DE69033606T2 - Verfahren zur verbesserung der wundheilung und gewebeerneuerung - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Kürzlich wurden natürlich gebildete Substanzen entdeckt, welche das Wachstum und die Heilung von Binde- und Stützgeweben fördern. Solche Substanzen wurden als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Wachstumsfaktoren, gewöhnlich Proteine, initiieren Programme von Differenzierung und/oder Entwicklung in einem Organismus.
• Obwohl Wachstumsfaktoren als ideal zur Induktion der Wiederherstellung von Stütz- und Bindegewebe erscheinen würden, sind solche Faktoren als pharmazeutische Agentien nicht praktisch einsetzbar. Wachstumsfaktoren sind nicht stabil und neigen dazu, bei der Lagerung abgebaut zu werden. Als Proteine eignen sich Wachstumsfaktoren nicht zur oralen Verabreichung, da sie verdaut und zerstört werden, bevor sie in den Blutstrom eintreten. Nachdem sie vom Körper nur langsam absorbiert und schnell abgebaut werden, können Wachstumsfaktoren als topische Salben nicht in zufriedenstellender Weise verabreicht werden. Als Folge der Labilität von Wachstumsfaktoren ist der bevorzugte Verabreichungsweg parenteral und erfordert somit eine ärztlich überwachte Verabreichung. Unglücklicherweise sind viele der Wachstumsfaktoren Spezies-spezifisch und werden von anderen Spezies als fremd erkannt. Somit besteht die ständige Gefahr, eine Immunantwort hervorzurufen. Zuletzt gibt es keinen Hinweis, daß Wachstumsfaktoren bei parenteraler Verabreichung gezielt Haut, Binde- und Stützgewebe aufsuchen.
• Mit der Ausnahme von bestimmten, kürzlich beschriebenen, natürlich vorkommenden Faktoren gibt es keinerlei Offenbarung oder Vorschlag im Stand der Technik bezüglich einer pharmazeutisch annehmbaren Verbindung, welche Haut, Binde- und Stützgewebe dazu veranlassen kann, neue Matrixkomponenten auf eine Weise zu synthetisieren, welche natürliche Bedingungen von Wachstum, Heilung und Wiederherstellung simuliert. Ferner gibt es keine Berichte über pharmazeutisch annehmbare Verbindungen, welche die Funktion von Matrix-bildenden Zellen normalisieren und zur Bildung von neuen normalen Haut-, Binde- und Stützgewebekomponenten führen, welche die Gewebewiederherstellung und -vermehrung erhöhen.
• US-A-4,529, 593, US-A-4,686, 104 und US-A-4,704,277 beschreiben Verfahren zur Verhinderung übermäßigen Calciumverlusts aus menschlichen Knochen durch die Verabreichung von pharmazeutisch annehmbaren Gallium-enthaltenden Verbindungen. Die Fähigkeit von Gallium-enthaltenden Verbindungen zu Inhibierung von Knochenresorption (Abbau) verhindert eine krankhafte Calcium-Homöostase.
Zusammenfassung der Erfindung
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Gallium-Verbindung eingesetzt zur Herstellung eines Medikaments, welches imstande ist, Gallium in löslicher Form bereitzustellen, zur Verwendung bei der Förderung von Binde- und Stützgewebewiederherstellung und -vermehrung, vorausgesetzt, daß das Gewebe kein Knochen ist.
Beschreibung der Erfindung
• Es wurde nun festgestellt, daß pharmazeutisch annehmbare Gallium- enthaltende Verbindungen, wie z. B. Galliumnitrat, die molekulare Wirkung von Transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) bezüglich der Induktion der Synthese von sowohl mRNA als auch Proteinen, die an der Wundheilung beteiligt sind, nachahmen. Insbesondere wurden bei Verwendung von Galliumnitratbehandelten Hautzellen Ergebnisse erhalten, welche anzeigen, daß der Wirkungsmechanismus von Gallium dem von TGF-β bei der Wundheilung ähnlich ist.
