen, wie szintigraphische Markierungen, z. B. Technetium 99 oder I-131, unter Verwendung von Standardkopplungsverfahren gekoppelt werden. Die markierten Verbindungen werden an Empfänger verabreicht, um die Orte von überschüssigen Mengen an einer oder mehreren Matrixmetallprotease(n) in vivo zu bestimmen. Die Fähigkeit der Inhibitoren, selektiv eine Matrixmetallprotease zu binden, wird so zur Aufzeichnung der Verteilung dieser Enzyme in situ genutzt. Die Techniken können natürlich auch bei histologischen Verfahren verwendet werden und die markierten Verbindungen der Erfindung können in kompetitiven Immunoassays verwendet werden.
Verwendung als Affinitätsliagenden
Die Verbindungen der Erfindung können an feste Träger, wie Trennmembranen, chromatographische Träger, wie Agarose, Sepharose, Polyacrylamid und dergleichen, gekoppelt werden, oder an Mikrotiterplatten, um Affinitätsträger zu erhalten, die zur Reinigung von unterschiedlichen Matrixmetallproteasen bei Säugern nützlich sind. Die selektive Bindung der Matrixmetallproteasen an den Inhibitorliganden ermöglicht die Adsorption des gewünschten Enzyms und seine darauffolgende Elution unter Verwendung von zum Beispiel veränderten Ionenstärke- und/oder pH-Wert-Bedingungen.
Herstellung der Verbindungen der Erfindung
Im Allgemeinen werden die Verbindungen der Erfindung, welche Hydroxamate sind, durch Umwandeln eines Carbonsäure- oder Estervorläufers der Formeln

wobei R die Bedeutung H oder Alkyl (1–6C) hat, in die entsprechenden Hydroxamate durch Behandeln dieser Verbindungen oder ihrer aktivierten Formen mit Hydroxylamin unter Bedingungen, welche die Umwandlung bewirken, erhalten.
Im Hinblick auf die Ausgangsmaterialien sind die Komponenten, die die Einheit -NR³-CHR⁴COX bilden, im Falle von Tryptophan und seinen Analoga in einfacher Weise als Ester oder Amide erhältlich. Wie vorstehend dargelegt ist, werden viele analoge kondensierte bicycloaromatische Aminosäuren von Greenstein und Winitz (vorstehend) beschrieben. Aminosäuren, die entsprechend zu jenen sind, wobei R⁴ 1-(2-Methylnaphthyl)methylen; 1-Chinolylmethylen; 1-Naphtylmethylen; 1-Isochinolylmethylen und 3-Isochinolylmethylen ist, können aus den bicycloaromatischen Methylenhalogeniden unter Verwendung der Acetamidomalonsäureestersynthese von Aminosäuren hergestellt werden, so wie es auf dem Fachgebiet gut verstanden wird. Die Methylenhalogenide selber können aus ihren entsprechenden Carbonsäuren durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid und Bromierung des resultierenden Alkohols mit Thionylbromid hergestellt werden.
Im Allgemeinen wird das Reagenz vom Hydroxylamintyp in situ durch Mischen des Hydroxylaminhydrochloridsalzes mit einem Überschuss an KOH in Methanol und Entfernen des ausgefallenen Kaliumchlorids durch Filtration gebildet. Das Filtrat wird dann mit der/dem Vorläufer-aktivierten Carbonsäure oder Ester von Formel 3 oder 4 für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das Gemisch wird dann unter verringertem Druck bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird angesäuert, dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, extrahiert, der Extrakt wird mit wässriger Kaliumbisulfatlösung und Salzlösung gewaschen und dann mit einem festen Trocknungsmittel, wie wasserfreiem Magnesiumsulfat, getrocknet. Der Extrakt wird dann wieder zur Trockene eingedampft und kristallisiert.
Die substituierten Formen des Hydroxamats, die -NHOR⁷ einschließen, werden in einer analogen Weise synthetisiert, aber durch Ersetzen von Hydroxylamin per se mit H₂NOR⁷, wobei R⁷ ein Niederalkyl oder -acyl (1–4C) ist. Das resultierende O-Alkyl- oder Acyl-Hydroxamat kann dann zudem alkyliert werden, wenn dies gewünscht ist, wobei das Derivat R⁷ONR⁶ der Carbonsäure erhalten wird. In ähnlicher Weise kann HNR⁶OH mit der Carbonsäure umgesetzt werden, wobei das Derivat HONR⁶ erhalten wird. HNCH₃OH und H₂NOCH₃ sind im Handel erhältlich.
Zur Herstellung der Ausgangsmaterialien der Formeln 3 und 4 wird die monoveresterte Carbonsäure der Formel
mit der Säure der Formel NHR³CHR⁴COX unter Bedingungen, wobei die Kondensation zur Bildung der Amidbindung stattfindet, umgesetzt, wobei X verschieden von OH ist. Solche Bedingungen umfassen typischerweise ein Gemisch der zwei Komponenten in einem nicht-wässrigen wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel in der Gegenwart von Base und eines Kondensationsmittels, wie einem Carbodiimid. So kann die Bildung der Amidverknüpfung in der Gegenwart von Standarddehydratisierungsmitteln, wie der Carbodiimide, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N-Carbonyldiimidazol, katalysiert werden. Das Produkt wird dann als ein Gemisch von Diastereomeren von Formel 3 oder 4 isoliert. Dieses Gemisch wird bevorzugt für die Umwandlung zum Hydroxamat verwendet und eines der erhaltenen Diastereomere kristallisiert direkt aus dem Produktgemisch. Alternativ werden die Diastereomere vor der Umwandlung zum Hydroxamat durch Flash-Chromatographie getrennt und getrennt isoliert. Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem Verfahren, wobei die Trennung der Diastereomere aufgeschoben wird, bis das Endprodukt erhalten wird, weniger bevorzugt.
Bei der in den Beispielen verwendeten Bezeichnung ist das Isomer „A" als dasjenige definiert, welches auf TLC schneller wandert; das Isomer „B" als dasjenige, welches langsamer wandert. Wenn die „L"-Form von Tryptophan oder eine andere Aminosäure, die ein kondensiertes bicycloaromatisches Ringsystem enthält, als der Rest verwendet wird und R¹ die Bedeutung H hat, ist im Allgemeinen die Form „A" diejenige, welche die entsprechende Konfiguration an dem Kohlenstoffatom trägt, das den Substituenten R² im Endprodukt vom Hydroxamattyp enthält (mit der Maßgabe, dass dies das einzige andere Asymmetriezentrum ist). Jedoch nachstehend in Beispiel 2, wo D-Tryptophan in der Zusammensetzung eingeschlossen ist, enthält das Isomer „B" das, was einer „L"-Konfiguration an dem Kohlenstoffatom entsprechen würde, das R² in den Verbindungen von Formel 1 enthält.
