DE69125489T2

DE69125489T2 - Verwendung von derivaten durch menschliches gallensalz stimulierter lipase zur herstellung von medikamenten

Info

Publication number: DE69125489T2
Application number: DE69125489T
Authority: DE
Inventors: Gunnar Bjursell; Lars Blaeckberg; Peter Carlsson; Sven Enerbaeck; Olle Hernell; Jeanette Nilsson; Thomas Olivecrona
Original assignee: Astra AB
Current assignee: Arexis AB
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-30
Publication date: 1997-08-14
Anticipated expiration: 2011-05-31
Also published as: YU95191A; RU2140983C1; CN1326782A; IS1751B; PT97836A; EP0535048B1; AU651979B2; KR100212411B1; CN1075113C; EP0535048A1; TW221712B; NO924528D0; ZA913778B; DE69125489D1; SE9001985D0; DK0535048T3; SK164491A3; LT4020B; IE911844A1; HK62497A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Enzyms, das u.a. als humane Gallensalz-stimulierte Lipase bekannt ist, zur Erzeugung eines Medikaments zur Behandlung eines mit exokriner Pankreas-Insuffizienz verbundenen pathologischen Zustandes.

Hintergrund der Erfindung

Die menschliche milchabsondernde Brustdrüse synthetisiert und sekretiert mit der Milch eine Gallensalz-stimulierte Lipase (bile salt-stimulated lipase, BSSL) [1], die nach spezieller Aktivierung durch Primärgallensalze [2, 57, 58] zur endogenen Fähigkeit der intestinalen Fettverdauung [3-5] eines mit Muttermilch genährten Kleinkindes beiträgt. Dieses Enzym, das etwa 1% des gesamten Milchproteins (6) ausmacht, ist eine unspezifische Lipase; in vitro hydrolysiert sie nicht nur Tri-, Di- und Monoacylglycerine, sondern auch Cholesteryl- und Retinylester und Lysophosphatidylglycerine (7-10). Weiters ist ihre Aktivität nicht auf emulgierte Substrate beschränkt, sondern es werden mizellare und lösliche Substrate mit ähnlichen Raten (11) hydrolysiert.
BSSL wird, während sie mit der Milch den Magen durchläuft, nicht abgebaut, und im Inhalt des Zwölffingerdames wird sie durch Gallensalze vor einer Inaktivierung durch pankreatische Proteasen, wie Trypsin und Chymotrypsin [2, 11] geschützt. Sie wird jedoch inaktiviert, wenn die Milch pasteurisiert wird, z.B. 30 min lang auf 62,5ºC erhitzt wird [12]. Modellversuche in vitro deuten darauf hin, daß die Endprodukte der Triacylglycerinverdauung in Anwesenheit von BSSL anders sind [5, 7]. Infolge niedrigerer intraluminaler Gallensalzkonzentrationen während der neonatalen Periode [13, 14] kann dies für die Produktabsorption günstig sein [5, 15].
Die Carbonsäureesterhydrolase (CEH) von humanem Pankreassaft [16] scheint funktional identisch oder zumindest sehr ähnlich wie BSSL zu sein [8]. Sie haben auch gemeinsame Epitope [8, 17], sie haben identische N-terminale Aminosäuresequenzen [17] und werden durch Inhibitoren von Serinesterasen, z.B. Eserin und Diisopropylfluorophosphat [6, 8, 16] inhibiert. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die beiden Enzyme Produkte desselben Gens sind [18, 19]. Der beobachtete molekulare Größenunterschied [8, 19] könnte durch verschiedene Glycosylierungsmuster erklärt werden, wie kürzlich vorgeschlagen [17] wurde.
Diätetische Lipide sind eine wichtige Energiequelle. Die energiereichen Triacylclycerine machen mehr als 95% dieser Lipide aus. Einige der Lipide, z.B. bestimmte Fettsäuren und die fettlöslichen Vitamine, sind wesentliche diätetische Bestandteile. Vor der gastrointestinalen Absorption benötigen die Triacylglycerine sowie die geringeren Bestandteile, d.h. veresterte fettlösliche Vitamine und Cholesterin, und Diacylphosphatidylglycerine eine Hydrolyse der Esterbindungen, um weniger hydrophobe, absorbierbare Produkte zu ergeben. Diese Umsetzungen werden durch eine spezifische Gruppe von Enzymen, genannt Lipasen, katalysiert. Beim erwachsenen Menschen nimmt man an, daß die involvierten essentiellen Lipasen gastrische Lipase, pankreatische Colipase-abhängige Lipase (Tri- und Diacylglycerinhydrolyse), pankreatische Phospholipase A2 (Diacylphosphatidylglycerine) und Carbonsäureesterhydrolase (cholesteryl- und fettlösliche Vitaminester) sind. Beim mit Muttermilch genährten Neugeborenen spielt die Gallensalz-stimulierte Lipase eine wesentliche Rolle bei der Hydrolyse mehrerer der oben erwähnten Lipide. Zusammen mit Gallensalzen bilden die Produkte des Lipidverdaus gemischte Mizellen, von welchen die Absoption stattfindet (3-5).
Allgemeine Gründe für eine Lipid-Malabsorption und daher fehlerhafte Ernährung, sind verringerte intraluminale Spiegel von pankreatischer Colipase-abhängiger Lipase und/oder Gallensalzen. Typische Beispiele für einen solchen Lipasemangel sind Patienten, die an zystischer Fibrose leiden, einem häufigen genetischen Defekt, der zu einem lebenslangen Mangel bei etwa 80% der Patienten führt, und chronischer Pankreatitis, die oft eine Folge von chronischem Alkoholismus ist.
Die Pankreas- und Leberfunktionen sind bei der Geburt nicht vollständig entwickelt, was bei Frühgeborenen am meisten augenscheinlich ist. Die Malabsorption von Fett ist aus physiologischen Gründen häufig zu finden, und man nimmt an, daß sie ein Ergebnis von niedrigen intraluminalen pakreatischen Colipaseabhängigen Lipase- und Gallensalzkonzentrationen ist (3, 4, 13- 15). Aufgrund von BSSL ist jedoch eine solche Malabsorption bei mit Muttermilch genährten Kleinkindern viel weniger häufig als bei Kleinkindern, die mit pasteurisierter Menschenmilch aus Milchzusammensetzungen für Kleinkinder ernährt werden (3-5, 12, 59, 60, 61). Dies ist ein Grund dafür, daß dafür geworben wurde, daß Neugeborene, insbesondere Frühgeburten, die nicht mit der Milch ihrer eigenen Mütter ernährt werden können, mit unpasteurisierter Milch anderer Mütter ernährt werden sollten (12).
