DE68925366T2 - Konjugierte polypeptide und verfahren zur herstellung und verwendung - Google Patents
Konjugierte polypeptide und verfahren zur herstellung und verwendungInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit aktiven Funktionalitäten, die nahe einer Bindungsstelle kovalent gebunden sind. Spezieller betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, worin die aktive Funktionalität ein Reportermolekül oder ein Chemotherapeutikum ist.
- Zahlreiche biologische Proteine sind als Ergebnis intermolekularer Bindungskräfte, einschließlich von elektrostatischen Bindungen, Wasserstoffbindungen und Van-der- Waals-Bindungen, zur spezifischen Bindung an andere biologische Moleküle befähigt. Eine solche Bindung tritt an einer Stelle auf dem Protein auf, die im allgemeinen als Bindungsstelle bezeichnet wird; zur Bindung kommt es nur bei Target-Liganden mit einer spezifischen Molekülgeometrie, die zur Bindungsstelle komplementär ist. Beispiele für solche Wechselwirkungen sind u. a. Antikörper-Antigen-Bindung, Enzym- Substrat-Bindung, Hormon-Rezeptor-Bindung, Lymphokin-Lymphokinrezeptor-Bindung und dergleichen. Eine Vielzahl wissenschaftlicher, medizinischer und kommerzieller Verfahren, einschließlich von Immunoassays, therapeutischen Behandlungen, immunohistochemischen Verfahren, Proteintrennungen, Reaktionskatalyse durch Stabilisierung von Übergangszuständen und dergleichen, beruht auf der Verfügbarkeit solcher spezifischer Bindungswechselwirkungen.
- In vielen Fällen wäre es wünschenswert, ein spezifisches Bindeprotein oder Polypeptid nahe der Bindungsstelle mit einem Konstituenten oder einer Funktionalität auszustatten, wobei der Konstituent für eine gewünschte Wechselwirkung mit dem Target-Liganden sorgen kann. Beispielsweise ist es oft wünschenswert, Konstituenten nahe einer für einen bestimmten Target-Liganden spezifischen Polypeptid-Bindungsstelle bereitzustellen, die nachweisbar sind oder die therapeutische oder katalytische Aktivität aufweisen. Durch das Vorsehen von chemotherapeutischen Mitteln nahe der Bindungsstelle (und an keinen anderen Stellen) spezifischer Bindeproteine, die zur Bindung erkrankter Zellen fähig sind, kann die chemotherapeutische Wirkung verstärkt werden, während ansonsten gegebenenfalls vorhandene toxische und andere Nebenwirkungen herabgesetzt werden. Durch Vorsehen eines Reportermoleküls nahe einer für eine bestimmte Substanz spezifischen Proteinbindungsstelle (und an keinen anderen Stellen) können Assays bereitgestellt werden, worin die Gegenwart von Substrat für die direkte Modulation des vom Reportermolekül beobachteten Signals sorgt.
- Im allgemeinen sind Verfahren zur kovalenten Bindung aktiver Funktionalitäten an spezifische Bindeproteine, wie z. B. Antikörper, bisher nicht nahe der Bindungsstelle lokalisiert worden. Das heißt, die Bindung wurde über Aminosäureseitenketten und Kohlenhydrate herbeigeführt worden, die an verschiedenen, nicht auf Positionen nahe der Bindungsstellen beschränkten Positionen auf der Proteinoberfläche zu finden sind. Es wurden zwar Enzyme so modifiziert, daß sie nahe aktiver Stellen Funktionalitäten, wie z. B. Cofaktoren, enthielten, die lokalisierte Bindung von Reportermolekülen und Chemotherapeutika nahe einer Proteinbindungsstelle wurde jedoch im allgemeinen nicht gelehrt. Darüberhinaus sind Verfahren zur lokalisierten Bindung aktiver Funktionalitäten an Proteine, die nicht strukturell charakterisiert worden sind, ungeachtet der Art des Proteins und der Art der aktiven Funktionalität im allgemeinen unbekannt.
- In Anbetracht obiger Fakten wäre es wünschenswert, Polypeptide mit Bindungsstellen zu schaffen, worin Chemotherapeutika oder Reportermoleküle nahe der Bindungsstelle gebunden und im Rest des Polypeptids im allgemeinen nicht vorhanden sind. Es wäre weiters wünschenswert, Verfahren zur kovalenten Bindung aktiver Funktionalitäten, einschließlich von Reportermolekülen, chemotherapeutischen Mitteln, katalytischen Gruppen, reaktiven Gruppen und dergleichen, nahe der Bindungsstelle an Polypeptide bereitzustellen, selbst wenn die Struktur des Polypeptids unbekannt ist.
- Es sind Immunotoxine bekannt, die Toxine und Arzneimittel umfassen, die kovalent an für Zell-Rezeptoren und andere Ziele spezifische Antikörper gebunden sind. Siehe z. B. US-A-4.340.535; 4.368.149; 4.489.710 und 4.671.958. Keines dieser Patente jedoch offenbart die stellenspezifische Bindung der Toxine und Arzneimittel nahe der Antikörperbindungsstelle. EP-A-187.658 offenbart kovalent an Aktivatoren gebundene Antikörper. Die Antikörper binden sich an erkrankte Stellen innerhalb eines Wirts, und die Aktiviatoren wechselwirken mit einer inaktiven Substanz innerhalb des Wirts, so daß eine aktive Substanz erzeugt wird. Die Bindung der Aktivatoren ist nicht auf die Antikörperbindungsstelle beschränkt. US-A-3.817.752 beschreibt Homogen-Enzym- Immunoassays unter Verwendung von nachweisbaren Enzymen mit daran gebundenem Hapten. Indem die Enzyme Antikörpern ausgesetzt werden, die für das Hapten spezifisch sind, kann Modulation der Enzymaktivität erreicht werden. Die Verwendung von an Enzyme gebundenen Spinmarkierungen zur Untersuchung der Enzymaktivität wird in Jones et al. (1973) "Eur. J. Biochem." 34 : 2840, geoffenbart. Es wurden polyklonale Antikörper mit Cofaktorbindungsstellen erzeugt (Raso und Stollar (1975) "Biochemistry" 14 : 584-591). Die Erzeugung monoklonaler Antikörper mit einer Cofaktorbindungsstelle wird in Shokat et al. (1988) "Angew. Chem." 100 : 1227-1229, beschrieben. Die Erzeugung von Affinitätsmarkierungen für Antikörperkombinationsstellen wird von Kohen et al. (1980) "FEBS Lett." 111 : 427431; Metzger et al. (1970), "Biochemistry" 9 : 1267-1278; und Givol et al. (1971) "Biochemistry" 10 : 3461-3466, beschrieben. Stellengerichtete Mutagenese wurde in Verbindung mit hochauflösender Röntgenkristallographie eingesetzt, um die Struktur von Enzymbindungsstellen und die Funktion solcher Stellen bei der Katalyse zu analysieren. Wilkinson et al. (1984) "Nature" 307 : 187-188; Craik et al. (1985) "Science" 228 : 291-297; Schultz et al. (1985) "Biochemistry" 24 : 6840-6848; Dalbadie-McFarland (1982) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 79 : 6409-6413; und Sigal et al. (1984) "J. Biol. Chem." 259 : 5327-5332. Ein Cystein im aktiven Bereich des Enzyms Papain wurde mit einem Flavin-Cofaktor modifiziert. Kaiser et al. (1984) "Science" 226 : 505-510. Ein Thiol wurde in die Enzyme Staphylokokken-Nuclease und RNase S eingebracht und in der Folge mit einem Oligonukleotid derivatisiert. Corey et al. (1987) "Science" 238 : 1 401- 1403. Das Serin der aktiven Stelle von Subtilisin wurde chemisch in ein Cystein umgewandelt. Bender et al. (1966) "J. Am. Chem. Soc." 88 : 3153-3154 und Koshland et al. (1966) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 56 : 1606-1611.
- Gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit nahe einer Bindungsstelle gebundenen aktiven Funktionalitäten bereitgestellt, worin die aktiven Funktionalitäten auf geeignete Weise aus der aus Reportermolekülen und Chemotherapeutika bestehenden Gruppe ausgewählt werden. Die aktiven Funktionalitäten sind an Stellen auf den Polypeptiden, die nicht nahe der Bindungsstelle liegen, im wesentlichen nicht vorhanden, und das Vorhandensein der Funktionalitäten stört die Ligandenbindung an die Bindungsstelle im wesentlichen nicht. Polypeptide liegen üblicherweise in Form von Antikörpern oder Antikörperfragmenten vor, wobei die Antikörper zur Bindung bestimmter Target-Liganden fähig sind, aber es können auch andere Formen von Bindeproteinen Anwendung finden, wie z. B. Enzyme, Hormone, Lymphokine, Lectine, Avidin, membrangebundene Zell-Rezeptoren, lösliche Rezeptoren, virale Hüllproteine, Strukturproteine und dergleichen. Polypeptide mit einer Bindungsstelle, die für einen interessierenden Analyten spezifisch ist, können an Reportermoleküle, wie z. B. Fluorophore, chemolumineszierende Substanzen, biolumineszierende Substanzen, Farbstoffe, Spinmarkierungen, Flavine, piezoelektrische Moleküle, Biotin, redoxaktive Moleküle und dergleichen, gebunden werden und sind zur Durchführung von Assays nützlich, bei denen die Aktivität oder Nachweisbarkeit des Reportermoleküls direkt durch Bindung an den Analyten moduliert wird. Polypeptide mit spezifischen Bindungsstellen für erkrankte Zellen, Tumoantigene, Pathogene und dergleichen können an Chemotherapeutika, wie z. B. Toxine, Bakterizide, Radikalfänger, Radikalbildner, Oxidationsmittel, Alkylierungsmittel und dergleichen, gebunden werden und dienen zur therapeutischen Behandlung, bei der die Aktivität des Chemotherapeutikums maximiert und die Reaktivität gegenüber Nebenreaktionen minimiert wird.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Herstellung nachweisbarer und chemotherapeutischer Polypeptide durch posttranslationale Modifikation der Polypeptide zum Einbringen der interessierenden aktiven Funktionalität bereitgestellt. Die Polypeptide können natürlich oder synthetisch sein, wobei zu den synthetischen Polypeptiden sowohl jene gehören, die durch Rekombinations-Techniken hergestellt wurden, als auch jene, die durch Festphasensynthesetechniken hergestellt wurden. Die synthetischen Polypeptide können Modifikationen eines exemplarischen natürlichen Polypeptids sein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren nahe der Bindungsstelle substituiert oder hinzugefügt sind. Durch das Einbringen seltener oder nicht-natürlicher Aminosäuren nahe der Bindungsstelle und spezifisches Binden der aktiven Funktionalität an die seltene oder nicht-natürliche Aminosäure kann nicht-lokalisierte Bindung der Funktionalität an von der Bindungsstelle entfernten Stellen im Polypeptid minimiert oder vermieden werden. Das Einbringen nicht-natürlicher Aminosäuren nahe der Bindungsstelle ist von besonderem Interesse, da sie einzelne reaktive Stellen liefern können, die gewährleisten können, daß die eingebrachte aktive Funktionalität sich nur an die Position nahe der Bindungsstelle bindet.
- Zum Modifizieren natürlicher Polypeptide, d. h. jener, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden, stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren bereit, das die lokalisierte Bindung der aktiven Funktionalität nahe der Bindungsstelle gewährleistet. Das Verfahren ist selbst dann nützlich, wenn Information über die Struktur des Polypeptids fehlt. Bei diesem Verfahren werden "Affinitätsmarkierungen" eingesetzt, die eine erste reaktive Gruppe umfassen, die durch einen abspaltbaren Linker abspaltbar an einen Liganden gebunden sind, wobei der Ligand für die Bindungsstelle des Polypeptids spezifisch ist. Die erste reaktive Gruppe kann sich kovalent an eine Aminosäureseitenkette binden, üblicherweise eine gewöhnliche Seitenkette, von der zu erwarten ist, daß sie nahe der Bindungsstelle (und anderswo) auf dem Polypeptid anzutreffen ist. Durch Kombinieren von Polypeptid mit der Affinitätsmarkierung bildet der Ligand einen Komplex mit der Bindungsstelle, so daß die erste reaktive Gruppe zu einer Position nahe der Bindungsstelle befördert wird. Die erste reaktive Gruppe kann dann kovalent an die Aminosäureseitenkette nahe der Bindungsstelle gebunden werden.
- Anschließend wird die reaktive Gruppe vom Polypeptid abgespalten und der Ligand vom Polypeptid entfernt. Das Polypeptid bleibt mit einer nahe der Bindungsstelle kovalent gebundenen Einheit (einem Artefakt) der ersten reaktiven Gruppe zurück. In manchen Fällen kann die Einheit selbst die aktive Funktionalität sein. Häufiger jedoch dient die Einheit als Bindungsstelle zum Anbinden der interessierenden aktiven Funktionalität. Die aktive Funktionalität kann unter derartigen Bedingungen an die Bindungsstelle für die Einheit gebunden werden, die das Festsetzen irgendwo anders am Peptid minimieren oder vollkommen verhindern. Dieses Verfahren zum Anbringen der aktiven Funktionalität ist nicht auf Reportermoleküle und Chemotherapeutika beschränkt, sondern dient für eine große Vielzahl an Funktionalitäten, einschließlich von katalytischen und reaktiven Funktionalitäten, wie in WO-A-90/05.785 und WO-A- 90/05.746 beschrieben.
