DE69034206T2

DE69034206T2 - Argininantagonisten zur Hemmung des systemischen Blutdruckes in Zusammenhang mitStickoxidbildung oder Endothelial Derived Relaxing Factor

Info

Publication number: DE69034206T2
Application number: DE69034206T
Authority: DE
Inventors: Robert G. Kilbourn; Roberto New York Levi; Steven S. New York Gross; Owen W. Milwaukee Griffith; Robert Bellaire Lodato
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; University of Texas System
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; University of Texas System
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1990-09-13
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2010-09-14
Also published as: EP0922454B1; DE69032911T2; ES2256913T3; EP0597831B1; JPH05500219A; JP2679873B2; KR100230514B1; EP0597831A1; SG48203A1; ATE309799T1; DK0922454T3; CA2065040C; CA2065040A1; AU634826B2; DE69034206D1; AU6409690A; EP0922454A2; ES2132070T3; ATE175871T1; EP0922454A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Prophylaxe und Milderung von durch die Erzeugung von Stickstoffoxid induzierter Hypotonie.
1980 zeigten Furchgott und Zawadski (Nature 288: 373–376), daß Endothelzellen, die Blutgefäße auskleiden, zur Freisetzung einer Substanz, die die glatte Gefäßmuskulatur relaxiert, d.h. eine Vasodilatation verursacht, stimuliert werden können. Da die chemische Natur dieser Substanz völlig unbekannt war, wurde sie einfach als aus dem Endothel stammender Relaxationsfaktor (EDRF) bezeichnet. Es ist nun in großem Umfang akzeptiert, daß viele natürlich vorkommende Substanzen, die als physiologische Vasodilatatoren fungieren, ihre gesamte oder einen Teil ihrer Wirkung durch Stimulieren der Freisetzung von EDRF vermitteln; diese Substanzen umfassen Acetylcholin, Histamin, Bradykinin, Leukotriene, ADP, ATF, die Substanz P, Serotonin, Thrombin und sonstige. Obwohl die extrem kurze Lebensdauer von EDRF (mehrere Sekunden) die Bemühungen zur chemischen Identifizierung dieses Moleküls behinderte, schlugen 1987 mehrere Laboratorien vor, daß es sich bei EDRF um Stickstoffoxid (NO), das sich spontan in Nitrat und Nitrit zersetzt, handeln könnte. Ein fundamentales Problem, um diese NO-Hypothese zu akzeptieren, bestand darin, daß bisher nicht bekannt war, daß Säugetiersysteme einen enzymatischen Weg zur möglichen Synthese von NO enthalten; außerdem war ein wahrscheinlicher Vorläufer für eine Biosynthese von NO unbekannt. Nach der Beobachtung, daß das zu Arginin analoge L-N^G-Methylarginin (L-NMA) die durch Acetylcholin und Histamin induzierte vaskuläre EDRF/NO-Synthese hemmen konnte und daß die EDRF/NO-Synthese durch Zugabe von L-Arginin im Überschuß wiederhergestellt werden konnte, schlugen bestimmte Erfinder der vorliegenden Erfindung vor, daß Arginin der physiologische Vorläufer der EDRF/NO-Biosynthese ist (Sakuma et al., PNAS 85: 8664–8667, 1988). Weitere, diesen Vorschlag stützende Belege wurden fast gleichzeitig berichtet. Bestimmte Erfinder der vorliegenden Erfindung zeigten später auf, daß die Hemmung der EDRF/NO-Synthese in narkotisiertem Meerschweinchen den Blutdruck erhöht, was zur Annahme führt, daß EDRF/NO ein wichtiger physiologischer Regulator des Blutdrucks ist (Aisaka et al., BBRC 160: 881–886, 1989). Ungeachtet der die Synthese von NO stützenden angehäuften Belege ist Fachleuten klar, daß andere Stickstoffoxide vorhanden sein und bezüglich Verringerung des Blutdrucks aktiv sein können. Innerhalb dieser Beschreibung soll das Akronym NO Stickstoffoxid und alle weiteren vasoaktiven Stickstoffoxide darstellen.
Andere Laboratorien hatten aufgezeigt, daß Makrophagenzellen durch eine 12- bis 36stündige Behandlung mit γ-Interferon, bakteriellem Endotoxin und verschiedenen Cytokinen "aktiviert" werden. Diese "Aktivierung" ist mit einem Auslösen des Abtötens von Tumorzellen und der Erzeugung von Nitrit und Nitrat aus L-Arginin verbunden. Es wurde beobachtet, daß aktivierte Makrophagen tatsächlich NO aus L-Arginin (genau wie Endothelzellen) herstellen und daß dieses NO anschließend mit Sauerstoff reagiert, wobei stärker oxidierte Stickstoffmetabolite gebildet werden, die physiologisch inert zu sein scheinen (Stuehr et al., J. Exp. Med. 169: 1011–1020, 1989). Das für die NO-Synthese verantwortliche Enzym (Stickoxidsynthetase) wurde durch einige Erfinder der vorliegenden Erfindung partiell charakterisiert (Stuehr et al., BBRC 161: 420–426, 1989) und bewirkt eine Oxidation der terminalen Aminogruppe von Arginin, was zur Erzeugung von NO und Citrullin führt. Es wird nun angenommen, daß das von Makrophagen stammende NO ein wichtiges tumorizides und bakterizides Mittel ist. Da bakterielles Endotoxin, γ-Interferon und andere Cytokine die Erzeugung von NO durch Makrophagenzellen triggern können, kann offensichtlich 1) die Erzeugung von NO von Endothelzellen durch ähnliche Stimuli stimuliert werden und 2) septischer Schock (d.h. eine durch bakterielles Endotoxin induzierte systemische Vasodilatation) durch eine massive Aktivierung der Biosynthese von NO entstehen. Die Spekulation, daß letztere Hypothese richtig war, wurde durch einen früheren Bericht genährt, nach dem die Nitratkonzentrationen im Harn durch die Behandlung von Ratten mit bakteriellem Endotoxin stark erhöht wurden (Wagner et al., PNAS 80: 4518–4521, 1983).
Es ist bekannt, daß Cytokine in Endothelzellen morphologische und funktionelle Änderungen verursachen, die als "Endothelzellenaktivierung" beschrieben werden. Unterschiedliche Immunmediatoren, wie Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin-1 (IL-1) und γ-Interferon (IFN oder I) scheinen unterschiedliche, jedoch partiell überlappende Muster einer Endothelzellenaktivierung, umfassend eine erhöhte Procoagulationsaktivität (Bevilaqua, 1986), die Produktion von PGI2 (Rossi, 1985 Science 229, 174), die HLA-Antigenexpression (Pober 1987) und Lymphocytenadhäsionsmoleküle (Harlan 1985; Cavender 1987) zu induzieren. Obwohl von diesen Cytokinen berichtet wird, daß sie Hypotonie, Gefäßhämorrhagie und Ischämie verursachen, sind die zugrundeliegenden Mechanismen einer veränderten Vasoaktivität unklar (Goldblum et al. 1989; Tracey et al. Science 234: 470, 1986). Ein möglicher Mediator einer veränderten Vasoaktivität ist EDRF.
Die EP 0 230 037 betrifft bestimmte Argininderivate, die als bei ischämischen Erkrankungen verwendbar vorgeschlagen wurden. Gold et al. (1989) FASEB 3(3): A494, 2463 betrifft den Einfluss von Argininanaloga und Depletion auf die endo thelabhängige Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur.
In sowohl klinischen Untersuchungen als auch Untersuchungen an Tieren (Dvorak, 1959) bezüglich der Wirkungen von Modifikatoren des biologischen Ansprechens bestand die eine größere Dosis begrenzende Toxizität in Hypotonie und Gefäßblutungen.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Inhibitors der Stickoxidbildung von Arginin bei der Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von systemischer Hypotonie.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner einen Inhibitor der Stickoxidbildung von Arginin zur Verwendung in der Humanmedizin, wobei der Inhibitor N^G-Aminoarginin, N^G-Nitroarginin, N^G-Methylarginin, N^G-Ethylarginin, N^G-Propylarginin, N^G-Butylarginin, N^G,N^G-disubstituiertes Arginin oder L-Nitroargininmethylester ist.
Die vorliegende Erfindung macht eine Prophylaxe oder Behandlung eines Lebewesens wegen durch einen Modifikator des biologischen Ansprechens, wie Cytokine, IFN, TNF, IL-1 und IL-2, induzierter systemischer Hypotonie verfügbar. Das Verfahren umfaßt die vorzugsweise intravaskuläre Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors der Stickoxidbildung aus Arginin. Obwohl die bevorzugte Verabreichung intravaskulär erfolgt, wird angenommen, daß andere parenterale Verabreichungswege, beispielsweise eine intraperitoneale, intramuskuläre oder subdermale Injektion, sich als günstig erweisen können. Unter bestimmten klinischen Bedingungen kann auch eine enterale oder topische Verabreichung vorteilhaft sein.
In einer Ausführungsform besteht der Inhibitor aus N^G-sub stituiertem Arginin oder einem N^G,N^G-disubstituierten Arginin, das an ein Lebewesen, das möglicherweise durch NO induzierte systemische Hypotonie entwickelt oder aufweist, verabreicht wird. Die Argininantagonisten der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise die L-Konfiguration auf und umfassen beliebige, den geplanten Behandlungen angemessene, pharmazeutisch akzeptable Additionssalze.
Eine spezielle Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Prophylaxe oder Behandlung von bei einem Patienten durch chemotherapeutische Behandlung mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2 oder beiden induzierter systemischer Hypotonie. Bei diesem Aspekt umfaßt das Verfahren die intravaskuläre Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von N^G-substituiertem Arginin oder einem N^G,N^G-disubstituierten Arginin an den Chemotherapiepatienten.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung eines Lebewesens wegen durch Endotoxin induzierter systemischer Hypotonie, d.h. septischen Schock. Obwohl eine Prophylaxe hier ungeeignet ist, ist eine Behandlung essentiell, wobei die Behandlung die intravaskuläre Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Argininantagonisten, wie N^G-substituiertes Arginin, N^G,N^G-disubstituiertes Arginin, N^G-Aminoarginin oder N^G-Nitroarginin, an ein derartiges Lebewesen mit niedrigem Blutdruck umfaßt.
