DE68918673T2 - IgG-bindendes Protein H, kodierendes Gen dafür und Verfahren zu seiner Herstellung. - Google Patents
IgG-bindendes Protein H, kodierendes Gen dafür und Verfahren zu seiner Herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues, spezifisch an das Fc- Fragment von menschlichem Immunglobulin G (IgG) bindendes Protein, ein das Protein codierendes Gen und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins.
- Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen eine Reihe als bakterielle Fc-Rezeptoren bekannte Proteine produzieren, die eine Affinität zu dem Fc- Fragment von Immunglobulinen aufweisen (Boyle et al., Bio/Technology 5, (1987) 697).
- Die Clonierung und Expression des Gens für einen Fc-Rezeptor des Immunglobulins G aus einem Streptococcus vom M-Typ 76, Gruppe A, ist beschrieben worden in Heath and Cleary, Infection and Immunity 55, (1987) 1233. Ein Subclon exprimierte ein Protein, das an Immunglobuline vom Pferd und Schwein bindet sowie an das alle vier Unterklassen repräsentierende menschliche Myelom-IgG und an gereinigte Fc-Fragmente von menschlichem IgG.
- Typische Beispiele solcher Proteine sind das aus Staphylococcus aureus stammende Protein A und das aus Streptococcus G148 stammende Protein G.
- Diese Proteine binden in charakteristischer Weise an das Fc-Fragment von Immunglobulinen und werden sowohl für Analysen, die Aufreinigung und Herstellung von Antikörpern als auch für klinische Diagnose und biologische Forschung verwendet.
- Sie können ebenfalls zur Behandlung von Krebs und Autoimmunkrankheiten verwendet werden, wobei die auf unlöslichen Trägermitteln immobilisierten Proteine verwendet werden, um unerwünschte Immunkomplexe aus Blut zu adsorbieren oder zu entfernen (Cancer 46, (1980) 675).
- Diese bekannten Proteine haben einige unerwünschte Eigenschaften als Mittel zur Reinigung menschlicher monoclonaler Antikörper, die von nichtmenschlichen, tierischen Zellen produziert werden, oder zur Entfernung von überschüssigem IgG aus Blut zur Blutreinigung.
- Protein A bindet sowohl IgGs verschiedener Tierarten, einschließlich des Menschen, als auch menschliches IgA, IgM und so weiter. Protein G bindet nur IgG, aber es bindet sowohl menschliches IgG als auch IgGs anderer Tierarten (Fahnestock, Trends in Biotechnology 5, (1987) 79). Ihre Bindungsspezifitäten sind daher nicht so eng begrenzt, so daß sie zur Analyse, Reinigung und Adsorption oder Entfernung von menschlichem IgG benutzt werden können.
- Unter diesen Umstanden ist die Entwicklung eines zur spezifischen Bindung von menschlichem IgG fähigen Proteins erforderlich gewesen.
- Es wurde vermutet, daß ein menschliches IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) aber IgGs anderer Tierarten nicht bindendes Protein vorkommen könnte in Zellen von Streptococcus-Stämmen der Gruppe A (Björck, J. Immunol. 133, (1984) 969). Ein solches Protein ist jedoch nicht isoliert worden. Zwei Typen von IgG-Fc-Bindungsproteinen sind aus Streptococcus der Gruppe A isoliert worden, von denen das eine menschliches IgG (IgG 1, IgG2 und IgG4), IgG des Schweins und IgG des Kaninchens bindet und das andere spezifisch menschliches IgG3 bindet (Boyle et al., Bio/Technology 5, (1987) 697).
- Es ist nicht bekannt, ob ein solches, spezifisch menschliches IgG (IgG 1, IgG2, IgG3 und IgG4) bindendes, aber IgGs der meisten anderen Tierarten und menschliches IgA, IgD, IgE und IgM nicht bindendes IgG-Fc-Bindungsprotein existiert oder nicht, und ob eine ausreichende Menge eines derartigen Proteins stabil gewonnen werden kann oder nicht.
- Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist daher, spezifisch menschliches IgG bindende Proteine bereitzustellen. Die Lösung dazu wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen dargelegten Ausführungsformen erreicht. Sie beruht auf dem Befund, daß der zu Streptococcus der Gruppe A gehörende Streptococcus sp. AP1 ein Protein mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften produziert. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein das Protein codierende Gen und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, bei dem das Gen verwendet wird.
- Die vorliegende Erfindung stellt daher ein neues Protein bereit, das fähig ist zur spezifischen Bindung von menschlichem IgG und nützlich zur Analyse und Aufreinigung von menschlichem IgG, zur Entfernung oder Adsorption von überschüssigem IgG aus Blut und zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten. Sie stellt ebenfalls ein das Protein codierendes Gen und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins im industriellen Maßstab bereit.
- Das erfindungsgemäß bereitgestellte Protein, auf das nachstehend als Protein H Bezug genommen wird, ist ein Protein, das fähig ist zur Bindung an das Fc-Fragment von Immunglobulinen und das produziert wird von einem Streptococcus-Stamm der Gruppe A. Es weist die folgende Bindungsspezifität auf:
- i) Es bindet menschliches IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) und Kaninchen-IgG;
- ii) Es bindet nicht IgGs von Maus, Ratte, Rind, Schaf und Ziege;
- iii) Es bindet nicht menschliches IgA, IgD, IgE und IgM;
- oder die folgende Bindungsspezifität:
- i) Es bindet stark menschliches IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), menschliches IgG-Fc und Kaninchen-IgG;
- ii) Es bindet schwach IgG vom Schwein;
- iii) Es bindet nicht IgGs von Maus, Ratte, Rind, Schaf, Ziege und Pferd;
- iv) Es bindet nicht menschliches IgG-Fab, IgA, IgD, IgE und IgM.
