JPH0235097A - モノクローナル抗体 - Google Patents

モノクローナル抗体

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JPH0235097A
JPH0235097A JP1103321A JP10332189A JPH0235097A JP H0235097 A JPH0235097 A JP H0235097A JP 1103321 A JP1103321 A JP 1103321A JP 10332189 A JP10332189 A JP 10332189A JP H0235097 A JPH0235097 A JP H0235097A
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cells
tumor
antibodies
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Magda Gutowski
マグダ・ガトウスキー
David A Johnson
デイビット・アーサー・ジョンソン
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Eli Lilly and Co
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、扁平上皮細胞癌および腺腫などの各種の癌腫
に存在する細胞表面である新規な腫瘍関連抗原を提供す
る。さらに、本発明は、この抗原と反応する抗体、この
本発明の抗体を産生ずるノ・イブリドーマセルライン、
および癌の診断および治療における該抗体の使用方法を
も提供するものである。
悪性腫瘍の早期の診断および腫瘍タイプの同定は癌腫の
臨床的処置にとって重要である。本発明は、ヒト癌細胞
に発現される抗原と反応するモノクローナル抗体を包含
するものである。癌腫と反応するモノクローナル抗体の
生産は、米国特許筒４．７０８，９３０号、欧州特許公
開第１５７．６１３号、マザーリック（Ｍａｚａｕｒｉ
ｃ）らのカンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）、４２：１５０（１９８２）、ブレンナ−（
Ｂｒｅｎｎｅｒ）らのカンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓｅａｒｃｈ）、　４２：３１ｇ？（１９８２）
、マル／ヤイン（Ｍｕｌｓｈｉｎｅ）らのザ・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、　１３１６１：４９７、お
よびマスク（Ｍａｓｕｋｏ）らのジャパニーズ・ジャー
ナル・フォー〇カンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、　７６（５）：３８６に記載されているが、本
発明の抗原と反応するモノクローナル抗体は記載されて
いない。肺、頭部および頚部の扁平上皮癌ならびに結腸
および肺の腺腫はすべて上記抗原を発現するので、本発
明の抗体と反応する。
ヒト癌腫におけるＬ／１Ｃ２抗原の広い分布は、本発明
の診断および治療適用の重要性を物語っている。
本発明は、実質的に純粋な形態にある腫瘍関連糖タンパ
ク抗原であって、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測
定でｉ；！１１０，０００−１４０，０００ダルトンの
範囲の分子量を有し、ヒトの頭部、頚部および肺の上皮
細胞から生じるヒト扁平上皮癌の表面に存在し、ハイブ
リドーマセルラインＬ／１Ｃ２から産生さ扛る抗体と免
疫沈降を生じる抗原を目的とするものである。
驚くべきことに、Ｌ／１Ｃ２抗原は本発明の抗体との結
合の後に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌ　１ｚｅｄ）される
。
このＬ／１Ｃ２抗原の内在化は、本発明の抗体がＬ／１
Ｃ２抗原に結合し、次いでその抗原−抗体複合体が細胞
内に取り込まれることにより、本発明の抗体と予め結合
させておいた腫瘍細胞崩壊剤を細胞内に供給できるとい
う点で本発明の治療態様として重要な局面である。
本発明はさらに、上記の腫瘍関連糖タンパク抗原と反応
する抗体を産生ずるハイブリドーマセルラインを提供す
るものである。
本発明はまた、上記の腫瘍関連糖タンパク抗原と反応す
る抗体をも提供するものである。
さらに、本発明は、試料中のＬ／１Ｃ２抗原の存在を検
出する方法であって、該試料に、上記の腫瘍関連抗原と
反応する抗体を加え、該試料に対する該抗体の反応性を
測定することを特徴とする方法を提供するものである。
本発明の抗体は、Ｌ／１Ｃ２抗原を発現する腫瘍に細胞
毒性物質をインビボ供給するのに特に有用である。細胞
毒性物質は、本発明の抗体と結合すると、その効能が有
意に増加することを示す。
以下に添付の図面の説明をする。
第１図：Ｌ／１Ｃ２抗原およびＬ／１Ｃ２抗体のドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の結果である。試料を、ドデ／ル
硫酸ナトリウムを存在させたポリアクリルアミドマトリ
ックスの電気泳動にかける。その移動距離を既知の分子
量のタンパク質と比較し、抗体サブユニットおよび抗原
の分子量を確立する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ジスルフィ
ド結合サブユニットを解離させる程度の還元条件下で行
った。パネルＡニブロチインＡ１１Ｌ／ｉＣ２抗体の単
一のＨ鎖および単一のし鎖を示している、還元条件下で
行ったコオマノシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂ
ｌｕｅ）染色７−１５％勾配ゲルである。
パネルＢ：還元条件下の７−１５％ゲル上で分子量標品
と共に分析した、免疫沈降された’Ｈ−グルコサミンー
標識化Ｌし　Ｉ　Ｃ２抗原のオートラジオグラムである
。表示した数字は、ｔｏ−３ｘ標品の分子量を表してい
る。ミエローマ（骨髄腫）１ｇＧ３ネガティブコントロ
ールは、確認できる程には抗原と免疫沈降しなかった。
第２図：選択した腫瘍セルラインと反応するＬ／１Ｃ２
の細胞選別分析の結果である。図示されているように、
ＵＳＣＬＳ−１、Ｍ２１およびＴ２２２標的細胞をＬ／
　Ｉ　Ｃ２または骨髄腫１ｇＧ３コントロール免疫グロ
ブリン（ｍ−１ｇＧ３）と共に懸濁液中でインキュベー
トした。検出試薬は、フルオレセイン標識化ヤキＦ　（
ａｂ’　）’抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭであった。
平均チャンネル蛍光を示す。
第３図：Ｔ２２２細胞におけるＬ／１Ｃ２抗原に結合し
た後のＬ／　ｌ　Ｃ２抗体の内在化の動態をＵＶ顕微鏡
検査によって表す。この分析法の詳細は実施例ＩＯに記
載する。パネル八には、０時点における膜染色の特徴で
ある明るいリング状蛍光が示されている。パネルＢは１
０５分時点のものであるが、この分析により上記細胞の
上皮における染色のフサ（ｃ　１ｕｓｔｅｒｓ）が表さ
れている。パネルＣは１３５分時点であり、これにはＬ
／　Ｉ　Ｃ２が既に内在化されていることを示す細胞内
染色のみが示されている。
第４図：実施例１２に記載したヌードマウス異種移植モ
デルにおけるＴ２２２異種移植片の増殖曲線である。パ
ネルＡには、Ｔ２２２腫瘍の増殖を抑制するＬ／１Ｃ２
−ＤＡＶＬＢＨＹＤの効能が表されている。パネルＢは
、ＤＡＶＬＢＨＹＤが腫瘍細胞と結合しない免疫グロブ
リンにコンジュゲートされているコントロール群である
。パネルＣは、遊離薬物コントロールてあり、これによ
り、パネルＡのＬ／１Ｃ２抗原反応性免疫コンジュゲー
ト体およびパネルＢの非−Ｌ／１Ｃ２抗原反応性免疫フ
ンシュゲート体と、ＤＡＶＬＢＨＹＤ活性との比較が行
える。
Ｌ／１Ｃ２と称される抗原は、３Ｈグルコサミンで生合
成によって環識したヒト癌腫セルラインの抽出物（エキ
ス）から免疫沈降によって単離することかできる。この
Ｌ／１Ｃ２抗原は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルで測
定した場合に１１０゜０００から１４０．０００ダルト
ンの分子量範囲を有する糖タンパク質である。
本発明のハイブリドーマセルラインは、免疫学的に関連
ある肺臓細胞を活性化するための免疫原性物質としてヒ
ト癌腫のセルラインを使用すれば調製することができる
。そして、マウス骨髄腫細胞との融合によって肺臓細胞
を永続化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ）する。次いで、こ
の融合によって得られたハイブリドーマと呼ばれる雑種
細胞、即ちハイブリドーマセルラインを、以下の第１表
に記載されているような各種のヒト癌腫セルラインに存
在するＬ／　Ｉ　Ｃ２抗原との反応性に関して選択、ス
クリニングする。
ヒト癌腫セル 寒達 ラインにおけるＬ／］、Ｃ２抗原の典型的分布扁平上皮
癌 ＡＤＵ Ｅ１８０ ＵＳＣＬＳ−１ 移行上皮癌 Ｔ４ ＣＣ３ＵＰ 腺腫 Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ ＨＴ　２９ Ｓ　Ｋ−ＣＯ−Ｉ ＵＣＬＡ／Ｐ３ Ｕ１４５ Ｃ３ 黒色腫（メラノーマ） 咽頭 頚（類表皮腫） 肺 肺 膀胱 膀胱 膀胱（乳頭腫） 膀胱 膀胱 結腸 結腸 結腸（腹水） 肺 前立腺 前立腺 皮膚 皮膚 第１表（続き） 非−形質転換セル−ライン ＦＬＯＷ２０００　　　胎児の肺線維芽細胞Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ　５５１　　　　　皮膚線維芽細胞第１表中、明ら
かな膜蛍光は（＋）で、弱い蛍光は（＋／−）で、陰性
反応は（−）で示す。すへての判定は、骨髄腫タン／　
ｚＮり質のネガティブコントロールと対比させて行う。
標的セルライン（こは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ロックビレ、ＭＤ
　　２０８５２、ＡＴＣＣ）から人手される以下の系統
を包含させた：　ＦａＤｕ　（ＡＴＣＣ＃Ｉ（ＴＢ４３
）　、５６３７　（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ９）、ＭＥ１８０
（ｌ〜ＴＣＣ＃ＨＴＢ３３）、５Ｋ−Ｃｏ−１（ＡＴＣ
Ｃ＃ＨＴＢ３９）、ＰＯ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５
）、ＤＵ１４５　（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ８１）　、Ｔ２４
　（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ４）　、ＲＴ４　（ＡＴＣＣ＃Ｈ
ＴＢ２）、ＨＴ２９　（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３８）　、Ｊ
８２（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢｌ）　、ＴＣＣ８ＵＰ　（ＡＴ
ＣＣ＃ＨＴＢ５）、およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ
２１８）。その他のセルラインとして（よ、Ｔ２２２　
［マスイ（Ｍａｓｕｉ）らのカンサー（Ｃａｎｃｅｒ）
　：４４（３）　１００２−７（１９８４）］　、Ｍ　
ｌ　４　　［チー（Ｃｈｅｅ）らのカンサー・リサーチ
３６（４）　：１５０３−１５０９（１９７６）］、Ｉ
ＪＣＬＡ／Ｐ３　ｉｌバルキ（Ｖａｒｋｉ）らのカンサ
ー・リサーチ４４：６８１−６８７（１９８４）］　、
およびＭ２１［モルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）らのサージエ
リ−（Ｓｕｒｇｅｒｙ）　６４（１）：２３３−２４０
（１９６８）］かある。Ｆｌｏｗ２０００をフロー・ラ
ボラトリーズ、　Ｉ　ｎｃ、　［Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉ　ｎｃ、　、　７６５５オールド・スプリング／％ウ
ス・ロード、マノクリーン、　Ｖ　Ａ、　２２１０１］
から入手した。
第１表は、上皮起源の腫瘍から誘導されるセルラインに
おけるＬ／１Ｃ２抗原の広範な分布を表している。Ｅｐ
ｉｃｓ−ＣｏｕｌｔｅｒＲＭａｒｋ　Ｉ　ＶＲ細胞分析
装Ｍ　［コールタ−・エレクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅ
ｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、ヘイレ（ｌｌｉａｌｅｈ
）、ＦＬ］を取り扱い方法どおりに使用し、本発明に係
る抗体のセルラインとの反応性を評価した。流動細胞測
定（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析の結果を添付
の第２図に示す。
新鮮なヒト腫瘍および正常組織の病理検体について評価
し、本発明に係る診断方法を説明する。イムノベルオキ
シダーセ（抗体−酵素コンシュケート体）法を利用する
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗原の正常組織分布を実施例６に記載す
る。
第２表は、異なる器官起源の癌腫におけるＬ／１Ｃ２抗
原の広範な分布を表すものである。