Septischer Schock ist ein lebensbedrohlicher Zustand, der aus einer Exposition mit bakteriellem Endotoxin entsteht. Er manifestiert sich durch einen Zusammenbruch des Herz/Kreislaufsystems und wird durch die Freisetzung von Cytokinen, wie Tumornekrosefaktor, vermittelt. Einige dieser Cytokine verursachen die Freisetzung vasoaktiver Substanzen. In der vorliegenden Untersuchung verursachte die Verabreichung von 40 μg/kg von bakteriellem Endotoxin an Hunde eine 33%ige Abnahme des peripheren Gefäßwiderstands und einen Abfall des mittleren arteriellen Blutdrucks von 54 % innerhalb von 30 bis 90 min. Der Gefäßwiderstand und der systemische arterielle Druck normalisierten sich innerhalb von 1,5 min nach der intravenösen Verabreichung von N^G-Methyl-L-arginin (20 mg/kg), einem starken und selektiven Inhibitor der Stickoxidsynthese. Obwohl die Injektion von N^G-Methyl-L-arginin den Blutdruck in Kontrollhunden erhöhte, war der blutdruckerhöhende Effekt in endotoxämischen Hunden viel größer (24,8 ±4,7 mmHg gegenüber 47,8 ±6,8 mmHg, n = 4). N^G-Methyl-L-arginin verursachte bei Hunden, die durch kontinuierliche intravenöse Infusion von Nitroglycerin niedrigen Blutdruck erhielten, nur eine mäßige Zunahme des Blutdrucks (17,1 ±5,0 mmHg, n = 3). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Überproduktion von Stickoxid wesentlich zu endotoxischem Schock beiträgt. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse zum ersten Mal die Nützlichkeit von Inhibitoren der Stickoxidsynthese bei endotoxischem Schock und sie legen nahe, daß derartige Inhibitoren bei der Behandlung von septischem Schock von therapeutischem Wert sein können.
Bevorzugte N^G-substituierte Argininantagonisten der L-Konfiguration für die hier beschriebenen Zwecke umfassen N^G-Aminoarginin, N^G-Nitroarginin und N^G-Alkylarginine, wie N^G-Methylarginin, N^G-Ethylarginin, N^G-Propylarginin oder N^G-Butylarginin. Therapeutisch wirksame Mengen der substituierten oder disubstituierten Argininantagonisten hemmen die Erzeugung von Stickoxid aus Arginin im Tier oder Patienten, wodurch dessen blutdrucksenkende Wirkungen abgewendet werden.
In einem mehr allgemeinen Sinn betrifft die vorliegende Erfindung die Prophylaxe oder Behandlung eines Lebewesens wegen mit der induzierten Erzeugung von Stickoxid im Zusam menhang stehender systemischer Hypotonie. Die Behandlung umfaßt die intravaskuläre Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Argininantagonisten zur Hemmung der Erzeugung von Stickoxid aus Arginin an ein Lebewesen. Wirksame Argininantagonisten können eine große Vielzahl von Verbindungen, insbesondere Argininderivate, die die Erzeugung von Stickoxid hemmen, umfassen. Viele Substituenten, beispielsweise an der Guanidinogruppe von Arginin oder analogen funktionellen Gruppen von Citrullin sollten die gleiche Aufgabe erfüllen. Die Synthese des Hypotonie erzeugenden Stickoxids kann direkt oder indirekt durch mindestens einen der Faktoren IFN, TNF, IL-1, IL-2 und Endotoxin induziert werden. In einem bevorzugten Aspekt umfassen die in der hier beschriebenen Weise verwendbaren Argininantagonisten N^G-substituiertes Arginin oder N^G,N^G-disubstituiertes Arginin. In einer Ausführungsform tragen diese Antagonisten vorzugsweise Alkylsubstituenten, ausgewählt aus der Gruppe Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl. Analoge Antagonisten können derivatisierte Alkylsubstituenten, ausgewählt aus der Gruppe Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl und Aminoalkyl, umfassen. Die bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendbaren Argininantagonisten umfassen Arginin mit mindestens einem N^G-Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Hydroxyalkyl und Alkenyl. Die therapeutisch wirksame Menge von Argininantagonisten der vorliegenden Erfindung ist eine zur Hemmung der Produktion von Stickoxid aus Arginin ausreichende Menge. Stickoxid wird in Gegenwart von Sauerstoff rasch zu Nitrat- und (primär) Nitritionen (in einem festen Verhältnis) abgebaut; deshalb werden Nitrite klinisch zum Nachweis der Stickoxidproduktion gemessen.
Bei intravaskulärer Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von NMA oder N^G-Methylarginin (gleichbedeutend mit N^G-Monomethyl-L-arginin oder NMMA) an einen Hund be trägt die therapeutisch wirksame Menge zwischen etwa 4 mg/kg und etwa 100 mg/kg. Die entsprechende Dosis von NMMA und/oder anderen Argininantagonisten für einen Menschen sollte zwischen etwa 0,1 mg/kg und etwa 100 mg/kg liegen.
Die in den Zeichnungen und an anderen Stellen dieser Anmeldung verwendeten Abkürzungen umfassen die folgenden. Sonstige sind im Text definiert.

ACh: = Acetylcholin
CO: = Herzleistung
EDRF: = aus dem Endothel stammender Relaxationsfaktor
ET: = Endotoxin
GP: = Meerschweinchen
HIST: = Histamin
IFN: = I = γ-Interferon
IV: = intravenös
L-Arg: = L-Arginin
L-NMA (oder NMMA): = N^G-Methyl-L-arginin = N^G-Monomethyl-L-Arginin
LPS: = Endotoxin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
LTD₄: = Leukotrien D₄
MBEC: = Mäusehirnendothelzellen
MDP: = Muramyldipeptid
NE: = Norepinephrin
NMA: = L-NMA = NMMA = N^G-Monomethyl-L-arginin
NO: = Stickoxid
PAF: = plättchenaktivierender Faktor
SAP: = systemischer arterieller Druck
SNP: = Natriumnitroprussid
SVR: = systemischer Gefäßwiderstand
TNF: = Tumornekrosefaktor

1 zeigt die Wirkungen von IFN in Kombination mit verschiedenen Cytokinen auf die Erzeugung von Nitriten durch Hirnendothelzellen (MBEC).
2a zeigt die Nitritkonzentration in Verbindung mit MBEC bei einer konstanten Konzentration des Tumornekrosefaktors (TNF) und einem Bereich von IFN-Konzentrationen.
2b zeigt die Nitritkonzentration in Verbindung mit MBEC bei konstanter IFN-Konzentration und einem Bereich von TNF-Konzentrationen.
3 zeigt die Nitritkonzentration in Verbindung mit MBEC, die durch TNF und IFN induziert wurde (als Funktion der Zeit).
4 zeigt die Nitritkonzentration in Verbindung mit MBEC, die mit TNF und IFN exponiert wurden, als Funktion der Konzentration von Arginin.
5 zeigt die Verringerung der durch TNF und IFN induzierten Nitritkonzentration in Verbindung mit MBEC durch NMMA.
5a zeigt die Umkehrung der NMMA-Hemmung der Nitritkonzentration durch Arginin.
6 zeigt Nitritkonzentrationen in Verbindung mit MBEC mit 100 U IFN/ml als Funktion der Endotoxinkonzentration.
7 erläutert Veränderungen bei systemischem Blutdruck (BP) und Herzfrequenz (HR) von Hunden als Funktion der Zeit nach der aufeinanderfolgenden Verabreichung von TNF, NMMA und L-Arginin.
7a erläutert ebenfalls Veränderungen bei systemischem BP und HR von Hunden als Funktion der Zeit nach der aufein anderfolgenden Verabreichung von TNF, NMMA und L-Arginin.
7b erläutert Kontrollexperimente, bei denen NMMA an vorher unbehandelte Hunde verabreicht wurde.
7c erläutert die Wirkungen von NMMA auf durch Nitroglycerin induzierte Hypotonie von Hunden.
8 erläutert die Wirkung von NMMA auf die endothelabhängige Relaxation von Pulmonalarterienringen von Meerschweinchen (cavian) als Reaktion auf ACh, LTD₄ und HIST und auf die durch SNP verursachte endothelunabhängige Relaxation.
9 zeigt Dosis/Ansprechkurven der Hemmung der acetylcholininduzierten Relaxation für bestimmte N^G-substituierte Argininderivate.
9a zeigt die Hemmung der A23187-stimulierten Nitritfreisetzung in Rinderaortaendothelzellen durch mehrere mono- und disubstituierte Argininanaloga.
9b zeigt die Hemmung der ACh-induzierten Relaxation in isolierten Kaninchenaortaringen durch mehrere mono- und disubstituierte Argininanaloga.
10 zeigt die Modifizierung der ACh-induzierten Relaxation durch NMMA, L-Citrullin, D-Arginin und L-Arginin in Gefäßringen aus verschiedenen Arten.
11 zeigt die durch L-NMA, D-Arginin (D-arg), L-Citrullin (L-cit) und L-Arginin (L-arg) modifizierte ACh-induzierte Relaxation von durch NE vorher zusammengezogener Kaninchenaorta und humaner innerer Brustarterie.
12 zeigt die Hemmung der durch Calciumionophor induzierten Nitritfreisetzung aus Rinderaortaendothelzellen (BAECs) durch NMMA.
13 zeigt die histamininduzierte Nitritfreisetzung von Meerschweinchenherz: Blockade durch NMMA und Wiederherstellung durch L-Arginin.
14 zeigt die Dosis/Ansprechbeziehung für die Blutdruckerhöhungswirkung von NMMA beim narkotisierten Meerschweinchen.
15 zeigt den zeitlichen Verlauf und die Dosisabhängigkeit der NMMA-Hypertonie beim Meerschweinchen.
16 zeigt den zeitlichen Verlauf und die Dosisabhängigkeit der von L-N^G-Aminoarginin induzierten Hypertonie beim Meerschweinchen.
17 zeigt die Blutdruckerhöhungswirkungen von L-N^G-Aminoarginin und NMMA als Funktion der Konzentration im Meerschweinchen.
18 zeigt die Wirkung einer IFN- und ET-Stimulation von EMT6-Zellen auf die Cytosolnitritkonzentration in diesen Zellen.
19 zeigt, daß die durch IFN und ET stimulierte Nitritbildung im Cytosol von EMT6-Zellen von Arginin und NADPH abhängig ist.
20 ist ein Lineweaver-Burke-Diagramm für die L-Arginin-abhängige Nitritsynthese durch eine in stimuliertem EMT6-Cytosol (mit IFN und ET stimuliert) vorhandene Enzymaktivität.
21 zeigt, daß NMMA ein kompetitiver Inhibitor des in 20 beschriebenen Enzyms ist.
22 zeigt ein Lineweaver-Burke-Diagramm, das zeigt, daß NG-Monoethylarginin (L-NEA) ein kompetitiver Inhibitor der in 20 gezeigten enzymatischen Aktivität ist.
23 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen des mittleren systemischen arteriellen Drucks (SAP) in einem mit Pentobarbital betäubten Hund nach der i.v. Verabreichung von Endotoxin (ET), N^G-Methyl-L-arginin (L-NMA) und L-Arginin (L-Arg).
24 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen des mittleren systemischen arteriellen Drucks (SAP) in einem mit Pentobarbital betäubten Hund nach der i.v. Verabreichung von Endotoxin, L-NMA und L-Arg.
25 zeigt den zeitlichen Verlauf von durch TNF vermittelter systemischer Hypotonie von Hunden und die Umkehrung durch N^G-Aminoarginin.
26 zeigt die Umkehrung der Endotoxin-induzierten systemischen Hypotonie durch N^G-Aminoarginin.
