DE68916132T2

DE68916132T2 - Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Messung der Fluoreszenz.

Info

Publication number: DE68916132T2
Application number: DE68916132T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hashimoto; Kyoko Imai; Nee Suzuki Masumi Kawase
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2009-08-26
Also published as: JP2656564B2; EP0355849B1; EP0355849A2; US5324635A; EP0355849A3; DE68916132D1; JPH0259671A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Gerät zum automatischen Messen der Fluoreszenz, und insbesondere auf ein analytisches Verfahren und Gerät, das zur Messung einer fluoreszierenden Substanz anwendbar ist, die durch Hinzufügen eines latent fluoreszierenden Reagenzmittels zu einer zu testenden Probe erzeugt wird.
Bisher wurde ein Radio-Immunoassayverfahren unter Benutzung von Radioisotopen im weiten Umfange angewandt, um auf immunologischer Basis eine kleine Substanzmenge in einer biologischen Probe zu messen. Vor kurzen ist jedoch ein Meßverfahren unter Benutzung von Enzymen oder Liposomen vorherrschend geworden.
Ein auf der Verwendung von Enzymen basierendes Immunoassayverfahren ist beispielsweise in der Druckschrift JP-A-62-50662 offenbart. Bei diesem Beispiel wird ein Komplex bestehend aus Antigen, Antikörper und Enzym auf der Oberfläche eines Kügelchens erzeugt und die Intensität der Fluoreszenz gemessen, die durch eine Enzymreaktion hervorgerufen wird, die sich entwickelt, wenn ein Substrat mit dem Komplex in Berührung gebracht wird.
Obige Druckschrift JP-A-62-50662 verwendet ein gewöhnliches Fluorophotometer, um Reaktionslösungen zu messen, nimmt aber keinerlei Bezug auf ein Gerät, das als Kombination eines automatischen Reaktionssystems und eines Fluorophotometers verwendet wird.
Andererseits ändert sich auf dem Gebiete der automatischen chemischen Analysatoren im Laufe der Zeit der Analysator selber, so daß gemessene Werte durch eine Driftänderung beeinflußt werden, weshalb Gegenmaßnahmen ersonnen worden sind. Beispielsweise offenbart das U.S.-Patent Nr. 4,043,756 die Lichtphotometriemessung von Licht, das durch Reaktionslösungen von zu testenden Proben absorbiert wird, die in Flußzellen gesaugt werden. Ehe die Messung von Testproben durchgeführt wird, wird eine Reaktionslösung bestehend aus einer Bezugsprobe und einer Reagenzmittelblindprobe im Hinblick auf das Korrigieren einer Standardkurve gemessen, wobei eine Driftveränderung des Analysators an sich unter Benutzung einer korrigierten Standardkurve berichtigt wird.
Wenn durch Einbauen eines Fluorophotometers in einen automatischen Analysator ein Immuoanalysator konstruiert wird ist es wichtig, bei einem im praktischen Einsatz befindlichen Immunoanalysator eine hohe Stabilität des Erfassungssystems und eine hohe Zuverlässigkeit der Meßergebnisse zu gewährleisten. Bei der Immunitätsmessung wird eine quantitative Messung einer geringen Menge von Antigenen oder Antikörpern in einer biologischen Probe erforderlich, wobei eine Leistungsanomalie des für die Fluorophotometrie verwendeten optischen Systems zu einer Beeinträchtigung der Analyse kleiner Mengen führt. Weiter ist bei der Analyse kleiner Mengen der Reagenzmittelabbau ein den Meßfehler vergrößernder Faktor.
Das obengenannte U.S.-Patent Nr. 4,043,756 beschreibt Driftänderungen des Analysators, zieht aber nicht die Leistungsverschlechterung des optischen Systems und den Reagenzmittelabbau in Betracht. Eine in dieser Literatur benutzte Bezugsprobe ist eine Reaktionslösung, die durch Reagierenlassen des gleichen Elementes als Targetelement in einer Testprobe in der gleichen Weise hergestellt wird. In der Immunoanalyse ist es jedoch schwierig, eine chemisch stabile Lösung einer Substanz zu erhalten, die im Rahmen von Reaktionen als Bezugsprobe benutzt werden kann. Die Druckschrift U.S.-A-4536655 offenbart ein Verfahren und ein Gerät zur Durchführung des Verfahrens, bei dem Fluoreszenzmessungen aus Eichmittelgefäßen (wells) bei der Berechnung der Pegel kritischer Komponenten in Proben, die fluoreszieren, verwendet werden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens und eines Gerätes, die automatisch entscheiden, ob ein für die Fluoeszenzmessung geeigneter Analysator das richtige Leistungsvermögen hält.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens und eines Gerätes, das hochgradig genaue Ergebnisse der Fluorophotometrie eines Targetelementes in einer zu testenden Probe erzielen kann.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens und eines Gerätes, das die Meßstabilität verbessern kann, wenn eine quantitative Messung der Konzentration von Antigenen oder Antikörpern in einer Testprobe indirekt durch Messen der Fluoreszenz durchgeführt wird, die von einer fluoreszierenden Substanz in einer Reaktionslösung stammt, welche das Ergebnis einer Immunoreaktion ist.
Gemäß der Erfindung werden fluoreszierende Substanzen entsprechend der Menge des Targetelementes in einer in einem Reaktionsbehälter enthaltenen Testprobe nachgewiesen, und die von einer Reaktionslösung im Reaktionsbehälter herrührende Fluoreszenzintensität wird mit Hilfe eines Fluorophotometers gemessen.
Dies kann durch die Schritte des Messens der Fluoreszenzintensität einer Bezugsprobe, die fluoreszieren kann; Vergleichen eines vorbestimmten Sollwertes mit einem Meßwert der Bezugsprobe; und Unterbrechen der nachfolgenden Probenahmeoperation durch Pipettiereinrichtungen geschehen, wenn die Vergleichsergebnisse anzeigen, daß der Meßwert kleiner als der Sollwert ist.
Wenn die Vergleichsergebnisse anzeigen, daß der Meßwert größer als der Sollwert ist, kann die nachfolgende Probeentnahmeoperation durch die Pipettiereinrichtungen fortgesetzt werden, und anschließend werden nacheinander eine Reaktiosbehandlung und ein fluorophotometrischer Arbeitungsgang für Universaltestproben durchgeführt.
