DE69034087T2

DE69034087T2 - Antiidiotypischer Antikörper, der ein Immunantwort gegen ein Glykosphingolipid induziert und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69034087T2
Application number: DE69034087T
Authority: DE
Inventors: Paul B. Chapman; Alan N. Houghton
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Priority date: 1989-05-25
Filing date: 1990-05-25
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2010-05-26
Also published as: DK0884329T3; ES2207768T3; EP1334984A1; JPH05500600A; CA2057010A1; DE69032855T2; EP0473721A4; EP0473721B1; WO1990014104A1; DE473721T1; CA2057010C; US5529922A; EP0884329B1; EP0473721A1; DE69034087D1; EP0884329A1; ES2127186T3; HK1014658A1; ATE243713T1; DK0473721T3

Description

R24, ein monoclonaler IgG3-Mausantikörper (mAb), der gegen ein menschliches Melanom erzeugt wurde, erkennt das GD₃-Gangliosid. Das GD₃-Gangliosid wird auf den meisten Melanomen zahlreich exprimiert, die Expression des GD₃-Ganliosids auf normalem Gewebe ist jedoch selektiv und erfolgt in geringen Konzentrationen (1). Ganglioside sind eine Untergruppe von Glycosphingolipiden, die wiederum eine Untergruppe von Glycolipiden sind. Glycolipide sind, wie ihr Name ausdrückt, zuckerhaltige Lipide.
R24 umfaßt ein bekanntes Gemisch von drei verschiedenen Antikörperspezies (11) mit der Beziehung V1-R24, V2-R24 und R24. Die V1-R24- und die V2-R24-Varianten umfassen jeweils eine bzw. zwei leichte Ketten von irrelevanten Antikörpern; im Gegensatz dazu umfaßt R24 relevante leichte Ketten. Allgemein bewirkt eine Kombination aus leichten und schweren Antikörperketten eine spezifische Antikörper-Antigen-Bindung. Die Antikörper, die leichte Ketten von irrelevanten Antikörpern enthalten, binden im Gegensatz zu Antikörpern, die leichte Ketten von relevanten Antikörpern enthalten, ein Antigen nicht spezifisch.
Zur Vermeidung einer Verwirrung wird die hier nachstehend beschriebene R24-Variante als „R24" bezeichnet, und R24, die die drei varianten Spezies umfaßt, wird als „R24-Zusammensetzung" bezeichnet. Jede Variante zeigt Unterschiede, die andeuten, daß der GD₃-bindende Bereich (auch als „Paratop" bezeichnet) von V1-R24, V2-R24 und R24 verändert ist.
Anti-idiotypische monoclonale Antiköper, die das innere Aussehen eines Saccharid-Epitops imitieren und besitzen, wurden entwickelt (2). Das Saccharid-Epitop ist ein Tumor-assoziiertes Globosid, d. h. ein Glycolipid. Diese anti-idiotypischen monoclonalen Antikörper imitieren aber ein Glycosphingolipid, ein Gangliosid oder insbesondere das GD₃-Gangliosid nicht spezifisch. Ferner sind diese anti-idiotypischen monoclonalen Antikörper nicht gegen R24 oder irgendwelche spezifisch ein Glycosphingolipid oder ein Gangliosid, und überhaupt nicht das GD₃-Ganliosid, bindende Antikörper gerichtet.
Mäuse wurden gegen Kapselantigene von pathogenen Bakterien durch Verabreichung von monoclonalen anti-idiotypischen Antikörpern, die die Polysaccharidkapsel von E. coli (ein gramnegatives Bakterium) imitieren, sensibilisiert (3). Es ist allgemein bekannt, daß Lipopolysaccharide (LPS) ein Hauptbestandteil der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien sind und bei der Lyse von Bakterien freigesetzt werden. LPS besteht aus einer kovalent an ein Glycolipid gebundenen Heteropolysaccharidkette. Es ist wichtig zu betonen, daß trotz der Verwendung dieser monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper zur Sensibilisierung eines Individuums gegen ein LPS die Herstellung von monoclonalen anti-idiotypischen Antikörpern gegen R24 oder irgendwelche spezifisch Glycosphingolipide oder Ganglioside, besonders das GD₃-Gangliosid, bindenden Antikörpern nicht nahegelegt ist.
EP-A-0 306 995 offenbart einen anti-idiotypischen Antikörper, der für einen Idiotypen spezifisch ist, der ein Menschen-assoziiertes GD₃-Gangliosidantigen erkennt und bei Erkennung des GD₃-Antigens durch einen monoclonalen MG-21-Antikörper ausgelöst wird. Die anti-idiotypischen Antikörper gemäß EP-A-0 306 995 sind dafür vorgesehen, zur Induzierung einer Immunantwort auf Tumoren verwendet zu werden, die ein spezifisches Antigen tragen.
WO-A-88/08429 offenbart Arzneimittel und Impfstoffe für die Behandlung von opportunistischen Infektionen bei Patienten mit einer Immunschwäche. Diese Zusammensetzungen und Impfstoffe basieren auf T-abhängigen Antigenen, die für eine Target-Infektion spezifisch sind, die mit einem T-Zell-unabhängigen Träger gekoppelt ist.