27 zeigt die Umkehrung der durch Interleukin-1 vermittelten Hypotonie durch N^G-Aminoarginin.
Klinische Untersuchungen von Modifikatoren des biologischen Ansprechens, wie bestimmte Cytokine, haben gezeigt, daß eine eine größere Dosis begrenzende Toxizität in Hypotonie besteht. Es zeigte sich auch, daß diese Cytokine Makrophagen aktivieren, ein Prozeß, der Makrophagen für Tumorzellen cytotoxisch macht. Jüngste Untersuchungen legten nahe, daß von Makrophagen stammendes Stickoxid das für die Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen verantwortliche Effektormolekül ist. Stickoxid (NO) ist eine hochreaktive Verbindung, die sich im Kulturmedium spontan zu Nitraten und Nitriten zersetzt. Nitrit, ein überwiegendes spontanes Oxidationsprodukt von NO, läßt sich ohne Schwierigkeiten testen und wird hier für Tests auf NO-Erzeugung verwendet. Es wurde auch gezeigt, daß NO durch Gefäßendothelzellen erzeugt wird, wobei dies früher als aus dem Endothel stammender Relaxationsfaktor (EDRF) bekannt war. Es hatte sich gezeigt, daß EDRF die Relaxation der glatten Muskulatur von Arterien als Reaktion auf die Infusion blutdrucksenkender Mittel, wie Bradykinin oder Acetylcholin, verursachte.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Erkenntnis, daß IFN (100 U/ml) in Kombination mit entweder TNF (500 U/ml), IL-1 (10 U/ml) oder Endotoxin (1 μg/ml) MBECs zur Ansammlung von Nitrat im Kulturmedium (15 bis 80 μM in 48 h) induzieren kann. Diese Konzentrationen sind mit den von aktivierten Makrophagen erzeugten vergleichbar. TNF, IL-1 oder Endotoxin allein induzierten die Produktion minimaler Konzentrationen von Nitriten (1–3 μM).
Die Freisetzung vasoaktiver Faktoren, wie NO, durch Endothelzellen kann bei der Entwicklung von Hypotonie in Verbindung mit der Verabreichung dieser Mittel in vivo eine Rolle spielen. Diese Erfindung betrifft eine Demonstration, daß kultivierte MBECs NO als Reaktion auf verschiedene Kombinationen von Cytokinen erzeugen, und die mögliche Rolle von NO bei der Pathogenese einer Verletzung von Gefäßendothelzellen.
Diese Beispiele sollen die beste Art und Weise, bevorzugte Ausführungsformen und Verwendungen der vorliegenden Erfindung beschreiben und sollen die vorliegende Erfindung nicht beschränken, sofern dies in den beigefügten Ansprüchen nicht anders angegeben ist.
BEISPIEL 1
Materialien – Rekombinantes Mäuse-IFN, IL-1 und TNF (Genzyme). NMMA war eine Gabe von Dr. Moncada, London, England. Endotoxin (E. coli B126) und alle sonstigen Reagenzien wurden von Sigma Chemical Co. (Sigma) erhalten.
Endothelzellen – MBECs wurden aus Mäusehirnmikrogefäßen isoliert und auf mit Gelatine beschichteten Gewebekulturschalen in DME/F12-Medien, die mit 2 % PPPHS, 5 % FBS (Hyolone), 50 μg/ml ECGF (Biomed Tech) und 10 U/ml Heparin (Sigma) ergänzt waren, kultiviert (Beschreibung siehe Belloni et al. 1989). Die Endothelderivatisierung der MBECs wurde durch das Vorhandensein einer nicht-thrombogenen Oberfläche gegenüber Plättchen und Immunfluoreszenzfärbung für mit Faktor VIII verwandtem Antigen bestimmt. Es wurden MBECs zwischen Durchgang 6–9 für alle Experimente verwendet.
Nitrittest – MBE-Zellen wurden auf Platten mit mit Gelatine beschichteten Vertiefungen (Corning) in 100 μl Kulturmedium kultiviert und 3 Tage nach dem Zusammenfließen mit Cytokinen behandelt. Nach 48 h wurde die Nitritproduktion durch einen kolorimetrischen Test bestimmt. Kurz gesagt wurden 50 μl des Mediums aus jeder Kulturvertiefung entfernt, mit 50 μl Greiss-Reagens (1 % Sulfanilamid und 0,1 % Naphthyethylendiamindihydrochlorid in 2 % H₃PO₄) gemischt, 10 min lang bei 25° unter Schütteln inkubiert und danach die Absorption (OD) in einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices Corp.) gemessen und die Konzentrationen durch Vergleich mit einer Standardlösung von NaNO₂ in Wasser bestimmt. Hintergrundnitritkonzentrationen in Kontrollkulturen, die keine Cytokine erhalten hatten, wurden von den experimentellen Werten abgezogen. Bei bestimmten Experimenten wurde NMMA dem Zuchtmedium zum Zeitpunkt der Cytokinzugabe zugesetzt, während in anderen argininfreie Medien als Zuchtmedium ergänzt wurden. Alle Behandlungen wurden dreifach durchgeführt und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Wirkung von Cytokinen auf die Nitriterzeugung durch MBEC
Die Wirkungen von IFN in Kombination mit verschiedenen Cytokinen oder Immunmodulatoren auf die Erzeugung von Nitrit durch MBEC sind in 1 erläutert. Die Exposition von Endothelzellen mit IFN (100 U/ml) allein hatte auf die Nitriterzeugung keine Wirkung, jedoch ergaben Kombinationen von Interferon mit TNF (500 U/ml), IL-1 (10 U/ml) oder Endotoxin (1 μg/ml) im Vergleich zu den Wirkungen dieser Mittel allein eine synergistische Wirkung auf die Nitriterzeugung. Weder Muramyldipeptid (MDP) oder IL-2 allein oder in Kombination mit IFN bewirkten eine Nitriterzeugung durch MBEC. Dieses Fehlen einer Reaktion unterscheidet die MBECs von aktivierten Makrophagen, die nach einer Exposition mit MDP und IFN signifikante Mengen Nitrite erzeugen (Drapier et al. 1988). Als wirksamste Cytokinkombination zur Induktion einer Nitritproduktion (19,5 mM ±5) erwies sich IFN plus TNF. Die Dosis/Ansprechkurven für TNF und IFN sind in 2a und 2b angegeben. Die Ansammlung von Nitriten war bei Vorhandensein von IFN mit einer Konzentration von 100 U/ml proportional zur Konzentration an zugesetztem TNF (2b).
Es zeigte sich auch, daß die Ansammlung von Nitriten im Kulturmedium in zeitabhängiger Weise erfolgte, wobei die erste nachweisbare Zunahme 8 h nach der Zugabe von TNF und IFN erfolgte (3). Die maximale Ansammlung wurde nach 48 h beobachtet und deshalb wurden in allen anschließenden Untersuchungen die Nitritmessungen 48 h nach der Zugabe von TNF (500 U/ml) und IFN (100 U/ml) durchgeführt. Obwohl sowohl von TNF als auch von IFN berichtet wurde, daß diese morphologische Veränderungen in humanen Nabelschnurendothelzellen verursachen, wurden unter diesen Bedingungen keine Veränderungen in der Grobmorphologie dieser Mikrogefäßendothelzellen von Mäusen erfaßt.
Arginin ist zur Erzeugung von Nitriten erforderlich
Mit mit TNF und IFN exponierten MBEC waren in argininfreiem Kulturmedium keine erhöhten Konzentrationen von Nitriten verbunden; die Nitritkonzentration nahm in dosisabhängiger Weise bei Zugabe von L-Arginin zum Medium zu (4). Die Nitriterzeugung wurde ebenfalls durch die Zugabe des Argininderivats NMMA gehemmt (5). Diese Hemmung war zur Konzentration von NMMA proportional und in Gegenwart von 1 mM NMMA maximal (E.D. 50 % = 0,33 mm). Ferner konnte die Hemmwirkung von NMMA durch die Zugabe von L-Arginin im Überschuß umgekehrt werden, wobei 8 mM L-Arginin die Wirkungen von 1 mM NMMA vollständig umkehrte (5a). Diese Ergebnisse legen nahe, daß mikrovaskuläre Endothelzellen als Reaktion auf spezifische Cytokine NO durch Neusynthese unter Verwendung von L-Arginin als physiologischem Vorläufer erzeugen. Ein ähnlicher Metabolismusweg wurde für die Erzeugung von NO durch Endothelzellen großer Gefäße als Reaktion auf blutdrucksenkende Mittel, wie Bradykinin und Acetylcholin, identifiziert (Palmer et al. 1988, BBRC 153: 1251–1256; Kelm et al. 1988).
Wie in 6 angegeben verursachte Endotoxin eine dosisabhängige Stimulation der Nitriterzeugung mit MBEC in Gegenwart von 100 Einheiten IFN/ml.
BEISPIEL 2
Mit der Verabreichung von TNF verbundene Hypotonie beim Hund kann durch anschließende Verabreichung von NMMA abgeblockt werden. NMMA weist in der Form der freien Base folgende Strukturformel auf:
Darüber hinaus kann diese Hemmung von Hypotonie durch die Verabreichung eines Überschusses von Arginin umgekehrt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß NO der Vermittler von durch TNF induzierter Hypotonie ist. Darüber hinaus kann die Aktivierung der NO-Synthese an der Pathogenese von septischem Schock beteiligt sein.
Reagenzien
Rekombinanter humaner TNF der spezifischen Aktivität 2 × 10⁷ Einheiten/mg stammte von der Niposn Chemical Corporation, Tokyo, Japan. TNF wurde in einer Dosis von 10 mcg/kg in einem Volumen von 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 2 mg/ml Hundealbumin enthielt, verabreicht. NMMA wurde durch Adaption des Verfahrens von Corbin und Reporter (Anal. Biochem. 57: 310–312, 1974) synthetisiert und zur Verabreichung mit einer Dosis von 15 mg/kg in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst. Arginin wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. erhalten.
Tiere
Es wurden vier konditionierte Promenadenmischungen, 2 männliche und 2 weibliche Hunde, die 28 bis 30 kg wogen, untersucht. Die Tiere wurden gemäß der Empfehlung der American Association for Accreditation of Laboratory Animals [DHEW(DHHS)-Veröffentlichung Nr. (NIH) 78–23, geändert 1978] versorgt. Am Tag des Experiments erhielten die Hunde über Nacht keine Nahrung. Sie wurden mit Phenobarbital (10 mg/kg) betäubt. Sie wurden dann oral mit einer #10-fr.-Endotrachealröhre intubiert und mit einem Harvard-Pumpenventilator mit einer Freqeunz von 12 Atemstößen pro Minute und einem Hubvolumen von 15 ml/kg beatmet. Eine Arterienleitung wurde am Tag des Experiments perkutan an die Oberschenkelarterie gelegt.