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm zu Erläuterung der Betriebsweise einer Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 ist eine schematische Draufsicht, die ein Immunoanalysegerät zum Betreiben der Ausführungsform gemäß dem Flußdiagramm der Fig. 1 zeigt;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das ein Beispiel einer Standardkurve T&sub4; (Thyroxin) zeigt;
Fig. 4 ist ein Diagramm, das ein Beispiel einer Standardkurve für TSH 2(schilddrüsenstimulierendes Hormon) zeigt;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung, die der Erläuterung der Reaktion bei einer vierten Ausführungsform der Erfindung dient; und
Fig. 6 ist ein Diagramm, das ein Beispiel einer Standardkurve für TSH zeigt, das bei der vierten Ausführungsform verwendet wird.
Bei einem Immunoanalysegerät, bei dem die Erfindung angewandt wird, wird die Untergrenze der Größe der für die Analyse kleiner Mengen benötigten gemessenen Signale vorher durch eine Eingabeeinheit eingestellt und in einer Speichereinheit gespeichert. Als Fluoreszenzbezugsprobe wird eine Lösung einer chemisch stabilen Substanz, wie beispielsweise Chininsulfat verwendet. Eine zu testende Probe (Universaltestprobe) und die Bezugsprobe werden in entsprechende Reaktionsbehälter in einer sich bewegenden Folge von Reaktionsbehältern pipettiert. Während ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel in den Reaktionsbehälter für die Testprobe eingegeben wird, wird in den Reaktionsbehälter für die fluoreszierende Bezugsprobe kein fluoreszierendes Reagenzmittel eingegeben, so daß die von der Lösung selber herrührende Fluoreszenz gemessen werden kann. Auf diese Weise kann die Fluoreszenzintensität, die im wesentlichen konstant ist, wiederholt gemessen werden, in soweit das Leistungsverhalten des optischen Systems konstant bleibt.
Vor Durchführung der Fluorophotometrie von Reaktionslösungen auf der Basis von Universaltestproben wird die von der Bezugsprobe herrührende Fluoreszenzintensität gemessen, und der Meßwert wird mit einem Sollwert verglichen, der zuvor in einer Speichereinheit gespeichert wurde. Wenn die von der Bezugsprobe stammende Fluoreszenzintensität unter dem Sollwert liegt und damit anzeigt, daß sich das optische System in einem Zustand befindet, der nicht der Bedingung zum Analysieren kleiner Mengen entspricht, wird das nachfolgende Pipettieren der Testprobe mit Hilfe eines Pipettiergerätes unterbrochen, um eine ungültige Messung zu verhindern. In einem solchen Falle überprüft der Bediener die Lichtquelle und die photoelektrischen Detektoren, und ersetzt, wenn nötig, schlecht funktionierende Komponenten durch neue, um es dem optischen System zu ermöglichen, die notwendigen Funktionen wieder zu erfüllen. Nach der Wiederaufnahme der Funktion des optischen Systems wird es dem Pipettiergerät ermöglicht, mit der Probeentnahme bei den Universalproben zu beginnen, und einer kreisförmigen Reaktionsscheibe wird es ermöglicht, mit dem normalen Betrieb zu beginnen. Anschließend werden Testproben, die bereits in mehreren Reaktionsbehälten auf der Reaktionsscheibe enthalten sind, in den unter programmierter Steuerung ablaufenden Analyseprozeß eingeführt, ohne ausgesondert zu werden.
Wenn die Ergebnisse des Vergleichs zwischen dem für die Bezugsprobe gemessenen Wert und dem Sollwert anzeigen, daß die von der Bezugsprobe herrührende Fluoreszenzintensität den Sollwert überschreitet, was anzeigt, daß sich das optische System in einem befriedigenden Zustand befindet, wird die Fortsetzung des nachfolgenden Pipettierens von Testproben zugelassen.
Bei einer bevorzugten Ausführungform der Erfindung wird die Obergrenze der Werte der Fluorophotometrie einer Reagenzmittelblindprobe zuvor eingestellt und gespeichert. Wenn der nach Analysieren der Hälfte einer Vielzahl von Testproben gemessene Wert der Reagenzmittelblindprobe die Obergrenze überschreitet, wird ein Alarm ausgelöst, der den Reagenzmittelabbau anzeigt und so dem Bediener ermöglicht, das Reagenzmittel gegen ein neues auszutauschen.
Ein Immunoanalysegerät, bei dem die Erfindung angewandt wird, kann in der in Fig. 2 dargestellten Weise aufgebaut werden.
Bezugnehmend auf Fig. 2 wird eine Vielzahl von Reaktionsbehältern 2 in einem Array auf einer drehbaren, kreisförinigen Reaktionsscheibe 1 entlang ihres Umfangsrandes plaziert, und die Reaktionsscheibe 1 wird durch einen Scheibenantriebsmechanismus 31 intermittierend in Drehung versetzt. Der für die Fluorophotometrie geeignete Reaktionsbehälter 2 ist aus einem transparenten Material, wie etwa Glas oder Acrylharz, hergestellt. Ein Fluorophotometer 19 nimmt eine photometrische Position 20 ein, die innerhalb eines thermostatischen Reaktionstanks 6 liegt.
Das Photometer 19 ist ein photometrischer Mehrwellentyp mit einer Vielzahl von Detektoren und richtet den Reaktionsbehälter 2 so aus, daß wenn sich ein Reaktionsbehälter 2 auf der Reaktionsscheibe 1 in der photometrischen Position 20 befindet, ein von einer Lichtquellenlampe 21 ausgesandter Lichtfluß 22 durch den Reaktionsbehälter 2 hindurchtritt. Anregungslicht, also monochromatisches Licht einer vorbestimmten Wellenlänge, wird von oberhalb oder unterhalb des Reaktionsbehälters auf die im Reaktionsbehälter befindliche Lösung gestrahlt. Die von der Lösung ausgesandte Fluoreszenzstrahlung durchquert die Seitenoberfläche des Behälters, und monochromatisches Licht einer vorbestimmten Wellenlänge wird von einer Fotovervielfacherröhre, die als lichtelektrischer Detektor dient, ausgewählt und erfaßt.
Andererseits ist eine Vielzahl von Reagenzmittelbechern 12, die für eine Vielzahl von Arten von Analysesubstanzen benötigt werden, in einem Array auf der Reaktionsscheibe 9 plaziert, die im Uhrzeigersinn oder Gegenuhrzeigersinn drehbar ist. Jeder der Reagenzmittelbecher 12 weist von Vielzahl von (beispielsweise 3) Speicherkammern für die Reagenzmittellösung aut, während Einzelkammern ein erstes Reagenzmittel, ein zweites Reagenzmittel und, soweit nötig, ein drittes Reagenzmittel aufnehmen, das jeweils spezifizierten Analysesubstanzen entspricht.