• Mechanismen der Wundheilung sind für Haut, Binde- und Stützgewebe ähnlich. Die angesprochenen Gewebe schließen nicht nur Haut, Knorpel und Sehnen ein, sondern auch diejenigen Gewebe, enthaltend eine aus einer Kollagen- Matrix gebildete stützende Fascie, die Muskeln und Organe einhüllen. Obwohl die Wundheilung eine komplexe Folge von Ereignissen erfordert, die nicht genau geklärt sind, ist es bekannt, daß Wachstumsfaktoren erforderlich sind. Solche Faktoren werden in die verletzte Region freigesetzt und wandern in die Wunde; dort stimulieren die Faktoren das Wachstum von Keratinozyten und Fibroblasten, initiieren die Angiogenese und stimulieren die Matrixbildung und Wiederherstellung der verletzten Region. Ten Dijke et al., "Growth Factors for Wound Healing", Bio/Technology, 7: 793-798 (1989).
• Aus den im folgenden präsentierten Daten ist ersichtlich, daß Galliumenthaltende Verbindungen die Wirkung von TGF-β nachahmen, indem sie direkt die Aktivität von Matrix-bildenden Zellen stimulieren und in der Folge die Bildung von Matrixkomponenten erhöhen. Matrix-bildende Zellen, welche die Strukturelemente von Binde- und Stützgeweben synthetisieren, sprechen auf Gallium-enthaltende Verbindungen auf ähnliche Weise an wie auf TGF-β, die Wachstumsfaktor ähnlichen Wirkungen dieser Verbindungen erhöhen die Wiederherstellung oder steigern die Festigkeit von Haut, Binde- und Stützgeweben. Die Mechanismen der Wundheilung sind in vielerlei Hinsicht für Mensch und Tiere ähnlich; somit sind tiermedizinische Anwendungen dieser Erfindung ebenfalls naheliegend.
• Wundheilung unter Beteiligung der Haut ist ein Beispiel von Gewebewiederherstellung. Ein Aspekt der Wundheilung bei der Haut beinhaltet die Bildung kritischer Matrixkomponenten, welche das architektonische und strukturelle Gittergerüst der Haut bilden. Die hauptsächliche Matrixkomponente ist Kollagen Typ I, ähnlich der Situation im Knochen. In der Haut sind es die Fibroblasten, welche neues Kollagen synthetisieren und in die Wundstelle freisetzen. Im Gegensatz zu Knochen ist diese Matrix nicht mineralisiert. Andere von Fibroblasten gebildete Proteine tragen zu der Matrix bei. Von einem solchen Protein, Fibronectin, wird angenommen, daß es als wichtiges Ankerprotein dient und dazu beiträgt, Schlüsselzellen an die darunterliegende Matrix zu binden. Fibronectin, dessen Synthese während der Wundheilung erhöht ist, wird ebenfalls von Fibroblasten gebildet.
• In der Haut ahmen die Wirkungen von Gallium-enthaltenden Verbindungen die Wirkungen von TGF-β nach, einem Faktor, von dem bekannt ist, daß er an der Wundheilung von Haut, Stütz- und Bindegeweben im ganzen Körper beteiligt ist. Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich somit zur Förderung der Hautheilung und der Heilung von anderen Binde- und Stützgeweben ebenso wie zur Vermehrung deren Masse durch die Synthese von Proteinen, welche mit der Wundheilung assoziiert sind, sogar in Abwesenheit einer speziellen Wunde. Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich aufgrund ihres Vermögens, natürliche Wachstumsfaktoren nachzuahmen, für die Verwendung zur Induktion der Bildung von Haut-, Bindegewebe-Matrixelementen und somit zur Steigerung der Festigkeit aller Binde- und Stützgewebe sowie zur Heilung von konkreten Verletzungen (Wunden) solcher Gewebe.
• Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß Galliumenthaltende Verbindungen der Stelle der Verletzung appliziert werden können. In einigen Fällen zeigt Gallium eine Tendenz, sich in speziellem Bindegewebe, wie z. B. Haut, anzureichern, und bietet den Vorteil, daß das Agens gezielt Gewebe aufsuchen kann, in denen es vorteilhafte Wirkungen besitzt. Frühere Lehren legten nahe, daß Gallium-enthaltende Verbindungen parenteral verabreicht werden müßten und somit einen Klinikaufenthalt und die Verabreichung relativ hoher Konzentrationen an Gallium erforderlich machten. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Gallium-enthaltende Verbindungen nun direkt der Stelle der Verletzung oder der Region, die einer Wachstumsförderung bedarf, appliziert werden, was zu geringeren Niveaus an Gallium in Serum, Organen und nicht beteiligtem Gewebe bei erhöhter Wirksamkeit an der Stelle der Verletzung und gleichzeitiger Verringerung des Risikos von Nebenwirkungen führt. Somit ist das bevorzugte Verabreichungsverfahren topisch.