T. Söderström et al. (1984), The New England J. of Medicine 310, 726–727; offenbart, dass Interleukin-1 bei Mäusen in vivo die sekundären Antikörper-Antworten auf ein Proteinantigen verstärkt, und dass dieses Protein ein wichtiger Vermittler der Abwehrantworten des Wirts und der stimulierenden Effekte einiger Adjuvantien sein kann.
Staruch et al. (1983) J. of Immunology 130, 2191–2194 bezieht sich auf das Adjuvanzvermögen von Interleukin-1 in vivo. Insbesondere wurde gezeigt, dass Interleukin-1 in vivo bei Mäusen die sekundären Antikörper-Antworten auf ein Proteinantigen verstärkt. Man fand heraus, dass die Aktivität von der Dauer und der Dosierung abhängig war. Die größtmögliche verstärkende Wirkung wurde mit 2000 LAF-Einheiten von IL1 erreicht, das zwei Stunden nach der erstmaligen Verabreichung des Antigens gegeben wurde. Die Beobachtung legt nahe, dass dieses Protein ein sehr wichtiger Vermittler von Abwehrantworten des Wirts als auch der stimulierenden Wirkungen einiger Adjuvantien sein könnte.
Das GD₃-Gangliosid ist schwach immunogen (1). Daher ist das GD₃-Gangliosid ein attraktives Ziel für die Krebsimmuntherapie, da aus der Entwicklung von Molekülen, die GD₃ strukturell imitieren und dramatisch signifikante immunogene Eigenschaften besitzen, kommerzieller Nutzen gezogen werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt einen als BEC2 bezeichneten anti-idiotypischen Antikörper bereit, der von dem als BEC-2 bezeichneten Hybridom hergestellt wird (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10153). Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein als BEC2-Hybridom bezeichnetes Hybridom bereit (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10153). Zusätzlich stellt diese Erfindung ein Arzneimittel bereit, das den erfindungsgemäßen anti-idiotypischen Antiköper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, das (a) den mit einem zytotoxischen Mittel markierten anti-GD₃-Antiköper R24 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 8445); und (b) den erfindungsgemäßen anti-idiotypischen Antikörper umfasst; wobei (a) und (b) sequentiell verabreicht werden können. Schließlich stellt diese Erfindung eine immunogene Zusammensetzung von Material bereit, das ein Cytokin und einen an einen Träger gebundenen R24-Antikörper (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 8445) bereit, wobei das Cytokin in einer Menge vorliegt, die wirksam ist um die Herstellung von Antikörpern in einem Patienten zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch einen anti-idiotypischen monclonalen Antikörper, der spezifisch eine Immunantwort gegen ein Glycosphingolipid und spezifischer gegen ein Gangliosid induziert. Ferner beschreibt die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein wirksame Menge eines Cytokins und einen an einen Träger gebundenen Melanom-Gangliosid-spezifischen Antikörper umfaßt. Schließlich beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung des vorher genannten anti-idiotypischen Antikörpers, das umfaßt: (a) Herstellung eines Antikörpers; (b) Reinigung des Antikörpers; (c) Anheftung des Antikörpers an einen Träger, um ein Immunogen herzustellen; (d) Zusammenführung des Immunogens mit einem Cytokin, um eine neue Immunogen-Cytokin-Kombination herzustellen; und (e) Injektion der neuen Immunogen-Cytokin-Kombination in einen Säuger, wodurch der anti-idiotypische Antikörper erzeugt wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Inhibition der Bindung von R24 an GD₃ durch BEC2. Verdünnungen von BEC2 wurden mit 5 μg/ml biotinyliertem R24 1 Stunde inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend in mit GD₃-enthaltenden Melanom-Gangliosiden beschichtete Vertiefung übertragen. Die Bindung von R24 wurde durch Zugabe von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Avidin 15 Minuten nachgewiesen. Nach dem Waschen wurde Substrat (p-Nitrophenylphosphat) zugesetzt und die Absorption bei 410 nm gemessen.
2: Anti-GD₃-Reaktivität, die in Kaninchen durch Immunisierung mit BEC2 induziert wurde. Kaninchen wurden subkutan 100 μl BEC2 in komplettem Freundschem-Adjuvans inokuliert. Anschließende Nachimmunisierungen wurden entweder subkutan in inkomplettem Freundschem-Adjuvans (Tage 17 und 31) oder intramuskulär ohne Adjuvans (Tage 57 und 85) verabreicht. Zum Nachweis von anti-GD₃-Kaninchen-Antkörpern durch ELISA wurden 96 Vertiefungen aufweisende Platten mit gereinigtem Melanom GD₃ beschichtet und mit 5% fettfreier Milch blockiert. Verdünnungen von Kaninchenserum wurden 1 Stunde zugesetzt. Nach dem Waschen wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-Kaninchen IgG zugesetzt. Die Bindung wurde durch Zugabe von Substrat (p-Nitrophenylphosphat) und Messung der Absorption bei 410 nm sichtbar gemacht.