- Fig. 1 veranschaulicht die in Beispiel 1 des experimentellen Teils verwendeten, abspaltbaren Affinitätsmarkierungen.
- Fig. 2 zeigt die Verfahren zum Synthetisieren der Affinitätsmarkierungen aus Fig. 1.
- Fig. 3 veranschaulicht die Strategie zum Einbringen einer Thiol-Funktionalität in die Bindungsstelle von MOPC 315 in Beispiel 1.
- Fig. 4 ist ein HPLC-Profil der tryptischen Digeste der schweren Kette von mit 2 markierten Fab (Fig. 1), überwacht durch UV-Absorptionsmittel (durchgehende Linie) und Radioaktivität (strichlierte Linie), wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Fig. 5 veranschaulicht die DNP-hältigen Ester, die in Beispiel 1 als Substrate für die Reaktion mit thiolisiertem Fab eingesetzt werden.
- Fig. 6 ist ein Eadie-Hofstee-Plot der Spaltung von Ester 14 durch mit 2 markiertes, thiolisiertes Fab in Beispiel 1.
- Fig. 7 veranschaulicht die Ergebnisse eines Fluoreszenz-Quenching-Bindungsassays für DNP-Glycin mit Fluorescein-Fab-Addukt ( ) über dem Vergleich mit Fluorescein plus underivatisiertem Fab ( ). Fluoreszenz-Quenching-Versuche wurden bei 10ºC unter Einsatz von 492 nm zur Erregung und unter Emissionsmessung bei 521 nm durchgeführt. Das Fluorescein-Fab-Addukt wurde mit (obigem) Assaypuffer auf 0,10 µM verdünnt. Aliquote von 2,4-DNP-glycin wurden hinzugefügt, und nach dem Mischen die Fluoreszenz beobachtet. Freies N-Fluoresceinthioureido-2-mercapthoethylamin und underivatisiertes Fab, jeweils 0,10 µM, wurden in einem ähnlichen Versuch behandelt.
- Es werden neue Polypeptide mit zur spezifischen Bindung eines vorbestimmten Target- Liganden befähigten Bindungsstellen hergestellt, die zumindest eine aktive Funktionalität nahe der Bindungsstelle umfassen. Andere Positionen auf dem Polypeptid als die Bindungsstelle sind im wesentlichen frei von der aktiven Funktionalität, so daß die von der Funktionalität gelieferte Aktivität an der Bindungsstelle lokalisiert ist. Die aktive Funktionalität kann ein Reportermolekül sein, wodurch die Polypeptide zum Nachweis des vorbestimmten Target-Liganden in einer Probe dienen, von der vermutet wird, daß sie einen solchen Liganden enthält. Bindung des Liganden an das Polypeptid moduliert die von der aktiven Funktionalität gezeigte Wirkung, was den Nachweis und (gegebenenfalls) die quantitative Bestimmung des in der Probe vorhandenen Substrats ermöglicht. Alternativ dazu kann die aktive Funktionalität ein Chemotherapeutikum sein, wodurch das Polypeptid zur Behandlung eines Erkrankungszustandes durch stellenspezifische Arzneimittelabgabe dient. Die Lokalisierung des Arzneimittels nahe der Bindungsstelle erhöht die Effizienz der Arzneimillelabgabe, indem die erforderliche Gesamtarzneimitteldosis verringert wird. Es werden auch die mit nichtspezifischer Abgabe des Arzneimittels verbundenen Nebenwirkungen verringert.
- Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polypeptide haben die folgende Formel:
- P-X-Y-Z,
- worin P, X, Y und Z wie folgt definiert sind.
- P ist ein Polypeptid mit einer Bindungsstelle, die zur spezifischen Bindung des interessierenden Target-Liganden fähig ist. Das Polypeptid kann natürlich oder synthetisch sein, wobei sich der Begriff natürlich im allgemeinen auf Polypeptide bezieht, die aus lebenden biologischen Organismen isoliert wurden, z. B. Zellkultur, Tiergewebe, Pflanzenquellen und dergleichen, und der Begriff synthetisch sich im allgemeinen auf Polypeptide bezieht, die nach Verfahren mittels rekombinanter DNA und nach chemischen Syntheseverfahren hergestellt werden, wie z. B. Festphasensynthesetechniken. Die Polypeptide können aus einer einzelnen Kette bestehen oder Mehrfachketten umfassen und können glykosyliert oder frei von Glykosylierung sein. Die Größe des Polypeptids ist nicht entscheidend, wobei die Polypeptide im Bereich von 2 Kilodalton (kD) bis 1000 kD, üblicherweise im Bereich von 20 kD bis 200 kD, liegen. Die Polypeptide können in Form von natürlichen biologischen Proteine vorliegen, wie z. B. als Antikörper, Enzyme, Hormone, Lectine, Lymphokine, Avidin (einschließlich von Streptavidin), membran-gebundene Zell- Rezeptoren, lösliche Rezeptoren, virale Hüllproteine, Strukturproteine und Fragmente davon, sowie andere Proteine, die fähig sind, Target-Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden, einschließlich von Analyten; Biotin; erkrankten Zellen; Tumorzellen, normalen Zellen, speziellen Klassen normaler Zellen (z. B. T-Lymphozyten); bakteriellen, Pilz- und viralen Pathogenen; Parasiten; Mycoplasma; und dergleichen. Von besonderem Interesse sind Antikörper, die gegen den interessierenden Target-Liganden gezüchtet worden sind.
- Gegebenenfalls können synthetische Polypeptide hergestellt werden, worin die Struktur eines natürlichen Antikörpers (d. h. eines solchen, der gegen ein Immunogen entwickelt wurde) oder eines anderen natürlichen Proteins auf vorbestimmte Weise modifiziert werden kann, um das Einbringen der interessierten aktiven Funktionalität zu erleichtern, z. B. können Aminosäuren hinzugefügt, gelöscht oder substituiert werden, um eine einzigartige oder seltene Anfügungsstelle nahe der Bindungsstelle bereitzustellen. Solche modifizierten Polypeptide behalten im allgemeinen die Fähigkeit bei, jenes natürlich auftretende Protein nachzuahmen, von dem sie abstammen, und behalten insbesondere die Fähigkeit bei, sich an den interessierenden Target-Liganden zu binden. Im Fall aktiver Proteine, wie Enzyme, Hormone, Lymphokine und dergleichen, ist es häufig wünschenswert, deren Aktivität zu verringern oder zu eliminieren, so daß sich das entsprechende Polypeptid an das interessierende Target binden kann, ohne die dem Protein normalerweise zugeordnete Funktion zu erfüllen.
- Alternativ dazu können die bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polypeptide neue Konfigurationen annehmen, die für bekannte Klassen biologischer Proteine nicht charakteristisch sind. Die Affinität beträgt zumindest etwa 10&supmin;³ Mol&supmin;¹, üblicherweise zumindest etwa 10&supmin;&sup4; Mol&supmin;¹, vorzugsweise zumindest etwa 10&supmin;&sup5; Mol&supmin;¹, mehr bevorzugt zumindest etwa 10&supmin;&sup6; Mol&supmin;¹, oder mehr. Im Fall modifizierter Polypeptide, d. h. bei jenen, die gegenüber einem natürlichen oder exemplarischen Protein Änderungen in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen, sollte es als Ergebnis der Modifikation keinen nennenswerten Verlust an Bindungsaffinität geben, und das modifizierte Polypeptid sollte im allgemeinen den soeben angeführten Affinitätswerten entsprechen, selbst wenn es zu einem gewissen Affinitätsverlust kam.
- Polypeptide mit der gewünschten Affinität werden am einfachsten hergestellt, indem Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen den Target-Liganden oder ein Analog davon gezüchtet werden. Die Antikörper können zu jeder Klasse gehören, einschließlich von IgG, IgA, IgD, IgE und IgM, wobei jedoch IgG und IgM die häufigsten sind. Antikörperfragmente, insbesondere durch Pepsinspaltung hergestellte Fab-Fragmente, sind gegenüber der Verwendung von intakten Antikörpermolekülen häufig vorzuziehen. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und monoklonalen Antikörpern gegen bestimmte haptene oder antigene Target-Substrate werden in Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic press, 2. Aufl. (1986); Kennet et al. "Monoclonal Antibodies" (1980); US-A-4.423.147; 4.381.292; 4.363.799; 4.350.683; und 4.127.124 gelehrt.
- Die Bindungsstelle des Polypeptids ist durch eine Gruppierung von Aminosäuren definiert, die fähig sind, sich spezifisch an den interessierenden Target-Liganden zu binden. Die Bindungsstelle umfaßt üblicherweise etwa 2 bis 15 Aminosäuren, häufiger etwa 2 bis 10 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren aufeinanderfolgend oder entlang der primären Sequenz des Polypeptids getrennt sein können. Wenn die Aminosäuren nicht aufeinanderfolgen, werden sie üblicherweise durch die Faltung (Sekundär-Struktur) des Polypeptids zusammengebracht. Die Bindungsstelle definiert üblicherweise einen Hohlraum oder eine andere dreidimensionale Struktur, die mit einem Abschnitt des Reaktanden oder der reaktiven Zwischensubstanz, die gerade gebunden wird, komplementär ist. Insbesondere die Seitenketten der Aminosäuren innerhalb der Bindungsstelle stehen mit der speziellen Struktur auf dem Target-Liganden in Wechselwirkung (die im Fall von Antikörperbindung als Epitop oder Determinantenstelle bezeichnet wird).
- X ist eine Aminosäureseitenkette nahe der Bindungsstelle des Polypeptids P. Die Seitenkette X befindet sich normalerweise außerhalb der dreidimensionalen Struktur der Bindungsstelle, kann jedoch in manchen Fällen auch innerhalb der Bindungsstelle liegen, solange das Vorhandensein der aktiven Funktionalität die Bindung zwischen dem Polypeptid und dem Target-Liganden nicht wesentlich beeinträchtigt. Im allgemeinen jedoch ist die Seitenkette X in einem Abstand um die Peripherie der Bindungsstelle herum angeordnet, der ausreichend gering ist, um für eine gewünschte Wechselwirkung (z. B. Arzneimittelabgabe oder Löschen eines fluoreszierenden Reportermoleküls) zwischen der aktiven Funktionalität und dem Target-Liganden zu sorgen. Der Abstand zwischen der Seitenkette X und der Bindungsstelle ist üblicherweise geringer als etwa 10 Å, vorzugsweise geringer als etwa 5 Å.
- Die Seitenkette X kann eine natürliche Aminosäureseitenkette (d. h. eine Seitenkette einer der natürlich auftretenden Aminosäuren) sein oder kann eine synthetische Aminosäureseitenkette sein (d. h. eine Seitenkette einer Aminosäure, die nicht in der Natur vorkommt und die nach einem synthetischen Herstellungsverfahren, wie nachstehend detaillierter beschrieben, spezifisch in das Polypeptid eingefügt wurde). In beiden Fällen ist die Aminosäureseitenkette ausreichend reaktiv, um die Verbindung einer aktiven Funktionalität Z über eine geeignete Linker-Gruppe Y zu ermöglichen, wie nachstehend detaillierter beschrieben.
- Wenn die Seitenkette X an einer natürlich vorkommenden Aminosäure hängt, ist die Seitenkette üblicherweise nicht-aliphatisch und wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der basischen Seitenketten (jenen von Lysin, Arginin und Histidin), der sauren Seitenketten (Aspartat und Glutamat), der aliphatischen Hydroxylseitenketten (Serin und Threonin), Thiol (Cystein), Sulfid (Methionin), Phenol (Tyrosin) und Aminoindol (Tryptophan).
- Vorzugsweise ist die Aminosäureseitenkette auf einer relativ seltenen Aminosäure vorhanden, die so gewählt wird, daß sie nahe der Polypeptid-Bindungsstelle vorhanden ist, während sie auf der übrigen freiliegenden Oberfläche des Polypeptids nicht vorhanden ist. Selbstverständlich können solche seltenen Aminosäuren durch Modifikation der Primärstruktur des Polypeptids nach Syntheseverfahren, wie nachstehend detaillierter beschrieben, absichtlich an einer Stelle nahe der Bindungsstelle eingebracht werden (und aus von der Bindungsstelle fernen Stellen gelöscht werden). Ob eine Aminosäure als selten erachtet wird oder nicht, hängt schlußendlich von der Struktur des jeweiligen Polypeptids ab. Jede Aminosäure, die nahe der Bindungsstelle der Oberfläche des Polypeptids ausgesetzt ist, aber ansonsten an der Oberfläche im wesentlichen nicht vorhanden ist, kann als selten erachtet werden. Üblicherweise ist die seltene Aminosäure an 10 oder weniger Stellen auf der Polypeptid P-Oberfläche vorhanden (außer nahe der Bindungsstelle), vorzugsweise an 5 oder weniger Stellen, noch bevorzugter an keiner anderen Stelle als der Bindungsstelle.
