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Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Behandlung von
Menschen und Tieren, bevor diese durch Chemotherapeutika, Bestrahlung und
andere Mittel belastet werden, die im Zellzyklus befindliche Stammzellen
irreparabel schädigen, sowie ein Mittel zur Wachstumshemmung von
Stammzellen, das sich für diese Behandlung verwenden läßt.
Querverweis auf damit im Zusammenhang stehende Patentanmeldungen
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Die vorliegende Anmeldung ist eine CIP ("continuation-in-part"-
Anmeldung) der am 25. September 1989 eingereichten US-Patentanmeldung
07/412,303.
Technischer Hintergrund
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Bei der Behandlung von Personen mit Carcinomen umfaßt die
herkömmliche Chemotherapie die Anwendung von einem oder mehreren
zellzyklusspezifischen, cytotoxischen Mittel(n), die den Nachteil haben, daß
sowohl normale als auch Carcinomzellen, die sich in Teilung befinden,
abgetötet oder irreparabel geschädigt werden. Diese Chemotherapeutika, wie
z. B. Cytosin-Arabinosid (ara-C), werden mit dem Ziel verwendet, die sich
teilenden Carcinomzellen zu zerstören oder so zu behindern, daß ein weiteres
Wachstum der Carcinomzellen verhindert wird. Eine bisher nicht vermeidbare
Wirkung der Chemotherapie ist jedoch die Zerstörung von anderen, sich
normal teilenden Zellen, insbesondere von Stammzellen des
Blutbildungssystems und der Epithel-Stammzellen, die das Oberflächengewebe
von Kopfhaut und Darm-Trakt bilden. Die durch Chemotherapeutika
verursachte Schädigung der Stammzellen führt zu den üblichen
Nebenwirkungen, wie z. B. Haarausfall, Schädigung des Magen-Darm-Trakts,
Hautschädigung, Knochenmarksuppression, Blutarmut, verminderter Funktion
des Immunsystems oder der Immunreaktion sowie der sich daraus ergebenden
erhöhten Anfälligkeit für Infektionen.
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Eine charakteristische Eigenschaft der Stammzellen ist ihre Inaktivität
innerhalb des Zellzyklus. Wenn das Knochenmark "angegriffen" wird, wie z. B.
durch Behandlung mit Medikamenten, Strahlen, bei schwerem Blutverlust,
Entzündungsreaktionen oder Infektionen, reagieren die Stammzellen durch
einen Rückkopplungsmechanismus, indem sie in den Zellzyklus eintreten und
sich zu reiferen Vorläuferzellen entwickeln, die sich ihrerseits in die
benötigten reifen Zellen des Blutbildungs-, Immun- oder Epithelsystems
differenzieren.
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Da die Blut-Stammzellen für die Entwicklung aller reifen (differenzierten)
Zellen der Blutbildungs- und Immunsysteme notwendig sind, ist ihr Überleben
für die Wiederherstellung eines voll funktionsfähigen Wirtsabwehrsystems bei
mit Chemotherapeutika behandelten Patienten lebensnotwendig. Das
Überleben der Epithel-Stammzellen ist ferner für die Reparatur der
Epithelauskleidungen von Organen, einschließlich der Haut, notwendig. Da
hohe Dosen zellzyklusspezifischer Chemotherapeutika, wie z. B. ara-C,
Stammzellen des Blutbildungssystems und der Epithelgewebe wirksam abtöten,
leiden mit diesen Mitteln behandelte Patienten unter ernsten Nebenwirkungen
und sind häufig von schweren Infektionskrankheiten bedroht.
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Eine ähnliche Zerstörung der Stammzellen tritt bei Belastung mit
verschiedenen Strahlendosen auf, gleichgültig, ob die Bestrahlung für
therapeutische Zwecke verwendet wird oder ob sie das Ergebnis einer
zufälligen bzw. unvermeidbaren Strahlenbelastung ist, wie sie z. B. Personen
erfahren, die mit Räumungarbeiten beschäftigt sind oder sich am Ort eines
nuklearen Unfalls in einem Kraftwerk oder an Bord eines Atom-U-Bootes
befinden. Bei strahlenbelasteten Personen werden auch die Blut-Stammzellen
zerstört, was zu vollständigem Versagen oder schwerer Schädigung der
Blutbildungs- und Immunsysteme führt. Durch Strahlung werden auch sich
teilende Epithelzellen abgetötet, wodurch viele Epithelgewebe geschädigt
werden.
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Bei Patienten, die mit Chemotherapeutika oder Strahlen belastet sind,
werden gegenwärtig zur Stimulierung der Entwicklung bestimmter
Blutzellfamilien Mittel, wie z. B. Koloniestimulierende Faktoren wie M-CSF, CSF-
1, GM-CSF und dergleichen, verwendet. Man kann aber davon ausgehen, daß
diese Mittel das Blutbildungssystem nicht wiederherstellen können, wenn nach
einer derartigen Belastung die Stammzellen beim Patienten nicht mehr in
ausreichender Menge vorhanden sind.
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Auf dem Fachgebiet besteht daher weiterhin Bedarf an anderen
therapeutischen Mitteln, die Stammzellen vor den schädlichen Wirkungen von
Chemotherapie oder Strahlung schützen können.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der Deckung dieses auf dem
Fachgebiet bestehenden Bedarfs durch Bereitstellung der in den
Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen. Ein Aspekt der
vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung eines menschlichen
Polypeptids, das eine Hemmwirkung auf Stammzellen ausübt, zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung von Personen, bevor diese mit einem Mittel
behandelt werden, das sich teilende oder im Zellzyklus befindliche Stammzellen
abtöten kann. Die durch dieses Verfahren geschützten Stammzellen können
Blut-Stammzellen sein, die sich normalerweise im Knochenmark befinden und
teilen. In einer anderen Ausführungsform kann es sich dabei um Epithel-
Stammzellen handeln, die sich beispielsweise in den Eingeweiden, der Kopfhaut
oder anderen Körperbereichen befinden. Das erfindungsgemäße Verfahren
kann wünschenswerterweise bei Menschen angewendet werden, obwohl das
Verfahren auch die Behandlung von Tieren umfaßt.
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Das in diesem Verfahren verwendete Mittel zur Hemmung von Stammzellen
umfaßt eine wirksame Menge eines Polypeptids oder eines Proteinfragments,
das in der vorliegenden Beschreibung als Stammzellen-hemmender Faktor
(SCIF) bezeichnet und nachstehend genauer beschrieben ist.