Wenn R⁶ und/oder R⁷ = Alkyl, wird das entsprechende O- oder N-Alkylhydroxylamin mit dem Methylester 4A umgesetzt, wie es für unsubstituiertes Hydroxylamin in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Alternativ kann der Methylester 4A zu seiner entsprechenden Carbonsäure verseift werden und mit Oxalylchlorid oder anderen Kondensationsmitteln aktiviert werden. Das Alkylhydroxylamin kann dann mit der aktivierten Carbonsäure umgesetzt werden, wobei die O- oder N-substituierte Hydroxamsäure erhalten wird. O- und N-Methylhydroxylamin können von Aldrich Chemical Company gekauft werden.
Andere N-Alkylhydroxylamine können durch Umwandlung von aliphatischen Aldehyden in ihre Oxime, gefolgt von einer Reduktion mit einem Boran-Pyridin-Komplex in der Gegenwart von 6N HCl zum N-Alkylhydroxylamin synthetisiert werden (Kawase, M. und Kikugawa, Y. J., Chem Soc, Perkin Trans (1979) 1: 643). Andere O-Alkylhydroxylamine können nach den allgemeinen Verfahren synthetisiert werden, die von Roberts, J. S., „Derivatives of Hydroxylamine", Kapitel 6.4 in Barton, D., et al., Herausg., Comprehensive Organic Chemistry (1979) 2: 187 bis 188 (Pergamon Press, Oxford) angegeben werden. Die zwei verwendeten allgemeinen Verfahren sind eine Verdrängung einer Abgangsgruppe von Hydroxylaminsulfonsäure oder Chloramin durch R⁷O^– und eine O-Alkylierung einer Hydroxamsäure mit R⁷-X, gefolgt von Hydrolyse: R⁷O^– + NH₂OSO₃H (or NH₂Cl) → NH₂R⁷ oder
Für R⁷ = Acyl kann eine Hydroxamsäure dieser Erfindung mit einem Säurechlorid, Anhydrid oder einem anderen Acylierungsmittel acyliert werden, um die Verbindungen dieser Klasse zu erhalten (siehe Beispiele 19 und 20).
In manchen Fällen sind die derivatisierten Malein- und Bernsteinsäurereste, welche für die Synthese der Verbindungen der Erfindung notwendig sind, im Handel erhältlich. Wenn nicht, können diese in Ausführungsformen, wobei R¹ die Bedeutung H oder Alkyl (1–8C) hat, durch Umsetzen eines 2-Oxocarbonsäureesters der Formel R²COCOOR' in einer Wittigreaktion mit einem Alkyltriphenylphosphoranylidenacetat oder α-Triphenylphosphoranylidenalkanoat in einfacher Weise hergestellt werden. Das Methylacetat oder das Alkanoat sind bevorzugt, aber jedweder geeignete Ester kann verwendet werden. Diese Umsetzung wird in einem nichtwässrigen, nicht-polaren Lösungsmittel, normalerweise bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die erhaltene Verbindung hat die Formel ROOCCR¹=CR²OOR', wobei R und R' Reste von veresterndem Alkyl oder Arylalkylalkohole sind.
Wenn die Verbindungen von Formel 4 gewünscht sind, wird dieses Produkt mit dem geeigneten Tryptophan oder einem analogen Derivat kondensiert; wenn die Verbindungen von Formel 3 gewünscht sind, wird das Zwischenprodukt unter Verwendung von Wasserstoff mit einem geeigneten Katalysator reduziert. Die Abfolge der Reaktionen zur Erlangung dieser Ausführungsformen, wobei R¹ die Bedeutung H oder Alkyl hat, n die Bedeutung 1 hat und m die Bedeutung 0 hat und R² Alkyl ist, sind in Reaktionsschema 1 gezeigt.
Bei jenen Ausführungsformen, bei welchen die Reste R¹ und R² zusammengenommen eine Gruppe (CH₂)_p sind, werden die Verbindungen der Erfindung analog zu der in Reaktionsschema 1 dargelegten Weise hergestellt, außer, dass das Zwischenprodukt der Formel ROOCCHR¹CHR²COOH aus der entsprechenden 1,2-Cycloalkandicarbonsäure, d. h. 1,2-Cyclopentandicarbonsäureanhydrid; 1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid oder 1,2-Cycloheptandicarbonsäureanhydrid, hergestellt wird.
Für Verbindungen, wobei -CONR³- eine modifizierte isosterische Form aufweist, können diese Formen nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Die folgenden Druckschriften beschreiben eine Herstellung von Peptidanaloga, welche diese alternativen Verknüpfungseinheiten einschließen: Spatola, A. F., Vega Data (März 1983), Bd. 1, Ausgabe 3, "Peptide Backbone Modifications" (allgemeiner Überblick); Spatola, A. F., in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins", B. Weinstein, Herausg., Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983) (allgemeiner Überblick); Morley, J. S., Trends Pharrn Sci (1980) Seiten 463 bis 468 (allgemeiner Überblick); Hudson, D., et. al., Int J Pept Prot Res (1979) 14: 177 bis 185 (-CH₂NR³-, -CH₂CHR³-); Spatola, A. F., et al., Life Sci (1986) 38: 1243 bis 1249 (-CH₂-S); Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307 bis 314 (-CH-R³-, cis und trans); Almquist, R. G., et al., J Med Chem (1980) 23: 1392 bis 1398(-COCHR³-); Jennings-White, C., et al., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533(-COCHR³-); Szelke, M., et al., Europäische Anmeldung EP 0 045 665 (1982) CA:97:39405 (1982) (-CH(OH)CHR³-); Holladay, M. W., et al., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401 bis 4404 (-C(OH)CH₂-); und Hruby, V. 7., Life Sci (1982)31: 189 bis 199(-CH₂-S-).
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung schließen ein:

HONHCOCH₂CH(n-Hexyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(n-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(i-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH₃;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH₂OH;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHcyclohexyl;
MeONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt;
EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt;
MeONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt;
EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-N-McTrp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₂OH;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(S)CHMePh;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₆NH-CBZ;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)NHMe;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₄CH₃;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-piperidin;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₁₁CH₃;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHcyclohexyl;
HONHCOCH₂CH(i-Bu)-L-Trp-OH;
HONMeCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe;
HONEtCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe;
CH₃OOONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe;
ΦCOONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe;
CH₃OOONMeCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; und
ΦOCOONEtCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe.

Mit den folgenden Beispielen ist beabsichtigt, die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht einzuschränken.