- In manchen Fällen ist es wünschenswert, einzigartige Aminosäureseitenketten einzubringen, indem nahe der Bindungsstelle des Polypeptids synthetische Aminosäureseitenketten vorgesehen werden. Der Einsatz synthetischer Aminosäuren ermöglicht das Einbringen von Seitenketten mit chemischen Reaktivitäten, die sich von jenen der natürlich vorkommenden Aminosäureseitenketten unterscheiden. Auf diese Weise kann die lokalisierte Bindung der aktiven Funktionalitäten nahe der Bindungsstelle gewährleistet werden. Besonders geeignete, synthetische Aminosäureseitenketten zur kovalenten Anbindung der aktiven Funktionalitäten sind Aryl- und Alkylamine (die durch Alkylierung von Halogenalkylen und α-Halogenketonen, durch reduktive Aminierung von Aldehyden, durch Acylierung von Isocyanaten oder Isothiocyanaten oder durch 1,4-Additionen von α,β-ungesättigten Enonen hergestellt werden); Aldehyde (die durch reduktive Aminierung von Alkyl- oder Arylaminen hergestellt werden); Carbonsäure-Derivate der Form C(O)A, worin A=Alkyl, Aryl oder dergleichen (die durch Transacylierung mit Alkyl- oder Arylaminen hergestellt werden); α,β-ungesättigte Enone (die durch Additionsreaktionen mit Nukleophilen, einschließlich von Aminen und Thiolen, hergestellt werden); und dergleichen.
- Y ist eine Linker-Gruppe, die so gewählt ist, daß die erforderliche kovalente Brücke zwischen der Aminosäureseitenkette X und einer reaktiven Gruppe auf der aktiven Funktionalität Z geschaffen wird. Beispiele für reaktive Gruppen sind u. a. Thiol, Disulfid, Ester, Aldehyd, α-Halogenketon, Diazonium, Isocyanat, α,β-ungesättigte Ketone und Enone und dergleichen. Die Art der Linker-Gruppe ist nicht entscheidend, aber vorzugsweise ist die zum Einbringen der Linker-Gruppe angewandte Chemie für die gewünschte Seitenkette X selektiv, um die Bindung der aktiven Funktionalität an andere Aminosäureseitenketten zu vermeiden. Die Länge der Linker-Gruppe Y ist nicht entscheidend und kann zwischen etwa 1,5 Å und 25 Å variieren, wobei sie üblicherweise zwischen etwa 5 Å und 12 Å variiert. Häufig ist die Linker-Gruppe das Ergebnis der Umsetzung der reaktiven Gruppe auf der aktiven Funktionalität mit der Aminosäureseitenkette, z. B. Thioester, Azo, Hydrazo, Hydroxylam in, Sulfenat, Sulfinat, Sulfonat, Peroxid, Anhydrid und dergleichen. Alternativ dazu wird die Linker-Gruppe aus einem bifunktionellen Vernetzer gebildet. Die von der Linker-Gruppe geschaffene Bindung sollte ausreichend stabil sein, um Reinigungsverfahren standzuhalten, nachdem die Bindung abgeschlossen ist, und auch den Einsatzbedingungen standzuhalten. In manchen Fällen jedoch wäre es wünschenswert, biologisch labile und/oder chemisch labile Linker-Gruppen bereitzustellen, die unter vorgewählten Bedingungen abgebaut werden. Beispielsweise ist es bei Immunotoxinen, die an Antikörper gekoppelte Toxine umfassen, häufig notwendig, daß das Toxin an der Oberfläche einer gebundenen Zelle abspaltbar ist, um die Invagination des Toxins zuzulassen. Allgemeine Techniken zum Binden von Molekülen an Aminosäureseitenketten sind in der Patent- und der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe beispielsweise Cuatreacasas et al. (1969), "J. Biol. Chem." 244 : 4316; Givol et al. (1971) "Biochemistry 10 : 3461; US-A- 4.340.535; 4.368.149; 4.489.710; und 4.671.958; und EP-A-187.658.
- Beispiele für Linker-Gruppen Y können wie folgt direkt zwischen Aminosäureseitenketten X und reaktiven Gruppen auf der aktiven Funktionalität Z gebildet werden: Linker-Gruppe Y X (oder Einheit darauf) Reaktive Gruppe auf ZAldehyd Amin/NaBH&sub3; (Amin) S-SR oder SH SH oder S-SR (Disulfid) Azobenzol Tyrosin Aryldiazonium Amin Aryl oder Alkylamin α-Halogenketon Thioharnstoff Aryl oder Alkylamin Isothiocyanat 1,4-Michael-Addukt Thiol oder Aryl oder Alkylamin α,β-Enon Amid Aryl oder Alkylamin Anhydroxysuccinimidester Amid Aryl oder Alkylamid Anhydrid
- Alternativ dazu können bifunktionelle Vernetzer verwendet werden, um die Linker- Gruppen Y zwischen der Aminosäureseitenkette X und der aktiven Funktionalität Z einzuführen. Beispiele für Vernetzer sind die folgenden:
- Vernetzer Reaktive Gruppe auf Z
- um die Schiffsche Base zu reduzieren
- 5. Nitrierung mit HNO&sub3;/H&sub2;SO&sub4;
- gefolgt von Reduktion mit NaBH&sub4;, gefolgt von Reaktion mit
- worin G eine geeignete Schutzgruppe, z. B. Thiopyridyl oder Acyl, ist; A = CH&sub2;, O oder NH ist; R = Aryl oder Wasserstoff ist; und X = Anhydrid, Anhydroxysuccinimidester oder eine andere aktive Acylgruppe ist.
- Die aktive Funktionalität Z ist ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reportermolekülen und Chemotherapeutika. Die Größe des Moleküls mit der aktiven Funktionalität ist nicht entscheidend, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von etwa 100 bis 2000 Dalton (D), häufiger im Bereich von etwa 200 bis 1000 D. Die Struktur der aktiven Funktionalität variiert stark je nach deren Beschaffenheit und beabsichtigter Verwendung, umfaßt aber notwendigerweise eine reaktive Gruppe zur kovalenten Bindung des Polypeptids P - entweder direkt oder über einen bifunktionellen Vernetzer. Aktive Funktionalitäten, die in ihrem natürlichen Zustand keine geeigneten Reaktandengruppen umfassen, müssen modifiziert werden, um solche Gruppen auf eine Weise bereitzustellen, die ihre gewünschte Aktivität nicht beeinträchtigt. Geeignete reaktive Gruppen auf der aktiven Funktionalität sind oben angeführt.
- Reportermoleküle und -verbindungen werden so gewählt, daß ein nachweisbares Signal gebildet wird, worin die Stärke oder ein anderes Merkmal des Signals durch die Bindung des Polypeptids an den Target-Liganden (Analyten) beeinflußt oder moduliert wird. Geeignete Reportermoleküle sind Chromogene (z. B. Farbstoffe und Fluorophore), chemolumineszierende Substanzen, biolumineszierende Substanzen, Spinmarkierungen, Flavine, piezoelektrische Moleküle, Biotin und dergleichen. In US-A- 4.366.241 werden zahlreiche geeignete Reportermoleküle beschrieben.
- Geeignete Chromogene umfassen Moleküle und Verbindungen, die Licht in einem bestimmten Bereich absorbieren, so daß eine Farbe beobachtet werden kann, oder Licht aussenden, wenn sie mit einer Strahlung mit bestimmter Wellenlänge oder aus einem bestimmten Wellenlängenbereich bestrahlt werden, z. B. Fluoreszenzmittel.
- Es ist eine große Vielzahl von geeigneten Farbstoffen verfügbar, die primär so ausgewählt werden, daß bei minimaler Absorption durch ihre Umgebung eine intensive Färbung entsteht. Beispiele für Farbstofftypen sind Chinolinfarbstoffe, Triarylmethanfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Alizarinfarbstoffe, Phthaleine, Insektenfarbstoffe, Azofarbstoffe, Anthrachinonfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, Phenazathioniumfarbstoffe und Phenazoxoniumfarbstoffe.
- Es kann eine breite Vielfalt an Fluoreszenzmitteln verwendet werden - entweder alleine oder in Verbindung mit Löschermolekülen. Interessierende Fluoreszenzmittel fallen in eine Vielzahl von Kategorien mit bestimmten Primärfunktionalitäten. Diese Primärfunktionalitäten sind u. a. 1- und 2-Aminoaphthalin, p,p'-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminobenzophenonimine, Anthrazene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzooxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3- aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane und Flavin.
- Einzelne fluoreszierende Verbindungen, die Funktionalitäten zum Verbinden aufweisen oder so modifiziert werden können, daß sie solche Funktionalitäten enthalten, sind Dansylchlorid, Fluoresceine, wie z. B. 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol, Rhodaminisothiocyanat, N-Phenyl-1-amino-8-sulfonatonaphthalin, N-Phenyl-2-amino-6- sulfonatonapthalin, 4-Acetamido-4-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure, Pyren-3- sulfonsäure, 2-Toluidinonaphthalin-6-sulfonat, N-Phenyl, N-Methyl-2-aminonapthalin-6- sulfonat, Ethidiumbromid, Stebrin, Auromin-0, 2-(9'-Anthroyl)palmitat, Dansylphosphatidylethanolamin, N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin, N,N'- Dihexyloxacarbocyanin, Merocyanin, 4-(3'-Pyrenyl)butyrat, D-3-Aminodesoxyequilenin, 12-(9'-Anthroyl)stearat, 2-Methylanthrazen, 9-Vinylanthrazen, 2,2'-(Vinylen-p- phenylen)bisbenzooxazol, p-Bis-[2-(4-methyl-5-phenyloxazolyl)]benzol, 6- Dimethylamino-1,2-benzophenazin, Retinol, Bis-(3'-aminopyridinium)-1,10- decandiyldiiodid, Sulfonaphthylhydrazon von Hellibrienin, Chlortetracyclin, N-(7- Dimethylamino-4-methyl-2-oxo-3-chromenyl)maleimid, N-[p-(2- Benzimidazolyl)phenyl]maleimid, N-(4-Fluoranthyl)maleimid, Bis(homovanillinsäure), Resazarin, 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol, Merocyanin 540, Resorufin, Bengalrosa und 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon.
- Wünschenswerterweise sollten Fluoreszenzmittel Licht oberhalb von etwa 300 nm, vorzugsweise oberhalb von 350 nm, noch bevorzugter oberhalb von etwa 400 nm, absorbieren, wobei sie üblicherweise in Wellenlängen emittieren, die mehr als 10 nm über der Wellenlänge des absorbierten Lichts liegen. Es sollte angemerkt werden, daß die Absorptions- und Emissionseigenschaften des gebundenen Farbstoffs sich vom ungebundenen Farbstoff unterscheiden können. Daher sind, wenn auf die verschiedenen Wellen längenbereiche und Merkmale der Farbstoffe bezuggenommen wird, die Farbstoffe gemeint, wie sie eingesetzt werden, und nicht der unkonjugierte und in einem willkürlichen Lösungsmittel charakterisierte Farbstoff.
- Im allgemeinen werden Fluoreszenzmittel gegenüber Absorptionsfarbstoffen insofern bevorzugt, als ein einzelnes Fluoreszenzmittel für die Vervielfachung eines Signals sorgen kann. Durch Bestrahlung eines Fluoreszenzmittels mit Licht kann eine Vielzahl von Emissionen erhalten werden. So kann eine einzige Markierung mehrere meßbare Größen liefern.
- Ein nachweisbares Signal kann auch von Chemolumineszenz- und Biolumineszenz- Quellen geliefert werden. Quellen von Chemolumineszenz sind u. a. eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch erregt wird und dann Licht aussenden kann, das als nachweisbares Signal dient oder Energie an einen Fluoreszenzakzeptor abgibt. Es wurde bei einigen Linker-Gruppen festgestellt, daß sie unter verschiedensten Bedingungen Chemolumineszenz erzeugen. Eine Linker-Gruppe ist 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, bei dem es sich um die 5- Amino-Verbindung handelt. Andere Vertreter dieser Gruppe sind das 5-Amino-6,7,8- trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz-Analog. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Kalziumhypochlorit und Base zum Lumineszieren gebracht werden. Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind die 2,4, 5- Triphenylimidazole, wobei Lophin der gebräuchliche Name für das Stammprodukt ist. Chemolumineszierende Analoge sind u. a. p-Dimethylamino- und -methoxy- Substituenten. Chemolumineszenz kann auch unter basischen Bedingungen mit Oxalaten, üblicherweise aktiven Oxalyl-Estern, z. B. p-Nitrophenyl-, und einem Peroxid, z. B. Wasserstoffperoxid, erzielt werden. Alternativ dazu können Luciferine in Verbindung mit Luciferase oder Lucigeninen verwendet werden, um Bioluminenszenz zu erzeugen.
- Spinmarkierungen liefern Reportermoleküle mit ungepaartem Elektronenspin, was mittels Elektronenspinresonanz-(ESP-)Spektroskopie nachgewiesen werden kann.
- Beispiele für Spinmarkierungen sind u. a. organische freie Radikale, Übergangsmetallkomplexe, insbesondere Vanadium, Kupfer, Eisen und Mangan, und dergleichen. Ein spezielles Beispiel für eine Spinmarkierung ist ein freies Nitroxid- Radikal.
- Chemotherapeutika werden in Abhängigkeit vom zu behandelnden Erkrankungszustand sowie von der Beschaffenheit des Target-Liganden ausgewählt. Solche Mittel können dazu bestimmt sein, erkrankte Zellen des Wirts zu töten, Pathogene zu töten, die Zellvermehrung zu hemmen, Hormontherapie zu bewirken oder eine große Vielzahl anderer nützlicher Wechselwirkungen zwischen dem Mittel und dem Target-Liganden zu bewirken. Beispiele für Chemotherapeutika sind Toxine, Toxinfragmente, Bakterizide, Radikalfänger, Radikalbildner, Alkylierungsmittel, Neurotransmitter, Radionuklide, antivirale Verbindungen, antifungale Verbindungen, Antineoplasie-Mittel, Antimycoplasma-Mittel, Schwermetalle und dergleichen. Tabelle 1 zeigt eine Liste geeigneter Arzneimittel.