第２表 例示したＬ／　Ｉ　Ｃ２抗体によるヒト腫瘍組織イムノ
ペルオキシダーゼ染色 肺扁平上皮癌 頭部および頚部扁平癌腫 結腸腺腫 肺腺腫 胸部癌腫 卵巣癌腫 前立腺癌腫 リンパ腫 メラノーマ １５／１５ １２／１２ １７／１７ ７／７ ９／１４ ６／８ ０／１ ０／２ 正常ヒト組織の評価によって、Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗原が、
腎および肝などの幾つかの器官の脈管（ｖｅｓｓｅＩｓ
）、管（ｄｕｃｔｓ）、および細管（ｔｕｂｕｌｅｓ）
で発現されることが判明した。これはさらに、腸および
気管支の上皮表面で発現される。腫瘍および正常組織の
両方をＳ“む結腸試料では、腫瘍組織は正常結腸組織よ
りも鮮やかに染色された。
コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスティン（Ｍｉ　
１ｓｔｅｉｎ）、不イチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２
５６：４９５−４９７（１９７５）に最明に記載された
ハイブリドーマ技術は、ハイブリドーマセルラインであ
って、その分泌産物、モノクローナル抗体がＬ／　Ｉ　
Ｃ２抗原と反応性を示すハイブリドーマセルラインの調
製に使用できる。
これら本発明のハイブリドーマセルラインを調シシする
一般的な方法を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レク／ヨンから受託番号ＡＴｃｃ♯Ｂ９６８２の下で入
手可能なハイブリドーマセルラインＬ／１Ｃ２について
、実施例１に記載する。
当業者であれば、抗体およびハイブリドーマセルライン
Ｌ／１Ｃ２を包含する本発明は、本発明のハイブリドー
マ、ひいては本発明の抗体を調製するための各種の方法
を提供することか理解されよう。
Ｌ／１Ｃ２抗体は本発明の単なる例示に過ぎず、起源の
種、または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス名
称、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ。
ＩｇＥおよびＩｇＤなどにかかわらず、Ｌ／　Ｉ　Ｃ２
抗原と反応するすべての抗体が本発明の範囲内に属され
る。さらに、本発明はＬ／１Ｃ２抗体の抗原結合性フラ
グメントをも包含するものである。
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗原との結合能力は、本発明抗体の一般
的な特性である。
既述のように、本発明の抗体は、免疫化、ハイブリドー
マの調製、ならひに腫瘍セルラインとの反応性およびＬ
／１Ｃ２抗体と同様の正常組織分布による抗体の同定に
よって構築し、単離することができる。しかし、本発明
は、数多くの腫瘍および正常組織との抗体反応性を測定
する必要のない、本発明抗体の同定手段をさらに提供す
るものである。本発明の抗体は、Ｌ／　Ｉ　Ｃ２セルラ
インから産生されるＬ／１Ｃ２抗体を使用する免疫沈降
法および競合結合試験によって同定することができる。
実施例２に記載するように、Ｌ／１Ｃ２モノクローナル
抗体との免疫沈降法によって得られる類似した挙動パタ
ーンから抗原の同一性を同定することができる。同一性
の確認は、ある１つの抗体を過剰量で使用して細胞エキ
スから抗原を枯渇させ、池の抗体かこの処置エキス由来
の抗原と免疫沈降できないことを観察することによって
行うことができる。さらに、抗体が同じエピトープまた
は密接に関連したエピトープ群と結合する場合には、各
々の抗体はＬ／　Ｉ　Ｃ２抗原との結合性に関して他の
抗体と競合するものである。競合結合試験を実施例４に
記載する。
抗体調製物をパパインおよびペプシンなどのタンパク分
解酵素で処理すると、抗原結合活性を保持したＦａｂお
よびＦ　（ａｂ’　）２種などの抗体フラグメントが得
られる。従って、本発明の抗体をこのような酵素で処理
することによって、本発明のし／１Ｃ２結合性フラグメ
ントか得られる。本発明の抗体の抗原結合性フラグメン
トの調製法、およびその治療上の有用性を実施例１７で
説明する。Ｌ／１Ｃ２抗体の抗原結合性フラグメントは
、本発明の治療的態様として特に有用である。
当業者であれば、本発明の抗体および抗体フラグメント
の抗原結合性領域が本発明の重要な特徴であることが理
解できるであろう。本発明のＬ／１Ｃ２ハイブリドーマ
細胞は、本発明の上記抗原結合性領域をコードしている
ＤＮＡの好ましい供給源として利用できる。このＤＮＡ
は、組換えＤＮＡ技術によって、あらゆる所望のアミノ
酸残基配列をコートするＤＮＡと結合させることができ
、これにより、雑種またはキメラタンパク質をコートし
ている新規な「雑種（ハイブリッド）」または［キメラ
Ｊ　ＤＮＡ配列か得られる。このような融合により、最
終的に、抗体の一部分かある１つの種から誘導され、抗
体の他の部分が異なる種から誘導された本発明に係るキ
メラ抗体を得ることができる。しかし、さらに、本発明
はＬ／１Ｃ２抗原結合性領域を含有するキメラ分子も包
含するものである。
Ｌ／１Ｃ２抗体などの本発明の抗体を免疫検定に使用す
れば、ヒト組織試料中の癌腫の存在性を診断できる。本
発明のＬ／　Ｉ　Ｃ２抗体を使用し、患者の生検および
検死試料を癌腫の存在に関して評価できる。本発明の抗
体は、蛍光標識物、酵素標識物、および放射線標識物な
どの検出団（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｇｒｏｕｐｓ）によっ
て標識することができる。本発明で使用される検出団に
は、蛍光標識物としてのフルオレセイン、酵素標識物と
してのベルオキシグーゼ、および放射線標識物としての
ヨウ素１２５などがある。
本発明で利用できる蛍光標識物にはさらに、ローダミン
、フィコエリトリン（紅藻素）、およびさらに蛍光エネ
ルギーを放出する化合物などがあるか、これらに限定さ
れない。本発明で利用でき。
る酵素標識物にはさらに、グルコースオキシダーセおよ
びアルカリホスファターゼなどがあるが、これらに限定
されない。また、本発明で利用できる放射線標識物には
さらに、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１があ
るが、これらに限定されない。当業者であれば、明らか
に、上述の標識物か本発明で利用できる種々の標識物の
単なる例示に過ぎないことを認識するものである。Ｌ／
１Ｃ２抗原反応性抗体は、さらにビオチン（ｂｉｏｔｉ
ｎ）とコンジュゲートさせることによっても誘導するこ
とができ（実施例７）、またこれは、免疫化学的および
免疫組織学的に複数回適用する上において、蛍光標識物
、酵素標識物または放射線標識物とのコンジュゲートに
よって検出可能にしたアビジン（ａｖｉｄｉｎ）種の付
加に使用することができる。
本発明の抗体を使用して癌腫を検出し、診断する方法を
実施例６で説明する。
Ｌ／１Ｃ２抗体の特徴としては、Ｌ／１Ｃ２抗原と結合
するという本発明の抗体の一般的特徴か挙げられる。ハ
イブリドーマセルラインＬ／１Ｃ２（ＡＴＣＣＨＢ９６
８２）から産生されるＬ／１Ｃ２反応性抗体に特徴的な
性質には以下の物理的性質がある・ネズミＩｇＧ３アイ
ソタイプ（実施例８で決定）、Ｌ／　Ｉ　Ｃ２セルライ
ンからはこの免疫グロブリンしか分泌されないような産
生、ＡＴＣＣ受託番号Ｂ９６８２　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析に関する第１図参照）、およびＰＢＳ中１０ｚｇ／
ａＱの溶解性。
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗体の治療上の有用性を、この抗体の細
胞毒コンジュゲート体（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｄｒｕｇ
　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を使用して決定づけた。さら
に、非修飾抗体でさえインビトロ活性を示すことを確認
した。
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗体における腫瘍細胞増殖のインビトロ
阻害能力を第３表に示す。インビトロ腫瘍細胞増殖検定
については実施例９で詳細に説明する。
第３表 インビトロ腫瘍細胞増殖抑制御） 濃度　　　　　ＣＰＭ　　　＋／−Ｓ、Ｅ、　　％変化
　ＰＬ／１Ｃ２ １００μｇ／靜　　５７．１４４　　　＋／−７，２４
２−９２０，００１１０４２４，４０６＋／−９８，６
５８−４１０，０５１５９５，５７８＋／−１０９，２
０９−１９ｎｓｏ　　　　　　　７３６．５６７　　　
＋／−１９，０２６Ｌ４／ＫＳ １００μｇ／ｍＱ　　６９８，８２３　　　＋／−８１
，６２５−８ｎ５１０　　　　　６５６．２８６　　　
＋／−４３，９６９−１３ｎｓｌ　　　　　　　７０９
．９２８　　　＋／−１，２，１２７１−６ｎｓｏ　　
　　　　　７５８、２７１　　　＋／−１８，９３１硫
酸プレオマインン １００μｇ／ｍ（１８９，９０６＋／−１３，６８５−
８６０，０１０６４８，３２７＋／−１０９，０１７１
）Ｔ２２２扁平上皮癌標的細胞に取り込まれた３Ｈ。
イシンのカウント７分（ＣＰＭ）を示している。本検定
にでは試料の数が多かったので１つ以上の組織培養プレ
ートを使用した。従って、各試験試薬は、ネガティブコ
ントロールウェル自身の組との比較で、阻害率を計算し
た。Ｐ値はスチュウデントのＴ検定で算定した。プレオ
マイシンは、本検定におけるポジティブコントロールと
して使用した。
第３表には、インビトロ腫瘍細胞増殖を阻害するＬ／　
Ｉ　Ｃ２抗体およびＬ４−／ＫＳの能力の比較が示され
ている。詳細には、第３表は、Ｌ／１Ｃ２抗体か１０μ
ｇ／ｍＱという低い濃度において、Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗原
陽性腫瘍セルライン、Ｔ２２２の増殖を膏意に阻害する
ことができることを示している。ＫＳＩ／４抗原（ヴア
ーク（Ｖａｒｋｉ）ら、ノＪンサー・リサーチ４４：６
８１（１９８４））と結合するＬ４／ＫＳ抗体［スター
リング（Ｓｔａｒｌ　ｉｎｇ）らのＪ、Ｃｅ１１　Ｂ　
ｉｏｃｈｅｍ、　、補稿１１Ｂ：１９２（１９８７）］
　もまた、Ｔ２２２腫瘍セルライン上に発現される。Ｌ
　４／ＫＳ抗体は、Ｌ／　ｌ　Ｃ２抗体とは対照的にＴ
２２２細胞の増殖を阻害するのに有効でなかった。
非修飾Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗体の腫瘍細胞増殖阻害における
新規な能力を理解するために実験を行い、補体結合およ
び抗原内在化の貢献度を決定した。５６°Ｃで３０分間
加熱し、補体活性を熱不活化した血清を使用し、実施例
９で教示している検定を行った。この試験結果は、補体
結合か非修飾抗体で認められる細胞毒性レベルの原因で
はないことを示している。このデータは、Ｌ４／ＫＳが
、補体結合か極めて巧みであることで知られている抗体
サブクラスであるＩｇＧ　２ａアイソタイプであるとい
う点で第３表のデータと矛盾がない。
抗原陽性の腫瘍セルラインと結合するＬ／１Ｃ２抗体の
動向を評価するため、実施例１０および１１に記載の検
定を行った。実施例１０は、Ｌ／１Ｃ２抗体が細胞表面
のＬ／１Ｃ２抗原と結合した後の内在化の動態を評価す
るために、Ｌ／Ｉｃ２抗原と反応するフルオレセイン標
識化抗体を使用することを教示するものである。第３図
は、抗体内在化をモニターするこの方法の実験結果を描
いたものである。この第３図で留意すべきことは、０分
時（パネルＡ）においては明るいリング状蛍光の膜局所
の特徴が明らかであった点である。これに対し、３７°
Ｃのインキュベート１０５分後（パネルＢ）では、明る
い蛍光のフサ（ｃｌｕｓｔｅｒｓ）が細胞の周辺で認め
られる一方で、リング状蛍光は減少していた。最後に、
１３５分時（パネルＣ）では、明るいリング状蛍光はも
はや存在しなかったが、細胞内蛍光が現れてきた。この
細胞内の染色は、Ｌ／１Ｃ２抗体が、Ｌ／１Ｃ２抗原と
の結合の結果として内在化されることを示唆するもので
ある。
実施例１１に記載の検定結果は、１２５Ｉ標識化Ｌ／１
Ｃ２抗体か内在化されていることを示唆していた。蛍光
発光化した第２の試薬（抗−マウス免疫グロブリン）に
よる、細胞表面に結合したＬ／１Ｃ２抗体の架橋が内在
化の誘発に関与しているかもしれいない役割を減じるた
めに放射性標識化抗体を使用し、実施例１０の蛍光法に
よって得られた内在化データを確認した。この検定の結
果を以下の第４表に示す。第４表のデータは明らかに、
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２がＬ／１Ｃ２抗原との結合時に内在化さ
れることを示している。
第４表 ２５１−Ｌ／１Ｃ２抗体を使用したＬ／１Ｃ２抗体内在
化の評価０°Ｃ３７°Ｃ ２５Ｉ−１／１Ｃ２の総ｃｐｍ”　５６，７７０　＋／
−３，０６９５６，７４６＋／−１，７３４非−解離の
カウント”　　Ｉｆ、３９８　＋／−８５９５，５１４
＋／−６４１）”’［−１−／１Ｃ２の総ｃｐｍは、細
胞表面および内在化”５１−Ｌ／１Ｃ２の両者を包含し
ているであろうすへての細胞関連放射活性の測定値であ
る。
２）非解離のカウントは、内在化され、従って抗原−抗
体結合を崩壊させることで知られている低いｐＨのグリ
ノン緩衝液による解離を受けていない＋２５１　　Ｌ／
　Ｉ　Ｃ２の測定値である。
Ｌ／１Ｃ２抗体が細胞増殖を阻害する機序（メカニズム