Die Reagenzmittelscheibe 9 und eine Probenscheibe 8 werden um eine von einem Steuergerät angegebene Anzahl von Schrittlängen um eine zentrale Welle 10 gedreht, wobei diese Drehbewegung durch einen Scheibenantriebsmechanismus 32 bewirkt wird. Mit dieser Konstruktion kann ein Probenbehälter 11, der eine Targettestprobe enthält, und ein benötigter Reagenzmittelbecher 12 auf der Reagenzmittelscheibe 9 an Positionen plaziert und gestoppt werden, an denen die benötigte Testprobe und das Reagenzmittel abgesaugt werden. Probenbecher 11 werden innerhalb eines thermokonstanten Lufttanks auf einer vorbestimmten Temperatur gehalten. Die Reagenzmittelbecher 12 werden mit Hilfe eines Kühltanks auf einer niedrigen Temperatur von 10ºC oder darunter gehalten.
Die Bezugsprobe oder Bezugslösung besteht aus einer Flüssigkeit oder Lösung, die eine Substanz enthält, welche in der Lage ist, durch Selbsterregung zu fluoreszieren, und die beispielsweise aus Chininsulfat, Rhodamin B oder Wasser besteht. Bei der vorliegenden Ausführungsform enthält einer der Reaganzmittelbecher 12 eine Chininsulfatlösung mit einer vorbestimmten Konzentration.
Mit Hilfe eines Pipettenantriebsmechanismus 33 kann ein Arm 14a senkrecht bewegt (orthogonal zur Zeichenebene) und um eine Welle 14 gedreht werden. Der Arm 14a trägt vorne eine Flüssigkeitslade- /entladedüse oder Pipettiersonde 15, die durch einen Flüssigkeitsströmungskanal mit einem Zylinder im Pipettenantriebsmechanismus 33 in Verbindung steht. Die Sonde 15 kann senkrecht in irgendeine der Probenabsaugpositionen auf der Probenscheibe 8, der Reagenzmittelabsaugpositionen auf der Reagenzmittelscheibe 9, der Flüssigkeitsentladepositionen 16 auf der Reaktionsscheibe 1, und in die Sondenwaschposition 17 bewegt werden. Während des ersten Drehzyklus der Reaktionsscheibe 1 kann die Sonde 15 zum Pipettieren einer vorbestimmten Probenmenge aus einem Probenbecher 11 in einen in der Entladeposition 16 stehenden Reaktionsbehälter eingesetzt werden, und während des zweiten Drehzyklus der Reaktionsscheibe 1 kann die Sonde 15 zum Pipettieren einer vorbestimmten Reagenzmittelmenge aus einem Reagenzmittelbecher 12 in den in der Entladeposition 16 stehenden Reaktionsbehälter eingesetzt werden.
Alternativ kann die Sonde 15 während des ersten Drehzyklus der Reaktionsscheibe 1 zum Pipettieren einer Testprobe und eines ersten Reagenzmittels eingesetzt werden, und sie kann während des zweiten und nachfolgenden Drehzyklus der Reaktionsscheibe ein zweites Reagenzmittel und, nötigenfalls, ein drittes Reagenzmittel pipettieren.
Wenn eine Analyseoperation einer Universaltestprobe, wie etwa ein Blutserum, durchgeführt wird, werden zuvor feste Phasen, an denen Antikörper (oder Antigene) entsprechend der individuellen Analysesubstanz angeheftet sind, also Arten von Antigenen oder Antikörpern, in Reaktionsbehältern untergebracht. Wenn beispielsweise ein Kügelchen als feste Phase benutzt wird, wird die Oberfläche des Kügelchens im voraus beispielsweise mit spezifizierten Antikörpern bedeckt.
Wenn ein Reaktionsbehälter 2, der eine mit Antikörpern besetzte Phase enthält, eine Entladeposition 16 erreicht, wird eine aus einem Probenbecher 11 in die Sonde 15 gesaugte Probe in den betreffenden Reaktionsbehälter entladen. Nach dem Entladen wird das Innere und das Äußere der Sonde 15 mit Hilfe einer Wascheinheit gewaschen, die auch durch das Bezugszeichen 17 bezeichnet wird. Anschließend saugt die Sonde 15 für eine Immunreaktion aus einem gewählten Reagenzmittelbecher 12 eine Reagenzmittellösung ab und gibt das Reagenzmittel in den gleichen Reaktionsbehälter 2, der immer noch in der betreffenden Entladeposition 16 steht. Die Lösung des Immunreaktionsreagenzmittels enthält Antikörper, die durch ein Enzym markiert sind. Anschließend wird die Reaktionsscheibe 1 im Uhrzeigersinn um einen Schritt vorgerückt. Für die nachfolgenden Reaktionsbehälter werden nacheinander ähnliche Probenahmeoperationen von der Sonde 15 durchgeführt, die als Pipettiermechanismus dient.
Indem die Testprobe und das hinzugefügte Immunreaktionsreagenzmittel (d.h. ein erstes Reagenzmittel), enthaltenden Reaktionsbehälter koppelt sich ein Antigen, das als Targetelement in der Probe dient, an einen an das Kügelchen angehefteten Antikörper an, und der durch das Enzym markierte Antikörper koppelt sich an das gekoppelte Antigen an. Durch die Antigen- /Antikörperreaktion werden also auf dem Kügelchen Immunkomplexe gebildet. Wenn der den Immunkomplex enthaltende Reaktionsbehälter den Bereich einer Wascheinrichtung 25 mit einer Vielzahl von Düsen erreicht, wird ein Flüssigkeit enthaltender Teil des Reagenzmittels, das noch nicht an der Reaktion teilgenommen hat, aus dem Reaktionsbehälter entladen, und dementsprechend bleibt das den Immunkomplex aufweisende Kügelchen im Reaktionsbehälter zurück. Im nächsten Schritt wird eine Reinigungslösung in den Reaktionsbehälter gefüllt, und diese wird nach der Reinigung entladen, wobei sie das Kügelchen mit dem Immunkomplex im Reaktionsbehälter zurückläßt. Die beschriebene Kügelchenwaschoperation wird mehrfach wiederholt. Die Waschvorrichtung 25 wird durch einen Waschvorrichtungsantriebsmechanismus 40 zur Ausführung einer senkrechten Bewegung und zum Laden/Entladen eingeschaltet.
Wenn die Reaktionsscheibe 1 weiter vorgerückt wird und der das gewaschene Kügelchen enthaltende Reaktionsbehälter 2 eine Entladeposition 16 erreicht, wird die Sonde 15 eingeschaltet, um ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel, das als zweites Reagenzmittel dient, aus einem spezifizierten Reagenzmittelbecher 12 abzusaugen und als zweites Reagenzmittel dem Kügelchen zugegeben. Als latent fluoreszierendes Reagenzmittel kann eine Lösung verwendet werden, die ein Substrat enthält, das sich in eine fluoreszierende Substanz umwandeln kann. Im Reaktionsbehälter 2 reagiert das Substrat mit dem an der festen Phase haftenden Enzym derart, daß es sich in die fluoreszierende Substanz umwandelt.
