DE69110906T2 - Verwendung von Wirtszellphospholipiden zur Hemmung bakterieller Besiedlung. - Google Patents
Verwendung von Wirtszellphospholipiden zur Hemmung bakterieller Besiedlung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Phospholipidrezeptoren, die Bakterien binden.
- Der Prozeß, durch den Mikroorganismen an Wirtszellen gebunden werden, wird Adhärenz oder Adhäsion genannt und es ist heutzutage weitgehend akzeptiert, daß dieser Mechanismus ein wichtiger Schritt bei der Einleitung mikrobieller Besiedelung und Infektion ist. Im allgemeinen besitzen wirtszellen Strukturen ("Rezeptoren"), welche die Bindung infektiöser Mikroorganismen vermitteln. Daher sind die Rezeptoren auf Wirtsgewebe in gleichem Maße eine Determinante mikrobieller Infektiosität, wie dies die Strukturen auf Mikroorganismen sind, die Bindung vermitteln.
- Ein Beispiel für einen pathogenen Mikroorganismus, der für Menschen von Bedeutung ist, ist Chlamydia trachomatis. Dieser Mikroorganismus ist ein obligater intrazellulärer bakterieller Parasit eukaryontischer Zellen und ist heutzutage als das häufigste sexuell übertragene Pathogen in industrialisierten Gesellschaften bekannt (Moulder in Microbiology of Chlamydia, Hrg. A.L. Barron, S. 3-19, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988; Schachter in Microbiology of Chlamydia, S. 153-166, 1988). Es ist geschätzt worden, daß in den Vereinigten Staaten mehr als vier Millionen Menschen jedes Jahr sich mit Chlamydia in Zusammenhang stehende Erkrankungen zuziehen (Eisner & Monahan, Diagnostics and Clin. Testing 28:26-28, 1990). Salpingitis, Bauchhöhlenschwangerschaft, Unfruchtbarkeit, chronische Beckenschmerzen, Frühgeburt, Neugeborenen-Bindehautentzündung, Lungenentzündung bei Kindern, endemisches Trachom, Urethritis und Epididyirtitis sind alle direkt oder indirekt mit einer Infektion durch den Organismus in Zusammenhang gebracht worden (Schachter 1988; Eisner & Monahan, 1990).
- Ein anderes Beispiel für einen pathogenen Mikroorganismus, der für Menschen von Bedeutung ist, ist Helicobacter pylori. Dieser Mikroorganismus ist ein Infektionserreger des menschlichen Magens. Die Infektion ist verbunden mit sowohl primärer, chronisch-aktiver Gastritis als auch peptischer Ulcuserkrankung (Blaser, J. Infect. Dis. 161:621-623, 1990; Marshall, J. Infect. Dis. All :650-657, 1986; Marshall et al., Lancet ii:1437- 1442, 1988). Jedes Jahr gibt es mehr als 300.000 neue Fälle, 3.200.000 Rückfälle und 3.200 Todesfälle bei Zwölffingerdarmerkrankungen in Nordamerika (Schefler, Statistics for Health Professionals, 1984). Eineinhalb Prozent aller Fehlzeiten von Arbeitern in Nordamerika ist ein Ergebnis von peptischen Ulcera (Jansen, Am. J. Med. 81:42-48, 1986). Antrale Gastritis steht ihrerseits im Zusammenhang mit gastrointestinalem Karzinom (Johansenn and Sikjay, Acta Path. Microbiol. Scan. 85:240, 1977) und kürzliche Studien haben H. pylori mit GI-Krebs in Verbindung gebracht (Parsonnet et al., 30th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Atlanta, Georgia, 21.-24. Oktober 1990, Abst. No. 5).
- Wegen der Schwierigkeiten bei gegenwärtigen Ansätzen zu Prävention und Behandlung mikrobieller Erkrankungen besteht ein Bedürfnis auf diesen Gebiet nach verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen zur Prävention und Behandlung mikrobieller Erkrankungen. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis und stellt außerdem andere verwandte Vorteile zur Vertügung.
- Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung eine Anzahl von in-vitro-Verfahren zur Hemmung bakterieller Besiedlung zur Verfügung. In einem Aspekt werden Verfahren zur Hemmung bakterieller Besiedlung in einer biologischen Zubereitung zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren, daß eine biologische Zubereitung mit einer wirksamen Menge eines Phospholipids mit der Formel: worin oder ist und
- R' eine Alkylgruppe ist und R Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkenylgruppen von Fettsäuren sind, in Kontakt gebracht wird.
- In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren, daß eine biologische Zubereitung mit einem Phospholipid, wie oben beschrieben, in Kombination mit GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid in Kontakt gebracht wird.