）は不確定のままであるが、Ｌ／１Ｃ２抗原が増殖因子
レセプターである可能性か考えられる。抗−上皮性増殖
因子レセプタ−（ＥＧＦ）抗体を使用した、内在化およ
び細胞増殖阻害に関する同様のデータが既に報告されて
いるが［モスイ（〜Ｉｏｓｕｉ）らのカンサー・リサー
チ４６．５５９２（１９ｇ６）］、競合結合試験および
セルライン分布の分析はＥＧＦレセプターに結合するＬ
／　Ｉ　Ｃ２抗体を考慮に入れていなかった。
腫瘍細胞抗原への結合時に内在化する抗体の重要性は、
当業者ならば理解するものである。免疫コンジュゲート
体（抗体−細胞毒）の効能は、大部分か腫瘍細胞への標
的能力に依存しており、次に、細胞毒性物質が腫瘍細胞
を死滅するように毒素形態で細胞毒性物質を供与または
腫瘍部位に放出する能力に依存している。腫瘍細胞への
結合時に抗体が内在化すれば、細胞毒性物質は細胞内供
給される。従って、このような細胞毒性物質の細胞内供
給は細胞毒性物質にとっての好ましいデリバリ−システ
ムであり得る。
種々の細胞毒を抗体に結合させることに成功している。
フレア（Ｂｌａｉｒ）らのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　５９、　＋２９（１９８３）およびガー
セ（Ｇｈａｓｅ）らのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　９３２８０（１９８３）は、細胞毒を抗
体に結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）させる方法を開示している
。本発明の好ましいモノクローナル抗体−Ｊｕｌコンジ
ュゲート体（免疫コンシュケート体）には、酸化し／ｌ
Ｇ２抗体をビンカアルカロイドのヒドラジン誘導体と反
応させて調製されるものがある。これらの強力な抗癌性
免疫コンジュゲート体は、欧州特許公開筒２４７，７９
２号（１９８７年１２月２日公開）に実質的に従えば調
製することができる。この欧州特許公開筒２４７，７９
２号は、Ｌ／１Ｃ２抗体を含有しない免疫コンジュゲー
ト体の構築を教示している。本発明の実施例１３には、
ビンカヒドラジドをＬ／　Ｉ　Ｃ２抗体に結合させる操
作法を開示している。ビンカ中間体、コンジュゲート方
法、および本発明の好ましい治療態様として本明細書中
で使用するＬ／１Ｃ２−４−デスアセチル−ビンブラス
チン−３−カルボキンヒドラジド以外の免疫コンシュケ
ート調製物の議論に関する考察を十分に行うためには、
欧州特許公開筒２４７，７９２号を参照する必要がある
。
Ｌ／１Ｃ２−４−デスアセチルビンブラスチン３−カル
ボキシヒドラジド（Ｌ／１Ｃ２−ＤＡＶ　Ｌ　１３　Ｈ
Ｙ　Ｄ　）またハｉｆｆ離の４−デアセチルビンブラス
チン−３−カルボキンヒトランド（ＤＡＶＬＢＨＹＤ）
または希釈剤として使用するＰＢＳを、実施例１２に記
載するマウス冗種移植モデルとしてのヌードマウスに静
脈投与した。マウスをＬ／１ｃ２−ＤＡＶＬＢＨＹＤ、
ＤＡＶＬＢＨＹＤ、またはＰＢＳのいずれかで、腫瘍移
植後１１．１５．１７．２２．２５、および２９日目に
処理し、第４図に示したデータを得た。
第４図のデータは、Ｄ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｂ　ＨＹ　Ｄの治
療効果を増幅するＬ／　Ｉ　Ｃ２の能力を示している。
Ｌ／　Ｉ　Ｃ２−Ｄ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｂ　ＨＹ　Ｄフンシ
ュゲート体を使用した実験によって第４図におけるデー
タを得た。Ｌ／１Ｃ２−ＤＡＶＬＢ免疫コンジュゲート
体は、平均フンシュケート比率５．７　：　１（ＤＡＶ
ＬＢＨＹＤ　：　Ｌ／１Ｃ２）と測定された。以下に記
載する投与量は個々の処理におけるＤＡＶＬＢＨＹＤｆ
ｆｉを意味する。ＤＡＶＬＢをＬ／　Ｉ　Ｃ２Ｄ　Ａ　
Ｖ　Ｌ　Ｂ　Ｉ（Ｙ　Ｄ免疫コンツユケート体くパネル
Ａ）として投与した場合、］、Ｏｘｇ／ｋｇおよび０゜
５肩ｇ／ｋｇＤＡＶＬＢＨＹＤの投与１て腫瘍が退縮し
た（パネルＡ）が、他方、遊離Ｄ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｂ　Ｈ
ＹＤを同じ投与量で投与しても、治療中に腫瘍の増殖を
遅延させただけであった（パネルＣ）。第４図の上のパ
ネルでは、Ｌ／１Ｃ）２−ＤＡＶＬＢＩＩ　Ｙ　Ｄ免疫
コンジュゲート体の能力として、Ｔ２２２癌腫をｌ　Ｏ
肩ｇ　／　ｋｇのビンカ…て撲滅できることか示されて
いる。＋Ｈ対的な効能の比較によって、試験中の１．Ｏ
ｓｇ／ｋｇおよび０．５屑ｇ　／　ｋｇの両レベルてＬ
　／　Ｉ　Ｃ２−Ｄ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｂ　Ｉ−（Ｙ　Ｄが
遊離Ｄ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｂ　ＨＹ　Ｄよりも優れているこ
とか分かる。
パネルＢは、Ｔ２２２細胞と結合しない抗体とのＤ　Ａ
　Ｖ　Ｌ　Ｂ　ＨＹ　Ｄのフンシュゲート体がＴ２２２
細胞の増殖を遅延させる効能がないことを示すデータで
ある。Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗原反応性のＬ／１ｃ２Ｄ　Ａ　
Ｖ　Ｌ　Ｂ　ＨＹ　Ｄなどの免疫フンシュゲート体は、
同じ投与量レベルの遊離薬物またはＬ／１Ｃ２抗原と反
応しない免疫コンシュケート体よりもＴ　２２２腫瘍セ
ルラインを抑制するのにより有効である。上述のデータ
は、Ｌ／＋Ｃ２抗原−結合性免疫フンシュゲート体の治
療的役割を物語るものである。
さらなる研究によって、他の細胞毒性化合物をＬ／１Ｃ
２抗原陽性腫瘍細胞に供給するためのビヒクル（運搬体
）としてのＬ／１Ｃ２抗体が確立された。実施例１３に
記載しているヒドラジド連結、およびＬ／１Ｃ２抗体と
メトトレキセート間における加水分解できるブリッジを
形成するための連結基（リンカ−）の使用によってメト
トレキセートがＬ／　Ｉ　Ｃ２に結合されている免疫コ
ンジュゲート体を構築した。メトトレキセートをメトト
レキセート＝γ−ヒトランドに誘導体化する方法は、実
施例１４のＡ項に記載する。実施例１３の教示に実質的
に従って、メトトレ手セードーγ−ヒドラジドを酸化Ｌ
／１Ｃ２抗体にコンジュゲートした。実施例１３の４−
デスアセチルビンブラスチン−３−カルボキシヒドラジ
ドをメトトレキセート−γ−ヒドラジドと置き換えるこ
とによって、治療適用に有用なＬ／］Ｃ２−メトトレキ
セート免疫コンジュゲート体を得た。これらの免疫コン
ジュゲート体を、実施例Ｉ２に詳細に記載したヌードマ
ウス異種移植モデルを用いて抗−腫瘍活性に関しインビ
ボ評価した。この試験では、マウスを、腫瘍移植後３．
６、および９日目にＬ／］Ｃ２メトトレキセート−γ−
ヒドラ／ド、メトトレキセート、または希釈剤のいずれ
かで処置した。データを以下の第５表に示すが、これは
希釈剤単独で処置した動物で観察された腫瘍の増殖に対
する腫瘍阻害％として表している。
！旦ｋ ＪＩＷメトトレキセートと比較したＬ／１ｃ２−メトト
レキセート＝７−ヒドラジンのインビトロ活性Ｌ／１ｃ
２−メトトレキセート６　ｒａｇ／　ｋ！？γ−ハイブ
リッド　　　　　３ｍｇ／に９１．５＋９／＆９ 遊離メトトレキセート　　　　６ｍｇ／ｋｇ３　ｍｇ／
　ｋｇ １　、５　ｍ９７に９ 第５表の結果は、メトトレキセートをＬ／１Ｃ２抗原反
応免疫コンシュケート体として腫瘍部位を標的とさせた
場合にメトトレキセートの効能が増大することを示すも
のである。二重波長ＵＶ分析（２８０および３７０ｎｍ
）によってこの免疫コンジュゲート体を測定するとＬ／
１Ｃ２抗体１モルに対するメトトレキセートのコンシュ
ケート比率は５．１・１モルであった。
さらに、この実験は、加水分解可能な連結基を介してＬ
／１Ｃ２抗体またはそのＦ（ａｂ’）ｔフラグメントに
共有結合した細胞毒性物質を供給するための、Ｌ／１Ｃ
２抗体およびその抗原結合性フラグメントの有用性を物
語るものである。実施例１４から実施例１７には、これ
ら免疫フンシュゲート体の調製法および評価法を開示し
ている。
上述のデータは、各種の連結手法によって細胞毒をコン
ジ−ケートした場合、Ｌ／１Ｃ２抗体またはその抗原結
合性フラグメントの治療上の有用性を証明するものであ
る。当業者は、Ｌ／１Ｃ２抗原への結合性が本発明抗体
の一般的な特徴であり、ＡＴＣＣＢ９６８２から産生さ
れる抗体以外の本発明に係る抗体も細胞毒性物質をして
Ｌ／］Ｃ２抗原陽性腫瘍を標的とさせるよう機能し得る
ことを理解するものである。本発明のＬ／１Ｃ２抗原結
合性抗体の親和性は当然に変化すると考えられ、一般に
、本抗体の親和性が高くなる程、より効率的に、その抗
体は細胞毒性物質をインビボにおいて腫瘍の標的とさせ
る。本発明抗体の治療上の有用性の理解を助けるために
のみ、Ｌ／１Ｃ２抗原反応性抗体、Ｌ／１Ｃ２抗体と、
ビンカアルカロイドの誘導体、およびメトトレキセート
とを含有する免疫コンジュゲート体を作成した。
本発明抗体の治療上用途は、本発明を説明するのに使用
した上記の細胞毒性物質になんら限定されるものではな
い。本発明の治療上適用にとって有用であり得るその他
の細胞毒性物質には、例えばアドリアマイシン、リチン
（ｒｉｃｉｎ）、リチンＡ鎖、ジフテリア毒、シュード
モナス外毒素、ス／ルベノール（ｓｃｉｒｐｅｎｏｌ）
、シアセトキシスシルペノール、アルファアマニチン、
マイトマイシンＣ１アブリン、ゲロニン、アメリカヤマ
ゴボウ抗−ウイルスタンバク質、５−フルオロウラノル
などかある。各種の他の連結手法、例えば米国特許第４
゜６７１，９５８ＭおよびＥＰＯ公開番号２４３，９２
９なども、本発明の抗体に細胞毒性物質を結合させるの
に利用することかできる。
さらに、本発明は、インビボにおける腫瘍イメージング
（画像）のために本発明のＬ／　Ｉ　Ｃ２抗原結合性モ
ノクローナル抗体を使用することを目的とするものであ
る。本発明の抗体を放射活性標識するのに使用できる同
位体としては、インジウム、鉛、レニウム、チク不シウ
ム、ヨウ素、ガリウム、ルテチウム（Ｉｅｕｔｅｃｉｕ
ｍ）、アスタチン、ビスマス、ホウ素、白金、銀、コバ
ルト、イッテルビウム、ルテニウム、水銀、スカンジウ
ム、臭素、リン、およびイツトリウムなとの元素の同位
体を挙げることができる。
腫瘍イメージングのための上記のような放射性同位元素
は、本発明のＬ／１Ｃ２抗原結合性抗体に結合させた場
合、治療に適用するよう使用することができる。従って
、本発明は、Ｌ／１Ｃ２抗原結合性抗体−放射性同位元
素免疫コンジュゲート体からなる治療剤の用途も目的と
するものである。
実施例 本発明の理解を助けるため、以下に実施例を挙げるが、
これらは限定的なものではない。
実施例Ｉ Ｌ／　Ｉ　Ｃ２ハイブリドーマセルラインの構築Ａ、亀
稟 モノクローナル抗体を生産するための方法はコーラ−お
よびミルスタイン［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　ＭｉｌｓＬ
ｅｉｎ、不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６：４９５
（１９７５）］　ｌこよって導入され、現在では当業界
で十分に確立されている。これより後のガフルレ（Ｇａ
ｒｌｒｅ）およびミルスタイン［メソソズ・イン・エン
ザイモロシー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、７３巻、ランガンおよびパン・ブナキス（Ｌ
ａｎｇｏｎ　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋ１８）５．３
−４６頁（アカデミツク・プレス）、ニューヨーク、　
１９８１］による発表では、その最初の方法の改良か要
約されており、モノクローナル抗体を生産するために必
要な装置および試薬、ならびにその工程が詳細に記載さ
れている。免疫原の選択はセルライン、腫瘍サンプル、
またはＬ／１Ｃ２抗原を含有するそれらのあらゆる成分
によってのみ限定を受ける。
フェルンステインら［Ｆｅｒｎｓｔｅｉｎ、カンサー・
リサーチ、　４６：２９７０−２９７７（１９８６）］
に記載されている扁平上皮起源、ＵＳＣＬＳ−１のセル
ラインを組織培養物中で繁殖させ、これをＬ／１Ｃ２抗
原の（供給源として１吏用した。このＵＳＣＬＳ−１セ
ルラインは例示であり、Ｌ／１Ｃ２抗原を発現するあら
ゆるセルラインを使用することができる（第１表参照）
。若い成熟Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに週単位で５ＸＩ
Ｏ８個のＵＳＣＬＳ−１細胞を４週間腹腔内注射で投与
した。４回目の注射の後２１日経過した時に、５ＸＩＯ
’個のＵＳＣＬＳ−１細胞で再度免疫した。マウスはこ
の方法にとっての例示であり、当業者は免疫細胞の供給
源として使用される種は限定されないことを理解するも
のである。ヒト、ラットおよびハムスターなどのその他
の種が有用であることが知られており、理論上、ウサギ
、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびサルなどのあ
らゆる種を使用することができるであろう。Ｌ／　Ｉ　
Ｃ２抗原の免疫原供給源として使用したＵＳＣＬＳ−１
細胞は、トリプシンＥＤＴＡ処理によって組織培養物下
層から回収した［グランド・アイスランド・バイオロジ
カル・カンパニー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、　３１７
５スタレー・ロート、グランド・アイスランド、ニュー