• Die effektive Menge und das Verabreichungsverfahren der speziellen Gallium- Formulierung kann variieren je nach der Art des Zustands und der Störung, der bzw. die behandelt wird, dessen/deren Schwere, dem Alter des Patienten und anderen Faktoren, die für einen Fachmann offensichtlich sind. Im allgemeinen sind Galliumenthaltende Verbindungen aufgrund ihrer niedrigen Toxizität im therapeutischen Dosierungsbereich, ihrer Stabilität und Fähigkeit, in eine große Vielfalt von Vehikeln für zahlreiche Verabreichungswege inkorporiert zu werden, pharmazeutisch annehmbar.
• Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich für das Gebiet der Gewebe- Implantate. Gewebe-Implantate umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Knorpel-Transplantate, Sehnen-Transplantate und Haut-Tansplantate. Die Transplantate können vor ihrer Implantation selektiv mit topischen Anwendungen, die Gallium-enthaltende Verbindungen enthalten, beschichtet werden oder durch Tränken oder Eintauchen in Lösungen von Gallium-enthaltenden Verbindungen imprägniert werden.
• In anderen Binde- und Stützgeweben als Knochen erhöhen Gallium- enthaltende Verbindungen die Gewebebildung, um so die Wundheilung zu fördern und die Inkorporation von Transplantaten, z. B. Sehne, Knorpel und Haut, zu erleichtern.
• In der Haut erhöht die topische oder subkutane Verabreichung von Gallium- enthaltenden Verbindungen die Synthese neuer Haut-Matrix. Erhöhte Produktion der Bindegewebe-Matrixkomponenten würde die Heilung von Rissen, Öffnungen oder Defekten in der Haut erleichtern. Eine erhöhte Matrix-Synthese würde die Hautdicke erhöhen und dadurch Falten aufgrund von Alterung entfernen. Gallium-induzierte Matrixsynthese könnte eingesetzt werden, um selektiv Hautdefekte aufgrund einer früheren Verletzung, z. B. aufgrund von Akne oder einem früheren Trauma, auszufüllen. Somit könnten Gallium-Verbindungen neben den Anwendungen bei der Wundheilung viele dermatologische und kosmetische Anwendungen zur Behandlung von Hautstörungen haben.
• Gallium-enthaltende Verbindungen, insbesondere Galliumnitrat, in einer pharmazeutisch annehmbaren Form und in Dosen weit unterhalb derjenigen, welche als zytotoxisch bekannt sind, wurden nun befunden, günstige Wirkungen auf Osteoblasten, Fibroblasten und Keratinozyten auszuüben. Bei explantierten Geweben wurde festgestellt, daß eine Behandlung mit Galliumnitrat die Synthese von neuen Binde- und Stützgewebe-Matrixelementen erhöht.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung werden zur Erzielung der günstigen Wirkungen von Gallium pharmazeutisch annehmbare Gallium-enthaltende Verbindungen dem Patienten in einer Menge verabreicht, welche ausreicht, um therapeutische Niveaus des Elements Gallium bereitzustellen. Typischerweise werden im Falle der Wundheilung therapeutische Niveaus erreicht, wenn das Element Gallium in einer Gleichgewichtskonzentration im Blut von etwa 1-150 uM mit einem bevorzugten Bereich von etwa 1-50 uM vorhanden ist oder wenn das Element Gallium in Geweben in einer Gleichgewichtskonzentration von etwa 1-1000 ng/mg Trockengewicht des Gewebes mit einem bevorzugten Bereich von etwa 1-500 ng/mg Trockengewicht des Gewebes vorhanden ist. Falls jedoch Galliumenthaltende Verbindungen in der Nähe der Verletzungsstelle appliziert werden, können niedrigere Niveaus an Gallium im Körper aufrechterhalten werden. Beispielsweise würde das effektive Niveau an Gallium, welches an der Verletzungsstelle erforderlich ist, etwa 0,25-100 uM betragen und damit zu begrenzten Galliumniveaus im Blut und den Eingeweiden führen, da die Absorption von der Stelle relativ unbedeutend sein würde. Die Verabreichung von Gallium-enthaltenden Verbindungen würde aufhören, sobald eine Wundheilung eingetreten ist. Im Falle der Hautvermehrung sind geringere Konzentrationen an Gallium-enthaltenden Verbindungen erforderlich und die Verabreichung kann kontinuierlich erfolgen, beispielsweise als Gesichtscreme, die täglich aufgebracht wird.
• Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich zur Formulierung einer Vielfalt von Verabreichungswegen. Der/die Verabreichungsweg/e, der/die sich für eine spezielle Anwendung eignet/n, ist/sind für einen Fachmann offensichtlich. Verabreichungswege umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, topisch, transdermal, parenteral, gastrointestinal, transbronchial und transalveolar.
• Formulierungen von Gallium-enthaltenden Verbindungen, die sich zur topischen Anwendung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Implantate, Salben, Cremes, Spülungen und Gele. Formulierungen, die sich zur transdermalen Verabreichung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Suspensionen, Öle, Cremes und Salben, die direkt appliziert werden oder mit einem schützenden Träger, beispielsweise einem Pflaster, verbunden sind. Formulierungen, die sich zur parenteralen Verabreichung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, sterile Lösungen für intravenöse, intramuskulare, intraartikulare oder subkutane Injektion oder Infusion. Formulierungen, die sich zur gastrointestinalen Verabreichung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Dragees oder Flüssigkeiten zur oralen Aufnahme und Zäpfchen für die rektale Verabreichung. Formulierungen, die sich zur transbronchialen und transalveolaren Verabreichung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, verschiedene Typen von Aerosolen zur Inhalation. Die oben genannten Formulierungen sollen die Verfahren zur Verabreichung von Gallium-enthaltenden Verbindungen beschreiben, jedoch nicht beschränken. Die Verfahren zur Herstellung der verschiedenen Formulierungen liegen im Rahmen der Fähigkeit eines Durchschnittsfachmanns und werden hier nicht detailliert beschrieben werden.
• Bei der Haut sind Gallium-enthaltende Verbindungen für die Verwendung zur Behandlung von Rissen, Öffnungen, Brüchen, Implantaten und unzureichender Bindegewebsmasse indiziert.
• Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Wundheilung unter Beteiligung der Haut. Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich für dermatologische Zustände, welche die Haut betreffen. In jedem Fall sind Gallium-enthaltende Verbindungen in der Lage, eine Synthese neuer Hautmatrix zu induzieren und dadurch die Heilung zu beschleunigen. Neben den Vorteilen bei der Wundheilung kann eine Gallium-induzierte Matrixvermehrung in der Haut günstige kosmetische Wirkungen haben, z. B. bei der Beseitigung von Hautdefekten als Folge des Verlusts von Hautelementen, die zur Aufrechterhaltung der Fülle und Glätte des Gewebes erforderlich sind.
• Gallium-enthaltende Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Wunden in anderem Binde- und Stützgewebe als Knochen. Ein solches Gewebe umfaßt Knorpel, Sehne, Kollagen-enthaltende Gewebe, welche Organe und Fascien einhüllen. Kollagen-enthaltende Gewebe, die Organe einhüllen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Nieren- und Leberkapseln, die Meningen, das Pericard und die Pleura. Die sogenannten Weichteile von Haut, Muskel und Organen werden von einem Kollagen-enthaltenden Bindegewebe gestützt, das als Fascie bekannt ist, und es ist die Fascie, welche für die strukturelle Integrität und Wundheilung dieser Gewebe essentiell ist.
• Bei der Behandlung einer Verletzung von Binde- und Stützgewebe ist die Verabreichung von Gallium-enthaltenden Verbindungen in der Nähe der Wunde bevorzugt. Beispielsweise können Schnitte, Abschürfungen und Verbrennungen topisch mit Salben, Cremes, Spülungen oder Gels bedeckt werden oder durch die Anwendung von transdermalen Pflastern oder durch subkutane Verabreichung behandelt werden. Bei der Behandlung von Verletzungen von Haut, Sehne, Knorpel und Kollagen-enthaltenden Geweben, welche Organe einhüllen, ist die topische Verabreichung von Gallium-enthaltenden Verbindungen bevorzugt und die bevorzugten Verabreichungswege sind topisch und transdermal. Adäquate Niveaus an Gallium können auch durch systemische Verabreichung, z. B. parenteral, gastrointestinal, transbronchial oder transalveolar, erzielt werden.