- In einer anderen Ausführungsforn umfaßt das Verfahren, daß eine biologische Zubereitung mit einem oben beschriebenen Phospholipid in Kombination mit Galβ1-3GalNacbβ1-4Galβ1-4Glc- Ceramid in Kontakt gebracht wird.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Entfernung von Bakterien aus einer biologischen Zubereitung zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren, daß ein Lipid mit einer biologischen Zubereitung, die in Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, unter Bedingungen und für einen Zeitraum in Kontakt gebracht wird, die ausreichend sind, um die Bindung zwischen besagten Phospholipid und besagten Bakterien zu ermöglichen, wobei besagtes Phospholipid die Formel besitzt: worin oder ist und
- R' eine Alkylgruppe ist und R Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkenylgruppen von Fettsäuren sind; und
- besagtes Lipid aus besagter biologischen Zubereitung abgetrennt wird, wodurch die Bakterien aus der biologischen Zubereitung entfernt werden.
- In einer anderen Ausführungsform liegt das Phospholipid in Kombination mit GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vor und der Abtrennschritt umfaßt das Abtrennen des Phospholipids und des GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramids aus der biologischen Zubereitung.
- In einer anderen Ausführungsform liegt das Phospholipid in Kombination mit GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vor und der Abtrennschritt umfaßt das Abtrennen des Phospholipids und des Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramids aus der biologischen Zubereitung.
- Für jede der Ausführungsformen können eine oder mehrere der Substanzen Phospholipid, GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid oder Galβ1-3galNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid auf einem festen Träger immobilisiert sein.
- Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung deutlich werden.
- Wie oben angegeben, ist die Adhärenz von Mikroorganismen an Wirtszellen ein wichtiger Schritt bei der Einleitung mikrobieller Besiedlung und Infektion. Mikroorganismen binden sich spezifisch an Wirtszellrezeptoren. In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, daß Phospholipide Rezeptoren für Bakterien sind und verwendet werden können, um bakterielle Besiedlung zu hemmen.
- Wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, binden sich eine Anzahl von Bakterien spezifisch an Phospholipide, die aus menschlichen Zellen isoliert worden sind. Solche Bakterien schließen Streptococci, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Helicobacter, Pasteurella, Campylobacter, Erysipelothrix, Gardnerella, Propionibacterium, Treponema, Clostridium, Shigella, Bacteroides, Fusobacterium, Chlamydia, Mycobacterium, Yersina, Coxiella, Vibrio, Peptostreptococcus, Salmonella und Mobiluncus ein. Typischerweise können die Wirtsrezeptoren für diese Bakterien auf Epithelzellen des Atemtraktes, Magen-Darm-Traktes oder Fortpflanzungstraktes oder auf Blut- oder Epidermiszellen angetroffen werden. Repräsentative kultivierte Zellinien schließen menschliche Mund-Rachen-Epithelzellen, menschliche Luftröhren-Epithelzellen, menschliche Gebärmutterschleimhautzellen, menschliche Embryoamnionzellen, menschliche Zahnfleischfibroblasten, HeLa-Zellen und McCoy- Zellen ein.
- Die Reinigung der für die Bindung verantwortlichen Phospholipide (d.h. "Rezeptor") kann durch eine Kombination von Extraktionen und chromatographischen Verfahren bewerkstelligt werden. Kurz gesagt werden zum Beispiel Zellen (wie etwa HeLa) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser extrahiert. Der Extrakt wird zentrifugiert, der Pellet erneut extrahiert und die Überstände kombiniert ("Lipidextrakt"). Der Lipidextrakt wird auf ein Anionenaustauschharz aufgebracht und, nach einer Methanolwaschung, wird die Rezeptorfraktion mit Methanol, das 10-20 mM NH&sub4;HCO&sub3; enthält, eluiert. Im Anschluß an die Verdampfung des Lösungsmittels und die erneute Lösung in 1:1 Methanol-Chloroform wird die Rezeptorfraktion weiter durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, z.B. Silicagel. Die Bande, die den Rezeptor enthält, wird auf eine Glassäule übertragen, mit Chloroforn gewaschen und mit Methanol eluiert. Die Reinheit kann durch analytische Dünnschichtchromatographie bestimmt werden.
- Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung zeigt, daß ein gereinigter Rezeptor die folgende Phospholipid-Struktur umfaßt, die Ethanolamin und mehrere verschiedene Fettsäuren enthält: ist oder und
- R stellt Alkyl-, Hydroxyalkyl- und Alkenylketten von Fettsäuren dar und R ist eine Alkylkette.
- Fettsäuren werden typischerweise durch numerische Bezeichnungen abgekürzt. Zum Beispiel ist CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub2;CH&sub2;COOH 16:0, wobei die Zahl links vom Doppelpunkt die Anzahl Kohlenstoffatome angibt und die Zahl rechts vom Doppelpunkt die Anzahl Doppelbindungen angibt. Die Fettsäuren, die in den gereinigten Rezeptor-Phospholipiden aus HeLa-Zellen identifiziert worden sind, sind 16:0, 18:1, 18:0, 20:4 und 18:9OH + 18:10OH und liegen in relativen Anteilen von etwa 16%, 17%, 47%, 1% bzw. 19% vor. Die Sammlung von Phospholipiden bindet Mikroorganismen spezifisch und mit hoher Avidität. Phospholipide dieses Typs, denen aber eine oder mehrere dieser bestimmten Fettsäuren fehlen, binden ebenfalls Mikroorganismen.