Die derzeitige Behandlung von Patienten, die an einem pankreatischen Lipasemangel leiden, ist die orale Verabreichung sehr hoher Dosen eines rohen Präparats von Schweine-Pankreasenzymen. Colipase-abhängige pankreatische Lipase wird durch einen niedrigen pH-Wert inaktiviert. Solche Bedingungen herrschen im Magen vor, woraus sich ergibt, daß oral verabreichte pankreatische Lipase bei der Passage des Magens zum Darm hin praktisch vollständig inaktiviert wird. Deshalb kann diese Wirkung durch die Verwendung hoher Enzymdosen nicht vollständig überwunden werden. Die verabreichten hohen Dosen sind für die meisten Patienten unangemessen, und die Präparate sind unrein und schmecken schlecht. Es wurden bestimmte Tabletten formuliert, die die Säurezonen des Magens passieren und das Enzym erst im relativ alkalischen Milieu des Jejunums abgeben. Viele Patienten, die an Bauchspeicheldrüsenerkrankungen leiden, haben jedoch ein abnorm saures Jejunum, und es kann passieren, daß solche Tabletten das Enzym nicht abgeben und daher unwirksam sind. Außerdem besteht, da die derzeit auf dem Markt befindlichen Präparate nicht-menschlichen Ursprungs sind, das Risiko von Immunreaktionen, die den Patienten schaden können oder zu einer Verringerung der Wirksamkeit der Therapie führen.
Ein weiterer Nachteil der derzeitigen Präparate ist, daß andere darin enthaltene lipolytische Aktivitäten, abgesehen von Colipase-abhängiger Lipase, nicht angegeben sind. Tatsächlich enthalten die meisten davon sehr geringgradige CEH/BSSL-Aktivität. Dies kann ein Grund dafür sein, warum viele an cystischer Fibrose leidende Patienten trotz einer Ersatztherapie an einem Mangel an fettlöslichen Vitaminen und essentiellen Fettsäuren leiden.
Es besteht daher ein großer Bedarf an Produkten mit Eigenschaften und einer Struktur, die von Humanlipasen stammen und mit breiter Substratspezifität, welche Produkte oral an Patienten, die an einem Mangel an einem oder mehreren der pankreatischen lipolytischen Enzyme leiden, verabreicht werden können. Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Produkte erfüllen diese Notwendigkeit selbst oder in Verbindung mit anderen Lipasen oder in Verbindung mit andere Lipasen enthaltenden Präparaten. Weiters besteht für einige menschliche Kleinkinder ein offensichtlicher Bedarf an einer Verbesserung der Fettausnützung aus herkömmlichen Milchzusammensetzungen für Kleinkinder oder pasteurisierter Menschenmilch aus sogenannten Milchbanken. BSSL besitzt mehrere einmalige Eigenschaften, die sie zur Substitutions- und Ergänzungstherapie ideal geeignet machen: Von Natur aus ist sie für die orale Verabreichung ausgelegt. Daher hält sie die Passage durch den Magen aus und wird im Inhalt des Dünndarms aktiviert. Ihr spezieller Aktivierungsmechanismus sollte eine gefährliche Lipolyse von Nahrungs- oder Gewebslipiden während der Lagerung und der Passage zu ihrem Wirkungsort verhindern. Infolge ihrer breiten Substratspezifität hat sie das Potential, eigenständig die völlige Verdauung der meisten diätetischen Lipide, inklusive der fettlöslichen Vitaminester, zu vermitteln. BSSL kann pankreatischer Colipaseabhängiger Lipase zur Hydrolyse von Esterbindungen enthaltenden langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren überlegen sein. In Anwesenheit von gastrischer Lipase und in Abwesenheit oder bei geringen Mengen von Colipase-abhängiger Lipase kann BSSL eine vollständige Triacylglycerin-Verdauung in vitro sicherstellen, selbst wenn die Gallensalzspiegel gering sind, wie dies bei Neugeborenen der Fall ist. In Anwesenheit von BSSL werden die Endprodukte der Triacylglycerin-Verdauung freie Fettsäuren und freies Glycerin, anstatt durch die anderen beiden Lipasen (5) erzeugte freie Fettsäuren und Monoacylglycerin. Dies kann sich auf die Produktabsorption günstig auswirken, insbesondere wenn die intraluminalen Gallensalzspiegel niedrig sind (3, 15). Vom geschichtlichen Standpunkt aus betrachtet wurden Milchzusammensetzungen für Kleinkinder von der Vorstellung ausgehend entwickelt und verbessert, daß ihre Zusammensetzung derjenigen von Menschenmilch so ähnlich wie möglich sein sollte. Die Ergänzung solcher Milchzusammensetzungen ist erwünscht.
Die Verwendung von Gallensalz-stimulierten Lipasen (BSSL) oder von Proteinen mit den wesentlichen Funktionen von BSSL, für Ergänzungs-, Substitutions- oder Therapiezwecke erfordert aber den Zugang zu Mengen des Produkts in großtechnischem Umfang. In fabriksmäßigem Umfang ist es jedoch nicht möglich, sich auf natürliche Quellen, wie Milch, als Ausgangsmaterial zu stützen. Abgesehen vom oben erwähnten Problem mit der Inaktivierung von BSSL während des Pasteurisierens besteht das zusätzliche Risiko der Verunreinigung eines aus natürlichen Quellen stammenden Materials mit infektiösen Agentien, z.B. Viren, wie HIV und CMV. Dementsprechend besteht ein Bedarf an einem Zugang in großtechnischem Umfang zu Produkten mit BSSL-Eigenschaften.
Hinweise zum Stand der Technik sind später in dieser Beschreibung angeführt.