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In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Schutz und zur Wiederherstellung der Blutbildungs-,
Knochenmarks- und Immunsysteme eines chemotherapeutisch behandelten
Patienten bereit, das die Verabreichung einer wirksamen SCIF-Menge an den
Patienten umfaßt. SCIF kann vor der Chemotherapie verabreicht werden. In
einer anderen Ausführungsform kann SCIF während der Chemotherapie
verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die SCIF-
Verabreichung in einem bestimmten Zeitraum nach der
chemotherapeutischen Behandlung. Nach der Chemotherapie kann der Patient
mit anderen therapeutischen Mitteln behandelt werden, wie z. B. mit
Koloniestimulierenden Faktoren oder anderen Lymphokinen, die die
Stammzellen zur Teilung und ferner die Produktion reiferer Zellen der Blut-
Zellfamilien anregen.
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In einer weiteren Ausführungsfprm umfaßt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur unterstützenden Behandlung von beliebigen Carcinomen,
einschließlich der durch feste Tumoren gekennzeichneten Carcinomarten,
wobei Krebspatienten eine wirksame SCIF-Menge zum Schutz der Blut-
Stammzellen des Knochenmarkes verabreicht wird, wodurch höhere
Chemotherapeutika- oder Bestrahlungsdosen zur Carcinombehandlung
eingesetzt werden können.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die
Behandlung von Leukämie und umfaßt die Behandlung von
Knochenmarkszellen, die proliferierende Leukämiezellen enthalten, mit einer
wirksamen SCIF-Menge zur Hemmung der Proliferation normaler Stammzellen
und die Behandlung des Knochenmarks mit einem cytotoxischen Mittel zur
Zerstörung von Leukämiezellen. Dieses Verfahren kann durch eine
Nachbehandlung des Knochenmarks mit anderen Mitteln, die seine
Proliferation stimulieren, z. B. Lymphokinen, verbessert werden. Dieses
Verfahren kann in vivo durchgeführt werden. In einer anderen
Ausführungsform kann das Verfahren ex vivo durchgeführt werden, wobei die
Leukämiezellen durch das Chemotherapeutikum aus dem entnommenen
Knochenmark entfernt werden. Das Mark kann danach dem Patienten erneut
injiziert werden.
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In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren die
Behandlung von Patienten, die an einer durch proliferierende Stammzellen
verursachten Krankheit leiden. Derartige Krankheiten, wie z. B.
Schuppenflechte, können behandelt werden, indem dem Patienten eine
wirksame SCIF-Menge zur teilweisen oder vollständigen Hemmung der
Proliferation der betreffenden Stammzellen verabreicht wird.
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Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die
folgende genaue Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der
Erfindung deutlich.
Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum reversiblen Schutz von
Stammzellen vor Schäden durch cytotoxische Mittel bereit, die in Teilung
befindliche Stammzellen abtöten können. Das Verfahren umfaßt die
Verabreichung einer wirksamen Menge des Stammzellen-Hemmfaktors (SCIF)
an einen Patienten, bevor dieser mit einem cytotoxischen Mittel behandelt
wird. Zur Erhöhung der Schutzwirkung auf Stammzellen kann das Verfahren
auch eine Verlängerung der SCIF-Behandlung über den gesamten Zeitraum der
cytotoxischen Behandlung hinweg umfassen.
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SCIF kann die Teilung verschiedener Stammzellen im menschlichen Körper
reversibel hemmen. SCIF läßt sich insbesondere für die vorübergehende
Hemmung sich teilender Blut-Stammzellen einsetzen. SCIF hemmt außerdem im
Zellzyklus befindliche oder sich teilende Epithel-Stammzellen, die im ganzen
Körper zu finden sind. Andere Stammzellpopulationen, auf die SCIF eine
reversible Hemmwirkung ausüben kann, umfassen männliche und weibliche
Keimzellen. SCIF kann daher zum Schutz männlicher oder weiblicher Patienten
vor Keimzell-Aplasie eingesetzt werden, die nach Chemotherapie auftreten
kann. Da Chemotherapeutika häufig Haarausfall und
Schleimhautentzündungen verursachen, kann SCIF außerdem verwendet
werden, um Haarfollikel und Epithel-Stammzellen der Mundhöhle bzw. des
Verdauungstraktes vor nachteiligen, durch Chemotherapie oder Bestrahlung
verursachte Nebenwirkungen reversibel zu schützen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher zur Linderung von
unerwünschten Nebenwirkungen der Chemotherapie auf die Blutbildungs-,
Knochenmarks- und Immunsysteme des Patienten eingesetzt werden, indem
Stammzellen vor Schäden geschützt werden, die durch Chemotherapeutika
verursacht werden, wie z. B. normalerweise zur Zerstörung von Carcinomzellen
verwendete cytotoxische Mittel oder Bestrahlungsdosen. Eine derartige
Anwendung von SCIF kann auch dem Schutz der Epithel-Stammzellen während
der Chemotherapie dienen. SCIF kann dem Patienten in einer Dosis verabreicht
werden, die zur Hemmung der Stammzellteilung über einen Zeitraum ausreicht,
der für die Wirkung des Chemotherapeutikums hinreichend lang ist. Nachdem
das chemotherapeutische Mittel seine Funktion erfüllt hat, können die durch
SCIF gehemmten Stammzellen ohne weitere Behandlung wieder in den Zustand
der Zellteilung zurückkehren. Falls eine erhöhte Reversion der Blut-
Stammzellen erwünscht ist, kann der Patient Dosen blutbildender
Wachstumsfaktoren oder Cytokine erhalten, die zur Stimulierung des
Wachstums und der Entwicklung von Blutzellen verwendet werden.
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Die Mehrzahl der zur Krebs-Chemotherapie verwendeten
Chemotherapeutika besitzt eine relativ kurze in vivo-Halbwertszeit, die
meistens weniger als 24 Stunden beträgt. Gemäß der vorliegenden Erfindung
bleibt die Hemmwirkung von SCIF zumindest für den größten Teil des Zeitraums
erhalten, in dem das chemotherapeutische Mittel in vivo wirkt. Bei
cytotoxischen Mitteln mit längeren Halbwertzeiten (z. B. länger als 24 Stunden)
wird auch eine längere Behandlung mit SCIF erforderlich sein. Die normalen
physiologischen Mechanismen im Patienten begrenzen wahrscheinlich die
effektive Dauer der SCIF-Aktivität auf Stammzellen, die sich im Zellzyklus
befinden.
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Das Verfahren läßt sich auch verwenden, um Patienten gegen andere
Strahlenbelastungen zu schützen, die ihre Knochenmarkszellen schädigen.