- Der das Protein H produzierende Stamm Streptococcus sp. AP1 ist am Fermentation Research Institute, Japan, hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERMP-10374 und ebenfalls unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-2371 nach dem "BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MlCROORGANISMS FOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEDURE".
- Das Protein H kann mit der Gentechnologie unter Verwendung des Protein H codierenden Gens hergestellt werden.
- Das von dem aus Streptococcus sp. AP1 isolierten Gen produzierte Protein H weist die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz auf. Diese Sequenz wurde durch die DNA-Sequenzanalyse des Gens identifiziert.
- Es versteht sich, daß in der vorliegenden Erfindung spezifisch offenbarte Subfragmente oder Varianten des Proteins H, bei denen die ursprüngliche Aminosäuresequenz modifiziert oder verändert wird durch Insertion, Zusatz, Austausch, Inversion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n), zu dem erfindungsgemäßen Geltungsbereich gehören, sofern sie die vorstehend erwähnte wesentliche Bindungsspezifität behalten.
- Das Protein H codierende Gen kann aus der chromosomalen DNA eines Protein H produzierenden Stammes isoliert werden, wie z.B. aus Streptococcus sp. AP1, auf der Grundlage der Information der in Fig. 4 gezeigten DNA-Sequenz des Proteins H. Die Isolierung des Gens kann wie folgt durchgeführt werden:
- Die chromosomale DNA kann aus Zellen des Protein H produzierenden Stammes nach bekannten Verfahren isoliert werden (Fahnestock, J. Bacteriol. 167, (1986) 870). Durch biochemische Mittel, wie z.B. Spaltung mit einem Restriktionsenzym, oder durch physikalische Mittel wird die isolierte chromosomale DNA dann in Fragmente von geeigneter Länge geschnitten.
- Die sich daraus ergebenden Fragmente werden dann in einen geeigneten Clonierungsvektor eingefügt, wie z.B. λgt11 (Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, (1983) 1194) oder Plasmidvektoren, wie z.B. pUC18 (Messing et al., Gene 33, (1985) 103).
- Die Vektoren werden dann in geeignete Wirtszellen, wie z.B. E.coli, eingebaut.
- Mit einem bekannten Verfahren (Fahnestock et al., J. Bacteriol. 167 (1986) 870) werden die Clone als den resultierenden Transformanten ausgewählt, die das menschliche IgG oder den Fc-Bereich von menschlichem IgG bindendem Protein produzieren.
- Nach der Isolierung der zur Bindung von menschlichem IgG oder des Fc- Bereichs von menschlichem IgG fähigen Proteine aus den resultierenden positiven Clonen gemaß herkömmlichen Verfahren werden die Bindungsspezifitäten der Proteine bestimmt, um die Protein H produzierenden Clone auszuwählen. Fig. 2 zeigt die Bindungsspezifität von Protein H.
- Nach der Isolierung der DNA-Insertion des Clones mit herkömmlichen Verfahren wird die DNA-Sequenz der Insertion mit bekannten Verfahren bestimmt (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, (1977) 5463; Choen et al., DNA 4, (1985)165). Fig. 4 zeigt die DNA-Sequenz der aus dem positiven Clon Fc4 isolierten DNA-Insertion. Fig. 5 zeigt die DNA-Sequenz das aus dem genannten Clon isolierten, Protein H codierenden Strukturgens.
- Die Erfindung bezieht sich auch auf DNA-Sequenzen, die mit der identifizierten DNA-Sequenz unter herkömmlichen Bedingungen hybridisieren und die ein Protein codieren, das im wesentlichen die gleichen Bindungseigenschaften zeigt wie das genannte Protein H. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff "herkömmliche Bedingungen" auf die Hybridisierungsbedingungen, bei denen der Tm-Wert zwischen etwa Tm-20 und Tm-27 liegt. Strenge (stringente) Hybridisierungsbedingungen werden bevorzugt.
- Bei Genen, die exprimiert werden sollen, ist es notwendig, daß sie Expressionskontrollbereiche enthalten, wie z.B. Promotor, Terminator und dergleichen. Das in Fig. 4 gezeigte Gen enthält solche notwendigen Expressionskontrollbereiche.
- Die Expression von Genen kann erreicht werden durch Expressionsvektoren mit den notwendigen Expressionskontrollbereichen, in die nur das Strukturgen eingebaut wird. Für diesen Zweck kann vorzugsweise das in Fig. 5 gezeigte Strukturgen verwendet werden. Das Protein H codierende Strukturgen kann aus der DNA-Sequenz von Fig. 4 erhalten oder mit herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden auf der Grundlage der in der vorliegenden Patentbeschreibung wiedergegebenen Aminosäuresequenz.
- Ähnlich wie bei den Expressionsvektoren sind verschiedene Wirts- Vektorsysteme entwickelt worden, von denen die geeignetsten Wirts- Vektorsysteme zur Expression des erfindungsgemäßen Gens ausgewählt werden können.
- Es ist bekannt, daß jede Wirtszelle eine besonders bevorzugte Codonverwendung für die Expression eines gegebenen Gens hat. Die vom Wirt bevorzugten Codons sollten benutzt werden beim Zusammenbau eines in einem gegebenen Wirts-Vektorsystem zu verwendenden Gens. Geeignete, in einem individuellen Wirts-Vektor-System zu verwendende Gensequenzen dem Proteins H können auf der Grundlage der in Fig. 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz entworfen und mit herkömmlichen Syntheseverfahren synthetisiert werden.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur Herstellung von Protein H durch Züchtung einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, in den das Protein H codierende Gen eingebaut ist.