ヨーク、　１４（１７２］。
Ｂ、肺細胞の調装 最後の免疫の後５日後に、免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウス
を頚部脱臼させ、エタノール中で洗浄した。肺臓を無菌
下で採取し、肺細胞調製用に小さい無菌皿に置いた。肺
臓を細かく切断分離し、肺細胞を水冷ダルヘッコス改変
イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉａ）［ＤＭＥ−ギブフコ中に
遊離させた。ピペット処理によって細胞を凝集塊から解
離させ、遠心管に移し、その管を水中に５分間放置した
。沈降した物質を廃棄し、得られた細胞懸濁液を別の管
に移した。２００ｇで５７分間遠心して肺細胞をベレッ
ト化した。得られた細胞ペレットを水冷０．１７Ｍ塩化
アンモニラム５ｆｆ１２中に懸濁させ、氷上に１０分分
装いて赤血球の崩壊を促進させた。水冷ＤＭＥ５ｉＱを
加え、次いで得られた混合物を２００９で５−７分間遠
心した。上清液を吸引し、赤血球を枯渇させた肺細胞ベ
レットを洗浄し、ＤＭＥｌｏｌｌＱに再懸濁した。
Ｃ８骨髄腫（ミエローマ）細胞の調製 ＵＳＣＬＳ−１反応性牌細胞反応性石細胞調製物として
使用するために、ＨＬ−ＩＴ）！フレンドリ−ミエロー
マ−６５３細胞［ベントレックス・ラボラトリーズ（Ｖ
ｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　Ｐ、　
０．ボックス９７０１．ボートランド、マイン０４０１
３コを選択した。これらの細胞はベントレックスから得
、それを附則の教示に従って維持させた。融合の２日前
に、ミエローマ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに移
し、ハイブリドーマ形成を完全に行うために重要な対数
期増殖を保障した。
ＨＬ　　１７Ｍフレンドリ−６５３細胞は細胞融合にと
って好ましいミエローマであるが、本発明の目的として
は、通常のマウス誘導化確立ミエローマセルライン、例
えばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　　（Ｐ２Ｏ３）　、
ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ−２）　、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−６．５．３　（Ｘ６’３゜６．５．３）　、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８　（Ｘ６３）、Ｐ３−ＮＳ−１−
Ａｇ４　（ＮＳ−１）、ＭＰＣＩ＋　−４５，６ＴＧ　
［，７（ＭＰＣ−１］）　、およびｓ　１９４１５ＸＸ
Ｏ，ＢＵ　ｌ　（Ｓ　１９４）［ガフルレ（Ｇａｆｌｒ
ｅ）およびミルスタインのメソッズ・イン・エンザイモ
ロジー、７３Ｂ巻、ランガンおよびパン・ブナキスｍ（
１９８１）を参照］をも使用することができる。
Ｄ、細胞融合 ２００ｇで５分間４°Ｃで遠心して肝細胞およびミエロ
ーマ細胞を洗浄し、次いで上清液を吸引し、ＤＭＥ中に
細胞を再懸濁した。ＤＭＥ洗浄を３工程行った後、細胞
数を数え、同時にトリパンブルー排出によって生存性を
評価した。本明細書中、細胞数とは生存細胞のみを意味
する（トリパンブルーで染色されない細胞）。１．５Ｘ
１０’個のミエローマ細胞を５０ｃｃ遠心管中の３．０
ＸＩＯ’個の肺細胞に加えた。細胞を２００９で５分間
４°Ｃて遠心し、ペレット中からの細胞の損失を可能な
限りなくして上清を完全に吸引した。次いで、管を穏や
かにたたき（タッピング）して、得られた細胞ペレット
をばらばらにした。３７°Ｃの融合化培地（以下の組成
を有する）１．５ｍ（を加え、内容物を穏やかに撹拌し
、管を３０秒間静置した。
次いで、３７°Ｃに暖めておいたＤＭＥを穏やかな撹拌
下に滴加し、ゆっくりと内容物の容量を２０ｍＱにした
。３７°ＣのＤＭＥをさらに３０婬追加した。混合物の
希釈中は、細胞凝集体が壊れないように注意しなければ
ならない。この融合物を２００ｙ、５分間の遠心にかけ
、２０％０％ラン血清（ギブコ）およびＩＸ　ＨＡＴを
加えたＨＬ−１７”培養培地（ベントレックス）　６０
　ｍＱ　中ニ穏やかに再懸濁した。
ＨＡＴは、牌細胞／ミエローマ雉種細胞を選択するのに
使用されるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチ
ミジンの混合物である。ＨＡＴおよびＰＥＧ４００　（
融合化培地（ｆｕｓｉｎｇ　ｍｅｄｉａ））の組成は、
以下の通りである： ＨＡＴ　（ｔｏｏｘ） Ａｍｔ、　／２５ｍ（２ ヒボキサンチン（１０００μＭ）　　　　３４　ｍｇア
ミノプテリン（１００μＭ）　　　　　１１ｍｇチミジ
ン（３００μＭ）　　　　　　　　１８．２５＃ｇ、ｌ
用に、ＩＮ水酸化ナトリウム１〜５滴中に別々に溶解し
、−緒にして混合し、管を洗浄し、ＤＭＥ２５ｉ（２に
した。ＨＡＴは、使用時に培養培地でｌｏｌｏｏに希釈
する。ＨＡＴはまた、ギブコから市販されている。
融合化培地は、次のようにして調製することができる：
１００ｆｆ（容器中でＰ　ＥＣ；４０００　［Ｊ、Ｔ。
ペイカー・ケミカル・Ｃｏ、　２２２レツド・スクール
・レーン、フィリップスバーク、ニューシャーシー０８
８６５］をオートクレーブ処理する。１５％ＤＭＳＯを
含有する滅菌タルベッコスＰＢＳ　（ギブコ）２８村を
加え、混合して４°Ｃで保存する。
Ｅ　供給細胞の調製 １８ゲージ針を使用して水冷ＤＭＥＩＯＪ！ｇをＢ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの腹膜腔に注射した。腹膜腔を掻き
回し、腹膜洗液を取り出した。腹膜細胞を水冷した遠心
管に入れ、２５０ｇで５分間遠心した。上清液を吸引し
た後、得られた細胞を水冷ＨＬ−１培地（ベントレック
ス）２＋１１Ｃ中に懸濁し、氷上に置いた。
Ｆ、ハイブリドーマの組織培養 供給細胞（腹膜洗浄細胞）を細胞融合混合物と一緒にし
、混合した。９６ウ工ル組織培養プレートにウェル１個
当たり細胞混合物２滴を加えた。
細胞融合産物の維持には、３７°Ｃの加湿インキュベー
ター（５％ＣＯ７雰囲気）を使用した。２０％ウシ胎仔
血清（ギプコ）および１．ＸＨＡＴを加えたＨＬ−１（
ベントレックス）を使用して全ウェルの容量を２００μ
Ｑに増加した。
Ｇ、抗原特異的ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレート中でクローンか肉眼で見えるように
なった時に、５０μＱ部分量を取り出し、抗原の特異性
に関して評価した。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）［
モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）らのサージエリ−（Ｓｕｒｇ
ｅｒｙ）６４（１）　：２３３−２４０（１９６ｇ）］
によって、］ＵＳＣ１，Ｓ−１Ｌ／　Ｉ　Ｃ２陽性標的
物、およびＭ２］、Ｌ／１Ｃ２陰性の黒色腫（メラノー
マ）誘導化セルラインに対する上清液の結合性を測定し
た。この詳細は以下に示す。他のＬ／１Ｃ２陽性または
陰性標的物を使用することもでき、それらは第１表に記
載している。
３７°Ｃにおける１５分間のＣＰＥＧ　（１３６ｍＭ　
ＮａＣＱ、２．７ｍＭ　ＫＣＱ、８ｍＭ　Ｎａ＝ＨＰＯ
，。
１．５ｍＭＫＨ２Ｐ○４．０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５６
ｍＭ　グルコース、ｐＨ７，３）処理、およびＰＢＳ（
ギブコ）洗浄によって、組織培養物の下層からＵＳＣＬ
Ｓ−１およびＭ２１セルラインを採取した。１．５ＸＩ
ｏ５個の細胞を、以下のようにポリーＬ−リジン（ｌｙ
ｓｉｎｅ）で被覆した可撓性９６ウエルプレートに分散
させた。ＰＢＳ中で調製したｌａｇ／ｚ＆ポリ−Ｌ−リ
ジン臭化水素塩（７グマ・ケミカル・カンパニー、　Ｐ
、　Ｏ，ボックス１４５０ｇセントルイス、ミズーリー
、６３１７１１１）　５０μｇを、プレート中の各ウェ
ルにピペットで加えた。次いで、このプレートを室温で
少な（とも４５分間インキュベートした。しかし、これ
は４°Ｃて１呆存してもよい。細胞を加える前に、プレ
ートをＰＢＳで２回洗浄しておいた。結合性を保持して
いない細胞をＰＢＳで洗い流した；保持細胞はＰＢＳ中
、０゜１％グルタルアルデヒドで固定化した。反応しな
かったグルタルアルデヒドを０．１％グリシンで阻害し
、１０％ウシ胎仔血清および０．０５％のＮａＮ３を含
有するリン酸緩衝化食塩水を用いてプレートを洗浄し、
その中で保存した。リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）はＯ
，ｌ　５Ｍ　ＮａＣＱを含有する０、０１Ｍ　　リン酸
ナトリウムである。
ハイブリドーマ上清を被検セルラインと共に室温（約２
２°Ｃ）で１時間インキュベートすることで、ＲＩＡを
行った。大量の洗浄によって非結合抗体を除去し、ヘル
ツエンバーブら（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇａｎｄ　Ｈｅｒ
ｚｅｎｂｅｒｇ）の実験免疫学の手引書［”Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　１ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ”、　１９７８．　Ｄ、　Ｍ、　Ｗｅｉｒ編
、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オノクスフォード］に記載された
クロラミンＴ法によって（票識した１００．ＯＯＯｃｐ
ｍの１２５Ｊ−ウサギ抗マウスＴｇＧを加え、室温でさ
らに１時間インキュベートした。ＰＢＳでウェルを洗浄
し、各ウェルに保持された放射活性量をオートラジオグ
ラフィーおよびガンマ−カウンターで測定した。オート
ラジオグラフィー分析では、９６ウエルプレートをＸ−
線フィルム上に置き、フィルムを暴露するのに十分な放
射活性を含むウェルの番号を記録した。オートラジオグ
ラフィーにおける暴露時間は６時間から一晩と種々であ
った。ＵＳＣＬＳＩとは反応するが、Ｍ２１とは反応し
ない抗体を産生ずるハイブリドーマクローンが目的のも
のであると考えられ、これらをさらに分析にかけた。
Ｌ／１Ｃ２ハイブリドーマセルライン、ＡＴＣＣ♯Ｂ９
８６２はＵＳＣＬＳ−１と反応し、Ｍ２１とは反応しな
かった。Ｌ／１．Ｃ２ハイブリドーマセルラインのモノ
クローナル化を確実にするため、コウルターＲ（Ｃｏｕ
ｌｔｅｒＲ）　［コウルター・エレクトロニクス、　　
Ｈ１ａｌｅｈ、　Ｆ　Ｌ　］］オートクロナーａｕｔｏ
ｃｌｏｎｅｒ）を使用して取り扱い書に従ってＬ／１Ｃ
２を２回サブクローンした。
Ｌ／１Ｃ２は本発明のセルラインを例示するハイブリド
ーマである。このハイブリドーマから産生されるＬ／１
Ｃ２抗体を、腫瘍セルラインのパネルに対する反応性に
関して評価した。間接免疫蛍光検定法をスクリーニング
に使用した。検定用混合物は、新規なＬ／　Ｉ　Ｃ２腫
瘍関連抗原の存在について評価を行う標的セルライン、
ハイブリドーマ上清（Ｌ／　Ｉ　Ｃ２反応性抗体の供給
源）、およびフルオレセイン標識され、かつマウス免疫
グロブリンに特異的な第２の抗体試薬から構成される。
使用に適当な第２の抗体試薬は、ジャクリン・イムノリ
サーチ・ラボラトリーズ［Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎ
ｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ
ｎｃ、　、　Ｐ、　Ｏ，ボックス６８３Ｉアバンダール
、ペンシルバニア１９３１１］　、およびメイルス・リ
サーチ・プロダクッメイルス・ラボラトリーズ［Ｍｉｌ
ｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍｉｌｅ
ｓ　Ｒａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　１１２１
　　ミルトル、ボックス２０００．エルクハート、イン
デイアナ４６５１５］などの多くの提供元から人手でき
る。
当業界で十分に確立されている条件下で、標的セルライ
ンを組織培養物中で増殖させた。検定の前に、トリプシ
ン／ＥＤＴＡ　（ギプコ）によって下層から細胞を取り
出した。遠心およびＤＭＥの再懸濁によって５×１０°
個の細胞を洗浄し、１２×７５η管中で、４８Ｃ，１時
間ハイプリドーマ上清と反応させた。細胞を、ラン血清
血清を通過させて下層まで遠心し、細胞から非反応抗体
を洗浄分離した。ヤギＦ（ａｂ’）２抗−マウス（Ｉｇ
Ｇ＋ＩｇＭ）Ｆ　Ｉ　ＴＣ，（フルオレセインイソチオ
シアネート）、コンジュゲート体（タボ・ラボラトリ−
（Ｔａｇｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンガ
ム、ＣＡ　９４０１０から入手）の第２の試薬中に、標
的細胞を再懸濁し、最終希釈率１：５０で使用した。被
検物質を４°Ｃて１時間維持させた。標的細胞を、ウシ
血清血清を通過させて下層まで遠心し、非結合第２試薬
と分割した。この血清を吸引し、得られた細胞をハンク
ス平衡塩類溶液（）ＩＢＳＳ）［キブコ由来７を使用し
て洗浄した。この細胞を再びＨＢ　Ｓ　Ｓで洗浄し、組
織培養培地中で再懸濁し、ＵＶ蛍光顕微鏡検査法によっ
て調査するため４°Ｃに維持した。
細胞の部分標本をヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉ
ｕｍｉｏｄｉｄｅ）　（ＨＢ　Ｓ　Ｓ中、１０μｇ／ｉ
ので対比染色し、抗体付着細胞が生存していることを確
認した（ヨウ化プロピジウムは死亡した細胞を選択的に
染色する）。標準的な表面リング状蛍光を示す生存細胞
はＬ／　Ｉ　Ｃ２抗原に対して陽性と考えられる。
さらに、当業界で確立された方法によって、Ｅｐｉｃｓ
−ＣｏｕｌｔｅｒＩｌＭａｒｋ　Ｉ　ＶＲ細胞分析器（
コウルター・エレクトロニクス）を用い、蛍光について
試料を評価した。腫瘍反応性クローンについての代替の
スクリーニング法は、ガフルレ（ＧａｆＩｒｅ）および
ミルスタインのメソッズ・イン・エンザイモロシー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、７３巻
１ランガンおよびパン・ブナキス（Ｌａｎｇｏｎ　ａｎ
ｄ　Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋ１８）１４、３−４６頁（アカ
デミツク・プレス）、ニューヨーク。
１９８１に詳細に記載されている。
■１本発明の抗体によるヒト病理検体の評価アビジン−
ビオチン法の改良法を利用したイムノペルオキシターゼ
手法によって、組織および腫瘍抗原の分布を評価した。
ヒト組織の凍結切片標本ヲセラチン被覆スライドガラス
上に４−６μｍで切断し、風乾し、５分間アセトン中に
固定化した。５％ウマ血清とブレインキュベートした後
、切片をＬ／ｌＧ２抗体と共に続いてインキュベートシ
、次いでビオチニル化つマ抗−マウスＩｇ［ベクターラ
ボス（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）、バーリンガム、　ＣＡ
］、およびアビジンとホースラディノシ斗ベルオキシタ
ーセとの複合体と共にインキュベートし、両工程の間に
、１％ウン血清アルブミンを含有したリン酸緩衝化食塩
水（ｐＨ７，２〜７，４）で洗浄した。すべての成分の
至適希釈度は、当業界で普通の「チエッカ−ホード（ｃ
ｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ）Ｊ測定によって経験的に決定
した。３，３°−アミノベンジジンを使用して発色させ
、切片標本をヘマトキシリンで対比染色した。得られた
結果を第２表に示す。
５ミクロン濾過（ミリボア（Ｍｉ　ｌ１ｉｐｏｒｅ））
の後、プロティンＡセフ１０−ス力ラム［ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｄｉｖ１８ｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、ｇｏｏセンテニアル・ア
ベニュー、ビスカッタウェイ　二ニー・シャーシー０８
８５４）］にかけ、抗体を腹水液からアフィニティー精
製した。洗浄緩衝液は、０．ＯＩＭ！Ｊン酸ナトリウム
（ｐ　Ｈ８，０）であり、０．１Ｍ　　リン酸ナトリウ
ム緩衝１ｆ（ｐＨ３，５）の段階勾配によって溶出を行
った。溶出されたフラクションを素早＜ＩＭ）リッマ緩
衝液（Ｔｒｉｚｍａ　ｂｕｆｆｅｒ、ジグ７）（Ｔ）８
７．４）で中和し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１２（ＰＢＳ）
を加えた０、０１Ｍ　　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，４
）に対して透析した。抗体調製物を０．２２ミクロンフ
ィルター（ミリポア・コーポレイション、アシュビー・
ロード、ベツドフォード、マサチ一−セノン０１７３０
）に通して滅菌し、使用するまで４°Ｃで保存した。
Ｋ、Ｌ／１Ｃ２抗体の生産 プリスタン−プライム（ｐｒ１８ｔｏｎｅ−ｐｒｉｍｅ
ｄ）　したＢＡＬＢ／Ｃマウス中、腹水としてＬ／　Ｉ
　Ｃ２ハイブリドーマを十分に増殖させ、５５−６ｒｉ
／ｍ（１で抗体を産生させた。プロティンＡクロマトグ
ラフィーを用いてＬ／１Ｃ２を精製し、収率７〇−９０
％で得、これを、レムリ［Ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチャー
（ロンドン）２２７：６８０（１９７０）］　に従って
ＳＤＳＰＡＧＥおよびコオマッシーブルー染色で評価す
ると９０％以上の純度であった（第１Ａ図）。精製した
Ｌ／　ｌ　Ｃ２抗体は、沈澱による損失もなく、濃度１
０ｘｇ／ｘＱ以上になることのできる、ＰＢＳにおける
優れた溶解性を示した。
実施例２ Ｌ／１Ｃ２抗原特性化 Ｌ／　Ｉ　Ｃ２抗体によって免疫沈降された抗原の特性
化を、放射線標識化５６３７　ｆｍ胞（ＡＴＣＣ＃）（
ＴＢ９）を使用して行った。セルライン、５６３７はＬ
／　Ｉ　Ｃ２抗原陽性癌を例示するものであり、第１表
に記載のＬ／　ｌ　Ｃ２陽性セルラインのいずれをも使
用することができるであろう。
この細胞を組織培養中で５０−７５％果密まて増殖させ
、接触細胞を滅菌したリン酸緩衝化食塩水（Ｐ　Ｂ　５
）（ｐ　Ｈ７，４、ギブコ）で２回洗浄した。
１！１ｃｉの３Ｈ−グルコサミン［ニュー・イングラン
ド・ヌクレアー、５４９アルバニー・ストリート、ボス
トン、マサチューセノン０２１１ｇ、　６１７−４８２
−９５９５コを培養培地で希釈し、フラスコに入れた。
２４時間後に、代謝的に標識した細胞を冷ＰＢＳで２回
洗浄し、水上にて０．０２％アジ化ナトリウム、２ｍＭ
フェニルメチルスルホニル・フルオライド、１％ノニデ
ソトｌ″（ＮｏｎｉｄｅｔＲ）　Ｐ　−４Ｑ　（シグマ
）および０１１％ラウリル硫酸を加えたＰＢＳで２０分
間抽出した。４°Ｃにおいてｌ　５．０００９．１５分
間、および同温度、１００．０００ｑ、１時間の遠心を
行った後、得られた放射線標識化上清抽出物を使用する
まで凍結保存した。使用前に、抽出物をプロティンＡセ
ファロースＲ（シグマ）と共にインキュベートし、非−
特異的結合性物質を除去した。ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｑ’ＣＰＭ
ｓの標識化細胞抽出物にＬ／　Ｉ　Ｃ２抗体を５０μｇ
まで加え、４°Ｃで４時間得られた混合物をインキュベ
ートし、間接免疫沈降法を行った。次いで、ＩＰ緩衝液
（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、および０．１％ノニデノトＰ−
４０Ｉ＋）中、２０％洗浄プロティンＡセファロースＲ
（シグマ）１００１１ｇを管に入れ、次いてさらに４時
間穏やかに揺り動かした。複合化抗原、抗体およびプロ
ティンＡセファロース８を遠心によってＩＰ緩衝液で２
回、次いでＰＢＳ単独で２回洗浄した。最後の洗浄の後
、得られたペレットをＳ　Ｉ）ＳＰＡＧＥで分析した。
免疫沈降した抗原の分子量を測定するための祭照タンパ
ク質は、リゾチーム（１４，４００）、大豆トリプシン
インヒビター（２１，５００）、炭酸脱水酵素（３１，
０００）　、オバルブミン（４５，０００）、ウシ血清
アルブミン（６６，２００）、ホスホリラーゼＢ　（９
２，５００）　、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５
０）　、およびミオシン（２００，０００）であった。
使用した分子量マーカーは、バイオラド・ラボラトリー
ズ［Ｂｉ。
Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　２２００ライト
・アベニュー　リノチモンド、カルフォルニア９４８０
４］からキットの形態で入手した。
分離した試料を含有するスラブゲルをコオマッシーブル
ー染色して分子量マーカーを視覚化し、次いでそのゲル
をオートラジオグラフィーにかけて標識化抗原を視覚化
した（第１図、Ｂ欄）。
実施例３ Ｌ／１０２抗体の生産 凍結したＬ／１Ｃ２ハイブリドーマのバイアルは、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから受託番
号ＡＴＣＣ♯Ｂ９６８２の下で入手することができる。
３７°Ｃ水浴中でバイアル内容物を撹拌しながら（急速
かつ均一な解凍を得るため）解凍し、生存細胞を回復さ
せた。得られた細胞懸濁液を平衡塩類溶液（ＢＳＳ−ギ
ブコ）で１．２に希釈し、血清を通過させて下層まで２
００９で遠心し、極低温用培地から細胞を分別した。
細胞ベレットの上部の物質を吸引した後、細胞を採取し
、血清および抗生物質を加えた当業界周知の組織培養培
地で希釈し、標準的な条件下（３７°Ｃおよび５％ＣＯ
，）で細胞培養物を確立した。
細胞培養を行う間は、細胞濃度をｌＸｌ０５−７×１０
５細胞／ｍρに維持することが望ましいが、勿論これは
適度な変動域が許容される。
Ｌ／　ｌ　Ｃ２抗体は、μｇ／ｍＩ２量で組織培養物か
ら回収することができる。さらに、げつ歯類種中、腹水
腫としてＬ／１．ｃ２を確立することによって、抗体の
生産性をより高めることができる。抗体の生産法および
収穫法は、ガフルレ（Ｑａｆｌｒｅ）およびミルスタイ
ンのメソッズ・イン・エンサイモロ／−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、７３巻、ランガン
およびパン・ブナキス（Ｌａｎｇｏｎ　ａｎｄ　Ｖａｎ
　Ｖｕｎａｋ１８）編、　４３−４５頁（アカデミツク
・プレス）、ニューヨーク、　１９８１］による発表に
より、その詳細が示されている。
実施例４ 本発明の抗原に対する抗体の結合性測定Ｌ／１Ｃ２抗原
陽性標的物と反応するモノクローナル抗体がＬ／１Ｃ２
抗原に結合するか否かの決定を、競合結合実験または免
疫沈降分析のいずれかによって行う。競合結合実験は、
当業者にとつては周知のものである。このタイプの実験
では、未知の抗原特異性の抗体を、標識化形態にあるＬ
／１Ｃ２抗体を検出する検定に使用する。Ｌ／１Ｃ２抗
体の結合性が阻害された場合は、問題の抗体かＬ／１ｅ
２抗原と結合することを示唆するものであろう。
Ａ、競合検定 競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）では、実施例１
に記載のようにプロティンＡクロマトグラフィーによっ
てＬ／１Ｃ２抗体を調製し、単離し、ツーおよびヘルチ
ェンバーグ（：Ｔｓｕ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ
＋細胞免疫学における選択方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍ
ｅｔｈ。
ｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）、ミツシェルおよびシーン（Ｍ１８ｈｅｌｌ　ａｎｄ
　Ｓｈｉｉｇｉ）編、３７５−３８０頁（Ｗ、ｌ（。
フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅ
ｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、サンフランシスコ
）］の教示に従って１２５１を用いて標識する。第１表
に記載したＬ／１Ｃ２抗原を発現するセルラインはいず
れも競合ＲＩＡにとっての標的細胞とすることができる
。
Ｌ／ｌＧ２抗原を呈するセルラインを組織培養液中で増
殖させ、所望の細胞数にする。ＣＰＥＧ処理によって細
胞を細胞下層から遊離させ、ＰＢＳで洗浄する。１．５
×１０５個の細胞を、前もってポリ、−し−リジン（シ
グマ）で被覆させた可撓性９６ウエルプレートに分散さ
せる。結合性を保持していない細胞をＰＢＳで洗い流す
：保持細胞を０．１％グルタルアルデヒドで固定化させ
る（室温で５分間、２？ａ／ウエル）。反応しなかった
グルタルアルデヒドを０．１％グリシンで阻害し、得ら
れたプレートを、ｌＯ％ウシ胎仔血清および０．０５％
Ｎ　ａ　Ｎ　３を加えたＰＢＳで洗浄し、その中で保存
する。
標的細胞プレートの調製法は、スターリング（Ｓｔａｒ
ｌｉｎｇ）らのカンサー・リサーチ４６（１）　：３６
７−３７４（１９８６）、およびスターリングらのジャ
ーナル・オブ・スープラモレキュラー・ストラフチャ−
［Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　１１（４）：５６３−５７７
（１９７９）に記載されている。”５Ｉ−Ｌ／１Ｃ２抗
体の至適希釈度を経験的に決定すると、本検定はハイブ
リトーマ上清液を添加する時の競合システムとしていつ
でも使用することができる。
”［−Ｌ／１Ｃ２およびハイブリドーマ被検試料を使用
する競合検定のための代替の方法が、ツーおよびヘルチ
ェンバーグ［Ｔｓｕ　ａｎｄ　Ｉｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ
、細胞免疫学における選択方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍ
ｅｔｈ。
ｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）、ミツシェルおよびシーン（Ｍ１８ｈｅｌｌ　ａｎｄ
　Ｓｈｉｉｇｉ）編、　３９０−３９４頁（Ｗｊ（。
フリーマン・アンド・カンパニー（Ｌ　Ｈ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、サンフランシスコ）
］の中に見付けることができる。
Ｂ、抗原特異性の免疫沈降分析 放射活性化細胞成分の免疫沈降法は、抗体が本発明のＬ
／　Ｉ　Ｃ２抗原と反応するか否かを確認するのに使用
することもできる。実施例２に記載した方法を使用し、
本発明の抗体が結合した抗原の特性化を行った。Ｌ／１