Man kann einer Person SCIF verabreichen, wenn unbeabsichtigte oder durch
einen Unfall bedingte Belastungen mit gefährlichen Strahlenwerten zu
erwarten sind. Beispielsweise können Personen, die Gefahr laufen, einer
kurzzeitigen Strahlenbelastung ausgesetzt zu sein, wenn sie Gebiete mit
radioaktivem Niederschlag betreten oder Kernkraftwerke bzw. Atom-U-Boote
und dergleichen nach dem Austritt gefährlicher Strahlung untersuchen und
reinigen, mit diesem Verfahren behandelt werden, um eine bei der Strahlung
auftretende Replikationsteilung der Stammzellen zu hemmen. Sowohl während
als auch vor der Strahlenbelastung kann eine SCIF-Verabreichung erhöhten
Schutz bieten.
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Im vorliegenden Verfahren kann SCIF außerdem als unterstützende
Behandlung zur chemotherapeutischen Krebsbehandlung verwendet werden.
Bei der Bestimmung der Strahlendosis oder der Dosis des cytotoxischen
Medikaments, die einem Patienten verabreicht werden kann, stellt das
Knochenmark den limitierenden Faktor dar. SCIF kann daher zum Schutz der
Knochenmarks-Blutzellen vor Strahlung oder Chemotherapeutika verwendet
werden. Dadurch können größere Strahlen- oder Medikamentendosen zur
Behandlung eines normalerweise mit Bestrahlung oder Chemotherapie
behandelbaren Carcinoms angewendet werden. Da die toxische Wirkung der
cytotoxischen Medikamente auf das Knochenmark auch ihre Dosierung
während der Chemotherapie einschränkt, können dem Patienten bei
Verabreichung von SCIF die Medikamente wahrscheinlich in höheren Dosen
gegeben werden, ohne daß die schweren Nebenwirkungen auftreten, die
normalerweise derart erhöhte Dosierungen begleiten würden.
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Das Verfahren kann auch zur Behandlung fester Tumore verwendet
werden, indem während der chemotherapeutischen Behandlung die Teilung
von Epithel-Stammzellen gehemmt wird.
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SCIF kann auch in Verfahren zur Herstellung von autologem
Knochenmark, das transplantiert werden soll, eingesetzt werden. Das
Knochenmark kann ex vivo mit einer wirksamen SCIF-Menge zur Hemmung
der Stammzellteilung behandelt und danach durch Verabreichung einer
wirksamen Menge eines Chemotherapeutikums oder Bestrahlung von
Krebszellen befreit werden. Das so behandelte Knochenmark kann erneut in
den autologen Spender injiziert werden. Gegebenenfalls kann der Patient dann
mit einem bekannten Mittel zur Stimulierung der Blutbildung behandelt
werden.
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SCIF kann auch im erfindungsgemäßen Verfahren in der
Leukämiebehandlung unterstützend eingesetzt werden. Wenn beispielsweise
die Leukämiezellen auf SCIF nicht reagieren, können die Knochenmarks-
Leukämiezellen ex vivo mit SCIF behandelt werden. Die Proliferation normaler
Stammzellen wird durch die Verabreichung von SCIF verhindert. Während der
Behandlungszeit der proliferierenden Leukämiezellen mit einem cytotoxischen
Mittel kann daher eine bestimmte Menge normaler Stammzellen vor
Schädigung geschützt werden. Während der Behandlung mit Medikamenten
oder Bestrahlung kann außerdem ein stimulierendes Cytokin, wie z. B. IL-3 oder
GM-CSF, zur Induzierung des Zellzyklus in den Leukämiezellen verabreicht
werden, während die normalen Stammzellen mit SCIF geschützt werden.
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Zur ex vivo-Verwendung kann das Knochenmark mit SCIF behandelt
werden, um die Teilung von Stammzellen zu hemmen. Die Stammzellen werden
dadurch vor Zerstörung durch eine anschließende Chemotherapie geschützt,
die am Knochenmark oder am Entstehungsort eines anderen Carcinoms ansetzt
und auf die Zerstörung von im Zellzyklus befindlichen Zellen, z. B.
Leukämiezellen, abzielt. Das resultierende gereinigte Knochenmark kann
erneut dem Patienten injiziert werden. Im Körper des Patienten beginnen sich
die Stammzellen normal zu teilen. Zur Verbesserung der Teilung von Blut-
Stammzellen können auch die vorstehend erwähnten Lymphokine und
Cytokine verabreicht werden. Das gleiche Verfahren kann durch
Verabreichung von SCIF an den Patienten in vivo durchgeführt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Behandlung von
Krankheiten angewendet werden, die mit hyperproliferierenden Stammzellen
im Zusammenhang stehen. Die Schuppenflechte ist beispielsweise eine
Krankheit, die durch hyperproliferierende Epithelzellen der Haut verursacht
und manchmal mit cytotoxischen Medikamenten behandelt wird. Die in situ-
Dysplasie des Cervicalepithels hat ähnliche Ursachen und entwickelt sich zu
Gebärmutterhalskrebs, wenn sie nicht behandelt wird. Beide
Übergangszustände können mit SCIF prophylaktisch behandelt werden. Andere
präneoplastische Schädigungen, an denen die Stammzellproliferation beteiligt
ist, können wahrscheinlich auch mit SCIF-Mengen behandelt werden, die die
Stammzellproliferation vollständig oder teilweise hemmen. Für diese
Anwendungen können sowohl SCIF enthaltende topische oder transcutane
Mittel als auch andere parenterale Mittel zur Verabreichung von SCIF
eingesetzt werden.
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Die SCIF-Polypeptide können auch in einem anderen erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden. Mit Hilfe von Standardverfahren können gegen
SCIF gerichtete monoclonale oder polyclonale Antikörper entwickelt werden.
Die Antikörper oder die SCIF-Polypeptide können mit nachweisbaren
Markierungen versehen werden, von denen auf dem Fachgebiet viele Typen
bekannt sind. Für diagnostische Zwecke können die markierten SCIF-
Polypeptide oder die gegen SCIF gerichteten Antikörper als Stammzellmarker
zur Identifizierung und Isolierung von Stammzellen dem Patienten direkt
verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform können die
markierten Polypeptide oder Antikörper bei Knochenmarkspräparaten zur
Identifizierung von Stammzellen ex vivo eingesetzt und somit vor den
Reinigungsverfahren entfernt werden. In gleicher Weise können markierte
Polypeptide oder Antikörper zur Isolierung und Identifizierung von Epithel-
Stammzellen oder anderen Stammzellen eingesetzt werden.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß das in den
folgenden Verfahren und Beispielen eingesetzte SCIF ein Maus-Protein ist, das
zu bereits identifizierten Proteinfaktoren homolog ist. K. Obaru et al., L
Biochem., 99 (1986), 885-894, haben die Aminosäure- und DNA-Sequenz eines
Gens bestimmt, von dem festgestellt wurde, daß es durch tumorfördernde Mittel,
wie z. B. Phorbolester in menschlichen Tonsillenlymphocyten, induziert
werden kann. Die Autoren machten die Voraussage, daß das Gen ein Protein
produziert, daß als Signal zur T-Zell-Proliferation dienen kann. Vor kurzem
berichteten P. F. Zipfel et al., J. Immunol., 142 (1989), 1582-1590, daß das gleiche
Protein durch eine mitogene Aktivierung menschlicher T-Zellen produziert
wird, und stellten die Hypothese auf, daß das Protein als Lymphokin oder
Cytokin wirken kann.