BEISPIELE
In den nachstehenden Beispielen sind die TLC-Lösungsmittelsysteme wie folgt: (A) Ethylacetat/Methanol (95:5); (B) Ethylacetat/Methanol (25:5); (C) Ethylacetat; (D) Ethylacetat/Methanol (30:5); (E) Ethylacetat/Hexan (1:1); (F) Chloroform/Methanol/Essigsäure (30:6:2); (G) Chloroform/Methanol/Essigsäure (85:10:1).
Beispiel 1
Herstellung von N-[D,L-2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]tryptophanmethylamid
Eine Suspension von 5 g (0,033 mol) des Natriumsalzes von 4-Methyl-2-oxopentansäure und 5,65 g (0,033 mol) Benzylbromid in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde für 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand mit Hexan auf 100 ml verdünnt und mit Wasser (3 × 20 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Abdampfung des Lösungsmittels führte zu 6,4 g (88% Ausbeute) des Benzylesters von 4-Methyl-2-oxopentansäure (1) als ein farbloses Öl.
Ein Gemisch von 6,4 g (0,029 mol) von (1) und 9,7 g (0,029 mol) Methyl(triphenylphosphoranyliden)acetat in 100 ml trockenem Methylenchlorid wurde für 12 Std. bei Raumtemperatur gerührt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hexan (3 × 50 ml) extrahiert. Die Hexanlösung wurde mit 10 %iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 30 ml), Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Abdampfung des Lösungsmittels führte zu 8,01 g (100% Ausbeute) Benzyl-2-isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propionat (2) als ein Gemisch von E- und Z-Isomeren.
Ein Gemisch von 8,01 g (0,029 mol) von (2) und 1 g 10% Palladium auf Kohle in 50ml Methanol wurde bei Raumtemperatur unter 4 Atmosphären Wasserstoffgas für 8 Std. hydriert. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration wurde das Filtrat unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 4,7 g (86% Ausbeute) 2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propionsäure (3) als ein farbloses Öl erhalten wurden.
Zu einem Gemisch von 0,85 g (4,5 mmol) von (3) und 0,57 g (4,5 mmol) Oxalylchlorid in 10 ml trockenem Methylenchlorid wurden 0,1 ml wasserfreies Dimethylformamid gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Std. wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde mit wasserfreiem Dimethylformamid auf 5 ml verdünnt und 1,06 g (4,1 mmol) des Hydrochloridsalzes von L-Tryptophanmethylamid (Kortylewicz und Galardy, J Med Chem (1990) 33: 263 bis 273) wurden zugegeben, gefolgt von einer Zugabe von 1,3 ml (9,3 mmol) Triethylamin bei –10°C. Dieses wurde für 7 Std. bei Raumtemperatur gerührt und bei Raumtemperatur unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat auf 150 ml verdünnt und mit Wasser (2 × 15 ml), 10 %iger Kaliumbisulfatlösung (5 × 20 ml), 10 %iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 20 ml), gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann eingedampft, wobei 1,6 g (83% Ausbeute) N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-L-tryptophanmethylamid 4 als ein Gemisch von Diastereomeren 4A und 4B erhalten wurden.
Die Isomere 4A und 4B wurden über Flash-Chromatographie (Kieselsäuregel, Ethylacetat) getrennt.

Isomer 4A: Schmp. = 134 bis 137°C. R_f(C) = 0,37.
Isomer 4B: Schmp. = 156 bis 158°C. R_f(C) = 0,2.

Alternativ wurde das Gemisch von 4A und 4B direkt in sein Hydroxamat umgewandelt, so wie nachstehend beschrieben wird. In diesem Fall wurde 5A aus dem Gemisch von 5A und 5B kristallisiert.
Ein warmes Gemisch von 0,22 g (3,96 mmol) Kaliumhydroxid in 1 ml Methanol wurde zu einem warmen Gemisch von 0,184 g (2,65 mmol) des Hydrochloridsalzes von Hydroxylamin gegeben. Nach Abkühlen in Eis unter einer Argonatmosphäre wurde das Kaliumchlorid abfiltriert und 0,5 g (1,32 mmol) von (4A) wurden zu dem Filtrat gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde für 7 Std. bei Raumtemperatur gerührt und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat suspendiert und mit 10 ml 10 %iger Kaliumbisulfatlösung, gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat kristallisiert, wobei 0,28 g (56 % Ausbeute) von reinem 5A erhalten wurden.
Isomer 4B wurde in seine entsprechende Hydroxamsäure 5B umgewandelt (72 % Ausbeute), so wie für 4A beschrieben wurde.

Isomer 5A: Schmp. = 176 bis 182°C. R_f(D) = 0,45.
Isomer 5B: Schmp. = 157 bis 162°C. R_f(D) = 0,39.

In dem Fall, wobei das Gemisch 4A/4B verwendet wird, kann das 5A direkt aus dem Rückstand kristallisiert werden, so wie es vorstehend beschrieben wird.
In einer ähnlichen Weise zu der, welche vorstehend dargelegt ist, aber unter Ersetzen von 4-Methyl-2-oxopentansäure mit 2-Oxopentansäure, 3-Methyl-2-oxobuttersäure, 2-Oxohexansäure, 5-Methyl-2-oxohexansäure oder 2-Decansäure, werden die entsprechenden Verbindungen von Formel 1 hergestellt, wobei R¹ die Bedeutung H hat und R² die Bedeutung n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, 2-Methylbutyl bzw. n-Octyl hat. Zudem werden durch Durchführen der hier vorstehend in Beispiel 1 dargelegten Verfahren, aber Weglassen des Schrittes der Hydrierung des durch Wittigreaktion erhaltenen Zwischenprodukts die entsprechenden Verbindungen von Formel 2 erhalten, wobei R¹ die Bedeutung H hat und R² die hier vorstehend dargelegte Bedeutung hat.
Um die Verbindungen zu synthetisieren, welche acylierte Formen des Indolylrestes enthalten, wird der Zwischenproduktester von Formel 3 oder 4 verseift und vor der Umwandlung zum Hydroxamat acyliert. Zur Veranschaulichung wird 4A mit Natriumhydroxid in Ethanol verseift und dann angesäuert, wobei N-(L-2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L-tryptophanmethylamid erhalten wird, das mit dem Anhydrid einer Alkyl(1–4C) carbonsäure behandelt wird, um N-(L-2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L-((N-acyl)indolyl)tryptophanmethylamid zu erhalten. Dieses Zwischenprodukt wird dann mit Oxalylchlorid behandelt, gefolgt von Hydroxylamin bei niedriger Temperatur, wobei das entsprechende Hydroxamat erhalten wird.