- Zusätzlich zu den oben beschriebenen Phospholipiden binden sich Bakterien auch stark an bestimmte Glykolipide. Insbesondere scheinen die GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Sequenzen, die in den Glykolipiden Asialo-GM1 und Asialo-GM2 gefunden werden, einen zweiten Rezeptor für Mikroorganismen darzustellen. Asialo-GM1 ist die Abkürzung für Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid und Asialo-GM2 hat dieselbe Struktur minus das terminale Gal. Ceramide sind Sphingolipidbasen, die am Amin mit einer Fettsäure acyliert sind.
- Die Phospholipide der vorliegenden Erfindung können einem Warmblüter (wie etwa einem Menschen) zur Hemmung bakterieller Besiedlung als eine Zusammensetzung verabreicht werden, die ein pharmazeutisch annehmbares Trägermittel oder Verdünnungsmittel einschließt. Alternativ können solche Zusammensetzungen eines oder mehrere der oben beschriebenen Glykolipide einschließen. Die genaue optimale Dosis kann in Abhängigkeit von dem bestimmten verwendeten Phospholipid oder Glykolipid variieren. Im allgemeinen wird jedoch eine wirksame Menge von etwa 0,1 bis etwa 10 mg pro kg Körpergewicht betragen. Diese Phospholipide und Glykolipide stellen ein Mittel zur Hemmung einer- Besiedelung durch zum Beispiel "Täuschen" von Bakterien durch Bindung an sie (d.h. als einem artifiziellem Rezeptor), statt an einen nativen Rezeptor auf einer Wirtszelle bereit.
- Pharmazeutisch annehmbare Trägermittel und Verdünnungmittel schließen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Liposome, Alkohole, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mischungen derselben ein. Eine Zusammensetzung kann über eine Anzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich orale, parenterale und transdermale Verabreichung. Für orale Verabreichung kann die Zusammensetzung in Pillen-, Kapsel- oder flüssiger Form vorliegen. Für Verabreichung durch Injektion ist physiologische Kochsalzlösung ein bevorzugtes Verdünnungsmittel. Für transdermale Verabreichung ist DMSO ein bevorzugtes Trägermittel.
- Die Rezeptor-Phospholipide der vorliegenden Erfindung können auch, einzeln oder zusammen, zur in-vitro-Hemmung bakterieller Besiedelung, wie etwa in einer biologischen Zubereitung, verwendet werden. Der Ausdruck "biologische Zubereitung" schließt biologische Proben ein, die in vivo und in vitro genommen sind (entweder mit oder ohne anschließende Manipulation) sowie diejenigen, die synthetisch hergestellt sind. Repräsentative Beispiele für biologische Zubereitungen schließen Zellen, Gewebe, Lösungen und Körperflüssigkeiten ein, wie etwa (oder aus) Blut, Urin, Speichel, Schweiß, Gelenkflüssigkeit, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit und Tränen. Kurz gesagt werden ein oder mehrere der Rezeptor-Phospholipide zu einer biologischen Zubereitung zugegeben. Alternativ können solche Phospholipide ein oder mehrere der oben beschriebenen Glykolipide einschließen. Die genaue optimale Konzentration kann in Abhängigkeit von dem bestimmten verwendeten Phospholipid oder Glykolipid variieren. Im allgemeinen wird jedoch eine Konzentration von etwa 1 bis 100 mg pro ml wirksam sein. Wie oben angegeben, verhindern diese Phospholipide und Glykolipide die Bindung von Bakterien an native Rezeptoren auf Wirtszellen. Demgemäß ist eine der Verwendungen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung, bakterielle Besiedelung einer biologischen Zubereitung während ihrer Lagerung zu verhindern.
- Es kann wünschenswert sein, zu einer biologischen Zubereitung ein Phospholipid (und/oder Glykolipid) zuzusetzen, das auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Diese Variation ermöglicht die Entfernung des Phospholipids (und/oder Glykolipids), an das ein Bakterium gebunden sein kann, vor der Verwendung der biologischen Zubereitung. Ein Phospholipid (und/- oder Glykolipid) kann auf einem festen Träger durch Adsorption oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Es wird den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, daß der Rezeptor in einer Anzahl von Arten kovalent gebunden sein kann, einschließlich Photoaktivierung und Linker-Gruppen, wie etwa die homo- und heterofunktionalen Reagentien, die von Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.) erhältlich sind.
- Ein Cervix-Isolat von C. trachomatis-Serovar E wurde in HeLa 229-Zellen gezüchtet und Chlamydia-Elementarkörperchen (EBS) wurden mit einem modifizierten Verfahren eines Renograffingradientenverfahrens gereinigt (Caldwell et al., Infect. Immun. 31:1161-1176, 1981; Bavoil et al., Infect. Immun. 44:478-485, 1984). Die gereinigten EBS wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und die Dichte der EBS wurde mit PBS auf diejenige von McFarland No. 3-Röhrchen eingestellt.