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Beim vorliegenden Verfahren wird daher für die Behandlung von
Menschen wünschenswerterweise der menschliche SCIF-Faktor eingesetzt.
Dieser SCIF-Faktor kann das menschliche Polypeptid sein, das von Sequenzen
codiert wird, die dem Stand der Technik entsprechen. Die SCIF-Sequenz von
Obaru/Zipfel ist nachstehend in Tabelle I gezeigt. In einer anderen
Ausführungsform kann der Faktor wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben,
gewonnen werden. Das menschliche SCIF-Analog wurde aus einer
menschlichen T-Zellinie unter Verwendung von Oligodesoxyribonucleotiden
gewonnen, die auf der vorstehend erwähnten, von Obaru et al.
veröffentlichten LD-78-Sequenz beruhen. Das menschliche SCIF-Polypeptid
zeigt im Menschen eine Wirksamkeit, die mit der Wirksamkeit des Maus-
Proteins in den nachstehend beschriebenen SCIF-Untersuchungen identisch
ist.
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Der menschliche SCIF-Clon in Beispiel 1 ist weitgehend sequenziert worden.
Es ist festgestellt worden, daß sich der Clon sowohl in der Nucleotid- als auch in
der Aminosäuresequenz von der veröffentlichten Sequenz unterscheidet,
obwohl er die erforderliche Wirksamkeit zeigt. Die alternativen DNA- und
Aminosäuresequenzen von menschlichem SCIF sind nachstehend in Tabelle II
aufgeführt. Die Sequenz in Klammern ist bisher noch nicht bestimmt worden.
Die Sequenz, die in Tabelle II in Klammern gezeigt ist, stammt aus der von Obaru
et al. veröffentlichten LD-78-Sequenz. Sie kann, muß aber nicht, mit der
Sequenz des menschlichen SCIF-Clons identisch sein. Die Nucleotidsequenz-
Unterschiede zwischen der clonierten SCIF-Sequenz von Beispiel 1 und der
veröffentlichten Sequenz von Obaru sind in Tabelle II durch Sternchen
gezeigt, die sich oberhalb der modifizierten oder zusätzlichen Aminosäuren
bzw. unterhalb der modifizierten Nucleotide befinden. Striche zeigen
nichtcodierende Sequenzen, die in der Sequenz von Beispiel 1 nicht
vorkommen. Die beiden SCIF-Sequenzen unterscheiden sich in 18 Nucleotiden
und 4 Aminosäuren. Im Gegensatz zur veröffentlichten Sequenz umfaßt der
menschliche Clon außerdem 3 zusätzliche Nucleotide und eine zusätzliche
Aminosäure.
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Als SCIF-Molekül lassen sich in der vorliegenden Erfindung jedoch auch
andere Proteine verwenden, die von anderen, mit den Sequenzen des Standes
der Technik nicht identischen DNA-Sequenzen codiert werden. Solche DNA-
Sequenzen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A
Laboratory Manual). (1982), Seiten 387-389, Cold Spring Harbor Laboratory] mit
den menschlichen SCIF-DNA-Sequenzen (oder der Sequenz von Obaru et al.)
hybridisieren können und bei der Expression Polypeptide oder Proteine
codieren, welche die in der vorliegenden Erfindung beschriebene SCIF-
Wirksamkeit zeigen können, wobei stringente Hybridisierungs-Bedingungen
eine Hybridisierung in 4 · SSC bei 65ºC, der ein einstündiges Waschen in 0,1 ·
SSC bei 65ºC folgt, oder eine Hybridisierung in 50% Formamid, 4 · SSC bei 42ºC
umfassen.
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In ähnlicher Weise können weitere SCIF-Polypeptide mit Hilfe von
Aminosäuresequenzen charakterisiert werden, die sich von der Sequenz von
Obaru et al. oder der aus dem Clon von Beispiel 1 gewonnenen Sequenz
aufgrund von Allelvariationen (natürlich auftretende Basenveränderungen in
der Population einer Art, die zu einer Aminosäureänderung oder auch nicht
führen kann) unterscheiden. In der vorliegenden Erfindung dürften sich
auch SCIF-Polypeptide verwenden lassen, die von DNA-Sequenzen codiert
werden, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder
aufgrund von Allelvariationen Unterschiede in der Codonsequenz aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Variationen in der SCIF-DNA-Sequenz,
die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifizierungen zur
Erhöhung der Wirksamkeit, der Halbwertszeit oder der Produktion der durch sie
codierten Polypeptide verursacht werden. Diese Sequenzen dürften sich im
offenbarten Verfahren verwenden lassen.
Tabelle I
Tabelle II
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Trotz der umfangreichen Untersuchungen, die Wissenschaftler mit diesem
Faktor durchgeführt haben, ist die Stammzellen-Hemmfunktion des in den
vorstehend erwähnten Artikeln identifizierten LD78- oder Maus-MIP-alpha-
Proteins bisher noch nicht als eine Funktion dieses Proteins identifiziert
worden. Vgl. beispielsweise Obaru et al. und Zipfel et al., vorstehend.
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Der Stammzellen-Hemmfaktor wirkt auf im Zellzyklus befindliche
Stammzellen dergestalt, daß diese in einen reversiblen "ruhenden" Zustand
versetzt werden und sich nicht teilen. Wenn die Stammzellen im
Anfangsstadium auf diese Weise behandelt werden, werden sie durch
anschließende Chemotherapie oder Bestrahlung nicht abgetötet, da sich die
Zellen nicht teilen. Nach chemotherapeutischer Behandlung oder Bestrahlung
können die Stammzellen daher durch Abbruch der SCIF-Verabreichung
"erneut aktiviert" werden, wobei sie sich teilende Vorläuferzellen erzeugen.
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Eine zusätzliche Möglichkeit, ruhende Stammzellen zur Teilung anzuregen,
kann auch darin bestehen, dem Patienten nach der Behandlung mit
Chemotherapie oder Bestrahlung andere koloniestimulierende Faktoren, z. B. M-
CSF, CSF-1, GM-CSF, G-CSF, Meg-CSF, oder andere Cytokine, wie z. B. IL-1, IL-2, IL-
3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL 9, IL-11 und Erythropoietin, zu verabreichen.