Physiologische Messungen
Der mittlere (elektronische) und die phasischen systemischen arteriellen Drucke (SAP) wurden kontinuierlich auf einem Aufzeichnungssystem von Hewlett-Packard (Modell 7758B) unter Verwendung von Druckmanometern (Hewlett-Packard Modell 1290A), die mit der Arterienleitung verbunden waren, aufgezeichnet. Die Herzfrequenz (HR) wurde aus einer EKG-Aufzeichnung bestimmt und kontinuierlich auf dem Aufzeichnungssystem von Hewlett-Packard aufgezeichnet. Die Oxyhämoglobinsättigung (SaO₂) wurde unter Verwendung eines Pulsoximeters (BIOX 111, Boulder, CO) erhalten. Reihenaufzeichnungen von SAP, HR und SaO₂ über die Zeit wurden unter Verwendung eines Analog/Digitalwandlers von Lab Master (16 Kanäle, 12 Bit, 30 kHz; Scientific Solutions, Inc.), der mit 55 Hz Proben nahm und die Mittelwerte über 6 s auf einer Magnetplatte speicherte, erhalten.
Es zeigte sich, daß NMMA den mit der Verabreichung von TNF verbundenen niedrigen Blutdruck umkehrte. Die Blutdruckerhöhungswirkung von NMMA erfolgte rasch (innerhalb von 2 min) und konnte durch Verabreichung eines Überschusses von L-Arginin antagonistisch beeinflußt werden. Die antagonistische Wirkung auf die Blutdruckerhöhungswirkung von NMMA war für die L-Form von Arginin stereospezifisch.
Die in 7 angegebenen Daten sind für mehrere Tierexperimente repräsentativ. Es wurden einige Schwankungen im Grad der Hypotonie sowie dem Zeitpunkt des Einsetzens der Hypotonie nach der Verabreichung von TNF festgestellt. 10 μg TNF/kg Körpergewicht wurden zum Zeitpunkt von 10 Minuten; 4,4 mg NMMA/kg bei etwa 52 min und 3 g L-Arginin bei etwa 63 min intravenös verabreicht. Das Einsetzen der Hypotonie wurde zwischen 30 bis 60 min nach TNF festgestellt. Bei Hund Nr. 3 fiel der SAP rasch von 106 auf 36. Die Verabreichung von NMMA führte zur raschen Zunahme des Blutdrucks auf einen SAP von 116. Das Ansprechen der übrigen beiden Hunde auf TNF war ähnlich dem in 7 beschriebenen.
Die Verabreichung von NMMA allein an unbehandelte Hunde (n = 3) wurde ebenfalls getestet. Innerhalb von 1,7 min nach der Infusion von NMMA nahm der Blutdruck ursprünglich zu. Danach folgte eine kompensatorische Abnahme der HR mit einer Rückkehr des BP zur Grundlinie. Die durch NMMA induzierte Bradykardie dauerte 31 min. Diese Reaktion wurde bei Tieren, die zuvor mit TNF behandelt worden waren, nicht beobachtet. In einem anschließenden Experiment (7a) war das blutdrucksenkende Ansprechen auf TNF besonders stark, mit einer Abnahme des BP von 125 mm auf 36 mmHg. Die Verabreichung von NMMA führte zu einer Zunahme des Blutdrucks auf 115 mm, eine Zunahme von 79 mm. Diese Zunahme des Blutdrucks wurde durch die Verabreichung von L-Arginin vollständig umgekehrt, die ein erneutes Abfallen des Blutdrucks auf 37 mmHg verursachte. Kontrollexperimente, in denen NMMA an unbehandelte Hunde verabreicht wurde, sind in 7b angegeben. Es wurde beobachtet, daß der Blutdruck innerhalb von 2 min um 12 mmHg anstieg. Dies war mit einer Abnahme der HR von 101 auf 92 Schläge/Minute verbunden. Die anschließende Verabreichung von L-Arginin kehrte diese beim systemischen arteriellen Druck beobachteten kleinen Veränderungen um. In einer zweiten Kontrolluntersuchung wurde Nitroglycerin als Infusion mit einer Rate von 28 μg/kg/min IV gegeben, um den Blutdruck auf die gleiche wie bei Tumornekrosefaktor beobachtete Höhe zu senken (7c). Nach der Verabreichung von NMMA in Hunden mit einer Infusion von Nitroglycerin nahm der Blutdruck nur 14 mm zu. Die anschließende Verabreichung von L-Arginin kehrte diesen mäßigen Effekt um.
Die Verabreichung von L-Arginin an mit NMMA behandelte Hunde führte zur raschen Abnahme des Blutdrucks. Der Blutdruck wurde durch die Verabreichung von L-Arginin an zuvor unbehandelte Hunde nicht beeinflußt.
Die die Dosis begrenzende Toxizität von an Patienten verabreichtem TNF besteht in Hypotonie. Diese Experimente legen nahe, daß NO, das auch als EDRF bekannt ist, der Vermittler der Hypotonie ist. Darüber hinaus können diese hämodynamischen Veränderungen durch ein N^G-substituiertes Argininderivat antagonistisch beeinflußt und anschließend durch die Zugabe von Arginin im Überschuß wiederhergestellt werden, was die Rolle des Arginins als Substrat der NO-Synthese stützt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß NMMA den Ruheblutdruck im Meerschweinchen erhö hen kann. Daher kann NO eine Rolle bei der Homöostase des normalen arteriellen Drucks spielen. Dies scheint auch für den Hund zuzutreffen.
Das Blutdruckerhöhungsansprechen auf NMMA ist bei Hunden mit durch TNF induzierter Hypotonie viel dramatischer als in Hunden mit normalem Blutdruck. Dies legt. nahe, daß durch TNF induzierte Hypotonie auf einer Erzeugung eines vasoaktiven Faktors (d.h. NO), der regulierend auf den normalen Ruheblutdruck wirkt, im Überschuß beruht.
TNF ist auch an der Entwicklung der bei septischem Schock beobachteten Toxizität beteiligt. Septischer Schock wird durch Endotoxin, eine Komponente der Zellwand gramnegativer Organismen verursacht. Die Verabreichung von Anti-TNF-Antikörpern nach Exposition mit TNF schützt nicht gegen Hypotonie. Dies legt nahe, daß TNF einen anderen Vermittler von Hypotonie induzieren kann. Die hier angegebenen Ergebnisse zeigen, daß NO der wirkliche Vermittler dieser Reaktion ist.
BEISPIEL 3
L-N^G-substituierte Argininanaloga blockieren die Synthese von NO aus Arginin. NMMA blockiert die endothelabhängige Relaxation als Reaktion auf verschiedene Dilatatoren, die über die Freisetzung von EDRF/NO wirken. 8 zeigt Konzentration/Ansprechkurven für die Relaxation von Pulmonalarterienringen von Meerschweinchen durch endothelabhängige und endothelunabhängige Vasodilatatoren und die Wirkung von NMMA. Gefäßringe wurden mit 1 μM Norepinephrin zuvor zusammengezogen und die Relaxation wurde durch kumulative Zugabe von Acetylcholin (ACh, Panel A), Leukotrien D4 (LTD4, Panel B), Histamin (HIST, Panel C) oder Natriumnitroprussid (SNP, Panel D), allein (Kontrolle) und in Gegenwart von NMA aus gelöst. Die Punkte sind Mittelwerte ± SEM (n = 4-8).
NMMA blockiert die Wirkung von ACh, LTD4 und HIST, Mitteln, die durch Auslösen der Freisetzung von EDRF gefäßerweiternd wirken, während NMMA die Vasodilatation durch SNP (das direkt auf die glatte Gefäßmuskulatur wirkt) nicht hemmt. NMMA hat daher eine spezifische Wirkung auf EDRF-vermittelte Vasodilatation. Es ist wichtig festzuhalten, daß L-Arginin die Relaxation in Gegenwart von NMMA wiederherstellte und daß das D-Stereoisomer kein Inhibitor der Synthese von EDRF/NO war.
Bei dieser Präparation der Meerschweinchenpulmonalarterie dienten Argininanaloga mit anderen N^G-Substitutionen als Methyl ebenfalls als Inhibitoren der Synthese von EDRF/NO. Die getesteten umfassen: NO₂-, NH₂-, CH₃ und Dimethyl- (Dosis/Ansprechkurven für einige von diesen sind in 9 angegeben). 9 zeigt Konzentration/Ansprechkurven für die Hemmung der ACh-induzierten Relaxation von Pulmonalarterienringen von Meerschweinchen durch L-N^G-substituierte Argininanaloga. Die Ringe wurden zuvor mit 1 μM NE kontrahiert, dann durch kumulative Zugabe von ACh, ohne Zusatz (Kontrolle) und dann in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Argininanaloga N^G-Aminoarginin, N^G-Nitroarginin und NMMA relaxiert. Die prozentuale Hemmung der Relaxation wird aus der maximalen ACh-induzierten Relaxation, die in Gegenwart des Argininanalogons beobachtet wurde, relativ zur Relaxation bei dessen Fehlen berechnet. Die Punkte stellen Mittelwerte ± SEM (n = 4-6) dar. Von den bis dahin getesteten Verbindungen schien das NH₂-substituierte Derivat die größte Aktivität aufzuweisen. Eine weitere N^G-Substitution, die bezüglich Hemmung der induzierten Nitritfreisetzung getestet wurde, wies an einem der Guanidinostickstoffe von Arginin zwei Methylgruppen auf. Die Konzentration/Ansprechbeziehungen bezüglich der Hemmung der A23187-stimulierten Nitritfreisetzung durch Rinderaortaendothelzellen (BAEC) sind in 9a für das N,N-disubstituierte Derivat im Vergleich zu mehreren monosubstituierten Derivaten angegeben. Die Nitriterzeugung wurde als Anzeige der Stickoxidsynthese gemessen, da sich Stickoxid spontan zur Nitrit zersetzt. Die Nitriterzeugung durch BAEC in einem 2-h-Zeitraum wurde in einem von L-Arginin freien Medium allein oder in Gegenwart der angegebenen Konzentration der Argininanaloga getestet. Die aufgetragenen Punkte stellen Mittelwerte ± S.E. der prozentualen Hemmung der Nitriterzeugung, die in drei einzelnen BAEC-Kulturvertiefungen beobachtet wurde, dar. Der Schlüssel an 9a gibt die an den Guanidinostickstoffen von L-Arginin substituierten Gruppen an. Me, Me- gibt das getestete disubstituierte Analogon an; es ist festzuhalten, daß diese Verbindung nahezu gleich stark zu L-N^G-Methylarginin ist.
9b vergleicht Konzentration/Ansprechbeziehungen für den gleichen Satz von mono- und disubstituierten Argininanaloga wie 9a sowie ein weiteres Dimethylanalogon mit den beiden Methylgruppen auf unterschiedlichen Guanidinostickstoffen. Der Test betrifft die Hemmung von ACh-induzierter Vasorelaxation in isoliertem Kaninchenaortaringen. Die aufgetragenen Punkte stellen Mittelwerte ± S.E. des maximalen Ansprechens auf ACh, das in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen der Analoga beobachtet wurde, dar (n = 4). Es ist festzuhalten, daß das Analogon mit 2 Methylgruppen auf einem Guanidinstickstoff (Me, Me-) ein aktiver Inhibitor ist, während die Verbindung mit einer Methylgruppe auf jedem der Guanidinostickstoffe (Me, Me'-) kein guter Inhibitor ist.