- Chlamydia-Organismen wurden radioiodiert, wie für Bakterien beschrieben (Krivan et al., Arch. Biochem. Biophys. 260:493- 496, 1988), mit geringfügigen Modifikationen. Kurz gesagt wurden 0,5 ml der Chlamydia-Suspension mit 0,5 mCi Na¹²&sup5;I in einem Eisbad in einem Röhrchen (10 x 75 mm), das mit 0,1 mg Iodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) beschichtet war, zur Reaktion gebracht. Nach 4 bis 5 min wurde die Suspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das 5 ml Tris-BSA-Puffer enthielt (0,05 M Tris-Hydrochlorid 0,91 [pH 7,8], enthaltend 0,15 M NaCl und 1% Rinderserumalbumin). Das Röhrchen wurde bei 30.000 x g für 30 min bei 4ºC zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. Der Pellet wurde erneut in 6 ml Tris-BSA-Puffer suspendiert und die Zentrifugation wurde wiederholt. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und der Pellet wurde erneut in 5 ml Tris-BSA-Puffer suspendiert. Die Radioaktivität der Suspension wurde für einen Chromatogrammdeckschichttest auf 2 x 10&sup6; cpm/ml und für einen Festphasenbindungstest mit RPMI-BSA auf 4 x 10&sup6; cpm/ml eingestellt (RPIM 1640-Medium [GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.] enthaltend 1% BSA).
- Die gereinigten EBS wurden für 7 min in einem Eisbad unter Verwendung einer Mikrospitze beschallt, gefolgt von Zentrifugation bei 4ºC für 30 min bei 30.000 x g. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Schallextrakt bezeichnet und ihre Proteinkonzentration wurde mit BCA-Proteintest (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als einem Standard bestimmt.
- Der Schallextrakt wurde radioaktiv markiert, wie für Protein beschrieben (Magnani et al., Meth. Enzymol. 83:235-241, 1982), mit geringtügigen Modifikationen. Kurz gesagt wurden 10 ug Protein in 30 ul PBS des Schallextraktes mit 100 ul 0,3 M Natriumphosphatpuffer in einem mit Iodogen beschichteten Röhrchen, wie oben beschrieben, vermischt. Ein nci Na¹²&sup5;I wurde zum Röhrchen zugegeben und der Schallextrakt wurde für 2 min in einem Eisbad mit häufigen Rütteln iodiert. Die Reaktionsmischung wurde auf eine PD-10 Sephadex G-25M-Säule (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) überführt, die mit Tris-BSA voräquilibriert wurde. Nach Durchgang der Mischung durch die Säule wurde 1 ml Tris-BSA oben auf die Säule zugegeben und hierauf folgt die Zugabe von mehr Tris-BSA. Der erste 1 ml wurde verworfen und die nächsten 5 ml wurden gesammelt. Die Radioaktivität des Schallextraktes wurde für einen Chromatogrammadeckschichttest auf 2 x 10&sup6; cpm/ml und für einen Festphasenbindungstest mit RPMI-BSA auf 4 x 10&sup6; cpm/ml eingestellt.
- Der Deckschichttest wurde durchgeführt, wie für Bakterien beschrieben (Krivan et al., Arch. Biochem Biophys. 260:493-496, 1988). Kurz gesagt wurden Lipide auf mit Aluminium verstärkten Silicagel-Hochleistungsdünnschichtplatten (HPTLC; E. Merck AG, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) chromatographiert und mit Chloroform-Methanol-0,25% wäßriges KCl (5:4:1) entwickelt. Die Platte wurde mit Polyisobutylmethacrylat (0,1% in Hexan) überzogen, an Luft getrocknet, für 1 h in Tris-BSA-Puffer getränkt und für 2 h bei Raumtemperatur mit ¹²&sup5;I-markierten entweder Chlamydia-Organismen oder Chlamydia-Subzellulärfraktion, wie oben beschrieben, überschichtet. Die Platten wurden vorsichtig gewaschen, um nicht-gebundene Organismen zu entfernen, getrocknet und für 40 h einen XAR-5-X-Röntgenfilm (Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.) ausgesetzt.
- Der Festphasenbindungstest wurde durchgeführt, wie von Krivan et al., Arch. Biochem. Biophys. 260:493-496, 1988, beschrieben. Kurz gesagt wurden Reihenverdünnungen von gereinigten Lipiden in Methanol (25 ul), die Cholesterin und Phosphatidylcholin (0,1 pg jeweils) enthielten, zu Polyvinylchlorid-Mikroverdünnungsvertiefungen (Falcon 3919; Becton Dickinson and Co., Paramus, N.Y.) zugegeben und durch Verdampfung getrocknet. Die Vertiefungen wurden mit Tris-BSA für 1 h blockiert, mit RPMI-BSA zweimal gespült und mit 25 ul von ¹²&sup5;I-markierten entweder Chlamydia-Organismen oder seiner subzellulären Fraktion für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Vertiefungen fünfmal mit PBS gewaschen worden waren, wurden die Polyvinylchlorid-Vertiefungen mit einer Schere abgeschnitten und in Zählröhrchen gegeben. Bindung wurde in einem Gammazähler quantifiziert.