Wenn die Reaktionsscheibe 1 erneut schrittweise vorgerückt wird und der die fluoreszierende Substanz enthaltende Reaktionsbehälter 2 die Photometrieposition 20 erreicht, wird durch das Fluorophotometer 19 angeregtes Licht auf den Behälter gestrahlt, um die von der Reaktionslösung im Behälter herrührende Fluoreszenzintensität zu messen. Ausgangssignale, die von einer Vielzahl von Photodetektoren des Photometers 19 erzeugt werden, werden an einen Multiplexer 34 angelegt, an dem nur ein auf dem geforderten monochromatischen Licht basiertes Signal gewählt bzw. abgenommen wird. Das gewählte Signal wird durch einen Analog- /Digitalumsetzer 35 in ein digitales Signal umgewandelt, das seinerseits über eine Schnittstelle 36 unter der Kontrolle einer Zentraleinheit ZE 37 in einer Speichereinheit 38, wie etwa einem Direktzugriffsspeicher oder einer Diskette, gespeichert wird.
Vor der Durchführung einer Reihe von Analyseoperationen, die oben für eine Blutprobe beschrieben wurden, die als Universaltestprobe dient, mit dem in Fig. 2 dargestellten Analysator, wird die Untergrenze zur Bestimmung des Leistungsverhaltens des optischen Systems, sowie die Obergrenze zur Bestimmung des Abbaus des Reagenzmittels im Analysator eingestellt. Durch den Bediener, der die Tastatur einer Betriebstafel 41 betätigt, wird ein Sollwert zur Bestimmung des Leistungsverhaltens des optischen Systems sowie ein annehmbarer oberer Grenzwert zur Bestimmung des Reagenzmittelabbaus eingegeben und unter der Kontrolle der Zentraleinheit 37 in der Speichereinheit 38 abgelegt.
Zur Vereinfachung der Beschreibung wird nunmehr ein Beispiel dargestellt, bei dem T&sub4; (Thyroxin) und TSH (ein Thyroid-stimulierendes Hormon) in einem Blutserum gemessen wird. Die genannten Analysesubstanzen werden auf dem Bildschirm einer Kathodenstrahlröhre (CRT) 42 dargestellt und gewählt. Reaktionsbehälter 2, die mit Antikörpern bedeckte Kügelchen enthalten und für entsprechende Analysesubstanzen benötigt werden, werden auf die Reaktionsscheibe 1 gesetzt. Für die Bezugsprobenmessung und die Reagenzmittelblindprobe werden Reaktionsbehälter ohne Kügelchen aufgesetzt. Die Entsprechung zwischen jedem der nacheinander auf der Reaktionsscheibe angeordneten Reaktionsbehälter und jeder Analysesubstanz der Referenzprobe und der Reagenzmittelblindprobe wird erstellt und im Steuergerät gespeichert. Ebenso werden vorher Standardkurven bzw. Arbeitskurven entsprechend den jeweiligen Analysesubstanzen bestimmt und im Steuergerät gespeichert. Fig. 3 zeigt ein Beispiel einer Standardkurve für T&sub4;, während Fig. 4 ein Beispiel für TSH wiedergibt.
Nachfolgend wird unter Bezugnahme auf Fig. 1 die Betriebsweise des in Fig. 2 dargestellten Analysators beschrieben.
In Schritt 101 drückt der Bediener den Startknopf auf der Betriebstafel 41 des Analysators, um die Analyseoperation einzuleiten. Beim Analysegerät wird der Arm 14a des Pipettiermechanismus zuerst eingeschaltet, um eine vorbestimmte Menge Chininsulfatlösung, die als fluorszierende Bezugsprobe dient, aus einem Reagenzmittelbecher 12, der das Chinfnsulfat enthält, in den ersten Reaktionsbehälter zu pipettieren (Schritt 102). Danach wird die Operation des Pipettierens einer Universaltestprobe aus einem Probenbecher 11 entsprechend dem nachfolgenden Reaktionsgefäß 2 eingeleitet (Schritt 103).
Der Pipettiermechanismus wird durch die Steuereinrichtung so gesteuert, daß weder ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel, das ein Substrat enthält, noch ein Reagenzmittel zum Auslösen der Immunreaktion in den mit dem Chininsulfat gefüllten Reaktionsbehälter eingegeben wird. Wenn der die Bezugsprobe enthaltende Reaktionsbehälter die Photometrieposition 20 erreicht, wird die von der Bezugsprobe herrührende Fluoreszenzstrahlung mit Hilfe des Fluorophotometers 19 gemessen (Schritt 104). Die photometrische Messung benutzt eine Erregerwellenlänge von 380 nm, um eine Fluoreszenzwellenlänge von 460 nm zu messen. Die gleiche genannte Erregerwellenlänge wird bei jedem Analyseposten einer Universaltestprobe angewandt.
In Schritt 105 entscheidet die Steuereinrichtung, ob ein Meßwert der von der Bezugsprobe herrührenden Fluoreszenzintensität einen vorbestimmten Sollwert überschreitet. Falls das Vergleichsergebnis anzeigt, daß der Meßwert der von der Bezugsprobe ausgesandten Fluoreszenzstrahlung kleiner als der Sollwert ist, geht die Prozedur nach Schritt 106 weiter. Gleichzeitig gibt die Steuereinrichtung einen Befehl zum Stoppen der Operation an individuelle Mechanismen, einschließlich des Pipettiermechanismus 33 und die Reaktionsscheibe 1, mit der Folge, daß die Analyseoperation unterbrochen wird (Schritt 107). Gleichzeitig wird ein die mangelnde Eignung des optischen Systems für die Analyse kleiner Mengen anzeigende Alarm auf dem Bildschirm der CRT 42 angezeigt (Schritt 108). In diesem Falle endet der Betrieb des Analysegerätes sofort (Schritt 109). Aufgrund der Beobachtung der Alarmanzeige überprüft der Bediener das Fluorophotometer 19 und wechselt die Lichtquellenlampe oder die photoelektrischen Detektoren, falls ihre Wirkung nachgelassen hat, gegen neue aus, um die Leistungsfähigkeit des Analysators wiederherzustellen.
Falls in Schritt 105 die Ergebnisse des Vergleichs anzeigen, daß die von der Bezugsprobe herrührende Fluoreszenzintensität größer als der Sollwert ist, fährt der Pipettiermechanismus 33 mit dem Pipettieren der Universaltestproben fort (Schritt 110). Keine in einem Reaktionsbehälter befindliche Probe wird zur Blindmessung pipettiert, sondern es wird ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel in den Blindmessungsreaktionsbehälter in der gleichen Menge eingegeben, wie die Menge, die der Universaltestprobe hinzugefügt wird. Eine Probenlösung wird in einer Menge von 50ul aus einem Probenbecher 11 in einen Reaktionsbehälter für Universaltestproben pipettiert, und anschließend wird ein Immunreaktionsreagenzmittel in einer Menge von 200ul in den betreffenden Reaktionsbehälter pipettiert (Schritt 111). Als Immunreaktionsreagenzmittel wird beispielsweise eine Lösung verwendet, die einen Antikörper für jede Analysesubstanz enthält, markiert durch ein Enzym.