3: Anti-GD₃-Reaktivität, die durch Immunisierung mit BEC2 in Kaninchen induziert wurde. Kaninchen wurden subkutan 100 μl BEC2 in komplettem Freundschem-Adjuvans inokuliert. Anschließende Nachimmunisierungen wurden entweder subkutan in inkomplettem Freundschem-Adjuvans (Tage 17 und 31) oder intramuskulär ohne Adjuvans (Tage 57 und 85) verabreicht. Zum Nachweis von anti-GD₃-Kaninchen-Antikörpern durch ELISA wurden 96 Vertiefungen aufweisende Platten mit dem gereinigten Melanom GD₃ beschichtet und mit 5% fettfreier Milch blockiert. Verdünnungen von Kaninchenserum wurden 1 Stunde zugesetzt. Nach dem Waschen wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-Kaninchen-IgM zugesetzt. Die Bindung wurde durch Zugabe von Substrat (p-Nitrophenylphosphat) und Messung der Absorption bei 410 nm sichtbar gemacht.
4: Inhibition der Bindung von R24 an GD₃ durch BEC2. Die Daten zeigen eine signifikante Inhibition der Bindung von R24 an GD₃ durch BEC2; dies stimmt damit überein, daß BEC2 ein Ab2b-anti-idiotypischer mAb ist.
5: Anti-GD₃-IgG des Kaninchens 521 durch RIA. Das Kaninchen 521 entwickelte IgG gegen GD₃ nach einer Immunisierung mit mit komplettem Freundschem-Adjuvans vermischtem BEC2. Die Antwort wurde durch RIA gemessen.
6: Anti-GD₃-IgM des Kaninchens 543 durch ELISA. Das Kaninchen 543 entwickelte IgM nach einer Immunisierung mit mit komplettem Freundschem-Adjuvans vermischtem BEC2. Die Antwort wurde durch ELISA gemessen.
7: Anti-GD₃-IgM des Kaninchens 545 durch ELISA. Das Kaninchen 545 entwickelte IgM nach einer Immunisierung mit mit komplettem Freundschem-Adjuvans vermischtem BEC2. Die Antwort wurde durch ELISA gemessen.
8: BEC2-induzierte anti-GD₃-Antikörper kreuzreagieren nicht mit anderen Gangliosiden. 1 μg verschiedener gereinigter Ganglioside wurde auf Streifen von Nitrocellulosefiltern aufgetragen und trocknen gelassen. Die Streifen wurden in 5% fettfreier Milch blockiert und gewaschen. Die Streifen wurden über Nacht in Kaninchenserum (Verdünnung 1 : 10) inkubiert. Nach dem Waschen wurde Peroxidase-konjugiertes anti-Kaninchen-IgM 2 Stunden zugesetzt. Die Streifen wurden erneut gewaschen und die Bindung durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol-Substrat mit H₂O₂ sichtbar gemacht.
9: Chromatogramm, das zeigt, daß die meisten Proteine bei einem Molekulargewicht von etwa 120 kD eluierten, was mit IgG (145 bis 150 kD), jedoch nicht mit IgM (900 kD) übereinstimmt.
10: Anti-GD₃-Reaktivität des NH₄SO₄-Niederschlags des Kaninchens 543. Darstellung, die die anti-GD₃-Reaktivität jeder Fraktion zeigt. Es ist erkennbar, daß nur die 120 kD-Fraktion an GD₃ gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen anti-idiotypischen Antikörper wie einen polyclonalen aber bevorzugt einen monoclonalen Antikörper, der eine Immunantwort gegen eine Glycosphingolipid induziert.
Wie hier verwendet sind Glycosphingolipide und Ganglioside entweder natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle.
In einem Fall ist das Glycosphingolipid ein Gangliosid, z. B. GD₃, GD2, GM2 und GM3. GD₃ wird bevorzugt.
Üblicherweise umfaßt ein Antikörper zwei Moleküle, wobei jedes Molekül zwei verschiedene Poylpeptide aufweist, von denen das kürzere als leichte Ketten des Antikörpers und das längere der Polypeptide als schwere Ketten des Antikörpers wirken. Dem Antikörper wird jedoch, wie her verwendet, eine funktionelle Definition gegeben, d. h. es ist jedes eine spezifische immunreaktive Aktivität aufweisende Molekül, ob natürlich vorkommend, künstlich induziert oder rekombinant hergestellt, gemeint. Üblicherweise schließt ein Antikörper, wie hier verwendet, mindestens einen variablen Bereich einer schweren oder leichten Kette ein. Ferner kann der Antikörper Kombinationen von variablen Bereichen einschleißen. Die Kombination kann mehr als einen variablen Bereich einer leichten oder schweren Kette einschließen. Der Antiköper kann ferner variable Bereiche von einer oder mehreren leichten Ketten in Kombination mit variablen Bereichen einer oder mehrerer schwere Ketten einschließen.
Daher ist ein Fragment eines natürlich vorkommenden oder rekombinaten Antikörpermoleküls in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen. Wie hier verwendet, ist ein Fab-Protein oder ein F(ab')₂-Protein, das eine immunreaktive Aktivität zeigt, ein Antikörper. Ferner ist, wie hier verwendet, ein immunologisch reaktiver Komplex, der zwei unterschiedliche Polypeptide umfaßt, von denen das kürzere als leichte Kette und das längere als schwere Kette wirkt, ein Antikörper. Ferner ist, wie hier verwendet, ein Fragment eines variablen Bereichs (Fv-Bereich) ebenfalls ein Antikörper.
Ferner kann in einem Beispiel der immunologisch reaktive Komplex durch bekannte genetische Konstruktionsverfahren oder anders hergestellt werden (4, 8, 9, 5, 10).