Ｃ２抗体または池の抗体を使用して免疫沈降を行う場合
に得られる挙動パターンの比較により、２つの異なる抗
体が抗原的同一性を有しているか否かを知ることができ
る。
抗体が本発明の抗原と反応する場合には、競合結合実験
および免疫沈降試験を組合わせることにより、別の確立
手段が提供される。
実施例５ Ｌ／１Ｃ２抗原と反応するポリクローナル抗体の生産 可溶性かつ粒状（細胞）抗原に対する通常の抗血清の生
産法は、当業界で確立されている。ポリクローナル抗体
の生産は、異種物質を免疫学的に反応するを椎動物種に
注入することによって行う。
好ましくは、抗血清の生産体として役立つ動物を、採血
試験後の測定で最適な体液性応答が得られるまで抗原で
反復してチャレンジする。Ｌ／１Ｃ２抗原陽性物質はい
ずれも免疫の目的で使用することができる。得られた抗
血清のＬ／１Ｃ２抗原に対する反応性は、実施例４に記
載のように測定することかできる。
実施例６ 癌腫の検出および診断 ポロビッツ（Ｂｏｒｏｗｉｔｚ）らのアメリカン・ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・パンロシー７９（３）　二
３８７３９１（１９８３）に記載されたアビジンービオ
チンイムノベルオキシターゼ法の改良法を利用し、本発
明抗体を例示しているＬ／　Ｉ　Ｃ２モノクロ一ナル抗
体を診断手段として用いた。
組織の凍結切片標本をゼラチン被覆スライドガラス上に
４−６μｍで切断し、風乾し、５分間アセトン中に固定
化した。５％ウマ血清とブレインキュベートした後、続
いて切片をＬ／　Ｉ　Ｃ２抗体と共にインキュベートし
、次いでビオチニル化つマ抗−マウスＩｇ（ベクターラ
プス（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ））およびアビジンとホー
スラディノ／ユベルオキシダーゼとの複合体と共にイン
キュベートし、両工程の間に、１％ウシ血清アルブミン
を含有したリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７，２−７，４）
で洗浄した。３，３°−アミノベンジジンを使用して発
色させ、切片標本をヘマトキシリンで対比染色した。
実施例７ 本発明の抗体と検出団とのコンジュゲート実施例６に記
載の方法は、Ｌ／１Ｃ２抗体を直接ヒオチニル化するこ
とによって、第２の抗体（ビオチニル化つン抗−マウス
Ｉｇ）の必要性を排除するよう容易に改変される。Ｌ／
１Ｃ２抗体をプロティンＡクロマトグラフィーによって
精製し、Ｑ　、　ｌ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３中で脱塩し
、透析またはセファデックスＧ２５Ｒ（ングマ）によっ
でＱ、１ＭＮａＨＣＯ３でｐＨ８，５−８，６に調節す
る。Ｇ２５の調製カラムはファルマンア・ケミカルＣｏ
、がらＰＤ１０１１カラムとして市販されている。Ｌ／
１Ｃ２抗体の濃度をｏ、　ｌ　Ｍ　ＮａＨＣ０３（ｐ　
Ｈｓ。
５−８．６）中でｌｕｇ／ｄに調節する。Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドビオチン［ピース・ケミカルＣｏ、　
（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）、　ｐ
、　ｏ、ボックス１１７、ロックフォード、イリノイス
６１１０５］を即座にＤＭＳＯに溶解して濃度１ｚｇ／
ｍｃとし、Ｌ／１Ｃ２抗体を１２０μＱ／ｐｇで加え、
素早く混合する。得られた反応混合物を室温で４時間放
置する。
透析またはセファデックスＧ２５Ｒへの通過によって、
コンジュゲート化抗体を未反応のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドビオチンから分離する。ビオチニル化し／１Ｃ
２抗体と蛍光部分、放射活性種、または酵素のアビジン
コンジュゲート体との反応時に検出が行える。検出につ
いてアビジン−ビオチンシステムを使用することは、当
業界で広く活用されており、上述のアビジンコンジュゲ
ート体は多くの会社から市販されている。
本発明の抗体に直接、蛍光標識物を結合させることは、
細胞免疫学における選択方法（ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）、ミノシェルおよびシーン（Ｍ１８ｈｅｌｌ　ａ
ｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉ）編、　２９２−３０２頁（Ｗ、Ｈ
，７リー７７・アンド・カンパニーＱ、　Ｉｌ、　Ｆｒ
ｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、サンフランシ
スコ）］に記載の方法に従って行うことができる。
実施例８ アイソタイプの決定 Ｌ／１Ｃ２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ＃８９８６２）か
ら産生されるＬ／１Ｃ２抗体のアイソタイプを１ｇＧ３
と決定した。ハイクローン・ラボラトリーズ（ＨｙＣＩ
ｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手したネズ
ミモノクローナル・サブ−アイソタイピング・キットお
よびその供給元から提示されている教示によって、この
決定を行った。
実施例９ インビトロ腫瘍細胞増殖阻害 ９６ウ工ル組織培養プレート（カスター）の各ウェルに
ｌＸｌ０’個の標的細胞を分配し、ロイシン不足培地（
１３μｇ／＋（２Ｌ−ロイシン、２９．２μｇ／肩１２
Ｌ−グルタミン、５０Ｍｇ／ｚ＆ゲンタマイシンおよび
１０％透析ウシつ仔血清を加えた、ロイシン不含のＤＭ
Ｅ）中、３７℃で１６時間インキュベートした（５％Ｃ
Ｏ２を含有する加湿インキュベーター中）。すべての組
織培養試薬は、ギブコ・ラボラトリ−から入手した。次
いて、その培地を吸引除去し、ロイシン欠損培地２００
μρ中、抗体希釈物を加えた。プレートを４８時間イン
キュベートし、その時点で培地を除去し、各ウェル毎に
４μＣｉの３Ｈ−ロイシン（ＮＥＮ）となるよう加えた
ロイシン欠損培地（キブコ）と取り替えた。そのプレー
トを上記のインキュベーターに２４時間戻した。大きな
分子に導入された放射活性を自動細胞捕集器および液体
シンチレーション法によって測定した。
実施例１０ ントとみなした。
実施例１１ トリプシン／ＥＤＴＡ　（ギブコ）処理によって、Ｔ２
２２細胞を組織培養フラスコから採取し、細胞がフラス
コから剥離したことを認めた。細胞をハンクス平衡塩類
溶液（ＨＢ　Ｓ、Ｓ　（ギブコ））で２回洗浄した。ｌ
Ｘｌ０６個の細胞を１２Ｘ７５Ｕ！管に移し、遠心して
ペレット化し、ＨＢＳＳを吸引した。Ｌ／１Ｃ２（５μ
ｇ／酎）５０μＱを管毎に加え、氷上で３０分間インキ
ュベートした。
インキュベートの後、ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、結
合していないＬ／ｌＧ２を除去し、最後の洗浄の後にＨ
ＢＳＳを吸引した。蛍光化ヤギＦ（ａｂ゛）、抗−マウ
ス［ｇＧ（タボ）５０μり加え、次いで得られた内容物
を混合し、水上で３０分インキュベートした。次いで、
細胞をＨＢ　Ｓ　Ｓで２回洗浄し、反応していない蛍光
化ヤギＦ　（ａｂ’　：Ｌ抗マウスＩｇＧを除去し、こ
れを本検定のＯ時ボイ化 取り扱い上の教示に従って、ヨードビーズＥピース・ケ
ミカルＣｏ、　］を使用して精製Ｌ／　Ｉ　Ｃ２を１２
５１で標識した。細胞ペレット中のｃｐｍを内在化した
”Ｊ−Ｌ／Ｉｃ２と考え、１ｔ５１−Ｌ／１Ｃ２の内在
化を評価した［マルソツク（Ｍａｌｚｋｕ）らのカンサ
ー・リサーチ４３：３８４８（１９８６）］。簡単に説
明すれば、１×１０８個の標的細胞を２００，０００ｃ
ｐｍ標識化抗体とｏ’ｃまたは３７°Ｃで９０分間反応
させ、４回洗浄し、グリシン緩衝液（０゜０５Ｍグリシ
ン−塩酸、ｐＨ２，８および０１Ｍ　ＮａＣ１２）０．
５ｍσ中に懸濁して細胞表面結合免疫グロブリンを解離
させた。遠心の後、上清または細胞ペレットの放射活性
を測定した。上清の放射活性のカウントを細胞表面結合
＋２ｓ■　（、／１Ｃ２と判断した。
実施例１２ 異系交配したヌードマウスをチャールス・リバー・ブリ
ーディング・ラボラトリーズ［ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅ
ｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ボ
ストン、ＭＡ］から入手し、無菌層流気流施設に収容し
、勝手に無菌水および食糧を採らせた。約２カ月令のマ
ウスの右背中の皮下にＱ、２ｘＩ２ＰＢＳ中ｌＸｌＯ７
個の腫瘍細胞を接種した。抗−腫瘍効能を評価するべき
化合物を滅１ＪＰＢｓ中で静注投与用に調製し、それを
、動物の外傷および被検動物の注射部位における感染を
最小限にするよう注意して投与した。
処置効能は、腫瘍の大きさをモニターして決定した。後
の腫瘍測定は、二次元で取り、その質屋は、式［（長さ
）（幅２）／　２　］を使用して計算した。
腫瘍増殖の阻害は、ＰＢＳのみを投与したコントロール
動物における腫瘍増殖と対比させて計算した。すべての
処置およびコントロール群には、１０匹のマウス群を使
用した。
本試験にとってはヌードマウスは好ましいげっ歯頚であ
るが、各種の研究は、宿主動物の免疫学的応答を阻害す
る照射または免疫抑制剤のいずれかによって他のげっ歯
頚を免疫抑制すると言われている。Ｔ２２２細胞は、ヌ
ードマウスの異種移植モデルとして特に好ましいヒト腫
瘍セルラインであるが、Ｌ／１Ｃ２抗原を発現し、ヌー
ドマウスに腫瘍を再現性よく確立させさえするヒト腫瘍
セルラインであるならば、これらも好ましいセルライン
となり得る。
実施例１３ Ｌ／　ｌ　Ｃ２抗体を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５，６、アセテート緩衝液）中で完全に透析し、
濃度１０ｒｓｇ／ｍ（ｌにまで希釈（総ｆｆ１１５．７
村）Ｌ、氷水浴巾約０°Ｃで平衡化させた。
過ヨウ素酸ナトリウム（メタ）５３５ｍｇを固形状で加
え、得られた反応混合物を穏やかに撹拌して過ヨウ素酸
ナトリウムを溶解させた。抗体を傷付けないように激し
く撹拌しなかった。混合物に光りか照るのを防ぐためア
ルミニウムホイルで覆いをし、反応混合物を水浴中で約
２１分間撹拌した。この２１分間のインキュベートの後
、１２５Ｍエチレングリコール（水中）１μＱを加えて
酸化反応を停止させた。遠心して凝集した物質を反応混
合物から除去し、得られた清澄水を、前もってアセテー
ト緩衝液で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５１
１ゲル−濾過カラム（４４ｇ。
セフ１デックス−０２５Ｒ，カラム２．５　Ｘ　５　Ｑ
ｃｘ）のクロマトグラフィーにかけた。カラムから最初
のピークを採取し、アセテート緩衝液で２．７７ｆｆｇ
／ｍＱまで希釈した。タンパク質濃度を２８０ｎｍの紫
外部吸収で測定し、抗体Ｌｍｇ／ｍ（ｌ溶液についてｌ
、４３の吸光率と評価された。
上記Ａ工程から得られた酸化Ｌ／１Ｃ２抗体（アセテー
ト緩衝液中２．７７ｍｇ／ｘｃ、総量５５ｉＱ）に、４
−デスアセチルビンブラスチン−３−カルボキシヒドラ
ジド硫酸（ＥＰＯ公開第２４７，７９２号の記載に従っ
て製造）２３８ｍｇを約−２°Ｃで撹拌下に加えた。４
−デスアセチルビンブラスチン−３−カルボキシヒドラ
ジド硫酸を溶解した時に、光りから保護するため混合物
をホイルで包み、冷所（４°Ｃ）に移してそこで１６時
間撹拌した。次いで、反応混合物を遠心して清澄化し、
前もってＰＢＳで平衡化しておいたセファデックスＧ−
２５濾過カラムＲ（セファデックスＧ−２５Ｒ６７ｇ、
２．５Ｘ７５ｃｉカラム）のクロマトグラフィーにかけ
た。フラクションを集め、最初のピークを採取し、２波
長ＵＶ分光器（２８０ｎｍおよび２７０ｎｍ）によって
タンパク質および薬物の濃度に関して評価した。免疫コ
ンジュゲート体を０．２μｇ濾過（ミリポア）で滅菌し
た後、４°Ｃで保存した。
実施例１４ Ｌ／　Ｉ　Ｃ２プロピオニル−３−アミ７カルボニルラ
ンドの調製 Ａ、メトトレキセート−γ−ヒドラジドの調製１００ｍ
Ｑ容ｉ１のフラスコに、Ｌ−グルタミン酸・５−メチル
エステル１．６１ｇ（ＩＯミリモル）を加えた。それに
、（−ブチルアセテート６ＣｈｔｔＱ、を加え、得られ
た混合物を撹拌して各成分を十分に混合した。次いで、
それに７０％過塩素酸１．５８ｇ　（１１ミリモル）を
撹拌を続けながら滴加した。この混合物を窒素雰囲気下
に２日間撹拌し、次いで０．５Ｎ塩酸１００ｘ（２で３
回抽出した。水層をまとめ、重炭酸ナトリウム３０ｇで
中和した。この中和溶液をジエチルエーテルで３回（総
！１１５０ｍ（２）抽出し、有機層をまとめ、塩水で洗
浄した。次いで、洗浄した有機溶媒を硫酸ナトリウムで
乾燥し、環境温度で減圧下に留去し、きれいな浦１．１
８ｇ　（５，４ミリモル）を得、これをＬ−グルタミン
酸・５−メチル−１−ｔブチルエステルと同定した。
オーブン乾燥した１００酎容量フラスコにトリエチルア
ミン０．９２ｍＱ　（６，６ミリモル）、ジエチル・シ
アノホスホネート１ｍσ（６，６ミリモル）、および酸
化バリウムから減圧下に蒸留したばかりのジメチルホル
ムアミド４９ｘＱを加えた。
撹拌したこの溶液に、２，４−ジアミノ−６−［Ｎ−メ
チルーＮ−（４−カルボキシフェニル）アミノコプテリ
ジン・三水和物５０６ｘｇ　（１，３ミリモル）を加え
た。撹拌下に中間生成物が溶解したなら、混合物を８０
°Ｃに加熱し、次いでトリエチルアミン０．２０ｍＱ　