Beispiel 2
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-D-tryptophanmethylamid (7B)
Das Gemisch der zwei Diastereomere von N-[2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-D-tryptophanmethylamid 6A,B wurde wie für 4A,B in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das Gemisch wurde in Ethylacetat kristallisiert, wobei nach zwei Umkristallisationen 0,26 g (49 %) des reinen Diastereomers 6B erhalten wurden: Schmp. 155 bis 157°C, R_f(C) = 0,32. 6B wurde in seine Hydroxamsäure 7B über das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren in 50 %iger Ausbeute umgewandelt (119 mg): Schmp. 157 bis 159°C, R_f(D) = 0,39.
Beispiel 3
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-N-methyl-L-tryptophanmethylamid (9A)
Die Umsetzung von N-Methyl-L-tryptophanmethylamid, welches wie in Beispiel 1 für L-Tryptophanmethylamid beschrieben hergestellt wurde, mit 3, welche wie für 4 beschrieben durchgeführt wurde, führte zu rohem N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-N-methyl-L-tryptophanmethylamid 8A,B, das in Ethylacetat kristallisiert wurde, wobei 76 mg (19% Ausbeute) von 8A erhalten wurden: Schmp. 171 bis 174°C, R_f(C) = 0,40.
8A wurde über das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren in 45 %iger Ausbeute (34 mg) in 9A umgewandelt: Schmp. 180 bis 183°C, R_f(D) = 0,54.
Beispiel 4
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydrocarbonylamido)propanoyl]-L-3-(2-naphthyl)alaninmethylamid (11A)
N-[D,L-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-L-3-(2-naphthyl)alanin 10A wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aus L-3-(2-Naphthyl)alaninmethylamid und 3 hergestellt. Das Rohprodukt wurde an 60 g Kieselsäuregel in Ethylacetat:Hexan 1:1 chromatographiert, wobei 12 mg (5% Ausbeute) von 10A erhalten wurden: Schmp. 151 bis 158°C, Rf (C) = 0,69.
10A wurde wie in Beispiel 1 in 30 %iger Ausbeute (3 mg) in das Hydroxamat 11A umgewandelt: Schmp. 179 bis 181°C, R_f(D) = 0,17. MS-FAB (m/z) 400 (M⁺+H)
Beispiel 5
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophan-2-hYdroxyethylamid (13A)
Das Hydrochloridsalz von L-Tryptophan-2-hydroxyethylamid wurde hergestellt und mit 3 gekoppelt, wie es für das Hydrochloridsalz von L-Tryptophanmethylamid in Beispiel 1 beschrieben ist, außer, dass 3 mit 1,1'-Carbonyldümidazol für 20 Minuten in Methylenchlorid bei Raumtemperatur aktiviert wurde. Das Rohprodukt war ein Gemisch von 0,7 g (67% Ausbeute) der Diastereomere 12A,B: R_f(C) 12A 0,38, Rf (C) 12B 0,19.
12A wurde in Ethylacetat in 35 %iger Ausbeute (0,18 g) kristallisiert: Schmp. 161 bis 163°C, R_f(C) = 0,38.
12A wurde wie in Beispiel 1 in 35 %iger Ausbeute (62 mg) in N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophan-2-hydroxyethylamid 13A umgewandelt: R_f(D) = 0,17, Schmp. 162 bis 163°C. MS-FAB (m/z) 419 (M⁺+H).
Beispiel 6
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylylamido)propanoyl]-L-tryptophanamylamid (15A)
Das Hydrochloridsalz von L-Tryptophanamylamid wurde wie in Beispiel 1 für L-Tryptophanmethylamid beschrieben hergestellt und mit 3 umgesetzt, das mit 1,1'-Carbonyldümidazol für 20 Minuten in Dichlormethan bei Raumtemperatur aktiviert worden war. Das Gemisch der zwei Diastereomere von N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-L-tryptophanamylamid 14A,B (90% Ausbeute) wurde in seine entsprechenden Hydroxamsäuren, wie für 4A beschrieben wurde, umgewandelt. Eine langsame Eindampfung der Ethylacetatlösung führte zu 0,343 g (71%) 15A,B: Schmp. 160 bis 163°C. MS-FAB (m/z) 445 (M⁺+H).
Beispiel 7
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophanpiperidinamid (17A,B)
L-Tryptophanpiperidinamid wurde wie in Beispiel 1 mit L-Tryptophanmethylamid durchgeführt mit 3 umgesetzt, wobei 1,14 g (89% Ausbeute) N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-L-tryptophanpiperidinamid 16A,B als ein Schaum erhalten wurden; R_f(C) (16A) 0,74, (16B) 0,67.
16A,B wurde in identischer Weise zu 4A in Beispiel 1 in rohes 17A,B in 88 %iger Ausbeute (570 mg) umgewandelt: R_f(D) (17A) 0,41, (17B) 0,30. Das rohe 17A,B wurde an 180 g Kieselsäuregel in 12 % Isopropanol in Ethylacetat chromatographiert, wobei 140 mg (25% Ausbeute) von 17A,B nach Kristallisation in Ethylacetat erhalten wurden: Schmp. 169 bis 170°C. MS-FAB (m/z) 443 (M⁺+H).
Beispiel 8
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophandodecylamid (19A)
Die Umsetzung von L-Tryptophandodecylamid wurde in einer analogen, zu der für L-Tryptophanmethylamid in Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt. Dieser Ester wurde wie in Beispiel 1 beschrieben nmit 3 umgesetzt, wobei rohes N-[D,L-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanol]-L-tryptophandodecylamid 18A,B in 93 %iger Ausbeute als ein Gemisch von Isomeren 19A und 19B erhalten wurde. Dieses Gemisch wurde an 150 g Kieselsäuregel in Ethylacetat:Hexan 1:2 chromatographiert, wobei 0,62 g des Gemisches der zwei Isomeren erhalten wurden: R_f(E) 19A 0,37, R_f(E) 19B 0,29.
Eine Kristallisation durch langsame Abdampfung von Ethylacetat führte zu 0,38 g 18A, welches nach TLC und NMR-Analyse mit ungefähr 10% 18B verunreinigt war: Schmp. 133 bis 135°C. 18A wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in seine entsprechende Hydroxamsäure umgewandelt, außer, dass das Kaliumsalz von 19A aus dem alkalischen Reaktionsgemisch in 81 %iger Ausbeute (222 mg) kristallisierte. Das Kaliumsalz von 19A (54 mg) wurde in 2 ml siedendem Methanol gelöst, ein paar Tropfen Wasser wurden zugegeben und die Lösung wurde mit 0,1 N Salzsäure auf pH-Wert 6 angesäuert und mit Wasser verdünnt, wobei 50 mg (100 %o Ausbeute) von 19A erhalten wurden: Schmp. 155 bis 159°C, R_f(D) = 0,49. MS-FAB (m/z) 543 (M⁺+H).