- Das Verfahren umfaßt die Schritte
- i) der Insertion eines Protein H codierenden Gens in einen Vektor;
- ii) der Einführung des resultierenden Vektors in eine geeignete Wirtszelle;
- iii) der Züchtung der sich daraus ergebenden Transformantenzelle zur Produktion von Protein H ; und
- iv) der Gewinnung des Proteins H aus der Kultur.
- Im ersten Schritt wird das aus der chromosomalen DNA von Streptococcus sp. AP1 isolierte oder wie vorstehend erwähnt, synthetisierte, Protein H codierende Gen in einen zur Expression in dem zu verwendenden Wirt geeigneten Vektor inseriert. Die Insertion des Gens kann durchgeführt werden durch die Spaltung des Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym und die Kopplung des Gens daran mit einem üblichen Verfahren.
- Im zweiten Schritt wird der resultierende Vektor mit dem Gen in Wirtszellen eingeschleust. Die Wirtszellen können Escherichia coli, Bacillus subtilis oder Saccharomyces cerevisiae und dergleichen sein. Die Einschleusung des Expressionsvektors in die Wirtszellen kann auf übliche Weise ausgeführt werden.
- Im dritten Schritt werden die resultierenden Transformantenzellen in einem geeigneten Medium gezüchtet, um das Protein H durch Expression des Gens zu produzieren. Die Züchtung kann in einer üblichen Art und Weise durchgeführt werden.
- Im vierten Schritt wird das produzierte Protein H aus der Kultur gewonnen und gereinigt, was mit bekannten Verfahren ausgeführt werden kann. Z.B. werden die Zellen mit bekannten Verfahren zertrümmert, wie z.B. durch Ultraschallbehandlung, Enzymbehandlung oder Zermahlen. Das von den Zellen freigesetzte oder ins Medium sezernierte Protein H wird gewonnen und gereinigt mit üblichen, meistens auf dem Gebiet der Biochemie verwendeten Verfahren, wie z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie unter Verwendung von IgG als Liganden, hydrophobe Chromatographie oder Umkehrphasenchromatographie, die allein oder in geeigneten Kombinationen benutzt werden können.
- Wie vorstehend erwähnt, kann das erfindungsgemäß bereitgestellte Protein zur Identifizierung oder Trennung von menschlichem IgG verwendet werden. Für diese Zwecke kann das Protein in einen Reagens-Satz (Kit) oder in ein Arzneimittel eingebracht werden durch Mischen oder Kombinieren mit geeigneten Reagenzien, Zusatzmitteln oder Trägermitteln.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, daß diese den erfindungsgemäßen Schutzbereich begrenzen.
- Bei den angefügten Zeichnungen stellt Fig. 1 die Aminosäuresequenz des Proteins H dar. Fig. 2 gibt Autoradiogramme wieder, die die Bindungsspezifitaten von Protein G und Protein H gegen verschiedene Antikörper zeigen. Fig. 3 ist ein Diagramm, das die DNA-Insertionen der Clone Fc4 und Fc16 schematisch veranschaulicht. Fig. 4 gibt die DNA-Sequenz der DNA-Insertion im Clon Fc4 wieder. Fig. 5 stellt die DNA-Sequenz des Strukturgens von Protein H dar. Fig. 6 veranschaulicht das Plasmid pPH-1 und dessen Deletionsplasmide, die zur Bestimmung der DNA-Sequenz verwendet wurden. Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsaktivität von Streptococcus sp. AP1 gegen menschliches IgG, IgG-Fc und Maus-IgG zeigt. Fig. 8 gibt Autoradiogramme wieder, welche die Bindungsaktivitäten von aus der periplasmatischen Fraktion von E. coli JM109( pPH-1) gereinigtem Protein H und von Protein G gegen verschiedene Antikörper zeigen.
- In ein Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 20 ul IODO-Gen (1,3,4,6- Tetrachlor-3α, 6α-diphenylglycouril; Pierce and Warriner Ltd.) in einer Dichlormethanlösung gegeben (0,1 mg/ml), die durch Einblasen von Stickstoffgas in das Reaktionsgefaß eingetrocknet wurde, wobei das Reaktionsgefaß schräggestellt war und rotierte. 200 ul Pufferlösung A (50 mM Na-Phosphat-Puffer pH 7,5, 0,01% Pluronic F-68 (BASF-AG)) wurden dem resultierenden Rückstand zugefügt. Der Puffer wurde entfernt, nachdem das Gemisch 10 Minuten im Eisbad stehengelassen worden war. 10 ul 0,5 M Na- Phosphat-Puffer (pH 7,5) und 25 ul IgG-Lösung (5 ug menschliches IgG, 5 ug Maus-IgG, 3,34 ug menschliches IgG-Fc; Cappel Laboratories) wurden in das Reaktionsgefäß gegeben, gefolgt von 2 ul Na¹²&sup5;J-Lösung (IMS 30, tragerfrei, 100 mCi/ml; Amersham Corp.). Bei Eiskühlung und sanftem Schütteln wurde das Gemisch 15 Minuten stehengelassen. Das Umsetzungsprodukt wurde in ein Serumreaktionsgefäß mit 200 ul einer Pufferlösung überführt (10 mM Na- Phosphat-Puffer pH 7,2, 150 mM NaCl), nachdem das Serumreaktionsgefaß, mit der Pufferlösung A (5 ml) in der gleichen Weise behandelt worden war, wie vorstehend erwähnt. Das Gemisch wurde 5 Minuten im Eisbad stehengelassen.
