DE69130536T2 - Adhäsionsrezeptoren für pathogene oder opportunistische mikroorganismen - Google Patents
Adhäsionsrezeptoren für pathogene oder opportunistische mikroorganismenInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft bestimmte Rezeptoren für pathogene und opportunistische Mikroorganismen. Die Rezeptoren können in Zusammensetzungen, Kits, Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis oder Messen von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen, zum Entfernen solcher Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit und zur Behandlung einer Infektion oder anderen von solchen Mikroorganismen verursachten Krankheit verwendet werden.
- Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes mikrobielles Adhäsinprotein, das an die Rezeptoren bindet; und Verfahren zum Erhalt eines derartigen Proteins. Derartige Verfahren schließen die Herstellung des rekombinanten Proteins auf gentechnischem Wege ein. Es wird erwartet, daß das Protein in diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen und insbesondere in einem Impfstoff zum Schützen eines menschlichen oder tierischen Wirts vor Infektion oder einer anderen von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen verursachten Krankheit nützlich ist.
- Auf mehrere Veröffentlichungen wird hierin durch arabische Ziffern in Klammern Bezug genommen. Am Ende der Beschreibung, unmittelbar vor den Ansprüchen, können vollständige Bezugsstellen für diese Literaturhinweise gefunden werden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen sind hierin in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf einbezogen, es sei denn, es ist anderweitig angegeben.
- Der Vorgang, durch den Mikroorganismen an Wirtszellen binden, wird als Adhärenz bzw. Anhaften oder Adhäsion bezeichnet, und es ist jetzt gängigerweise akzeptiert, daß dieser Mechanismus ein wichtiger Schritt bei der Einleitung einer mikrobiellen Kolonisierung und Infektion ist. Es war seit langer Zeit bekannt, daß die spezifische Adhäsion von Bakterien, Pilzen, Mycoplasmen und Viren an Wirtszellen durch Zelloberflächen-Kohlenhydratstrukturen vermittelt wird (1, 2). Dies ist nicht überraschend, da alle tierischen und humanen Zellen zuckerbeschichtet sind. D. h., sie sind alle mit einer Schicht aus Kohlenhydrat bedeckt, das in Form von Glykoproteinen und Glykolipiden vorkommt, welche in der Zellmembran verankert sind und die Glykomoleküle sind, mit denen viele Mikroorganismen während des Infektionsvorgangs zuerst in Kontakt kommen. Im allgemeinen werden die Strukturen auf den Mikroorganismen, welche die Bindung infektiöser Agentien an Wirtszellen vermitteln, als Adhäsine bezeichnet, und die Wirtszell-Kohlenhydratstrukturen, welche von mikrobiellen Adhäsinen erkannt werden, werden als die Rezeptoren bezeichnet. Deshalb ist das Vorhandensein von Rezeptoren auf Wirtsgewebe genau so sehr eine Determinante des mikrobiellen Infektionsvermögens wie das Auftreten von Adhäsinen auf den Mikroorganismen.
- Zelloberflächenkohlenhydrate sind als Rezeptoren für Infektion hauptsächlich auf der Grundlage indirekter Untersuchungen in Betracht gezogen worden, wie der Inhibition von mikrobieller Adhäsion oder Hämagglutination durch einfache Zucker und/oder durch die Vorbehandlung von Zellen mit Kohlenhydrat-spaltenden Enzymen, die als Glykosidasen bezeichnet werden (2, 3). Erst kürzlich ist eine systematischere Untersuchung unter Verwendung direkter Bindungsassays durchgeführt worden. Ein derartiger Assay beinhaltet das Überlagern von Glykolipid-Chromatogrammen mit markierten Mikroorganismen, und auf diese Weise kann von einer Anzahl von Glykolipiden gezeigt werden, daß sie an ein bestimmtes Bakterium oder Virus binden. Da Glykolipide ein Oligosaccharid pro Molekül enthalten (anders als Glykoproteine, welche mehrere verschiedene Saccharide pro Molekül enthalten), wird die spezifische Kohlenhydratrezeptorsequenz viel einfacher ermittelt (4). Unter Anwendung der Überlagerungstechnik wurde gezeigt, daß derjenige E. coli. welcher Harnwegsinfektionen beim Menschen verursacht, an Gal-alpha-1-4Gal-enthaltende Glykolipide bindet (5). Dieses Ergebnis war der Anstoß für eine gründlichere Untersuchung von Glykolipiden als Rezeptoren für infektiöse Agentien und Toxine.
- Bis heute sind Glykolipidrezeptoren für eine Vielzahl von Mikroorganismen und Toxinen beschrieben worden. Zum Beispiel binden Arten von Propionibacterium an Lactosylceramid (GalB1-4GlcB1-1Cer) (6, 7), viele Lungen-pathogene Mikroorganismen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae, binden an Ganglio-Reihen-Glykolipide, enthaltend GalNacB1-4GalB1-4Glc-Sequenzen (8), und Mycoplasma pneumoniae bindet an sulfatierte Glykolipide, die Gal(3So&sub4;)B1-1Cer-Sequenzen enthalten (9). (Wie in den Formeln in dieser Anmeldung verwendet, ist B gleichbedeutend mit beta.) Weiterhin ist berichtet worden, daß Streptococcus pneumoniae an Glykolipide bindet, welche das Disaccharid GlcNAcB1-3Gal enthalten (10,11). Kürzlich ist auch von Neisseria gonorrhoeae berichtet worden, an Ganglio-Reihen-Glykolipide zu binden, welche GalNAcB1- 4GalB1-4Glc-Sequenzen enthalten (12, 13).
- Strömberg et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 4902-4906, offenbart mögliche Kohlenhydratrezeptoren für N. gonorrhoeae, aber gibt an, daß N. gonorrhoeae nicht an die Rezeptoren der Lacto- und Lactoneo-Reihen bindet (siehe Tabelle 1).
- Strömberg & Karlsson (1990) J. Biol. Chem. 265. 11244-11250 offenbart die Bindung von bestimmten Lacto- und Lactoneo-Reihen-Rezeptoren an Propionibacteria granulosum. Dieser Mikroorganismus ist nicht einer der Bakterientypen, auf die spezifisch in den Ansprüchen Bezug genommen wird.
- Die US 4 762 800 beschreibt monoklonale Antikörper herstellende Hybridomzellinien, welche fähig zur Erkennung von Antigenen von Krebszellen sind. Es gibt darin keine Beschreibung von irgendwelchen Rezeptoren für jedwede Bakterien.
- Die WO 91/06007 (Stand der Technik unter Artikel 54(3)EPÜ) erläutert bestimmte Rezeptoren für bestimmte Mikroorganismen. Der Bezugsstelle ist zu entnehmen, daß Staphylococcus, Streptococcus und Pseudomonas an Asialo-GM1, Asialo-GM2 und Fucosyl- Asialo-GM1 binden und daß Mycoplasma an Lacto-Reihen-Rezeptoren bindet.
- Lomberg et al. (1986) Infect. Immun 51, 919-926 beschreibt den Einfluß von Kohlenhydraten, die für die rote Blutkörperchen-Gruppenfestlegung verantwortlich sind, auf die Bindung des Bakteriums E. coli.
- de Man et al. (1987) J. Clin. Microbiol. 25, 401-406 beschreibt den Nachweis von E.coli. welcher an die Globo-Reihe von Glykolipiden bindet.
- Die Erfinder haben noch einen anderen Rezeptor gefunden, welcher überraschenderweise ein universeller Rezeptor für pathogene und opportunistische Mikroorganismen zu sein scheint. Mit einem derartigen Rezeptor werden ein gereinigtes universelles Adhäsin-Protein, das dafür codierende Gen oder die dafür codierenden Gene und durch solche Gene hergestellte rekombinante Proteine erhalten. Das Protein wird in einem Breitbandimpfstoff gegen diese Mikroorganismen als auch in diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen nützlich sein.
- Es ist ein Ziel der Erfindung, Rezeptoren für pathogene oder opportunistische Mikroorganismen bereitzustellen.
- Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, als Rezeptoren für pathogene oder opportunistische Mikroorganismen verwendbare Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen.
- Ein ferneres Ziel der Erfindung besteht darin, diagnostische Kits und Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen in einer Probe zur Verfügung zu stellen.
- Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Entfernen pathogener oder opportunistischer Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit.
- Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, pharmazeutische Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung, Prävention oder Abmilderung von Krankheit oder Infektion in Tieren, welche durch pathogene oder opportunistische Mikroorganismen verursacht werden, zur Verfügung zu stellen.
- Ein ferneres Ziel der Erfindung besteht darin, ein in Diagnostika, Therapeutika und Impfstoffen verwendbares, isoliertes mikrobielles Adhäsinprotein bereitzustellen.
- Ein noch weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, für das mikrobielle Adhäsinprotein codierende DNA, die DNA enthaltende Vektoren und durch solche DNA und Vektoren transformierte Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen.
- Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden teilweise in der Beschreibung, welche folgt, dargestellt werden und werden teilweise aus der Beschreibung offensichtlich oder können durch die Ausübung der Erfindung ersehen werden. Die Ziele und Vorteile der Erfindung werden mittels der Instrumentalisierung und Kombinationen, welche in den beigefügten Ansprüchen besonders hervorgehoben werden, erreicht werden.
- Um die Ziele in Übereinstimmung mit der Absicht der Erfindung, wie hierin beinhaltet und in breitem Umfang beschrieben, zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung einen Rezeptor für einen pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismus bereit, umfassend eine im wesentlichen reine Verbindung, gewählt aus der Gruppe, welche besteht aus GalB1- 4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1- 3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3Gala1-4Glc, Gala1-4GlcNAcB1-3Gal und GalB1-3-GlcNAcB1- 3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R für H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X steht, so daß X(R) ein Ceramid ist. Vorzugsweise ist ein derartiger Rezeptor eine reine Verbindung aus der vorstehenden Gruppe, angeheftet an ein lösliches oder unlösliches Substrat. Am stärksten bevorzugt ist der Rezeptor an ein Liposom angeheftet.
- In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen in einer Probe, die im Verdacht steht, derartige Mikroorganismen zu enthalten. Die Probe wird mit Rezeptoren der Erfindung während einer Zeitdauer und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ausreichend sind, damit die Rezeptoren an die Mikroorganismen binden, wenn sie in der Probe vorhanden sind. Danach wird eine Bestimmung vorgenommen, ob die Rezeptoren an die Mikroorganismen gebunden haben oder nicht. Vorzugsweise sind die Rezeptoren an ein unlösliches Substrat angeheftet, und die Komplexe werden durch einen nachweisbar markierten Antikörper gegen ein Antigen auf der Oberfläche der Mikroorganismen nachgewiesen.
- Die Erfindung umfaßt ferner ein diagnostisches Kit zum Nachweis dieser Mikroorganismen in einer Probe. Das Kit enthält die an einen unlöslichen Träger angehefteten Rezeptoren der Erfindung und Mittel zum Nachweisen oder Messen der Bildung von Komplexen aus den Rezeptoren und den Mikroorganismen oder den Rezeptoren und den Adhäsinproteinen von den Mikroorganismen. Das Kit ist besonders nützlich zum Nachweis von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen in einer Probe, die eine Körperflüssigkeit aus einem Menschen oder einem anderen Tier ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mittel zum Nachweisen oder Messen der Komplexe um einen Immunoassay.
- In einem anderen Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Entfernen dieser Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird mit den Rezeptoren der Erfindung während einer Zeitdauer und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ausreichend sind, damit die Rezeptoren an die Mikroorganismen binden. Die Flüssigkeit wird dann von dem Kontakt mit den Rezeptoren entfernt, wodurch die Mikroorganismen aus der Flüssigkeit entfernt werden. Die verwandte Vorrichtung umfaßt einen Behälter zur Aufnahme der Flüssigkeit, Mittel zum Einführen der Flüssigkeit in einen Behälter und Mittel zum Entfernen derselben aus dem Behälter. Der Behälter enthält die Rezeptoren der Erfindung, vorzugsweise gebunden an einen festen Träger innerhalb des Behälters.
- Die Erfindung umfaßt ferner Verfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung, Prävention oder Abmilderung von Infektion oder anderen Krankheiten bei Menschen und anderen Säugern, die durch pathogene oder opportunistische Mikroorganismen verursacht werden. Eine wirksame Menge der Rezeptoren der Erfindung für eine derartige Behandlung, Prävention oder Abmilderung wird dem Säugerwirt, vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, verabreicht. Der Träger ist vorzugsweise ein Liposom. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Träger um ein Makromolekül, an welches der Rezeptor gekoppelt worden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Rezeptor in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert, die mit Säugerzellen physiologisch verträglich ist, und eine derartige Zusammensetzung wird verwendet, um das Anhaften von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen an solchen Zellen zu inhibieren oder derartige Mikroorganismen von solchen Zellen zu entfernen.