Im Reaktionsbehälter 2 auf der Reaktionsscheibe 1 erfolgt eine Antigen-/ Antikörperreaktion unter der Bedingung einer Wärmeisolierung bei 37ºC, um auf einem Kügelchen Antigen-/Antikörperreaktionskomplexe zu erzeugen. Der Reaktionsbehälter erreicht den Bereich der Waschvorrichtung 25 dreißig Minuten nach Beginn der Reaktion, und in dem genannten Bereich wird derjenige Teil der Substanzen enthaltenden Lösung, der nicht zur Reaktion gelangt ist, aus dem Reaktionsbehälter entladen. Eine Reinigungslösung in einer Menge von 500ul wird in den Reaktionsbehälter gefüllt, und die benutzte Reinigungslösung wird schließlich aus dem Reaktionsbehälter entladen (Schritt 112). Die Kügelchenwaschoperation unter Benutzung der Reinigungslösung wird dreimal wiederholt.
Andererseits pipettiert der Pipettiermechanismus 14 die Bezugsprobeniösung und das latent fluoreszierende Reagenzmittel in entsprechende Reaktionsbehälter für die Bezugsprobe und die Reagenzmittelblindprobe, die in vorbestimmten Intervallen in der Folge der Reaktionsbehälter angeordnet sind (Schritt 113).
Der Pipettiermechanismus 14 pipettiert dann ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel in den in Schritt 112 gewaschenen Reaktionsbehälter für die Universaltestprobe. Als latent fluoreszierendes Reagenzmittel wird ein Substrat und eine Pufferlösung jeweils entsprechend in einer Menge von 50ul und 200ul hinzugefügt (Schritt 114), und es vollzieht sich bei 37ºC während einer Zeitdauer von 30 Minuten eine Enzymreaktion. Im vorliegenden Beispiel wird als Substrat eine Lösung von 4-Methylumbelliferylphosphat verwendet, während Alkaliphosphatase als Enzym verwendet wird, um die Enzymreaktion durchzuführen. Durch diese Reaktion wird 4-Methylumbelliferon erzeugt, das eine fluoreszierende Substanz ist.
In Schritt 115 wird entschieden, ob der in der Photometrieposition 20 stehende Reaktionsbehälter für die Bezugsprobe bestimmt ist, und in ähnlicher Weise wird in Schritt 116 entschieden, ob der die Photometrieposition erreichende Reaktionsbehälter für die Reagenzmittelbllndprobe bestimmt ist. Für die Reaktionslösung der Universaltestprobe wird die von ihr stammende Fluoreszenzintesität 15 nach Schritt 114 gemessen (Schritt 117). Die Menge des in der Reaktionslösung erzeugten 4-Methylumbelliferons hängt von der Menge der Antigen-/Antikörperreaktionskomplexe auf dem Kügelchen ab.
Wenn der für die Bezugsprobe bestimmte Reaktionsbehälter die Photometrieposition 20 erreicht, zweigt die Prozedur von Schritt 115 nach Schritt 122 ab, bei dem die von der Chininsulfatlösung herrührende Fluoreszenzintensität gemessen wird. Ein im voraus abgespeicherter Korrekturkoeffizient für die Standardkurve wird auf der Basis des Meßwertes der von der Bezugsprobe herrührenden Fluoreszenzintensität (Schritt 123) berechnet und zum Korrigieren der Standardkurve verwendet (Schritt 124).
Wenn der Reaktionsbehälter für die Reagenzmittelblindprobe die Photometrieposition 20 erreicht, zweigt die Prozedur von Schritt 116 nach Schritt 118 ab, bei dem die von der Reagenzmittelblindprobe, die von dem Antigen-/Antikörperreaktionskomplex nicht beeinflüßt worden ist, herrührende Fluoreszenzintensität gemessen wird, und es wird entschieden, ob sie größer als ein im voraus gespeicherter annehmbarer Wert ist (Schritt 119). Falls der für die Reagenzmittelblindprobe gemessene Wert den annehmbaren Wert überschreitet, wird auf dem Bildschirm der CRT 42 ein Alarm angezeigt, der auf den Abbau des latent fluoreszierenden Reagenzmittels hinweist (Schritt 120). Dieser Alarm wird nach Liefern der Analyseergebnisse in Schritt 126 von einem Drucker 43 ausgedruckt.
Falls der für die Reagenzmittelblindprobe gemessene Wert kleiner als der annehmbare Wert ist, folgt die fluorophotometrische Messung der Reaktionslösung der Universaltestprobe, und der Meßwert der von der Reaktionslösung herrührenden Fluoreszenzintensität wird auf der Basis des Wertes der Reagenzmittelblindprobe (Schritt 121) korrigiert und dann für den Vergleich mit der Standardkurve verwendet. Selbst wenn entschieden wird, daß der Wert der Reagenzmittelblindprobe größer als der annehmbare Wert ist, braucht das Analysegerät nicht abgeschaltet zu werden, sondern kann mit der Analyse der Universaltestproben fortfahren, vorausgesetzt, daß der Bediener den Austausch der Substratlösung entsprechend der Alarmanzeige durchführt.
In Schritt 125 wird die Elementenkonzentration entsprechend den Meßwerten für die Universalmeßproben aus der Standardkurve berechnet, die auf der Basis des Meßwertes für die Bezugsprobe und des Meßwertes für die Reagenzmittelblindprobe korrigiert wurde. In Schritt 126 werden die Analysewerte für einzelne Testproben geliefert. Bei diesem Beispiel wird das Verhältnis zwischen dem photometrischen Wert, der bei der Erstellung einer Standardkurve für die Bezugsprobe gemessen wurde, und einem photometrischen Wert, der unmittelbar vor Durchführung der photometrischen Messung der Testprobe für die Bezugsprobe gemessen wurde, benutzt, um die Standardkurve selber zu korrigieren. Alternativ kann aber ein für die Testprobe gemessener Wert auch zuerst durch den Korrekturkoeffizienten berichtigt werden und dann auf die anfängliche Standardkurve angewandt werden, um die Konzentration der Analyseelemente zu berechnen. Wenn die Analyseoperationen für alle Testproben beendet sind, endet auch der Betrieb der einzelnen Mechanismen des Analysegerätes (Schritt 127).