- Die resultierende Lösung wurde auf eine mit Pufferlösung B (30 mM Na- Phosphat-Puffer pH 7,3, 120 mM NaCl, 0,1% BSA) äquilibrierte PD-10-Säule (Pharmacia Fine Chemicals) gegeben und mit Pufferlösung B eluiert. Zur Gewinnung des ¹²&sup5;J-markierten IgG wurden 2 ul Probe von jeder Fraktion (0,5 ml) entnommen und mit einem γ-Zähler (Ria Gamma "Quatro"; LKB Corp.) vermessen.
- 2,24 x 10&sup7; cpm/ug (1,12 x 10&sup8; cpm/ml) ¹²&sup5;J-menschliches IgG, 8,98 x 10&sup7; cpm/ug (3 x 108 cpm/ml) ¹²&sup5;J-menschliches IgG-Fc und 2,42 x 107 cpm/ug (1,21 x 10&sup8; cpm/ml) ¹²&sup5;J-Maus-IgG wurden auf diese Weise erhalten.
- Mittels einer Impföse wurden 5 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium (Difco laboratories) mit Streptococcus sp. AP1-Zellen beimpft und 10 Stunden bei 37ºC bebrütet. Eine 2 ml-Portion der Kulturlösung wurde 100 ml Todd-Hewitt-Medium hinzugefügt, 13 Stunden bei 37ºC bebrütet und zur Zellernte zentrifugiert
- Die Zellen wurden gewaschen mit 100 ml Pufferlösung C (30 mM Na- Phosphat-Puffer pH 7,2, 120 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 00,02% NaN&sub3;) und verdünnt mit Pufferlösung C, wodurch Suspensionen mit unterschiedlichen Zellkonzentrationen zwischen 10&sup7; bis 10¹&sup0; cfu (koloniebildende Einheiten)/ml resultierten. Eine 200 ul-Portion jeder Suspension wurde in ein Serumreaktionsgefäß gegeben, gefolgt von ¹²&sup5;J-markiertem IgG (10 ng menschliches IgG, 5,2 ng menschliches IgG-Fc, 10 ng Maus-IgG), das Gemisch gerührt und noch 2 Stunden bei 37ºC stehengelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 2 ml Pufferlösung C hinzugefügt und zur Zellernte zentrifugiert. Die Menge des an die Zellen gebundenen, ¹²&sup5;J-markierten IgG wurde mit einem γ-Zähler gemessen nach Wiederholung der gleichen Zellbehandlung mit 2 ml Pufferlösung C.
- Wie die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, ist bewiesen worden, daß Streptococcus sp. AP1 menschliches IgG und IgG-Fc bindet, aber Maus-IgG nicht.
- Zellen von Streptococcus sp. API wurden mit einer lmpföse in 10 ml Todd- Hewitt-Kulturmedium geimpft und 13 Stunden bei 37ºC bebrütet. Ein 8 ml-Teil der Kultur wurde zu 400 ml Todd-Hewitt-Medium gegeben und 3 Stunden bei 37ºC gezüchtet (A&sub6;&sub6;&sub0; 0,6). Die Kultur wurde erneut 1 Stunde bebrütet nach der Zugabe von 22 ml 10% Cystein und 26 ml 0,4 M D,L-Threonin. Dann wurden 250 ml 15 % Glycin hinzugefügt und die Züchtung für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit 0,2 M Natriumacetat gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden suspendiert in 40 ml 27% Saccharose und 10 mM EDTA enthaltende Pufferlösung D (0,15 M NaCl, 0,015 M Na&sub3;-Citrat pH 7,4 - 7,6). 2500 Einheiten Mutanolysin (Sigma Chemical Co.) wurden der Suspension hinzugefügt und diese 3 Stunden bei 37ºC bebrütet. 4 ml 10% SDS und Proteinase K (0,2 mg/ml) wurden dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und dieses über Nacht bei Raumtemperatur bebrütet. Nach Phenol- und darauffolgenden Etherextraktionen wurde das zweifache Volumen Ethanol der abgesetzten wäßrigen Phase hinzugefügt und die ausgefällte DNA durch Aufwickeln auf einen Glasstab gewonnen.
- Die gewonnene DNA wurde in 5 ml Pufferlösung D gelöst und 1 Stunde mit RNase A (100 ug/ml) bei 37ºC inkubiert. Danach wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung zur Rückgewinnung der DNA durchgeführt.
- Die Ausbeute an chromosomaler DNA belief sich auf etwa 1 mg.
- Die in Beispiel 2 erhaltene chromosomale DNA (etwa 100 ug) wurde gelöst in 200 ul einer 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthaltenden Pufferlösung und durch eine für Injektionen verwendete Nadel (27G) hindurchgedrückt, um DNA-Fragmente von 2 bis 10 kb zu scheren. Ungefähr 10 ug der erhaltenen DNA-Fragmente wurden einer Lösung hinzugefügt, die 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mg/ml BSA, 50 uM dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) und 10 Einheiten T4-DNA-Polymerase enthielt, und 2 Stunden bei 24ºC umgesetzt, wodurch sie mit glatten Enden versehen wurden. Dann wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung durchgeführt und die so zurückgewonnenen, mit glatten Enden versehenen DNA-Fragmente 50 ul einer Lösung hinzugefügt, die 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 80 uM S-Adenosylmethionin und 200 Einheiten EcoRI-Methylase enthielt, und 20 Minuten bei 37ºC umgesetzt, wodurch sie methyliert wurden. Dann wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung durchgeführt und die so zurückgewonnenen, methylierten DNA-Fragmente 12 Stunden bei 16ºC behandelt mit einem kommerziell erhältlichen EcoRI-Linker, der unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ligierungssatzes (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) bereits phosphoryliert worden war. Das resultierende Umsetzungsprodukt wurde einer Lösung hinzugefügt, die Puffer E (10 mM Tris- HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) und 200 Einheiten EcoRI enthielt, und 12 Stunden bei 37ºC umgesetzt.