- In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein im wesentlichen reines mikrobielles Adhäsinprotein zur Verfügung, das aus der Oberfläche eines pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismus erhalten wurde, welches an die Rezeptoren der Erfindung bindet. Das Protein wird durch Solubilisieren der Membranen von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen erhalten. Das solubilisierte Material enthält das Adhäsinprotein. Dieses Material wird von dem unlöslichen Material abgetrennt und mit den Rezeptoren der Erfindung während einer Zeitdauer kontaktiert, die ausreichend ist, damit die Proteinmoleküle an die Rezeptoren binden. Die Rezeptoren sind an einen unlöslichen festen Träger angeheftet. Die Proteinmoleküle werden dann von den Rezeptoren entfernt und gewonnen. Vorzugsweise werden die Rezeptoren nach der Kontaktierung mit dem solubilisierten Material gewaschen, um nicht-gebundenes Material vollständig zu entfernen.
- Die Erfindung schließt auch modifizierte Proteine und Polypeptide ein, welche von dem Adhäsionsprotein abgeleitet sind, vorausgesetzt daß derartige abgeleitete Proteine und Polypeptide an die Rezeptoren der Erfindung binden. Vorzugsweise handelt es sich bei derartigen Derivaten um eines oder mehrere der Epitope des Adhäsinproteins. Vorzugsweise sind sie auch für menschliche oder tierische Wirte immunogen und immunologisch kreuzreaktiv mit dem bakteriellen Adhäsinprotein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid verändert worden, um dessen Immunogenität zu steigern.
- Die Polypeptide sind nützlich in einem Impfstoff zur Prävention, Abmilderung oder Behandlung von Infektion oder einer anderen Erkrankung in einem menschlichen oder tierischen Wirt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff eine immunologisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids der Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff einen avirulenten Mikroorganismus, der gentechnisch behandelt worden ist, um ein Protein oder Polypeptid der Erfindung zu exprimieren.
- Die Proteine und Polypeptide der Erfindung sind vorzugsweise rekombinante Proteine und Polypeptide, welche durch gentechnische Techniken hergestellt worden sind. Sie werden durch eine geeignete Wirtszelle hergestellt, welche durch DNA transformiert worden ist, die für derartige Proteine oder Polypeptide codiert.
- Eine isolierte oder im wesentlichen reine DNA-Sequenz, welche für das mikrobielle Adhäsinprotein der Erfindung codiert, wird wie folgend erhalten. Rezeptoren der Erfindung werden verwendet, um eine genomische Bibliothek zu screenen, welche die DNA eines pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismus enthält. Die Bibliothek ist aus Klonen von Vektoren angefertigt, in welche verschiedene Sequenzen der DNA funktionstüchtig und wiedergewinnbar eingefügt worden sind, wobei jeder der Vektoren nur eine Sequenz der DNA enthält. Die Klone werden mit den Rezeptoren der Erfindung kontaktiert, um einen Klon zu identifizieren, welcher an die Rezeptoren bindet. Der Klon wird dann isoliert. Vorzugsweise werden die exogenen DNA-Sequenzen aus dem Klon zurückgewonnen.
- Die Erfindung umfaßt ferner isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA, die aus dieser DNA abgeleitet ist, zum Beispiel durch einzelne oder mehrere Mutationen. Vorzugsweise hybridisiert eine derartige DNA mit der aus der genomischen Bibliothek erhaltenen DNA unter Bedingungen mäßiger Stringenz.
- Die begleitenden Zeichnungen, welche in diese Beschreibung eingebunden sind und einen Teil davon bilden, veranschaulichen eine Ausführungsform der Erfindung und dienen, zusammen mit der Beschreibung, zur Erklärung der Prinzipien der Erfindung.
- Die Fig. 1 zeigt die Bindung des ¹²&sup5;I-markierten N. gonorrhoeae-Stammes MS11mk (P-, PH-) an Paraglobosid und Lacto-N-triaosylceramid, aufgetrennt durch Dünnschichtchromatographie. Glykolipide wurden auf Aluminiumrückseiten-Silicagel-HPTLC-Platten chromatographiert, welche in Chloroform/Methanol/0,25% KCl in Wasser, 5 : 4 : 1, entwickelt wurden. Die Platten wurden mit 0,1% Polyisobutylmethacrylat beschichtet, in TBS-BSA getränkt, und 2 Stunden lang bei 25ºC mit ¹²&sup5;I-markierten Gonokokken inkubiert, welche in HBSS-BSA suspendiert waren (Tafel B), oder mit Orcinol-Reagenz besprüht, um Glykolipide zu identifizieren (Tafel A). Spuren 1: jeweils 1 ug Galactosylceramid (CMH), Lactosylceramid- Dublette (CDH), Trihexosylceramid (CTH), Globosid (GL4), Forssman-Glykolipid (FORS) und Ganglioside GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b und GT1b; Spuren 2 : 1 ug Sialylparaglobosid; Spuren 3 : 1 ug Paraglobosid, abgeleitet aus Sialylparaglobosid durch Behandlung mit Neuraminidase; Spuren 4: Lacto-N-triaosylceramid, abgeleitet aus Paraglobosid durch Behandlung mit beta-Galactosidase; Spuren 5 : 1 ug Lactosylceramid, das aus Lacto-N-triaosylceramid durch Behandlung mit N-Acetyl-B-hexosaminidase abgeleitet wurde. Für die Strukturen siehe Tabelle I.
- Die Fig. 2 zeigt die Bindung von N. gonorrhoeae-Stamm MS 11mk (P-, PII-) an immobilisierte Glykolipide. Lipide in 25 ul Methanol, enthaltend jeweils 0,1 ug der Hilfslipide Cholesterin und Phosphatidylcholin, wurden in Flachbodenvertiefungen von Polyvinylchlorid- Mikrotiterplatten eingedampft. Die Vertiefungen wurden über Nacht mit 1% Albumin bei 4ºC geblockt, zweimal mit HBSS-BSA gewaschen und bei 25ºC mit 25 ul ¹²&sup5;I markierten N. gonorrhoeae inkubiert (ungefähr 10&sup5; cpm). Nach zwei Stunden wurden die Vertiefungen fünfmal mit Kochsalzlösung gewaschen, aus der Platte geschnitten, und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Szintillationszähler quantifiziert. In Kontrollexperimenten wurden Gonokokken lediglich mit Hilfs-Lipiden inkubiert, um hinsichtlich der nicht-spezifischen Bindung zu korrigieren (typischerweise < 1% der zugesetzten Gesamtradioaktivität). Die N. gonorrhoeae-Bindung wurde in HBSS-BSA für Asialo-GM2 ( ), Paraglobosid ( ) und Lactosylceramid, GM1 oder Sialylparaglobosid ( ) bestimmt.
- Die Fig. 3 zeigt die Bindung von monoklonalem Anti-LOS-Antikörper 4BE12 an authentisches Paraglobosid. Tafel A: durch Orcinol-Farbung nachgewiesene Glykolipide. Tafel B: Autoradiogramm der Chromatogramm-Überlagerung mit monoklonalem Antikörper B54 und radioaktiv markiertem Anti-Maus-IgM-Antikörper. Spuren 1: jeweils 1 ug Galactosylceramid (CMH), Lactosylceramid (CDH), Trihexosylceramid (CTH), Globosid (GL4), Forssman- Glykolipid (FORS) und Ganglioside GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b und GD1b;
- Spuren 2 : 1 ug Asialo-GM1; Spuren 3 : 1 ug Paraglobosid; Spuren 4, 5, 6, 7, 8 und 9 sind 0,5, 0,25, 0,125, 0,062, 0,031 bzw. 0,016 ug Paraglobosid.
- Die Fig. 4 zeigt die Bindung von Pseudomonas aeruginosa CT4 an mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennte Glykolipide. Die Glykolipide wurden auf Aluminiumrückseiten- Silicagel-HPTLC-Platten chromatographiert, die in Chloroform/Methanol/0,25% KCl in Wasser, 5 : 4 : 1, entwickelt wurden. Die Platten wurden mit Polyisobutylmethacrylat beschichtet, in Tris-BSA getränkt und 2 Stunden lang bei 25ºC mit ¹²&sup5;I markiertem P. aeruginosa, der in 1% BSA enthaltendem Tris-BSA suspendiert war, inkubiert. Die Fig. 4 A zeigt mit Orcinol- Reagenz nachgewiesene Standardglykolipide. Die Fig. 4B zeigt Glykolipidrezeptoren, die durch Überlagern mit radioaktiv markierten Mikroorganismen, gefolgt von Autoradiographie (18 h) nachgewiesen wurden. Spuren 1: Galactosylceramid (CMH), Lactosylceramid (CDH), Sulfatid (SFT), Globtriaosylceramid (CTH), Globosid (GL4), und Ganglioside GM3, GM2, GM1, GD1a, GD1b und GT1b (1 ug von jedem Glykolipid); Spuren 2: Gangliotriaosylceramid (Asialo-GM2, 1 ug) und Gangliotetraosylceramid (Asialo-GM1, 1 ug); und Spuren 3: Lacto- N-tetraosylceramid-Dublette (Paraglobosid, 2 ug).
- Es wird nun ausführlich Bezug genommen auf die vorliegend bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, welche zusammen mit den nachfolgenden Beispielen, dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
- Die Erfindung betrifft einen universellen Adhäsionsrezeptor für pathogene oder opportunistische Mikroorganismen, mikrobielle Adhäsinproteine und Polypeptide, welche an den Rezeptor binden, für die Proteine codierende DNA und Verfahren zur Anwendung dieser Materialien. Wie hierin verwendet, bedeuten die Begrübe "Adhäsinrezeptor" oder "Rezeptor" eine Verbindung, welche eine spezifische Affinität für einen oder mehrere Mikroorganismustypen aufweist und selektiv daran bindet.
- Der Rezeptor umfaßt bestimmte Lacto-Reihen-Glykolipide und Derivate davon, welche als Adhäsionsrezeptoren für ein breites und mannigfaltiges Spektrum von Mikroorganismen wirken. Eines der Glykolipide ist Lactotriaosylcer (Lactotriaosylceraniid, N-Acetylglucosaminbeta-1-3-galactose-beta-1-4-glucose-beta-1-1-ceramid), welches durch die folgende Formel repräsentiert wird:
- GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1Cer
- Ein anderes ist Paraglobosid (Lactoneotetraosylceramid, Galactose-beta-1-4-N-acetylglucosamin-beta-1-3-galactose-beta-1-4-glucose-beta-1-1-ceramid), welches durch die folgende Formel repräsentiert wird:
- GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1Cer
- Ein drittes ist ein Isomer von Paraglobosid, welches durch die nachfolgende Formel repräsentiert wird:
- GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1Cer
- (Trivialnamen und Strukturen werden gemäß den Empfehlungen in Literaturhinweis 38 und den darin zitierten Bezugsstellen repräsentiert. Wie in den Formeln in dieser Anmeldung verwendet, ist B gleich beta.) Darüber hinaus schließen die Rezeptoren der Erfindung die obenstehend angegebenen Verbindungen ein, aus welchen der Fettsäurerest des Ceramidrestes entfernt worden ist. Schließlich beinhalten die Rezeptoren der Erfindung die Kohlenhydratreste der obenstehend angegebenen Strukturen und bestimmte Reste davon ein. Diese werden durch die nachstehenden Formeln repräsentiert:
- GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc
- GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc
- GlcNAcB1-3GalB1-4Glc
- GalB1-4GlcNAcB1-3Gal
- GalB1-3GlcNAcB1-3Gal
- Die bevorzugte Rezeptorstruktur ist GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1Cer.
- Deshalb umfassen die Rezeptoren der Erfindung eine im wesentlichen reine Verbindung, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1- 3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAc- B1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4 Glc, GalB1- 4GlcNAcB1-3Gal und GalB1-3-GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R für H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X steht; so daß X(R) ein Ceramid ist.
- Die Rezeptoren der Erfindung sind mindestens im wesentlichen rein und vorzugsweise rein. Wie hierin verwendet, bedeuten der Begriff "im wesentlichen rein" und ähnliche Begriffe, daß die Verbindung zu mindestens 80 Gew.-% rein ist. Das heißt, die Verbindung enthält nicht mehr als 20 Gew.-% an Chemikalien, die von der Verbindung verschieden sind. Wie hierin verwendet, bedeuten der Begriff "rein" und verwandte Begriffe, daß die Rezeptorverbindung lediglich eine Bande liefert, nachdem sie durch Dünnschichtchromatographie analysiert und gemäß den in Literaturhinweis 9, welcher hierin durch den. Bezug darauf einbezogen ist, beschriebenen Verfahren chemisch gefärbt worden ist. Falls notwendig kann die Verbindung durch bekannte Techniken weiter gereinigt werden. Somit ist die Rezeptorverbindung zu mindestens 90 Gew.-% rein, vorzugsweise zu mindestens 95 Gew.-% rein und am stärksten bevorzugt zu mindestens 98 Gew.-% rein.