Beispiel 9
Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophan-(S)-methylbenzylanmid (21A)
Die Umsetzung von L-Tryptophan-(S)-methylbenzylamid mit 3 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei nach Kristallisation in Ethylacetat 330 mg (51% Aubeute) N-[2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-L-tryptophan-(S)-methylbenzylamid 20A erhalten wurden: Schmp. 160 bis 162°C, R_f(C) = 0,77.
20A wurde über das identische Verfahren, das in Beispiel 1 verwendet wurde, in 38 %iger Ausbeute in das Hydroxamat 21A umgewandelt (76 mg): Schmp. 165 bis 166°C, R_f(D) = 0,73. MS-FAB (m/z) 479 (M⁺+H).
Beispiel 10
Herstellung von N-[L-2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophan(6-phenylmethoxycarbonylaminohexyl-1)amid (27A)
Zur Herstellung von 1-Amino-6-phenylmethoxycarbonylaminohexan (23) wurde ein äquimolares Gemisch (0,01 mol) von 1,6-Diaminohexan und Benzaldehyd in 25 ml Methylenchlorid für 5 Std. in der Gegenwart von 1,5 g wasserfreiem Magnesiumsulfat bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Trocknungsmittels durch Filtration wurde das Filtrat unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2 g (100% Ausbeute) rohes 1-Amino-6-phenylaminohexan 22 als ein farbloses Öl erhalten wurden; NMR (CDCl₃) 1,1 bis 1,9 (m, 10H, Hexan CH₂-2, -3, -4, -5, NH₂); 2,6 (m, 2H, CH₂-1); 3,51 (m, 2H, Hexan CH₂-6); 7,1 bis 7,8 (m, 5H, aromatisch); 8,16 (s, 1H, Imin CH). Zu einem Gemisch von 2 g (0,01 mol) von 22 und 1,4 ml (0,01 ml) Triethylamin in 20 ml Methylenchlorid wurden dann bei –5°C 1,78 g (0,01 mol) Benzylchlorformiat tropfenweise gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde für 0,5 Std. bei 0°C und für 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Methylenchlorid auf 50 ml verdünnt und mit Wasser (20 ml), 2 %iger Natriumbicarbonatlösung (20 ml), Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand in 5 ml Ethanol gelöst und 10 ml 2N Salzsäure wurden zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde für 6 Std. bei Raumtemperatur gerührt, dann unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 50 ml verdünnt und mit Ethylether (2 × 15 ml) gewaschen. Die Wasserphase wurde unter verringertem Druck abgedampft und das Produkt 23 wurde durch Kristallisation aus einem kleinen Teil Wasser mit einer Ausbeute von 42 % gereinigt; Schmp. 175 bis 178°C.
Zur Herstellung des Dipeptidanalogons (N-(L-2-Isobutyl-3-methoxycarbonyl)propanoyl-L-tryptophan (25A)) für eine Derivatisierung zu 23: Zu einem Gemisch von 1,754 g (9,32 mmol) 2-Isobutyl-3-methoxycarbonylpropionsäure 3 in 4 ml 50 % wasserfreies DMF in Methylenchlorid wurden bei Raumtemperatur 1,66 g (10,2 mmol) N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) gegeben. Nach 15 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurden 3,08 g (9,31 mmol) des Hydrochloridsalzes von L-Tryptophanbenzylester zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Ethylacetat auf 60 ml verdünnt und mit 5 %iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 15 ml), Wasser (2 × 15 ml), gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck führte zu 4,32 g (100% Ausbeute) an 24, dem Benzylester von 25 als einen farblosen Schaum, der im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Wasserstoffgas wurde für 2 Std. durch ein Gemisch von 4,32 g (9,31 mmol) von 24 und 0,5 g 10 % Palladium auf Kohle in 15 ml Methanol geleitet, während Methanol zugegeben wurde, um das Volumen des Reaktionsgemisches konstant zu halten. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit einer frischen Portion Methanol (15 ml) gewaschen und das Filtrat wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck und Trocknen des Rückstandes im Vakuum führte zu 3,08 g (88% Ausbeute) Säure 25A,B als ein Gemisch von zwei Diastereomeren in der Form eines farblosen glasartigen Feststoffes. Dieser wurde über Flash-Chromatographie (Kieselsäuregel; Ethylacetat; R_f(25A) = 0,24, R_f(25B) = 0,1) getrennt, wobei die Isomere 25A und 25B erhalten wurden.
Die Verbindung 25A wurde wie folgt in N-[L-2-Isobutyl-3-methoxycarbonylpropanoyl]-L-tryptophan(6-phenylmethoxycarbonylaminohexyl-1)amid(26A) umgewandelt. Ein Gemisch von 0,55 g (1,47 mmol) von 25A und 0,24 g (1,48 mmol) CDI in 1 ml 2% Dimethylformamid in Methylenchlorid wurde für 0,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt und 0,42 g (1,47 mmol) von 23 wurden zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Chloroform auf 50 ml verdünnt und mit 2 %iger Kaliumbisulfatlösung (2 × 10 ml), Wasser (10 ml), 5 %iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 10 ml), Wasser (2 × 10 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck führte zu 0,8 g des rohen 26A, das über Flash-Chromatographie (Kieselsäuregel; Ethylacetat/Hexan 25:5) gereinigt wurde: Ausbeute 56%; R_f(E) = 0,57.
Wenn 4A in Beispiel 1 durch das Produkt 26A ersetzt wird, führt das identische Verfahren in 46 %iger Ausbeute zur Titelverbindung 27A, welche bei 102 bis 108°C schmilzt; R_f(D) = 0,63.
Beispiel 11
Herstellung von N-[L-2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyll-L-tryptophancyclohexylamid (28A)
Wenn 23 in Beispiel 10 durch Cyclohexylamin ersetzt wird, führt das identische Verfahren in 49 %iger Ausbeute zur Titelverbindung 28A, welche bei 199 bis 203°C schmilzt; R_f(D) = 0,51.
Beispiel 12
Herstellung von N-[cis-2-(N'-hydroxycarbonylamido)cyclohexylcarbonyl]-L-tryptophanmethylamid (29A,B)
Ein Gemisch von 2 g (0,013 mol) cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in 15 ml Methanol wurde für 5 Std. unter Rückfluss gehalten, dann unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,41 g (100 % Ausbeute) cis-2-Methoxycarbonylcyclohexancarbonsäure erhalten wurden. Als 3 in Beispiel 1 durch dieses ersetzt wurde, führte das identische Verfahren in 36 %iger Ausbeute zur Titelverbindung, welche bei 140 bis 144°C schmolz; R_f(D) = 0,53, 0,47.
Beispiel 13
Herstellung von N-[trans-2-(N'-hydroxycarbonylamido)cyclohexylcarbonyl]-L-tryptophanmethylamid (30A,B)
Als cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in Beispiel 12 durch (±)-trans-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid ersetzt wurde, führte das identische Verfahren in 37 %iger Ausbeute zur Titelverbindung 30A,B, welche bei 167 bis 174°C schmolz; R_f(D) = 0,57.
