-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
Erfindung betrifft allgemein therapeutische Verbindungen und insbesondere
lösliche
und membrangebundene Formen eines Rezeptors mit niedriger Affinität für human
Immunglobulin G, denselben kodierende Nucleinsäuren und die diagnostische
und therapeutische Verwendung solcher Rezeptoren.
-
Hintergrund
-
Rezeptoren
für den
Fc-Teil von Immunglobulin G (IgG) spielen eine zentrale Rolle in
der zellulären
Immunantwort. Drei Typen solcher Rezeptoren sind identifziert worden:
ein 72 Kilodalton (kD) Rezeptor mit hoher Affinität für monomeres
IgG findet sich auf Monocyten und einigen Makrophagen, ein 40 kD
Rezeptor mit niedriger Affinität
für monomeres
IgG findet sich auf Monocyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Plättchen und
bestimmten human Tumorzelllinien und ein 50–70 kD Rezeptor mit niedriger
Affinität
für monomeres
IgG findet sich auf Neutrophilen, Eosinophilen, natürlichen
Killerzellen und Makrophagen. Diese drei Typen von Fcγ-Rezeptoren
werden als FcγRI,
FcγRII bzw.
FcγRIII
bezeichnet: Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol., Band 6, Seiten
251–281
(1988).
-
Es
wird angenommen, dass die FcγRIII
vermittelte Entfernung von IgG-beschichteten Plättchen eine wesentliche Rolle
beider Pathogenese der Immunthrombocytopenie purpura (ITP) spielt,
eines Zustands des Plättchenmangels,
der durch exzessive Blutungen gekennzeichnet ist: von dem Borne,
Seiten 222–256,
in Immunohaematology, Engelfriet et al., Hrsg. (Elsevier, Amsterdam,
1984). Clarkson et al., New England J. Med., Band 314, Seiten 1236–1239 (1986),
berichten, dass die Infusion eines Liganden blockierenden Anti-FcγRIII-Antikörpers in
einen Patienten mit refraktorischer ITP zu einem vorübergehenden
Anstieg der Plättenchenzahl
führte.
Diese Beobachtung legt nahe, dass die schädlichste Manifestation der
ITP sich durch die Verabreichung von Mitteln, die mit FcγRIII um Bindungsstellen
auf IgG-beschichteten Plättchen
wetteifern oder diese blockieren, verbessert werden könnte.
-
In
einem separaten Gebiet der klinischen Immunologie sind erhöhte Serumlevel
von Aggregaten, die aus Immunglobulin und Antigen bestehen (sog. "Immunkomplexe"), mit einer breiten Vielzahl
von Störungen, insbesondere
Autoimmunerkrankungen, wie dem systemischen Lupus erythematosus
(SLE) und der rheumatoiden Arthritis korreliert worden. Der Level
solcher Komplexe ist ein wesentlicher Diagnosefaktor für das Vorliegen
von Autoimmunstörungen
geworden (beispielsweise Theofilopoulos et al., Am. J. Pathol.,
Spalte 100, Seiten 531–591
(1980).
-
Gegenwärtige Tests
auf Serumlevel von Immunkomplexen schließen Festphasentest, die die
Affinität der
Komplexe für
bestimmte Komplemente oder rheumatoide Faktorproteine ausnutzen,
und zelluläre
Tests ein, die die Eigenschaft von Raji-Zellen nutzen, bevorzugt
Immunkomplexe zu binden; Theofilopoulos et al., Kapitel 28, und
Toth et al., Kapitel 29, in Rose et al., Hrsg. Manual of Clinical
Immunology, 3. Auflage (American Society for Microbiology, Washington,
D.C., 1986). Leider ist der Raji-Zelltest, wie viele Tests auf Basis
von Säugerzellen,
schwierig durchzuführen
und erfordert umständliche
Kontrollen und Standards auf Grund der inhärenten Variabilität der Bindung
der Raji-Zellen an Immunkomplexe.
-
Nature,
Band 33, 9. Juli 1988, Seiten 568–570, beschreibt einen Rezeptor
für die
Fc-Region von menschlichem IgG, der 283 Aminosäuren lang ist.
-
WO
88/06733 beschreibt lösliche
Formen von Fc-gamma-Rezeptoren mit niedriger Affinität ohne, dass
irgendeine Sequenzinformation für
die Rezeptoren bereitgestellt wird.
-
Im
Hinblick auf das oben stehende, wäre es von Vorteil für die Gemeinschaft
der Mediziner, alternative Testverfahren für Immunkomplexe zur Verfügung zu
haben, die wohl charakterisierte, weit verbreitet erhältliche und
einfach zu kultivierende Zelllinien nutzen. Es wäre außerdem von Vorteil, wenn lösliche FcγRs in ausreichender
Menge produziert werden könnten,
um eine praktikable Notfalltherapie für refraktorische Fälle der
ITP zu gestatten.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung ist auf lösliche
und membrangebundene menschliche FcγRIII-Polypeptide, ihre Muteine, Nukleinsäuren, die
dieselben kodieren können,
und diagnostische und therapeutische Verwendungen solcher Polypeptide
und Muteine gerichtet.