- Nach Beendigung dieser Umsetzung wurden Phenolextraktion und Isopropanolfällung zur Rückgewinnung der DNA durchgeführt.
- Die so erhaltene DNA (ungefähr 0,5 ug) wurde 16 Stunden bei 16ºC umgesetzt mit 1ug λgt11-DNA (Protoclone λgt11-System: Promega Biotech Corp.) in 13 ul einer Lösung, die Puffer F (66 mM Tris-HCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,1 mM ATP) und 400 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt.
- Die ligierten DNAs wurden unter Verwendung eines in vitro- Verpackungssatzes (Gigapack Gold; Stratagene Corp.) in Phagen verpackt und als Genbank von Streptococcus sp. AP1 verwendet. Die Verpackungseffizienz betrug 3,2 x 10&sup6; pfu (plaquebildende Einheiten)/ug λgt11-DNA, wie mit E. coli Y1090 gemessen.
- E. coli Y1090 wurde bis A&sub6;&sub6;&sub0; = 0,6 in LBM-Medium gezüchtet {LB-Medium (1%Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl; pH 7,2), 10 mM MgSO&sub4;, 0,2% Maltose, 50 ug/ml Ampicillin}. Von dieser Kultur wurden 0,2 ml entnommen und zur Zellernte zentrifugiert.
- Die Zellen wurden in 0,2 ml Pufferlösung G suspendiert (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgSO&sub4;, 0,01% Gelatine), mit 100 ul Pufferlösung G und 7,6 ul Lösung der Genbank-Phagenpartikel (5 x 10&sup4; pfu) gemischt und 20 Minuten bei 37ºC bebrütet. 7 ml Weichagarlösung (LBM-Medium, 0,4% Weichagar, 47ºC) wurden diesem Umsetzungsgemisch hinzugefügt, verrührt und damit eine LBM-Platte (Durchmesser 150 mm) überschichtet. Nach 3-stündiger Bebrütung bei 42ºC wurde die Platte mit einem Nitrocellulose-Filter bedeckt (BA 85, Durchmesser 142 mm; Schleicher und Schuell AG), das 5 Minuten in eine 20 mM IPTG-Lösung eingetaucht und dann getrocknet worden war, und 16 Stunden bei 37ºC bebrütet.
- Nach Abschluß der Bebrütung wurde das Nitrocellulose-Filter abgenommen. Dann wurde das Verfahren bei Raumtemperatur unter langsamen Schütteln wie folgt weitergeführt:
- Das Nitrocellulose-Filter wurde 5 Minuten in 50 ml Pufferlösung H behandelt (10 mM Veronalpuffer pH 7,4, 0,15M NaCl) und 1 Stunde inkubiert in 50 ml 0,25% Gelatine und 0,25% Tween 20 enthaltender Pufferlösung H . Nach 3- stündiger Inkubation mit menschlichem IgG-Fc-Fragment (2 ug/ml) (Cappel Corp.) in 40 ml 0,1% Gelatine enthaltender Pufferlösung H wurde das Filter dreimal 10 Minuten gewaschen mit jeweils 40 ml 0,1% Gelatine enthaltender Pufferlösung H. Eine 1-stündige Inkubation wurde erneut durchgeführt mit gegen menschliches IgG-Fc gerichtetem Ziegen-Peroxidase-Conjugat (affinitätsgereinigt; Jackson Immunoresearch Laboratories Corp.; 1000-fach verdünnt mit Pufferlösung H, enthaltend 0,1% Gelatine) in 40 ml 0,1% Gelatine enthaltender Pufferlösung H, das Filter dreimal 10 Minuten gewaschen mit 40 ml 0,1% Gelatine enthaltender Pufferlösung H, gefolgt von einem 5-minütigem Waschen mit 40 ml Pufferlösung K (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl). Das Filter wurde 30 Minuten eingetaucht in eine farbentwickelnde Lösung (20 mg 4-Chlor-1-naphthol/6,6 ml Methanol, 20 ul H&sub2;O&sub2;/33,4 ml Pufferlösung K). Von 70 000 Plaques (Lysezonen) wurden 17 purpurn gefärbte Plaques abgesammelt und in 500 ul Pufferlösung G suspendiert. 10 ul Chloroform wurden der Suspension hinzugefügt, das Gemisch 40 Minuten stehengelassen und dann zentrifugiert (10 000 Upm, 1 Minute). Mit dem resultierenden Überstand wurde das gleiche Verfahren wiederholt, wobei sich die stabilen Clone Fc4 und Fc16 ergaben.
- Die von den Clonen Fc4 und Fc16 produzierten IgG-Fc-Bindungsproteine besaßen das gleiche scheinbare Molekulargewicht von 45 kDa, wie mit dem Western-Blotting-Verfahren eingeschätzt wurde.
- Phagenlösungen von Fc4 und Fc16 (400 ul, ungefähr 10¹&sup0; pfu/ml) wurden jeweils mit E. coli Y1090- Kultur (400 ul) gemischt, dazu wurde Weichagarlösung (8 ml) gegeben. Mit dem resultierenden Gemisch wurden 8 LB-Platten überschichtet. Nach 16-stündiger Bebrütung bei 37ºC wurden jeder Platte 15 ml Pufferlösung M (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 8,1 mM MgSO&sub4;, 0,01% Gelatine) hinzugefügt und diese 3 Stunden bei 4ºC geschüttelt.
- Nach Entfernung der Pufferlösungen wurden die Platten mit Pufferlösung gewaschen (2 ml/Platte), die mit der vorher entfernten Pufferlösung vereinigt wurde. 2 ml Chloroform wurden der vereinigten Pufferlösung zugefügt, das Gemisch gerührt und 15 Minuten bei 7000 Upm zentrifugiert.