Versuchsbeispiel

Das gleiche Kontrollblutserum wurde in 20 Reaktionsbehälter pipettiert, und T&sub4; und TSH wurden gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Flußdiagramm gemessen. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 dargestellt. Nettodaten für individuelle Testproben, die für vor der Korrektur gemessene Werte stehen, sind durch den Zusatz A gekennzeichnet, während Daten, die nach der Korrektur gemessen wurden, mit dem Zusatz B versehen sind. Die Bezugsprobe war eine Chininsulfatlösung. Der bei der experimentellen Ermittlung der in Tabelle 1 aufgeführten Daten photometrisch gemessene Wert für Chinin war 170,3, und der bei der Erstellung der Standardkurve photometrisch gemessene Wert für Chinin war 165,4. Entsprechend besitzt der Korrekturkoeffizient den Wert 165,4/170,3. Tabelle 1 Probe Nr
Nachdem die Daten der Tabelle 1 gemessen worden waren, wurde das gleiche Kontrollblutserum in 10 Reaktionsbehälter pipettiert und der Analysemessung ähnlich der vorhergehenden unterzogen. Die für individuelle Testproben auf diese Weise ermittelten Nettodaten sind durch den Zusatz A gekennzeichnet, während die nach der Korrektur ermittelten Daten durch den Zusatz B' gekennzeichnet sind. Bei dieser Messung betrug der photometrische Wert der Bezugsprobe 175,6. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 2 dargestellt. Da der bei der Erstellung der Standardkurve für die Chininsulfatlösung gemessene photometrische Wert die Größe 165,4 besaß, hat der für die Ermittlung der in Tabelle 2 dargestellten Daten benutze Korrekturkoeffizient den Wert 165,4/175,6. Tabelle 2 Probe Nr.
Für T&sub4; hat der Durchschnittswert der korrigierten Werte in Tabelle 1 die Größe 391,4, während der Durchschnittswert ' der korrigierten Werte in Tabelle 2 die Größe 391,9 besitzt, was deutlich macht, daß selbst wenn die Messung nicht an der gleichen Probenreihe durchgeführt wird, der Einfluß der Drift auf das Analysegerät beseitigt werden kann, um eine hochgradig reproduzierbare Messung zu gewährleisten.
Nachfolgend wird eine zweite Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Bei dieser Ausfährungsform wird wiederum das in Fig. 2 dargestellte Immunanalysegerät verwendet. Als Bezugsprobe wird eine Rhodamin B-Lösung verwendet, wobei ein die Bezugsprobe enthaltender Becher auf der Reagenzmittelscheibe 9 aufgestellt wird. Der Analysator wird ähnlich dem in Fig. 1 dargestellten Flußdiagramm betrieben, um T&sub4; und TSH zu messen. Der Rhodamin B-Lösung wird kein latent fluoreszierendes Reagenzmittel zugegeben, und es wird nur die vom Rhodamin B selber herrührende Fluoreszenzintensität gemessen. Bei dieser Ausführungsform beträgt die Wellenlänge des Anregungslichtes für die Bezugsprobe 550nm, während die von der Bezugsprobe angeregte Fluoreszenzwellenlänge 590nm beträgt.
Bei der zweiten Ausführungsform wurde die Reproduzierbarkeit der Messung in ähnlicher Weise wie bei der vorherigen Ausführungsform überprüft. Es wurden 10 Proben des gleichen Kontrollblutserums zweimal in unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen. Der Wert der Fluoreszenzintensität, die bei der Erstellung der Standardkurve für die Bezugsprobe Rhodamin B gemessen wurde, betrug 451,7; er betrug 438,2 bei der Durchführung der ersten Messung des Kontrollblutserums; und er betrug 420,8 bei der Durchführung der zweiten Messung des Kontrollblutserums. Als die Meßwerte für die Testproben unter Benutzung des Meßwertes für die Bezugsprobe und des Meßwertes für die Reagenzmittelblindprobe korrigiert wurden, ergab sich ein Durchschnittswert der Meßwerte der ersten Messung von 382,1, während der Durchschnittswert der Meßwerte der zweiten Messung 382,7 betrug. Selbst wenn Rhodamin B als Bezugsprobe verwendet wird, kann also der Drifteinfluß beseitigt und der Unterschied zwischen den Chargen ausgeschlossen werden.