Es zeigte sich, daß L-NMA als bezüglich Arginin reversibler Inhibitor von EDRF/NO in vaskulären Präparationen aus einer Reihe von Arten, umfassend Meerschweinchen, Ratte, Kanin chen, Hund und in äußerst bemerkenswerter Weise Mensch, wirkt (vgl. 10 und 11). 10 zeigt die Hemmung der ACh-induzierten Relaxation durch NMMA in Arterien unterschiedlicher Gefäßschichten und -arten und die stereospezifische Umkehrung durch L-Arginin. Meerschweinchenpulmonalarterie (GP PA), Ratten- und Kaninchenaorta (Ao) und Hundekoronar- (CA) und -oberschenkelarterie (FA) wurden mit NE (1 μM) zuvor kontrahiert und mit einer einzigen Konzentration von ACh relaxiert. Konzentration von ACh: GP PA 1 μM, Ratten-Ao 0,3 μM, Kaninchen-Ao 0,3, Hunde-CA 0,3 μM und Hunde-PA 0,1 μM. Die Konzentration von NMMA betrug 100 μM mit Ausnahme für die Ratten-Ao, die 5 μM betrug. Die Konzentrationen von L-Citrullin (L-cit), D-Arginin (D-arg) und L-Arginin (L-arg) betrugen alle 0,5 mM. Die Balken sind Mittelwerte ± SEM (n = 4-6).
11 enthält repräsentative physiographische Aufzeichnungen, die die ACh-induzierte Relaxation von mit NE zuvor kontrahierten Ringen, die aus Kaninchenaorta (oberes Panel) und humaner innerer Brustarterie (unteres Panel) präpariert wurden, angeben. Es zeigt sich, daß NMMA in beiden Geweben eine ACh-induzierte Vasarelaxation schwächt; die Zugabe von L-Arginin im Überschuß stellt die Relaxation wieder her.
L-NMA hemmt ebenfalls die Freisetzung von EDRF/NO aus in Kultur gezüchteten Rinderendothelzellen (12) und aus dem isolierten Meerschweinchenherz (13), wenn diese mit einem endothelabhängigen gefäßerweiternden Mittel beansprucht wurden.
12 erläutert die Hemmung der durch Calciumionophor stimulierten Nitritfreisetzung aus in Zellkultur gewachsenen Rinderaortaendothelzellen durch NMMA. Die Zellen wurden durch Zugabe von 3 μg/ml Ionophor (A23187) zum Kulturmedium, allein und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von NMMA, zur Freisetzung von NO stimuliert. Die kumulative Freisetzung von Nitrit (das stabile Oxidationsprodukt von NO) während einer 4stündigen Inkubation bei 37° ist als Funktion der NMMA-Konzentration angegeben. Die Punkte sind Mittelwerte ± SEM (n = 3).
13 zeigt die Hemmung der Histamin-induzierten Nitritfreisetzung aus dem isolierten Meerschweinchenherzen mit Koronarperfusion durch NMMA und die Wiederherstellung durch L-Arginin. Die Herzen wurden bei konstantem Druck (40 cm H₂O) mit Krebs-Henseleit-Puffer, der das Thromboxan-A2-Analogon (U-46619, 86 nM) enthielt, zur Induktion koronarer Vasokonstriktion perfundiert. Histamin wurde als schnelle Bolusinjektion in die Aorta verabreicht und es wurde die bloße Nitritfreisetzung während der anschließenden 2,5 min bestimmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM (n = 4 – 6) dar. Nicht angegeben ist hierbei, daß Histamin eine dosisabhängige Zunahme des koronaren Durchflusses (Vasodilatation) auslöst, die durch L-NMA abgeschwächt wird, jedoch durch Zugabe von überschüssigem L-Arginin wiederhergestellt wird. Offensichtlich vermittelt daher die NO-Synthese aus L-Arginin zumindest teilweise eine Histamin-induzierte Vasodilatation der Koronararterie im Meerschweinchenherzen.
Die Verabreichung von L-NMA (1–10 mg/kg, intravenös), jedoch nicht von D-NMA, an ein narkotisiertes Meerschweinchen löst einen verzögerten Anstieg des diastolischen BP aufgrund der Hemmung der Ruhekonzentrationen der EDRF/NO-Synthese aus (14 und 15). Eine ähnliche, jedoch stärkere Wirkung wurde mit L-N^G-Aminoarginin beobachtet (16 und 17). 15 und 16 geben den zeitlichen Verlauf der durch NMMA (NMA; 15) und L-N^G-Aminoarginin (NAA; 16) ausgelösten Blutdruckerhöhungswirkung im mit Phenobarbital betäubten Meerschweinchen wieder. Die Punkte sind die mittleren Veränderungen des diastolischen arteriellen Drucks (± SEM; n = 4-5). Der systolische und diastolische Kontroll-BP war 75 ±3 bzw. 51 ±3 mmHg. In ähnlicher Weise wurde L-N^G-Ethylarginin (L-NEA) in vivo getestet und es zeigte sich, daß es ebenfalls eine verzögerte Blutdruckerhöhungswirkung im Meerschweinchen verursacht.
Es wurde beobachtet, daß eine Mäusekrebszellinie, EMT6, bei Aktivierung durch bakterielles ET, IFN und verschiedene Cytokine große Mengen von Nitrit in das Kulturmedium freisetzt. Es wurden daher Cytosolpräparationen von EMT6 (d.h. zellfreie Lösungen) präpariert und eine Enzymaktivität charakterisiert, die NO und Citrullin aus Arginin bildet. Diese Reaktion erfordert NADPH (18 und 19) und andere Cofaktoren.
18 zeigt den zeitlichen Verlauf der Nitriterzeugung bei 37°C durch Cytosolpräparationen von EMT6-Zellen, die entweder unbehandelt (Kontrolle) oder durch IFN und Endotoxin stimuliert waren. Die Inkubationsgemische besaßen ein Gesamtvolumen von 100 μl und enthielten: 40 μl Cytosol (100000 × g-Überstand), 2 mM L-Arginin, 2 mM NADPH, 20 mM TRIS (pH-Wert 8,0) und einen "Cocktail" von Proteaseinhibitoren. Eine Nitritsynthese wurde bei aus stimulierten Zellen präpariertem Cytosol, jedoch nicht bei Kontrollzellen beobachtet.
Aus kinetischen Untersuchungen wurde eine scheinbare Michaelis-Menten-Konstante zur Nutzung von L-Arginin durch das Enzym abgeleitet. 20 ist ein Lineweaver-Burke-Diagramm für die Synthese von Nitrit aus L-Arginin durch Cytosol aus stimulierten EMT6-Zellen. Die Rate der Nitritbildung wurde über einen Bereich von L-Arginin (ARG)-Konzentrationen (0,03–2,0 mM) unter zu den für 18 beschriebenen ähnlichen Bedingungen mit Ausnahme davon, daß die Inkubate 50 μl Cytosol in einem Gesamtvolumen von 80 μl enthielten, bewertet. Leere und volle Kreise stellen die mit jeder der beiden Cytosolpräparationen erhaltenen Ergebnisse dar. Aus diesen Ergebnissen kann ein scheinbarer Km-Wert von 61,6 μM für die Verwendung von ARG durch den NO bildenden enzymatischen Weg extrapoliert werden. Die N^G-substituierten Argininanaloga wurden bezüglich der genauen Quantifizierung ihrer Fähigkeit zur Hemmung der argininabhängigen Bildung von NO durch das EMT6-Enzymsystem abgetastet. Daher kann aus Daten wie den in 21 dargestellten berechnet werden, daß NMMA ein kompetitiver Inhibitor der Nutzung von Arginin mit einem offensichtlichen Ki-Wert von 5–10 μM ist. Die ethylsubstituierte Verbindung ist bei diesem Test etwa zehnfach weniger aktiv (22).
Aus diesen Untersuchungen wurde gefolgert, daß die Synthese von NO aus L-Arginin in einer großen Vielzahl von in-vitro-Präparationen aus einer Reihe von Arten aufzeigbar ist. NO ist ein wichtiger Vermittler der Vasodilatation in vivo und spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der vaskulären Homöostase. Schließlich können N^G-substituierte Argininanaloga als spezifische Blocker des enzymatischen Wegs zur Erzeugung von NO verwendet werden. Diese Klasse von Argininantagonisten kann daher eine spezielle Milderung von Hypotonie, die aus Zuständen, die die überschüssige Erzeugung von NO verursachen, wie die in den Beispielen 1 und 2 angegebenen, entsteht, bieten.