- Wie zuvor erwähnt, wirken die Rezeptoren der Erfindung als Adhäsionsrezeptoren für eine breite Auswahl von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Mikroorganismen" Bakterien, Viren, Mycoplasma, Pilze, Rickettsien und Protozoen ein. Vorzugsweise handelt es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "pathogene Mikroorganismen" jedwede Mikroorganismen, welche eine Erkrankung (einschließlich Infektion) oder krankhafte Symptome in Menschen oder anderen tierischen Wirten verursachen. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "opportunistische Mikroorganismen" jedwede Mikroorganismen, welche gewöhnlich keine Erkrankung oder Infektion verursachen, welche aber unter bestimmten Umständen pathogen werden, in welchen der Wirtsorganismus belastet ist, so daß er eine beeinträchtigte Immunantwort aufweist. Vorzugsweise binden die Rezeptoren der Erfindung an Bakterien der folgenden Gattungen: Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium. Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Shigella. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei den Bakterien um die folgenden: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae (Gp. B), Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium difficile Borrelia burgdorferi (Lyme-Agenz), Haemophilus influenzae, Haemophilus narainfluenzae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas maltophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Shigella dysenteriae, Shigella flexerni und Coxiella burnetti. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Mikroorganismen um Rotaviren.
- Die Erfinder haben ebenfalls überraschenderweise herausgefunden, daß das Disaccharid, GlcNAcB1-3Gal, über welches als ein Rezeptor für S. pneumoniae aber nicht für irgendeines der anderen obenstehend erwähnten Mikroorganismen berichtet worden ist, auch als ein Rezeptor für die anderen obenstehend angegebenen Mikroorganismen wirkt. Daher schließt die Erfindung auch Zusammensetzungen mit diesem Rezeptor und Verfahren zur Anwendung davon in Hinblick auf von S. pneumoniae verschiedene Mikroorganismen ein.
- Die Rezeptoren der Erfindung werden durch bekannte Techniken in Verbindung mit den hierin offenbarten Lehren hergestellt. Paraglobosid wird durch 60 Minuten lange Desialylierung von Erythrozyten-Sialylparaglobosid mit 1 M Ameisensäure bei 100ºC hergestellt, wie es in Literaturhinweis 9 beschrieben wird. Lactotriaosylcer wird durch Verdau von Paraglobosid mit beta-Galactosidase hergestellt, wie beschrieben für die Herstellung von Asialo-GM2 aus Asialo-GM1 in Literaturhinweis 14. Die Lyso-Derivate dieser Verbindungen werden durch in Basta, M., Karmali, M., und Lingwood, C. (1989) J. Chm. Microbiol. 27: 1617-1622 offenbarte Techniken hergestellt, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Die Kohlenhydratrest-Derivate dieser Glykolipide werden durch Entfernen des Ceramidrestes hergestellt gemäß den Techniken von Miljkovic, M., und Schengrund (1986) Carbohydr. Res. 155: 175-181; Ito, M., und Yamagata, T. (1986) J. Biol. Chem. 261: 14278-14282; und Kanfer, J. N., und Hakomori, S-i (1983), Handbook of Lipid Research, Sphingolipid Biochem., Plenum Press, NY, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, oder direkt synthetisiert gemäß den Techniken der Europäischen Patentanmeldung 84850084.9 von Svenska Sockerfabriks Ab, veröffentlicht am 21. November 1984 (Publikations-Nr. 0 126 043), die hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Der Rezeptor GlcNAcB1- 3GalB1-4Glc wird gemäß den letztgenannten Techniken synthetisiert.
- Die Rezeptoren der Erfindung sind nützlich zum Nachweisen der Gegenwart von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen in einer Probe, die im Verdacht steht, solche Mikroorganismen zu enthalten. Darüber hinaus kann, da Adhäsine von manchen Mikroorganismen sezerniert werden können, die Gegenwart der Adhäsine mit dem Rezeptor nachgewiesen werden. Die Rezeptoren der Erfindung werden mit der Probe während einer Zeitdauer und unter Bedingungen kontaktiert, die ausreichen, damit Rezeptoren an die Mikroorganismen und/oder die Adhäsine binden, wenn eines davon oder beide vorhanden sind. Eine solche Zeit und derartige Bedingungen können von Fachleuten auf dem Gebiet leicht in Hinsicht auf irgendeinen jeweiligen Typ von Mikroorganismen bestimmt werden, wenn die hierin beschriebenen Lehren in Betracht gezogen werden. Man bestimmt dann, ob die Rezeptoren an die Mikroorganismen und/oder Adhäsine gebunden haben, wobei Mikroorganismus-Rezeptor- und/oder Adhäsin-Rezeptor-Komplexe gebildet werden. Die Bindung der Mikroorganismen und/oder der Adhäsine an die Rezeptoren wird durch dem Fachmann bekannte Techniken in Verbindung mit den hierin offenbarten Lehren bestimmt. Vorzugsweise sind die Rezeptoren an eine feste Matrix oder ein anderes unlösliches Substrat gebunden. Die Rezeptoren sollten an das Substrat in einer Menge und in einer Weise gebunden sein, welche eine ausreichende Bindung der nachzuweisenden Mikroorganismen gestattet. Vorzugsweise werden die Rezeptoren als eine molekulare Monoschicht gebunden, welche die Oberfläche des Substrats im wesentlichen überzieht bedeckt. Die tatsächliche Konzentration des Rezeptors zu einem gegebenen Substrat wird von dem jeweiligen nachzuweisenden Mikroorganismus, dem jeweiligen verwendeten Rezeptor, dem jeweiligen Substrat und der Bindungseffizienz des Rezeptors an den Mikroorganismus abhängen.
- Der Rezeptor kann an das Substrat auf jedwede geeignete Weise gebunden sein. Kovalente, nicht-kovalente oder ionische Bindung kann verwendet werden. Zum Beispiel kann der Lipid- Bereich hydrophobisch an bestimmte Kunststoffsubstrate gebunden werden. Eine kovalente Bindung kann durch Anheften des Rezeptors an reaktive Gruppen auf dem Substrat direkt oder über einen Linker-Arm, wie offenbart im U. S. -Patent Nr. 4 657 849 an Kallenius et al., welches hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, bewerkstelligt werden. Alternativ dazu können die Lyso-Derivate der Rezeptoren an den festen Träger gemäß des Verfahrens angeheftet werden, welches beschrieben ist in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 89113785.3 (Publikations-Nr. 0 352 766), eingereicht am 26. Juli 1989 und veröffentlicht am 31. Januar 1990, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
- Vorzugsweise wird der Rezeptor zuerst an ein lösliches Substrat, wie ein Protein, gekoppelt. Rinderserumalbumin wird bevorzugt. Dann wird diese Kombination an den unlöslichen Träger angeheftet.
- Das unlösliche Substrat kann jedwedes feste, unlösliche Material sein, an welches die Rezeptoren gebunden werden können und welches zweckmäßigerweise in dem Assay der Erfindung verwendet werden kann. Derartige Substrate schließen permeable und semipermeable Membranen, Glasperlen, Kunststoffperlen, Latexperlen, Kunststoffmikrotitervertiefungen, Agarose, Dextran, Sepharose und Diatomeenerde ein. Alternativ dazu können die Rezeptoren an jegliches poröse oder Flüssigkeits-permeable Material, wie ein Sieb oder Netz, gebunden werden. Ein Bindemittel kann verwendet werden, solange es nicht das Vermögen des Rezeptors, an Mikroorganismen zu binden, stört.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Rezeptoren in Liposomen eingebunden. Die Liposomen werden vorzugsweise hergestellt gemäß den Techniken von Gruner et al., Biochemistry, 24: 2833-2842 (1985), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Die Rezeptoren werden unter Verwendung von Standardtechniken in die Liposomen eingebunden. Sie werden im wesentlichen spontan in die Lipiddoppelschicht des Liposoms eingebunden, nachdem sie mit dem Liposom in Kontakt gebracht wurden. Der Fettsäureteil geht in die Lipidmembran, und der Kohlenhydratrest steht aus der Membran heraus, auf der Innenseite oder außerhalb des Liposoms.
- Nachdem die Probe mit dem Substrat, welches die Rezeptoren enthält, während einer ausreichenden Zeitdauer kontaktiert worden ist, um den Mikroorganismen zu gestatten, an die Rezeptoren binden, wird eine derartige Bindung durch die Anwendung des passenden Nachweismittels detektiert. Grundsätzlich wird das Substrat, welches die Rezeptoren enthält und das im Verdacht steht, an die Rezeptoren gebundene Mikroorganismen zu enthalten, mit einem Material in Kontakt gebracht, welches spezifisch an die Mikroorganismen bindet, die nachgewiesen werden sollen. Solche Materialien schließen, zum Beispiel, Antikörper gegen die spezifischen Mikroorganismen, insbesondere gegen Oberflächenproteine, oder einen Rezeptor, der spezifisch an die Mikroorganismen bindet, welche nachgewiesen werden sollen, ein. Im allgemeinen wird des Substrat gewaschen, um alle oder im wesentlichen alle ungebundenen Materialien zu entfernen. Der Nachweis-Assay kann ein Immunoassay, Agglutinationsassay, Dünnschichtchromatographie-Assay oder Cytotoxizitätsassay sein. Immunoassays schließen Radioimmunoassays, "Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays" (ELISA), Western-Blot, Immunofluoreszenzassays, Chemolumineszenzassays und Biolumineszenzassays ein. Das Ausmaß oder die Menge der Bindung kann ebenfalls durch die Anwendung bekannter Techniken ermittelt werden, welche eine Messung der- Menge oder Konzentration von Mikroorganismen in der Probe zur Verfügung stellen.
- Der Antikörper oder Kohlenhydratrezeptor kann mit einer Substanz markiert werden, die einfach nachzuweisen ist. Derartige nachweisbare Reste schließen ein Enzym oder eine radioaktive, fluoreszente oder chemolumineszente Einheit ein. Ein erster Antikörper gegen ein Oberflächenantigen der Mikroorganismen, welche nachgewiesen werden sollen, kann in Verbindung mit einem markierten zweiten Antikörper gegen den ersten Antikörper eingesetzt werden. Der erste Antikörper wird mit dem Substrat in Kontakt gebracht, wobei er an jegliche an Rezeptoren auf dem Substrat gebundene Mikroorganismen bindet. Das Substrat wird vorzugsweise gewaschen und mit dem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht, welcher dann nachgewiesen wird, wodurch die Gegenwart der Mikroorganismen auf dem Substrat angezeigt wird.
- Die verschiedenen nachweisbaren Reste, die verwendet werden können, um die in derartigen Assays verwendeten Antikörper oder Rezeptoren zu markieren, die Techniken, um dies zu bewerkstelligen, und die verschiedenen spezifischen Assays unter Bedingungen zu ihrer Anwendung sind dem Fachmann gut bekannt; siehe zum Beispiel das U. S. -Patent Nr. 4 486 530 an David et al., erteilt am 4. Dezember 1984, das U. S. -Patent Nr. 4 708 818 an Montagnier et al., erteilt am 24. November 1987, und das U. S. -Patent Nr. 4 753 873 an Beltz et al., erteilt am 28. Juni 1988, welche alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind. Ein besonders bevorzugter Assay, der die Rezeptoren der Erfindung beinhaltet, basiert auf demjenigen, welcher in Basta, et al., J. Clin. Microbiology, 27 : 1617-1622 (1989) offenbart ist, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
- Verschiedene Typen von Proben können hinsichtlich der Gegenwart von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen gemäß der Erfindung getestet werden. Bei der Probe kann es sich um eine biologische Probe handeln, die eine Körperflüssigkeit oder einen Gewebeextrakt aus einem Menschen oder einem anderen tierischen Patient umfaßt oder daraus abgeleitet ist. Die Probe wird normalerweise mit einer geeigneten Lösung, wie physiologische Kochsalzlösung, verdünnt werden. Alternativ dazu kann ein Baumwoll-Tupfer oder anderes. Material verwendet werden, um die Mikroorganismen aufzusammeln. Der Tupfer wird dann in eine sterile Lösung gebracht, um die Mikroorganismen in die Lösung freizusetzen. Die Lösung wird danach gemäß der Erfindung getestet.
- Die Erfindung kann auch verwendet werden, um auf die Gegenwart von Mikroorganismen in Umgebungen zu testen, welche steril sein sollten, wie Krankenhaus-Operationszimmer, Arzneimittel- und Medizinvorrichtungen-Herstellungsanlagen und Nahrungsmittel-Herstel lungseinrichtungen. Mikroorganismen können auf verschiedenen dem Fachmann bekannten Wegen gesammelt werden, und eine flüssige Probe, die solche Mikroorganismen enthält, kann hergestellt werden.