-
Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung einer einen human FcγRIII kodierenden
cDNA. Ein cDNA-Klon, pcD(SRα),
enthaltend das FcγRIII-kodierende
Insert (veranschaulicht in 1), ist
in E. coli K12, Stamm MC1061, bei der American Type Culture Collection
(ATCC), Rockville, Maryland, USA, unter der Zugangsnummer 67707
hinterlegt.
-
Demgemäß stellt
die Erfindung ein Polypeptid bereit, das in der Lage ist, den Fc-Teil
von menschlichem IgG zu binden, und umfassend die folgende Aminosäuresequenz:
-
Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
-
1, Teile A und B (auf zwei Seite an Seite
zu lesenden Bögen)
veranschaulicht die Nucleotidsequenz des cDNS-Inserts von pcD(SRα)-GP5;
-
2 veranschaulicht
den relativen Ort des Stopp-Codons, das insertiert wurde, um einen
löslichen human
FcγRIII
zu produzieren, der als ein mutanter FcγRIII sekretiert wird;
-
3 veranschaulicht das Ergebnis der gelelektrophoretischen
Analyse des in Beispiel III unten produzierten löslichen FcγRIII; und
-
4, Teile A und B (auf zwei Seite an Seite
zu lesenden Bögen),
veranschaulicht die Nukleotidseguenz des cDNS-Inserts von pcD(SRα)-NL10.
-
Genaue Beschreibung der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst Nucleinsäuren, die Polypeptide kodieren,
welche an den Fc-Teil von humanem IgG binden können. Diese Polypeptide sind
von human FcγRIII
abgeleitet. Die Erfindung umfasst lösliche und membran-gebundene
Polypeptide für
human FcγRIII.
Diese und andere modifizierte Versionen der Polypeptide lassen sich
leicht unter Verwendung von Standardverfahren des Protein-Engineering
bzw. der Gentechnik herstellen.
-
Sobald
eine Nucleinsäuresequenz-
und/oder eine Aminosäuresequenzinformation
für ein
natives Protein verfügbar
ist, wird eine Vielzahl von Techniken zur Herstellung praktisch
jeder Mutation der nativen Sequenz verfügbar. Shortle gibt in Science,
Band 229, Seiten 1193–1201
(1985), einen Überblick über Techniken zum
Mutieren von Nucleinsäuren,
die auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind. Vorzugsweise werden Mutanten
des Proteins der vorliegenden Erfindung über die ortspezifische Oligonucleotid
dirigierte Mutagenese erzeugt, beispielsweise Zoller und Smith,
Methods in Enzymology, Band 100, Seiten 468–500 (1983), und Mark et al.,
US-Patent Nr. 4,518,584 mit dem Titel "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins", oder über die sog. "Kassetten"-Mutagenese, beschrieben
von Wells et al. in Gene, Band 34, Seiten 315–323 (1985), von Estell et
al. in Science, Band 233, Seiten 659–663 (1986), und ebenfalls
im Wesentlichen von Mullenbach et al. in J. Biol. Chem., Band 261,
Seiten 719–722
(1986), und von Feretti et al. in Proc. Natl. Acad. Sci., Band 83,
Seiten 597–603
(1986).
-
Polypeptide
mit Aminosäuremodifikationen
(das heißt
Muteine) können
in einer Vielzahl von Umständen
wünschenswert
sein. Beispielsweise können
unerwünschte
Nebenwirkungen durch bestimmte Muteine reduziert werden, insbesondere
dann, wenn die Nebenwirkung mit einem ande ren Teil des Polypeptids
als demjenigen der gewünschten
Aktivität
verbunden ist. In einigen Expressionssystemen kann das native Polypeptid für die Abbau
durch Proteasen empfindlich sein. In solchen Fällen können ausgewählte Substitutionen und/oder
Deletionen von Aminosäuren,
die die empfindlichen Sequenzen ändern,
die Ausbeuten signifikant erhöhen,
beispielsweise die britische Patentanmeldung 2173-804-A, in der
Arg in Position 275 des human Gewebeplasminogenaktivators (tPA =
tissue Plasminogen Activator) durch Gly oder Glu ersetzt wird. Muteine können außerdem die
Ausbeuten in Reinigungsverfahren erhöhen und/oder die Lebensdauer
von Proteinen durch Elimination von Aminosäuren erhöhen, die gegenüber Oxidation,
Acylierung, Alkylierung oder anderen chemischen Modifikationen empfindlich
sind. Beispielsweise wird Methionin leicht oxidiert, um ein Sulfoxid
zu bilden, das in vielen Proteinen mit dem Verlust der biologischen
Aktivität
verbunden ist: beispielsweise Brot und Weissbach, Arch. Biochem.
Biophys., Band 223, Seite 271 (1983). Methionine können häufig durch
inertere Aminosäuren
ersetzt werden mit geringem oder keinem Verlust der biologischen
Aktivität,
beispielsweise die australische Patentanmeldung AU-A-52451/86. In bakteriellen
Expressionssystemen lassen sich die Ausbeuten manchmal durch Eliminieren
oder Ersetzen von für
die Konformation unwesentlichen Cysteinen erhöhen, beispielsweise Mark et
al., US-Patent 4,518,584.