In einem weiteren Beispiel bindet der zuvor beschriebene monoclonale anti-idiotypische Antikörper, der spezifisch eine Immunantwort gegen das GD₃-Gangliosid induziert, auch spezifisch an die Bindungsstelle des R24-Antikörpers.
Der hier beschriebene genetisch konstruierte anti-idiotypische Antikörper kann von einem beliebigen Säuger stammen. Der genetisch konstruierte anti-idiotypische Antikörper kann ferner ein chimärer Antikörper sein, der von einer Kombination von unterschiedlichen Säugern stammt. Der Säuger kann beispielsweise ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, eine Ziege oder ein Mensch sein. Die Kombination von verschiedenen Säugern schließt Fragmente von menschlichen und Maus-Quellen ein.
Die Antikörperklasse und -unterklasse sind nicht kritisch. Jede Unterklasse kann zur Herstellung der anti-idiotypischen Antikörper verwendet werden. Die Antikörper können ferner Fragmente von Antikörpern von unterschiedlichen Klassen und Unterklassen enthalten, wodurch eine zusammengesetzte Verbindung entsteht. In einem Aspekt ist der vorstehend beschriebene anti-idiotypische Antikörper ein anti-idiotypischer Antikörper der IgG-Klasse.
Der vorstehend beschriebene monoclonale anti-idiotypische Antikörper wird als BEC2 bezeichnet. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörper produziert, bereit. Das BEC2 produzierende Hybridom wird als BEC2-Hybridom bezeichnet. Das BEC2-Hybridom wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck des Patentverfahrens bei der Patentkulturhinterlegungsstelle der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 USA unter der ATCC-Hinterlegungsnr. HB 10153 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen von BEC2-Hybridom hergestellten anti-idiotypischen Antikörper bereit. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der anti-idiotypische Antikörper mit einem nachweisbaren Marker markiert. Der nachweisbare Marker kann durch Reaktion eines Enzyms, beispielsweise alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase, erzeugt werden.
Der Fachmann weiß, dass ein Verfahren der Anheftung des anti-idiotypischen Antikörpers von Interesse an ein Enzym eine Modifikation des Periodatverfahrens sein kann (6). Alternativ kann der Fachmann einen Liganden an die anti-idiotypischen Antikörper von Interesse und einen Rezeptor des Liganden an das Enzym anheften. Eine geeignete Ligand-Rezeptor-Kombination ist Biotin-Avidin gemäß dem Verfahren von Bayer et al. (7).
Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung des oben beschriebenen, beanspruchten anti-idiotypischen Antikörpers, BEC2, das umfaßt: (a) Herstellung eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers, gegen ein Glycosphingolipid, spezifischer gegen ein Gangliosid, und noch spezifischer gegen GD₃; (b) Reinigung des Antikörpers; (c) Anheftung des Antikörpers, wie R24, an einen Träger, um eine Immunogen herzustellen; (d) Kombination des Immunogens mit einem Cytokin, um eine neue Immunogen-Cytokin-Kombination herzustellen; und (e) Injektion der neuen Immunogen-Cytokin-Kombination in einen Säuger, wobei der anti-idiotypische Antikörper produziert wird. Gemäß der Durchführung der Erfindung kann der Träger jedes beliebige Material sein, das bei einer Zusammenführung mit dem Antikörper immunogen ist. Der Träger kann eine Mikrobe, ein Liposom oder ein Proteosom sein. In einem Beispiel ist die Mikrobe S. aureus.
Ferner kann das Cytokin gemäß der Durchführung der Erfindung ein Interleukin, vorzugsweise Interleukin-1, sein. In einem Beispiel ist Interleukin-1 das rekombinante menschliche Interleukin-1.
GD₃ ist im Menschen schwach immunogen. Im Gegensatz dazu sind die anti-idiotypische Antikörper von Interesse stark immunogen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, der den anti-idiotypischen Antikörper, BEC2, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Diese Impfstoffe sind hochwirksame und kommerziell verwendbare Therapeutika.
Beispiele für geeignete Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können, jedoch ohne irgendwie Beschränkung darauf und ohne jede Absicht dazu, jeden pharmazeutischen Standardträger, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsion, und verschiedene Arten von Netzmitteln einschleißen. Weitere Träger können auch sterile Lösungen, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln einschließen.
Typischer Weise enthalten solche Träger Excipienten, wie Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Arten von Ton, Gelatine, Stearinsäure oder Salze davon, Magnesium- oder Calciumstearat, Talk, Pflanzenfette oder -öle, Gummi, Glycole oder andere bekannte Excipienten. Diese Träger können auch Geschmacks- und Farbzusätze oder andere Bestandteile einschließen. Diese Träger umfassende Zusammensetzungen werden durch gut bekannte Standardverfahren formuliert.
Diese Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können, jedoch ohne irgendeine Beschränkung darauf oder ohne jede Absicht dazu, jeden der pharmazeutischen Standardträger, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsion, und verschiedene Arten von Netzmitteln einschließen. Weitere Träger können auch sterile Lösungen, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln einschließen.
Diese Erfindung stellt außerdem einen Impfstoff bereit zur Immunisierung eines menschlichen Individuums gegen GD₃-Ganglioside. Hierbei soll eine geeignete Dosis des vorstehend beschriebenen Impfstoffes an das Individuum verabreicht werden. Die Verabreichung jeglicher Impfstoffe kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Geeignete Verabreichungsverfahren schließen eine intravenöse, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre, lokale oder intradermale Verabreichung ein.