Die Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Klonen von für BSSL codierender cDNA, die aus der menschlichen Brustdrüse stammt. Aus humaner Pankreas haben wir auch eine partielle cDNA isoliert, die für CEH codiert. Abgeleitete Aminosäuresequenzen von den humanen cDNAs und der Vergleich mit CEH von anderen Spezies bestärken die Interpretation, daß BSSL und CEH identisch sind.
Wie nachstehend genauer ausgeführt, wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Struktur des Proteins, wie sie von der cDNA abgeleitet ist, sich von der Struktur anderer Lipasen sehr unterscheidet. Es zeigte sich, daß die Struktur unerwarteterweise eher der Struktur typischer Esterasen, wie Cholinesterase, entspricht.
Unter Bezugnahme auf Fig. II. und Fig. VII sind erfindungsgemäß zu verwendende Produkte:
a) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-722 in Fig. VII definiert,
b) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-535 in Fig. VII definiert,
c) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-278 in Fig. VII definiert,
d) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-341 in Fig. VII definiert,
e) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-409 in Fig. VII definiert,
f) ein Protein, wie durch die Aminosäuresequenz 1-474 in Fig. VII definiert,
g) Kombinationen von unter b) - f) definierten Proteinen, beispielsweise wie durch die Aminosäuresequenz in den Positionen 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 und 536-722 definiert,
h) Kombinationen von unter b) - g) definierten Proteinen in Verbindung mit einer oder mehreren Sequenzwiederholungen gemäß Fig. V,
i) ein Protein, wie unter a) - h) definiert, das eine zusätzliche, N-terminale Aminosäure, nämlich Methionin, und funktionell äquivalente Varianten und Mutanten des Proteins, wie in a) - i) voranstehend definiert, besitzt.
Es sei bemerkt, daß die oben unter a, b, c, d, e, f, h und i) angeführten Proteine nicht in jeder Hinsicht mit natürlich vorkommender BSSL identisch sein werden, sie werden jedoch eine oder mehrere der kritischen Funktionen von natürlich vorkommender BSSL aufweisen. Kritische Funktionen sind nachstehend angeführt:
j) eine DNA-Sequenz, die für die voranstehend unter a, b, c, d, e, f, h und i definierten Proteine codiert;
k) eine DNA-Sequenz gemäß Fig. II, die durch die folgenden Nucleotid-Zahlen in Fig. II definiert ist:
a) eine DNA-Sequenz 151-2316 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-722 in Fig. VII definierte Protein codiert,
b) eine DNA-Sequenz 151-1755 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-535 in Fig. VII definierte Protein codiert,
c) eine DNA-Sequenz 151-985 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-278 in Fig. VII definierte Protein codiert,
d) eine DNA-Sequenz 151-1172 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-341 in Fig. VII definierte Protein codiert,
e) eine DNA-Sequenz 151-1376 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-409 in Fig. VII definierte Protein codiert,
f) eine DNA-Sequenz 151-1574 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 1-474 in Fig. VII definierte Protein codiert,
g) eine DNA-Sequenz 986-1172 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 279-341 in Fig. VII definierte Protein codiert,
h) eine DNA-Sequenz 986-1376 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 279-409 in Fig. VII definierte Protein codiert,
i) eine DNA-Sequenz 986-1574 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 279-474 in Fig. VII definierte Protein codiert,
j) eine DNA-Sequenz 1173-1376 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 342-409 in Fig. VII definierte Protein codiert,
k) eine DNA-Sequenz 1173-1574 gemäß Fig. II, die für das durch die Aminosäuresequenz 342-474 in Fig. VII definierte Protein codiert.
Wichtige Funktionen für erfindungsgemäß zu verwendende Proteine sind:
a) Eignung zur oralen Verabreichung;
b) Aktivierung durch spezifische Gallensalze;
c) Wirkung als unspezifische Lipase im Inhalt des Dünndarms, die Lipide relativ unabhängig von ihrer chemischen Struktur und ihrem physikalischen Zustand (emulgiert, mizellar, löslich) hydrolysieren kann;
d) Fähigkeit, Triacylglycerine mit Fettsäuren verschiedener Kettenlänge und verschiedenem Unsättigungsgrad zu hydrolysieren;
e) Fähigkeit, auch Diacylglycerin, Monoacylglycerin, Cholesterylester, Lysophosphatidylacylglycerin und Retinyl und andere fettlösliche Vitamin-Ester zu hydrolysieren;
f) Fähigkeit, nicht nur die sn-1(3)-Esterbindungen in einem Triacylglycerin zu lösen, sondern auch die sn-2-Esterbindung;
g) Fähigkeit zur Interaktion nicht nur mit primären, sondern auch mit sekundären Gallensalzen;
h) Abhängigkeit von Gallensalzen für optimale Aktivität;
i) Stabilität, so daß der Mageninhalt die katalytische Effizienz nicht in wesentlichem Maß beeinträchtigt;
j) Stabilität gegenüber Inaktivierung durch pankreatische Proteasen, z.B. Trypsin, vorausgesetzt, Gallensalze sind anwesend;
k) Fähigkeit zur Bindung von Heparin und Heparinderivaten, z.B. Heparinsulfat;
l) Fähigkeit zur Bindung an Lipid-Wasser-Interphasen;
m) Stabilität, um eine Lyophilisierung zu gestatten;
n) Stabilität bei Mischung mit Nahrungsmittelbestandteilen, wie in Menschenmilch oder einer Milchzusammensetzung.
Die kritischen Funktionen für Ergänzungs-, Substitutions- oder Therapiezwecke sind die gemäß a), c), d), e), f), i), j) und l). Für andere Zwecke müssen nicht alle kritischen Funktionen notwendig sein.
Zur Expression der oben angeführten Proteine wird die oben angeführte, passende DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor inseriert, welcher dann in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt wird. Dieser Vektor muß auch passende Signal- und andere Sequenzen aufweisen, die es dem Organismus ermöglichen, das gewünschte Protein zu exprimieren.