-
Vorzugsweise
werden lösliche
Formen des FcγRIII
der Erfindung durch Einführen
eines Stopp-Codons vor (das heißt
in der 5'- oder "Upstream"-Richtung) dem für die transmembranen
und intrazellulären
Anteile kodierenden Bereich der FcγRIII-cDNS erzeugt. Dies wird
herkömmlicherweise
durch ortspezifische Mutagenese bewirkt. Transmembranbereiche lassen
sich leicht über
die Anwesenheit eines Aminosäuresegements identifizieren,
das von etwa 20 bis 25 Reste enthält, die eine hohe durchschnittliche
Hydrophobizität
aufweisen, beispielsweise Wickner, Science, Band 210, Seiten 861–868 (1980),
und Green et al., Ann. Rev. Immunol., Band 4, Seiten 69–95 (1986).
-
Das
Plasmid pcD(SRα)-GP5
ist dem pcD-Shuttle-Vektor, beschrieben von Okayama und Berg, Mol. Cell.
Biol., Band 2, Seiten 161–170
(1983), und Band 3, Seiten 280–289
(1983), ähnlich,
mit der Ausnahme, dass der SV40-Promotor modifiziert wurde, um die
Expression über
die Downstream-Insertion eines Teils des langen terminalen Repeats
(LTR) aus einem HTLV(I)-Retrovirus
zu verbessern, beschrieben von Takebe et al., Mol. Cell. Biol.,
Band 8, Seiten 466–472
(1988). Das Plasmid wird bequemerweise in E. coli K1, Stamm MC1061,
oder dergleichen als Wirt propagiert.
-
Die
Immunglobulin G bindende Eigenschaft des FcγRIII der Erfindung wird über Standard
techniken gemessen, beispielsweise (1) im Fall von membran-gebundenem
FcγRIII:
die Fähigkeit
von mit FcγRIII-cDNS transfizierten
Zellen Rosetten in der Anwesenheit von IgG-beschichteten roten Blutkörperchen
(RBCs = Red Blood Cells) Rosetten zu bilden oder vorzugsweise durch Wärmebehandlung
aggregiertes human IgG zu binden; oder (2) im Fall von löslichem
FcγRIII:
die Fähigkeit,
vorzugsweise FcγRIII über eine
human IgG enthaltende Immunosorptionssäule aus einer Lösung zu
entfernen oder die Rosettenbildung zwischen IgG-beschichteten roten
Blutkörperchen
und Zellen zu inhibieren, von denen bekannt ist, dass sie FcγRIII aufweisen.
Die erstere Messung kann mit fluoreszenz-markierten human IgG-Molekülen durchgeführt werden,
beispielsweise Haug-land,
Handbook of Fluorescent Probes (Molecular Probes, Inc., Junction
City, OR, 1985). Die letztere Messung kann durch Konstruieren einer
IgG-Säule
aus isoliertem human IgG und einer im Handel erhältlichen aktivierten Sepharosesäule durchgeführt werden,
beispielsweise von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA).
-
Rosettentests
sind Stand der Technik, beispielsweise Winchester et al, Kapitel
31, in Rose et al., Hrsg., Manual of Clinical Laboratory Immunology,
3. Auflage (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1986).
-
Sobald
die cDNS der Erfindung kloniert worden ist, kann ein weiter Bereich
von Expressionssystemen (das heißt Kombinationen von Wirt und
Expressionsvektor) zur Erzeugung der Proteine der Erfindung verwendet
werden. Mögliche
Typen von Wirtszellen schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf bakterielle Wirte, Hefen, Insekten, Säuger und dergleichen. Die Selektion
bzw. Wahl eines Expressionssystems und die Optimierung der Proteinproduktion
hierdurch involviert die Betrachtung und Balance von zahlreichen
Faktoren, eingeschlossen (1) die An des zu exprimierenden Proteins,
beispielsweise kann das Protein für einige Wirtsorganismen giftig
sein, es kann gegenüber
dem Abbau durch Wirtsproteasen empfindlich sein oder es kann in
inaktiven Konformationen oder in in einigen Wirten unlöslicher
Form exprimiert werden, (2) der Art der Messenger-RNS (mRNS), entsprechend
dem interessierenden Protein, beispielsweise kann die mRNS Sequenzen aufweisen,
die gegenüber
Wirtsendonucleasen besonders empfindlich sind, die drastisch die
funktionale Lebensdauer der mRNS verringern, oder die mRNS kann
Sekundärstrukturen
bilden, die das Start-Codon oder die Ribosomenbindungsstelle maskieren,
wodurch die Initiation der Translation in einigen Wirten inhibiert
wird, (3) die Selektion, Verfügbarkeit
und die Anordnung von wirtskompatiblen Expressions-Kontrollsequenzen
in den 3'- und 5'-Bereichen, die den
kodierenden Bereich flankieren – diese
schließen
Promotoren, 5'-
und 3'-Schutzseguenzen,
Ribosomenbindungsstellen, Transkriptionsterminatoren, Verstärker (Enhancer),
Polyadenylierungsstellen, Cap-Stellen, Intron-Splice-Stellen und dergleichen ein,
(4) ob das Protein eine Sekretionssignalsequenz aufweist, die vom
Wirt prozessiert bzw. verarbeitet werden kann oder ob eine Expressionskontrollsequenz,
kodierend eine dem Wirt endogene Signalsequenz, auf den das reife
Protein kodierenden Bereich angespliced werden muss, (5) die verfügbaren Moden
und Effizienzen der Transfektion oder Transformation des Wirtes
und ob eine vorübergehende
oder stabile Expression gewünscht
ist, (6) der Maßstab
und die Kosten des für
die Expression des Proteins gewünschten
Wirts-Kultursystems, (7) ob und welche Art von posttranslationaler
Modifikation(en) gewünscht
sind, beispielsweise das Ausmaß und
die Art der gewünschten
Glycosilierung, können
die Wahl des Wirtes beeinflussen, (8) die Leichtigkeit, mit der
das exprimierte Protein von Proteinen und anderen Materialien der
Wirtszellen und/oder des Kulturmediums getrennt werden können, beispielsweise
kann es in einigen Fällen
wünschenswert
sein, ein Fusionsprotein mit einer spezialisierten Signalsequenz
zu exprimieren, um die späteren
Reinigungsschritte zu unterstützen,
beispielsweise Sassenfeld et al., Biotechnology, Januar 1984, (9)
die Stabilität
und Kopienzahl eines bestimmten Vektors in einem selektierten Wirt,
beispielsweise Hofschneider et al., Hrsg., Gene Cloning in Organisms
Other than E. coli (Springer Verlag, Berlin, 1982), und (10) ähnliche
Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind.