Zusätzlich stellt diese Erfindung einen Impfstoff zur Behandlung eines menschlichen Individuums mit einem neoplastischen oder präneoplastischen Zustand im Zusammenhang mit der Expression von Glycosphingolipiden, beispielsweise Gangliosiden, wie GD₃, bereit, wobei eine wirksame Menge des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers an das Individuum verabreicht werden soll. Beispiele für neoplastische und präneoplastische Zustände im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Gangliosiden schließen einen Zustand ein, der ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Melanom, Plattenepithelzellkarzinom, Glioblastom, Sarcom, T-Zell-Leukämie und Lymphom, Hodgkin-Krankheit, kleinzelligem Karzinom der Lunge oder Gehirntumor.
In einem Beispiel wird die Verabreichung des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers durch intravenöse Verabreichung durchgeführt. In einem weiteren erfindungsgemäßen Beispiel erfolgt die Verabreichung des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers durch intraperitoneale Verabreichung. In noch einem weiteren Beispiel erfolgt die Verabreichung des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers durch subkutane Verabreichung. In noch einem weiteren Beispiel erfolgt die Verabreichung des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers durch intramuskuläre Verabreichung. Ferner erfolgt in einem weiteren Beispiel die Verabreichung des vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörpers durch lokale Verabreichung. Ferner erfolgt die Verabreichung in noch einem weiteren Beispiel des vorstehend beschriebenen anti-idiotypisches Antikörpers durch intradermale Verabreichung.
Diese Erfindung stellt außerdem einen Impfstoff zur Inhibition einer mikrobiellen Infektion bereit, wie eine Entotoxin-bedingte Infektion, in einem Individuum, umfassend die Behandlung („Priming") des Individuums mit einer wirksamen Menge des vorstehend beschriebenen Impfstoffs zur Erzeugung eines Antikörpers, der spezifisch an ein Glycosphingolipid auf einer mikrobiellen Membran bindet, wobei der Antikörper und das Glycosphingolipid eine Kombination bilden und dabei die mikrobielle Infektion hemmen.
Ferner stellt die Erfindung einen Impfstoff zur Inhibition eines Malignoms bereit, im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Gangliosiden in einem Individuum, wie einem menschlichen Individuum. Hierbei soll das Individuum mit einer wirksamen Menge des zuvor beschriebenen Impfstoffes zur Erzeugung eines an ein GD₃-Gangliosid spezifisch bindenden Antikörpers geprimt werden, wobei der Antikörper und das GD₃-Gangliosid eine Kombination bilden und so ein Malignom im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Gangliosiden hemmen. Beispiele für Malignome im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Ganglisiden schließen ein Malignom ein, das ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Melanom, Plattenepithelzellkarzinom, Glioblastom, Sarcom, T-Zell-Leukämie und Lymphom, Hodgkin-Krankheit, kleinzelligem Karzinom der Lunge oder Gehirntumor. In einem Beispiel wird das Verfahren zur Messung des Expressionsniveaus von GD₃-Gangliosiden im Gewebe von einem Individuum durch Ermittlung der Menge und Verteilung von GD₃ in Gewebeschnitten von einem zu testenden neoplastischen Gewebe durchgeführt. Das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen des zu testenden Gewebes mit dem Antikörper R24 und damit den Nachweis des Expressionsniveaus und der Verteilung von GD₃.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel bereit zur Behandlung eines an einem Malignom im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Gangliosiden auf malignen Zellen leidenden Individuums. Hierbei soll eine für Zellen tödliche Menge eines anti-GD₃-Antikörpers, der mit einem cytotoxischen Agens, wie einem Radioisotop, einem Arzneistoff, oder einem Schwermetall, markiert ist, an das Individuum verabreicht werden. Der markierte Antikörper bindet an GD₃-Ganglioside, wonach das cytotoxische Agens die malignen Zellen, an die das GD₃-Ganglisodi gebunden ist, tötet. Es ist wichtig, den ungebunden Antikörper, der mit einem cytotoxischen Agens markiert ist, schnell zu eliminieren. Die Eliminierung kann durch Inkontaktbringen des ungebundenen markierten Antikörpers mit jedem der vorstehend beschriebenen anti-idiotypischen Antikörper beschleunigt werden. Die anti-idiotypischen Antikörper binden den zuvor ungebundenen markierten Antikörper, um einen Komplex zu bilden, der durch Ausscheiden aus dem Individuum beseitigt werden kann. So wird das Individuum wegen des Malignoms behandelt, ohne daß es durch das cytotoxische Agens unnötig geschädigt wird.
Es ist dem Fachmann gut bekannt, daß eine „Beseitigung" unerwünschter Komposita, besonders des markierten Komplexes, den Transport des Komplexes zur Milz, Lunge oder Leber umfaßt, wo ein Fc-Bereich des Antikörpers innerhalb des Kompositums an den Fc-Rezeptor von Milz-, Lungen- oder Lebergewebe oder davon stammende Zellen binden würde. Nach der Bindung an diese Gewebe oder die davon stammenden Zellen wird der Komplex aus dem Körper auf physiologischem oder biochemischem Wege ausgeschieden.