Geeignete Expressionsorganismen:

Mit den rekombinanten DNA-Techniken ist es möglich, ein Protein, an dem Interesse besteht, in einer Vielfalt von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtsorganismen zu klonieren und zu exprimieren. Mögliche Expressionsorganismen sind Bakterien, einfache Eukaryonten (Hefe), Tierzellkulturen, Insektenzellkulturen, Pflanzenzellkulturen, Pflanzen und transgene Tiere. Jedes einzelne System hat seine eigenen besonderen Vorteile und Nachteile. Die einfache Schlußfolgerung ist, daß jedes zu exprimierende Gen ein besonderes Problem darstellt und keine Standardlösung zur Verfügung steht.
Allgemein verwendete Bakteriensysteme sind E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces. Allgemein verwendete Hefen sind Saccharomyces und Pichia pastoris. Allgemein verwendete Tierzellen sind CHO-Zellen und COS-Zellen. Allgemein verwendete Insektenzellkulturen sind von Drosophila stammende Zellen.
Eine allgemein verwendete Pflanze ist die Tabakpflanze.
Mögliche transgene Tiere sind Ziege und Kuh.
Mögliche bakterielle Vektoren sind pUC- und Protein A-Vektoren.
Ein mölgicher Hefevektor ist pMA 91.
Mögliche Insektenvektoren stammen vom Baculo-Virus.
Mögliche Tierzellvektoren stammen von SV/40. Mögliche Pflanzenvektoren stammen vom Ti-Plasmid.
In jedem System können sowohl natürliche als auch synthetische Promotoren und Terminatoren verwendet werden.
Verständlicherweise kann, je nach der Wahl des Expressionssystems, das exprimierte Protein eine zusätzliche N-terminale Aminosäure (Methionin) enthalten, einige zusätzliche Aminosäuren enthalten oder zu einem heterologen Protein (Z.B. Protein A) fusioniert sein, oder sich vom natürlich vorkommenden Protein hinsichtlich der Glycosylierung unterscheiden. Weiters können die Vektoren auch Signalsequenzen enthalten, um das Protein zum Periplasma oder zum Kulturmedium zu exportieren.
Somit sind weitere Aspekte, die für die Expression von erfindungsgemäß zu verwendenden Proteinen relevant sind, folgende:
a) ein Vektor, der eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein Protein, wie oben angegeben, codiert,
b) ein Wirtsorganismus, der eine DNA-Sequenz, wie oben angegeben, aufweist,
c) ein Verfahren für die Erzeugung eines Proteins, wie oben angegeben, durch Züchten eines Wirtsorganismus, der einen Vektor, wie oben unter a) angeführt, enthält, und Isolieren des Proteins.
Die Verfahren zur Reinigung basieren auf dem verwendeten Expressionssystem (z.B. Protein A/IgG) und/oder auf Methoden, die zur Reinigung dar natürlich vorkommenden Enzyme verwendet werden, wie in Literaturstelle 6 beschrieben.
Aspekte der Erfindung sind:
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit exokriner Pankreas-Insuffizienz verbundenen pathologischen Zustandes,
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung zystischer Fibrose,
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung chronischer Pankreatitis,
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Fett- Malabsorption jeglicher Ätiologie,
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Malabsorption fettlöslicher Vitamine,
- die Verwendung eines Proteins, wie oben angegeben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Malabsorption von Fett, welche auf physiologische Ursachen zurückzuführen ist, z.B. bei Neugeborenen.
Die DNA-Sequenz in Fig. II von Position 151 bis zu und einschließlich Position 2316 ist die Sequenz, die für das Gesamtprotein codiert. Die Sequenz ab Position 2317 bis zu und einschließlich Position 2415 wird nicht zu Protein translatiert, sondern ist im in Tabelle 2 nachstehend identifizierten Exon d inkludiert

Versuchsteil

Abkürzungen

aa: Aminosäure; bp: Basenpaar; BSSL: Gallensalz-stimulierte Lipase; c-AMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; CEH: Carbonsäureesterhydrolase; Da: Dalton; c &sup7;GTP: 7-Deaza-2-desoxyguanosin-5'-triphosphat; EDTA: Ethylendiamintetraacetat; kb: Kilobasen; MOPS: 3-N-Morpholinopropansulfonsäure; nt: Nucleotid; PAGE: Polyacrylamidgelelekrophorese; SDS: Natriumdodecylsulfat; SSC: NaCl-Citrat, xGal: 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid.

Enzyme

Gallensalz-stimulierte Lipase EC 3.1.1.3
Carbonsäureesterhydrolase EC 3.1.1.1

Materialien und Methoden

A. Enzym- und Antikörperherstellung

BSSL wurde wie zuvor beschrieben aus Menschenmilch gereinigt [6]. Bei Verwendung für die Antikörpererzeugung wurde das Enzym mittels SDS-PAGE weiter gereinigt. Die der Lipase entsprechende Proteinbande wurde nach Färbung mit Coomassie Brilliant-Blau aus dem Gel elektroeluiert. 25 µg gereinigtes Enzym wurden zusammen mit einem gleichen Volumen von vollständigem Freundschen Adjuvans für eine erste i.c.-Injektion, und dieselbe Enzymmenge mit unvollständigem Adjuvans für die nachfolgenden monatlichen Booster-Injektionen verwendet. Von den Kaninchen wurde etwa zwei Wochen nach jedem Booster Blut abgezapft, und Sera wurden hergestellt und bei -20ºC gelagert.