- Arzneimitteltyp Beispiele
- Bakterizide Sulfanilamid
- Polymyxin
- Chloramphenicol
- Aminoglycoside:
- Streptomycin
- Neomycin
- Kanamycin
- Amikacin
- Gentamicin
- Tobramycin
- Streptomycin B
- Spectinomycin
- Ampicillin
- Antivirale Mittel Acyclovir
- Vir A
- Symmetrel
- Antifungale Mittel Nystatin
- Antineoplasie-Mittel Adriamycin
- Cerubidin
- Bleomycin
- Alkeran
- Valban
- Oncovin
- Fluoruracil
- Radiopharmazeutika ¹²&sup5;I
- ¹³¹ I
- 99mTc (Technetium)
- Schwermetalle Barium
- Gold
- Platin
- Antimycoplasmide Tylosin
- Spectinomycin
- Toxine Ricin
- Ricin A-Kette
- Diphterie-Toxin
- Diphterie-Toxin A-Kette
- Abrin
- Modeccin
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeigneterweise Teil eines Zweistufen-Verfahrens, bei dem zuerst ein Polypeptid (ohne die aktive Funktionalität) erzeugt und die aktive Funktionalität dann stellenspezifisch nahe der Bindungsstelle des Polypeptids eingebracht wird. Die Polypeptide können aus natürlichen Quellen erhalten werden, wie z. B. Zellkulturen, Tiergeweben, pflanzlichen Quellen und dergleichen, oder können synthetisch hergestellt werden, wie nachstehend detaillierter beschrieben. Am häufigsten sind die Polypeptide Antikörper oder Antikörperfragmente, die auf herkömmliche Weise gegen den interessierenden Target-Liganden (oder ein Analog davon) erzeugt wurden.
- Der interessierende Target-Ligand kann als Antigen verwendet werden oder kann, wenn er ausreichend klein ist, an einem geeigneten Immunogen angebracht werden, um Antigenizität zu liefern. Sobald der antigene Target-Ligand erhalten wurde, können nach in vitro- oder in vivo-Verfahren polyklonale Antikörper erzeugt werden, die für das Substrat spezifisch sind. In vitro-Verfahren umfassen die in vitro-Aussetzung der Lymphozyten gegenüber den antigenen Target-Substraten, währen in vivo-Verfahren das Injizieren der antigenen Target-Substrate in eine große Vielzahl von Wirbeltieren erfordern. Geeignete Wirbeltiere sind nicht-menschliche, einschließlich von Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen, Ziegen und dergleichen. Target-Substrate, die kleiner als etwa 10 kD, insbesondere etwa 6 kD, sind, werden üblicherweise an ein größeres Molekül gebunden, um den gewünschten Immunresponse hervorzurufen. Bei in vivo- Verfahren werden die Immunogene nach einem vorbestimmten Plan in das Tier injiziert und den Tieren periodisch Blut entnommen, wobei aufeinanderfolgende Blutabnahmen jeweils verbesserten Titer und verbesserte Spezifität aufweisen. Die Injektionen können intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder auf ähnliche Weise erfolgen, und es wird ein Adjuvans, wie z. B. unvollständiges Freundsches Adjuvans, eingesetzt.
- Falls gewünscht, können monoklonale Antikörper erhalten werden, indem immortalisierte Zellinien hergestellt werden, die zur Erzeugung von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität befähigt sind. Derartige immortalisierte Zellinien können auf vielerlei Arten hergestellt werden. Zweckmäßigerweise wird ein kleines Wirbeltier, wie z. B. eine Maus, nach dem soeben beschriebenen Verfahren mit dem gewünschten Antigen hyperimmunisiert. Das Wirbeltier wird dann, üblicherweise 7 Tage nach der letzten Immunisierung, getötet, die Milz des Tieres entfernt und die Milzzellen immortalisiert. Die Art der Immortalisierung ist nicht entscheidend. Die gegenwärtig üblichste Technik ist die Fusion mit einem Myelom-Zellfusionspartner, wie erstmals von Kohler und Milstein (1976) "Eur. J. Immunol." 6 : 511-519, beschrieben. Andere Techniken sind die EBV-Transformation, die Transformation mit bloßer DNA, z. B. Onkogenen, Retroviren usw., oder irgendein anderes Verfahren, das für die stabile Aufrechterhaltung der Zellinie und die Produktion monoklonaler Antikörper sorgt.
- Unter Anwendung von Fusion mit einem Fusionspartner ist die Art der Fusion nicht entscheidend; verschiedene Verfahren können angewandt werden. Zweckmäßigerweise werden die Milzzellen und Myelomzellen in Gegenwart von nicht-ionogenem Detergens, üblicherweise Polyethylenglykol, und anderen Additiven, wie "Dulbecco's Modified Eagle's"-Medium, einige Minuten lang kombiniert. Am Ende der Fusion wird das nichtionogene Detergens durch Waschen der Zellen rasch entfernt, die wenigen Zellen sofort in kleine Kulturnäpfe (üblicherweise in einer Mikrotiterplatte) mit relativ geringer Dichte im Bereich von etwa 1 bis 5 · 10&sup5; pro Napf in ein selektives Medium eingebracht, das so ausgewählt ist, daß es das Wachstum der Hybridzellen unterstützt, während es für die Myelomzellen letal ist. Üblicherweise wurde die Myelomzellinie derart mutiert, daß sie gegenüber einem letalen Mittel, typischerweise HAT, empfindlich ist.
- Nach ausreichender Zeit, üblicherweise 1 bis 2 Wochen, werden Kolonien von Hybriden beobachtet, und Platten, die hybrid-positive Näpfe enthalten, werden identifiziert. Die Platten und Näpfe, die nur eine Kolonie pro Napf aufweisen, werden ausgewählt und Überstände aus diesen Näpfen auf die Bindungsaktivität gegenüber dem Target-Liganden getestet. Sobald die positiven Hybridome identifiziert wurden, kann die Zellinie als lebensfähige Kultur und/oder durch Lyophilisierung und Lagerung in gefrorenem Zustand aufrechterhalten werden.
- Sobald die Hybridome selektiert wurden, können monoklonale Antikörper aus den Überständen der wachsenden Kolonien isoliert werden. Die Ausbeute an erhaltenen Antikörpern ist jedoch üblicherweise gering. Die Ausbeute kann nach verschiedenen Verfahren, wie z. B. Injektion der Hybridom-Zellinie in die Bauchfellhöhle eines Wirbeltier-Wirtes, der die Zellen akzeptiert, erhöht werden. Monoklonale Antikörper können dann aus dem Bauchwasser oder aus dem Blut gewonnen werden. Eiweißhältige und andere Verunreinigungen werden üblicherweise nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Chromatograph, Gelfiltration, Ausfällung, Extraktion oder dergleichen, aus den monoklonalen Antikörpern entfernt.
- Synthese- und Rekombinations-Verfahren zur Herstellung der Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung beginnen üblicherweise mit einer exemplarischen Aminosäuresequenz, die für ein Protein charakteristisch ist, das bekannterweise den Target-Liganden mit der erforderlichen Affinität bindet. Derartige examplarische Aminosäuresequenzen können von Enzymen stammen, die sich bekannterweise an einen interessierenden Target-Liganden binden, oder von Antikörpern, die - wie oben beschrieben - gegen die Target-Substrate gezüchtet worden sind. Natürliche Rezeptoren und Liganden, wie z. B. Hormone, Lymphokine, Lectine, Avidin (einschließlich von Streptavidin), Proteine des Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes ("major histocompatibility complex", MHC), T-Zellen-Rezeptoren, G-Proteine, Neurotransmitterrezeptoren, DNA-Bindeproteine, z. B. Repressoren, und dergleichen, finden bei der Definition interessierender Bindungsstellen, die in synthetische Polypeptide eingebaut werden können, ebenfalls Anwendung.
- Syntheseverfahren können zur Herstellung von Polypeptiden eingesetzt werden, die weniger als etwa 200 Aminosäuren, üblicherweise weniger als etwa 150 Aminosäuren, häufiger 100 oder weniger Aminosäuren, aufweisen. Die synthetischen Herstellungsverfahren, wie nachstehend detaillierter beschrieben, sind besonders zweckmäßig, um die Einfügung synthetischer (nicht-natürlicher) Aminosäuren an einer gewünschten Position nahe der Bindungsstelle des Polypeptids zu ermöglichen, besitzen allerdings im Vergleich zu biologischen Syntheseverfahren den Nachteil geringer Ausbeuten und eines Mangels an Glykosylierung.
- Geeignete synthetische Polypeptid-Herstellungsverfahren können auf dem wohlbekannten Merrifield-Festphasen-Syntheseverfahren basieren, wonach Aminosäuren in bestimmter Abfolge an eine wachsende Kette addiert werden (Merrifield (1963) "J. Am. Chem. Soc." 85 : 2149-2156). Automatisierte Systeme zur Synthese von Polypeptiden nach solchen Verfahren sind im Handel von Herstellern wie Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien 94404; New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey 08818; und Parmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, New Jersey 08854, erhältlich.
- Zur Herstellung größerer und/oder glykosylierter Polypeptide werden üblicherweise Herstellungsverfahren unter Rekombination vorgezogen. Derartige Rekombinations- Verfahren umfassen die Expression rekombinanter DNA-Moleküle, die für die gewünschte Polypeptid-Aminosäuresequenz kodieren, in kultivierten Zellen. Die DNA- Sequenz kann selbst synthetisch sein oder alternativ dazu aus einer natürlichen Quelle, d. h. dem Gen eines exemplarischen Antikörpers, Enzyms, Lymphokins, Hormons oder anderen Proteins, modifiziert werden. Synthetische DNA-Sequenzen (Polynukleotide) können nach wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise können kurze einstrangige DNA-Fragmente nach dem von Beaucage und Carruthers (1981), "Tett. Letters" 22 : 1859-1862, beschriebenen Phosphoramidit-Verfahren erhalten werden. Ein doppelstrangiges Fragment kann dann erhalten werden, indem entweder ein komplementärer Strang synthetisiert und die Stränge unter entsprechenden Bedingungen anneliert werden, oder durch Addieren einer geeigneten Primersequenz unter Verwendung von DNA-Polymerase an den komplementären Strang. Zweckmäßigerweise ist eine automatisierte Ausrüstung zur Herstellung der synthetischen DNA-Sequenzen von den oben angeführten Erzeugern erhältlich, die Ausrüstung für synthetische Polypeptide bereitstellen. Alternativ dazu kann die gewünschte DNA-Sequenz aus einer geeigneten cDNA oder Genom-Sammlung erhalten werden, die ihrerseits aus einer das exemplarische Protein von Interesse exprimierenden Zellinie erhalten wird. Beispielsweise kann das einen interessierenden monoklonalen Antikörper exprimierende Gen aus der Hybridomzellinie, die einen solchen Antikörper exprimiert, isoliert werden. Das Gen kann dann wie nachstehend detaillierter beschrieben modifiziert werden, um eine oder mehrere Aminosäuren zu substituieren oder hinzuzufügen, die zur Bindung der interessierenden aktiven Funktionalität befähigt sind. Die Verfahren zum Isolieren von Antikörpergenen aus Hybridom-Zellinien sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe beispielsweise Gearhart et al. (1983) "Proc. Nat. Acad. Sci. USA" 80 : 3439-3443.
- Die natürlichen oder synthetischen DNA-Fragmente, die für das gewünschte katalytische oder reaktive Polypeptid kodieren, werden in DNA-Konstrukte eingebaut, die zum Einbringen in eine und Exprimieren in einer in vitro-Zellkultur befähigt sind. Die DNA-Konstrukte können zur Replikation in einem einzelligen Wirt, wie z. B. Hefe oder Bakterien, geeignet sein, sind aber häufig zum Einbringen in das Genom kultivierter Säugetier- oder anderer eukaryotischer Zellinien und zur Integration innerhalb dessen bestimmt. DNA-Konstrukte, die zum Einbringen in Bakterien oder Hefe hergestellt werden, umfassen ein Replikationssystem, das vom Wirt erkannt wird, jenes DNA-Fragment, das für das interessierende Polypeptid kodiert, an das 5'-Ende der DNA-Sequenz gebundene Transkriptions- und Translations-Initiations-Regelsequenzen, sowie an das 3'-Ende der DNA-Sequenz gebundene Transkriptions- und Translations- Terminations-Regelsequenzen. Die Transkriptions-Regelsequenzen umfassen einen heterologen Promotor, der vom Wirt erkannt wird. Zweckmäßigerweise können verfügbare Expressionsvektoren eingesetzt werden, die ein Replikationssystem und Transkriptions- und Translations-Regelsequenzen gemeinsam mit einer Einfügungsstelle für die zu exprimierende DNA-Sequenz umfassen.
- Wenn mit isolierten Genen begonnen wird, die für das exemplarische Protein kodieren, das üblicherweise ein Antikörper, Enzym, Lymphokin, Hormon oder Fragment davon ist, ist es üblicherweise wünschenswert, das Gen so zu modifizieren, daß eine oder mehrere Aminosäuren substituiert oder hinzugefügt werden, wodurch die aktive Funktionalität innerhalb oder nahe der Bindungsstelle gebunden wird. Es ist eine Vielzahl von Verfahren zur Änderung der natürlichen Gensequenz, um solche Substitutionen oder Additionen zu ergeben, bekannt und wird in der Patent- und der wissenschaftlichen Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Maniatis et al., Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) und "Guide to Molecular Cloning Techniques" (Berger und Kimmel, Hrsg.), "Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, Inc., Orlando, Florida (1987). Spezielle Techniken zur Schaffung solcher Änderungen im Gen umfassen die stellengerichtete Mutagenese, wie von Kunkel et al. (1985), "Nucleic Acids Res." 13 : 8764 beschrieben, und Kassettenmutagenese, wie von Wells et al. (1985) "Gene" 34 : 315-323, beschrieben. Das veränderte Gen kann dann, wie oben beschrieben, in Zellkultur exprimiert und das modifizierte Polypeptid nach herkömmlichen Reinigungsverfahren erhalten werden.