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SCIF-Polypeptide oder wirksame Fragmente davon mit hemmender Wirkung
auf Stammzellen können mit Hilfe bekannter herkömmlicher chemischer
Syntheseverfahren oder DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden,
wobei die vorstehend in Tabelle I oder Tabelle II gezeigten Aminosäure- und
DNA-Sequenzen verwendet werden. SCIF-Polypeptide können beispielsweise
durch Züchtung einer geeigneten Zelle oder Zellinie hergestellt werden, die
mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, welche bei der Expression unter der
Kontrolle bekannter Regulationssequenzen ein SCIF-Polypeptid oder ein
aktives Fragment davon codiert. Das resultierende Protein kann mit Hilfe
üblicher Verfahren aus den Zellen, Zellysaten oder dem Medium isoliert
werden. Geeignete Verfahren für die Herstellung von rekombinanten SCIF-
Polypeptiden sind beispielsweise in T. Maniatis et al., Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY, beschrieben.
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Dem Fachmann sind auch chemische Syntheseverfahren zur Herstellung
von SCIF-Polypeptiden bekannt, die sich in dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwenden lassen. Vgl. beispielsweise Merrifield, I. A. C. S., 85
(1963), 2149-2154, oder "Peptide Synthesis" von Bodanszky et al., zweite Ausgabe
(1976), John Wiley and Sons.
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Mittels Rekombinationsverfahren oder chemischer Synthese hergestellte
SCIF-Polypeptidsequenzen können aufgrund von Primär-, Sekundär- oder
Tertiärstrukturen und Konformationseigenschaften wie natürlich
vorkommende SCIF-Polypeptide dieselbe biologische Eigenschaft zur Hemmung
der Stammzellteilung wie der vorstehend in Tabelle I oder Tabelle II bestimmte
menschliche Faktor besitzen.
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Peptide oder DNA-Sequenzen, die SCIF oder aktive Fragmente davon
codieren, können auch modifiziert werden. Man kann davon ausgehen, daß
sich die modifizierten SCIF-Peptide oder Fragmente davon im
erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen, wenn sie die gewünschte
biologische Aktivität zur Hemmung der Stammzellen besitzen. Zu den an den
SCIF-Sequenzen vorgenommenen Modifizierungen, die von Interesse sind,
gehören Austausch, Insertion oder Deletion eines ausgewählten
Aminosäurerestes in den codierenden Sequenzen. Mutageneseverfahren für
Austausch, Insertion oder Deletion sind dem Fachmann wohl bekannt [vgl.
beispielsweise US-Patent 4,518,584].
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Spezielle Sequenzmutationen des SCIF-Polypeptids umfassen die Insertion
einer mit Asparagin verbundenen Glycosylierungsstelle in die Sequenz, wobei
die Glycosylierungsstelle entweder Asp-X-Thr oder Asp-X-Ser bedeutet und X
eine beliebige Aminosäure sein kann, oder eine Sequenzmodifizierung an
einer beliebigen Stelle des Moleküls durch Hinzufügen von O-gebundenen
Kohlehydraten.
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Vom Fachmann können ohne weiteres andere Analoge oder Derivate der
SCIF-Sequenz hergestellt werden, von denen erwartet werden kann, daß sie
insgesamt oder teilweise die SCIF-Wirksamkeit behalten und sich deshalb in den
erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen.
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Derzeit ist die Herstellung von SCIF mit Hilfe von DNA-
Rekombinationsverfahren bevorzugt. Menschliche cDNA kann isoliert und in
geeignete Zellen oder Zellinien so eingebaut werden, daß sie unter der
Kontrolle geeigneter Regulationssequenzen stehen. Geeignete Wirtszellen zur
Proteinproduktion können Säugerzellen sein, wie z. B. Ovarialzellen vom
Chinesischen Hamster (CHO) oder 3T3-Zellen. Die Auswahl geeigneter Säuger-
Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifizierung,
Untersuchung sowie Herstellung und Reinigung des Produkts sind auf dem
Fachgebiet bekannt. Vgl. beispielsweise Gething und Sambrook, Nature. 293
(1981), 620-625. Andere Ausführungsformen finden sich bei Kaufman et al.,
Mol. Cell. Biol., 5(7) (1985), 1750-1759, oder Howley et al., US-Patent 4,419,446.
Andere geeignete Säuger-Zeilinien sind die Affen-Zellinie COS-1 und die CV-1-
Zellinie.
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Als Wirtszellen, die sich zur SCIF-Produktion eignen und sich daher in der
vorliegenden Erfindung verwenden lassen, sind bakterielle Zellen ähnlich
nützlich. In der Biotechnologie sind beispielsweise die verschiedenen E. coli-
Stämme (z. B. HB101, MC1061 und die in den folgenden Beispielen verwendeten
Stämme) als Wirtszellen wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis,
Pseudomonas und ähnlichen Mikroorganismen können im vorliegenden
Verfahren auch eingesetzt werden.
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Dem Fachmann sind viele Hefestämme bekannt, die als Wirtszellen zur
Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verfügbar sind. Falls
gewünscht, können im erfindungsgemäßen Verfahren außerdem
Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden. Vgl. beispielsweise Miller et
al., Genetic Engineering, 8 (Plenum Press 1986), 277-298, und darin angegebene
Literaturstellen.
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In den erfindungsgemäßen Verfahren zum Schutz der Stammzellen eines
Patienten vor Zerstörung durch ein Mittel, das sich teilende Stammzellen
abtöten kann, können auch ein oder mehrere SCIF-Peptidfragmente verwendet
werden, die die Fähigkeit des vollständigen SCIF-Moleküls, eine Hemmwirkung
auf Stammzellen auszuüben, behalten haben.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren zum Schutz von Stammzellen kann eine
therapeutisch wirksame Menge des SCIF-Proteins oder ein therapeutisch
wirksames Fragment davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch
verträglichen Trägermittel verwendet werden. Falls gewünscht, kann eine
systemische Verabreichung des SCIF-Mittels in parenteraler Form erfolgen. Bei
klinischen Anwendungen kann es wünschenswert sein, SCIF gezielt dem
blutbildenden Gewebe, z. B. Knochenmark, zuzuführen. Diese zielgerichtete
SCIF-Zuführung kann durch Injektion von SCIF erreicht werden,
normalerweise durch Infusion oder intravenöse Injektion. In einer anderen
Ausführungsform kann SCIF durch Veränderungen der pharmazeutischen
Formulierung des Medikaments zielgerichtet zugeführt werden, z. B. indem SCIF
an Mittel gebunden wird, die nachweislich auf das Knochenmark gerichtet
sind. Diese Präparate können intravenös verabreicht werden. Auf Wunsch
kann das Mittel auch subcutan verabreicht werden.