- Die Erfindung umfaßt ebenfalls Kits zum Nachweisen des Vorhandenseins von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen, welche von Nutzen in der wissenschaftlichen Forschung, der klinischen Diagnose und Nahrungsmittelsicherheits-Verfahren sein würden. Das Kit umfaßt: (1) Einen Behälter, der einen festen Träger oder ein anderes unlösliches Substrat hält, an welches die Rezeptoren der Erfindung angeheftet sind; und (2) ein Mittel zum Nachweis oder zum Messen der Bildung von Komplexen aus den Mikroorganismen oder Adhäsinen und Rezeptoren. Alternativ dazu können die Rezeptoren an die Wände des Behälters angeheftet werden, welche der Probe ausgesetzt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem unlöslichen Substrat um die Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Das Nachweis- oder Messungsmittel ist vorzugsweise ein Reagenz, das einen nachweisbaren Rest enthält und in der Lage zur Bindung an die Mikroorganismen ist. Ein derartiges Reagenz kann der Rezeptor der Erfindung, konjugiert mit einem nachweisbaren Rest, sein. Alternativ dazu kann das Reagenz ein Antikörper gegen ein Oberflächenantigen der Mikroorganismen, konjugiert an einen nachweisbaren Rest, wie ein Enzym, sein. In einer anderen alternativen Ausführungsform ist das Nachweis- oder Messungsmittel ein erster Antikörper gegen ein Oberflächenantigen des Bakteriums und ein zweiter Antikörper gegen den ersten Antikörper, wobei der zweite Antikörper an einen nachweisbaren Rest konjugiert ist. Ein Beispiel eines derartigen zweiten Antikörpers ist mit Peroxidase markierter Ziegen-Anti-IgG.
- Die Erfindung umfaßt auch Verfahren und Gerätschaft zum Entfernen pathogener oder opportunistischer Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird mit den vorliegenden Rezeptoren während einer Zeitdauer und unter Bedingungen kontaktiert, welche ausreichen, um die Mikroorganismen an die Rezeptoren zu binden. Danach wird die Flüssigkeit vom Kontakt mit den Rezeptoren entfernt oder die Rezeptoren werden von dem Kontakt mit der Flüssigkeit entfernt, wodurch eine Flüssigkeit bereitgestellt wird, welche frei von den Mikroorganismen ist oder in welcher ihre Anzahl wesentlich verringert worden ist, abhängig vom beabsichtigten Ausmaß der Entfernung. Vorzugsweise sind die Rezeptoren an einen festen Träger angeheftet, wie hierin bereits erörtert, und die Flüssigkeit strömt um die Rezeptoren.
- Die betreffende Vorrichtung umfaßt einen Behälter für die Flüssigkeit mit einem Einlaß zum Einführen der Flüssigkeit und einem Auslaß, um sie zu entfernen. Darüber hinaus enthält der Behälter die Rezeptoren, gebunden an einen festen Träger, oder alternativ dazu können die Rezeptoren an die Oberfläche des Behälters gebunden sein, welche der Flüssigkeit ausgesetzt ist. Am stärksten bevorzugt ist der Behälter eine chromatographische Säule, welche eine Festphasenmatrix enthält, an die die Rezeptoren der Erfindung angeheftet sind. Zum Beispiel können sie kovalent an Epoxy-aktivierte Sepharose (Sepharose-4B, Pharmacia) oder eine ähnliche Matrix auf Agarosebasis gekoppelt sein. Die Flüssigkeit wird in die Spitze der Afflnitätssäule eingeführt, und die Mikroorganismen werden entfernt, wenn die Flüssigkeit die Säule hinabläuft, um am Boden aufgefangen zu werden.
- In einer alternativen Ausführungsform ist der feste Träger für die Rezeptoren eine Membran, vorzugsweise eine semipermeable Membran, oder ein Liposom. Bei Durchtritt der Flüssigkeit durch die Membran oder das Liposom werden Mikroorganismen entfernt.
- Die Rezeptoren können auch zur Behandlung, Prävention oder Abmilderung von durch pathogene oder opportunistische Mikroorganismen erzeugter Krankheit oder Infektion in einem Wirt verwendet werden. Im allgemeinen werden die Rezeptoren in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht. Folglich beinhaltet die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung, Prävention oder Abmilderung von Krankheit oder Infektion in Tieren, insbesondere Säugern, und ganz besonders Menschen, umfassend eine wirksame Menge der Rezeptoren der Erfindung für eine derartige Behandlung, Prävention oder Abmilderung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Rezeptoren können mit dem Träger vermischt oder daran gekoppelt vorliegen. Zum Beispiel können die Rezeptoren an einen makromolekularen Träger gekoppelt sein. Sie können ebenfalls innerhalb von Liposomen vorliegen.
- Die Zusammensetzungen werden durch im Fachgebiet bekannte Techniken unter Betrachtung der hierin enthaltenen Lehren hergestellt. Die Rezeptoren werden mit für pharmazeutische Zwecke üblichen Additiven vermischt, wie Vehikeln, Stabilisatoren, Lösungsvermittlern oder inerten Verdünnungsmitteln, und werden durch übliche Verfahren in eine geeignete Verabreichungsform, wie Tabletten, Kapseln, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, umgewandelt. Wenn der Rezeptor an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist, wird es bevorzugt, daß der Träger ein natürliches oder synthetisches Polymer ist. Vorzugsweise ist ein derartiges Polymer ein Polypeptid, wie Rinderserumalbumin, oder ein Polysaccharid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Rezeptoren in Liposomen eingebunden, wie hierin bereits erörtert.
- Die pharmazeutischen Präparationen der Erfindung werden lokal, wie durch Injektion oder topische Anwendung, intravenös, oral, intradermal, subkutan, intraokular, subkonjunktival, intramuskulär und intrathekal verabreicht. Die Art der Verabreichung wird notwendigerweise von der Krankheit und den beteiligten Mikroorganismen abhängen.
- Eine wirksame Menge der Zusammensetzung wird dem Wirt oder Patienten verabreicht. Der Wirt oder Patient ist ein Tier, vorzugsweise ein Säuger, und am stärksten bevorzugt ein Mensch. Die tatsächliche zu verabreichende Menge des Rezeptors wird von der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung abhängen. Eine derartige Bestimmung wird vom gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet der Bestimmung therapeutischer Dosierungen routinemäßig vorgenommen und liegt innerhalb des Umfangs der Aufgaben, welche von ihm routinemäßig ohne ungebührlichen experimentellen Aufwand durchgeführt werden.
- Eine bevorzugte Verwendung der Rezeptoren der Erfindung besteht in der Inhibition des Anhaftens von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen an Tier-, vorzugsweise Säugerzellen, oder im Entfernen derartiger Mikroorganismen von solchen Zellen. Die Zellen können in Gewebekultur oder in dem Wirt vorliegen. Eine ausreichende Menge der Rezeptoren der Erfindung, um das Anhaften derartiger Mikroorganismen zu inhibieren oder solche Mikroorganismen zu entfernen, wird an derartige Zellen verabreicht. Vorzugsweise sind die Rezeptoren in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert, welche mit den Zellen physiologisch verträglich ist.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Rezeptoren in Kochsalzlösung gelöst, welche dann verwendet wird, um das verwundete Gewebe eines Säugerwirtes zu übergießen. Zum Beispiel kann es sich bei dem Gewebe um verbranntes menschliches Hautgewebe handeln. Das Übergießen mit der Flüssigkeit hilft bei der Entfernung von Mikroorganismen, welche verursachen könnten oder verursachen, daß die Wunde infiziert wird.
- In einer alternativen und bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das lösliche Substrat, an welches die Rezeptoren gekoppelt sind, eine pharmazeutische Verbindung, die gegen einen Typ von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen gerichtet ist. Zum Beispiel kann die Verbindung ein Antibiotikum sein, welches benötigt wird, um eine von pathogenen Bakterien erzeugte Krankheit zu behandeln, welches aber ernsthafte Nebenwirkungen aufweist. Durch Koppeln des Antibiotikums an einen Rezeptor der Erfindung wird das Antibiotikum zu den fraglichen Bakterien ziel-gelenkt werden. Dies wird die Verabreichung einer viel · niedrigeren, aber noch therapeutischen, Dosis an den Wirt, und die Verringerung oder Eliminierung der Nebenwirkungen, die dem Antibiotikum zuzuschreiben sind, gestatten. Die Verbindung kann auch ein Immunogen sein, welches die Herstellung von Antikörpern gegen einen bestimmten Mikroorganismus in dem Wirt stimuliert.
- Die Erfindung umfaßt ferner ein isoliertes mikrobielles Adhäsinprotein, erhalten aus der Oberfläche eines pathogenen oder opportunistischen Bakteriums, welches an die Rezeptoren der Erfindung bindet. Das Protein wird aus natürlichen Quellen, d. h. pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen, welche an die Rezeptoren der Erfindung binden, durch die Anwendung von Standard-Proteinreinigungstechniken im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren erhalten. Alternativ dazu wird das Protein als ein rekombinantes Protein durch die Anwendung von gentechnischen Standard-Verfahren im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren erhalten.
- Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des isolierten Proteins aus natürlichen Quellen ist wie folgend beschaffen. Membranen von pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismen werden durch Standardtechniken erhalten und solubilisiert, wobei eine solubilisierende Verbindung, wie ein Detergenz, verwendet wird. Das Adhäsin-Protein befindet sich in dem solubilisierten Material. Das verbleibende unlösliche Material aus der Membran wird, vorzugsweise durch Zentrifügieren, abgetrennt. Der Überstand wird durch eine Affinitätschromatographie-Säule, welche die Rezeptoren der Erfindung enthält, hindurchgelassen, wodurch verursacht wird, daß das Protein an die unlösliche Matrix der Säule bindet. Die Säule wird vorzugsweise ein oder mehrere Male in geeigneter Pufferlösung gewaschen. Das Adhäsinprotein wird dann unter Verwendung des passenden Mittels eluiert. Bei diesem kann es sich um freien Rezeptor in Lösung oder ein chaotropes Mittel, wie KSCH, NaCl oder Guanidinhydrochlorid handeln. Das eluierte Protein wird dann gegenüber den Rezeptoren der Erfindung getestet, um zu bestätigen, daß es an diese bindet. Die Reinheit des isolierten Proteins kann durch SDS-PAGE analysiert werden.
- Falls gewünscht, kann das Protein weiter gereinigt werden durch Anwenden von Standard- Proteinreinigungstechniken, modifiziert und angewandt gemäß den Feststellungen und Erkenntnissen, welche hierin beschrieben sind. Derartige Techniken schließen Elektrophorese, Zentrifugation, Gelfiltration, Präzipitation, Dialyse, Chromatographie (einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie, Afiinitäts-Chromatographie, Immunadsorbtions-Affinitätschromatographie, Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Gelpermeations- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie), isoelektrische Fokussierung und Variationen und Kombinationen davon ein. Die bevorzugten Techniken schließen jene ein, welche angegeben und beschrieben worden sind im U. S. -Patent Nr. 4 446 122, erteilt am 1. Mai 1984 an Chu et al., das hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Vorzugsweise wird das Protein weiterhin durch Rezeptor-Affinitätschromatographie gereinigt.
- Eine oder mehrere dieser Techniken werden sequentiell in einem Verfahren angewandt, welches ausgelegt ist, um Moleküle gemäß ihren physikalischen oder chemischen Merkmalen zu trennen. Diese Merkmale beinhalten die Hydrophobizität, Ladung, das Bindungsvermögen und Molekulargewicht des Proteins. Die verschiedenen nach jeder Technik erhaltenen Fraktionen von Materialien werden hinsichtlich ihres Vermögens, mit den Rezeptoren der Erfindung zu reagieren, getestet. Diejenigen Fraktionen, welche eine derartige Aktivität zeigen, werden dann der nächsten Technik in dem sequentiellen Verfahren unterzogen, und die neuen Fraktionen werden wiederum getestet. Das Verfahren wird wiederholt, bis nur eine mit den Rezeptoren reaktive Fraktion übrig bleibt, und diese Fraktion nur eine einzige Bande erzeugt, wenn sie einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen wird.
- Somit ist das Protein der Erfindung ein im wesentlichen reines Protein, das an die Rezeptoren der Erfindung bindet. Wie hierin verwendet, bedeuten "im wesentlichen rein" und verwandte Begriffe, daß das Protein von anderen Proteinen, die natürlicherweise mit dem Protein der Erfindung assoziiert sind, isoliert worden ist. Das im wesentlichen gereinigte Protein ist zu mindestens 80 Gew.-% rein und vorzugsweise zu mindestens 90 Gew.-% rein. D. h., die das im wesentlichen gereinigte Protein umfassende Zusammensetzung enthält nicht mehr als 20 Gew.-% und vorzugsweise nicht mehr als 10 Gew.-% an Proteinen, bei denen es sich nicht um das Protein der Erfindung handelt. Da das Protein durch die Anwendung von Standardtechniken weiter gereinigt werden kann, umfaßt die Erfindung das gereinigte Protein. Wie hierin verwendet, bedeuten der Begriff "gereinigt" und Varianten davon, daß die Proteine zu mindestens 95 Gew.-% rein, vorzugsweise zu mindestens 98 Gew.-% rein, und am stärksten bevorzugt zu mindestens 99 Gew.-% rein sind.