BEISPIEL 4
Septischer Schock, eine lebensbedrohliche Komplikation bakterieller Infektionen, betrifft in den Vereinigten Staaten jährlich 150000 bis 300000 Patienten (J.E. Parillo, 1989, Septic Shock in Humans: Clinical Evaluation, Pathogenesis, and Therapeutic Approach. In Textbook of Critical Care, 2. Auflage, Shoemaker et al., Herausgeber, Saunders Publishing Co., Philadelphia, PA, S. 1006). Der Zusammenbruch des Herz/Kreislaufsystems und die multiplen Stoffwechselentgleisungen, die mit septischem Schock verbunden sind, beruhen hauptsächlich auf bakteriellem ET, das bei Verabreichung an Tiere erwiesenermaßen einen einem septischen Schock ähnlichen Zustand auslöst (Natanson et al., 1989, Endotoxin and Tumor Necrosis Factor Challenges in Dogs Simulate the Cardiovascular Profile of Human Septic Shock, J. Exp. Med. 169: 823). Es ist bekannt, daß ET die Synthese und Freisetzung mehrerer Cytokine und biologischer Mediatoren mit blutdrucksenkender Aktivität stimuliert; von den freigesetzten Faktoren wurden TNF, PAF, Prostacyclin und das Complement-abgeleitete C5a-Anaphylatoxin als wichtige Faktoren, die zum Herz/Kreislaufzusammenbruch bei septischem Schock beitragen, vorgeschlagen (Hesse et al., 1988, Cytokine Appearance in Human Endotoxemia and Primate Bacteremia, Surg. Gynecol. Obstet. 166: 147; Etienne et al., 1986, The Relative Role of PAF-acether and Icosanoids in Septic Shock, Pharmacol. Res. Commun. 18: 71; Halushka et al., 1985, Elevated plasma 6-keto-prostaglandin F1 alpha in Patients in Septic Shock, Crit. Care Med. 13: 451; Smedegard et al., 1989, Endotoxin-induced Shock in the Rat: A Role for CSa, Am. J. Pathol. 135: 489). Obwohl gezeigt wurde, daß Tiere mit einer Vorbehandlung mit anti-TNF-Antikörpern (Beutler et al., Passive Immunization against cachectin/TNF protects mice from lethal effects of ET, Science, 229: 869), PAF-Rezeptorantagonisten (Casals-Stenzel, 1987, Protective Effect of WEB 2086, a Novel Antagonist of Platelet Activating Factor in Endotoxin Shock, European J. Pharmacology 135: 117) und Prostacyclin-Syntheseinhibitoren (Wise et al., 1985, Ibuprofen, Methylprednisolone, and Gentamycin as Cojoint Therapy in Septic Shock, Circ. Shock 17: 59) signifikant gegen septischen Schock geschützt sind, ist die relative Bedeutung dieser Mediatoren in der Pathologie von septischem Schock derzeit ungewiß. Es gibt auch Belege, daß einige dieser Mediatoren indirekt durch Freisetzung sekundärer Mediatoren wirken können. Die Erkenntnis, daß Anti-TNF-Antikörper wenig oder keinen Schutzeffekt bei Verabreichung nach der Exposition mit ET zeigen (Beutler et al., 1985, Passive Immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effects of endotoxin, Science, 229: 869), legt nahe, daß TNF die Erzeugung eines weiteren Faktors, der das tatsächliche blutdrucksenkende Mittel darstellt, stimuliert; sobald dieser initiiert ist, können die Synthese und Freisetzung dieses Faktors offensichtlich selbst bei Abwesenheit nachweisbarer TNF-Konzentrationen fortgesetzt werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß sich Nitrit bei der Exposition kultivierter Mäuseendothelzellen mit Immunmodulatoren und Endotoxin ansammelt (Kilbourn et al., 1990 Endothelial cell production of nitrogen oxides in response to Interferon gamma in combination with tumor necrosis factor, interleukin-1, or endotoxin. J. Natl. Cancer Inst. 82: 722). Daß dieses Nitrit aus dem Syntheseweg von Stickoxid (NO) entsteht, wird durch die Beobachtung belegt, daß seine Ansammlung L-Arginin-abhängig ist und durch N^G-Methyl-L-arginin (L-NMA), einen selektiven Inhibitor von NO-Synthase, blockiert wird (Hibbs et al., 1988, Macrophage Cytotoxicity: Role for L-Arginine Deiminase and imino Nitrogen Oxidation to Nitrite. Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 87). Da NO ein starker aus dem Endothel stammender Relaxationsfaktor (EDRF) ist, legten diese Untersuchungen nahe, daß eine Überproduktion von NO für die mit der Verabreichung von Endotoxin und Cytokin verbundenen kardiovaskulären Veränderungen verantwortlich sein könnte. In Übereinstimmung mit dieser Ansicht fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung, daß die durch TNF in Hunden ausgelöste blutdrucksenkende Reaktion durch Verabreichung von L-NMA vollständig umgekehrt werden kann (Kilbourn et al., 1990, N^G-Methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: implications for the involvement of nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 87: 3629). In der vorliegenden Untersuchung wurde die Wirkung von L-NMA auf durch Endotoxin induzierten Schock in Hunden geprüft. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß NO ein wichtiger Vermittler von durch Endotoxin induzierter Hypotonie ist und daß Inhibitoren der Synthese von NO bei der Behandlung von septischem Schock von Wert sein sollten.
Reagenzien: N^G-Methyl-L-arginin wurde in bekannter Weise synthetisiert (Corbin et al., 1974, N^G-Methylated Arginines: Convenient Preparation of N^G-Methylarginines. Anal. Biochem. 57, 310–312) und durch Kristallisation als Monoflavianatsalz gereinigt. Eine Lösung der freien Aminosäure wurde durch Rühren einer Suspension des Salzes mit Dowex-1 (OH) erhalten; nach der Neutralisation mit HCl wurde die Konzentration von L-NMA durch Aminosäureanalyse unter Verwendung des kristallinen Monoflavianatsalzes als Standard bestimmt. Endotoxin (Escherichia coli; B0128: B12) und alle sonstigen Reagenzien wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri gekauft. Nitroglycerin wurde von DuPont Pharmaceuticals, Wilmington, D.E. gekauft.
Tiere: Die Untersuchungen wurden an 12 konditionierten Promenadenmischungen (9 männliche und 3 weibliche Hunde), die 22–32 kg (Mittelwert 25,3 kg) wogen, durchgeführt. Die Versorgung der Tiere erfolgte gemäß den Empfehlungen der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care und erfüllte alle durch den Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1978) Dept. of Health, Education and Welfare, Washington, D.C. (Veröffentlichung Nr. 78-23)) vorgeschriebenen Standards. Die Tierprotokolle wurden durch The University of Texas Animal Welfare Committee gebilligt.
Die Tiere erhielten über Nacht vor dem Tag des Experiments kein Futter. Sie wurden mit Natriumpentobarbital (25 mg/kg i.v.) betäubt. Die Hunde wurden dann endotracheal intubiert und mit einem kolbengetriebenen Beatmungsgerät (Harvard instruments) unter Verwendung von Raumluft mit einem Hubvolumen von 20 ml/kg und einer Frequenz von 10 bis 12 Atemstößen pro Minute, das zum Erreichen eines normalen arteriellen pH-Werts und pCO₂-Werts eingestellt war (Instrumentation Laboratories 1L1302 pH/Blutgasanalysator), beatmet. Katheter wurden perkutan an die Oberschenkel- und Pulmonalarterien angelegt; bei letzterer wurde ein durchflussgesteuerter Thermodilatationskatheter verwendet (Abbott Critical Care Systems).
Physiologische Messungen: Mittlerer SAP und Herzfrequenz wurden kontinuierlich überwacht (Parametron 7048 Monitoring System, Roche) und auf einer Magnetplatte unter Verwendung eines Analog/Digital-Wandlers (Scientific Solutions, Inc.) gespeichert. Die Herzleistung (CO) wurde als Mittelwert von sechs Messungen durch Thermodilution bestimmt. Der systemische Gefäßwiderstand wurde als (SAP x80)/CO berechnet und als dyn·s/cm2 ausgedrückt.
Protokoll: Nach der Stabilisierung des Blutdrucks und der Herzfrequenz wurde Endotoxin (40 μg/kg in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4) i.v. während 2 min als Infusion gegeben. Diese Endotoxindosis induziert typischerweise einen schweren und häufig letalen Herz/Kreislaufzusammenbruch beim Hund. Der Blutdruck wurde überwacht und wenn entweder der SAP unter 60 mmHg fiel oder 10 min lang ein stabiler Tiefpunkt im systemischen arteriellen Druck (SAP) beibehalten wurde, wurde L-NMA verabreicht (20 mg/kg in 5 ml PBS i.v. während 1 min). In den meisten Experimenten wurde L-Arginin (400 mg/kg in 20 ml PBS) 10 min später durch i.v. Infusion während 2 min verab reicht. In Kontrollexperimenten erhielten Hunde ohne eine vorherige Exposition mit Endotoxin L-NMA allein. Zur Simulation der Hypotonie, die in Hunden, die Endotoxin erhielten, beobachtet wurde, erhielt eine Gruppe von Hunden eine kontinuierliche i.v. Infusion von Nitroglycerin (2 mg/ml) mit einer Geschwindigkeit, die zur Beibehaltung des SAP bei 60–70 mmHg eingestellt war. Die mit Nitroglycerin behandelten Hunde erhielten dann L-NMA (20 mg/kg) und 20 min später wurde L-Arginin verabreicht (400 mg/ml).
Statistik: Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung des Student-Tests und entweder einer einendigen oder zweiendigen Analyse in zu Vergleichen geeigneter Weise bewertet.
Eine repräsentative Aufzeichnung des Blutdrucks, die die Wirkung von Endotoxin auf den systemischen arteriellen Blutdruck beim narkotisierten Hund angibt, ist in 23 angegeben. Die kardiovaskulären Parameter für diesen und drei weitere Hunde sind in Tabelle 1 zusammengefaßt (Untersuchung 1). Tabelle 1 Hämodynamische Effekte von L-NMA während Hypotonie
Zur Untersuchung 1 wurden Hunde betäubt, mit Instrumenten versehen und die kardiovaskulären Messungen der Grundlinie aufgezeichnet (Vorbehandlung). Dann wurde Endotoxin (40 μg/kg) verabreicht und es wurden die kardiovaskulären Parameter überwacht. Wenn der Blutdruck entweder einen stabilen Tiefpunkt erreichte oder unter 60 mmHg abfiel (nach Endotoxin), wurde L-NMA (20 mg/kg) verabreicht und es wurden erneut die kardiovaskulären Parameter bestimmt (nach L-NMA). Nach weiteren 10 min wurde L-Arginin (400 mg/kg) verabreicht und es wurden die kardiovaskulären Messungen 2 min später bestimmt (nach L-Arginin). Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± S.E. (n = 4) angegeben. Die Untersuchung 2 wurde ähnlich ausgeführt, wobei jedoch Endotoxin nicht verabreicht wurde. Statt dessen erhielten die Hunde ein kontinuierliche Infusion von Nitroglycerin (2 mg/ml), das zur Aufrechterhaltung eines SAP bei 65 mmHg titriert wurde (n = 3). Die Sternchen zeigen eine statistisch signifikante Abweichung (*p < 0,005, **p < 0,001) vom unmittelbar vorhergehenden Zustand an.
ET (40 μg/kg) erzeugte eine deutliche Abnahme des Blutdrucks innerhalb von 120 min (Δ SAP = –69 ±16 mmHg, p < 0,05). Ohne Behandlung verursacht diese Endotoxindosis typischerweise einen letalen Herz/Kreislaufzusammenbruch beim Hund. L-NMA kehrte die Hypotonie innerhalb von 1,5 min im großen Maße um, wobei SAP um 47,8 ±6,8 mmHg (p < 0,01) und SVR um 2060 ±338 dyn·s/cm^s (p < 0,01) anstiegen; HR und CO waren unverändert (Tabelle 1). L-Arginin kehrte die Wirkung von L-NMA um und stellte die Endotoxin-induzierte Hypotonie wieder her, wobei sowohl SAP (p < 0,01) und SVR (p < 0,01) auf Werte ähnlich den vor der Verabreichung von L-NMA beobachteten abnahmen. Wie in 23 erläutert, nahm nach L-Arginin der Blutdruck auf geringere Werte als die vor der Verabreichung von L-NMA beobachteten ab, was belegt, daß das Vermögen zur Überproduktion von NO während des Zeitraums, als die Produktion von NO durch L-NMA blockiert war (p = NS), weiterlief. 23 zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderungen des mittleren systemischen arteriellen Drucks (SAP) in einem mit Pentobarbital betäubten Hund anschließend an die i.v. Verabreichung von Endotoxin (ET), N^G-Methyl-L-Arginin (L-NMA) und L-Arginin (L-Arg). Die Daten aus diesem und weiteren Experimenten sind in Tabelle 1 (oben) zusammengefaßt.