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Bei systemischer Verabreichung stellt das therapeutische Mittel zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine zur parenteralen
Verabreichung geeignete wäßrige Lösung dar, die keine fiebererzeugenden
Stoffe enthält. Die Herstellung einer solchen pharmazeutisch verträglichen
Proteinlösung mit einem entsprechenden pH-Wert, die u. a. isotonisch und
stabil ist, gehört zum allgemeinen Fachwissen. Im Verfahren zur Behandlung
von hyperproliferierenden Stammzellen kann das SCIF enthaltende Mittel
topisch oder transcutan mit einem Pflaster verabreicht werden, wodurch seine
Wirkung auf den Bereich der Hyperproliferation lokalisiert wird.
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Das Verfahren zur Behandlung einer Person, bevor diese mit cytotoxischen
Mitteln behandelt wird, oder zur Behandlung hyperproliferierender
Stammzellen, umfaßt ein Dosierungsschema, das durch den behandelnden Arzt
ermittelt wird. Dabei werden verschiedene Faktoren in Erwägung gezogen, die
die Medikamentenwirkung verändern, z. B. körperliche Verfassung,
Körpergewicht, Geschlecht oder Ernährung des Patienten, die Schwere einer
Infektion, Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im
allgemeinen sollte die tägliche Dosis im Bereich von 1-1000 Mikrogramm SCIF-
Protein oder SCIF-Fragment pro Kilogramm Körpergewicht liegen.
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Nach Behandlung des Patienten mit einem cytotoxischen Mittel oder
Bestrahlung können ihm im Rahmen des erfindungsgemäßen
Therapieverfahrens auch ein oder mehrere Lymphokine, koloniestimulierende
Faktoren oder andere Gytokine, Haemotopoitine, Interleukine oder
Wachstumsfaktoren verabreicht werden, um eine allgemeine Stimulierung des
Wachstums und der Teilung der durch die vorangegangene SCIF-Behandlung
gehemmten Stammzellen zu erreichen. Diese therapeutischen Mittel, die die
Blutbildung fördern, umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF,
M-CSF, CSF-1, GM-CSF, G-CSF oder Erythropoietin. Die Dosen dieser Mittel können
im gleichen Bereich wie die vorstehend angeführten SCIF-Dosen liegen. Die
Dosierungen werden in ähnlicher Weise so eingestellt, daß Veränderungen
ausgeglichen werden, die sich aus dem physischen Zustand des Patienten bzw.
aus der Menge oder Art des Chemotherapeutikums oder der Bestrahlung, mit
dem/der die Person behandelt wurde, ergeben. Mit üblichen Verfahren kann
die Aufhebung der Stammzellen-Hemmung kontrolliert werden, die durch SCIF-
Verabreichung an den behandelten Patienten verursacht wurde.
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Bei der Leukämiebehandlung kann es vorteilhaft sein, während der
Behandlung mit cytotoxischen Medikamenten oder Bestrahlung gleichzeitig
SCIF zur Hemmung des normalen Stammzellzyklus und ein Stimulierungsmittel
für das Wachstum von Leukämiezellen, wie z. B. IL-3 oder GM-CSF, zu
verabreichen. Mit diesem Verfahren sollte es möglich sein, die größten
Unterschiede zwischen normalen und Leukämiezellen hinsichtlich ihres
Zellzyklus-Zustandes zu erzielen.
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Die folgenden Beispiele beschreiben die Verwendung von Maus-SCIF in
einem in vitro-Stammzellentest. Diese Beispiele dienen der Erläuterung und
sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise
einschränken.
Beispiel 1 - Gewinnung einer menschlichen SCIF-cDNA
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Aus der menschlichen T-Zellinie C10-MJ2 isolierte polyadenylierte RNA
wurde als Matritze zur Synthese einer komplementären einzelsträngigen DNA
mit Hilfe von Standardverfahren verwendet [vgl. Maniatis et al., vorstehend].
Die Gegenwart von menschliches SCIF-Protein codierenden cDNAs wurde durch
Polymerasekettenreaktion (PCR) unter stringenten Bedingungen [R. K. Saiki et
al., Science, 230 (1985), 1350] nachgewiesen, wobei die folgenden, auf der
Sequenz von Tabelle I beruhenden Oligodesoxyribonucleotide verwendet
wurden:
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5'-AGCTCGAGAT CATGCAGGTC TCCACTG-3'
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5'-GCGAATTCCC TCAGGCPCITC AGCTCCA-3'.
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Doppelsträngige SCIF-DNA, die als PCR-Produkt erhalten und mit (alpha
³²P)dCTP durch das Zufallsprimer-Verfahren markiert worden war, wurde zum
Nachweis von SCIF-cDNAs in einer zuvor konstruierten C 10-MJ2-cDNA-
Expressionsgenbank verwendet [J. F. Moreau et al., Nature., 336 (1988), 690].
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Mit SCIF-cDNAs voller Länge und richtiger Insertions-Orientierung wurden
COS-Zellen transfiziert. Durch diese Zellen konditioniertes Medium wurde nach
dem in Beispiel 3 beschriebenen Testverfahren untersucht. Die Sequenzierung
ausgewählter Clone, die als pXMT2.A1 bzw. pXMT2.A3 bis pXMT2.A9 bezeichnet
wurden, ist derzeit noch in Arbeit.
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Die menschliche SCIF-Sequenz von Tabelle II unterscheidet sich wesentlich
von der in Tabelle I gezeigten LD 78-Sequenz von Obaru et al., von der die
Oligodesoxyribonucleotide abgeleitet wurden. Sie unterscheiden sich in 18
Basen, 4 Aminosäuren, 3 zusätzlichen Basen und 1 zusätzlichen Aminosäure.
Beispiel 2 - In-vitro-Stammzellentest
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Zum Nachweis der Stammzellen in vitro wurden 10&sup4; Maus-
Knochenmarkszellen aus der Maus-Makrophagen-Zellinie J774.2 [P. Ralph et
al., J. Immunol., 114 (1975), 898-905] in 4 ml alpha-modifiziertem
Minimalgrundmedium (MEM), enthaltend 25% foetales Kälber- oder
Pferdeserum und 0,3% Agar, in einer Petrischale mit 6 cm Durchmesser auf
eine Schicht des gleichen Mediums aufgebracht, das 0,6% Agar, 10% durch
L929-Zellen konditioniertes Medium (L929 cm, eine Quelle für den
Wachstumsfaktor CSF-1) und 10% durch AFl-19T-Zellen konditioniertes Medium
(AFl-19T cm, eine Quelle für die Wachstumsfaktoren GM-CSF und andere
nichtcharakterisierte Stammzellen-Wachstumsfaktoren) enthielt. Die Kulturen
wurden 11 Tage bei 37ºC in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre aus 10%
CO&sub2;, 5% O&sub2; und 85% N&sub2; bebrütet. Die Kolonien können mit INT [2-(p-
Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchloridhydrat] über Nacht
angefärbt werden.