Beispiele eines Malignom im Zusammenhang mit der Expression von GD₃-Gangliosiden umfassen alle Malignome, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einem Melanom, Plattenepithelzellkarzinom, Glioblastom, Sarcom, T-Zell-Leukämie und Lymphom, Hodgkin-Krankheit, kleinzelligem Karzinom der Lunge oder Gehirntumor.
Diese Erfindung beschreibt außerdem ein Verfahren zur Inhibition der Proliferation von Zellen im Zusammenhang mit erhöhten Mengen von GD₃-Gangliosiden in einem Individuum. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge des vorstehend beschriebenen Impfstoffes an das Individuum.
Ferner stellt diese Erfindung eine immunogene Zusammensetzung aus Material bereit, die eine wirksame Menge eines Cytokins, z. B. Interleukin-1, vorzugsweise rekombinantes menschliches Interleukin-1, und einen an einem Träger haftenden Melanom-Gangliosid-spezifischen Antikörper, wie einen R24-Antikörper, umfaßt. Ferner kann der Träger eine Mikrobe, vorzugsweise S. aureus, sein.
Ferner beschreibt die vorstehende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines anti-idiotypischen Antikörpers, das umfaßt: (a) Anheften eines Antigens, beispielsweise R24, an eine Mikrobe zum Erhalt eines Immunogens; (b) Reinigung des Immunogens; (c) Zusammenführung des Immunogens mit Interleukin-1 zur Produktion einer Immunogen-Interleukin-1-Kombination; und (d) Injektion der Immunogen-Interleukin-1-Kombination in Mäuse, vorzugsweise syngene Mäuse, wodurch der anti-idiotypische Antikörpererzeugt wird.
Schließlich wird die Erfindung im nachstehend beschriebenen Abschnitt über experimentelle Details erläutert. Dieser Abschnitt dient zum besseren Verständnis der Erfindung, soll jedoch die in den angefügten Ansprüchen beschriebene Erfindung nicht in irgendeiner Weise einschränken und soll auch nicht so verstanden werden.
Experimentelle Details
Anti-idiotypische mAbs gegen R24
Syngene (C57B1/6X BACB/c) weibliche F1-Mäuse wurden mit dem gereinigten R24, der von den Varianten V1-R24 und V2-R24 frei war, immunisiert. Der Sinn der Verwendung von syngenen Mäusen ist, daß der einzige Teil des R24-Moleküls, der als fremd erkannt werden soll, das Paratop ist. Es ist Standard, das immunisierende Material mit einem „Adjuvans", einem Verstärker einer Immunantwort, der die Immunantwort der Maus verstärkt, zu mischen. Das hier beschriebene neue Adjuvans wurde durch Befestigung des R24 auf S. aureus-Zellen und Injektion der R24-beschichteten Zellen zusammen mit rh IL-1 (DuPont) hergestellt.
Die Mäuse erhielten zwei wöchentliche Nachimmunisierungen. Drei Tage vor der Fusion wurden den Mäusen 50 μg R24 i.v. injiziert. Splenocyten wurden mit SP2/0 unter Verwendung von Standardverfahren fusioniert. Die Hybridome wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung an R24-F(ab')₂-Fragmente unter Verwendung eines alkalischen Phosphatase-konjugierten Ziegen-anti-Maus-F_c-spezifischen zweiten Antikörpers abgesucht. Die positiven Kolonien wurden zweimal durch begrenzende Verdünnung subcloniert. Sowohl S. aureus als auch IL-1 sind starke Stimulatoren von B-Lymphocyten. Unter Verwendung von Hybridom-Standardverfahren und einer Fusion von Maus-Milz-Immunzellen mit der Maus-Myelomzellinie SP2/0 wurden BEC2 und BEC3 produziert.
Nachweis von BEC2 als anti-idiotypischer mAb
BEC2 erkennt einzigartige Determinanten auf R24
Wenn BEC2 tatsächlich ein anti-Idiotyp für R24 ist, würde erwartet werden, daß BEC2 nur an R24 und keine anderen mAb binden würde. Es wurde die Fähigkeit von BEC2 zur Bindung an 23 andere mAbs unter Verwendung eines Inhibtionstests getestet. Kein mAb, außer R24, kann mit R24 um eine BEC2-Bindung konkurrieren (Tabelle 1). Es ist bemerkenswert, daß V1-R24, die Variante mit zwei irrelevanten leichten Ketten, nicht von BEC2 gebunden wird. Dies stimmt mit dem Modell überein, daß BEC2 das Paratop von R24 erkennt.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 wurden unter Verwendung des nachstehenden Verfahrens erhalten. BEC2 (5 μg/ml) wurde mit Verdünnungen des hemmenden mAb 1 Stunde vorinkubiert. Das Gemisch wurde anschließend in zuvor mit R24-F(ab')₂-Fragmenten beschichteten Vertiefungen übertragen und mit 5% fettfreier Milch blockiert. Die BEC2-Bindung wurde durch ELISA unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten F_c-Bereich-spezifischen zweiten Antikörpers nachgewiesen. BEC2 trägt das innere Bild des ursprünglichen Antigens GD₃.