• Ferner werden Sehnen-, Knorpel-, Fascie- und Haut-Transplantate allgemein zur Behandlung von zerissenem oder beschädigtem Gewebe eingesetzt. Diese Transplantate können vor der Implantation mit Spülungen oder Gelen, die Galliumenthaltende Verbindungen enthalten, bedeckt oder darin getränkt oder eingetaucht werden. Die topische Verabreichung von Gallium-enthaltenden Verbindungen eignet sich auch zur Förderung der Heilung von Sehnen-, Knorpel- und Hauttransplantaten. Die Gallium-enthaltenden Verbindungen induzieren die Matrixkomponenten- Synthese zur Erhöhung der Haftung, Fixierung und Stabilisierung von Implantaten durch Förderung von neuem Gewebewachstum auf das Implantat.
• Es wurde bereits gezeigt, daß der aktive Bestandteil in Gallium-enthaltenden Verbindungen das Element Gallium selbst ist und nicht irgendein Begleitsalz. Deshalb kann jede Verbindung, welche adäquate Blut- und Gewebeniveaus oder Gewebeniveaus des Elementes Gallium in der Nähe der Verletzungsstelle bereitstellt, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Galliumnitrat wurde in den folgenden Beispielen eingesetzt und ist repräsentativ für alle pharmazeutisch annehmbaren Gallium-enthaltenden Verbindungen, welche in der Lage sind, therapeutisch wirksame Niveaus des Elements Gallium zur Aufnahme durch den Patienten bereitzustellen. Der Gebrauch des Begriffs "Gallium-enthaltende Verbindung" bezeichnet eine oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Verbindung(en), welche zur Bereitstellung therapeutischer Niveaus des Elements Gallium in der Lage ist/sind. Solche Verbindungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Galliumnitrat, Gallium-phosphat, Galliumcitrat, Galliumchlorid, Galliumfluorid, Galliumcarbonat, Gallium-formiat, Galliumacetat, Galliumtartrat, Galliummaltol, Galliumoxalat, Galliumoxid und hydratisiertes Galliumoxid. Koordinationskomplexe von Gallium, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Gallium-Pyrone (wie z. B. diejenigen, die von Kojisäure abgeleitet sind), Gallium- Pyridone (wie z. B. Desferal), Gallium-Hydroxymate, Gallium-Aminocarboxylate oder Gallium-Oxime (wie z. B. 8-Hydroxychinolon) sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. An Proteine gebundenes Gallium, wie z. B. Transferrin oder Lactoferrin, jedoch nicht darauf beschränkt, illustriert eine weitere Klasse von Gallium-enthaltenden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Gallium wird durch im Stand der Technik bekannte Mittel an Proteine gebunden.
• Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden speziellen Beispiele weiter erläutert, welche den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
BEISPIEL 1 Die Wirkungen von Gallium-enthaltenden Verbindungen auf mRNA-Niveaus in Human-Fibroblasten- und Ratten-Osteoblasten-Zellinien
• Die in dieser Untersuchung eingesetzten Zellinien umfassen Human-Hautfibroblasten und eine Ratten-Osteosarkom-Tumorzellinie (ROS 17/2.8). Die Fibroblasten sind von menschlicher Haut abgeleitete Primärkulturen. Die Ratten- Osteosarkom-Zellinie ist eine permanente Zellinie, welche viele der charakteristischen Eigenschaften von Osteoblasten beibehält. Majeska et al., "Parathyroid Hormone: Responsive Clonal Cell Lines from Rat Osteosarcoma", Endocrinol., 107: 1494-1503 (1980). Zur Bestätigung der Spezifität von Gallium-enthaltenden Verbindungen und zum Vergleich der Verbindungen mit TGF-β wurden den Zellen mehrere Metall- und Fastmetallenthaltende Verbindungen, TGF-β oder ausgewählte Biphosphonat-Verbindungen verabreicht. Die Metall- und Fastmetall-Verbindungen umfaßten Eisen(III)-nitrat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(II)-chlorid, Aluminiumchlorid, Zinkchlorid, Galliumnitrat, Cisplatin und Spirogermanium. Die Metall- und Fastmetall- Verbindungen wurden bei 