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Nach der Durchführung von Vorversuchen unter Verwendung von
Cytosinarabinosid wurde ein Koloniedurchmesser von 2 mm als brauchbarer
Grenzwert ausgewählt, obwohl einige der im CFU-A-Test vorhandenen Kolonien
einen Durchmesser von weniger als 2 mm aufwiesen. Es wurde festgestellt, daß
in den einzelnen Petrischalen Kolonien mit einem Durchmesser < 2 mm
hauptsächlich von im Zellzyklus befindlichen Zellen abstammten, während
Kolonien mit einem Durchmesser > 2 mm von kaum proliferierenden Zellen
abstammten. Bei diesen Tests wurden nur Kolonien mit Durchmessern > 2 mm
ausgewertet.
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Der auch in I. B. Pragnell et al., Blood. 72 (1988), 196-201, beschriebene Test
zeigt, daß eine SCIF-Behandlung bei reiferen Vorläuferzellen keine
Auswirkung hat, während Zellen, die sich im Zellzyklus befinden, nach SCIF-
Behandlung gegen die Wirkung von Cytosinarabinosid resistent werden. Nach
Waschen der behandelten Stammzellen mit gepufferter Kochsalzlösung, um das
cytotoxische Mittel und SCIF zu entfernen, proliferieren die überlebenden
Stammzellen in Kultur normal, wie nachstehend erläutert.
Beispiel 3 - Beweis der Wirkung von SCIF auf CFU-A
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Knochenmarkszellen wurden jeweils in zwei Röhrchen inkubiert, die 5 ·
10&sup6; Zellen in 1 ml Fischer-Medium enthielten, das mit 20% Pferdeserum ergänzt
worden war. Jedem Röhrchen wurde SCIF oder alpha-MEM zugesetzt, während
Kontrollröhrchen Fischer-Medium zugegeben wurde. Die Gemische wurden 5
Stunden bei 37ºC inkubiert (Hemmtests). In ein Röhrchen wurden in den
letzten 60 Minuten der Inkubation 10&supmin;³ M Cytosinarabinosid gegeben, während
in das andere Röhrchen Medium in gleicher Menge gegeben wurde. Die Zellen
wurden zweimal gewaschen, bevor sie im vorstehend beschriebenen CFU-A-
Test untersuchten wurden. Es wurde festgestellt, daß SCIF die Zahl der im
Zellzyklus befindlichen Stammzellen von durchschnittlich mehr als 30% auf
durchschnittlich weniger als 10% vermindert. Im Gegensatz zu den mit dem
Hemmstoff behandelten Stammzellen wurden die unbehandelten Zellen durch
die Behandlung mit dem cytotoxischen Mittel abgetötet.
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Bei in vivo-Untersuchung im vorstehend erwähnten, von Pragnell et al.
beschriebenen CFU-S-Tesi: unter Verwendung von ara-C werden auch
multipotente Stammzellen durch SCIF-Reinpräparate aus dem Zellzyklus
reversibel herausgelöst.
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Das gereinigte und sequenzierte erfindungsgemäße SCIF-Polypeptid ist ein
Cytokin, das speziell den Anteil der Blut-Stammzellen vermindern kann, in
denen DNA-Synthese stattfindet, wodurch die Zellen vor Cytosinarabinosid
geschützt werden, einem zellzyklusspezifischen cytotoxischen Medikament. Im
Gegensatz dazu beeinflußt SCIF die Proliferation reiferer Vorläuferzellen nicht
und scheint daher ein spezifischer Regulator des Stammzellkompartiments zu
sein. SCIF ist in einem Konzentrationsbereich von 200-500 pM wirksam, wie in
direkten CFU-A-Zugabetests gemessen.
Beispiel 4 - Expression von rekombinantem menschlichem SCIF-Protein
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Zur Herstellung von SCIF wird die das Protein codierende cDNA mit Hilfe
von molekularbiologischen Standardverfahren in einen geeigneten
Expressionsvektor übertragen, wobei zahlreiche Vektortypen zur Expression in
Säuger-, Insekten-, Hefe-, Pilz- und Bakterienzellen auf dem Fachgebiet
bekannt sind. Vgl. beispielsweise Y. C. Yang et al., Cell, 47 (1986), 3-10. Ein
solcher Vektor ist der Expressionsvektor pXM für COS-Zellen, enthaltend das
SV40-Enhancerelement, einen späten Hauptpromotor vom Adenovirus, eine
DHFR codierende Sequenz, eine PolyA-Anheftungsstelle von später SV40-mRNA
und das VaI-Gen. Der Vektor kann mit der Endonuclease (Restriktionsenzym)
XhoI linearisiert und mit äquimolaren SCIF-cDNA-Mengen ligiert werden,
wobei die cDNA vorher durch Zugabe synthetischer Oligodesoxyribonucleotide
modifiziert wurde, die komplementäre überhängende XhoI-Enden erzeugen. Die
Oligodesoxyribonucleotide sind im Handel erhältlich [Collaborative Research,
Lexington, MA]. Der Vektor wird danach mit Hilfe üblicher gentechnologischer
Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt.
a. Expression in Säugerzellen
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Der die SCIF-DNA-Sequenz enthaltende Vektor pXM wird beispielsweise in
COS-Zellen transfiziert, um das SCIF-Polypeptid bei Verwendung in den
nachstehend beschriebenen Tests zu exprimieren. Das durch die transfizierten
COS-Zellen konditionierte Medium enthält biologische SCIF-Aktivität, wie in
dem in Beispiel 2 beschriebenen Test ermittelt.
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Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Expressionsvektoren für
Säugerzellen können mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, die dem
Fachmann wohl bekannt sind. Die Bestandteile der Vektoren, z. B.
Replikationsstartpunkte, Selektionsgene, Enhancer (Verstärkerelemente),
Promotoren und dergleichen, können aus natürlichen Quellen gewonnen oder
mittels bekannter Verfahren synthetisiert werden. Vgl. Kaufman et al., J. Mol.
BioL, 159 (1982), 511-521; sowie Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (1985),
689-693. Beispiele von Säuger-Wirtszellen sind insbesondere Primaten-
Zellinien und Nagetier-Zellinien, einschließlich transformierter Zellinien.