Im Hinblick auf die mögliche klinische Verwendung von Inhibitoren der NO-Synthese bei Endotoxin- und Cytokin-induziertem Schock ist es wichtig, sicherzustellen, daß L-NMA eine langzeitige Umkehrung von Hypotonie bewirken kann. Es zeigte sich, daß eine einzige i.v. Dosis von L-NMA (20 mg/kg) 30–60 min lang normalen Blutdruck wiederherstellte. Wenn bei Beginn einer erneuten Abnahme des Blutdrucks eine weitere Dosis von L-NMA (20 mg/kg) gegeben wurde, konnte mindestens 2 h lang im mit Endotoxin behandelten Hund normaler Blutdruck aufrechterhalten werden. Die Ergebnisse einer typischen Untersuchung sind in 24 gezeigt. Die Aufrechterhaltung von normalem Blutdruck blieb selbst nach 2 h von L-NMA abhängig, da L-Arginin zu diesem Zeitpunkt immer noch endotoxische Hypotonie wiederherstellen konnte (d.h. eine Abnahme des Blutdrucks <45 mmHg). 24 zeigt den zeitlichen Verlauf von Veränderungen des mittleren systemischen arteriellen Drucks (SAP) in einem mit Pentobarbital betäubten Hund anschließend an die i.v. Verabreichung von Endotoxin. Nach 53 min nahm der Blutdruck auf 47 mmHg ab (Δ SAP = –61 mmHg). Die Verabreichung von L-NMA (20 mg/kg) führte zu einer raschen Umkehrung der starken Hypotonie (Zunahme des SAP um 73 mmHg innerhalb von 10 min). Der Blutdruck wurde 48 min lang durch die erste Dosis von L-NMA beibehalten und begann dann abzusinken. Eine zweite Dosis L-NMA stellte den Blutdruck auf einer der ersten Dosis äquivalenten Höhe wieder her und behielt dann den SAP von mehr als 100 mmHg 2 h lang bei. Zur Demonstration, daß das Potential für Hypotonie noch vorhanden war, wurde die Wirkung von L-NMA durch einen Überschuß von L-Arginin (400 mg/ml) umgekehrt. Dies führte zu einer Abnahme des Blutdrucks auf 43 mmHg (Δ SAP = –77 mmHg).
Wie in Tabelle 2 angegeben, hatte L-NMA alleine bei nicht mit Endotoxin behandelten Kontrollhunden eine signifikante, jedoch mäßige blutdruckerhöhende Wirkung; L-NMA erhöhte SAP um nur 24,8 ±2,7 mmHg (p, 0,01) mit einer damit verbundenen Zunahme der SVR (p, 0,01) und jeweils einer Abnahme der Herzfrequenz (HR) und der Herzleistung (CO), die eine statistische Signifikanz nicht erreichten. L-Arginin (400 mg/kg) kehrte die Blutdruckerhöhungswirkung von L-NMA vollständig um. Tabelle 2 Hämodynamische Effekte von L-NMA bei Kontrollhunden
Die Experimente wurden wie in 23 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch Endotoxin nicht verabreicht wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± S.E. (n = 4) angegeben. Sternchen geben signifikante Abweichungen von der Grundlinie an (*p, 0,005, **p, 0,001). L-NMA = N^G-Monomethyl-L-arginin.
In einer zusätzlichen Reihe von Experimenten wurde der Blutdruck durch kontinuierliche i.v. Infusion mit Nitroglycerin, einem blutdrucksenkenden Mittel, das NO durch einen von L-Arginin und NO-Synthetase unabhängigen Mechanismus bildet, auf 65 mmHg verringert. Die Verabreichung von L-NMA (20 mg/kg) an diese Hunde führte nur zu einer Veränderung von 17,1 ±5,0 mmHg ohne signifikante Änderung von HR, CO oder SVR (Tabelle 1, Untersuchung 2).
Die Pathogenese des Herz/Kreislaufzusammenbruchs, der während septischem Schock erfolgt, ist schlecht verstanden. Die derzeitige Behandlung umfaßt die i.v. Verabreichung von Flüssigkeit und die Verwendung von blutdruckerhöhenden Arzneimitteln, um den peripheren Gefäßwiderstand und die Herzleistung zu erhöhen. In jüngster Zeit wurden Endotoxin bindende Mittel einschließlich Polymyxin B (Hanasawa et al., 1989, New Approach to Endotoxic and Septic Shock by Means of Polymyxin B Immobilized Fiber, Surg. Gynecol. Obstet. 168: 232) und TNF neutralisierende Antikörper (Tracey et al., 1987, Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteremia, Nature 330: 662–664) in einem Versuch zur Modifikation der Folgen von septischem Schock verwendet. Obwohl die letzteren Versuche prophylaktischen Wert haben können, gibt es keine Belege, daß septischer Schock ohne weiteres oder rasch durch die Entfernung von Endotoxin oder TNF umgekehrt werden kann. Die Therapie von bereits in septischem Schock befindlichen Patienten erfordert eine Intervention in den sekundären und tertiären Stufen in der Ereigniskaskade, die durch Endotoxin ausgelöst wird. Da die Entwicklung von Hypotonie und anderen mit septischem Schock verbundenen Veränderungen von komplexen Wechselwirkungen zwischen Cytokinen, Eikosanoiden, PAF, aktivierten Komplementkomponenten und anderen Faktoren abhängen kann, ist es nicht überraschend, daß sich mehrere Eingriffe als zumindest teilweise effektiv in einigen Modellen erwiesen haben. Inhibitoren der Prostaglandinsynthese und PAF-Rezeptorantagonisten sind zwei Hauptverbindungsklassen, die therapeutisches Potential aufweisen können (8–9). Obwohl diese Mittel wirksam zu sein scheinen, wurden sie primär an Tieren getestet, denen sehr große Dosen Endotoxin (beispielsweise 1 bis 40 mg/kg oder etwa tausendfach größere als die hier verwendeten Dosen) verabreicht wurden. Das Einsetzen von Hypotonie erfolgt bei diesen Tieren innerhalb von wenigen Minuten und kann nicht genau die für klinischen septischen Schock charakteristischen Cytokin-vermittelten Vorgänge widerspiegeln. In der vorliegenden Untersuchung mit Endotoxin und bei vorhergehendem klinischem septischem Schock, in der vorliegenden Untersuchung mit Endotoxin und in einer früheren Untersuchung mit TNF (Kilbourn et al., 1990, N^G-Methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: Implications for the Involvement of Nitric Oxide, Proc. Acad. Sci., U.S.A. 87: 3629) wurden Mikrogrammdosen von ET oder TNF verabreicht und das blutdrucksenkende Ansprechen erfolgte nach einer Verzögerung von 30 bis 90 min.
Die Demonstration der Erfinder der vorliegenden Erfindung (Kilbourn et al., 1990, N^G-Methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: Implications for the Involvement of NO, Proc. Acad. Sci., U.S.A. 87: 3629), daß Hunde, die TNF erhielten, eine starke Hypotonie entwickeln, die durch Verabreichung von L-NMA im wesentlichen umgekehrt werden kann, legte nahe, daß die Überproduktion von NO ein Hauptfaktor bei TNF-induziertem Schock ist. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, daß L-NMA eine rasche und starke antiblutdrucksenkende Wirkung auf den endotoxämischen Hund hat.
Die Wirkungen von L-NMA auf Herzleistung und SVR in den vier Kontrollhunden zeigten eine beträchtliche Variation. Bei zwei Hunden nahm die Herzleistung deutlich ab (Δ ≥ 1,5 1/min) und die berechnete SVR nahm drastisch zu (Δ ≥ 3500 dyn × s/cm^s). Im Gegensatz hierzu waren größere Veränderungen der Herzleistung nach Verabreichung von L-NMA bei einem der ET-behandelten Hunde oder bei den anderen beiden Kontrollhunden nicht zu beobachten; bei letzteren nahm SVR um nur etwa 1400 dyn·s/cm^s zu. Obwohl diese Ergebnisse die Möglichkeit nahelegen, daß L-NMA unter Kontrollbedingungen eine direkte Wirkung auf die Herzleistung haben kann, sind zusätzliche Untersuchungen erforderlich. Es ist wahrschein lich, daß die Aktivierung des arteriellen Barorezeptorreflexmechanismus (Lodato, Control of Cardiac Output, In: D.R. Dantzer (Hrsg.) Cardiopulmonary Critical Care, W.B. Saunders, Philadelphia, PA (im Druck)) für die durch L-NMA induzierte Abnahme von HR und CO unter Kontrollbedingungen verantwortlich ist. Diese Ansicht wird von der Beobachtung gestützt, daß Kontrollhunde, die Phenylephrin mit einer Dosis erhalten hatten, die SAP auf eine von L-NMA allein erzeugte Höhe brachte, ebenfalls eine ähnliche Abnahme von HR und CO zeigten. Der Mangel an Wirkung von L-NMA auf HR oder CO in Hunden mit Hypotonie kann darauf zurückzuführen sein, daß das Ausmaß der Hypotonie unter dem Bereich der Barorezeptorreflexempfindlichkeit lag (Lodato, Control of Cardiac Output, In: D.R. Dantzer (Hrsg.) Cardiopulmonary Critical Care, W.B. Saunders, Philadelphia, PA (im Druck)).
Im Hinblick auf die vielfachen Mediatoren, die zu septischem Schock beitragend angegeben wurden, bestand die Erwartung, daß selbst eine vollständige Hemmung der NO-Bildung nicht vollständig die Hypotonie von durch ET induziertem Schock umkehren könnte. In der Tat legt die Tatsache, daß der Blutdruck nicht vollständig zu den Vorbehandlungswerten durch 20 mg/kg L-NMA wiederhergestellt wurde, nahe, daß andere Mediatoren außer NO in mäßigem Umfang zu Hypotonie im endotoxämischen Hund beitragen. Die Möglichkeit, daß die NO-Synthese durch die verabreichte Dosis von L-NMA nicht vollständig gehemmt wurde, liefert eine alternative Erklärung für das Nichtgelingen einer vollständigen Wiederherstellung des Blutdrucks auf die Vorbehandlungswerte. Obwohl eine direkte Beschreibung des Ausmaßes der Hemmung der NO-Synthese in vivo nicht möglich ist, ergeben Grenzdosis/Ansprechuntersuchungen, daß L-NMA-Dosen von mehr als 20 mg/kg keine signifikant größere Blutdruckerhöhungswirkung besitzen. Die Blockade zum Entkommen vor einer durch ET induzierten Hypotonie durch 20 mg/kg L-NMA kann auf anderen Mediatoren als NO beruhen. Die langzeitige Hemmung durch L-NMA könnte durch Umwandlung zu L-Arginin eigenbeschränkt sein (Salvemini et al., 1990, Immediate Release of a Nitric Oxide-Like Factor from Bovine Aortic Endothelial Cells by Escherichia coli Lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2593), doch sollte ein derartiger Metabolismus den kurzzeitigen Blutdruckerhöhungseffekt von L-NMA, der in 23 gezeigt ist, nicht verringern. Dennoch zeigt die Erkenntnis, daß L-NMA den Blutdruck auf normale oder nahezu normale Werte wiederherstellt, an, daß die Überproduktion von NO eine Hauptursache, und vielleicht die Hauptursache, von Hypotonie bei endotoxischem Schock ist.