- Der Überstand wurde erneut zentrifugiert (17 000 Upm, 3 Stunden). Der gewonnene Niederschlag wurde in 0,5 ml Pufferlösung M suspendiert, dazu wurde CsCl bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml gegeben. Die Suspension wurde dann zur Gewinnung der Phagenpartikel zentrifugiert (22 000 Upm; 2 Stunden; 4ºC). Die Phagenpartikel-Suspension wurde gegen eine 50 mM Tris- HCl pH 8,0, 10 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2; enthaltende Pufferlösung dialysiert. Der dialysierten Lösung wurden EDTA (Endkonzentration 20 mM), SDS (Endkonzentration 0,5%) und Proteinase K (Endkonzentration 50 ug/ml) zugegeben, das Gemisch 1 Stunde bei 65ºC inkubiert und mit Phenol extrahiert, gefolgt von Chloroformextraktion.
- Die waßrige Phase wurde gegen eine 10 mNl Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA enthaltende Pufferlösung dialysiert und mit Bthanol zur DNA-Gewinnung gefällt.
- Die erhaltene Phagen-DNA (200 ug) wurde gelöst in 200 ul einer 10 mM Tris- HCl, pH 7,5, und 1 mM EDTA enthaltenden Pufferlösung und das Restriktionsenzym-Spaltmuster untersucht, wobei gefunden wurde, daß die Clone Fc4 und Fc16 besondere DNA-Insertionen aufwiesen, wie in Fig. 3 gezeigt.
- Gemäß den von Young et al. beschriebenen Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, (1983) 1194) wurde E. coli Y1090 durch die Phagenclone Fc4 und Fc16 mit Prophagen versehen (lysogenisiert).
- Der mit dem Phagen Fc4 lysogenisierte E. coli Y1089 wurde in 40 ml des vorstehend genannten LBM-Mediums geimpft und dann 16 Stunden bei 28ºC bebrütet. Die Impfkultur wurde 2 Litern LBM-Medium zugegeben und dann 145 Minuten bei 28ºC bebrütet.
- IPTG wurde der Kultur bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und diese 45 Minuten bei 42ºC und zusätzlich 1 Stunde bei 37ºC bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und suspendiert in 100 ml einer 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 5 mM EDTA, 5 mM Benzamidin-HCl und 5 mM Jodacetamid enthaltenden Pufferlösung und 10 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Zur Entfernung der Zelltrümmer wurde das Gemisch bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und dann 30 Minuten bei 50 000 Upm. Der Überstand wurde auf eine IgG-Sepharose-Säule (6 Fast Flow; Pharmacia) (10 ml) aufgetragen, die nacheinander gewaschen worden war mit 400 ml Pufferlösung N (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20), 2,5 M NaJ (pH 7,2) und Pufferlösung N, und äquilibriert war mit Pufferlösung N. Nach dem Waschen der Säule mit 300 ml Pufferlösung N wurde eine Elution durchgeführt mit 40 ml 2,5 M NaJ (pH 7,2) zur Gewinnung von Protein H.
- Fraktionen von jeweils 0,5 ml wurden gesammelt und eine kleine, jeder Fraktion entnommene Probenmenge wurde auf ein Nitrocellulose-Filter getüpfelt. Der Nachweis der Protein H enthaltenden Fraktionen wurde dann durchgeführt nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Färbeverfahren.
- Die Protein H enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und einmal dialysiert gegen 1 Liter 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 0,15 M NaCl und 0,25% NaJ enthaltende Pufferlösung und zweimal gegen je 5 Liter 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) und 0,15 M NaCl enthaltende Pufferiösung und dann mit Amicon YM-5 (Amicon Corp.) auf ungefähr 1 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine mit einer 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) und 0,2 M NaCl enthaltenden Pufferlösung äquibrilierten HPLC- Gelfiltrationssäule gegeben (Durchmesser 7,5 mm x 60 cm, TSK gel G3000 SW (Toyo Soda Co., Ltd.)) und mit der gleichen Pufferlösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min. eluiert. Die zwischen der 34. und 36. Minute der Elution gesammelten Protein H-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und mit Amicon YM-5 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine HPLC-Säule vom Umkehrphasen-Typ aufgetragen (Durchmesser 4,6 mm x 7,5 cm, TSK gel Phenyl-5PW RP (Toyo Soda Co., Ltd.)), äquibriliert mit einer 0,1 M Glycin/NaOH (pH 10,0) und 1 mM Tetra-n-butylammoniumhydroxid enthaltenden Pufferlösung, und das Protein H mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (0% T 66%, 2%/Min.) eluiert. Die um die 16. Minute der Elution gesammelten Protein H-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und unter verringertem Druck auf ungefähr 2 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine mit Wasser äquibrilierte PD-10-Säule aufgetragen (Pharmacia Corp.) und mit Wasser eluiert zur Entfernung von Salzen. Bei dem gewonnenen Protein belief sich die Ausbeute auf ungefähr 53 Ug und das Molekulargewicht betrug ungefähr 45 kDa, wie mit der Western-Blotting-Methode unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Färbeverfahrens eingeschätzt wurde.
- Ungefähr 10 ug Protein G (Genex Corp.) und ungefähr 10 ug des vorher erwähnten Proteins H wurden mit Na¹²&sup5;J markiert nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wobei sich 1,28 x 10&sup7; cpm/ug (8,5 x 10&sup7; cpm/ml) ¹²&sup5;J-Protein G und 1,68 x 107 cpm/ug (1,4 x 10&sup8; cpm/ml) ¹²&sup5;J-Protein H ergaben.