50 uM getestet. Die ausgewählten Bisphosphonate, welche EHDP und Clodronat (Cl&sub2;MDP) umfaßten, wurden in Konzentrationen verabreicht, die bekanntermaßen antiresorptive Aktivität aufweisen. TGF-β wurde bei 5,0 ng/ml getestet. Die Fibroblasten und Osteoblasten wurden den Verbindungen 24-48 h lang ausgesetzt, wonach die gesamte zelluläre RNA mittels Guanidiniumisothiocyanat-Extraktion und Ultrazentrifugation durch Cäsiumchlorid isoliert wurde. Chirgwin et al., "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochem., 18: 5294-5299 (1979). Die RNA wurde durch Elektrophorese auf einem denaturierenden MOPS-Formaldehyd- Agarosegel (Biorad Products, Rockville Center, NY) aufgetrennt, auf Nytran-Filter (Schleicher und Schuell, Keene, NH) überführt und mit [³²P]dCTP (New England Nuclear) markierten cDNA-Sonden, die für die Matrixproteine spezifisch waren, hybridisiert. Die Sonden umfaßten: α&sub1;(I)-Prokollagen, Osteocalcin, Osteonectin, Osteopontin, Fibronectin, und konstitutiv synthetisierte Proteine wie Tubulin und α- Actin als Kontrollen. Die radioaktive Markierung der Sonden erfolgte nach dem statistischen Priming Verfahren von Feinberg et al., "A Technique for Radiolabeling DNA Restriction Endonuclease Fragments to High Specific Activity", Anal. Biochem., 132: 6-13 (1983). Diese Sonden wurden von den Drs.: David Rowe (α&sub1;(I)- Prokollagen, University of Connecticut, Storrs, CT), P. Robey (Osteopontin, Osteonectin, National Institutes of Health, Bethesda, MD), John Wozney (Osteocalcin, Genetics Institute, Cambridge Park, MA), R. Hynes (Fibronectin, Rockefeller University, New York, N. Y.) und Lydia Pan (α-Actin, Stanford, Palo Alto, CA) erhalten. Die Hybridisierung der Sonden mit den Filtern erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers. Die hybridisierten Filter (Northern-Blots) wurden unter stringenten Bedingungen gewaschen und damit ein Röntgenfilm belichtet.
• Nach der Entwicklung des Röntgenfilms wurden die Banden, die den mRNAs von Prokollagen, Fibronectin, Osteopontin, Osteocalcin und α-Actin entsprachen, gescannt, um eine Abschätzung der prozentualen Veränderung der mRNA-Niveaus nach Galliumnitrat-Behandlung im Vergleich zu Kontrollzellen, die nicht mit Galliumnitrat behandelt worden waren, zu ergeben. Die Röntgenfilme wurden unter Verwendung eines LKB Modell 2202 Ultroscan Laser-Densitometers gescannt. Die in Tabelle 1 dargestellten Zahlen repräsentieren die prozentuale Veränderung im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
• Die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse zeigten, daß nur das Galliumnitrat und der TGF-β eine Erhöhung an α&sub1;(I)-Prokollagen-, Osteonectin- und FibronectinmRNA bei gleichzeitiger Verringerung an Osteocalcin verursachten. Dieses Ergebnis zeigt, daß nur Galliumnitrat die Veränderungen nachahmt, welche zu beobachten sind, wenn dieselben Zellen TGF-β ausgesetzt werden. Überraschenderweise verursachten sowohl Eisen(III)-chlorid als auch Zinkchlorid etwa 2-3fach erhöhte Niveaus an Osteocalcin-mRNA, eine Wirkung, die der von Gallium und TGF-β entgegengesetzt ist. TABELLE I PROZENTUALE VERÄNDERUNG DER MATRIXPROTEIN-mRNA-NIVEAUS NACH GALLIUM-BEHANDLUNG
• Somit erhöht Galliumnitrat, nicht jedoch andere Metall- oder Fastmetallenthaltende Verbindungen oder Biphosphonate, die Synthese von mRNA, die für Schlüsselkomponenten der Stroma-Matrix kodiert. Es gab keinen Hinweis auf eine Erhöhung der TGF-β-Aktivität in den Kulturmedien von Zellen, die Galliumnitrat ausgesetzt waren, was nahelegt, daß die Matrix-erhöhende Wirkung direkt durch Galliumnitrat vermittelt wurde, nicht indirekt mittels Induktion von TGF-β-Synthese. Ferner scheinen mehrere andere Metalle die Produktion von Osteocalcin zu induzieren, was zu verminderter Matrixbildung führen würden.