Ein anti-idiotypischer mAb, der das Paratop des immunisierenden mAb erkennt, wird als Ab2b-anti-idotypischer mAb bezeichnet. Eine Bedeutung davon ist, daß das Paratop von BEC2 GD₃ imitieren soll. Wenn man sich das R24-Paratop als Matrize für GD₃ vorstellt und sowohl GD₃ als auch BEC2 zu dieser Matrize passen, dann muß zwischen BEC2 und GD₃ eine Ähnlichkeit bestehen. Unter Verwendung von serologischen Tests wird gezeigt, daß BEC2 die Bindung von R24 an GD₃ hemmen kann. 4 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, in dem verschiedene Konzentrationen von BEC2 mit einer festgelegten Verdünnung von biotinyliertem R24 vorinkubiert wurden. Das Gemisch wurde einer GD₃-beschichteten Vertiefung zugesetzt, und die zur Bindung verfügbare Menge R24 wurde durch Zugabe von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Avidin gemessen. Die Daten zeigen eine signifikante Inhibition der R24-Bindung an GD₃ durch BEC2, was damit übereinstimmt, daß BEC2 ein Ab2b-anti-idiotypischer mAb ist. Zum direkten Nachweis, daß das Paratop von BEC2 GD₃ imitiert, ist es erforderlich, Tiere mit BEC2 zu immunisieren und zu zeigen, daß die Tiere Antikörper gegen GD₃ entwickeln.
Vier weiße New Zealand-Kaninchen wurden mit mit komplettem Freundschem-Adjuvans vermischtem BEC2 immunisiert. Die Tiere erhielten mehrere Nachimmunisierungen, die mit inkomplettem Freundschem-Adjuvans vermischt waren, über etwa drei Monate. Den Kaninchen wurde regelmäßig Blut entnommen und das Serum auf eine anti-GD₃-Reaktivität unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Tests getestet. Die anti-GD₃-IgG-Antwort wurde durch einen Radioimmuntest (RIA) unter Verwendung von [¹²⁵I]-Protein A gemessen. Die anti-GD₃-IgM-Antwort wurde durch ELISA unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten zweiten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpers, der für die mu-Kette spezifisch war, gemessen. Die Spezifität sowohl der IgG- als auch der IgM-Antwort wurde durch Immunblot-Tests gegen mehrere Ganglioside analysiert. In diesen Tests wurde [¹²⁵I]-Protein A verwendet, um die IgG-Bindung sichtbar zu machen, während das Peroxidas-konjugierte Ziegen-anti-Kaninchen (mu-Ketten-spezifische)-Antiserum zur Sichtbarmachung der IgM-Bindung verwendet wurde.
Tabelle 1 Fähgkeit von BEC2 zur Bindung an verschiedene monoclonale Antikörper, gemessen durch die Fähigkeit des monoclonalen Antikörpers zur Verhinderung der Bindung von BEC2 an R24. Inhibition der BEC2-Bindung an R24-F(ab')2-Fragmente durch ein Spektrum von mAb.
Mindestens drei der vier Kaninchen entwickelten eine anti-GD₃-Antikörperantwort. Im RIA entwickelte Kaninchen 521 IgG gegen GD₃ (5), obwohl im Immunblot alle vier Kaninchen anscheinend anti-GD₃-IgG herstellten. Im ELISA entwickelten die Kaninchen 543 (6) und 545 (7) IgM. Die Spezifität dieser Antikörperantwort wurde durch einen Immunblot analysiert. 8 zeigt, daß IgM von Kaninchen 543 an GD₃ bindet, jedoch nicht an die anderen fünf getesteten Ganglioside (GM1, GM2, GM3, GD1a, GT1b). Wie vorstehend beschrieben, zeigte ein Immunblot von Serum von allen vier Kaninchen einen Nachweis der IgG-Bindung an GD₃, und diese Bindung war spezifisch.
Zur Bestätigung, daß diese anti-GD₃-Reaktivität tatsächlich IgG war, wurde Serum des Kaninchens 543 unter Verwendung von 45% NH₄SO₄ ausgefällt und das ausgesalzene Immunglobulin durch Größenausschlußchromatographie (Superose 6-Säule, Pharmacia) fraktioniert. 9 zeigt, daß der größte Teil des Proteins bei einem Molekulargewicht von etwa 120 kD eluierte, was mit IgG (145 bis 150 kD), jedoch nicht mit IgM (900 kD) übereinstimmte. 10 zeigt die anti-GD₃-Reaktivität jeder Fraktion, und es ist erkennbar, daß nur die 120 kD-Fraktion an GD₃ bindet.
Ergebnisse
BEC2 bindet an den Fab-Bereich von R24 und blockiert die R24-Bindung an GD₃-Ganglioside. Ferner bindet BEC2 an die beiden monoclonalen anti-GD₃-Antikörper C5 (IgG3) und K9 (IgM). Da BEC2 irrelevante leichte Ketten enthält, bindet BEC2 weder an andere monoclonale Mausantikörper, einschließlich der vier monoclonalen IgG3-Antikörper, noch an die Variante von R24.
BEC2 ist ein AB2-anti-idiotypischer monoclonaler Antikörper, da er an den GD₃ erkennenden Teil von R24 bindet. Wenn man sich die R24-Bindungsstelle als Matrize für GD₃ vorstellt und sowohl GD₃ als auch BEC2 zu dieser Matrize passen, dann maß BEC2 GD₃ gleichen. Unter Verwendung von serologischen Tests wurde gezeigt, daß BEC2 wirklich GD₃ ähnelt. BEC2 ist ein nützlicher Weg zur Immunisierung gegen GD₃ und daher als ein Impfstoff gegen Melanome und andere Tumore wichtig.