Nachfolgend wird eine dritte Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Auch bei dieser Ausführungsform wird wiederum das in Fig. 2 dargestellte Immunanalysegerät verwendet. Als Bezugsprobe wird bei dieser Ausführungsform Wasser benutzt. Zum Messen von T&sub4; und TSH wird das Analysegerät gemäß einem Flußdiagramm betrieben, das dem in Fig. 1 dargestellten ähnlich ist. Bei dieser Ausführungsform erfolgt wiederum keine Zugabe eines latent fluoreszierenden Reagenzmittels, und es wird die vom Wasser selbst herrührende Fluoreszenzintensität gemessen. Die Wellenlänge des Anregungslichtes für das als Bezugsprobe dienende Wasser beträgt 380nm, während die Wellenlänge der von der Bezugsprobe angeregten Fluoreszenzstrahlung 470nm beträgt.
Bei der dritten Ausführungsform wurde auch die Reproduzierbarkeit der Messung untersucht. Es wurden 10 Proben des gleichen Kontrollblutserums zweimal und in verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Der bei der Erstellung der Standardkurve für die Wasserbezugsprobe gemessene Wert der Fluoreszenzintensität betrug 95,56; er betrug 93,24 bei der Durchführung der ersten Messung des Kontrollblutserums; und er betrug 91,73 bei der Durchführung der zweiten Messung. Als die Meßwerte für die Testproben unter Verwendung der Meßwerte für die Bezugsprobe korrigiert wurden, ergab sich bei der ersten Messung für T&sub4; ein Durchschnittswert von 393,0, und bei der zweiten Messung ein Wert von 391,0, während sich bei der ersten Messung für TSH ein Durchschnittswert von 289,7, und bei der zweiten Messung ein Durchschnittswert von 289,6 ergab.
Nachfolgend wird eine vierte Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Bei dieser Ausführungsform wird nicht das Substrat als latent fluoreszierendes Reagenzmittel verwendet, sondern es werden durch Antikörper sensibilisierte Liposomen verwendet. Die Ausführungsform wird nunmehr unter Bezugnahme auf, beispielsweise, TSH als Meßsubstanz erläutert. Es wieder das in Fig. 2 dargestellte Analysegerät verwendet, und es werden eine Bezugsprobe aus Chininsulfat und eine Lösung von dispergierten Liposomen, von denen jedes ein eingeschlossenes FITC als Fluoreszenzmarkierer aufweist, auf der Reagenzmittelscheibe 9 aufgestellt. An die Oberfläche der Liposomen werden Anti-TSH-Antikörper angeheftet. Wie Fig. 5 zeigt, werden die gleichen Anti-TSH-Antikörper 51 an die Oberfläche eines im Reaktionsbehälter 2 enthaltenen Kügelchens angeheftet. Zehn Proben des Kontrollblutserums werden auf der Probenscheibe 8 aufgestellt. Ein Beispiel einer im voraus erstellten Standardkurve ist in Fig. 6 dargestellt.
Bei dieser Ausführungsform folgt der Betrieb des Analysegerätes ebenfalls den Schritten 101 bis 113 der Fig. 1. In Schritt 105 wird entschieden, ob der für die Bezugsprobe Chininsulfat gemessene Wert größer als der Sollwert ist. Wenn das Kontrollblutserum in das Reaktionsgefäß 2 zugegeben wird, hängen sich Antigene 53 (TSH) in der Blutserumsprobe an die Antikörper 51 auf dem Kügelchen 50 an, um Antigen- /Antikörperreaktionskomplexe 54 zu bilden. Anschließend wird ein Reagenzmittel hinzugegeben, das durch Antikörper sensibilisierte Liposomen 55 enthält. Dreißig Minuten nach der Einleitung einer Immunreaktion beginnt die Waschvorrichtung 25 mit der Beseitigung eines Teils des Reagennmittels und eines Teils der Probe, die im Reaktionsbehälter nicht reagiert haben. Nach dem Waschen wird eine Pufferlösung, die eine oberflächenaktive Substanz in einer Menge von 500ul enthält, in den Reaktionsbehälter gegeben. Dies bricht die Umhüllung des Liposoms 55 auf, und das eingeschlossene FITC fließt aus. Der diese Reaktionslösung enthaltende Reaktionsbehälter wird in der Photometrieposition 20 plaziert, woraufhin die fluorophotometrische Messung durchgeführt wird.
Der für die Testproben gemessene Wert wird unter Verwendung der Meßwerte für die Bezugsprobe und die Reagenzmittelblindprobe gemäß dem Flußdiagramm der Fig. 1 korrigiert. Der auf der fluorophotometrischen Messung der Bezugsprobe basierende Korrekturkoeffizient für die Standardkurve betrug 165,4/175,4. Der Mittelwert der Fluoreszenzintensität der gemessenen Werte von 10 analysierten TSH-Proben betrug 270,2, während der korrigierte Durchschnittswert 254,8 betrug.