- Ein zweites Verfahren kann zur Substitution synthetischer (nicht-natürlicher) Aminosäuren in einem exemplarischen Protein eingesetzt werden, für das ein unmodifiziertes Protein-Gen kodiert. Das Gen wird wie oben beschrieben abgeändert, um ein Aminosäure-Codon an der gewünschten Position nahe der Bindungsstelle durch ein nicht-gerichtetes Codon zu ersetzen, das sich vom Terminationscodon des Gens unterscheidet. Zweckmäßig kann für eine solche Substitution oligonukleotid-gerichtete Mutagenese eingesetzt werden. Eine Suppressor-tRNA, die gegen das nicht-gerichtete Codon gerichtet ist, wird chemisch oder enzymatisch mit der gewünschten synthetischen Aminosäure acyliert und einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem zugegeben, das so programmiert ist, daß es die abgeänderte DNA-Sequenz exprimiert. Die synthetische Aminosäure wird an der Position des nicht-gerichteten Codons eingefügt. Dieser Ansatz funktioniert selbstverständlich genauso mit natürlichen Aminosäuren, ist aber mühevoller als die einfache Abänderung der DNA-Sequenz, um für die gewünschte natürliche Aminosäure zu kodieren.
- Das gewünschte einzigartige Codon darf nicht für eine natürliche Aminosäuren- Einfügungsstelle (natürliche tRNA-Erkennungsstelle) kodieren; ein geeignetes Codon ist ein TAG-Terminations- oder "Amber"-Codon. Jede Mutation in einem Gen, die ein Terminationscodon (TAG, TAA oder TGA) erzeugt, führt zur vorzeitigen Termination der Polypeptidsynthese als Folge der Unfähigkeit der natürlich auftretenden tRNA, sich an die Freisetzungsfaktoren zu binden und damit zu konkurrieren. Bei derartig veränderten Genen muß selbstverständlich eines der beiden alternierenden Terminationscodons verwendet werden. Dieser Ansatz ist insofern besonders vorteilhaft, als alternierende Aminosäurensubstitutionen durch Herstellung verschiedener synthetischer Aminosäuren im Aminoacylierungs-Schritt erhalten werden können.
- Mutationen in der Anti-Codon-Schleife bei einer Anzahl von tRNA-Molekülen führen zu einer Amber-Suppressor-tRNA. Siehe z. B. Steege und Soll, in "Biological Regulation and Development" Bd. I (Goldberger, Hrsg.), Plenum Press (1978). Amber-Suppressoren, die durch eine 5'-CUA-3'-Anti-Codon-Schleife charakterisiert sind, sprechen nicht mehr auf Codons an, die von ihren Wildform-Gegenstücken erkannt werden, sondern fügen anstattdessen Aminosäuren nur als Reaktion auf Amber-Codons (UAG) ein. Die gewünschte tRNA, die eine synthetische Aminosäure trägt, kann durch Anti-Codon- Schleifen-Ersatz erzeugt werden, wie von Bruce et al. (1982) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 79 : 7127-7131, beschrieben. Alternativ dazu kann ein Gen, das für jene tRNA kodiert, die die synthetische Aminosäure trägt, in einem geeigneten Expressionssystem synthetisiert und exprimiert werden, oder die Suppressor-tRNA kann durch Runoff- Transkription erzeugt werden. Die chemisch oder genetisch konstruierte SuppressortRNA muß dann mit der in das Polypeptid der Erfindung einzubauenden, synthetischen Aminosäure aminoacyliert werden. Ein geeignetes chemisches Acylierungsverfahren, bei dem N-blockiertes Aminoacyl-pCpA-dinukleotid eingesetzt wird, das über carbonyldiimidazol-vermittelte Anbindung von N-blockierten Aminosäuren an geschütztes pCpA-OH synthetisiert wird, wird in Gegenwart von T4-RNA-Ligase mit einer abgekürzten tRNA kondensiert. Heckler et al. (1984) Tetrahedron 40 : 87-94. Ein geeignetes, prokaryotisches in vitro-Transkriptions/Translationssysem wird von Pratt in "Transcription and Translation, A Practical Approach" (Hames und Higgens, Hrsg.), IRL Press, Washington (1984) beschrieben.
- Die Herstellung von Antikörpern durch Rekombination wird in einer Reihe jüngerer Patentanmeldungen gelehrt, einschließlich von EP-A-123.527; EP-A-171.496; EP-A- 173.494; EP-A-184.187; WO-A-86/01.533; WO-A-87/02.671 und JP-A-62.100.291. Siehe auch US-A-4.518.584, die die stellengerichtete Mutagenese von Säugetierproteinen beschreibt.
- Sobald das Polypeptid nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wird die aktive Funktionalität entweder direkt oder über einen bifunktionellen Linker, wie oben beschrieben, kovalent an einer Aminosäureseitenkette nahe der Bindungsstelle des Polypeptids angebracht. Durch Bereitstellen einer seltenen oder synthetischen Aminosäure nahe der Bindungsstelle wird die Verbindungruppe an der Bindungsstelle lokalisiert und ist an anderen Stellen auf dem Polypeptid als jenen nahe der Bindungsstelle im wesentlichen nicht vorhanden. Alternativ dazu kann eine neue Affinitätsmarkierungs-Technik zum stellenspezifischen Einbringen einer Linker-Gruppe in die Seitenketten auch von häufigen Aminosäuren eingesetzt werden, wie nachstehend detaillierter beschrieben.
- Linker-Gruppen und aktive Funktionalitäten können auch nach einer neuen Technik in die Polypeptide eingeführt werden, bei der abspaltbare Affinitätsmarkierungs- Reagenzien eingesetzt werden. Solche Reagenzien werden erhalten, indem abspaltbare reaktive Gruppen mit Affinitätsmarkierungen verbunden werden, z. B. Haptene, die für die Proteinbindungsstelle spezifisch sind. Durch das Binden der abspaltbaren Affinitätsmarkierungen an das Protein an der Bindungsstelle und darauffolgendes kovalentes Anbringen des freien Endes der reaktiven Gruppe an einer Aminosäureseitenkette nahe der Bindungsstelle kann die reaktive Gruppe vom Hapten abgespalten und das Hapten vom Protein entfernt werden, wodurch die reaktive Gruppe auf dem Polypeptid in Position bleibt. Nützliche Aminosäureseitenketten zum Befestigen der affinitätsmarkierenden reaktiven Gruppen sind Carboxylat (Aspartat und Glutamat), primäres Amin (Lysin), Imidazol (Histidin), Phenol (Tyrosin) und Thiol (Cystein). Die nach der Spaltung verbleibende Einheit der reaktiven Gruppe kann selbst die aktive Funktionalität umfassen, insbesondere eine katalytische oder reaktive Funktionalität, wie in den ausstehenden Anmeldungen WO-A-90/05.785 und WO-A- 90/05.746. Häufiger jedoch dient die Einheit der reaktiven Gruppe auf dem Polypeptid als Anfügungsstelle zur kovalenten Bindung der aktiven Funktionalität. Die oben beschriebenen Verfahren zur kovalenten Bindung dienen im allgemeinen dazu, Funktionalitäten, einschließlich von Reportermolekülen und Chemotherapeutika, an reaktive Gruppen zu binden, die durch Affinitätsmarkierung eingeführt wurden. Spezifische Verfahren zum Synthetisieren solcher Affinitätsmarkierungen und deren Anbinden an eine Antikörperkombinations-Stelle werden in Beispiel 1 im nachstehenden Experimentellen Teil gelehrt. Solche abspaltbaren Affinitätsmarkierungen dienen besonders zum selektiven Modifizieren von Polypeptiden, die nicht strukturell charakterisiert wurden.
- Das Einbringen von Thiolen (die zur Bildung von Disulfidbindungen mit einer aktiven Funktionalität dienen) in die Bindungsstelle eines Polypeptids kann unter Verwendung von Affinitätsmarkierungen wie folgt erreicht werden. Die Affinitätsmarkierung kann ein Thioester oder eine an das Hapten gebundene, reaktive Disulfidgruppe sein; durch die Abspaltung der Markierung nach der stellenspezifischen Derivatisierung wird ein freies Thiol an der Bindungsstelle eingebaut. Ein Thiolester kann mit Hydroxylamin gespalten werden, während ein Disulfid mit Dithiothreitol reduziert werden kann. Die Disulfide werden unter milden Bedingungen reduziert, die so gewählt werden, daß im Inneren des Proteins befindliche Disulfide nicht betroffen werden. Eine weitere, für die spaltbare Verbindung geeignete Funktionalität ist ein Acetal, das zu einer proteingebundenen Aldehydeinheit führen würde, die durch reduktive Aminierung derivatisiert werden könnte. Jedoch könnten die für die Spaltung erforderlichen, sauren Bedingungen zur Inaktivierung säureempfindlicher Proteine führen. Eine Azobenzol-Vernetzung könnte dann reduktiv gespalten werden, so daß ein aromatisches Amin entsteht, das dann bei niedrigem pH selektiv derivatisiert werden könnte.
- Die Wahl der reaktiven Gruppe für die Affinitätsmarkierungs-Reagenzien wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt. Die reaktive Linker-Gruppe sollte langsam genug reagieren, daß sie primär an oder nahe der Bindungsstelle des Proteins reagiert, nachdem sich ein Gleichgewicht eingestellt hat. Die Gruppe kann mit mehr als einer Art von Aminosäurerest reagieren, was zur Maximierung der Wahrscheinlichkeit von erfolgreicher Derivatisierung vorteilhaft ist. Es ist insofern von Nachteil, als es die Charakterisierung des markierten Proteins komplizieren kann. Idealerweise sollte ein einziger Rest auf dem Polypeptid modifiziert werden, um ein homogenes Addukt zu ergeben. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Synthese der Markierungsreagenzien. Es sollte leicht möglich sein, die Länge des Reagens zu variieren, um den Einbau von Markierung in das Protein zu optimieren. Die Affinitätsmarkierung sollte auch in radiomarkierter Form leicht zu synthetisieren sein, um den Einbau der Markierung leicht quantifizieren zu können. Schließlich sollte die Markierung bei darauffolgenden Proteinmanipulations-Bedingungen stabil sein, einschließlich von degradativen Verfahren, die bei der Proteinsequenzermittlung eingesetzt werden.
- Zwei bevorzugte reaktive Gruppen, die unter Verwendung von Affinitätsmarkierungen eingeführt werden können, sind Diazoketone und aromatische Azide. Diese Gruppen können durch photochemische Bestrahlung in der Proteinbindungsstelle in reaktive Spezies umgewandelt werden und weisen daher den Vorteil auf, daß sie in der Bindungsstelle eines Protein spezifisch aktiviert werden können. Mehrere andere reaktive, chemische Funktionalitäten sind ebenfalls geeignet. Diazoniumgruppen reagieren spezifisch mit der phenolischen Seitenkette von Tyrosin. Epoxidgruppen reagieren mit nukleophilen Seitenketten, einschließlich von primären Aminen (Lysin) und Carboxylaten (Asparatat und Glutamat). Aldehyde reagieren mit dem primären Amin in der Seitenkette von Lysin, so daß Schiffsche Basen als Zwischenstufen gebildet werden, die mit Natriumcyanoborhydrid reduziert werden können. Die Verwendung von tritiiertem NaCNB³H&sub3; führt zum Einbau von Tritium, was die Charakterisierung des markierten Proteins vereinfacht. Schließlich sind α-Bromketone vielseitige Reagenzien zur Affinitätsmarkierung. Deren Reaktivität ist ausreichend langsam, so daß sie Proteine an ihren Bindungsstellen nahezu stöchiometrisch markieren können. Darüberhinaus reagieren sie mit einer Anzahl von nukleophilen Seitenketten, einschließlich von Carboxylat, primärem Amin (Lysin), Imidazol (Histidin) und Phenol (Tyrosin).
- Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polypeptide mit daran gebundenen Reportermolekülen sind nützlich bei der Durchführung von Assays auf Analyten in biologischen und anderen Proben. Im allgemeinen dienen die Assays zum Nachweis der Gegenwart der Target-Liganden des Polypeptids, d. h. der Analyt ist der Target-Ligand. Die Gegenwart des Target-Liganden in einer Probe kann basierend auf einer beobachteten Änderung des vom Reportermolekül gelieferten Signals, üblicherweise eine durch Wechselwirkung zwischen dem Reportermolekül und dem gebundenen Target-Liganden verursachte Reduktion der Stärke des Signals nachgewiesen und gegebenenfalls quantitativ bestimmt werden. Somit ist das beobachtete Signal umgekehrt proportional zur in der Probe vorhandenen Konzentration oder Menge an Target-Liganden. In speziellen Systemen kann das Signal geeicht werden, um für die quantitative oder halb-quantitative Bestimmung eines gewünschten Analyten zu sorgen.
- Zusammensetzungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Polypeptide enthalten, sind insofern besonders vorteilhaft, als sie die Durchführung nicht-kompetitiver, homogener Assays ermöglichen. Da sich die Polypeptide direkt an den Target-Liganden binden und ein Signal liefern können, das umgekehrt proportional zur Konzentration an Target-Liganden ist, ist kein Ersetzen von Liganden erforderlich. Darüberhinaus ist kein Trennschritt erforderlich, da die Signalmodulation im Probenmedium erreicht werden kann.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Verwendung sekundärer Bindungssysteme bei der Durchführung von Assays Durch das Anbringen von Zwischenbindungs-Spezies, wie z. B. Biotin, ein Haptens oder dergleichen, an das Polypeptid nahe der Bindungsstelle kann das Reportermolekül über ein Bindeprotein, das für die Zwischenbindungs-Spezies spezifisch ist, z. B. Avidin oder für das Hapten spezifische Antikörper, in das System eingebracht werden. Somit werden Biotin und Hapten für den Zweck der vorliegenden Erfindung als Reportermoleküle angesehen.
- Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polypeptide mit daran gebundenen Chemotherapeutika dienen zur therapeutischen Behandlung von Menschen und anderen Tieren. Insbesondere können an Zelltoxine gebundene Polypeptide verwendet werden, um verschiedene Krebsformen zu behandeln, bei denen die neoplastischen Zellen durch ein einziges Tumorantigen gekennzeichnet sind, das spezifisches Anbringen der Polypeptide, üblicherweise über einen gegen das Tumorantigen gerichteten Antikörper, ermöglicht. Außerdem können bakterielle Infektionen mit an ein geeignete Bakterizide, wie z. B. Antibiotika, gebundenen Antikörpern behandelt werden, die für die Bakterien spezifisch sind.
- Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polypeptide mit daran gebundenen Chemotherapeutika können in herkömmliche pharmazeutische Formulierungen zur Verabreichung an Menschen und andere Tiere eingebunden werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sollten eine therapeutische Dosis des Polypeptids in einem geeigneten, pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Der pharmazeutische Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische Substanz sein, die sich dazu eignet, dem Patienten die Polypeptide zuzuführen. Steriles Wasser, Alkohole, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können als Träger verwendet werden. Pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien, Puffer, Dispergatoren und dergleichen können ebenfalls in die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung eingebunden werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können ein einzelnes Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung oder zwei oder mehrere solcher Polypeptide enthalten. Zusätzlich können andere therapeutisch aktive Ingredienzien enthalten sein. Solche "Cocktails", die zwei oder mehr Polypeptide und/oder aktive Ingredienzien mit unterschiedlichen Spezifitäten und/oder unterschiedlichen therapeutischen Wirkungen umfassen, können unter einer Vielfalt von Umständen vorteilhaft sein.
- Die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind zur oralen oder parenteralen, insbesondere parenteralen, Verabreichung, geeignet, einschließlich von subkutaner, intramuskulärer und intravenöser Injektion. Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intramuskulären Injektion enthält 1 ml steriles, gepuffertes Wasser und 50 mg der Polypeptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion enthält etwa 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoklonalen Antikörper. Die eigentlichen Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind Fachleuten bekannt und in der medizinischen, wissenschaftlichen sowie Patentliteratur ausführlich beschrieben. Im speziellen wird auf "Remington's Pharmaceutical Science", 15. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), verwiesen, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert und vor der Verwendung in einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich für eine große Vielzahl von Antikörpern und anderen Proteinen als wirksam erwiesen. Fachleuten wird klar sein, daß die Lyophilisierung und Rekonstitution zu unterschiedlichen Graden von Aktivitätsverlust der Antikörper führen können und daß die Menge der Antikörper oder anderer Polypeptide in den pharmazeutischen Zusammensetzungen möglicherweise angepaßt werden muß, um einen solchen Verlust auszugleichen.
- Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
- Die folgenden Untersuchungen wurden am IgA MOPC315 durchgeführt, das substituierte 2,4-Dinitrophenyl-(DNP-)Liganden mit Assoziationskonstanten im Bereich von 5 · 10&sup4; bis 10&sup6; Mol&supmin;¹ bindet (Haselkorn et al. (1974) "Biochemistry" 13 : 2210). Obwohl die dreidimensionale Struktur nicht bekannt ist, wurde die Antikörper- Kombinationsstelle durch spektroskopische Verfahren (UV, Fluorimetrie, NMR), chemische Modifikation und Aminosäuresequenzierung des variablen Bereichs charakterisiert. Darüberhinaus haben frühere Affinitätsmarkierungs-Studien mit Reagenzien unterschiedlicher Strukturen (Givol und Wilcheck (1977), "Meth. Enzy." 46 : 479; Givol et al. (1971) "Biochemistry" 10 : 3461; und Strausbauch et al. (1971) "Biochemistry" 10 : 4342) eine Anzahl von reaktiven Aminosäureseitenketten in der Nähe der Kombinationsstelle definiert.
- In für die MOPC315-Kombinationsstelle spezifische Affinitätsmarkierungen wurden spaltbare Spacer eingebaut, wie in Fig. 1 gezeigt. Diese Affinitätsmarkierungs- Reagenzien enthalten die DNP-Gruppe, die über spaltbare Disulfid- oder Thiophenylbrücken an elektrophile Aldehyd- oder α-Bromketongruppen gebunden ist. Kovalente Bindung der Markierung an den Antikörper, gefolgt von Spaltung der Vernetzung und Entfernen des freien Liganden, führt zum stellenspezifischen Einbau eines freine Thiols in die Antikörper-Kombinationsstelle. Die Geometrie der Affinitätsmarkierungs-Reagenzien 1-5 variiert hinsichtlich des Abstands zwischen der DNP-Gruppe und der elektrophilen Gruppe, da die Position einer nukleophilen Lysin-, Histidin- oder Tyrosin-Seitenkette nicht genau bekannt ist. Die Synthesen der Affinitätsmarkierungen 1-5 sind in Fig. 2 dargelegt und nachstehend im Detail beschrieben.
- Die Affinitätsmarkierungen 1 und 2 wurden wie folgt hergestellt.
- Einer Suspension aus N,N'-Bis-(2,4-dinitrophenyl)cystamin (Chan et al. (1979) "Phosphorous Sulfur" 7 : 41) (4,84 g, 10 mM) in Dimethylformamid (200 ml) mit Triethylamin (50 µl) wurde 2-(2-Mercaptoethyl)-1,3-dioxolan (2,45 g, 18 mMol) zugegeben und das Gemisch bei 60ºC 24 Stunden lang gerührt. Wasserstoffperoxid (2 ml einer 30%-igen Lösung) wurde zugegeben und das Dimethylformamid im Vakuum entfernt.
- Der ölige Rückstand wurde in Methylenchlorid (100 ml) gelöst. Die Methylenchlorid- Schicht wurde mit Wasser (3 · 5 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Kieselgel-Säulenchromatographie mit 3 : 2 Hexane: Ethylacetat (Rf: 0,31) ergab 6 (1,37 g, 3,65 mMol, 20%) als orangefarbenes Öl.
- IR (Dünnfilm): 3353, 2923, 1623, 1525, 1342, 1138 cm&supmin;¹; ¹H-NMR, CDCl&sub3;: δ 2.08 (m,2H), 2.82 (t,2H,J = 7.1 Hz), 3.00 (t,2H,J = 6.6 Hz), 3.8 -4.0 (m,6H), 4.95 (t,1H,J=4.3 Hz), 7.00 (d, 1H,J= 9.5 Hz), 8.30 (d, 1H,J =9.6 Hz), 8.80 (s, 1H), 9.16 (d, 1H, J=2.6 Hz);
- Massenspektrum (EI) 375 (M+). Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub7;N&sub3;O&sub6;S&sub2;: C, 41.60; H, 4.53; N, 11.20; s, 17.07.
- Gefunden: C, 41.57; H, 4.67; N, 11.10; S, 16.99.
- Eine Lösung von Dioxolan 6 (0,50 g, 1,33 mMol) in Wasser (2 ml), Acetonitril (2 ml) und Essigsäure (8 ml) wurde 20 Stunden lang rückflußerhitzt. Dann wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und langsam zu 150 ml kaltem, gesättigtem, wäßrigem NaHCO&sub3; zugegeben. Die wäßrige Schicht wurde mit Methylenchlorid (3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum zu einem orangefarbenen Öl eingeengt. Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten aus 30 bis 40% Ethylacetat in Hexan ergab 1 (0,30 g, 0,91 mMol, 68%) als orangefarbenen Halbfeststoff: Rf = 0,22 in 3 : 2 Hexan:Ethylacetat;
- IR (KBr-Preßling) 3353, 1722, 1623, 1525, 1504, 1426, 1342, 1131 cm&supmin;¹; ¹H=NMR (CDCl&sub3;) δ 2.90=3.04 (m, 6H), 3.79 (t,2H,J = 6.5 Hz), 7.01 (d,1H,J = 9.5 Hz), 8.31 (d,1H,J = 9.5 Hz), 8.80 (m,1H), 9.15 (d,1H,J = 2.6 Hz) 9.83 (s, 1H);
- Massenspektrum (EI) 331 (M+). Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub5;S&sub2;: C, 39.88; H, 3.93; N, 12.69; S, 19.34.
- Gefunden: C, 40.01; H, 3.91; N, 12.66; S, 19.34.
- Diese Verbindung wurde ausgehend von N,N'-Bis-(2,4-dinitrophenyl)cystamin (2,42 g, 5 mMol) und 3-(3-Mercaptopropyl)-1,3-dioxolan (1,48 g, 10 mMol) wie oben für 6 beschrieben hergestellt, was 7 (0,60 g, 1,54 mMol, 15%) als orangefarbenes Öl ergab:
- Rf = 0,43 in 3 : 2 Hexan:Ethylacetat;
- IR (Dünnfilm) 3360, 2923, 1623, 1592, 1528, 1426, 1335, 1131 cm&supmin;¹; ¹H=NMR (CDCl&sub3;); δ 1.80-1.95 (m,6h), 2.78 (t,2H,J = 7.0 Hz), 2.99 (t, 2H,J = 6.7 Hz), 3.8-4.0 (m, 6H), 4.87 (t, 1H, J = 4.2 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 8.32 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 8.79 (s, 1H), 9.16 (d, 1H, J = 2.6 Hz);
- Massenspektrum (EI) 389 (M), 368, 359, 294, 279, 256, 225, 210, 196.
- Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub9;N&sub3;O&sub6;S&sub2;: C, 43.19; H, 4.88; N, 10.80; S, 16.45.
- Gefunden: C, 43.27; H, 4.65; N, 10.79; S, 16.40.
- Die Verbindung wurde wie oben für 1 beschrieben ausgehend von Dioxolan 6 (389 mg, 1,0 mMol) hergestellt, was 2 (340 mg, 0,99 mMol, 99%) als orangefarbenen Feststoff ergab: Fp.: 64-65ºC; Rf = 0,25 in 3 : 2 Hexan:Ethylacetat;
- IR (KBr-Preßling) 3331, 3092, 2923, 2846, 1722, 1630, 1589, 1525, 1415, 1342, 1247, 1146 cm&supmin;¹;
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2.06 (t,2H, J = 7.3 Hz), 2.63 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.75 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 3.00 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.81 (t, 2H,J 6.1 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 8.31 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 8.79 (s, 1H), 9.16 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 9.80 (s, 1H);
- Massenspektrum (EI) 345 (M). Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub5;N&sub3;O&sub5;S&sub2;: C, 41.74; H, 4.35; N, 12.17; S, 18.55.
- Gefunden: C, 41.71; H, 4.38; N, 12.11; S, 18.49.
- Die Affinitätsmarkierungen 3, 4 und 5 wurden wie folgt hergestellt:
- Einer Lösung von 3-Mercaptopropansäure (1,59 g, 15 mMol) in 70 ml 2,0 m wäßrige Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) wurde eine Lösung von 2,4-Dinitrofluorbenzol (3,32 g, 18,0 mMol) in 50 ml abs. Ethanol unter Rühren, bei Raumtemperatur, unter Stickstoff, 15 min lang zugegeben. Nach 24 Stunden wurde der blaßgelbe, feste Niederschlag gesammelt und mit Wasser gewaschen, wodurch 8 erhalten wurde (3,40 g, 12,5 mMol, 83%): Fp.: 154.5 - 157.5ºC; IR (KBr) 3630,3476 (br), 3113, 3082, 1718, 1589, 1511, 1344, 1055, 922 cm&supmin;¹;
- ¹H-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 2.71 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 3.40 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 3.40 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 3.40 (s, 1H), 7.37 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 3.32 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 8.76 (d, 1H, J = 2.5 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 271 (M-H)&supmin;, 249, 199, 183, 141, 113, 109. Elementaranalyse: berechnet für C&sub9;H&sub8;N&sub2;O&sub6;3: C, 39.71; H, 2.96; N, 10.29; S, 11.78.
- Gefunden: C, 39.92; H, 2.96; N, 10.15; S, 11.64.
- Einer Lösung von 8 (0,70 g 2,5 mMol) in trockenem Dioxan (10 ml) wurde Thionylchlorid (5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff 12 Stunden lang gerührt. Die flüchtigen Substanzen wurden im Vakuum entfernt und der gelbe Rückstand in trockenem Dioxan (25 ml) gelöst. Es wurde eine Lösung von Diazomethan (0,6 Mol) in Diethylether (25 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0ºC 4 Stunden lang gerührt, woraufhin die flüchtigen Substanzen im Vakuum entfernt wurden. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat als Eluens gereinigt, wodurch 9 (0,29 g, 0,92 mMol, 36%) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 117-119ºC; Rf = 0,52 im obigen Eluens; IR (KBr-Preßling) 3458 (br), 3090, 2111, 1637, 1583, 1508, 1340, 1096 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2.75 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 3.35 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 5.32 (s, 1H), 7.61 (d, 1H,J = 9.0 Hz), 8.48 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 9.07 (d, 1H, J = 2.5 Hz) Massenspektrum (FAB&supmin;) 296 (M&supmin;), 199, 183, 141, 109. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub8;N&sub4;O&sub5;S: C, 40.54; H, 2.72; N, 18.91; S, 10.82. Gefunden: C, 40.81, H, 2.89; N, 18.59; s, 10.79.