Beispiel 14
Herstellung von N-[2-Isobutvl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophan (31A)
31A wurde aus 25A in Beispiel 10 in einer ähnlichen Weise zur Herstellung von 5A in Beispiel 1 in 75 %iger Ausbeute (128 mg) hergestellt und als ein Schaum aus Ethylacetat isoliert: R_f(F) = 0,55, MS-FAB (m/z) (M⁺+H). Eine kleine Probe von 31A, welche in Ethylacetat umkristallisiert wurde, hatte einen Schmelzpunkt von 116 bis 120°C.
Beispiel 15
Herstellung von N-[D,L-2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L-tryptophan(6-aminohexyl-1)amid (32A)
Ein Gemisch von 0,5 g (8,24 mmol) von 26A in 0,4 ml 2N Kaliumhydroxid in Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 15 ml verdünnt und mit 1N Salzsäure auf pH-Wert = 2 angesäuert. Die rohe freie Säure von 26A wurde in Ethylacetat (3 × 15 ml) aufgenommen und die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,45 g (92% Ausbeute) von 26A als ein farbloser Schaum erhalten wurden.
Wasserstoffgas wurde durch ein Gemisch von 0,395 g (6,6 mmol) der freien Säure von 26A in 15 ml Methanol in der Gegenwart von 0,12 g 10% Palladium auf Kohle für 2 Std. bei Raumtemperatur geleitet. Der Katalysator wurde abfiltriert, mit Ethanol gewaschen (2 × 20 ml) und das Filtrat wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 0,3 g (92 % Ausbeute) der Titelverbindung 32A als ein farbloser Schaum erhalten wurden; R_f(G) = 0,08.
Beispiel 16
Herstellung von N[-N-(2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L-tryptophanyl]g-lycin (34A,B)
Die Umsetzung von L-Tryptophanylglycinmethylester mit Säure 3, welche wie für 25A beschrieben durchgeführt wurde, führte in 87 %iger Ausbeute zu rohem N-[N-(D,L-2-Isobutyl-3-methoxycarbonylpropanoyl)-L-tryptophanyl]glycinmethylester 33 als ein Gemisch der Diastereomere 33A und 33B. Die Isomere 33A und 33B wurden über Flash-Chromatographie (Kieselsäuregel; Ethylacetat) getrennt. Isomer 33A Schmp. = 154 bis 155°C; R_f(C) = 0,46.
Die Ester 33A,B wurden über Verseifung mit zwei Äquivalent methanolischem Kaliumhydroxid wie für 25A beschrieben in die freien Säuren 34A,B umgewandelt. Isomer 34A, Ausbeute 92%; Schmp. 96 bis 102°C; R_f(G) = 0,31.
Isomer 34B, Ausbeute 93 %; Schmp. = 99 bis 105°C; R_f(G) = 0,25.
Beispiel 17
Herstellung von N-(cis-2-Carboxycyclohexylcarbonyl)-L-tryptophanmethylamid (35)
Zu einem Gemisch von 0,281 g (1,82 mmol) cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid und 0,47 g des Hydrochloridsalzes von L-Trp-NHMe in 0,5 ml Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur 0,51 ml Triethylamin zugegeben. Nach 2 Std. Rühren wurde das erhaltene Gemisch mit Wasser auf 10 ml verdünnt und 25 ml Ethylacetat wurde zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit 10 %iger Kaliumbisulfatlösung auf pH-Wert = 2 angesäuert und die organische Phase wurde mit Wasser (2 × 15 ml), gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Titelverbindung 35 wurde über Kristallisation in einem Gemisch von Ethylacetat/Hexan gereinigt. Ausbeute 48%; Schmp. = 105 bis 112°C; R_f(G) = 0,65, 0,61.
Beispiel 18
Herstellung von N-(tans-2-Carboxyclohexylcarbonyl)-L-tryptophaninethylamid (36)
Wenn cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in Beispiel 17 durch (±)-trans-l,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid ersetzt wird, führt das identische Verfahren in 56 %iger Ausbeute zur Titelverbindung 36: Schmp. 167 bis 174°C; R_f(G) = 0,67, 0,61.
Beispiel 19
Herstellung von N-[2-Isobut (N'-acetoxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryptophanmethylamid (37A)
Zu 97,5 mg (0,25 mmol) von 5A (Beispiel 1) in 0,5 ml Dimethylformamid wurden 25,5 mg (0,25 mmol) Essigsäureanhydrid und 37 mg (0,25 mmol) 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) bei Raumtemperatur gegeben. Nach Stehen über Nacht wurde unter hohem Vakuum das DMF abgedampft und der Rückstand wurde in einem Gemisch von gleichen Volumina an Ethylacetat und 2 %iger Kaliumbisulfatlösung aufgenommen. Die Ethylacetatschicht wurde mit 2 %iger Kaliumbisulfatlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei ein Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde in einem 1:1 Gemisch von heißem Ethylacetat:Hexan gelöst, was durch Stehen bei Raumtemperatur zu 71 mg (66% Ausbeute) an festem Produkt 37A führte: Schmp. = 184 bis 186°C; R_fG) = 0,68.
Beispiel 20
Herstellung von N-[Isobutyl-3-(N'-benzoxycarbonylamido)propanoyl]-L-tryutophanmethylamid (38A)
Zu 30,5 mg (0,25 mmol) Benzoesäure in 1 ml Tetrahydrofuran wurden 40,5 mg (0,25 mmol) Carbonyldiimidazol gegeben. Nach 10 Minuten wurden 97 mg (0,25 mmol) von Verbindung 5A von Beispiel 1 in 1 ml Dimethylformamid zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das Reaktionsgemisch unter hohem Vakuum zur Trockene eingedampft und in einem Gemisch an gleichen Volumina von Ethylacetat und Wasser gelöst. Die Ethylacetatschicht wurde mit 5 %iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 2 %iger Natriumbisulfatlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Eindampfen der Ethylacetatschicht auf ein kleines Volumen führte zu 50 mg (41%) der Titelverbindung 38A: Schmp. = 187 bis 187,5°C; Fr(G) = 0,54.