-
Es
sind zahlreiche Übersichtsartikel
verfügbar,
die Hilfestellung bzw. Anleitung bezüglich der Auswahl und/oder
Modifikationen bestimmter Expressionssysteme im Hinblick auf die
genannten Faktoren bereitstellen, beispielsweise geben de Boer und
Shepard "Strategies
for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", Seiten 205–247, in
Kroon, Hrsg., Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York,
1983), Übersicht über zahlreiche
E.coli-Expressionssysteme; Kucherlapati et al., Critical Reviews
in Biochemistry, Band 16, Ausgabe 4, Seiten 349–379 (1984), und geben Banerji
et al., Genetic Engineering, Band 5, Seiten 19–31 (1983), Übersicht über Verfahren
für die
Transfektion and Transformierung von Säugerzellen; Reznikoff und Gold,
Hrsg., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) geben
einen Überblick über ausgewählte Fragen
der Genexpression in E. coli, Hefen und Säugerzellen; und Tilly, Mammalian
Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) geben Übersicht über Mammalier-Expressionssysteme.
-
Gleichermaßen sind
viele Übersichtsartikel
verfügbar,
die Techniken und Bedingungen für
die Verknüpfung
und/oder Manipulierung von spezifischen cDNS' und Expressionskontrollsequenzen beschreiben, um
für die
Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignete Expressionsvektoren
zu erzeugen und/oder diese zu modifizieren: beispielsweise Maniatis
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory, N.Y., 1982); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach,
Bände I
und II (IRL Press, Oxford, 1985), und Perbal, A Practical Guide
to Molecular Cloning (John Wiley & Sons,
N.Y., 1984).
-
Für die Erfindung
geeignete Expressionssysteme schließen diejenigen ein, die von
Itakura und Riggs, US-Patent 4,704,362 (bakterielle Expression),
von Clark et al., US-Patent 4,675,285, und von Hamer, US-Patent
4,599,308 (Säugerexpression),
und von Kurjan et al., US-Patent 4,546,082 (Hefeexpression), offenbart sind.
Dementsprechend sind die obigen Patente durch Bezugnahme eingeschlossen.
-
Wann
immer SV40-basierende Vektoren eingesetzt werden, beispielsweise
pcD-Vektoren, ist ein bevorzugter Wirt die COS7-Zelllinie, beschrieben
von Gluzman, Cell, Band 23, Seiten 175–182 (1981), und erhältlich von
der ATCC unter der Zugangsnummer CRL1651.
-
Lösliche FcγRIII der
Erfindung werden als pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung
der ITP verabreicht. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame
Menge des FcγRIII
in einem pharmazeutischen Träger.
Ein pharmazeutischer Träger
kann jede kompatible, nichttoxische Substanz sein, die für die Übermittlung
der Zusammensetzung der Erfindung an einen Patienten geeignet ist.
Im Allgemeinen sind für die
parenterale Verabreichung solcher Wirkstoffe geeignete Zusammensetzungen
wohl bekannt, beispielsweise Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflage
(Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativ können die
Zusammensetzungen bzw. Zubereitungen der Erfindung in den Körper eines
Patienten über
ein implantierbares Wirkstoffübermittlungssystem
eingeführt
werden, beispielsweise Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.,
Band 24, Seiten 199–236
(1984).
-
Bei
parenteraler Verabreichung werden die löslichen FcγRIII in einer Einheitsdosis
in injizierbarer Form (Lösung,
Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger formuliert.
Solche Träger
sind inhärent
nichttoxisch und nichttherapeutisch. Beispiele solcher Träger sind
normales Kochsalz, Ringer's
Lösung,
Dextroselösung
und Hank's Lösung. Nichtwässrige Träger wie
Fixed Oils und Ethyloleat können
ebenso eingesetzt werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalz.