Zum Nachweis, daß BEC2 ein inneres Bild von GD₃ trägt, wurden NZW- Kaninchen mit BEC2 immunisiert und die Präimmun- und Immunseren auf einen Beweis für eine anti-GD₃-Reaktivität untersucht. Immunisierte Kaninchen entwickelten eine Antikörperantwort gegen GD₃, die durch ELISA und Immunblot gegen gereinigtes GD₃ und durch einen gemischten Hämadsorptionstest gegen eine menschliche GD₃+-Melanomzellinie nachweisbar war. Eine Spezifitätsanalyse zeigte, daß Immunseren nur GD₃ und nicht GM₁, GM₂, GM₃, GD_1a oder GT_1b erkannten; der monoclonale Antikörper BEC2 liefert also eine Strategie für eine aktive Immunisierung von Melanompatienten gegen GD₃.
Eine Immunisierung mit BEC2 induziert hohe Titer, spezifische IgM- und IgG-Antikörper gegen GD₃ in Kaninchen und IgM-Antikörper in syngenen (BALB/c × C57B1)F1-Mäusen.
Diese Experimente zeigen, daß BEC2 ein gegen R24 gerichteter anti-idiotypischer Maus-IgG2b-mAb ist und an die Antigen-Bindungsstelle von R24 bindet. Ferner bewirkt eine Immunisierung von Kaninchen mit BEC2 eine IgM- und IgG-Antwort gegen GD₃. Schließlich trägt BEC2 das innere Bild des Gangliosids GD₃, er ist daher zur Immunisierung gegen GD₃-Ganglioside nützlich.
Literaturhinweise

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9. Neuberger, et al. (1984) Nature (London), 312: 604;
10. Neuberger, M. J. et al. (1985) Nature (London), 314: 268–270.

Claims

Anti-idiotypischer Antikörper, bezeichnet als BEC2 und hergestellt mit dem Hybridom bezeichnet als BEC2-Hybridom (ATCC-Hinterlegungsnr. HB 10153).
Anti-idiotypischer Antikörper nach Anspruch 1, der mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.
Anti-idiotypischer Antikörper nach Anspruch 2, wobei der nachweisbare Marker ein Enzym ist.
Anti-idiotypischer Antikörper nach Anspruch 2, wobei der nachweisbare Marker ein Chromophor, ein Fluorophor, ein Radioisotop oder ein Schwermetall ist.
Hybridom bezeichnet als BEC2-Hybridom (ATCC-Hinterlegungsnr. HB 10153).
Arzneimittel umfassend den anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 6, das ein Impfstoff ist.
Impfstoff nach Anspruch 7 zur Hemmung einer Malignität in einem menschlichen Individuum, die mit der Expression von GD₃-Gangliosiden assoziiert ist, wobei der Impfstoff intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, topisch oder intradermal verabreicht wird.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die Malignität, die mit der Expression von GD₃-Gangliosiden assoziiert ist, jegliche Malignität einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Melanom, Plattenepithelcarcinom, Glioblastom, Sarcom, T-Zell-Leukämie, T-Zell-Lymphom, Hodgkin-Krankheit, kleinzelligem Carcinom der Lunge und Gehirntumor.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Hemmung einer mikrobiellen Infektion in einem Individuum, wobei das Individuum mit dem Impfstoff zur Induktion einer Immunantwort gegen ein Glykosphingolipid auf einer mikrobiellen Membran stimuliert wird, wodurch die mikrobielle Infektion gehemmt wird.
Arzneimittel umfassend: (a) den anti-GD₃-Antikörper R24 (ATCC-Hinterlegungsnr. HB 8445), markiert mit einem cytotoxischen Agens; und (b) den anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 1; wobei (a) und (b) aufeinanderfolgend verabreicht werden.
Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Behandlung von Malignitäten, die mit der Expression von GD₃-Gangliosiden assoziiert sind.
Arzneimittel nach Anspruch 11 oder 12, wobei das cytotoxische Agens in (a) ein Radioisotop, ein Arzneistoff oder ein Schwermetall ist.
Arzneimittel nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Malignität, die mit der Expression von GD₃-Gangliosiden assoziiert ist, eine Malignität ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Melanom, Plattenepithelcarcinom, Glioblastom, Sarcom, T-Zell-Leukämie, T-Zell-Lymphom, Hodgkin-Krankheit, kleinzelligem Carcinom der Lunge und Gehirntumor.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein Cytokin und einen R24-Antikörper (ATCC-Hinterlegungsnr. HB 8445), verknüpft mit einem Träger, wobei das Cytokin in einer Menge enthalten ist, die wirksam ist zur Stimulation der Bildung von Antikörpern in einem Individuum.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Cytokin Interleukin-1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Träger S. aureus ist.
Verfahren zur Herstellung des anti-idiotypischen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend das Züchten der Hybridomzelllinie und Isolieren des gewünschten Antikörpers, gegebenenfalls gefolgt vom Markieren des Antikörpers.
Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels nach Anspruch 6 oder 7 oder des Impfstoffes nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend das Kombinieren des anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 1 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend das Kombinieren jeweils des anti-GD₃-Antikörpers, markiert mit einem cytotoxischen Agens, und des anti-idiotypischen Antikörpers mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Herstellung der immunogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, umfassend das Kombinieren des Cytokins und des mit einem Träger verknüpften R24-Antikörpers.