（１，４ミリモル）および上記のように製造したし一グ
ルタミン酸ジエステル３４２１１１ｇをジメチルホルム
アミド１叶に加えた。
得られた混合物を８０°Ｃで２時間撹拌し、次いで冷却
し、減圧下に溶媒を除去した。得られた残渣をクロロホ
ルム３００ｙ（ｌ中に取り、重炭酸ナトリウム５％溶液
で洗浄した。水層をクロロホルムで抽出し、有機層をま
とめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮してオレ
ンジ色の油１．３５ｇを得、次いでこれをクロロホルム
中１０％メタノールで溶出するシリカゲル１５０ｇクロ
マトグラフィーにかけた。生成物を含有するフラクショ
ンをまとめて、・層線し、γ−カルボキンかメチルエス
テル形態であり、α−カルボ牛シがｔ−ブチルエステル
形態であるメトトレキセートジエステル体６４５１ｇを
得た。
上記中間生成物を他のロフトの同じ化合物（全ｆｆ１６
９７．ｖｇ（１，３ミリモル））と−緒にし、メタ／−
ル１２ｆｆ（に溶解した。それに無水ヒドラジン１７０
ｘｇ　（５，３ミリモル）を加え、得られた混合物を窒
素雰囲気下に環境温度で６日間撹拌した。次いで、溶媒
を減圧下に除去し、得られた残渣をシリカゲル１５０ｇ
のクロマトグラフィーに付し、クロロホルム中１５％メ
タノールで溶出し、メトトレキセート−α−ｔ−ブチル
エステル−γヒドラジド４７０１Ｋｇ（０，９ミリモル
）を得た。
この中間生成物をＩＮ塩酸１２０ｚｆ２に溶解し、５５
°Ｃで５０分間加熱した。次いで、減圧下に濃縮して固
形物とし、得られた残渣を０．０１．Ｍ酢酸アンモニウ
ム（ｐＨ８）８０ｍｅに取った。この溶液を４°Ｃで３
日間保存し、次いで直く前で使用したものと同一の緩衝
液（緩衝液Ａ）と１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８）
（緩衝液Ｂ）との勾配法によって溶出するセファロース
ファーストフＯＱ　［５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　
Ｆｌｏｗ　Ｑ＋ファルマシア］３００ＲＩ２のクロマト
グラフィーにかけた。１００％の緩衝液Ｂで溶出する生
成物を含有するフラクションをまとめ、凍結乾燥を繰り
返し、痕跡量の酢酸アンモニウムを除去した。メトトレ
キセート−γ−ヒドラジドの収量は３２６＋＋ｇ　（０
，７ミリモル）であった。
２５ＯＲ＋２容量フラスコに、ジオキサン１００ｆｆＣ
中、４−カルホキジベンズアルデヒド３ｇ（２０ミリモ
ル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｇ（２
０ミリモル）を加えた。この混合物を５−１０分間撹拌
し、次いてジシクロへキンル力ルホジイミド４．１ｇ（
２０ミリモル）を加えた。環境温度で１時間この混合物
を撹拌した後、濾過した。得られた濾液を減圧下に留去
し、白色固体９．４ｇを得、これを温イソプロパツール
２５ｍρから再結晶した。この中間生成物をイソプロパ
ツールでトリチュレートし、４−カルボキシベンズアル
デヒドの所望のＮ−スクシンイミドエステル体２．１ｇ
（８，５ミリモル）を得た。
さらに中間生成物のバッチを製造し、全量１０ｇ（４０
ミリモル）のＮ−スクシンイミドエステルを、β−アラ
ニン３．６ｇ　（４０ミリモル）のＩＮ水酸化ナトリウ
ム４０ｍＱおよび本釣１００村中溶液に加えた。ｐＨを
８以上に維持しながら、この混合物を１．５時間撹拌し
た。次いで、混合物を濾過し、２Ｎ塩酸を用い、得られ
た濾液をｐＨ１，９まで酸性にした。全ｊ１１５０ｚ（
！の酢酸エチルで３回抽出し、得られた有機層をまとめ
、塩水で洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウムで
乾燥し、減圧下に留去して白色固体の３（４−ホルミル
フェニルカルボニルアミノ）プロピオン酸４．６ｇ（２
１ミリモル）ヲ得７’：。
この中間生成物１００ｍｇ　（０，４５ミリモル）、シ
ンクロへキシルカルボジイミド１０３ｍｇ（０゜５ミリ
モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５７．５ｍｇ　
（０，５ミリモル）およびジオキサン１０ｍＣを小フラ
スコ中に入れ、窒素雰囲気下に環境温度で撹拌した。薄
層クロマトグラフィーによって、この反応の進行を観察
し、ジシクロへキシルカルボジイミド７５ｍｇ　（０，
３６ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド４
５ｍｇ　（０，４ミリモル）をそれぞれ追加した。４時
間経過後、この反応混合物を濾過し、得られた濾液を減
圧下に留去して固形物を得た。不純物を含む生成物約２
００１１ｇを得、これをジクロロメタン中５％インプロ
パツールで溶出するシリカゲル３０ｇのクロマトグラフ
ィーにかけた。生成物を含有するフラクションをまとめ
、若干の不純物を含む所望の中間生成物８１＋ｇ　（０
，２５ミリモル）を得た。
との結合 １００！（２容量フラスコに環境温度で、０．３４Ｍホ
ウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）７６．１ｚ９中の抗体１−
／１Ｃ２（１０２６ｚｇ、６．８μｍｏｌ）溶液を加え
、次いてアセトニトリル３．３１７（中、製造例３から
得た活性エステル１４．１ｘｇ　（４４μｍｏｌ）を加
えた。この混合物を環境温度で１時間撹拌した。次いで
、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５６）で溶出するセフ
ァデックスＧ２５（ファルマシア）９０ｇのクロマトグ
ラフィーにかけた。
２５８ｎｍおよび２８０ｎｍのＵＶ分析によッテ得られ
たフラクションを評価し、生成物を含有するフラクショ
ンをまとめ、濃度８．５ｍｇ／ｍＱの溶液状（１１１，
５ｍ１２　）の所望の生成物９４８ｍｇ　（６，３μｍ
ｏｌ）を得た。この誘導体化抗体におけるコンジュゲー
ト比率は、抗体１モル当たりリンカ−４，８モルであっ
た。
誘導体化抗体４７２ｍｇ　（３，１μｍｏｌ）を含有す
る、製造例４の生成物の５５．６ｍｇ部分量に０１Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，６）を８７ＲＱ追加して希釈
した。
メトトレキセート−γ−ヒドラジドの部分量１０１　ｍ
ｇ　（２１６μｍｏｌ）をアセトニトリル７．２ｍｇ、
およびＩＭ−塩基性カリウムリン酸緩衝液２１．６１１
１ｆ２中に取った。５Ｎ水酸化ナトリウム約１ｍＱをこ
の溶液に加え、次いで抗体溶液を加えた。氷酢酸を用い
てこの反応混合物をｐＨ５，８まで酸性に調節し、環境
温度で１６時間撹拌した。
次いで、遠心し、上清液を、生理的緩衝化食塩水で溶出
するセファデックスＧ２５　（９０ｇ）２個でクロマト
グラフィーにかけた。
溶液の全１１２０２．８ｍｇをこのクロマトグラフィー
から採取し、これらを紫外線分光測定によって分析し、
２８０および３７０ｎｍのスペクトルを観察した。分析
により、溶液はＯ，Ｏｌ　８　ｍｇ／ｘ（のメトトレキ
セートおよび１．８７　ｙｇ／ｍ（ｌの抗体を含有する
ことが判明した。従って、コンジュゲ−１・比率はモル
濃度からみると３．０であった。
この生成物の溶液を冷所で生理的緩衝化食塩水に対して
減圧下に透析し、本実施例の生成物溶液を、同様に操作
して得た生成物溶液２１２ｆｆｆｆと一緒にした。透析
によってその容量を１０８πＱまで減じた。
実施例１５ 実施例１４に記載の条件中、以下に記載の事項のみを変
動させ、実施例１４に記載のコンジュゲート化反応を４
回繰り返した。
Ａ、Ｏ，１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）６７μＱお
よびアセトニトリル３３μＱに溶解したメトトレキセー
ト−γ−ヒドラジド０．６７ｍｇを、実施例１４．０項
に記載の中間生成物２．２ｘｇのｏ、ｔＭ酢酸ナトリウ
ム溶液１村と一緒にし、得られた混合物を１１時間放置
した。次いで、バイオゲルＰ　６　（Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ
６、バイオラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド、ＣＡ　９４
８０４）５．９　ｇのクロマトグラフィーにかけ、コン
ジュゲート溶液５！ｌ１２を得た。これは、抗体１モル
当たりメトトレキセー１−３．２モルのコンジュゲート
比率で所望のコンジュゲート体０．６１１１ｇを含有し
ていることが見いだされた。
Ｂ、実施例１５、Ａ項で使用したメトトレキセート−γ
−ヒドラジド溶液の同量を、実施例１４．０項の中間生
成物０．４２ｍｇを含有する中間生成物溶液０．９５ｆ
ｆ（と−緒にし、この混合物を１１時間放置した。これ
を実施例１５、Ａ項に記載のようにクロマトグラフィー
にかけ、フンシュゲート比率がＬ／１Ｃ２抗体１モ抗体
１リル当トレキセート５．４モルのフンシュゲート体０
．１１花を含有するフンシュゲート溶液４．７５ＮＩＱ
を得た。
Ｃ，アセトニトリル５０μＱおよび１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ５，８）１００μＱに溶解したメトトレキセート−
γ−ヒドラジド０．７ｍｇを、０゜１Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，６）　　Ｌｍ（ｌに溶解した実施例１４．０
項の中間生成物２．２＋ｇと一緒にした。この混合物を
１１時間放置した。次いで、実施例１５、Ａ項に記載の
ようにクロマトグラフィーにかけ、抗体１モル当たりメ
トトレキセート３．３モルのコンジュゲート比率のコン
シュケート体１．３ｍｇを含有するコンジュゲート溶液
５．３ｍＱを得た。
Ｄ、アセトニトリル５０μＱおよびＩＭ　リン酸緩衝液
（ｐＨ５，８）１５０μＱに溶解したメトトレキセート
−γ−ヒドラジド０．７ｍｇを、０゜１Ｍ酢酸ナトリウ
ム１７１１１２に溶解した実施例１４．０項の中間生成
物２．２ｍｇと一緒にした。この混合物を１４時間放置
した後、実施例１５、Ａ項に記載のようにクロマトグラ
フィーにかけ、Ｌ／１Ｃ２抗体１モ抗体１リル当トレキ
セート３．３モルのコン７ユゲート比率のコンジュゲー
ト体１゜７ｍｇを含有するコンジュゲート溶液５．３＋
Ｑを得た。
上述のコンジュゲート化反応の変法は確立されており、
このンステムによって薬物のＬ／１Ｃ２抗体への結合程
度をコントロールすることができる。好ましいフンシュ
ゲート比率は、抗原のＩ−／１Ｃ２抗体への結合性を有
意に減少させることなく結合できる薬物の最大数である
と一般に考えられる。
実施例１６ ４−カルボキ／ベンズアルデヒド−Ｎ−スクシンイミド
エステル０．３１ｍｇを実施例１４、Ｂ項に記載のよう
に製造した。それをジメチルホルムアミド１００μｅに
溶解し、それを０３４Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）
２．１肩ρ中、抗体Ｌ／１Ｃ２（１８，９ｍｇ）　に加
えた。コノ混合物を環境温度で１．５時間撹拌し、次い
でＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）で溶出するバ
イオゲルＰ６　（６ｇ）のクロマトグラフィーにかけた
。
溶液６．２ｍＱ部分遣を得、これをＵＶ分析し、２５６
および２８０ｎｍのスペクトルを観察した。
この分析により、抗体１モル当たりリンカ−５２モルの
コンジュゲート比率であり、濃度２．６Ｍｇ／ｙａＱの
誘導体化抗体１６．１Ｍｇが得られたことを確認した。
誘導体化抗体１０．４　ｍｇ　（０，０６９μｍｏｌ）
を含有する、実施例１６、Ａ項に記載の溶液４１１ｇを
、ジメチルホルムアミド２５０μＱ中、メトトレキセー
ト−γ−ヒドラジド３．２１１ｇ　（６，８μｍｏ１）
と−緒にした。この混合物を環境温度で６時間放置し、
次いで冷蔵庫に入れた。２日経過後、この混合物を遠心
し、上清液をバイオゲルＰ６（生理的緩衝化食塩水で溶
出）にかけ、溶液８．５１１１Ｃを得、これをＵＶ分析
し、２８０および３７０ｎｍにおけるスペクトルを観察
した。この分析により、生成物が、コンジュゲート比率
、抗体１モル当たり６．４モルの薬物を有しており、ま
たこの溶液が０．６４ｒｇ／ｍＱ、のコンジュゲート体
を含有していることを確認した。
実施例９に記載のように、組織培養中のＴ２２２腫瘍細
胞の増殖を阻害する能力について、得られた生成物を評
価した。このコンジュゲート体は、メ２−レキセード含
量に基づいて、０．０３５μｇ／ｍ（ｌの濃度で細胞増
殖の７０％を阻害を示すことが見いだされた。
実施例１７ ペプシン／１１ρが１２．６ｍｇのペプシンｍ液２゜４
ｆｆ１２を生理的緩衝化食塩水２７０ｄ中、Ｌ／１Ｃ２
抗体１．５ｇに加えることによって抗体Ｌ／１Ｃ２のＦ
　（ａｂ’　）ｔフラグメントを調製した。この混合物
を３７°Ｃに２時間２０分維持した後、トノエタノール
アミンを添加して反応を停止させた。
次イテ、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムで溶出するセファロ
ース・ファスト・フロー・カラムのクロマトグラフィー
によって生成物を濃縮した。得られたＦ　（ａｂ’　）
、を含有するフラクションをまとめ、透析によって濃縮
して抗体Ｌ／１Ｃ２のＦ　（ａｂ’　）２フラグメン）
９９２ｍｇを含有する生成物溶液１００、ｖＱ、を得た
。
ゲート比率の誘導体化抗体フラグメンＨ９ｍｇ（０，１
９μｍｏｌ）を得た。
実施例６、Ａ項で調製したＬ／　ｌ　Ｃ２Ｆ　（ａｂ’