Normale diploide Zellen und Zellinien, die aus einer in vitro-Kultur von
Primärgewebe abstammen, sind ebenso wie Primärexplantate geeignet. Sofern
das Selektionsgen dominant ist, ist es nicht notwendig, daß das Selektionsgen im
Genotyp der zur Verwendung vorgesehenen Zellen fehlt. Zur stabilen
Integration der Vektor-DNA und anschließenden Amplifizierung der
integrierten Vektor-DNA können CHO-Zellen eingesetzt werden, wobei beide
Schritte mittels üblicher Verfahren durchgeführt werden. In einer anderen
Ausführungsform kann die Vektor-DNA das Genom des Rinder-Papillomvirus
[Lusky et al., Cell 36 (1984), 391-401] vollständig oder teilweise umfassen und
kann in Zellinien, wie z. B. C127-Zellen der Maus, als stabiles episomales Element
enthalten sein. Andere geeignete Säuger-Zellinien umfassen HeLa-Zellen, die
Affen-Zellinie COS-1, die Maus-Zellinie L-929, die aus Schweizer-, Balb-c- oder
NIH-Mäusen abstammenden 3T3-Zellinien sowie die Hamster-Zellinien BHK oder
HaK, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Stabile Transformanten werden dann mit Immun- oder Enzymstandardtests
auf die Expression des Produkts hin untersucht. Die Gegenwart der die SCIF-
Polypeptide codierenden DNA kann mit Hilfe von Standardverfahren, wie z. B.
Southern-Blot-Hybridisierung, nachgewiesen werden. Eine kurzzeitige
Expression der die Polypeptide codierenden DNA während mehrerer Tage nach
Einführung der Expressionsvektor-DNA in geeignete Wirtszellen, wie z. B. die
Affen-Zellinie COS-1, wird ohne Selektion mittels Proteinaktivitätstest oder
Immuntest im Kulturmedium gemessen.
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Ein Fachmann kann auch andere, mit dem pXM/SCIF-Vektor vergleichbare
Expressionsvektoren für Säugerzellen konstruieren, indem beispielsweise die
SCIF-DNA-Sequenz mit Hilfe von XhoI in die jeweiligen Plasmide eingebaut
wird, wobei wohl bekannte Rekombinationsverfahren der Gentechnolgie sowie
andere bekannte Vektoren eingesetzt werden, wie pJL3 und pJL4 [Gough et al.,
EMBO T., 4 (1985), 645-653] oder pMT2 (beginnend mit pMT2-VWF, ATCC #67122;
vgl. PCT-Anmeldung PCT/US-87/00033). Die Transformation geeigneter
Wirtszellen mit diesen Vektoren führt zur Expression der SCIF-Polypeptide.
b. Bakterielle Expressionssysteme
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Ein Fachmann kann genauso die SCIF-Sequenz verändern, indem er alle
Regulationssequenzen des Säugers, die die codierenden Sequenzen flankieren,
entfernt und Bakteriensequenzen inseriert, wobei bakterielle Vektoren zur
intrazellulären oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen SCIF-
Polypeptide durch bakterielle Zellen geschaffen werden. Die den Faktor
codierende DNA kann wie auf dem Fachgebiet bekannt, weiterhin so modifiziert
werden, daß sie zur bakteriellen Expression benötigte unterschiedliche Codons
enthält. Vorzugsweise wird die Sequenz, wie auch auf dem Fachgebiet bekannt,
im richtigen Leseraster mit einer Nucleotidsequenz funktionell verbunden, die
ein Leader-Polypeptid zur Sekretion codiert, was die bakterielle Expression,
Sekretion und Prozessierung des veränderten reifen Proteins ermöglicht. Die
in bakteriellen Wirtszellen exprimierten Verbindungen können dann
gewonnen, aufgereinigt und/oder hinsichtlich ihrer
physikalischchemischen, biochemischen und/oder klinischen Parameter charakterisiert
werden. Diese Schritte werden jeweils mit Hilfe bekannter Verfahren
durchgeführt.
c. Expression in Insekten- oder Hefezellen
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Zur Expression in Insektenzellen können ähnliche Manipulationen für die
Konstruktion eines Insekten-Vektors durchgeführt werden [solche Verfahren
sind beispielsweise in der veröffentlichten EP-A 155,476 beschrieben]. Zur
intrazellulären oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen
Proteine durch Hefezellen kann auch ein Hefevektor unter Verwendung von
Hefe-Regulationssequenzen konstruiert werden. [Solche Verfahren sind
beispielsweise in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und in EP-
A 123,289 beschrieben.]
Beispiel 5 - Konstruktion von CHO-Zellinien, die hohe SCIF-Mengen
exprimieren
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Ein Verfahren zur Herstellung hoher Mengen erfindungsgemäßer SCIF-
Polypeptide in Säugerzellen umfaßt die Konstruktion von Zellen, die mehrere
Kopien des heterologen SCIF-Gens enthalten. Das heterologe Gen kann mit
einem amplifizierbaren Marker verbunden werden, z. B. dem
Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen. Dadurch können mehrere Genkopien
enthaltende Zellen auf Vermehrung in zunehmenden Methotrexat (MTX)-
Konzentrationen nach dem Verfahren von Kaufman & Sharp, J. Mol. Biol.,
(1982), vorstehend, selektiert werden. Dieser Weg kann bei einer Anzahl
verschiedener Zelltypen verwendet werden.
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Der Vektor pXM, der die Genexpression regulierende Plasmidsequenzen in
funktioneller Verbindung mit einem SCIF-Gen enthält, kann gemeinsam mit
dem DHFR-Expressionsplasmid pAdD26SV(A)3 (Kaufman & Sharp, Mol. Cell Biol.,
3(9) (1983), 1598-1608) mittels Calciumphosphat-Copräzipitierung und
Transfektion in die CHO-Zellen DUKX-BII eingeführt werden, denen das DHFR-
Gen fehlt.
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In einer anderen Ausführungsform kann das SCIF-Gen in den vorstehend
erwähnten Vektor pMT2 eingebaut werden. Der sich daraus ergebende Vektor
wird dann anstelle von pXM/SCIF und pAdD26SV(A)3 verwendet. DHFR
exprimierende Transformanten werden auf Wachstum in alpha-Medium mit
dialysiertem foetalem Kälberserum selektiert. Wie in Kaufman et al., Mol. Cell
Biol., 5 (1983), 1750; beschrieben, wird anschließend auf Zellvermehrung in
zunehmenden MTX-Konzentrationen selektiert (aufeinanderfolgende Schritte
mit 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX). Von den Transformanten werden Clone
hergestellt. Die Expression von biologisch aktivem SCIF-Polypeptid wird mit
Hilfe des Tests in Beispiel 2 kontrolliert. Die Expression des SCIF-Polypeptids
dürfte sich mit zunehmender MTX-Resistenz erhöhen.