- Einer Lösung von 9 (95 mg, 0,32 mMol) in trockenem Dioxan (5 ml) wurde bei 25ºC unter Stickstoff eine gesättigte Lösung von HBr in Dioxan (2 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt, wonach die flüchtigen Substanzen im Vakuum vollständig entfernt wurden, wodurch reines 3 (130 mg, 0,373 mMol, 86%) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 99-101ºC; Rf = 0,78 in 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat;
- IR (KBr) 3106, 3097, 3012, 2958, 1724,
- 1592, 1510, 1339, 1068, 1053 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 3.24 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.46 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 4.28 (s, 2H), 7.98 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.48 (dd, 1H, J = 2. 5, 9. 0 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 268 (M-HBr)&supmin;, 233, 199, 183, 109. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub9;BrN&sub2; O&sub5;S: C, 34.40; H, 2.60; Br, 22.89; N, 8.02; 3, 9.18. Gefunden: C, 34.50; H, 2.60; Br, 22.70; N, 7.88; S, 9.04.
- Die Verbindung wurde ausgehend von 4-Mercatpobutansäure (1,80 g, 15 mMol) wie oben für 8 beschrieben hergestellt, so daß 10 (3,21 g, 11,2 mMol, 75%) als blaßgelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 126,5-130ºC;
- IR (KBr) 3528 (br), 3117, 3090, 2948, 1709, 1587, 1518, 1341 cm&supmin;¹;
- ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1.85 (m, 2H), 2.34 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.18 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 3.78 (s, 1H), 7.95 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 8.41 (dd, 1H, J = 2.4, 9.0 Hz), 8.84 (d, 1H, J = 2.4 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 285 (M-H)&supmin;, 249, 199, 139. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;N&sub2;O&sub6;S: C, 41.96; H, 3.52; N, 9.79; S, 11.20. Gefunden: C, 41.94; H, 3.50; N, 9.60; S, 10.97.
- Diese Verbindung wurde ausgehend von 10 (1,00 g, 3,49 mMol) wie oben für 9 beschrieben hergestellt, so daß 11 (0,68 g, 2,20 mMol, 63 Wo) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 84-86ºC; Rf = 0,52 in 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat;
- IR (KBr) 3106, 2939, 2866, 2104, 1626, 1589, 1513, 1343 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 2.10 (m, 2H), 2.55 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.10 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 5.29 (s, 1H), 7.74 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.38 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 9.06 (d, 1H, J = 2.4 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 310 (M&supmin;), 249, 199, 139, 107.
- Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub0;N&sub4;O&sub5;S: C, 42.58; H, 3.25; N, 18.06; S, 10.33. Gefunden: C, 42.79; H, 3.39; N, 17.93; S, 10.14.
- Diese Verbindung wurde ausgehend von 11 (101 mg, 0,326 mMol) wie oben für 3 beschrieben hergestellt, so daß 4 (116 mg, 0,32 mMol, 98%) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 87-90ºC; Rf = 0,78 in 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat;
- IR (KBr) 3113, 3009, 2953, 1723, 1592, 1512, 1343 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1.89 (m, 2H), 2.79 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 3.17 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 4.36 (s, 2H), 7.88 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 8.43 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 8.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz)
- Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub1;BrN&sub2;O&sub3;S: 0, 36.38; H, 3.05; Br, 2.00; N, 7.71. S, 8.83. Gefunden:c, 36.57; H, 3.17; Br, 21,83; N, 7.49; S, 9.01.
- Die Verbindung wurde wie oben für 8 beschrieben ausgehend von 4-Mercaptopentansäure (2,00 g, 15 mMol) hergestellt, wodurch 12 (4,20 g, 14,0 mMol, 93%) als blaßgelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 159-161ºC;
- IR (KBr) 3117, 2948, (br), 1707, 1587, 1587, 1517, 1341 cm&supmin;¹
- ¹H-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1.83 (m, 4H), 2.39 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.83 (s, 1H) 3.26 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 7.95 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.45 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 8.96 (d, 1H, J = 2. 5 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 299 (M-H)&supmin;, 199, 183, 141, 113, 109. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub6;5: C, 44.00; H, 4.03; N, 9.33. S, 10.68. Gefunden: C, 43.33; H, 3.92; N, 9.42; S, 10.59.
- Diese Verbindung wurde wie oben für 9 beschrieben ausgehend von 12 (1,00 g, 3,33 mMol) hergestellt, so daß 13 (0,70 g, 2,15 mMol, 65%) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 120-122ºC; Rf = 0,50 in 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat;
- IR (KBr) 3093, 2937, 2110, 1637, 1584, 1508, 1336, 1109 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1.83 (m, 4H), 2.39 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.04 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 5.25 (s, 1H), 7.53 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.37 (dd, 1H, J = 2.5, 9.0 Hz), 9.07 (d, 1H, J = 2.5 Hz);
- Massenspektrum (FAB&supmin;): 324, 307, 267, 199, 183, 141, 109.
- Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S: C, 44. 44; H, 3.73; N, 17.28. S, 9.89. Gefunden: C, 44.60; H, 3.74; N, 16.99; S, 9.65.
- Diese Verbindung wurde wie oben für 3 beschrieben ausgehend von 13 (119 mg, 0,366 mMol) hergestellt, so daß 5 (0,127 g, 0,336 mMol, 92%) als gelber Feststoff erhalten wurde: Fp.: 80-83ºC, Rf= 0,78 in 9 : 1 Methylenchlorid:Ethylacetat;
- IR (KBr) 3121, 2937, 2872, 1719, 1586, 1513, 1339, 1095, 1053; ¹H-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1.81 (m, 4H), 2.79 (t, 2H, J=6.6 Hz), 3,24 (t, 2H, J=6.8 Hz), 4.13 (s, 2H), 7.93 (d, 1H, J=9.0 Hz), 8.45 (dd, 1H, J=2.5, 9.0 Hz), 8.95 (d, 1H, J=2.5 Hz); Massenspektrum (FAB&supmin;) 378 (M&supmin;), 307, 263, 199, 183, 141, 109. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub3;BrN&sub2;O&sub5;S: C, 38.21; H, 3.47; Br, 21.18; N, 7.43; S, 8.50. Gefunden: C, 28.40; H, 3.45; Br, 21.34; N, 7.34; S, 8.46.
- Die Vorgangsweise zum Einführen eines Thiols an der Bindungsstelle von MOPC315 ist in Fig. 3 dargelegt. Diese Schritte wurden mit dem Fab-Fragment durchgeführt, das durch die Behandlung des reduzierten und alkylierten IgA mit Papain, gefolgt von Affinitätschromatographie auf DNP-gekoppelter Sepharose 4B (Goetzl (1970) "Biochemistry" 9 : 1267) erzeugt wurde. Das Fab-Fragment (10 µM) wurde entweder 1 Stunde lang mit 1,5 Äquivalenten der Aldehyde 1 oder 2, gefolgt von 7,5 Äquivalenten NaCNBH&sub3; in 0,2 m Natriumphosphat; pH 7,0, bei 37ºC über 20 Stunden; oder 16 Stunden lang mit 1,3 Äquivalenten der α-Bromketone 3, 4 oder 5 in 0,1 m Natriumbicarbonat, pH 9,0, bei 37ºC behandelt. In beiden Fällen wurde das markierte Fab mittels Chromatographie über Sephadex G-50 in 0,1 m Natriumphosphat, pH 7,3, und - nach dem Lyophilisieren - mittels darauffolgender Affinitätschromatographie auf DNP-gekoppelter Sepharose 4B (Goetzl, oben) gereinigt, um unmarkiertes oder nichtspezifisch markiertes Fab zu entfernen. Das Ausmaß der Derivatisierung wurde spektralphotometrisch quantifiziert (für die Markierungen 1 und 2: λmax = 360 nm, ε=12.800 Mol&supmin;¹cm&supmin;¹), sowie - für die Markierungen 1 und 2 - zusätzlich durch Einbau von Tritium aus NaCNB³H&sub3; (unter Verwendung von 12 mCi/mMol NaCNB³H&sub3;). Bei den Markierungen 2 und 4 waren über 90% der Markierung eingebaut (85%ige Ausbeute nach der Affinitätschromatographie) (Tabelle 2). In beiden Fällen trat in Gegenwart von 10 mMol des kompetitiven Inhibitors DNP-Glycin weniger als 10% nicht-spezifische Markierung auf. Tabelle 2 Einbau von Affinitätsmarkierungen in Fab Verbindung % markiertes Fab (ohne DNP-Glycin) % markiertes Fab (mit DNP-Gylcin)
- Die Abspaltung des mit 2 oder 4 (2,0 mg) affinitätsmarkierten Fab mit 50 mMol Dithiothreitol in 2 mM EDTA, 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0 (2 ml) über 12 Stunden bei 37ºC ergab das freie Thiol. Das thiolhältige Fab wurde durch Raschentsalzungschromatographie unter Verwendung einer Pharmacia FPLC-Säule in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,3 direkt in 1,0 ml einer 4,5 mM Lösung von 2,2'- Dithiodipyridin (0,1 M Natriumphosphat, pH 5,5, mit 15% Acetonitril) gesammelt. Dieses Gemisch (Endvolumen: 10 ml) wurde bei 20ºC 12 Stunden lang umgesetzt, woraufhin überschüssiges 2,2'-Dithiodipyridin durch ausgiebige Dialyse entfernt wurde. Der thiolisierte Antikörper wurde in einer Ausbeute von über 90% derivatisiert (65% Ausbeute im Fall von 2), bezogen auf das Absorptionsvermögen von Thiopyridin bei 343 nm (ε=7060 Mol&supmin;¹cm&supmin;¹) (Grassetti et al. (1967) "Arch. Biochem. Biophys." 119 : 41) nach der Spaltung mit 10 mMol Dithiothreitol und das Protein-Absorptionsvermögen bei 280 nm (E0,1%=1,37, MG=50.000 für Fab).
- Mit 2 oder 4 markierte Fab-Fragmente wurden mit Trypsin gespalten und Peptid- Mapping unterzogen, um die Selektivität des Thioleinbaus zu bestimmen. Fab wurde in Gegenwart von Markierung 2 und NaCNB³H&sub3; (12 mCi/mMol) oder mit ³H-markiertem 4 (4 mCi/mMol) wie oben beschrieben affinitätsmarkiert. ³H-markiertes 4 wurde wie für 4 beschrieben ausgehend von 3,5-³H-2,4-Dinitrofluorbenzol hergestellt. Das markierte Fab (1,0 mg/ml) wurde dann in 8 M Harnstoff, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, denaturiert, mit 20 mM Dithiothreitol (1 Stunde bei 37ºC) reduziert und mit 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, alkyiert, mit 20 mMol Dithiothreitol (1 Stunde bei 37ºC) reduziert und mit 60 mMol Jodacetamid (1 Stunde bei 37ºC) alkyliert. Nach Dialyse gegen 7 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurden die schweren und leichten Ketten durch Anionenaustauschchromatographie auf einer Pharmacia Mono-Q-FPLC-Säule getrennt. Die Trennung wurde bei 1,0 ml/min in 7 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit einem linearen Gradienten von 40 mM bis 200 mM Natriumchlorid über 30 min erreicht.
- Im Fall von mit 2 markiertem Fab wurde festgestellt, daß die schwere Kette über 95% des eingebauten Tritiums enthielt; bei mit 4 markiertem Fab fanden sich über 95% der Tritiummarkierung auf der leichten Kette. In jedem Fall wurde die radiomarkierte Kette gegen 2 M Harnstoff/100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,2, dialysiert und dann in Gegenwart von 0,1 mM CaCl&sub2; bei 37ºC im Dunkeln mit Trypsin (Gewichtsverhältnis Trypsin:Protein = 1 : 25) behandelt. Nach 8 Stunden wurden die Reaktionen mit 10 Vol.-% Essigsäure gequenscht. Die radiomarkierten Peptide wurden durch Umkehrphasen- HPLC mit einem linearen Gradienten von 0 bis 50% Acetonitril in Wasser mit 1,0 ml/min über 70 min gereinigt (dem Wasser bzw. dem Acetonitril wurden 0,1 Vol.-% und 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure zugegeben). Peptide wurden aufgrund ihres Absorptionsvermögens bei 214 nm bestimmt, Fraktionen wurden in 1,0 ml-Intervallen abgenommen und die Radioaktivität von Aliquoten gezählt (Fig. 4). Fraktionen, die Radioaktivität enthielten, wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 50% 2-Propanol in Wasser bei 0,75 ml/min über 70 min erneut chromatographiert. Das Wasser und das 2-Propanol enthielten 0,1% bzw. 0,06% Trifluoressigsäure.