- Menschliches IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 (allesamt Protogen Corp.); menschliches IgM, IgG und Serum-IgA, sowie IgGs von Schaf, Kaninchen, Rind und Ziege (allesamt Cappel, Corp.); menschliches IgD und IgE (allesamt Serotec Corp.); Ratten-IgG (Jackson Immunoresearch Corp.); Maus-IgG (Zymed Corp.) und menschliches monoclonales IgG wurden in Pufferlösung K gelöst und mit Pufferlösung K verdünnt auf Konzentrationen von 0,08 bis 10 ug/200 ul. Jede verdünnte Lösung (200 ul) wurde auf ein Nitrocellulose-Filter aufgetragen (Schleicher und Schüll AG) und mit BIO-DOT (BioRad Laboratories) am Filter adsorbiert. Das Filter wurde 1,5 Stunden bei 42ºC inkubiert in 40 ml einer Puffer K, 0,25% Gelatine und 0,25% Tween 20 enthaltenden Pufferlösung und bei Raumtemperatur zweimal 15 Minuten gewaschen in 0,25% Gelatine enthaltender Pufferlösung K. Bei Raumtemperatur wurde das gewaschene Filter 3 Stunden weiter inkubiert in 40 ml einer Lösung, die Pufferlösung K, 0,1% Gelatine und 0,5 ug (1,6 x 10&sup5; cpm/ml) ¹²&sup5;J-Protein G oder 0,5 ug (2,1 x 10&sup5; cpm/ml) ¹²&sup5;J-Protein H enthielt.
- Zum Waschen wurde das Filter 4-mal 15 Nlinuten bei Raumtemperatur inkubiert mit 40 ml einer Pufferlösung K, 0,25% Gelatine, 0,25% Tween 20 und 0,8 M NaCl enthaltenden Lösung. Mittels Autoradiographie wurden die Antikörper-bindenden Eigenschaften von Protein G und Protein H nach Trocknen des Filters analysiert.
- Die in Fig. 2 gezeigten Autoradiogramme beweisen, daß Protein H die Spezifität besitzt,
- i) an menschliches IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) und an Kaninchen-IgG zu binden, und
- ii) an IgGs von Maus, Ratte, Rind, Schaf und Ziege sowie an menschliches IgA, IgD, lgE und IgM nicht zu binden.
- Die in Beispiel 3 erhaltene Phagen-DNA (ungefähr 10 ug) des Clons Fc4 wurde 5 Stunden bei 37ºC inkubiert in 100 ul einer Lösung, die Pufferlösung P (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT), 30 Einheiten SacI und 42 Einheiten KpnI enthielt. Nach Beendigung der Umsetzung wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung durchgeführt zur Gewinnung der Phagen-DNA. Plasmid pUC18 (ungefähr 8 ug) wurde andererseits 10 Stunden bei 37ºC inkubiert in 30 ul einer Pufferlösung P, 20 Einheiten SacI und 14 Einheiten KpnI enthaltenden Lösung. Nachfolgend wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung zur DNA-Gewinnung durchgeführt. Die gewonnene DNA wurde in 50 ul 1M Tris-HCl (pH 8,0) gelöst und 30 Minuten bei 65ºC inkubiert mit 0,36 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Nach der Zugabe von 0,36 Einheiten BAP wurde das Umsetzungsgemisch erneut inkubiert für weitere 30 Minuten bei 65ºC. Nachfolgend wurden Phenolextraktion und Ethanolfallung zur DNA-Gewinnung durchgeführt.
- In 30 ul einer Puffer E und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase enthaltenden Lösung wurden das BAP-behandelte pUC18 (0,5 ug) und die mit SacI und KpnI verdaute Phagen-DNA (0,1 ug) 16 Stunden bei 16ºC inkubiert. Mit diesem Umsetzungsgemisch wurden E. coli JM109-Zellen transformiert und Ampicillinresistente Transformanten gewonnen, von denen Plasmid-DNA hergestellt wurde. Durch Analyse der Restriktionsenzym-Spaltmuster wurde ein Plasmid pPH-1 enthaltender Transformant ausgewählt, wie in Fig. 6 gezeigt.
- Plasmid pPH-1 (ungefähr 10 ug) wurde 8 Stunden bei 37ºC inkubiert in 25 ul einer Puffer E, 12 Einheiten BamHI und 12 Einheiten PstI enthaltenden Lösung. Dann wurde die resultierende DNA durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen und mit einem Deletionskit für Kilobasensequenzen behandelt (Takara Shuzo Co., Ltd.). Mit der DNA wurden E. coli JM109-Zellen transformiert und Ampicillin-resistente Transformanten gewonnen, von denen Plasmid-DNA hergestellt wurde. Im Anschluß daran wurden durch die Analyse der Restriktionsenzym-Spaltmuster Transformanten ausgewählt, welche die in Fig. 6 gezeigten Deletionsplasmide enthielten.
- Die Deletionsplasmide und pPH-1 (jeweils ungefähr 3 ug) wurden gelöst in jeweils 20 ul einer 2ul 2N NaOH und 2 ul 2 mM EDTA enthaltenden Lösung und 5 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Durch Ethanolfällung wurde die DNA gewonnen und die Nucleotidsequenz bestimmt mit SEQUENASE (U.S. Biochemical), [α-³²P]-dCTP (800 Ci/mmol; Amersham Co., Ltd.) und dem Primer M3 (Takara Shuzo Co., Ltd.).
- Die Nucleotidsequenz des aus der chromosomalen DNA von Streptococcus sp. AP1 stammenden DNA-Fragment es wird in Fig. 4 veranschauIicht. Das DNA- Fragment enthält Promotorbereich, SD (Shine-Dalgarno)-Sequenz und das Strukturgen für das Protein H, das eine aus 376 Aminosäuren bestehende (einschließlich Met als Startpunkt) Aminosäuresequenz codiert, am Initiationscodon ATG beginnend und mit dem Terminationscodon TAA endend.