Der Träger
kann kleinere Mengen von Additiven wie Substanzen enthalten, die
die Isotonizität
und die chemische Stabilität
fördern,
beispielsweise Puffer und Konservierungsmittel. Das lösliche FcγRIII wird
vorzugsweise in gereinigter Form im Wesentlichen frei von Aggregaten
und anderen Proteinen in einer Konzentration im Bereich von etwa
5 bis 30 mg/ml und vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich
von etwa 10 bis 20 mg/ml formuliert.
-
Die
Wahl eines Verabreichungsschemas zur Übermittlung einer Menge des
löslichen
FcγRIII
an einen Patienten, die zur Verbesserung der Thrombopenie wirksam
ist, die mit der ITP verbunden ist, hängt von zahlreichen Faktoren
ab, einschließlich
der Serumumsatzgeschwindigkeit oder Turn-over-Rate des löslichen
FcγRIII,
dem Serumlevel von kompetitierendem endogenen FcγRIII, der mit der Immunstörung verbunden
ist, der möglichen
Immunogenizität
des löslichen
FcγRIII
und dergleichen. Vorzugsweise maximiert ein Verabreichungsschema
die an den Patienten übermittelte
Menge an löslichem
FcγRIII, übereinstimmend
mit einem akzeptablen Maß an
Nebeneffekten. Dementsprechend hängt
die übermittelte
Menge an löslichem
FcγRIII
teilweise von dem eingesetzten speziellen löslichen FcγRIII und von dem Schweregrad
der behandelten Erkrankung ab. Eine Führung bei der Wahl geeigneter
Dosen findet sich in der Literatur betreffend therapeutische Anwendungen
von Antikörpern
und Antikörperfragmenten,
die Polypeptide von etwa dersel ben Größe wie die löslichen
FcγRIII
darstellen, beispielsweise Bach et al., Kapitel 22, in Ferrone et
al., Hrsg., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications,
Park Ridge, NJ, 1985), und Russell, Seiten 303–357, und Smith et al., Seiten
365–389,
in Haber et al., Hrsg., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy
(Raven Press, New York, 1977). Vorzugsweise liegt die Dosis im Bereich
von etwa 1–20
mg/kg pro Tag, stärker
bevorzugt etwa 1–10
mg/kg pro Tag.
-
BEISPIELE
-
Die
folgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.
Die Wahl von Vektoren und Wirten wie auch die Konzentration der
Reagenzien, die Temperaturen und die Werte anderer Variablen dienen
nur dazu, die Anwendung der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen
und sind nicht als Beschränkungen
derselben aufzufassen.
-
BEISPIEL I. Konstruktion
von stabilen Säugerzelltransformanten,
die human FcγRIII
exprimieren
-
Vorzugsweise
werden Säugerzelllinien,
die zur stabilen Expression von FcγRIII befähigt sind, über die Cotransfektion einer
Säugerzelle
als Wirt mit einem Vektor, der einen selektierbaren Marker trägt, und
einem Vektor, der einen wirtskompatiblen Promotor und das FcγRIII cDNS-Insert trägt, cotransfiziert.
Für pcD(SRα)-GP5 umfassen
geeignete Wirte chinesische Hamsterovarzellen (CHO-Zellen), COS-Affenzellen und
L-Zellen von Mäusen
wie die Thymidinkinase-Mangelmutante (tk–)L-Zeile,
erhältlich
von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer
CCL 1.3. Der selektierbare Marker gestattet es einem, Wirtszellen
zu selektieren, die mit hoher Wahrscheinlichkeit das FcγRIII-Gen
voll in das Wirtsgenom integriert enthalten. Typischerweise beträgt das Verhältnis von
pcD(SRα)-GP5
zum Marker enthaltenen Vektor in der Transfektionslösung etwa
10:1. Somit ist dann, wenn das Markergen in das Wirtsgenom integriert
ist, die Wahrscheinlichkeit sehr hoch, dass pcD(SRα)-GP5 ebenfalls
auf Grund seiner höheren
Konzentration integriert ist. Der selektierbare Marker stellt auch
ein Mittel zur Verfügung,
welches verhindert, dass Kulturen der gewünschten Transformanten von
revertierten Zellen überwuchert
werden.
-
tk–Maus-L-Zellen
werden mit pcD(SRα)-GP5
und pSV2tk, einem pSV2-Plasmid, welches ein Thymidinkinasegen unter
Kontrolle des SV40 Early Promotors trägt, cotransfiziert. Das pSV2-Plasmid wurde von Mulligan
et al., Science, Band 209, Seiten 1422–1427 (1980), und von Subramani
et al. beschrieben, Mol. Cell. Biol., Band 1, Seiten 854–864 (1981),
und ist von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer
37146 erhältlich.