- Die Aminosäuresequenzen der reinen Peptide wurden auf einem Applied Biosystems 477A Protein Sequencer ermittelt. Bei der von mit 2 markiertem Fab erhaltenen, schweren Kette war jegliche nachweisbare Derivatisierung am Leucin 52H. Bei der leichten Kette von mit 4 markiertem Fab war jegliche nachweisbare Derivatisierung am Tyrosin 34L. Diese Reste sind identisch mit jenen von Givol et al. (Haimovich et al. (1972) "Biochemistry" 11 : 2389) mit den Reagenzien Bromacetyl-Nε-DNP-L-lysin und N-Bromacetyl-N'-DNP-ethylendiamin markierten.
- Zusätzlich zur selektiven Modifikation des thiolierten Antikörpers mit katalytischen und anderen Gruppen kann das Thiol selbst bei der Thiolyse eines entsprechenden Substrats als Nukleophil agieren. Die DNP-hältigen Ester 14 und 15 (Fig. 5) wurden als Substrate für die Umsetzung mit thioliertem Fab, das mit 2 bzw. 4 markiert war, ausgewählt. Die Position der spaltbaren Verbindung in der Affinitätsmarkierung 2 kommt jener des Esters im entsprechenden Substrat 14 nahe, wodurch gewährleistet wird, daß das Thiol in der Kombinationsstelle entsprechend angeordnet ist, um den Ester anzugreifen. Ebenso sollte das Thiol in mit 4 markiertem Fab so angeordnet sein, daß es den Ester 14 angreift. Darüberhinaus enthalten diese Substrate fluoreszierende Cumarin- Abgangsgruppen, die leicht in Konzentrationen im nMol-Bereich nachgewiesen werden können.
- Ein Gemisch aus N-DNP-3-Aminopropansäure (1,28 g, 5 mMol) und 7-Hydroxycumarin (0,81 g, 5 mMol) in Phosphoroxychlorid (8 ml) wurde unter Stickstoff 2 Stunden lang rückflußerhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und zu 60 ml kaltem Wasser zugegeben. Der braune Feststoff wurde abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zerstoßen mit Aceton ergab 14 (0,79 g, 2,0 mMol, 40%) als hellbraunen Feststoff; Fp.: 155-156ºC, IR (KBr-Preßling) 3374, 3107, 2368, 1750, 1722, 1624, 1532, 1426, 1349, 1159, 1127 cm&supmin;¹, ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ 3.04 (t, 2H, J=6.7 Hz), 2.90 (t, 2H, J=6.5 Hz), 6.43 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.17 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.30 (s, 1H), 7.37 (d, 1H, J=9.7 Hz), 7.78 (d, 1H, J=8.5 Hz), 8.07 (d, 1H, J=9.3 Hz), 8.29 (d, 1H, J=9.6 Hz), 8.87 (s, 1H), 8.99 (m, 1H); Massenspektrum (FAB&spplus;) 400 (MH&spplus;). Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub8;: C, 54,14; H, 3.26; N, 10.53. Gefunden: C, 54.05; H, 3.26; N, 10.23.
- Ein Gemisch aus 2,4-Dinitrobenzoesäure (1,06 g, 5,0 mMol) und 7-Hydroxycumarin (0,81 g, 5,0 mMol) in Phosphoroxychlorid (4 ml) wurde mit einem Kalziumsulfat- Trockenrohr 40 min lang rückflußerhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und zu Wasser (40 ml) hinzugegeben. Der braune Feststoff wurde abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch 15 (1,32 g, 3,7 mMol), 74%) als rot-brauner Feststoff erhalten wurde: Fp.: 200-205ºC;
- IR (KBr) 3107, 3057, 2364, 1736, 1619, 1544, 1348, 1246, 1122 cm&supmin;¹; H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6.53 (d, 1H, J=9.6 Hz), 7.34 (dd, 1H, J=2.2, 8.5 Hz), 7.47 (d, 1H, J=2.1 Hz), 7.89 (d, 1H, J=8.5 Hz), 8.12 (d, 1H, J=9.6 Hz), 8.44 (d, 1H, J=8.4 Hz), 8.78 (dd, 1H, J=2.2, 8.4 Hz) 8.93 (d, 1H, J=2.2 Hz), Massenspektrum (EI) 356 (M&spplus;), 195, 162, 134, 122. Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub8;: C, 53.94; H, 2.26; N, 7.86. Gefunden: C, 52.18; H, 2.29; N, 7.51.
- Die Spaltung der DNP-Cumarinester 14 und 15 durch die thiolhältigen Antikörper wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 µM NaCl, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0 mit 24 µM Dithiothreitol bei 10ºC durchgeführt. Die Freisetzung von freiem Cumarin wurde fluorimetrisch quantifiziert, wobei bei 355 nm angeregt und die Emission bei 455 nm gemessen wurde. Das S-Thiopyridyl-Fab wurde zuerst, 30 min vor den Assays, gegen Assaypuffer dialysiert, ein Aliquot des Thiopyridyl-Fab (0,15 mg in 0,19 ml) wurde mit 3,8 mM Dithiothrietol bei 20ºC reduziert. Für jeden Assay wurde reduziertes, thioliertes Fab (15 µg in 18,8 µl) mit Assaypuffer (2,95 ml) so verdünnt, daß die Nettokonzentrationen an thioliertem Fab und an Dithiothreitol 0,1 µM bzw. 24 µM betrugen. Nach der Gleichgewichtseinstellung wurde das Substrat zugegeben (30 µl einer Stammlösung in Acetonitril) und die Lösung 10 s lang vermischt, bevor die Fluoreszenzänderung aufgezeichnet wurde. Die Geschwindigkeiten für die Antikörper wurden korrigiert, indem die Spaltungsgeschwindigkeit in Abwesenheit von Fab subtrahiert wurde.
- Es wurde festgestellt, daß der mit 2 affinitätsmarkierte Antikörper die Spaltung von Ester 14 gegenüber der Spaltungsreaktion in äquimolarem Dithiothreitol um einen Faktor von 6 · 10&sup4; beschleunigt. Die Reaktionskinetik stimmt mit der Bildung eines Michaelis- Komplexes überein (Fig. 6). Die kinetischen Konstanten kcat und Km der Reaktion betragen 0,87 min&supmin;¹ bzw. 1,2 µMol. Die Thiolysereaktion wurde durch DNP-Glycin mit einem Ki von 8 µMol kompetitiv gehemmt
- Cumarin
- Weder der ungespaltene affinitätsmarkierte Antikörper, noch der iodacetamid-alkylierte Antikörper beschleunigte die Geschwindigkeit der Thiolysereaktion über die Hintergrundgeschwindigkeit. Die Stöchiometrie der Produktfreisetzung entsprach 1,0 Cumarin zu 1,0 Fab-SH. Die Zugabe von Hydroxylamin zum Reaktionspuffer führte nicht zu Mehrfachumsätzen. Jedoch kann das Einbringen sowohl eines Thiols als auch einer allgemeinen Base in die Markierung zu einem katalytischen System führen (Bruice (1959) "J. Am. Chem. Soc." 81 : 5444, und Street et al. (1985) "J. Am. Chem. Soc." 107 : 7669). Interessanterweise hydrolysierte mit Bromketon 4 markiertes, thioliertes Fab die Ester 6, 7 oder DNP-Acetat nicht. Fluoreszenz-Quenching-Versuche zeigten, daß das Derivatisierungs-Fab - vermutlich als Ergebnis der sterischen Blockierung der Antikörper- Kombinationsstelle - das Substrat nicht mit nennenswerter Affinität band (Fig. 7).
- Um zu zeigen, daß das thiolierte Fab mit einem Reportermolekül weiter derivatisiert werden kann, wurde N-Fluorsceinthioureido-2-mercaptoethylam in (Zackerman et al. (1987) "Nucleic Acids Res." 15 : 5305) selektiv über eine Disulfidaustauschreaktion eingebaut (Fig. 3). Das mit 2 markierte S-Thiopyridyl-Fab (9,0 nMol in 0,50 ml 0,1 m Natriumphosphat, pH 7,3) wurde bei 23ºC mit N-Fluoresceinthioureido-2- mercaptoethylamin behandelt (52 nMol in 0,50 ml 0,1 m Triethylammoniumacetat, pH 7,5, plus 10% Acetonitril). Die Reaktion wurde durch Freisetzung von Thiopyridon bei 343 nm (Grassetti und Murray (1967), "Arch. Biochem. Biophys." 119 : 41) überwacht. Nach 3 Stunden wurde kein weiteres Thiopyridon freigesetzt und das Gemisch ausgiebig gegen Assaypuffer dialysiert (50 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0). Das resultierende Addukt wurde in 84% Gesamtausbeute isoliert, wobei mehr als 90% des Fluorphors eingebaut waren.
- Die Zugabe des Liganden DNP-Glycin zum Fluorescein-Fab-Addukt führte zu einer Abnahme der Fluoreszenz, wodurch ein direkter Assay auf Ligandenbindung bereitgestellt wurde (Fig. 7). Fluoreszenz-Quenching-Experimente wurden bei 10ºC unter Anregung bei 492 nm durchgeführt und die Emission bei 521 nm gemessen. Das Fluorescein-Fab-Addukt wurde mit Assaypuffer (50 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0) auf 0,10 µM verdünnt. Aliquote von 2,4-DNP-Glycin wurden zugegeben und nach dem Vermischen die Fluoreszenz beobachtet. Die Assoziationskonstante von DNP-Glycin zum Fluorescein-Fab-Addukt wurde mit 3,0 · 10&sup5; Mol&supmin;¹ ermittelt, fast identisch mit dem KA von DNP-Glycin zu underivatisiertem MOPC315, nämlich 2,0 · 10&sup5; Mol&supmin;¹. Die Zugabe von DNP-Glycin zu einer Lösung von einem Äquivalent freiem N-Fluoresceinthioureido-2-mercaptoethylamin und underivatisiertem Fab (jeweils 0,10 µM) führte zu keiner nachweisbaren Fluoreszenzänderung (Fig. 7).
- Die vorangehende Erfindung ist zwar durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zweck eines klaren Verständnisses detailliert beschrieben worden, es versteht sich jedoch, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, die ebenso im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche liegen.
Claims (10)
1. Verfahren zum Einbringen einer aktiven Funktionalität in ein Polypeptid nahe
einer Bindungsstelle, wobei das Verfahren umfaßt:
das Kombinieren des Polypeptids mit einem Liganden, der in der Lage ist, sich an
die Bindungsstelle zu binden, wobei der Ligand eine erste, daran abspaltbar befestigte,
reaktive Gruppe aufweist;
das kovalente Binden der ersten reaktiven Gruppe an eine Aminosäure-
Seitenkette des Polypeptids, wobei die Aminosäure-Seitenkette sich in einer Entfernung
von weniger als etwa 10 Å von der Bindungsstelle und an einer Position befindet, wo
die aktive Funktionalität die Bindung eines Target-Liganden an die Bindungsstelle nicht
wesentlich beeinträchtigt;
das Abspalten der ersten reaktiven Gruppe vom Liganden, wodurch eine Einheit
der reaktiven Gruppe über die Aminosäure-Seitenkette am Polypeptid gebunden bleibt;
und
das Entfernen des Liganden vom Polypeptid.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die verbleibende Einheit die aktive
Funktionalität ist und aus der aus katalytischen Funktionalitäten und reaktiven
Funktionalitäten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Einheit ein Thiol ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin durch Spaltung der reaktiven Gruppe eine
Einheit bereitgestellt wird, die aus der aus Diazoketonen, aromatischen Aziden,
Diazonium, Thiol, α-Bromketon, Epoxid und Aldehyd bestehenden Gruppe ausgewählt
ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, weiters umfassend das kovalente Binden einer
zweiten Funktionalität an die Einheit der reaktiven Gruppe, worin die zweite
Funktionalität die aus der aus katalytischen Funktionalitäten, reaktiven Funktionalitäten,
Markergruppen und chemotherapeutischen Mitteln bestehenden Gruppe ausgewählte,
aktive Funktionalität ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 5, worin die aktive Funktionalität eine aus der
aus Säuren, Basen, Enzymkofaktoren, Metallkomplexen, photoaktiven Molekülen,
Nukleophilen, Elektrophilen und redoxaktiven Molekülen bestehenden Gruppe
ausgewählte, reaktive Funktionalität ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2 oder 5, worin die aktive Funktionalität eine aus der
aus Alkylierungsmitteln, Oxidationsmitteln, Reduktionsmitteln, hydrolytischen
Substanzen und photoaktiven Substanzen bestehenden Gruppe ausgewählte, reaktive
Funktionalität ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, worin die aktive Funktionalität eine aus der aus
Fluorophoren, chemolumineszierenden Substanzen, biolumineszierenden Substanzen,
Farbstoffen, Spinmarkierungen, Flavinen, piezoelektrischen Molekülen und Biotin
bestehenden Gruppe ausgewählte, nachweisbare Markierung ist.
9. Verfahren nach Anspruch 5, worin die aktive Funktionalität ein aus der aus
Toxinen, Toxinfragmenten, Bakteriziden, Radikalfängern, Radikalbildnern,
Alkylierungsmitteln, Neurotransmittern, Radionukliden, antiviralen Verbindungen,
antifungalen Verbindungen, antineoplastischen Mitteln, antimycoplasmatischen Mitteln
und Schwermetallen bestehenden Gruppe ausgewähltes, chemotherapeutisches Mittel
ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polypeptid aus der aus Antikörpern,
Antikörperfragmenten, Enzymen, Enzymfragmenten, Hormonen, Lymphokinen,
Lectinen, Avidin, Proteinen des MHC, T-Zellen-Rezeptoren, G-Proteinen,
Neurotransmitter-Rezeptoren und DNA-Bindeproteinen bestehenden Gruppe
ausgewählt ist.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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