B. Herstellung von Trypsin-Fragmenten und Aminosäuresequenzanalyse

3 mg gereinigte BSSL wurden in 1 ml 0,1 M Tris-Cl-Puffer, pH 8,5, enthaltend 6M Guanidiniumhydrochlorid und 2 mM EDTA, gelöst. Dithioerythrit wurde auf 5 mM zugegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden 300 µl 50 mM Jodacetat zugegeben. Nach 90minütiger Inkubation bei 25ºC im Dunklen wurde das reduzierte und carboxymethylierte Enzym auf einer Sephadex G-25- Säule entsalzt, die mit 0,5 M Ammoniumbicarbonat äquilibriert war. 30 µg mit Tosyl-L-phenylalaninchlormethan behandeltes Rinder-Trypsin (Worthington Diagnostics System Inc., Freehold, NJ, USA), wurden vor der Lyophilisation zugegeben. Das lyophilisierte Protein wurde in 4 ml 0,1 M Ammoniumbicarbonat gelöst, und zusätzliche 90 µg Trypsin wurden zugegeben. Nach 5-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Protein wiederum lyophilisiert. Das tryptische Digest wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (2mg/ml) gelöst. 300 µg trypsinierte BSSL wurde unter Verwendung einer C- 18-Umkehrphasensäule auf HPLC chromatographiert und mit einem Gradienten von 0-50% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Die Peptidsammlung wurde mittels kontinuierlicher Aufzeichnung der Absorption bei 215 nm überwacht. Zu sequenzierende Peptide wurden weiters mittels Rechromatographie unter Verwendung derselben Säule mit eingestellten Gradienten gereinigt. Proben der zu sequenzierenden Peptidfragmente wurden unter Stickstoff zur Entfernung von Acetonitril getrocknet und auf den Sequenzierer aufgetragen. Zur N-terminalen Sequenzanalyse wurde native BSSL in 0,1% Essigsäure aufgelöst. Die Sequenzanalysen erfolgten auf einem 477A gepulsten Flüssigphasen-Sequenzierer und on-line PTH 120A-Analysator von Applied Biosystems Inc. mit regulären Zyklus-Programmen und Chemikalien vom Hersteller. Die Anfangs- und wiederholte Ausbeute, betrug, aus einem sequenzierten Standard-Protein, β-Lactoglobulin, berechnet, 47 bzw. 97%.

C. Isolierung von RNA

Proben von humanem pankreatischem adipösem und milchgebendem Brustdrüsengewebe wurden chirurgisch erhalten und sofort in Guanidinium-thiocyanat (1-5 g in 50 ml) gegeben. Die Gesamt-RNA wurde, wie von Chirgwin [20] beschrieben, extrahiert. Poly(A)- RNA wurde mittels Chromatographie auf einer Oligo-desoxythymidilat-(Oligo(DT))-Cellulosesäule [21] hergestellt.

D. Konstruktion und Screening der cDNA-Banken

Etwa 15 µm poly-adenylierte RNA aus humaner Pankreas wurden mit Methylquecksilber(II)-hydroxid [22] denaturiert, mit Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Primern (Pharmacia, Uppsala, Schweden) versetzt und unter Verwendung von Standardvorgangsweisen einer Revers-Transkription unterzogen [23]. Die Zweitstrang-Synthese erfolgte gemäß Gubler und Hoffman [24], außer daß DNA-Ligase und β-NAD weggelassen wurden, und die Reaktionstemperatur wurde auf 15ºC eingestellt. Überschüssige RNA wurde mit RNAse A (50 µg/ml) digeriert, und die doppelsträngige cDNA wurde mit EcoRI-Methylase behandelt [25]. Die Enden wurden mit Klenow-Enzym abgestumpft. Nach Ligation an EcoRI-Linker und Spalten mit EcoRI wurde die cDNA auf einer Sepharose 4B-Cl-Säule fraktioniert. Die Hohlraumvolumenfraktion wurde mit Ethanol ausgefällt, und die cDNA wurde in die EcoRI-Stelle eines mit Phosphatase behandelten λgt11-Vektors [26] ligiert. In vitro-Packung ergab mehr als 7x10&sup5; Rekombinanten.
Eine cDNA-Bank einer menschlichen Brustdrüse, die von einem von einer im achten Monat schwangeren Frau stammenden Gewebe erhalten worden war, wurde gekauft (Clontech Laboratories, Inc., Pab Alto, CA; USA).
Phagen aus den cDNA-Banken wurden mit 5x10&sup4;-Plaque-bildenden Einheiten pro 120 mm Schale plattiert. Das Antiserum wurde auf ein Verhältnis von 1:3200 verdünnt, und das Screenen erfolgte gemäß Young und Davis (27). Mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegen-Antikaninchen-Antikörper wurden als zweite Antikörper verwendet (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Zur Isolierung von Klonen, die dem 5'-Ende der mRNA entsprachen, wurde eine Nucleinsäurehybridisierung unter Standardbedingungen [23] vorgenomen, wobei ein subkloniertes Fragment von einem der immunpositiven Klone als Sonde verwendet wurde.

E. RNA-Analyse

Die Elektrophorese erfolgte in einem 1% Agarose-Gel in 40 mM MOPS-Puffer, pH 7,0, nach Denaturierung mit Glyoxal und Dimethylsulfoxid [28]. Mit Glyoxalat behandelte Gesamt-RNA wurde dann auf Nitrocellulosefilter übertragen [29]. Die Blots wurden mit Subklonen von BSSL- und CEH-Rekombinanten, die mittels der Oligo-Markierungstechnik markiert wurden [30], als Sonden untersucht. Prehybridisierung und Hybridisierung erfolgten mit 50% Formamid bei 46ºC [23]. Posthybridisierungswaschungen wurden mit großer Sorgfalt durchgeführt (0,1% SDS und 0,1xSSC bei 60ºC). (1xSSC, 0,15 M NaCl, 0,0015 M Na&sub3;-Citrat, pH 7,6).

F. Nucleotidsequenz

cDNA-Insert von SSL- und CEH-Rekombinanten wurden entweder direkt in M3mp18 und mp19 nach Ultraschallbehandlung und Größen- Fraktionierung kloniert, oder einige davon wurden weiter in pTZ19R nach Digerieren mit PstI, BstXI, NarI, SmaI und AhaII subkloniert. Die Nucleotidsequenz wurde mittels der Didesoxyketten-Terminationsmethode [31] bestimmt. Die GC-reichen Wiederholungen (siehe unten) wurden auch mit TaqI-Polymerase und dc &sup7;GTP sequenziert. Beide Stänge wurden sequenziert. Die Sequenzinformation wurde von Autoradiogrammen unter Verwendung der Software MS edSeq, wie von Sjöberg et al. [55] beschrieben, wiedergewonnen.

G. Äminosäuresequenzvorhersagen und Homologien.

Zur Vorhersage der entsprechenden Aminosäuresequenz der cDNA-Inserts wurde die Codon-Verwendung verschiedener Leserahmen gemäß Staden verglichen und ergab einen offenen Leserahmen [32]. Homologien wurden mit den Programmen der UWGCG-Software-Package [33] gesucht.