Beide Plasmide werden in E. coli amplifiziert, beispielsweise dem
Stamm HB101, erhältlich
von der ATCC unter der Zugangsnummer 33694, und werden über Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation
gereinigt. Eine Suspension von etwa 1 × 105 von
tk–-L-Zellen
in 10 ml Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DME) mit 10% Kalbsserum wird in eine Falcon
3003 Schale gegeben und bei 37 °C
für 20
Stunden in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxidgas inkubiert, wonach
das Medium durch 10 ml frisches DME mit 10 % Kalbsserum ersetzt
wird. Die Kultur wird für
weitere 4 Stunden inkubiert. Nach Inkubation werden dem Kulturmedium
0,5 ml Lösung
A (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,22)
und 0,5 ml Lösung
B (2 M CaCl2, 10 μg pcD(SRα)-GP5, 1 μg pSV2tk) zugesetzt und die
Kultur bei 37 °C
für 24
Stunden in einer Atmosphäre
von 5 % CO2 inkubiert, wonach die Zellen
in ein selektives Medium mit HAT (beispielsweise Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) gegeben werden. Nach zwei Wochen werden die überlebenden
Kolonien durch Grenzverdünnungen
subkloniert und die Klone auf die Expression von FcγRIII getestet.
-
BEISPIEL II. Verwendung
von stabilen L-Zelltransformanten, die membrangebundenes FcγRIII exprimieren, um
Immunkomplex-Serumlevel zu messen
-
Eine
das FcγRIII
der Erfindung exprimierende stabile transformierte Säugerzelle
kann die Raji-Zelllinie in Tests auf Immunkomplexe ersetzen, beispielsweise
Theofilopoulos et al., Kapitel 28, Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 3. Auflage (American Society for Microbiology, Washington,
D.C., 1986).
-
Ein
Antiserum gegen humanen IgG wird in Kaninchen vorbereitet und die
IgG-Fraktion durch Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Fraktionierung
auf einer Anion-Austauscher-Chromatographiesäule (DEAE-Cellulose 52; Whatman
Chemical Separation Ltd., Maidstone, England) isoliert. Antiserum
aus kommerziellen Quellen kann ebenfalls eingesetzt werden. Die
IgG-Fraktion des Antiserums wird auf 5 mg/ml gebracht und 1 ml mit 125J markiert. Nach Iodierung und Dialyse
wird das Antiserum auf 1 mg/ml mit phosphat-gepuffertem Kochsalz
(PBS) verdünnt,
um eine spezifische Aktivität
von etwa 3 × 105 cpm/μg
zu erreichen. Die mit der FcγRIII-cDNS
transformierten Zellen werden nach etwa 72 Stunden Kultur geerntet
und Anteile von 2 × 106 Zellen in 200 μl Medium in 1,5 ml Kunststoff
Eppendorf®-Hütchen (Brinkmann
Instruments, Inc., Westbury, N.Y.; Katalog Nr. 22-36-411-1) eingegeben.
1 ml Zentrifugiermedium (Eagle Minimalmedium ohne Ca2+ und
Mg2+) wird jedem Hütchen zugesetzt und die Zellen
bei 800 g für
8 Minuten zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeiten
werden abgesaugt und die Zellpellets in 50 μl Zentrifugiermedium resuspendiert.
Zu testendes Serum wird vierfach in 0,15 M NaCl (physiologisches
Kochsalz) verdünnt
und 25 μl
zu den transformierten Zellen zugesetzt. Nach 45 Minuten Inkubationszeit
bei 37 °C
un ter sanftem Schütteln
per Hand alle 5 bis 10 Minuten werden die Zellen 3-mal mit Zentrifugiermedium
gewaschen. Nach der letzten Waschung werden die Zellen unter leichtem
Schütteln
alle 5 bis 10 Minuten 30 Minuten bei 4 °C mit 125J-markiertem
Antihuman-IgG aus Kaninchen, verdünnt mit Zentrifugiermedium,
enthaltend 10 g Humanserumalbumin (HSA) pro Liter, reagieren gelassen.
Nach Inkubation werden die Zellen 3-mal gewaschen, die Überstandsfluide
vollständig
abgesaugt und die Radioaktivität des
Zellpellets in einem Gammazählgerät ermittelt.
Alle Tests werden doppelt ausgeführt.
Die Aufnahmemenge, ausgedrückt
als absolute Zählrate,
die Prozentzahl des Inputs oder der Mikrogramm an Antikörper wird
als Standardkurve der radioaktiven Antikörperaufnahme durch mit normalem
Humanserum inkubierte Zellen (Komplementquelle), enthaltend verschiedene
Mengen an aggregiertem human IgG (AHG) bezeichnet. Die Menge an
Immunkomplex im Serum wird einer Menge von AHG nach Berichtigung
um den Verdünnungsfaktor gleichgesetzt
und wird als Mikrogramm AHG-Äquivalent
pro Milliliter Serum ausgedrückt.
Das lösliche
AHG wird aus einer Lösung
von 6,5 mg Cohn Fraktion II oder isoliertem human IgG pro Milliliter
physiologisches Kochsalz, erwärmt
auf 63 °C
für 30
Minuten und zentrifugiert (1500 × g, Minuten) zur Entfernung
unlöslicher großer Aggregate,
gebildet. Der Überstand
wird anschließend
mit Puffer verdünnt,
um eine Endkonzentration von etwa 1,6 mg/ml zu erhalten. Anteile
(0,5 ml) dieser Zubereitung werden bei –70 °C gelagert und können bis
zu einem Monat lang verwendet werden.