）、フラグメントを、０．３４Ｍホウ酸塩緩衝１（ｔ（
ｐＨ８，６）中で透析し、Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメ
ント２３ｚｇ　（０，２３μｍｏｌ）を溶液３．８ｍ＋
２として得た。この溶液を、アセトニトリル１０２μｅ
中、３−（４−ホルミルフェニルカルボニルアミノ）プ
ロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル０゜４４　ｍ
ｇ　（１，４μｍｏｌ）と−緒にした。この混合物を環
境温度で１時間撹拌し、次いで得られた溶液を、０．１
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ＋（５，６）で溶出するセファデ
ックスＧ２５　（ｌ　Ｉｇ）のカラムでクロマトグラフ
ィーにかけた。生成物を含有するフラクションをまとめ
、溶液９，６靜中、抗体１モルに当たりリンカ−２，８
モルのフンシュ上記８項で調製した、誘導体化抗体フラ
グメントｓｆｆｇ　（０，０８μｍｏｌ）を含有する誘
導体化抗体フラグメント溶液２．７ｍＱに、１Ｍ　リン
酸緩衝液（＋）Ｈ５，６）０．４７２（！を加えた。こ
の溶液に、最小量の０．１Ｍ酢酸ナトリウムに溶解した
メトトレキセート−γ−ヒドラジド３．７ｉｇ　（７９
μｍｏｌ）を加えた。希塩酸によってこの混合物のｐＨ
を５．６に再調節し、環境温度で１７時間撹拌した。次
いで、遠心し、得られた上清液を、生理的緩衝化食塩水
で溶出するセファデックスＧ２５（ｌ１ｇ）のカラムで
クロマトグラフィーにかけた。ＵＶ分析によって、０．
９５肩ｇ／ｙＱ、で含有する溶液状のフンシュゲート体
５．８ｍｇか得られ、そのコンジュゲート比率はＬ／１
Ｃ２抗体１モル当たりメトトレキセート ことか判明した。
実施例９に記載のように、このコンジュゲート体を、Ｔ
２２２腫瘍細胞に対するインビトロ腫瘍細胞増殖阻害検
定に使用することにより、ｉｌＡ度０。
００４６μｇ７ｍ（ｌて２２％の程度の細胞増殖を阻害
することか判明した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｌ／１Ｃ２抗体（パネルｌ〜）およびＬ／１
Ｃ２抗原（パネルＢ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を
示す写真の模写図であり、第２図は、選択した腫瘍セル
ラインとのＬ／１Ｃ２抗体の反応性を示すｌｆｌｔ動細
胞測定の結果を示すグラフであり、第３図は、ＵＶ顕微
鏡検査により測定したＩ７／　Ｉ　Ｃ　２抗体の内在化
を示す写真の模写図であり、第４図は、ヌードマウス異
種移植モデルにおけるＴ２２２扁平」二皮癌異種移植片
の増殖曲線を表すグラフである。 Ｆ　Ｉ　Ｇ．２ ＵＳＣＬＳ・１ ＦＩＧ．１ ＦＩＧ．３

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、実質的に純粋な形態にある腫瘍関連糖タンパク抗原
    であって、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で
    は１１０，０００−１４０，０００ダルトンの範囲の分
    子量を有し、ヒトの頭部、頚部および肺の上皮細胞から
    生じるヒト扁平上皮癌の表面に存在し、ハイブリドーマ
    セルラインＬ／１Ｃ２から産生される抗体により免疫沈
    降を生じ得る抗原。 ２、請求項１に記載の糖タンパク抗原と反応する抗体を
    産生するハイブリドーマセルライン。 ３、Ｌ／１Ｃ２である請求項２に記載のハイブリドーマ
    セルライン。 ４、請求項１に記載の腫瘍関連糖タンパク抗原と反応す
    る抗体。 ５、請求項２に記載のハイブリドーマセルラインから産
    生される抗体。 ６、キメラ抗体である請求項４に記載の抗体。 ７、ＩｇＧ抗体である請求項４または請求項５に記載の
    抗体。 ８、Ｌ／１Ｃ２抗体である請求項７に記載の抗体。 ９、請求項４から請求項８までのいずれかに記載の抗体
    の抗原結合性領域を含有している分子。 １０、請求項４から請求項８までのいずれかに記載の抗
    体のＦａｂフラグメント。 １１、請求項４から請求項８までのいずれかに記載の抗
    体のＦ（ａｂ’）＿２フラグメント。 １２、試料中のＬ／１Ｃ２抗原の存在を検出する方法で
    あって、（ａ）該試料に、請求項１に記載の腫瘍関連糖
    タンパク抗原と反応する抗体を加え、（ｂ）該試料に対
    する該抗体の反応性を測定することを特徴とする方法。 １３、放射性元素、生物学的毒素または腫瘍細胞崩壊性
    薬物と結合した請求項４から請求項１１までのいずれか
    に記載の抗体、分子またはフラグメントからなるヒト癌
    の治療に有用な抗癌性物質。 １４、生物学的毒素がジフテリア毒またはリチンである
    か、あるいは腫瘍細胞崩壊性薬物がメトトレキセート、
    ビンカアルカロイドまたはアドリアマイシンである請求
    項１３に記載の抗癌性物質。 １５、抗体、分子またはフラグメントが、ＡＴＣＣ♯Ｂ
    ９６８２の分泌産物であるモノクローナル抗体Ｌ／１Ｃ
    ２である請求項１３または請求項１４に記載の抗癌性物
    質。 １６、ヒトに請求項１３から請求項１５までのいずれか
    に記載の抗癌性物質を投与することを特徴とするヒト癌
    の治療方法。 １７、請求項５から請求項１１までのいずれかに記載の
    抗体、分子またはフラグメントを調製するための方法で
    あって、（ａ）請求項２または請求項３に記載のハイブ
    リドーマセルラインからモノクローナル抗体を分泌させ
    、（ｂ）該モノクローナル抗体を精製し、（ｃ）Ｆａｂ
    またはＦ（ａｂ’）フラグメントの調製を望む場合はタ
    ンパク質分解酵素パパインまたはペプシンで該精製抗体
    を開裂することを特徴とする方法。 １８、請求項１３から請求項１５までのいずれかに記載
    の抗癌性物質を調製する方法であって、請求項４から請
    求項１１までのいずれかに記載の抗体、分子またはフラ
    グメントを、放射性元素、生物学的毒素または腫瘍細胞
    崩壊性薬物と結合させることを特徴とする方法。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5134075A (en) * 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
ZA914625B (en) * 1990-06-22 1993-02-24 Lilly Co Eli In vivo targeting with bifunctional antibodies
CA2044421C (en) * 1990-11-27 2005-06-21 Thomas Hyatt Duffy Squamous cell carcinoma-like immunoreactive antigen from human female urine
JPH06145196A (ja) * 1992-11-10 1994-05-24 Tosoh Corp 癌細胞が分泌する蛋白質
US5424402A (en) * 1993-10-18 1995-06-13 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Non-destructive method for radiolabelling biomolecules by halogenation
US5482040A (en) * 1994-04-14 1996-01-09 The Ohio State University Research Foundation Biostaging of adenocarcinomas utilizing radiolabeled tumor-associated glycoprotein antibodies
US6348194B1 (en) 1995-11-13 2002-02-19 Ixsys Incorporated Tumor specific internalizing antigens and methods for targeting therapeutic agents
US6406917B1 (en) 1996-06-11 2002-06-18 Advanced Research And Technology Institute Methods and compositions for the use of apurinic/apyrimidinic endonucleases
WO1997047971A1 (en) * 1996-06-11 1997-12-18 Advanced Research & Technology Institute Methods and compositions for the use of apurinic/apyrimidinic endonucleases
US20050069551A1 (en) * 2002-03-08 2005-03-31 Emory University Cytotoxic compound-protein conjugates as suppressors of tumor growth and angiogenesis
CA2478522A1 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Emory University Novel curcuminoid-factor viia constructs as suppressors of tumor growth and angiogenesis
AU2015224535B2 (en) * 2011-06-21 2017-07-20 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
BR112013032928A2 (pt) * 2011-06-21 2017-01-24 Immunogen Inc "derivados de maitansinoide com ligante de peptídeo e conjugados dos mesmos, composição farmacêutica que os compreende e uso dos mesmos"

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132769A (en) * 1974-10-30 1979-01-02 Osther Kurt B Cancer antigen, cancer therapy, and cancer diagnosis
US4713352A (en) * 1981-08-31 1987-12-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Reseach Monoclonal antibody panel for early diagnosis and therapy of renal carcinoma
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
AU4070685A (en) * 1984-03-30 1985-10-03 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monoclonal antibody specific for human basal cell surfaces
US4708930A (en) * 1984-11-09 1987-11-24 Coulter Corporation Monoclonal antibody to a human carcinoma tumor associated antigen
US5019497A (en) * 1984-11-09 1991-05-28 Lennart Olsson Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies
US4814275A (en) * 1985-05-13 1989-03-21 E.I. Dupont De Nemours And Company Monoclonal hybridoma antibody specific for a human epithelial antigen
US4816402A (en) * 1986-01-07 1989-03-28 Northwestern University Murine hybridoma and diagnostic antibody produced thereby
EP0232871A3 (en) * 1986-02-07 1989-03-15 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Human monoclonal antibody, hybridoma producing the same and its use
US4912031A (en) * 1987-10-23 1990-03-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for detecting carcinomatous and precarcinomatous colo-rectal disease

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