- Das Protein der Erfindung kann durch bekannte Proteinmodifikationstechniken modifiziert werden. Diese schließen die Techniken ein, welche im U. S. -Patent Nr. 4 302 386, erteilt am 24. November 1981 an Stevens, das hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, beschrieben sind. Derartige Modifikationen können die Immunogenität oder antimikrobielle Aktivität des Proteins steigern, oder können keine Auswirkung auf eine solche Aktivität haben.
- Zum Beispiel können einige wenige Aminosäurereste verändert oder entfernt werden.
- Alternativ dazu kann das Protein der Erfindung eine oder mehrere Aminosäuresequenzen enthalten, welche für dessen Immunogenität oder antimikrobielle Aktivität nicht notwendig sind. Es kann zum Beispiel der Fall sein, daß lediglich die Aminosäuresequenzen eines besonderen Epitops des Antigens für immunogene Aktivität notwendig sein werden. Unerwünschte Sequenzen können durch im Fachgebiet gut bekannte Techniken entfernt werden. Zum Beispiel können unerwünschte Aminosäuresequenzen über limitierten proteolytischen Verdau unter Verwendung von Enzymen, wie Trypsin oder Papain oder verwandten proteolytischen Enzymen, entfernt werden.
- Dieses Vorgehen ist erwartungsgemäß besonders nützlich für das Adhäsinprotein der Erfindung. Da die Rezeptoren der Erfindung an eine breite Auswahl von Mikroorganismen binden, können die Proteinadhäsine dieser Mikroorganismen leichte Variationen in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen. Jedoch binden sie alle an die Konsensus-Sequenz GlcNAcB1- 3GalB1-4G1cB1-1Cer, ungeachtet dessen, ob diese Sequenz eine terminale Sequenz, wie in Lactotriaosylcer, oder eine interne Sequenz, wie in Paraglobosid, ist. Deshalb werden solche Proteine eine konservierte Region besitzen, welche ein universelles Epitop ist. Dieses universelle Epitop ist das besonders bevorzugte Polypeptid der Erfindung.
- Alternativ dazu können zu verschiedenen immunogenen Epitopen des Proteins entsprechende Polypeptide chemisch durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren synthetisiert werden. Diese schließen die Verfahren ein, welche in dem U. S. -Patent Nr. 4 290 994 offenbart sind, das am 22. September 1981 an Goldberg erteilt wurde, welches hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
- Somit schließt das Protein der Erfindung eine Klasse von modifizierten Polypeptiden, einschließlich synthetisch abgeleiteten Peptiden oder Fragmenten des Proteins, mit gemeinsamen Elementen des Ursprungs, der Struktur und des Wirkungsmechanismus, wie dem immunogenen oder antimikrobiellen Effekt oder dem Vermögen, an den Rezeptor der Erfindung zu binden, ein, welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, da sie vom Fachmann hergestellt werden können, sobald die Lehren der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus liegen, zumal der Fachmann Modifikationen an oder Derivate von Epitopen auf dem Protein der Erfindung anfertigen kann, sobald derartige Epitope identifiziert sind, solche Modifikationen oder Derivate innerhalb des Umfangs der Erfindung, mit der Maßgabe, daß sie immunogen sind und einen antimikrobiellen Effekt in Menschen oder anderen Tieren, insbesondere einschließlich Säugern und Primaten, aufweisen.
- Daher kann das Polypeptid ein immunogenes Fragment des Proteins der Erfindung oder ein zu diesem Polypeptid im wesentlichen homologes modifiziertes Polypeptid sein. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen homolog" immunologisch kreuzreaktiv. Ein solches Polypeptid kann auch durch die Tatsache identifiziert werden, daß es an Antikörper gegen das Adhäsinprotein der Erfindung binden wird, wobei die Antikörper durch Standardtechniken hergestellt werden können.
- Das Adhäsinprotein der Erfindung oder ein daraus abgeleitetes immunogenes Fragment oder Polypeptid hat erwartungsgemäß einen Nutzen als ein Immunogen in einem antimikrobiellen Impfstoff für Tiere, einschließlich Säugern, Primaten und Menschen. Ein solcher Impfstoff kann durch dem Fachmann bekannte Techniken hergestellt werden und würde, zum Beispiel, das Antigen, einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein geeignetes Adjuvanz und andere herkömmlicherweise in Impfstoffen anzutreffende Materialien umfassen. Eine immunologisch wirksame Menge des Antigens wird durch im Fachgebiet bekannte Mittel bestimmt.
- Die Proteine und Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um einen Mikroorganismus nachzuweisen, der die Rezeptoren der Erfindung exprimiert. Zum Beispiel wurde, wie in der Fig. 3 gezeigt, festgestellt, daß N. gonorrhoeae den Rezeptor GalB1- 4GlcNAcB1-3Ga1B1-4Glc als Teil seines Lipopolysaccharids enthält. Somit kann das Protein oder Polypeptid an einen festen Träger, wie Perlen oder eine Mikrotitervertiefting, durch Standardtechniken angeheftet und in Verfahren und Kits zum Nachweis derartiger Mikroorganismen verwendet werden, wie hierin bereits beschrieben. In ähnlicher Weise kann das Protein oder Polypeptid an ein pharmazeutisches Mittel angeheftet werden, wie hierin bereits beschrieben, um ein solches Mittel zu einem derartigen pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismus zu lenken.
- In Betrachtung der Rezeptoren der Erfindung und der hierin offenbarten Lehren kann der Fachmann die DNA, welche für das mikrobielle Adhäsin-Polypeptid der Erfindung codiert, in isolierter oder im wesentlichen gereinigter Form durch die Anwendung von gentechnischen Standardverfahren erhalten. Derartige Techniken schließen diejenigen ein, welche beschrieben sind in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1982), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
- Die DNA der Erfindung ist eine isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz (d. h. Polydesoxyribonukleotid), welche für ein Polypeptid codiert, das an die Rezeptoren der Erfindung bindet. Wie hierin verwendet, bedeuten der Begriff "isoliert" und Variationen davon, daß die DNA in Isolation von DNA vorliegt, welche für andere Polypeptide codiert, die dieses Polypeptid normalerweise begleiten. Somit schließt die DNA der Erfindung für das Polypeptid codierende DNA ein, wenn diese DNA in einen mikrobiellen Vektor, wie ein Plasmid, oder in einen viralen Vektor, der von einem Bakteriophagen beinhaltet sein kann, kloniert worden ist, vorausgesetzt daß solche Klone von Klonen isoliert sind, die DNA enthalten, welche für andere Polypeptide codiert, die dieses eine normalerweise begleiten. Wie hierin verwendet, bedeuten der Begriff "im wesentlichen rein" und Varianten davon, daß die DNA im wesentlichen frei von DNA und RNA ist, welche nicht für das Protein codieren. Das heißt, es wird nicht mehr als etwa 1 Gew.-% an anderer DNA und RNA, und vorzugsweise nicht mehr als etwa 0,2 Gew.-% an an anderer DNA und RNA in jeglicher Probe geben, welche die DNA der Erfindung enthält.
- Vorzugsweise wird die DNA durch Verwendung der vorliegenden Rezeptoren zum Screenen einer geeigneten genomischen Bibliothek, welche die DNA eines pathogenen oder opportunistischen Mikroorganismus enthält, erhalten. Eine derartige Bibliothek umfaßt Kolonien eines einzelnen Typs von Mikroorganismus, im allgemeinen Bakterien, wie E. coli K12 (HB101), in welche Stücke der fremden DNA eingefügt worden sind, im allgemeinen indem sie in ein Plasmid, Cosmid oder einen Phagenvektor eingebaut werden, welches/welcher mit dem Mikroorganismus kompatibel ist. Genauer gesagt, umfaßt die Bibliothek Klone von Vektoren, in die verschiedene Sequenzen der DNA funktionstüchtig und wiedergewinnbar eingefügt worden sind, wobei jeder der Vektoren nur eine Sequenz der DNA enthält. Die Vektoren können Plasmide, Cosmide oder Phagengenome sein. Falls aufgrund des Typs der verwendeten Bibliothek notwendig, sind Segmente von DNA auf eine Weise in die Vektoren eingefügt worden, daß sie unter passenden Bedingungen exprimiert werden (d. h. in der richtigen Orientierung und im korrekten Leserahmen und mit geeigneten Expressions- Sequenzen, einschließlich einer RNA-Polymerase-Bindungssequenz und einer ribosomalen Bindungssequenz). Bei den Mikroorganismen wird es sich um solche handeln, weiche das Adhäsinprotein nicht exprimieren, wie E. coli HB101.
- Klone aus der Bibliothek werden mit den Rezeptoren der Erfindung in Kontakt gebracht, um diejenigen Klone zu identifizieren, welche an die Rezeptoren binden. Vorzugsweise wird die Bibliothek mit dem Rezeptor auf einer Dünnschichtchromatographie-Platte in Kontakt gebracht, um zu bestimmen, welcher der Mikroorganismen an den Rezeptor bindet. Die Klone werden isoliert und die exogene DNA-Sequenz wird aus einem der Klone gewonnen. Die Sequenz wird ausgewertet, um zu bestimmen, ob sie für das Protein codiert.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die DNA der Erfindung durch eine Anwendung und Modifikation der Leheren von Paruchuri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 333-337 (1990), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, erhalten. Die Autoren verwendeten einen unterschiedlichen Adhäsions-Rezeptor für N. gonorrhoeae, um das Adhäsionsprotein und das Gen zu identifizieren und zu charakterisieren.
- Wie auf diese Erfindung angewandt, wird eine genomische Bibliothek des N. gonorrhoeae- Stammes MS11 in dem Vektor pHS56 (Seifert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 735-739 (1986), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) in E.coli HB101 (Seifert et al., J. Bacteriol., 172: 40-46 (1990), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) konstruiert. Ein Dünnschichtchromatographie-Überlagerungsassay wird angewandt, um die Klone zu identifizieren, welche das Adhäsionsprotein exprimieren. Die DNA wird danach in isolierter oder im wesentlichen gereinigter Form erhalten.
- In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden Kolonien, welche DNA enthalten, die für das(die) mikrobielle(n) Adhäsingen(e) codiert, unter Verwendung von DYNA-Perlen gemäß Olsvick et al., 29. ICAAC, Houston, Tex. 1989, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, nachgewiesen. Die früher beschriebenen Glykolipide werden an toyslierte DYNA-Perlen M280 vernetzt und diese Rezeptor-enthaltenden Perlen werden dann verwendet, um an Kolonien zu adsorbieren, die die Adhäsinprotein(e) exprimieren. Das Adhäsin nicht exprimierende Kolonien werden durch Waschen entfernt, und dieser Vorgang wird wiederholt werden, um eine angemessene Anreicherung zu erhalten. Vermutliche Adhäsin-exprimierende Kolonien werden dann ausplattiert und durch metabolisches Markieren jeder Kolonie mit ³&sup5;S- Methionin und Testen des Vermögens der Kolonie, an den Rezeptor zu binden, wie bereits beschrieben, bestätigt. Die DNA aus mehreren adhärierenden Klonen wird verglichen, um gemeinsame Sequenzen zu identifizieren, und diese gemeinsamen Sequenzen werden weiter subkloniert und charakterisiert, wie bereits beschrieben.
- In einer anderen alternativen bevorzugten Ausführungsform werden die Gen(e) für das spezifische Glykolipid-Adhäsin durch Konstruieren von nicht-adhärenten Mutamen eines spezifischen Pathogens lokalisiert und identifiziert. Dies wird bewerkstelligt, indem Mutanten unter Verwendung eines transponierbaren Elements, wie TnPhoA, erzeugt werden, wie beschrieben in Manoil et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 81129-8133 (1985), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Alkalische Phosphatase-positive Mutanten würden Mutationen innerhalb von exportierten Proteinen anzeigen. Da vermutet wird, daß das Adhäsin für jedes Pathogen an der Außenmembran-Oberfläche lokalisiert und deshalb exportiert wird, würde diese Reihe von Mutanten eine sehr verminderte Untergruppe von Mutarten enthalten. Sie würden danach hinsichtlich eines Verlustes der Bindungsaktivität durch zuvor beschriebene Verfahren gescreent werden.