-
Die
Standardkurve der radioaktiven Antikörperaufnahme wird wie folgt
konstruiert. 50 ml Anteile von AHG (80 μg Protein) werden seriell in
Kochsalz verdünnt
(11 2-fache Verdünnungen).
Anschließend
werden 50 μl
einer 2-fachen Verdünnung
von normalem Humanserum (Komplementquelle), frisch erhalten oder
bei –70 °C gelagert,
jeder Verdünnung
von AHG zugesetzt, sorgfältig
gemischt und bei 37 °C
für 30
Minuten inkubiert. Danach setzt man 25 μl jeder Mischung zu 2 × 106 Zellen in doppelten Ansätzen zu (4-fache Endverdünnungen
des Serums, enthaltend 20 μg
bis etwa 20 ng AHG); die Mischung wird inkubiert, gewaschen und
mit radioaktiv markiertem Antikörper
umgesetzt. Die Radioaktivität
wird anschließend
wie bei den Testseren gezählt.
Eine Basislinie der Aufnahme radioaktiver Antikörper (Hintergrund) durch mit
25 μl einer
4-fachen Verdünnung
von normalem Humanserum, verwendet als Komplementquelle in der Bezugskurve,
wird ebenfalls etabliert.
-
Standardzubereitungen
der IgG-Aggregate und von Immunkomplexen des Tetanus-Toxoids mit
Human-Anti-Tetanus-Toxoid sind in jüngerer Zeit unter Aufsicht
der International Union of Immunologists entwickelt worden und sind über den
Bluttransfusionsservice des Schweizer Roten Kreuzes erhältlich,
beispielsweise Nydegger et al., Clin. Exp. Immunol., Band 58, Seiten
502–509
(1984).
-
BEISPIEL III. Konstruktion
eines löslichen
human FcγRIII
-
Lösliches
FcγRIII
wurde unter Verwendung der ortspezifischen oligonucleotid-dirigierten
Mutagenese des FcγRIII
cDNS-Inserts von pcD(SRα)-GP5
konstruiert. Das gesamte cDNS-Insert von pcD(SRα)-GP5 wurde als ein 2,4 KB Bam
HI-Fragment in das Bluescript KS-Plasmid (Stratagene, San Diego,
CA) subkloniert und anschließend
einzelsträngige
DNS hergestellt.
-
Ein
synthetisches Oligonucleotid (Minimalgröße etwa 18 Nucleotide), kodierend
ein TAA-Stopp-Codon und
eine Bam HI-Site (wobei die Mutation in 2 in Fettbuchstaben
gezeigt sind), wurde als Primer für die Synthese des komplementären Stranges
unter Verwendung des großen
Fragments der DNS-Polymerase I (Amersham, Arlington Heights, IL)
eingesetzt. 2 zeigt die Position des Stopp-Codons
und der Bam HI-Site bezogen auf die von der FcγRIII-cDNS kodierten Hauptdomänen: S steht
für den
das Signalpeptid kodierenden Bereich, EC steht für die extrazelluläre Domäne von FcγRIII kodierenden
Bereich, H steht für
den die hydrophobe oder Transmembrandomäne von FcγRIII kodierenden Bereich und
C steht für
den die cytoplasmatische Domäne
kodierenden Bereich. Die Einführung
des Stopp-Codons, wie in 2 angezeigt, erzeugt ein mutantes
FcγRIII,
dem sowohl die cytoplasmatische als auch die Transmembrandomäne fehlen;
es ist löslich,
wie durch die Bezeichnung "sFcγRIII" neben der modifizierten
DNS-Sequenz angezeigt. Nachdem die Identität der Mutante durch DNS-Sequenzanalyse
bestätigt
worden war, wurde sie zurück
in die Bam HI-Site des pcD(SRα)-Vektors
subkloniert, in E. coli amplifiziert und in COS7-Zellen mittels
Elektroporation transfiziert. Einen Tag vor der Transfektion wurden
etwa (1,5–2,0) × 106 COS7-Affenzellen
auf einzelne 100 mm Platten in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) enthaltend 6 % Kalbsserum
und 2 mM Glutamin, ausgesät.
Um die Transfektion durchzuführen,
wurden die Zellen durch Trypsinierung geerntet und gezählt, 2-mal
in serumfreiem DME gewaschen und auf (1–7) × 106 Zellen
pro Milliliter in serumfreiem DME suspendiert. Die DNS wurde auf
25 μg/ml
zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen
gelassen, wonach 0,8 ml in einer 0,4 cm sterilen Cuvette mit einem
Bio Rad® Genpulser
(Richmond, CA) bei 250 Volt und 960 Mikrofarad gepulst wurden. Nach
dem Pulsen wurden die Zellen 10 Minuten stehen gelassen und anschließend in einer
Konzentration von (1,5–2,0) × 106 pro 100 mm Platte in DME plus 6 fetales
Kalbsserum ausplattiert. Die Überstände wurden
geerntet und auf lösliches
FcγRIII
nach 72 Stunden analysiert.
-
Der
lösliche
FcγRIII
in den Überständen der
COS7-Kultur wurde weiter mittels Gelelektrophorese analysiert und
immun gefällt.
Die Ergebnisse davon din in 3 veranschaulicht.