- Das Strukturgen codiert die aus 376 Resten bestehende, mit Met beginnende und mit Asn endende Aminosäuresequenz, wie in Fig. 5 gezeigt. Die aus 41 Resten bestehende, mit Met beginnende und mit Ala endende N-terminale Aminosäuresequenz besitzt gemeinsame Merkmale mit den zur Proteinsekretion bei gram-positiven Bakterien für notwendig gehaltenen Signalsequenzen, und deshalb kann angenommen werden, daß das reife Protein H ein aus 335 Resten bestehendes, mit Glu beginnendes und mit Asn endendes Protein ist.
- Der in Beispiel 5 erhaltene E. coli JM109 (pPH-1) wurde 16 Stunden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, enthaltend Ampicillin mit einer Konzentration von 50 g/ml. Die Kultur wurde 2 Litern des gleichen Mediums hinzugefügt, 4,5 Stunden bei 37ºC bebrütet und zentrifugiert.
- Die periplasmatische Fraktion wurde hergestellt mit dem osmotischen Schock-Kälte-Verfahren (Nossal et al., J. Biol. Chem. 241, (1966) 5055). Ein Gemisch der Cytoplasma- und Membranfraktionen wurde hergestellt durch Ultraschallbehandlung des nach kaltem osmotischem Schock erhaltenen Pellets.
- Bei diesem Verfahren wurden mehr als 95% der p-Galactosidase-Aktivität in dem Gemisch aus Cytoplasma- und Membranfraktionen beobachtet, während mehr als 95% der β-Lactamase-Aktivität in der periplasmatischen Fraktion beobachtet wurden.
- Beide Fraktionen wurden mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Western- blotting-Verfahren analysiert. Protein H mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 45 kDa wurde nur in dem Gemisch aus Cytoplasma- und Membranfraktionen nachgewiesen, während Protein H mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 42 kDa in der periplasmatischen Fraktion gezeigt wurde.
- Das Protein H mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 42 kDa wurde aus der in Beispiel 6 erhaltenen periplasmatischen Fraktion gereinigt durch aufeinanderfolgende Chromatographie an IgG-Sepharose und Gelfiltration nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren. Die Ausbeute an Protein H belief sich auf ungefähr 4 mg.
- Mit einem Aminosäure-Sequenzierungsautomaten (Applied Biosystems model 477A amino acid sequencer; Applied Biosystems Corp.) wurde die N- terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins bestimmt als Glu-Gly- Ala-Lys-Ile-Asp-Trp-Gln-Glu-Glu, was identisch war mit der mutmaßlichen N- terminalen Aminosäuresequenz des reifen Proteins H, wie in Beispiel 5 beschrieben.
- Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde das gereinigte Protein H radioaktiv markiert. Die Bindungseigenschaften des radioaktiv markierten Proteins H wurden nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Außer den in Beispiel 4 beschriebenen Immunglobulinen wurde ebenfalls die Bindung an menschliches IgG-Fc und menschliches IgG- Fab (allesamt Cappel Corp.) sowie an Pferde- und Schweine-IgG (allesamt Cooper Corp.) bestimmt.
- Die in Fig. 8 gezeigten Autoradiogramme beweisen, daß Protein H die Spezifität aufweist
- i) an menschliches IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), menschliches IgG-Fc und Kaninchen-IgG stark zu binden
- ii) an IgG des Schweins schwach zu binden;
- iii) an IgGs von Maus, Ratte, Rind, Schaf, Ziege und Pferd nicht zu binden; und
- iv) an menschliches IgG-Fab, IgA, IgD, IgE und IgM nicht zu binden.
Claims (14)
1. DNA-Sequenz, die Protein H mit der folgenden Aminosäure-
Sequenz codiert:
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz die
folgende DNA-Sequenz ist:
3. DNA-Sequenz, beginnend bei Nucleotid 124 und endend bei
Nuoleotid 1128 der DNA-Sequenz nach Anspruch 2.
4. DNA-Sequenz nach Anspruch l, wobei die DNA-Sequenz die
folgende Sequenz ist:
5. DNA-Sequenz, die nit einer DNA-Sequenz nach einern der
Ansprüche 1 bis 4 unter üblichen Bedingungen
hybridisiert und die ein Protein mit den Bindungseigenschalten
von Protein H codiert.
6. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz nach einem
der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
7. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz nach einem
der Ansprüche 1 bis 5 unter der Kontrolle eines
Expressionskontrollbereichs enthält.
8. Wirtszelie, die mit den rekombinanten Plasmid nach
Anspruch 6 oder 7 transforniert ist.
9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dia zur Art Escherichia coli
gehört.
10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit den
Bindungseigenschaften von Protein H, umfassend die Züchtung
einer Wirtszelle nach Anspruch 8 oder 9 unter geeigneten
Bedingungen, Anreicherung des Proteins in der Kultur und
seine Gewinnung daraus.
11. Protein mit den Bindungseigenschaften von Protein H, das
von einer DNA-Sequenz nach einen der Ansprüche 1 bis 5
codiert wird.
12. Reagenzkit zur Bindung, Abtrennung und Identifizierung
von menschlichem immunglobulin G, dadurch
gekennzeichnet, daß es ein Protein nach Anspruch 11 umfaßt.
13. Arzneimittel, umfassend ein Protein nach Anspruch 11 und
gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen
Zusatzstoff oder Träger.
14. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Protein nach Anspruch 11 mit
pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen gemischt
wird.
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