- HeLa 229 wurden in TC-175 cm²-Kolben gezüchtet und entweder durch milde Trypsinisierung oder Abschaben geerntet. Die Zellen wurden dreimal in 0,0067 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, ph 7,2) gewaschen. Die gesamten Lipide der HeLa 229-Zellen wurden extrahiert durch Zugabe von drei Volumenteilen (zum Naßgewicht der Zellen) entionisiertem Wasser, zehn Volumenteilen Methanol und fünf Volumenteilen Chloroform. Die Mischung wurde für 2 min ultrabeschallt und über Nacht auf einem Schüttelbett bei Raumtemperatur inkubiert. Der Extrakt wurde bei 4ºC für 5 min bei 2.000 UPM zentrifugiert. Überstehende Flüssigkeit wurde zurückbehalten und der Pellet wurde erneut in denselben Volumenteilen entionisiertem Wasser, Methanol und Chloroform suspendiert. Die Suspension wurde für 30 min ultrabeschallt und überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die erste und die zweite überstehende Flüssigkeit wurden in einem Rundkolben kombiniert und an einem Rotationsverdampfer getrocknet.
- Der getrocknete Gesamtlipidextrakt von HeLa 229-Zellen wurde in 1:1 Methanol-Chloroforn (0.5 ml pro 1 Gramm Naßgewicht der Zellen) löslich gemacht. Ein Teil des Gesamtlipids wurde bei -20ºC für spätere Analyse aufbewahrt. Der Rest wurde unter Stickstoff getrocknet und im ursprünglichen Volumen Chloroform-Methanol-Wasser (30:60:8) gelöst. Die Gesamtlipide von Hela 229-Zellen wurden auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) aufgebracht, und man ließ sie sich 20 min binden. Neutrale Lipide wurden zunächst mit fünf Gelvolumenteilen Methanol eluiert, dann wurde die Fraktion, die Chlamydia-Rezeptor ("Rezeptor") enthielt, mit fünf Gelvolumenteilen Methanol, enthaltend 10-20 mM NH&sub4;HCO&sub3;, eluiert. Fraktionen, die Rezeptor enthielten, wanderten zwischen CMH und CDH, wie analysiert durch HPTLC, und waren schwach Orcinol-positiv. Durch die Fähigkeit, radioaktiv markierte Elementarkörperchen zu binden, wie analysiert mit dem Chromatogrammdeckschichttest, der in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde verifiziert, daß die Phospholipid-Fraktionen den Chlamydia-Rezeptor enthielten. Andere saure Lipide wurden mit fünf Gelvolumenteilen Methanol, enthaltend 0,5 M NH&sub4;HCO&sub3;, eluiert. Jede Lipidelution wurde an einem Rotationsverdampfer getrocknet und erneut in 1:1 Methanol-Chloroform gelöst.
- Die Fraktion, die Rezeptor enthielt, wurde weiter gereinigt durch Chromatographie auf präparativen Silicagel G-2000 Mikrons-Dünnschichtplatten (Anal. Techn. Newark, N.J.), entwikkelt mit 5:4:1 Chloroform-Methanol-wäßriges 0,25%iges KCl. Die Platten wurden mit Primulin besprüht und mit einem langwelligen UV-Licht untersucht. Die Bande, die Rezeptor enthielt, färbt sich positiv mit Primulin und bindet Chlamydia im Chromatogrammdeckschichttest, wie beschrieben in Beispiel 1. Die Rezeptor-Bande wurde herausgekratzt, zerkleinert und in eine Glassäule gepackt. Die Säule wurde mit fünf Gelvolumenteilen Chloroform gewaschen, dann wurde Rezeptor mit zehn Gelvolumenteilen Methanol eluiert. Die Elution wurde rotationsverdampft und auf 1/2 des ursprünglichen Volumens mit 1:1 Methanol-Chloroform erneut gelöst. Die Reinheit des Rezeptors wurde durch Dünnschichtchromatographie untersucht und seine Fähigkeit, als der Chlamydia-Rezeptor zu wirken, wurde durch Chromatogrammdeckschichttest verifiziert, beide Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Aminosäureanalyse (gemäß dem Verfahren von Spackman et al., Anal. Chem. 30:1190-1206, 1958) des Rezeptors zeigte ein Fehlen von Aminosäuren, aber das Vorhandensein von Ethanolamin (10-15 Gew-%). Die Ergebnisse der Fettsäureanalyse (gemäß dem Verfahren von Gaver & Sweeley, J. Am. Oil Chem. 42:294-298, 1965) von "bPE" (L-α-Phosphatidylethanolamin aus Rinderhirn, P8673 Chargennummer 69F-8365-1, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Rezeptor sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Fettsäurezusammensetzung von bPE und Rezeptor % des Gesamtfettsäuregehaltes Fettsäure Rezeptor a Zwei unterschiedliche ungesättigte C18:1-Fettsäuren
- Fast-Atom-Bombardment-Massenspektren (FAB-MS) im Negativionen- Modus wurden auf einem VG ZAB-SE-Magnetsektorinstrument aufgenommen. Proben wurden in Triethanolamin gelöst und auf das Target aus rostfreiem Stahl geladen, das mit Xenon-Atomen mit einer kinetischen Energie von 8 keV bombadiert wurde, und eine Beschleunigungsspannung von 10 kV wurde verwendet. Gasflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (GLC-MS) im Elektronionisations-Modus wurde auf einem VG-12-250-Quadropol-Instrument durchgeführt, das mit einer DB-1-Kapillarsäule (0,25 mm x 30 m) ausgerüstet war. Spektren wurden bei 70 eV mit einer Ionenquellentemperatur auf 200ºC aufgezeichnet. Für Gasflüssigkeitschromatographie (GLC) wurde ein Hewlett-Packard 5890-Instrument verwendet, ausgerüstet mit einem Flammenionisationsdetektor. Trennungen wurden auf einer DB-1-Kapillarsäu- le (0,25 mm x 30 m) durchgeführt.