Beispiel 21
Durch Anwendung der vorstehend dargelegten Verfahren werden die folgenden Verbindungen der Erfindung synthetisiert:

HONHCOCH₂CH(n-Hexyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(n-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(i-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHMe;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH₃;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH_ZOH;
HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHcyclohexyl;
McONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt;
EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt;
MeONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt und
EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt;

Beispiel 22
Assay der Inhibierungsaktivität
Die Inhibitoren wurden an roher und gereinigter Fibroblastcollagenase menschlicher Haut unter Verwendung des synthetischen Thiolestersubstrats bei pH-Wert 6,5 in einem Assay untersucht, genau so wie es von Kortylewicz & Galardy, J Med Chem (1990) 33: 263 bis 273 beschrieben wird. Die Collagenasekonzentration betrug 1 bis 2 nM. Die Verbindungen der Beispiele 1 bis 18 wurden in diesem Assay auf ihre Fähigkeit, rohe Collagenase und Gelatinase von Fibroblasten menschlicher Haut, rohe Collagenase und Gelatinase aus eitrigem menschlichem Sputum zu inhibieren, getestet. Die Ergebnisse bezüglich der rohen Enzymzubereitung sind in Tabelle 1 gezeigt. Der K_i-Wert von 5A für gereinigte Collagenase menschlicher Haut beträgt 0,4 nM. Assays für Inhibierung von humanem Stromelysin werden wie von Teahan, J., et al., Biochemistry (1989) 20: 8497 bis 8501 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 21
Vorbeugung von Korneaulzeration auf der mit Alkali verbrannten Kaninchenkornea Die Fähigkeit der Verbindungen der Erfindung, einer Ulzeration vorzubeugen, wurde über einen Korneaassay bestätigt, der von Gregory Schultz, University of Florida, Gainesville, FL durchgeführt wurde.
Zwanzig Kaninchenaugen wurden für 60 Sekunden mit 1N NaOH in einem Durchmesser von 10 mm verbrannt. Die zehn Augen für die Kontrolle wurden alle zwei Stunden von 8.00 bis 18.00 Uhr mit zwei Tropfen hypotonischem Puffer und dann mit einer subkonjunktivalen Injektion von 0,5 ml Puffer am Abend behandelt. Die Augen für die Untersuchung wurden in identischer Weise behandelt, aber mit 400 μg pro ml Inhibitor in Puffer. Die Augen wurden klinisch bewertet, wobei 0 für keine Ulzeration steht und 5 einer Perforation der Kornea entspricht. 1 zeigt eine durchschnittliche klinische Bewertung über 26 Tage. Die Verbindung 5A zeigt einen ausgeprägten Schutz der Kornea vor Perforation. 2 zeigt den Prozentanteil der Korneae, welche über 26 Tage nicht perforiert wurden; Verbindung 5A zeigt 100 %igen Schutz.
Im Folgenden wird eine histologische Untersuchung der behandelten und unbehandelten Korneae gezeigt:
Senkrechte Schnitte durch die Korneae von Kaninchen wurden 28 Tage nach ernsthaften Alkaliverletzungen, welche durch Einwirken von 2N Natriumhydroxid auf Korneae von anästhesierten Kaninchen für 60 Sekunden in einer Vertiefung mit 12,5 mm Durchmesser hervorgerufen wurden, untersucht. Nach der Verletzung wurden die Kaninchen topisch mit 2 Tropfen jede Stunde zwischen 8.00 und 18.00 Uhr behandelt, gefolgt von einer subkonjunktivalen Injektion von 0,5 ml Collagenaseinhibitor der Formel 5A oder Vehikel (50 mM Hepes, Antibiotika).
Die Kornea eines mit Collagenaseinhibitor behandelten Kaninchens zeigt Lamellen, deren Wiederaufbau mit Keratocyten, welche höchstwahrscheinlich aus der nicht verletzten peripheren Korea und Sklera eingewandert sind, eingesetzt hat. Das Stroma enthält auch einige Entzündungszellen, wahrscheinlich Makrophagen, welche in die verletzte Kornea eingewandert sind. Es liegen wenige Beweise für ein Auseinanderreißen der extrazellulären Matrix der Stromalamellen vor und es gibt keinen Beweis für eine wesentliche Zerstörung der extrazellulären Matrix. Das Epithel in diesem Schnitt hat die Kornea wieder bedeckt, obwohl das Epithel schwach angefügt ist, wie durch die Trennung der Schnitte des Epithels vom darunterliegenden Stroma bewiesen wird. Es gibt keinen Beweis für eine Revaskularisierung dieses Teils der Kornea. Die Endotheloberfläche hat sich nicht wieder gebildet und die Descemet-Membran hat sich vom Stroma in einer trüben Kornea abgetrennt, welcher es an fortdauernder und vollständiger Epithelneubildung mangelt und bei welcher keine wesentliche Stromaulzeration auftritt.
Nur mit Vehikel behandelte Kornea zeigt ein vorherrschendes Auftreten eines umfangreichen Abbaus der Stromamatrix und das Vorhandensein von starken Entzündungszelleninfiltraten. Diese Entzündungszellen sind höchstwahrscheinlich Makrophagen und Neutrophile. Die Stromalamellen haben in diesem Schnitt ungefähr zwei Drittel der Gesamttiefe des Stromas aufgelöst und in benachbarten Schnitten fand eine Abtragung der Descemet-Membran statt. Das Stroma scheint an der Kante eine abgenutzte Erscheinung aufzuweisen, wo die Entzündungszelleninfiltration am stärksten ist. Durch das Stroma verlaufende Bruchlinien weisen auf eine allgemeine Schwächung der extrazellulären Matrix hin. In diesem Schnitt der Kornea gibt es keinen Beweis für Revaskularisierung, Epithelzellen oder Endothelzellen. Fragmente von Endothelzellen sind zusammen mit Entzündungszellen auf der Descemet-Membran im Fluid der vorderen Augenkammer vorhanden. Wenn überhaupt, können wenige Keratocyten im Stroma identifiziert werden. Dieser mikroskopische Schnitt stimmt im Allgemeinen mit den Ergebnissen von Spaltlampenmikroskopie, welche daraufhinweisen, dass auf der Kornea eine umfangreiche Ulzeration und eine periphere Revaskularisierung stattfinden, überein.
Insgesamt weist die Histopathologie dieser zwei Schnitte darauf hin, dass eine Hauptwirkung des Collagenaseinhibitors bei der Vorbeugung von Ulzeration auf einer Verringerung der Entzündungszelleninfiltration in die mit Alkali verletzte Kornea beruht. Zudem weist dieser Schnitt darauf hin, dass ein Wiederaufbau des Stroma in den mit Collagenaseinhibitor behandelten Korneae eingesetzt hat und dass ohne eine Neubildung des Endothels eine unvollständige Epithelneubildung transienter Natur auf der Epitheloberfläche eingesetzt hat.