Ergebnisse und Diskussion

A. Sequenzen von Trypsin-Fragmenten und des N-Terminus von BSSL

Trypsindigestion von gereinigter BSSL ergab etwa 50 Fragmente, wie gemäß der Anzahl der während der HPLC-Chromatographie erhaltenen Peaks (Fig. I) beurteilt. Die Peaks wurden gesammelt, und die angegebenen Peaks, die in sehr reinem Zustand und in annehmbaren Mengen isoliert werden konnten, wurden sequenziert. Die resultierenden Sequenzen sind in Tabelle I gezeigt. Zusätzlich wurden die 30 am meisten N-terminalen Reste sequenziert (Fig. II), und sie bestätigen die früher berichtete Sequenz von Abouakil et al. (30 Reste) [17].

B. Nucleotidsequenz von BSSL

Zur Konstruktion der λgt11-cDNA-Bank verwendeten wir polyadenylierte RNA von humaner Pankreas. Anfangs wurden vier immunpositive Klone isoliert, und dann wurde diese pankreatische Expressions-cDNA-Bank mit Antiserum gegen BSSL gescreent. Die Nucleotidsequenzanalyse der vier Klone zeigte, daß sie mit dem 3'-Ende der mRNA perfekt übereinstimmen und diesem entsprechen. Sie beginnen alle mit einem Poly-A-Schwanz und unterscheiden sich nur in der Länge; das längste Insert, als ACEH bezeichnet, erstreckt sich über 996 bp.
Eine cDNA-Bank einer menschlichen Brustdrüse wurde mit Antiserum und dem Pankreas-Klon ACEH als Sonde gescreent. Positive Klone wurden aus beiden Screenings isoliert, die alle vom 3'- Ende ausgehen. Der längste Brustdrüsenklon, als ABSSL gezeichnet, reicht 2100 bp stromaufwärts. Er enthält vier der sequenzierten Trypsin-Fragmente (Fig. II), inkludiert jedoch nicht die N-terminale Aminosäuresequenz. Um die Sequenz über den Translationsstart hinauszuverlängern, wurde die Brustdrüsen-cDNA-Bank mit einer 118 Basen langen Sonde, die von dem am nächsten 5'- liegenden Teil von ABSSL stammte, wiederum gescreent. Ein Klon wurde isoliert, der weitere 328 Nucleotide stromaufwärts reichte. Er paßte zur N-terminalen Aminosäuresequenz und enthielt das restliche Trypsin-Fragment. Wie in Fig. II gezeigt, ist die cDNA 2428 Nucleotide lang und enthält 81 Basen stromaufwärts vom ersten ATG-Codon. Das Polyadenylierungssignal, AATAAA, befindet sich 13 Nucleotide stromaufwärts vom poly-A- Schwanz, und das Terminations-Codon TAG wurde bei Nucleotid 2317 gefunden, gefolgt von einem 3'-nicht-translatierten Bereich von 112 pb. Ein GC-reicher Bereich, bestehend aus 16 Wiederholungen von 33 Basen, wurde im 3'-Ende der Sequenz zwischen Base 1756 und 2283 gefunden. Die Nucleotidsequenz der Wiederholung, in Fig. III gezeigt, besteht aus sechs identischen Wiederholungen, umgeben von zehn Wiederholungen mit unterschiedlicher Anzahl von Substitutionen, die wahrscheinlich nach mehreren Duplikationen auftraten. Die geringe Anzahl von Substitutionen läßt darauf schließen, daß diese Wiederholungen spät während der Evolution aufgetreten sind.

C. Gewebsverteilung der Expression

RNA von menschlicher milchgebender Brustdrüse, Pankreas, adipösem Gewebe und von humaner Hepatom-Zellinie (HepG2) wurde mittels Nothern Blot analysiert. Die Größe des Messenger wurde sowohl bei der milchgebenden Brustdrüse als auch bei der Pankreas als etwa 2,5 kb festgestellt. In den Bahnen mit RNA, die von HepG2 oder von adipösem Gewebe extrahiert worden war, konnte kein Signal detektiert werden (Fig. IV).
Da die für die Brustdrüsenbank verwendete mRNA von einer im achten Monat schwangeren Frau stammte, ist es offensichtlich, daß die Transkription und vermutlich die Translation des BSSL- Gens vor dem Geburtsvorgang einsetzt, was mit früheren Feststellungen über eine BSSL-Sekretion vor dem Geburtsvorgang [35] übereinstimmt. Vgl. Fig. IV.

D. Aminosäuresequenz von BSSL

Aufgrund einer Beurteilung mittels SDS-PAGE wurde berichtet, daß die Molekularmasse 107-125 kDa (8,36) ist, und aufgrund einer analytischen Ultrazentrifugation wurde sie mit 105 kDa angegeben [37]. Das Enzym, wie es von der cDNA abgeleitet ist, besteht aus 722 Aminosäureresten (Fig. II), was bei einer Molmasse von 76.271 Da anzeigt, daß das Enzym mindestens 15-20% Kohlenhydrat enthält. Die Leadersequenz ist 23 Reste lang. Ein vermutlicher Serin-Rest des aktiven Zentrums ist an Serin-217 lokalisiert (Fig. V). Die Sequenz um dieses Serin herum stimmt überein mit der Consensus-Sequenz des aktiven Zentrums von Serinhydrolasen (38). Es wurde kürzlich vorgeschlagen, daß basische Reste, die in der Nähe des Serins des aktiven Zentrums gefunden werden, an der Spaltung von Esterbindungen in Acylglycerinen durch Lipasen beteiligt sein können [39]. Es ist interessant festzustellen, daß solche Reste in BSSL nicht vorhanden sind. Die einzige vermutliche N-Glycosilierungsstelle ist nur sieben Reste ab dem Serin lokalisiert. Der Glycosilierungsgrad [6,16] deutet darauf hin, daß das Enzym 0-gebundenes Kohlehydrat enthält. Es gibt zahlreiche Stellen, an welche eine solche Glycosilierung stattgefunden haben könnte. Die Aminosäurezusammensetzung aufgrund gereinigter Enzyme hat einen hohen Gehalt an Prolin-Resten gezeigt [6]. Die von cDNA erhaltene Aminosäuresequenz bestätigt dies. Außerdem sind die meisten der Prolin- Reste in den 16 Wiederholungen von je 11 Resten lokalisiert, wobei sie den Hauptteil der C-terminalen Hälfte des Enzyms ausmachen.