- Vom Fachmann wird erkannt werden, daß die DNA-Sequenz für das Adhäsin-Protein durch bekannte Techniken im Hinblick auf die hierin offenbarten Lehren modifiziert werden kann. Zum Beispiel können verschiedene Codons substitutiert werden, welche für dieselbe Aminosäure codieren, wie das Originalcodon. Alternativ dazu können die Substitut-Codons für eine unterschiedliche Aminosäure codieren, welche die Immunogenität oder antimikrobielle Aktivität des Proteins nicht beeinflussen wird oder welche dessen Immunogenität oder antimikrobielle Aktivität verbessern kann. Zum Beispiel können Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese oder andere Techniken zur Erzeugung einzelner oder mehrfacher Mutationen, wie Ersetzungen, Insertionen, Deletionen und Transpositionen, wie beschrieben in Botstein und Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis", Science, 229: 193-1210 (1985), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, angewandt werden. Da derartige modifizierte DNA durch die Anwendung von bekannten Techniken auf die hierin enthaltenen Lehren erhalten werden kann, liegt eine solche DNA innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung.
- Darüber hinaus wird vom Fachmann erkannt werden, daß die DNA Sequenz (oder Fragmente davon) der Erfindung verwendet werden kann, um andere DNA-Sequenzen zu erhalten, welche damit unter Bedingungen mäßiger bis hoher Stringenz hybridisieren, wobei im Fachgebiet bekannte allgemeine Techniken angewandt werden. Folglich schließt die DNA der Erfindung eine derartige DNA ein.
- Die DNA der Erfindung kann gemäß bekannten Techniken, welche im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren geeignet modifiziert werden, verwendet werden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, welcher dann verwendet wird, um einen Mikroorganismus für die Expression und Herstellung des Polypeptids der Erfindung zu transformieren. Derartige Techniken beinhalten diejenigen, welche offenbart sind in den U. S. -Patenten Nr. 4 440 859, erteilt am 3. April 1984 an Rutter et al., 4 530 901, erteilt am 23. Juli 1985 an Weissman, 4 582 800, erteilt am 15. April 1986 an Crowl, 4 677 063, erteilt am 30. Juni 1987 an Mark et al., 4 678 751, erteilt am 7. Juli 1987 an Goeddel, 4 704 362, erteilt am 3. November 1987 an Itakura et al., 4 710 463, erteilt am 1. Dezember 1987 an Murray, 4 757 006, erteilt am 12. Juli 1988 an Toole, Jr., et al., 4 766 075, erteilt am 23. August 1988 an Goeddel et al., und 4 810 648, erteilt am 7. März 1989 an Stalker, von denen alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
- Die DNA der Erfindung kann an eine breite Vielzahl von anderen DNA-Sequenzen für die Einführung in eine geeignete Wirtszelle verknüpft werden. Die Begleiter-DNA wird von der Natur der Wirtszelle, der Art der Einführung der DNA in die Wirtszelle und davon, ob eine episomale Aufrechterhaltung oder eine Integration gewünscht wird, abhängen.
- Im allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, in richtiger Orientierung und im korrekten Leserahmen für eine Expression eingefügt. Falls notwendig, kann die DNA an die passenden Transkriptions- und Translations-regulatorischen Steuerungsnukleotidsequenzen, welche vom gewünschten Wirt erkannt werden, verknüpft werden, obwohl solche Steuerungen im allgemeinen in dem Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann über Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht · alle der Wirte durch den Vektor transformiert. Deshalb wird es notwendig sein, nach transformierten Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet das Einbinden einer DNA-Sequenz, mit jedweden notwendigen Steuerungselementen, in den Expressionsvektor, welche für ein selektierbares Merkmal in der transformierten Zelle, wie eine Antibiotikum-Resistenz, codiert. Alternativ dazu kann das Gen für ein derartiges selektierbares Merkmal auf einem anderen Vektor vorliegen, welcher verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu co-transformieren. Bei dem bevorzugten Expressionsvektor zur Verwendung in der Erfindung handelt es sich um die Bluescript-Reihe von Stratogene, Inc. Die bevorzugte Wirtszelle ist DH5 alpha.
- Die transformierten Wirtszellen exprimieren die Proteine oder Polypeptide der Erfindung. Solche Zellen werden durch bekannte Techniken kultiviert, und die Proteine oder Polypeptide werden durch bekannte Techniken gewonnen. Abhängig vom verwendeten Wirt und dem verwendeten Expressionssystem können die rekombinanten Proteine und Polypeptide der Erfindung Teil eines von den transformierten Wirtszellen hergestellten Fusionsproteins sein. Solche Proteine werden durch bekannte Techniken gewonnen, und der unerwünschte Teil kann durch bekannte Techniken entfernt werden. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein selbst immunogener sein als das rekombinante Protein oder Polypeptid allein und kann deshalb selbst in einem Impfstoff verwendet werden.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff der Erfindung einen avirulenten Mikroorganismus, der durch die DNA der Erfindung transformiert worden ist, wodurch der transformierte Mikroorganismus das Protein oder die Polypeptide der Erfindung auf eine solche Weise exprimiert, daß die Zuführung des avirulenten transformierten Mikroorganismus an einen tierischen oder menschlichen Wirt zu einer Immunantwort führt. Im allgemeinen werden die fremden antigenen Determinanten auf der Oberfläche des Mikroorganismus exprimiert. Vorzugsweise liegt der Mikroorganismus in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vor. Besonders bevorzugte Mikroorganismen wären Arten von Salmonella, welche für die orale Zuführung von heterologen Antigenen präpariert werden können gemäß den Verfahren, die offenbart sind in Chatfield et al., Vaccine, 7: 495-498 (1989), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
- Es versteht sich, daß die Anwendung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns in Ansehung der hierin enthaltenen Lehren liegen. Beispiele der Produkte der vorliegenden Erfindung und von Verfahren für ihre Verwendung erscheinen in den nachfolgenden Beispielen.
- Glykolipid-Adhäsions-Rezeptoren für N. gonorrhoeae
- Dieses Beispiel zeigt, daß Lacto-Reihen-Glykolipide, welche die Minimal-Kohlenhydratsequenz GlcNAcB1-3GalB1-4Glc enthalten, die Adhäsion von N. gonorrhoeae unterstützen können, und daß die Bindung nicht abhängig ist von Pili, Protein II (P II) oder der Gegenwart von Lipooligosaccharid (LOS). Interessanterweise werden Lacto-Reihen-Strukturen auch in manchen LOS gefunden, die von der äußeren Membran von N. gonorrhoeae abgeleitet sind (15), was das gut bekannte Phänomen der Autoagglutination erklären kann, welches bei diesem Organismus ersichtlich ist.
- Materialien. Gonokokken-LOS wurde aus mit Azeton pulverisierten Organismen durch das Heißes-Phenol-Verfahren isoliert (16, 17). Monoklonaler Maus-IgG-Antikörper 4BE12 gegen meningococcales LOS vom Serotyp 3, 7, 9 (18) wurde von Dr. Wendell Zollinger (Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D. C.) zur Verfügung gestellt. Affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-Maus-IgM (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) wurde mit ¹²&sup5;I (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) durch das Iodo-Gen-Verfahren (19) zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 25 Ci/ug markiert. (Wie im Zusammenhang mit Messungen in den Beispielen dieser Anmeldung verwendet, ist u gleichbedeutend mit mikro.) Rinderhoden-B- Galaktosidase, Neuraminidase (Arthrobacter ureafaciens) und Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V) wurden von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erwoben, N-Acetyl-B-Dhexosaminidase war von Genzyme (Boston, MA). Alle Standard-Gangliosid- und Neutral- Glykolipide waren von BioCarb Chemicals (Lung, Sweden). Aluminium-Rückseiten-Silicagel- Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie-Platten wurden von Merck (Westdeutschland) erworben. Alpha-2-3-Sialyllacto-neotetraosylceramid (Sialylparaglobosid) wurde aus humanen Erythrozyten vom Typ 0 isoliert (20). Lacto-N-neotetraosylceramid (Paraglobosid) wurde durch Desialylierung von Erythrozyten-Sialylparaglobosid mit 1 M Ameisensäure während 60 Minuten bei 100ºC hergestellt. Lacto-N-triaosylceramid wurde durch Verdau von Paraglobosid mit B-Galaktosidase hergestellt, wie beschrieben für die Herstellung von Asialo- GM2 aus Asialo-GM1 (14). Die in Tabelle I aufgelisteten Konzentrationen von Glykolipiden wurden durch Densitometrie (Quick-scan, Helena Laboratories) von Orcinol-gefärbten Dünnschichtchromatogrammen bestimmt, welche mit authentischen Standards verglichen wurden. Die Reinheit aller Lipide wurde durch Dünnschichtchromatographie in neutralen und sauren Lösungsmittelsystemen bestätigt.
- Die gonokokkalen Stämme und Varianten sind in der Tabelle II beschrieben. Die Mikroorganismen wurden in supplementiertem GCB (Difco)-Nährmedium unter Schütteln bei 1500 Upm oder auf Agarplatten bei 37ºC in 5% CO&sub2;/95% Luft herangezogen. Anaerob auf GCB- Agar herangezogene Zellen wurden mit Nitrat supplementiert, wie beschrieben (21). Unter Bedingungen mit begrenztem Eisen herangezüchtete Gonokokken wurden durch dreimaliges Überführen der Zellen auf Medien, welche mit 25 uM Desferal (Ciba-Geigy) supplementiert waren, angefertigt, wie beschrieben (22). Mikroorganismen wurden von Agarplatten gekratzt oder aus Nährmedium durch Zentrifugation geerntet und in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, enthaltend 0,15 M Natriumphosphat (PBS), suspendiert. Die Mikroorganismen wurden bei 4ºC und 10 000 · g zentrifugiert und die Pellets wurden zweimal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden wie beschrieben (23) unter Verwendung von 0,4 mCi Na ¹²&sup5;I (ICN Biomedicals) radioiodiert. Die Iodierung wurde nach 3 Minuten durch Entfernen der Zellen aus dem Reaktionsröhrchen beendet, gefolgt von Zentrifugation und zwei Waschschritten in PBS. Die markierten Gonokokken wurden zu 2,5 · 10&sup6; oder 4 · 10&sup6; cpm/ml in Hanks balancierter Salzlösung, pH 7,4, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (HBSS-BSA), resuspendiert.
- An Glykolipide gebundene Gonokokken, aufgetrennt durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie, wurden nachgewiesen, wie beschrieben (23). Die Bindung von Gonokokken an gereinigte Glykolipide, die in Mikrotiterplatten (Falcon 3912-III, Bectin-Dickinson) immobilisiert waren, wurde wie früher beschrieben (23) gemessen.
- Authentisches Paraglobosid wurde auf Dünnschichtchromatogrammen durch Immunfarben, gefolgt von 24 Stunden langer Autoradiographie, nachgewiesen (24).
- Die Glykolipid-Spezifität der verschiedenen gonokokkalen isogenen Varianten wurde durch den Dünnschicht-Überlagerungsassay festgestellt und ist in der Tabelle II zusammengefaßt. Wie durch ein Autoradiogramm (Fig. 1B) im Vergleich mit einer identischen Dünnschichtplatte, die mit Orcinol-Reagenz sichtbar gemacht wurde (Fig. 1A), gezeigt, bindet N. gonorrhoeae in avider Weise an authentisches Paraglobosid und das nach B-Galaktosidase- Behandlung erhaltene Produkt, Lacto-N-triaosylceramid (Fig. 1B, Spuren 3 und 4). Es wurde keine Bindung an Lactosylceramid, abgeleitet aus Lacto-N-triaosylceramid nach Behandlung mit N-Acetyl-B-hexosaminidase (Fig. 1B, Spur 5), oder an die anderen getesteten neutralen Glykolipide (Fig. 1B, Spur 1; Tabelle I) nachgewiesen. Diese Daten erscheinen von denjenigen von Stromberg et al. (12) abzuweichen, der berichtete, daß N. gonorrhoeae nicht an Lacto-Ntriaosylceramid und Lacto-N-neotetraosylceramid (Paraglobosid) bindet. Möglicherweise steht diese Diskrepanz im Zusammenhang mit der Quelle und/oder dem Fettsäuregehalt (12) der von diesen Forschern verwendeten Glykolipide. In manchen Experimenten hat N. gonorrhoeae schwach an manche der Ganglioside gebunden (Tabelle I), wobei Sialylparaglobosid (Fig. 1B, Spur 2) und GM1 (Fig. 1B, Spur 1) eingeschloßen sind; allerdings war diese Beobachtung nicht immer reproduzierbar, und keines der Ganglioside zeigte eine konzentrationsabhängige Bindung in Mikrotiterplatten (Fig. 2).