BEISPIEL 2 Gallium-Wirkung auf die Human-Keratinozvten-Proliferation
• Ein kritischer Schritt bei der Wundheilung von Hautrissen und -öffnungen ist die erneute Epithelbildung der Wunde. Ein erster Schritt bei der Wundheilung ist die Proliferation von speziellen Hautzellen, die als Keratinozyten bekannt sind. Diese Zellen wachsen von den Rändern in eine Wunde, um eine schützende Zellbarriere über der Wunde bereitzustellen. Derzeit sind die endogenen natürlichen Wachstumsfaktoren in der Haut, welche diese kritische Proliferation initiieren können, nicht vollständig identifiziert. Wenn frisch isolierte Human-Keratinozyten mit Galliumnitrat behandelt wurden, induzierten niedrige Konzentrationen an Gallium eine proliferative Reaktion.
• Human-Keratinozyten wurden aus Spalthaut-Hautproben, entnommen aus Leichen wie bereits beschrieben, Staino-Coico et al., "Human Keratinocyte Culture", J. Clin. Invest., 77: 396404 (1986), präpariert. In Kürze, die Gewebeproben wurden in sterilem Eagle's Minimum Essential Medium, enthaltend Antibiotika zur Verhinderung von Bakterien- und Pilzwachstum, suspendiert. Das Gewebe wurde 90 Minuten lang bei 37ºC in phosphatgepufferte Salzlösung gelegt, die 0,5% Trypsin enthielt, jedoch frei von Calcium und Magnesium war. Einzelzell-Suspensionen wurden durch die Zugabe von 0,25%iger DNase I und dann fötalem Kalbserum, gefolgt von Filtration durch sterile Gaze, hergestellt. Die isolierten Zellen wurde durch Zentrifugation geerntet, dann in Medien, die 20% fötales Rinderserum, ergänzt mit Aminosäuren, Hormonen und Antibiotika enthielten, resuspendiert. Alle Reagenzien und Medien wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO., erhalten.
• Durch Messung der Keratinozyten-Zellzahlen wurde gezeigt, daß eine Konzentration von 10 uM ausreichend war, um eine Verdoppelung der Keratinocyten-Zellzahl nach 7 Tagen zu ergeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Zellzählung in Millionen angegeben ist und unbehandelte Zellen die Kontrolle darstellen. TABELLE 2 Wirkung von Gallium auf Human-Keratinozyten
• Erhöhte Keratinozyten-Proliferation bedeutet, daß die Wundheilung beschleunigt ist. Die Schutzbarriere über der Hautwunde wird somit früher etabliert, was es der nachfolgenden Heilung ermöglicht, in einer geschützten und sterilen Umgebung abzulaufen. Die Wundinfektion aufgrund unzureichender Versiegelung der Wunde ist wahrscheinlich eines der Haupthindernisse bei der Wundheilung. Zusammen mit der bekannten Erhöhung der Fibroblasten-Produktion von Schlüssel- Matrixkomponenten erleichtert und beschleunigt die Behandlung von Hautwunden mit einer Gallium-enthaltenden Verbindung die Wundheilung sehr.

Claims (5)

1. Verwendung einer Gallium-Verbindung zur Herstellung eines Medikaments, welches zur Bereitstellung von Gallium in löslicher Form in der Lage ist, zur Erhöhung der Binde- und Stützgewebewiederherstellung und -vermehrung, vorausgesetzt, daß das Gewebe nicht Knochen ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Gallium-Verbindung Galliumnitrat, Galliumcitrat, Gallium-phosphat, Galliumchlorid, Galliumfluorid, Galliumcarbonat, Galliumacetat, Galliumtartrat, Galliummaltol, Galliumoxalat, Galliumformiat, Galliumoxid, hydratisiertes Galliumoxid, ein Koordinationskomplex von Gallium oder ein Protein-gebundenes Gallium ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Koordinationskomplex ein Gallium- Pyron, Gallium-Pyridon, Gallium-Hydroxymat, Gallium-Aminocarboxylat oder Gallium-Oxim ist und das Protein Transferrin oder Lactoferrin ist.

4. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament an eine topische, transdermale, parenterale, intraartikulare, gastrointestinale, transbronchiale oder transalveolare Verabreichung angepaßt ist.

5. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Gewebe aus Haut, Knorpel, Sehne, Fascie und Kollagen-enthaltenden Geweben, welche Organe einhüllen, ausgewählt ist.