- FAB-MS im Negativionen-Modus von bPE und Rezeptor zeigte ein kompliziertes Muster von [M-1]&supmin;-Ionen über einen Bereich von 600-900 Masseneinheiten. Beide Verbindungen zeigten eine beträchtliche Heterogenität im Lipid-Teil. Der Bereich für die relative Molekülmasse ist, was man für Phosphatidylethanolamine erwarten kann. Subtraktion des bPE-Spektrums vom Rezeptor- Spektrum zeigte, daß der Rezeptor eine von bPE verschiedene Lipid-Einheit aufweist.
- ¹H- und ¹³C-Spektren wurden auf einem Bruker AM-500-Instrument aufgezeichnet. Spektren wurden in CD&sub3;OD bei 27ºC erhalten und chemische Verschiebungen wurden ausgedrückt relativ zu internen Tetramethylsilan, gesetzt auf 0 ppm (für ¹H-Spektren), oder durch Setzen des zentralen Signals der Methyl-Resonanz in CD&sub3;OD auf 48,9 ppm (für ³C-Spektren). Zweidimensionale Proton-Proton- Spektren mit Correlation Spectroscopy (COSY) und Distortionless Enhancement of Polarisation Transfer (DEPT) wurden gemäß dem Standard-Softwareprogramm Bruker Spectrospin erhalten.
- Die ¹H-Spektren des Rezeptors zeigten charakteristische Signale für ein Lipid mit CH&sub3;-Gruppen (0,85 ppm) und CH&sub2;-Signale aus aliphatischen Ketten (1,3 ppm). Beträchtliche Mengen an Ungesättigtheiten in den Fettsäure-Ketten wurden aus der Menge aus Signalen um 5,4 ppm herum deutlich. Eine Anzahl von Signalen, die sich nicht von Fettsäuren ableiten, waren im Bereich von 6-3 ppm zu sehen. Zwei Spinsysteme mit gleichen Intensitäten und mit ähnlichen Merkmalen, die jedes fünf Signale enthielten, wurden nachgewiesen.
- Das erste System mit Multiplett-Signal bei 5,23 ppm war durch Cross-Peaks im COSY-Spektrum verbunden mit zwei AB-Systemen (CH&sub2;-Gruppen, beurteilt von ihrer T&sub1;-Relaxation her), eines bei 4,43 ppm und 4,17 ppm und das andere bei 3,95 ppm (Signal, das von zwei Protonen stammt). Diese Merkmale weisen eine starke Ähnlichkeit zu Glycerin auf, das substituiert ist durch Fettsäuren in den Positionen 1 und 2 und einen Phosphordiester in Position 3. (Birdsal et al., J. Chem. Soc. Perkin II:1441-45, 1972; Huang & Andersson, J. Biol. Chem. 264:18667-72, 1989). Das andere Spinsystem zeigte ein ähnliches Muster, CH&sub2; bei 5,17 ppm und eine Zwei-Protonen-Resonanz bei 3,98 ppm. Das zweite AB-System zeigte eine merkbare Verschiebung des anderen AB- Systems zu 3,0 und 3,95 ppm. Dies könnte auf eine Anderung von einer acylierten zu einer alkylierten CH&sub2;-Gruppe hinweisen.
- Die zwei übrigen Signale, ein Dublett bei 5,97 ppm, verbunden mit einem Quartett bei 4,35 ppm, weisen auf eine Doppelbindung in einem Strukturelement:
- -O-CH=CH-CH&sub2; hin.