Claims

1. Fluoreszenzanalyseverfahren, bei dem eine zu testende Probe (11) und ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel (12) in einen Reaktionsbehälter (2) pipettiert wird, und bei dem eine Reaktionslösung, die eine im Reaktionsbehälter erzeugte fluoreszierende Substanz enthält, mit Hilfe eines Fluorophotometers (19) gemessen wird, weiter umfassend die früheren Schritte:

Liefern (102) einer Bezugsprobe (12), die fluoreszieren kann, an einen Reaktionsbehälter, mit Hilfe von Pipettiereinrichtungen (15) vor dem Messen der Reaktionslösung;

Messen (104) der Intensität der von der Bezugsprobe herrührenden Fluoreszenz mit Hilfe des Fluorophotometers;

Vergleichen (105) eines vorbestimmten Fluoreszenzsollwertes mit einem für die Bezugsprobe gemessenen Fluoreszenzwert; und

Veranlassen der Pipettiereinrichtung, die anschließende Probenahmeoperation abzubrechen (106), wenn die Ergebnisse des Vergleiches anzeigen, daß der gemessene Fluoreszenzwert kleiner als der Fluoreszenzsollwert ist; aber Fortsetzen (110) der anschließenden Probenahmeoperation, wenn die Vergleichsergebnisse anzeigen, daß der gemessene Fluoreszenzwert größer als der Fluoreszenzsollwert ist.

2. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bezugsprobe eine Lösung ist, die eine Substanz enthält, die von sich aus fluoreszieren kann.

3. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 2, bei dem die fluoreszenzfähige Substanz aus der Gruppe bestehend aus Chininsulfat, Rhodamin B und Wasser gewählt wird.

4. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, bei dem das latent fluoreszierende Reagenzmittel ein Substrat aufweist, das sich in eine fluoreszierende Substanz verwandeln kann.

5. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, bei dem das latent fluoreszierende Reagenzmittel ein Liposom aufweist, das eine fluoreszierende Substanz enthält.

6. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, das bei Fortsetzung der Probenahmeoperation folgende Schritte ausführt:

Messen (118) der Intensität der Fluoreszenz, die von einer Leerwertlösung in einem Reaktionsbehälter herrührt, um einen Leermeßwert in der Mitte des Meßablaufs einer Vielzahl von Testproben zu erzeugen, wobei die Leerwertlösung keinerlei Testprobe, sondern ein latent fluoreszierendes Reagenzmittel enthält, und

Auslösen (120) eines Alarms, wenn der Leermeßwert größer als eine vorbestimmte, annebmbare obere Grenze ist.

7. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, das bei Fortsetzung der Probenahmeoperation folgende Schritte ausführt:

Erzeugen (117) eines ersten Meßwertes der von der Testprobe ausgesandten Fluoreszenz durch Messen der Intensität der Fluoreszenz, die von einer im Reaktionsbehälter erzeugten fluoreszierenden Substanz herrührt, der die Testprobe und das latent fluoreszierende Reagenzmittel enthält;

Erzeugen (122) eines zweiten Meßwertes, der von der Bezugsprobe ausgesandten Fluoreszenz durch Messen der Intensität der Fluoreszenz, die in der Mitte des Meßablaufs einer Vielzahl von Testproben von der Bezugsprobe herrührt; und

Korrigieren des ersten Fluoreszenzmeßwertes auf der Basis des zweiten Fluoreszenzmeßwertes.

8. Fluoreszenzanalyseverfahren nach Anspruch 1, die bei Fortsetzung der Probenahmeoperation folgende Schritte ausführt:

Erzeugen eines Immunokomplexes (54) eines Antikörpers (oder Antigens) (51), der an eine feste Phase (50) gebunden ist, und eines Antigens (oder Antikörpers) (53), das in einer Testprobe enthalten ist, in einem Reaktionsbehälter, und Markieren des Immunokomplexes durch ein Enzym;

Erzeugen einer fluoreszierenden Substanz durch Zugabe eines Substrats in den den Immunokomplex enthaltenden Reaktionsbehälter; und

Messen der Intensität der Fluoreszenz, die von einer Reaktionslösung herrührt, welche aus der fluoreszierenden Substanz erzeugt wurde, durch das Fluorophotometer.

9. Automatischer Fluoreszenzanalysator, umfassend:

scheibenförmige Reaktionseinrichtungen (1) zum Festhalten und Bewegen einer Vielzahl von Reaktionsbehältern (2);

Pipettiereinrichtungen (15) zum Liefern von Testproben (11) und/oder Reagenzmitteln (12) in die Reaktionsbehälter;

fluorophotometrische Einrichtungen (19) zum Strahlen von Anregungslicht auf einen von der Rekationsscheibe gehaltenen Reaktionsbehälter, und Messen der von einer Lösung im Reaktionsbehälter ausgesandten Fluoreszenz;

Steuereinrichtungen mit einer Speichereinheit (38), die zur Steuerung von Operationen von Organisationselementen im Analysator betriebsbereit sind; und

Eingabeinrichtungen (41) zum Eingeben von Daten in die Speichereinheit;

wobei die Steuereinrichtungen betriebsbereit sind, um einen von den Eingabeeinrichtungen in die Speichereinheit eingegebenen Fluoreszenzsollwert zu speichern; und die betriebsbereit sind, um einen Fluoreszenzmeßwert, der photometrisch von einer Bezugsprobe erhalten wurde, mit einem in der Speichereinheit gespeicherten Fluoreszenzsollwert zu vergleichen; und die anschließende Operation der Pipettiereinrichtungen abzubrechen, wenn die Vergleichsresultate anzeigen, daß der gemessene Fluoreszenzmeßwert kleiner als der Fluoreszenzsollwert ist.

10. Automatischer Fluoreszenzanalysator nach Anspruch 9, der weiter Ausgabeeinrichtungen (42) zum Liefern der Meßergebnisse aufweist, wobei die Steuereinrichtungen betriebsbereit sind, um einen Leermeßwert, der durch Messen einer Reagenzleerwertlösung, die keine Testprobe, aber ein Reagenz enthält, erhalten wurde, mit einer vorbestimmten annehmbaren oberen Grenze zu vergleichen, und um einen Alarm an die Ausgabeeinrichtungen zu senden, wenn die Vergleichsergebnisse zeigen, daß der Leermeßwert größer als die annehmbare obere Grenze ist.