In einem Experiment konnte eine einzige Injektion von L-NMA (20 mg/kg) die durch Endotoxin ausgelöste Hypotonie 30 bis 60 min lang umkehren. Wie in 24 angegeben, konnte der Normaldruck während mindestens 2 h durch eine anschließende Gabe von L-NMA aufrechterhalten werden. Die langzeitige Umkehrung von Endotoxin-induzierter Hypotonie mit L-NMA zeigt die mögliche klinische Nützlichkeit dieses Mittels auf. Folglich legen diese Ergebnisse nahe, daß Inhibitoren der NO-Synthese bei der Behandlung von septischem Schock von beträchtlichem Wert sein sollten.
BEISPIEL 5
Die Verabreichung von ET an Hunde war deutlich stärker toxisch und weniger vorhersagbar als die Verabreichung von TNF. In dieser Versuchsreihe mit kleinen Dosen von ET (1 μg/kg) wurde beobachtet, daß der Blutdruck innerhalb von 60–90 min abnahm. Nach dem Erreichen des Tiefpunkts des Blutdrucks wurde NMMA (5 mg/kg) verabreicht. Innerhalb von 1,5 min nahm der Blutdruck um 33 ±2,5 mmHg zu. Diese Zunahme des Blutdrucks wurde durch die anschließende Verabreichung von L-Arginin (100 mg/kg) umgekehrt und es wurde beobachtet, daß der Blutdruck sprunghaft unter die Vor-NMMA-Höhe fiel. Die Verabreichung von NMMA an endotoxämische Hunde führte im Vergleich zu unbehandelten Tieren zu einer signifikant größeren Zunahme des Blutdrucks (33 mmHg gegenüber 12 mmHg). Zum Nachweis, ob durch Endotoxin induzierter letaler Schock durch NMMA umgekehrt werden konnte, wurden endotoxämische Hunde, die 100 μg/ml Endotoxin erhalten hatten, mit 20 mg/kg NMMA behandelt (23). Dies führte zu einer beträchtlichen Zunahme des Blutdrucks von 65 mm im Vergleich zu einer Zunahme von 35 mm bei einem normalen unbehandelten Hund. Darüber hinaus konnte der Blutdruck mit erneuter Verabreichung von NMMA aufrechterhalten werden (24).
Da NMMA spezifisch die NO-Synthese blockiert, legen diese Beobachtungen eine Rolle für NO bei durch Immunmodulatoren induziertem Schock und septischem Schock nahe. Da die Verabreichung von L-Arginin die durch L-NMMA bewirkte kompetitive Hemmung durch Bereitstellung eines Überschusses des erforderlichen Vorläufers für die NO-Synthese beseitigt, legt diese Arbeit auch eine Rolle für Arginin bei der Erzeugung von mit diesen beiden Vorgängen verbundener Hypotonie nahe. Die Umkehrung von Hypotonie durch NMMA scheint für durch TNF und ET induzierte Hypotonie selektiv zu sein, da eine Verringerung des Blutdrucks auf eine ähnliche Höhe von Hypotonie mit Nitroglycerin durch die Verabreichung von NMMA nicht antagonistisch beeinflußt wurde. Dies unterstützt weiter eine Rolle von NO in diesen Prozessen, da Hypotonie bei Induktion durch ein Mittel, das auf einem von Arginin unabhängigen Weg wirkt, durch NMMA nicht antagonistisch beeinflußt wurde.
Das Ansprechen des Hundes auf TNF und ET ist ähnlich dem beim Menschen beobachteten. In klinischen Versuchen, in denen TNF an Krebspatienten verabreicht wurde, ist Hypoto nie die dosisbegrenzende Toxizität, die die verabreichbare Dosis an TNF beschränkt. Wie bei Patienten beobachtet, ist die Zeit des Einsetzens und der Stärke der Hypotonie beim Hund variabel. Die Verabreichung von ET an den Hund ist im Vergleich zu einer Bolusinjektion von TNF mit einer stärkeren und nicht kontrollierbaren Form von Hypotonie verbunden. Dies kann auf der Tatsache beruhen, daß TNF im Stoffwechsel eine kurze Lebensdauer besitzt (5 min), jedoch nach der Verabreichung von ET kontinuierlich durch endogene Quellen erzeugt wird. Dies kann zu einem erhöhten induktiven Antrieb zur Erzeugung größerer Mengen von NO als Reaktion auf ET im Vergleich zu TNF führen. Diese Hypothese wird durch die Tatsache bestärkt, daß geringere Dosen von NMMA zur Umkehrung von durch TNF induziertem Schock im Vergleich zu durch ET induziertem Schock erforderlich waren.
NMMA hemmt die Anti-Tumoraktivität von TNF und IL-2 in vitro nicht. Die TNF-Bioaktivität wurde durch die Cytotoxizität gegenüber L929-Zellen von Mäusen in vitro gemessen. Die Zugabe von NMMA oder N^G-Aminoarginin änderte die cytolytische Wirkung von TNF gegenüber Tumorzellen in vitro nicht (Tabelle 3). Tabelle 3 Wirkungen von NMMA auf die cytolytische Aktivität von rh-TNF gegen mit Actinomycin D behandelte L929-Zellen
In ähnlicher Weise änderte NMMA weder die Proliferationsphase (Daten nicht angegeben) noch die Lysephase von mit Il-2 exponierten humanen LAK-Zellen in vitro (Tabelle 4). Tabelle 4 Wirkungen von NMMA auf die IL-2-vermittelte Lymphokin-aktivierte Killerzellenaktivität in vitro

* Prozentuale Lyse, berechnet aus der prozentualen Freisetzung von Radioaktivität aus ⁵¹Cr-markierten Raji-Targetzellen minus der spontanen Freisetzung. Die Effektorzellen bestanden aus humanen Blutlymphocyten, die 4 d lang in Gegenwart von 40 U/ml IL-2 kultiviert wurden (E:T = 80:1).

Aminoarginin ist der stärkste Inhibitor der Stickoxiderzeugung, der bisher gemessen wurde. Da NMMA zu Citrullin metabolisiert wird, das anschließend als Vorläufer der Argininbiosynthese dienen kann, wurden andere Argininanaloga bezüglich ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Stickoxiderzeugung getestet (Tabelle 5). Tabelle 5 Vergleich der ED_50% ^*-Werte von N^G-substituierten Argininanaloga

*ED_50% + Die effektive Wirkstoffdosis, die 50 % der Nitriterzeugung durch Maus-Endothelzellen, die mit Gamma-Interferon (100 U/ml) und TNF (500 U/ml) in vitro exponiert waren, hemmte.

Das stärkste getestete Derivat war N^G-Aminoarginin. Das anschließende Testen in vivo zeigte, daß Aminoarginin im Vergleich zu NMMA bei der Umkehrung der mit der Verabreichung von TNF im Hund verbundenen Hypotonie effektiver war (25).
Die Umkehrung eines ET-Schocks (letale Dosis) durch N^G-Aminoarginin (NAA) während 4 h 38 min wurde unter Verwendung multipler Dosen von Aminoarginin (NAA) aufgezeigt. 26 zeigt den systemischen arteriellen Druck (SAP) gegen die Zeit (min). ET (2 mg/kg), eine letale Dosis, wurde über 60 min als Infusion gegeben und NAA wurde nach 97, 165 und 374 min zur Aufrechterhaltung des Blutdrucks verabreicht. Das Tier überlebte 24 h lang und wurde anschließend einer Autopsie unterzogen. In Leber, Lungen, Herz, Hirn, Darm oder Niere wurden keine pathologischen Veränderungen beobachtet.
27 zeigt die Fähigkeit von N^G-Aminoarginin zur Umkehrung von durch Interleukin-1 vermittelter systemischer Hypotonie auf. Eine anschließende Verabreichung von L-Arginin beseitigte diese Umkehrung.
Die Erfindung umfasst die folgenden Zusammensetzungen:
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die N^G-Methylarginin oder N^G,N^G-Dimethylarginin umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung eines tierischen Lebewesens wegen durch gamma-Interferon, Tumornekrosefaktor, Interleukin-1 oder Interleukin-2 induzierter systemischer Hypotonie.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die N^G-Methylarginin oder N^G,N^G-Dimethylarginin umfasst, zur Verwendung bei der Prophylaxe für ein tierisches Lebewesen wegen durch die Produktion von Stickoxid verursachter systemischer Hypotonie, die durch eine Therapie mit gamma-Interferon, Tumornekrosefaktor, Interleukin-1 oder Interleukin-2 induziert wird.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die N^G-Methylarginin oder N^G,N^G-Dimethylarginin umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung eines tierischen Lebewesens wegen durch Einwirkung eines Endotoxins induzierter systemischer Hypotonie.

Claims

Inhibitor der Stickoxidbildung von Arginin zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, wobei der Inhibitor ein N^G-Aminoarginin, N^G-Nitroarginin, N^G-Methylarginin, N^G-Ethylarginin, N^G-Propylarginin, N^G-Butylarginin oder ein N^G,N^G-disubstituiertes Arginin oder ein L-Nitroarginin-methylester ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, der ein N^G-Methylarginin ist.
Inhibitor nach Anspruch 2, der ein N^G-Methyl-L-arginin ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, der ein N^G,N^G-Dialkylarginin ist.
Inhibitor nach Anspruch 4, der ein N^G,N^G-Dialkylarginin mit einem Alkylsubsituenten, der aus Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl ausgewählt ist, ist.
Inhibitor nach Anspruch 4 oder 5, der N^G,N^G-Dimethylarginin ist.
Verwendung eines Inhibitors der Stickoxidbildung von Arginin bei der Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von systemischer Hypotonie.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die systemische Hypotonie durch Stickoxidproduktion induziert ist.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Inhibitor ein Argininantagonist ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Argininantagonist ein N^G-substituiertes Arginin oder ein N^G,N^G-disubstituiertes Arginin ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Argininantagonist ein N^G-substituiertes Arginin oder ein N^G,N^G-disubstituiertes Arginin mit einem Nitro-, Amino-, Alkyl-, Hydroxyalkyl-, Carboxyalkyl-, Aminoalkyl- oder Alkenylsubstituenten, der einen Wasserstoff einer Guanidinoaminogruppe ersetzt, ist.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Argininantagonist ein N^G-Aminoarginin, N^G-Nitroarginin oder ein N^G-Alkylarginin, wie N^G-Methylarginin, N^G-Ethylarginin, N^G-Propylarginin oder N^G-Butylarginin, ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Argininantagonist ein N^G-Methylarginin ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Argininantagonist N^G-Methyl-L-arginin ist.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Argininantagonist ein N^G,N^G-disubstituiertes Arginin ist.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Argininantagonist ein N^G,N^G-Dialkylarginin ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Argininant agonist ein N^G,N^G-Dialkylarginin mit einem Alkylsubstituenten, der aus Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl ausgewählt ist, ist.
Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Argininantagonist N^G,N^G-Dimethylarginin ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Argininantagonist L-Nitroarginin-methylester ist.