- Schließlich können zwei Multipletts bei 4,03 ppm und bei 3,15 ppm im Verhältnis von 4:1, verglichen mit den zwei Glycerin- Einheiten, erklärt werden durch die zwei CH&sub2;-Gruppen in einem phosphorylierten Ethanolamin:
- Die obigen Daten legen die folgenden zwei Strukturen in einem 1:1-Verhältnis nahe:
- R und R' repräsentieren die Kohlenwasserstoff(oder hydroxylierten Kohlenwasserstoff)-Ketten von Fettsäuren bzw. Plasmalogenen. Diese Interpretation wurde bestätigt durch Aufnahme eines Referenzspektrums von L-α-Phosphatidylethanolamin, erhalten aus Rinderhirn (bPE) und angegeben als 54% Plasmalogen enthaltend (d.h. α, β-ungesättigte Alkylketten). Das Zusammenpassen zwischen den zwei Spektren (Rezeptor und bPE) war nahezu perfekt, was die vorgeschlagenen Strukturen bestätigte. (Die Referenzprobe enthielt etwa 67% Plasmalogen statt 54%, wie angegeben.) ¹³C-Spektren unterstützten die obigen Strukturen.
- H. pylori-Isolate LC3 und LC11 wurden aus Magenschleimhaut- Biopsieproben von Kindern mit antraler Gastritis kultiviert. Die Organismen wurden in Brucella-Brühe mit 10% Glycerin und 10% fötalem Rinderserum bei -70ºC gelagert. Kulturen wurden typischerweise für maximal 6 Monate gelagert. Kulturen wurden auf Skirrow-Medium plattiert und bei 37ºC unter reduzierten Sauerstoff für 24 h inkubiert. Ein Inoculum von der Platte wurde in 10 ml Brucella-Brühe, ergänzt mit 10% fötalem Rinderkalbsserum, in einen Wegwerf-Erlenmeyerkolben gegeben. Der Kolben wurde mit einem lockeren Schraubverschluß in ein Evakuierungsgefäß gegeben und wurde unter reduziertem Sauerstoff bei 37ºC für 16 h unter konstantem Schütteln mit 70 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Dieses Verfahren führte konsistent zu Wachstum von 10&sup4; Organismen pro ml. Die Bakterien hatten eine klassische spirale Flagellat-Morphologie, wenn sie unter einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet wurden. Sie waren positiv auf Urease, Oxidase und Katalase.
- Ein polyvalenter Vollzell-H. pylori-Antikörper wurde durch intravenöse Injektion von formalisiertem H. pylori-Stamm LC3 in ein 1500 g schweres weißes Neuseeland-Kaninchen produziert, Bakterien (10&sup4;) in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden injiziert, 2 und 6 Wochen später gefolgt von Injektionen von 10&sup8; Organismen, die in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert waren. Antiserum wurde mit Hilfe eines Venenkatheters (mit den Kaninchen unter Vollnarkose) zwei Wochen nach der letzten Injektion erhalten. Das Vorhandensein von H. pylori-Antikörper wurde durch Immunoblots von Vollzell- Beschallungsprodukten von sechs getrennten H. pylori-Isolaten gezeigt. Der Antikörper reagierte mit denselben Proteinen aus jedem Isolat.
- Lipid-Extrakte (50 ug) wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Folie mit Plastikrücken (Polygram SIL-G, Brinkman Instruments, Ontario, Kanada) in Chloroform/Methanol/Wasser, 65:25:4 (volumenbezogen), getrennt. Die Platten wurden in 3% Gelatine bei 37ºC für 2 h blockiert. Nach dem Waschen wurden die Platten bei Raumtemperatur in einer Atmosphäre von Kohlendioxid/- Wasserstoff mit frisch kultiviertem H. pylori in Wachstumsmedium (10&sup6;/ml) inkubiert. Nach 2 h Inkubation wurden die Platten in 100 mmol/l "Tris"-Kochsalzlösung pH 7,6 gewaschen, in einer 1/600-Verdünnung von Kaninchen-H. pylori-Antiserum inkubiert und für weitere 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wieder gewaschen und mit Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad, Richmond, Cal.), für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Organismen durch Zugabe von Peroxidase-Substrat 4-Chlor-1-naphthol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) sichtbar gemacht. Inkubationen in der Abwesenheit von H. pylori wurden gleichzeitig durchgeführt.
- Lipide wurden aus veralteten roten Blutzellen, Schleimhautabstrichen von Schweinemagen und von menschlichem Magen, erhalten bei Necropsie, und kultivierten HEp2-Zellen extrahiert. Das Gewebe wurde gewogen, in einem minimalen Volumen Wasser homogenisiert und in 20 Volumenteilen Chloroform/Methanol 2:1 (volumenbezogen) extrahiert; der Extrakt wurde dann gegen Wasser getrennt. Die Lipide in der unteren Phase wurden getrocknet, in Chloroform/Methanol 98:2 gelöst und auf eine Kieselsäuresäule, die vorher in Chloroform äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wurde ausgiebig nacheinander mit Chloroform, Aceton/Methanol 9:1 (3:1 für Extrakte aus roten Blutzellen) und Methanol gewaschen. Die Fraktionen wurden getrocknet und gewogen. Zur weiteren Reinigung wurde die Methanol- Fraktion, die das Helicobacter-Bindungslipid enthielt, konzentriert, erneut auf eine Kieselsäuresäule aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von Chloroform/Methanol 10:1 bis 2:1 eluiert. Fraktionen wurden konzentriert und auf Bindung durch Dünnschichtchromatographiedeckschichttest, beschrieben in Beispiel 3, getestet. Diejenigen, die den Rezeptor enthielten, wurden gepoolt.