Die Spuren 1, 3 und 6 enthielten jeweils Proteine aus den Kulturüberständen der
mit dem die cDNS für
das lösliche
FcγRIII
tragenden pcD transfizierten COS7-Zellen. Proteine aus Spur 1 wurden
mit einem unspezifischen Maus-IgG2-Antikörper immun
gefällt;
Proteine aus Spur 3 wurden mit humanem IgG immun gefällt, vermutlich
auf Grund der Bindung des Fc-Teils des Antikörpers mit dem löslichen
FcγRIII;
und Proteine aus Spur 6 wurden mit dem monoklonalen Antikörper 3G8
immun gefällt,
der für
die extrazelluläre
Domäne
von FcγRIII
spezifisch ist. Größenmarker
in Nachbarschaft zu der Kontrollspur (Spur 1) sind in Kilodalton
angegeben. Der lösliche
FcγRIII
entspricht der breiten Bande bei etwa 40 Kilodalton. Die Spuren
4 und 7 enthalten Proteine aus den Kulturüberständen von COS7-Zellen, die mit
einem die cDNS für
lösliches
FcγRIII
tragenden pcD transfiziert waren und in der Anwesenheit von Tunicamycin
kultiviert worden waren. Tunicamycin inhibiert die posttranslationale
Anheftung von N-verbundenen Kohlenhydraten an Proteine. Dieses wurde
in einem Versuch angewandt, die Natur der offensichtlichen Heterogenität der 40
Kilodalton Bande zu ermitteln. Tunicamycin verursachte das Auftreten
zweier Banden geringeren Molekulargewichts, was mit der Deglycosylierung
des löslichen
FcγRIII
konsistent ist. Das Tunicamycin wurde den Kulturen, wie von Martens
et al., PNAS 84: 809–813
(1987) offenbart, zugesetzt. Die Spuren 2 und 5 enthielten Proteine
aus Kulturüberständen von
COS7-Zellen, die denselben Manipulationen wie die COS-Zellen der
Spuren 3 und 4 und der Spuren 6 und 7 unterworfen worden waren,
mit der Ausnahme, dass keine Plasmid-DNS in das Transfektionsprotokoll
eingeschlossen wurde.
-
BEISPIEL IV: Isolierung
einer humanen FcγRIII-Variante
aus natürlichen
Killerzellen
-
Eine
cDNS-Datenbank wurde aus mRNS, extrahiert aus einer Zelllinie von
humanen natürlichen
Killerzellen (NK-Zelllinie), unter Verwendung des pcD(SRα)-Expressionsvektors
konstruiert. Die Datenbank wurde mit einer Sonde gescreent, die
aus dem cDNS-Insert von pcD(SRα)-GP5 konstruiert war,
das mit 31P radioaktiv markiert war, über statistisch
geprimte DNS-Markierung
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Ein Klon pcD(SRα)-NL10 wurde
erhalten, der eine Aktivität
der Bindung an human IgB aufwies. Die Sequenz des dDNS-Inserts von
pcD(SRα)-NL10
ist in 3 veranschaulicht. Es ist ersichtlich,
dass die Aminosäuresequenz
dieses FcγRIII
und diejenige, die von pcD(SRα)-GP5
kodiert werden, sehr ähnlich
sind, wobei sie sich in der extrazellulären Domäne nur durch sechs Aminosäuren unterscheiden.
-
Die
Beschreibungen der vorgenannten Ausführungsformen der Erfindung
sind zum Zweck der Veranschaulichung und Beschreibung gegeben. Sie
sollen nicht abschließend
sein oder die Erfindung auf die präzise offenbarten Formen beschränken, und
offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen im
Licht der oben genannten Lehre möglich.
Die Ausführungsformen
wurden gewählt
und sind beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und deren
praktische An wendung am besten zu erklären und dadurch andere Fachleute
in die Lage zu versetzen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen
und mit solchen Modifikationen, die dem angestrebten speziellen
Einsatz angemessen sind, einzusetzen. Es ist angestrebt, dass der Bereich
der Erfindung durch die hieran angefügten Ansprüche definiert wird.
-
Die
Anmelder haben pcD(SRα)-GP5
bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC)
unter der Zugangsnummer 67707 hinterlegt. Diese Hinterlegung erfolgte
unter dem Budapester Vertrag für
die Hinterlegung von Mikroorganismen; und auch unter den Bedingungen,
wie bereitgestellt durch die Übereinkunft
der ATCC für
Culture Deposit for Patent Purposes (Kulturhinterlegung für Patentzwecke),
welche sicherstellt, dass die Hinterlegung dem US Commissioner of
Patents and Trademarks gemäß 35 U.S.C.
122 und 37 C.F.R.1.14 zugänglich
gemacht werden wird und der Öffentlichkeit
nach Erteilung eines US-Patents zugänglich gemacht werden wird,
was erfordert, dass die Hinterlegung aufrecht erhalten wird. Zugänglichkeit des
hinterlegten Stammes ist nicht als eine Lizenz zu deuten, die Erfindung
zu praktizieren unter Verletzung der Rechte, die im Auftrag von
jeder Regierung in Übereinstimmung
mit ihren Patentgesetzen gewährt
wird.