E. Vergleich der Enzyme in Brustdrüse (BSSL) und Pankreas (CEH)

Es wurde bereits gezeigt, daß BSSL von Menschenmilch und humane Pankreas-CEH ähnlich, wenn nicht identisch sind. Die vorliegenden Daten weisen stark darauf hin, daß die beiden Enzyme Produkte desselben Gens sind. Die Nucleotidsequenz der cDNA-Klone zeigt, daß der pankreatische Klon ACEH mit dem Brustdrüsen-Klon ABSSL ab dem Poly-A-Schwanz und 996 Basen zum 5'- Ende hin, einschließlich der für die Prolin-reichen Wiederholungen kodierenden Sequenz, identisch ist. Northern Blot ergab eine einzige Bande von 2,5 kb in RNA von Pankreas und milchgebender Brustdrüse (Fig. IV). Genomische Southern Blots unterstützen weiter die Idee, daß nur ein Gen für BSSL und CEH codiert. Der Unterschied in der Mobilität auf SDS-PAGE zwischen BSSL und CEH kann als eine Folge unterschiedlicher Glykosylierung oder differentiellen Spleißens erklärt werden.
Die Ähnlichkeit von BSSL mit den Enzymen von Ratte und Rind (siehe unten) und mit Ergebnissen von genomischen Blots bestärken die Möglichkeit, daß differentielles Spleißen nicht für die Mobilitätsdifferenz verantwortlich sein kann. Da die C-terminale Sequenz auf Protein-Niveau nicht bestätigt worden ist, ist die Möglichkeit, daß CEH durch eine proteolytische Spaltung im C- terminalen Ende verarbeitet werden kann, weniger wahrscheinlich.
Soweit uns bekannt ist, wurden pankreatische Enzyme, die offensichtlich zu CEH korrespondieren, häufig nach der Spezies und den besonderen Substraten, die verwendet wurden, um ihre jweiligen Aktivitäten zu bestimmen, benannt; Lysophospholipase, Cholesterylesterase, Sterolesterhydrolase, unspezifische Lipase, Carbonsäureesterlipase und Cholesterylesterhydrolase. Die verfügbaren Daten stimmen mit der Ansicht überein, daß all diese beschriebenen Aktivitäten in ein und derselben funktionellen Entität ihren Ursprung haben [42,43]. Dies veranschaulicht die breite Substratspezifität und die Relevanz der Bezeichnung derselben als unspezifische Lipasen. Wenn die Sequenz von humaner BSSL/CEH mit der Lysophospholipase-Sequenz von Ratten-Pankreas [40] und Cholesterinesterase von boviner Pankreas [41] verglichen wird, finden sich umfassende Ähnlichkeiten, die etwa 530 Reste ab dem N-Terminus reichen (Fig. V); doch unterscheiden sie sich im Teil des Molekuls, in welchem die Wiederholungen auftreten. Das Rattenenzym hat nur vier Wiederholungen, und das bovine drei. Daher ist das humane Enzym ein wesentlich längeres Peptid.
Außerdem fand man auffallende Ähnlichkeiten zwischen BSSL und einer Anzahl typischer Esterasen, z.B. Acetylcholinesterasen von mehreren Spezies, einschließlich dem Menschen und Drosophila, und Carbonsäureesterasen (Fig. VI). Diese Ähnlichkeiten waren auf die N-terminalen 300 Reste von BSSL beschränkt, welche den vermutlichen Serin-Rest des aktiven Zentrums inkludieren. Eine Ähnlichkeit mit Acetylcholinesterase wurde aus der Tatsache vorausgesagt, daß BSSL durch typische Cholinesteraseinhibitoren [6, 8, 16] inhibiert wird. Mit der möglichen Ausnahme der Rattenleber-Carbonsäureesterase [45] wurde von keinem dieser ähnlichen Enzyme gezeigt, daß es dieselbe Gallensalzabhängigkeit aufweist wie BSSL; dies läßt darauf schließen, daß die strukturelle Basis für diese Eigenschaft im C-terminalen Teil des Proteins liegt. Außerdem kann BSSL emulgierte Substrate wirksam angreifen, was kein bekanntes Charakteristikum der ähnlichen Esterasen ist. Für diese Aktivität ist das Gallensalz eine Voraussetzung.
Die vorhergesagte Sequenz für humane BSSL wurde mit anderen, gut charakterisierten Lipasen von Säugern verglichen. Abgesehen von der Consensus-Sequenz rund um das Serin des aktiven Zentrums (G-X-S-X-G) wurden keine offensichtlichen Ähnlichkeiten gefunden [44].
Zusätzlich zu den Ähnlichkeiten mit anderen Enzymen gibt es auch wesentliche Ähnlichkeiten mit einem c-AMP-abhängigen Protein von Dictyostelium discoideum (46) sowie mit Thyroglobulin von mehreren Spezies (Fig. VI) (47-49). Die Ähnlichkeiten zwischen BSSL und Thyroglobulin, die den Bereich des aktiven Zentrums, aber nicht das aktive Zentrum selbst umfassen, weisen darauf hin, daß diese hochkonservierten Abschnitte von Aminosäuren von allgemeinerer Bedeutung sind als daß sie nur die enzymatische Aktivität von Esterasen unterstützen.
Zusammenfassend gesagt, besteht die humane Milch-BSSL aus 722 Aminosäure-Resten. Verfügbare Daten weisen stark darauf hin, daß seine Peptidkette mit jener der pankreatischen CEH identisch ist und daß sie vom selben Gen codiert werden. Der stärkste Beweis ist, daß die Nucleotidsequenzen ihrer 3-Enden und ihre N- terminalen Aminosäuresequenzen identisch sind. Die auffallenden Homologien, die man zur pankreatischen Lysophospholipase der Ratte und zur bovinen pankreatischen Cholesterinesterase gefunden hat, unterstützen die Hypothese, daß auch diese Enzyme funktionell identisch sind. Es wurde jedoch angeregt, daß die unter den Spezies gefundenen unterschiedlichen Molekulargrößen nicht lediglich auf Unterschiede in der Glycosylierung zurückzuführen sind; statt dessen zeigen sie eine variable Anzahl von elf Aminosäure-Wiederholungen. Die Ähnlichkeit der Sequenz des aktiven Zentrums zwischen diesen Esterasen deutet darauf hin, daß diese Proteine von einem gemeinsamen Ahnen-Gen stammen.
Unter Bezugnahme auf die Fig. I-VII ist die folgende Legende gegeben:

Fig. I: Trennung des Trypsin-Digests von BSSL auf HPLC

Gereinigte BSSL wurde mit Trypsin behandelt und auf HPLC chromatographiert, wie unter Materialien und Methoden beschrieben. Die angezeigten Peaks wurden gesammelt und durch Rechromatographie weiter gereinigt, und ihre Aminosäuresequenz wurde bestimmt.

Fig. II: Die cDNA-Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für humane Gallensalz-stimulierte Lipase:

Die cDNA ist 2428 Basen lang. Die N-terminale 23-Codon- Sequenz (nt82-150), die mit einem ATG beginnt, wird als Leader- Peptid interpretiert, da die N-terminale Aminosäuresequenz des reifen Proteins bei Codon 24 (nt 151, Ala) beginnt. Das Leader- Peptid ist unterstrichen. Das Zeichen * zeigt den Ausgangspunkt eines Exons an. Das Zeichen # zeigt den Ausgangspunkt des Wiederholungsteils an.

Fig. III: Die Nucleotidsequenz der C-terminalen GC-reichen Wiederholungen in der Gallensalz-stimulierten Lipase:

Substitutionen sind durch ein * angezeigt.

Fig. IV: Northern Blot-Hybridisierung

Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA, die von einer menschlichen, milchgebenden Brustdrüse isoliert worden war, Pankreas, adipöses Gewebe und eine Human-Hepatom-Zellinie (HepG2). Gesamt- RNA (10µg) von milchgebender Brustdrüse (Bahn A), Pankreas (Bahn B), adipösem Gewebe (Bahn C) und HepG2 (Bahn D) wurden in einem 1% Agarosegel in 40 mM MOPS-Puffer bei pH 7,0 nach Denaturierung von RNA in 1 M Glyoxal, 50% Dimethylsulfoxid und 40 mM MOPS, der Elektrophorese unterzogen. Die glyoxalierte RNA wurde dann zur Hybridisierung mit mit [³²P] markierter BSSL-cDNA (ABSSL) auf Nitrocellulose-Papier übertragen.

Fig. V: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von humaner Milch-BSSL, pankreatischer Lysophospholipase der Ratte (Rat1pl) [40] und boviner pankreatischer Cholesterinesterase (Bovceh) [41]:

Die am aktiven Zentrum beteiligten Serin-Reste sind durch ein * angezeigt, und das # bedeutet das einzige mögliche N- Glycosylierungssignal des Proteins. Die direkten Wiederholungen von Aminosäuresequenzen sind umrahmt. Übereinstimmende Sequenzen sind in Blockbuchstaben bezeichnet, übereinstimmende Sequenzen zwischen zwei Enzymen sind in Kleinbuchstaben bezeichnet, und nichtübereinstimmende mit einem Punkt.

Fig. VI: Vergleich der Primärstruktur von BSSL mit anderen Esterasen, Thyroglobulin und mit einem c-AMP-abhängigen Enzym von Dictyostelium discoideum:

BSSL: Gallensalz-stimuiierte Lipase vom Menschen, Cheshum: Cholinesterase von fötalem Humangewebe [50], Torpase: Acetylcholinesterase von Torpedo marmorate [51], Drosceh: Carbonsäureesterhydrolase von Drosophila melaogaster [52], Ratlivce: Carbonsäureesterase von Rattenleber [53], Drosace: Acetylcholinesterase von Drosophila melaogaster [54], Thyrhum: Thyroglobulin vom Menschen [49] und Dict.Di: c-AMP-abhängiges Enzym von Dictyostelium discoideum [46]. Es gibt 7 verschiedene Domänen, die Ähnlichkeiten zwischen den Enzymen aufweisen. Kästchen umschließen Reste, die identisch sind, und Kleinbuchstaben in der Consensus-Sequenz zeigen identische Reste in allen Enzymen außer einem an. Punkte zeigen fehlende Übereinstimmung an. Der am aktiven Zentrum beteiligte Serin-Rest ist mit * angezeigt. Die Figur in der rechten Ecke zeigt, wie die Domänen orientiert sind.

Fig. VII:

zeigt Aminosäuresequenz 1-722 für das Gesamtprotein (Einbuchstaben-Code) und gibt die Exons a, b, c und d an. Das Zeichen # zeigt den Ausgangspunkt des Wiederholungsteils an. Tabelle 1. Aminosäuresequenz von BSSL-Peptiden. Infolge störender Peaks konnte keine positive Identifizierung des Restes in den Zyklen 1 und 2 der Sequenzierung bei Peptid Nr. 26 vorgenommen werden. Die Peptidzahlen beziehen sich auf die Peaks in Fig. I. Tabelle 2: Identifizierung der Exons a, b, c und d, wie in den Fig. II und VII bezeichnet.

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Claims

1. Verwendung eines rekombinanten Proteins, wie in Fig. VII von Position 1 bis Position 722 gezeigt, oder einer funktionell äquivalenten Variante desselben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit exokriner Pankreas- Insuffizienz verbundenen pathologischen Zustandes.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung zystischer Fibrose.

3. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung chronischer Pankreatitis.

4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Malabsorption von Fett.

5. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Malabsorption fettlöslicher Vitamine.

6. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Malabsoption von Fett, welche auf physiologische Ursachen zurückzuführen ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein in Verbindung mit einer Lipase oder mit Lipasen oder in Verbindung mit eine Lipase oder Lipasen enthaltenden Präparaten vorliegt.