- Phospholipide aus menschlichen rohen Blutzellen und H. pylori- Rezeptor wurden durch HPLC getrennt (wie beschrieben von Heinz et al., Chromotographia 25:497-503, 1988). Fettsäuren der Rezeptor-Phospholipide wurden durch Phospholipase C-Verdauungs- Methanolyse, HPLC und GLC-Trennung und Peak-Integration analysiert, wie beschrieben von Myher et al. (Lipids 24:396-407, 1989). Die Ergebnisse der Fettsäure-Analyse von Phosphatidyiethanolamin aus roten Blutzellen ("RBC PE") und Rezeptor sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Fettsäure-Zusammensetzung von RBC PE und Rezeptor FAME + DMA FAME¹ REZEPTOR FLÄCHE % RBC PE FLÄCHE % DMA² ¹Fettsäuremethylester ²dimethylacetale
- Auf der Grundlage der Ergebnisse der Strukturcharakterisierung von H. pylori-Rezeptor ist es ein Phosphatidylethanolamin-ähnliches Molekül. Wenn native Phosphatidylethanolamine im Chromatogrammdeckschichttest (beschrieben in Beispiel 4.C. oben) getestet werden, wurde eine beträchtliche Variation in der Bindung von H. pylori an Phosphatidylethanolamin (PE) aus verschiedenen Quellen beobachtet. Von den nativen PES war das PE aus E. coli der wirksamste Rezeptor. PE aus Rinderhirn, Schweineleber, Eidotter und Sojabohne wurde in geringerem Maße von H. pylori erkannt, während PE aus Rinderleber und Hundehirn keine Rezeptoraktivität zeigte.
Claims (11)
1. Ein Verfahren zur Hemmung bakterieller Besiedelung in einer
biologischen Zubereitung, welches umfaßt:
In-Kontakt-Bringen besagter biologischen Zubereitung, die in
Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, die ausgewählt sind
aus der Gruppe, die aus Streptococcus, Chlamydia, Clostridium,
Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Helicobacter,
Shigella, Pasteurella, Coxiella, Mycobacterium, Salmonella,
Fusobacterium, Bacteroides und Campylobacter besteht, mit
einer wirksamen Menge von Phospholipid mit der Formel:
worin
oder
ist
und
R' eine Alkylgruppe ist und R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder
Alkenylgruppe von Fettsäuren ist.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte biologische
Zubereitung Zellen, Gewebe, Lösungen oder Körperflüssigkeiten
umfaßt, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Schweiß,
Gelenkflüssigkeit, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit oder Tränen,
umfaßt.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Phospholipid in
Kombination mit GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vorliegt.
4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Phospholipid in
Kombination mit Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vorliegt.
5. Ein Verfahren zur Entfernung von Bakterien aus einer
biologischen Zubereitung, welches umfaßt:
In-Kontakt-Bringen besagter biologischen Zubereitung, die in
Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, die ausgewählt sind
aus der Gruppe, die aus Streptococcus, Chlamydia, Clostridium,
Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Helicobacter,
Shigella, Pasteurella, Coxiella, Mycobacterium, Salmonella,
Fusobacterium, Bacteroides und Campylobacter besteht, mit
einen Phospholipid unter Bedingungen und für einen Zeitraum,
die ausreichend sind, um Bindung zwischen besagten
Phospholipid und besagten Bakterien zu ermöglichen, wobei
besagtes Phospholipid die Formel besitzt:
worin
ist
und
R' eine Alkylgruppe ist und R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder
Alkenylgruppe von Fettsäuren ist; und
Abtrennen besagten Phospholipids aus besagter biologischen
Zubereitung, wodurch besagte Bakterien aus besagter
biologischen Zubereitung entfernt werden.
6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei besagte biologische
Zubereitung Zellen, Gewebe, Lösungen oder Körperflüssigkeiten
umfaßt, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Schweiß,
Gelenkflüssigkeit, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit oder Tränen,
umfaßt.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Phospholipid auf
einem festen Träger immobilisiert ist.
8. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Phospholipid in
Kombination mit GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vorliegt und der
Abtrennschritt Abtrennen des Phospholipids und des GalNacβ1-
4Galβ1-4Glc-Ceramids aus der biologischen Zubereitung umfaßt,
wodurch die Bakterien aus der biologischen Zubereitung
entfernt werden.
9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Phospholipid oder
das GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid oder beide auf einem festen
Träger immobilisiert sind.
10. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Phosphalipid in
Kombination mit Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid vorliegt
und der Abtrennschritt Abtrennen des Phospholipids und des
Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramids aus der biologischen
Zubereitung umfaßt, wodurch die Bakterien aus der biologischen
Zubereitung entfernt werden.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Phospholipid
oder das Galβ1-3GalNacβ1-4Galβ1-4Glc-Ceramid oder beide auf
einem festen Träger immobilisiert sind.
Applications Claiming Priority (2)
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