Claims

Verbindung, welche mindestens eine Matrixmetallprotease bei Säugern inhibiert, wobei die Verbindung die Formel:
aufweist, wobei R¹ jeweils unabhängig H oder Alkyl (1–8C) ist und R2 Alkyl (1–8C) ist, oder wobei die nahegelegenen Reste R1 und R2 zusammengenommen eine Gruppe -(CH₂)_p-, wobei p = 3 bis 5, sind; R³ die Bedeutung H oder Alkyl (1–4C) hat; R⁴ ein kondensierter oder konjugierter unsubstituierter oder substituierter Bicycloarylmethylenrest ist, wobei das bicyclische System Naphtyl, Indolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Biphenyl, 4-Phenylpyrimidyl oder 3-Phenylpyrimidyl ist und die Substituenten 1 bis 2 Alkylreste (1–4C) und/oder Hydroxy sind, oder ein beliebiges Ringstickstoffatom C1–5 acyliert sein kann; n gleich 0, 1 oder 2 ist; m gleich 0 oder 1 ist; und X die Bedeutung OR⁵ oder NHR⁵ hat, wobei RS die Bedeutung H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1–12C), Ary1 (6–12C), Arylalkyl (6–16C), wobei die Substituenten Hydroxyl, Phenylmethoxycarbamyl oder eine Aminogruppe sind, hat; oder X ein Aminosäurerest oder ein Amid davon ist; oder X ein Piperidin- oder Morpholinrest ist; und wobei R6 die Bedeutung H oder Niederallcyl (1–4C) hat und R⁷ die Bedeutung H, Niederalkyl (1–4C) oder Acylgruppe ist; und wobei CONR3 gegebenenfalls eine derartig modifizierte Form aufweist, dass anstatt der Funktionalität -CONR³- die Verbindung stattdessen eine Einheit, ausgewählt aus -CH₂NR³-, -COCHR³-, -CH(OH)NR³-, -CH(OH)CHR³-, -CSCHR³-, -CH=CR³-, -CF=CR³ und -NR³CO-, aufweist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R³ die Bedeutung H hat und/oder R⁷ und R⁶ die Bedeutung H haben, und/oder R¹ die Bedeutung H hat und/oder R2 die Bedeutung Alkyl (3–8C) hat und/oder X die Bedeutung NHR⁵ oder der Rest aus einem cyclischen Amin oder heterocyclischen Amin ist, und/oder R⁴ ausgewählt ist aus 1-(2-Methylnaphtyl)methylen; 1-Chinolylmethylen; 1-Naphtylmethylen; 2-Naphtylmethylen; 1-Isochinolylmethylen; 3-Isochinolylmethylen; 3-Thionaphthenylmethylen; 3-Cumaronylmethylen; 3-(5-Methylindolyl)methylen; 3-(5-Hydroxyindolyl)methylen; 3-(2-Hydroxyindolyl)methylen; Biphenylmethylen; (3-Indolyl)methylen und 4-Phenylpyrimidylmethylen, und substituierte Formen davon.
Verbindung gemäß Anspruch 2, wobei X die Bedeutung NHR5 hat und wobei RS die Bedeutung Alkyl (1–4C); substituierter Alkylrest (1–4C substituiert mit einer Hydroxylgruppe); Arylalkyl oder substituierter Alkylrest (2–7C substituiert mit Phenylmethoxycarbonylamido) hat, und/oder R2 die Bedeutung Isobutyl, 2-Methylbutyl oder Isopropyl hat, und/oder R4 die Bedeutung (3-Indolyl)methylen oder dessen N-acylierte (1–5C) substituierte Form ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus: HONHCOCH₂CH(n-Hexyl)-CO-L-Trp-NHMe; HONHCOCH₂CH(n-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe; HONHCOCH₂CH(i-Pentyl)-CO-L-Trp-NHMe; HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHMe; HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH₃; HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHCH₂CH₂OH; HONHCOCH₂CH(Ethyl)-CO-L-Trp-NHcyclohexyl; McONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt; EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Trp-NHEt; McONHCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt; EtONMeCOCH₂CH(iBu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)-NHEt; HONHCOCH_ZCH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-N-McTrp-NHMe; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₂OH; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(S)CHMePh; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₆NH-CBZ; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Ala(2-naphthyl)NHMe; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₄CH₃; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-piperidin; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NH(CH₂)₁₁ CH₃; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHcyclohexyl; HONHCOCH₂CH(i-Bu)-L-Trp-OH; HONMeCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; HONEtCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; CH₃OOONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; Φ COONHCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; CH₃OOONMeCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe; und Φ COONEtCOCH₂CH(i-Bu)-CO-L-Trp-NHMe.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welche an eine Einheit mit einer radioaktiven Markierung, einen antigenneutralen Träger, einen Zielliganden oder einen festen Träger konjugiert ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei -CONR³ eine modifizierte isosterische Form wie in Anspruch 1 definiert aufweist.
Arzneimittel, welches bei der Behandlung von Zuständen, die durch ungewollte Matrixmetallproteaseaktivität gekennzeichnet sind, wirksam ist, wobei die Zusammensetzung eine Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst, die wirksam ist, die Matrixmetallproteaseaktivität zu inhibieren, im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Arzneimittel davon, um die Matrixmetallproteaseaktivität zu inhibieren, um Zustände zu behandeln, die durch ungewollte Matrixmetallproteaseaktivität gekennzeichnet sind, wobei dieser Zustand ausgewählt ist aus Magengeschwüren, oberflächlichen Wunden, Epidermolysis Bullosa, Hautkrebs, Pemphigus, septischem Schock und ARDS.
Verfahren zum Inhibieren von Matrixmetallproteaseaktivität in vitro oder in Zellkulturen, wobei das Verfahren das Kontaktieren der zu inhibierenden Matrixmetallprotease mit einer wirksamen Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Antikörperzubereitung, die mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 spezifisch immunreaktiv ist.
Verfahren zum Bestimmen des Levels einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Probe mit einer Antikörperzubereitung, die mit der Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 spezifisch immunreaktiv ist, unter Bedingungen, unter denen die Antikörper mit der Verbindung, falls vorhanden, komplexieren und das Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Komplexes umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1) oder (2) gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren das Behandeln einer Verbindung der Formel

oder einer aktivierten Form davon; wobei R die Bedeutung H oder Alkyl (1–6C) hat und die übrigen Substituenten wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einer Menge von substituiertem oder unsubstituiertem Hydroxylamin unter Bedingungen, die zur Umwandlung der Verbindungen der Formeln (3) und (4) in die Verbindungen der Formeln (1) bzw. (2) wirksam sind, und das Isolieren der Verbindung der Formel (1) oder (2) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei -CONR³ eine modifizierte isosterische Form wie in Anspruch 1 definiert aufweist.
Verbindung der Formel
wobei die Substituenten wie in den Ansprüchen 1 und 12 definiert sind.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1) oder (2) gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren das Behandeln einer Verbindung der Formel
wobei die Substituenten wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einem Alkylierungsmittel umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei -CONR³ eine modifizierte isosterische Form wie in Anspruch 1 definiert aufweist.