- Die Bindung von N. gonorrhoeae an gereinigte Glykolipide, welche auf Mikrotiterplatten adsorbiert waren, wurde untersucht, um die Bindungsspezifität weiter einzugrenzen und die relativen Aviditäten der Lacto- und Ganglio-Reihen-Rezeptoren zu vergleichen. Wie in der Fig. 2 gezeigt, binden die Gonokokken besser an Asialo-GM2 als an Paraglobosid und überhaupt nicht an Sialylparaglobosid, wobei GM2 bei 0,2 ug halbmaximal ist, etwa 7mal besser als an Paraglobosid (oder Lacto-N-triaosylceramid, Daten nicht gezeigt), was eine höhere Avidität für die Ganglio-Reihen-Glykolipide nahelegt. Die Bindung von P&spplus;- und P&supmin; Varianten von N. gonorrhoeae sowohl an Asialo-GM1 als auch an Paraglobosid wurde nicht durch Verändern der Wachstumsbedingungen des Organismus beeinflußt, zumal die Gonokokken gleich gut an beide Glykolipide banden, wenn sie anaerob, mikroaerophil auf Agar oder in Nährmedium oder unter Bedingungen mit begrenztem Eisen herangezüchtet worden waren (Daten nicht gezeigt).
- N. gonorrhoeae agglutinieren humane Erythrozyten (25) und adhärieren an Neutrophile und werden von diesen phagozytiert (26). Der Rezeptor, der die Bindung dieser Zellen an die Gonokokken vermittelt, ist wahrscheinlich Paraglobosid und Lacto-N-triaosylceramid, welche in wesentlichen Mengen in beiden Zelltypen vorhanden sind (14, 16, 27). Die Lacto-Reihe bildet auch die hauptsächliche Glykolipid-Komponente von verschiedenen Geweben und Organen und stellt die Glykolipidvorläufer der Hauptblutgruppen-Antigene. Interessanterweise sind GalB1-4GlcNAcB1-4Glc...-Sequenzen auch in vielen gonokokkalen LOS vorhanden (15). Wie in der Fig. 3 gezeigt, bindet ein Anti-LOS-Antikörper (4BE12) (18) stark an authentisches humanes Paraglobosid, wobei er so wenig wie 30 ng an Glykolipid detektiert. Gonokokkales Lipopolysaccharid, welches die 4,8 kD große LOS-Komponente enthält, wird vom monoklonalen Antikörper 4BE12 gebunden, womit die Gegenwart der GalB1-4GlcNAcB1-4GalB1- 4Glc...-Sequenz in diesem Lipopolysaccharid bestätigt wird (Daten nicht gezeigt). Dieses LOS inhibiert auch in starkem Maße die gonokokkale spezifische Agglutination von humanen Erythrozyten, und inhibiert ebenfalls die Bindung von radiomarkierten P&spplus;- und P&supmin;-Gonokokken an Paraglobosid und Lacto-N-triaosylceramid auf Dünnschichtchromatogrammen (Daten nicht gezeigt). Somit kann der Mechanismus für das gut bekannte Phänomen der gonokokkalen Autoagglutination (29, 30) durch ein Adhäsin eines Organismus erklärt werden, welches an GlcNAcB1-3GalB1..-Sequenzen im LOS des anderen Organismus bindet. Da das LOS von Mikroorganismen kein Ceramid enthält, ist die Bindung von N. gonorrhoeae zumindestens an die Lacto-Reihen-Glykolipide wahrscheinlich nicht von der Fettsäure in Ceramid abhängig, wie es für andere Mikroorganismen berichtet worden ist (31).
- Es ist berichtet worden, daß Asialo-GM2 in kultivierten humanen endozervikalen Zellen vorkommt (12), einem relevanten Zielgewebe für Infektion, und daß Asialo-Ganglioside auch in anderen menschlichen Geweben vorkommen, wenngleich in niedrigeren Mengen (14, 32, 33). Sowohl Asialo-GM1 als auch Asialo-GM2 binden jedoch N. gonorrhoeae mit höchster Avidität (Fig. 2). Kürzlich haben Paruchuri et al. (34) das Gen identifiziert, welches für ein Adhäsin codiert, das an Asialo-GM1 und Asialo-GM2 bindet, und haben gezeigt, daß das Adhäsin ein 36 kD großes Protein ist, welches nicht mit gonokokkalen Pili assoziiert ist. Da Mutanten, welche dieses Adhäsin nicht exprimieren, ihre Fähigkeit, humane Erythrozyten zu agglutinieren, beibehalten (34), ist dieses Adhäsin wahrscheinlich von der Paraglobosidbindenden Spezifität, die wir hier beschreiben, verschieden. Daher kann mehr als ein Typ von gonokokkalem Adhäsin die Bindung an verschiedene humane Zelltypen vermitteln und individuell oder koordiniert zur Krankheitspathogenese beitragen.
- Die Rolle, welche Glykolipide als Adhäsionsrezeptoren für Neisseria gonorrhoeae spielen, wurde untersucht. Serum-resistente Isolate, isogene Varianten mit Pili und ohne Pili, als auch hinsichtlich Lipooligosäccharid (LOS) und Protein II defiziente Gonokokken haben spezifisch an terminale und interne GlcNAcB1-3Ga1B1-4Glc-Sequenzen in Lacto-Reihen-Glykolipiden gebunden, wie dies durch Überschichten von Glykolipid-Chromatogrammen mit ¹²&sup5;I-markierten Organismen gemessen wurde. Die Bindungsaktivität wurde nicht durch Verändern der Wachstumsbedingung des Organismus beeinflußt, da die Gonokokken an die Glykolipide banden, wenn sie anaerob, mikroaerophil auf Agar oder in Nährmedium oder unter Eisen- Begrenzungs-Bedingungen herangezüchtet worden waren. Die Gonokokken banden nicht an Lactosylceramid (GalB1-4GlcB1-1Cer), das aus Lacto-N-triaosylceramid oder aus Asialo- GM2 durch Behandlung mit N-Acetyl-B-hexosaminidase abgeleitet wurde, oder an andere getestete neutrale Glykolipide. Obwohl N. gonorrhoeae an manche Ganglioside auf Dünnschichtchromatogrammen schwach gebunden hat, einschließlich Sialylparaglobosid und GM1, haben · die Gonokokken in Festphasenassays mit moderater Avidität an die Sequenz GlcNAcB1- 3GalB1-4Glc gebunden und überhaupt nicht an Ganglioside. Interessanterweise inhibierte die 4,8 kD große Komponente von gonokokkalem LOS, welche Lacto-N-neotetraose (GalB1- 4GlcNAcB1-3Ga1B1-4Glc) enthält, in starker Weise die gonokokkale spezifische Agglutination von humanen Erythrozyten und inhibierte die Bindung von markierten Organismen an humanes Paraglobosid und Lacto-N-triaosylceramid auf Dünnschichtchromatogrammen. Möglicherweise erklärt diese Bindungsspezifität, warum Gonokokken in vitro autoagglutinieren.
- Eine breite Vielzahl von anderen Mikroorganismen wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 1 getestet, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, an die Rezeptoren der Erfindung zu binden. Diese Organismen sind in der Tabelle III identifiziert. Es wurde festgestellt, daß derartige Mikroorganismen an den Rezeptor mit dem gleichen Bereich an Affinität banden, wie N. gonorrhoeae die Rezeptoren in Beispiel 1 gebunden hatte. Die Fig. 4 ist ein repräsentatives Beispiel, welches die Bindung von Pseudomonas aeruginosa an Paraglobosid zeigt.
- Dieses Beispiel zeigt, wie man das gereinigte bakterielle Adhäsinprotein erhält, das an die Rezeptoren der Erfindung bindet. Die Schritte sind wie folgend:
- 1. Aufzucht von Organismen. Ein speziell definiertes Medium, mit niedrigem Methionin, wird hergestellt, und 75 ml von diesem frischen Medium in einer sterilen 100 ml großen Glasflasche werden mit dem Organismus inokuliert. Danach werden 0,5 mCi an ³&sup5;S-Methionin zugesetzt. Der Organismus wird 24 Stunden lang bei 37ºC, 5% CO&sub2;, herangezogen.
- 2. Abernten des Organismus. Nach 24 Stunden wird der Organismus 10 Minuten lang bei 10 000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 ml an 10 mM Hepes, pH 7,4, Kochsalzlösung, resuspendiert und auf Eis gestellt.
- 3. Präparation von Omps. Der resuspendierte Organismus wird auf Eis 6 mal je 30 Sekunden lang bei einer Einstellung von 4 auf dem Bronson-Sonicator Ultraschall-behandelt. Danach wird der aufgebrochene Organismus 10 Minuten lang bei 4ºC bei 10 000 · g zentrifugiert. Der Überstand wird 30 Minuten lang bei 100 000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird als Omps bezeichnet. Proteaseinhibitoren werden zugesetzt (PIC 1 + 11) und es erfolgt eine zweiwöchige Lagerung bei 4ºC.
- 4. Solubilisierung von Omps. Omps werden wie obenstehend bei 100 000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in 4 ml 10 mM Hepes, pH 8,0, 1,3% Octyl-Glucopyranosid (Sigma) resuspendiert, 5 Minuten lang Ultraschall-behandelt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden die Omps wie zuvor bei 100 000 · g zentrifugiert. Der resultierende Überstand enthält lösliches Adhäsin.
- 5. Reinigung von Adhäsinprotein. Das Adhäsin wird aus dem Octylglucopyranosid-Überstand durch Verdünnen desselben um 1/10 in 50 mM Tris-HCl, pH 7, 8, 150 mM NaCl, 1,0% BSA, und Inkubieren desselben in zuvor geblockten Vertiefungen eines ELISA-Platte, welche 0,8 ug/Vertiefung an Rezeptor enthält, während 2 Stunden bei Raumtemperatur gereinigt. Die Vertiefungen werden 4mal mit kalter normaler Kochsalzlösung gewaschen, danach werden 30 ul von bei 60ºC befindlichem 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Kochsalzlösung, 0,1% SDS in jede Vertiefung zugegeben und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Alternativ dazu wird das Adhäsin durch Rezeptor-Affinitätssäulenchromatographie gereinigt, wobei der Rezeptor auf einem unlöslichen Träger, wie Agaroseperlen, immobilisiert ist. Der SDS-Elutionspuffer wird aus entsprechenden Vertiefungen entnommen und auf SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Tabelle I Glykolipide, getestet hinsichtlich der Fähigkeit, N. gonorrhoeae auf Dünnschichtchromatogrammen zu binden
- a Die Trivialnamen und Strukturen sind gemäß den Empfehlungen in Literaturhinweis 38 und darin zitierten Bezugsstellen dargestellt; Cer = Ceramid; CMH = Ceramidmonohexosid; CDH = Ceramiddihexosid (Lactosylceramid); CTH = Ceramidtrihexosid; GL4 = Globosid.
- b Negative Bindung (-) weist auf keine Bindung an 2 ug Glykolipid hin, und bei positiver Bindung gilt: an weniger als 0,4 ug (++), 0,8-1 ug (+) und 1 ug (+/-) Tabelle II In dieser Untersuchung verwendete N. gonorrhoeae-Stämme und ihre Glykolipid- Bindungsspezifitätena
- a Bestimmt durch den Mikroorganismen-Überlagerungsassay unter Verwendung von 0,5 ug gereinigtem Asialo-GM1 oder 1 ug Paraglobosid, wie beschrieben in Material und Methoden.
- b verwendete Abkürzungen: P+ = mit Pili; P- = ohne Pili; PII = Protein II-defizient; LOS- = Lipooligosaccharid-defizient; MAb = monoklonaler Antikörper. Tabelle III Andere pathogene und opportunistische Mikroorganismen, welche an die Rezeptoren Lactotriaosylcer und Paraglobosid binden.
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Claims (40)
1. Zusammensetzung, verwendbar als ein Rezeptor für ein pathogenes oder opportunistisches
Bakterium, umfassend einen an ein Liposom geknüpften Rezeptor, wobei der Rezeptor
eine im wesentlichen reine Verbindung umfaßt, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus
GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-
X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-
3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-4GlcNAcB1-3Gal und
GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes
Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein
Ceramid ist, und wobei das pathogene oder opportunistische Bakterium gewählt ist aus der
aus Streptococcus, Staphvlococcus, Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas,
Neisseria, Coxiella und Sbigella bestehenden Gruppe.
2. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines pathogenen oder opportunistischen
Bakteriums in einer Probe, die im Verdacht steht, das Bakterium zu enthalten, umfassend
die folgenden Schritte:
Kontaktieren der Probe mit der Zusammensetzung von Anspruch 1 während einer
Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, damit der Rezeptor an das Bakterium
bindet, wenn das Bakterium in der Probe vorliegt; und
Bestimmen, ob der Rezeptor an das Bakterium gebunden hat, wobei das Bakterium
gewählt ist aus der aus Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium, Borrelia,
Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Sbigella bestehenden Gruppe.
3. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines pathogenen oder opportunistischen
Bakteriums in einer Probe, die im Verdacht steht, das Bakterium zu enthalten, umfassend
die folgenden Schritte:
Kontaktieren der Probe mit einem an ein unlösliches Substrat geknüpften Rezeptor
während einer Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, damit der Rezeptor an das
Bakterium bindet, wenn das Bakterium in der Probe vorliegt;
Kontaktieren jeglicher gebildeter Rezeptor-Bakterium-Komplexe mit einem Antikörper
gegen ein Antigen auf der Oberfläche des Bakteriums, wobei der Antikörper mit einer
nachweisbaren Gruppe markiert ist, wodurch ein Rezeptor-Bakterium-Antikörper-
Komplex gebildet wird;
Entfernen von nicht-gebundenem Antikörper; und
Nachweisen der Gegenwart der nachweisbaren Gruppierung, wobei der Rezeptor eine im
wesentlichen reine Verbindung umfaßt, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-
4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R),
GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-
3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-4GlcNAcB1-3Ga1 und
GalBl-3GlcNAcBI-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes
Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein
Ceramid ist, und wobei das pathogene oder opportunistische Bakterium gewählt ist aus der
aus Streptococcus, Staphvlococcus, Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas,
Neisseria, Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe.
4. Diagnostisches Kit für den Nachweis eines pathogenen oder opportunistischen Bakteriums
in einer Probe, umfassend in einem Behälter:
einen an ein unlösliches Substrat geknüpften Rezeptor, wobei der Rezeptor eine im
wesentlichen reine Verbindung umfaßt, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-
4GlcNAcB1-3GalBl-4G1cB1-1-X(R), GalBl-3GlcNAcB1-3Ga1B1-4G1cB1-1-X(R),
GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-
3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, Galal-4GlcNAcB1-3Gal und
GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes
Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein
Ceramid ist; und
Mittel zum Nachweisen oder Messen der Bildung eines Komplexes aus dem Bakterium und
dem Rezeptor, wobei das pathogene oder opportunistische Bakterium aus der aus
Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas.
Neisseria. Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe gewählt ist.
5. Kit von Anspruch 4, wobei es sich bei dem unlöslichen Substrat um die Vertiefung einer
Mikrotiterplatte handelt.
6. Kit von Anspruch 4, wobei das Mittel zum Nachweisen oder Messen ein Reagenz ist, das
eine nachweisbare Gruppe enthält und fähig zur Bindung an das Bakterium ist.
7. Verfahren zum Entfernen eines pathogenen oder opportunistischen Bakteriums aus einer
Flüssigkeit, umfassend die folgenden Schritte:
Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem Rezeptor für das Bakterium während einer
Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, um das Bakterium an den Rezeptor zu
binden, und
Entfernen des Rezeptors, wobei der Rezeptor eine im wesentlichen reine Verbindung
umfaßt, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-
X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R),
GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-
4Glc, GalBl-4GlcNAcB1-3Gal und GalBl-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin,
hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein
N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein Ceramid ist, und wobei das pathogene oder
opportunistische Bakterium gewählt ist aus der aus Streptococcus, Staphylococcus,
Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria. Coxiella und Shigella
bestehenden Gruppe.
8. Verfahren von Anspruch 7, wobei der Rezeptor an einen festen Träger gebunden ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung, Prävention oder Abmilderung von
durch pathogene oder opportunistische Bakterien verursachter Krankheit oder Infektion in
Säugern, umfassend eine wirksame Menge eines Rezeptors in Kombination mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei der Rezeptor eine im wesentlichen reine
Verbindung umfaßt, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-
4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3 GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-
4G1cB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalBl-4Glc,
GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-4GlcNAcB1-3Gal und GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin
X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein
N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein Ceramid ist, und wobei das pathogene
oder opportunistische Bakterium gewählt ist aus der aus Strentococcus, Staphylococcus,
Clostridium, Borrelia, Haemonhilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Shigella
bestehenden Gruppe.
10. Zusammensetzung von Anspruch 9, wobei der Träger ein Liposom ist.
11. Zusammensetzung von Anspruch 9, wobei der Rezeptor an einen makromolekularen
Träger gekoppelt ist.
12. Zusammensetzung von Anspruch 11, wobei der makromolekulare Träger ein Polymer ist.
13. Zusammensetzung von Anspruch 9, wobei der Rezeptor an ein antibakterielles Mittel oder
an ein Immunogen gebunden ist.
14. Verwendung einer im wesentlichen reinen Rezeptorverbindung, gewählt aus der Gruppe,
die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-
4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc,
GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-4GlcNAcB1-3Gal
und GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder
gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R)
ein Ceramid ist, für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der
Inhibierung der Adhärenz von pathogenen oder opportunistischen Bakterien an
Säugerzellen oder bei der Entfernung der Bakterien von den Zellen, wobei die pathogenen
oder opportunistischen Bakterien aus der aus Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium,
Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Shigella bestehenden
Gruppe gewählt sind.
15. Verwendung des Rezeptors gemäß Anspruch 14, wobei der Rezeptor in einer Flüssigkeit
gelöst oder suspendiert ist, welche mit den Zellen physiologisch verträglich ist
16. Verfahren zur Herstellung eines isolierten bakteriellen Adhäsinproteins, umfassend die
folgenden Schritte:
Solubilisieren der Membranen von pathogenen oder opportunistischen Bakterien, wodurch
solubilisiertes Material, das das Adhäsinprotein enthält, und unlösliches Material erzeugt
wird;
Trennen des solubilisierten Materials von dem unlöslichen Material;
Kontaktieren des solubilisierten Materials mit einem Rezeptor, wobei der Rezeptor an
einen unlöslichen festen Träger gebunden ist, während einer Zeitdauer, die ausreicht, damit
das Adhäsinprotein an den Rezeptor bindet; und
Entfernen des Proteins von dem Rezeptor, wodurch das Protein in isolierter Form
gewonnen wird, wobei der Rezeptor eine im wesentlichen reine Verbindung umfaßt,
gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalBl-4G1cB1-1-X(R),
GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-
4GlcNAcB1-3GalBl-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcBl-3Ga1B1-4Glc,
GalBl-4GlcNAcB1-3Gal und GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin,
hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat
von X ist, so daß X(R) ein Ceramid ist, und wobei das pathogene oder opportunistische
Bakterium gewählt ist aus der aus Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium, Borrelia,
Haemophilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe.
17. Isoliertes bakterielles Adhäsinprotein, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 16.
18. Im wesentlichen gereinigtes bakterielles Adhäsinprotein, erhalten von der Oberfläche eines
pathogenen oder opportunistischen Bakteriums, das an einen Rezeptor bindet, der eine im
wesentlichen reine Verbindung umfaßt, die gewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus
GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-
X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-
3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3Ga1B1-4Glc, GalB1-4GlcNAcB1-3Gal und
GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin, hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes
Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein
Ceramid ist, und wobei das pathogene oder opportunistische Bakterium gewählt ist aus der
aus Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas,
Neisseria, Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe.
19. Im wesentlichen gereinigtes bakterielles Adhäsinprotein, erhalten von der Oberfläche eines
pathogenen oder opportunistischen Bakteriums, das an eine im wesentlichen reine
Verbindung bindet, die gewählt wird aus der Gruppe, die aus Paraglobosid oder
Lactotriaosylcer besteht, und wobei das pathogene oder opportunistische Bakterium aus der aus
Streptococcus, Staphvlococcus, Clostridium, Borrelia, Haemophilus, Pseudomonas,
Neisseria. Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe gewählt ist.
20. Protein von Anspruch 19, wobei das Paraglobosid oder Lactotriaosylcer aus humanen
Zellen erhalten wird.
21. Im wesentlichen reines Protein gemäß Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung in der
Medizin.
22. Verwendung von im wesentlichen reinem Polypeptid gemäß Anspruch 18, oder einem
Fragment davon, zur Herstellung eines Medikaments, das fähig ist, eine antigene Antwort
in einem tierischen Wirt hervorzurufen, wobei die antigene Antwort eine durch pathogene
oder opportunistische Bakterien verursachte Krankheit oder Infektion in dem Wirt
verhindert oder abmildert.
23. Immungenes Polypeptid, das immunologisch kreuzreaktiv mit dem Protein von Anspruch
18 ist.
24. Polypeptid von Anspruch 23, wobei das Polypeptid verändert ist, um dessen
Immunogenität zu steigern.
25. Im wesentlichen reines Polypeptid, das an Antikörper gegen das Protein von Anspruch 18
bindet.
26. Impfstoff, umfassend eine immunologisch wirksame Menge des Proteins von Anspruch 18
oder eines Fragments davon in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
27. Diagnostisches Kit für den Nachweis eines pathogenen oder opportunistischen Bakteriums
in einer Probe, umfassend in einem Behälter:
Protein von Anspruch 18, gebunden an ein unlösliches Substrat; und
Mittel zum Nachweisen oder Messen der Bildung von Komplexen aus dem Protein und
dem Bakterium.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung, Prävention oder Abmilderung von
durch ein pathogenes oder opportunistisches Bakterium, welches einen Rezeptor auf seiner
Oberfläche exprimiert, verursachter Krankheit oder Infektion in Säugern, umfassend eine
wirksame Menge des Proteins von Anspruch 18 in einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger, wobei der Rezeptor aus einer im wesentlichen reinen Verbindung aufgebaut ist,
gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R),
GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-
4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc,
GalB1-4GlcNAcB1-3Gal und GalBl-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin,
hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein N-
Acylfettsäurederivat von X ist, so daß X(R) ein Ceramid ist.
29. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, codierend für ein bakterielles
Adhäsinprotein, das an einen Rezeptor für ein pathogenes oder opportunistisches
Bakterium bindet, wobei der Rezeptor eine im wesentlichen reine Verbindung umfaßt,
gewählt aus der Gruppe, die besteht aus GalB1-4GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R),
GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB1-1-X(R), GalB1-
4GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GalB1-3GlcNAcB1-3GalB1-4Glc, GlcNAcB1-3GalB1-4Glc,
GalB1-4GlcNAcB1-3Gal und GalB1-3GlcNAcB1-3Gal, worin X Sphingosin,
hydroxyliertes Sphingosin oder gesättigtes Sphingosin ist, und R H oder ein N-Acylfettsäurederivat
von X ist, so daß X(R) ein Ceramid ist, und wobei das pathogene oder opportunistische
Bakterium aus der aus Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium. Borrelia,
Haemonhilus, Pseudomonas, Neisseria, Coxiella und Shigella bestehenden Gruppe gewählt
ist.
30. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, abgeleitet von der DNA-Sequenz
von Anspruch 29 durch einzelne oder mehrere Mutationen.
31. DNA Sequenz, die mit der DNA-Sequenz von Anspruch 29 unter Bedingungen mäßiger
Stringenz hybridisiert.
32. Rekombinante DNA-Sequenz, umfassend die DNA-Sequenz von Anspruch 29 in
funktionstüchtiger Verknüpfung an geeignete regulatorische Steuerungs-
Nukleinsäuresequenzen, die in der Lage sind, die Expression der DNA-Sequenz in
transformierten Wirtszellen zu bewirken.
33. Expressionsvektor zur Expression von DNA, die für das Protein von Anspruch 18 codiert,
in einem kompatiblen Wirt, umfassend einen Vektor, der fähig zur Transformation einer
prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle ist, und die DNA von Anspruch 29, welche in
den Vektor in der richtigen Orientierung und im korrekten Leserahmen für die Expression
eingefügt ist.
34. Wirtszelle, transformiert mit der rekombinanten DNA-Sequenz von Anspruch 32.
35. Rekombinantes Protein, hergestellt durch die transformierte Zelle von Anspruch 34.
36. Verfahren zur Herstellung des Proteins von Anspruch 18, umfassend die folgenden
Schritte:
Kultivieren von Wirtszellen, die mit einer rekombinanten DNA-Sequenz transformiert sind,
welche aufgebaut ist aus einer für das Protein von Anspruch 18 codierenden DNA-Sequenz
in funktionstüchtiger Verknüpfung an geeignete regulatorische
Steuerungs-Nukleinsäuresequenzen, die in der Lage sind, die Expression der DNA-Sequenz in den transformierten
Zellen zu bewirken; und
Entfernen des Polypeptids, dessen Expression von der Sequenz codiert worden ist.
37. Immunogenes Polypeptid, umfassend ein Fusionsprotein, welches das Protein von
Anspruch 18 enthält.
38. Rekombinantes Protein von Anspruch 35 zur Verwendung in der Medizin.
39. Impfstoff umfassend eine immunologisch wirksame Menge des rekombinanten Proteins
von Anspruch 3 S in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
40. Impfstoff, umfassend eine immunologisch wirksame Menge eines avirulenten Bakteriums,
das mit der rekombinanten DNA von Anspruch 32 transformiert ist, wobei das Bakterium
in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegt.
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