DE68912270T2

DE68912270T2 - Lyophilisiertes MDM enthaltende Zusammensetzung und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE68912270T2
Application number: DE89119819T
Authority: DE
Inventors: Sudhakar S Dr Wagle
Original assignee: Sanol Schwarz GmbH
Current assignee: Sanol Schwarz GmbH
Priority date: 1988-11-01
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: IE893397L; EP0367090B1; ATE100210T1; EP0367090A1; DE68912270D1; IE60788B1; DK542089A; PT92163B; ES2048263T3; DK542089D0; PT92163A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Erkennung von Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillinen und Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zusammensetzung, welche mit Wasser rekonstituiert werden kann und zur Erkennung von Allergie und Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin eingesetzt wird. Die Erfindung betrifft ebenso das Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzung.
Unglücklicherweise induziert das gewöhnlich verwendete Antibiotikum Penicillin an Patienten mit Penicillinallergie oder -Überempfindlichkeit allergische Reaktionen. Häufig sind diese Reaktionen schwerwiegend. In den schlimmsten Fällen induziert Penicillin einen anaphylaktischen Schock, der über Kreislaufkollaps, ventrikuläre Arrhythmie oder Lungenversagen zum Tode führt. In anderen weniger schwerwiegenden, jedoch noch ernsthaften Fällen induziert Penicillin nichttödliche Anaphylaxie und nesselsuchtartige Reaktionen, die diffuse Ausschläge, Schwierigkeiten beim Atmen, abdominale Krämpfe, Ohnmacht, Hypotonie oder Arrhythmien verursachen.
Die Häufigkeit von Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillinen ist beträchtlich. Ärzte und Forscher schätzen, daß bis zu 10 % aller mit Penicillin behandelten Patienten eine allergische Reaktion erleiden. Von diesen sind 10 % lebensbedrohlich. Unmittelbare Reaktionen oder Anaphylaxie treten bei 0,01 % aller mit Penicillin behandelten Patienten auf. Von diesen erweisen sich 9 % der allergischen Anaphylaxiereaktionen als tödlich. Sogar Patienten ohne Vorgeschichte von Penicillinallergie oder -Überempfindlichkeit sind gefährdet, da nesselsuchtartige Reaktionen bei 4,5 % dieser Patienten auftreten.
Penicillinallergie oder -überempfindlichkeit war die Hauptursache, die den Gebrauch dieser ansonsten vorteilhaften Medikation begrenzte. Über viele Jahre haben Ärzte Patienten mit einer Vorgeschichte über Penicillinallergie oder -überempfindlichkeit diese als "allergisch gegenüber Penicillin" bezeichnet und diesen Patienten lebenslang Penicillin vorenthalten. Anstatt Penicillin zu verschreiben, behandelten die Ärzte solch einen Patienten mit alternativen Antibiotika.
Trotz der Verfügbarkeit vieler neuer Antibiotika ist Penicillin in einigen klinischen Fällen immer noch das Mittel der Wahl. Zum Beispiel sind alternative Antibiotika gegenüber Penicillin in der Behandlung von Syphilis bei schwangeren Frauen viel weniger wirksam und weniger verträglich. Ein weiteres Beispiel sind alternative Antibiotika, die zur Behandlung bakterieller Endokarditis nicht so gut geeignet sind wie Penicillin.
In den letzten zwei Jahrzehnten haben Ärzte und Forscher herausgefunden, daß Allergie oder Überempfindlichkeit überdiagnostiziert worden sein könnte. Wenn das wahr ist, könnten viele als "allergisch gegenüber Penicillin" bezeichnete Patienten diese Medikation ohne ernste Reaktion sicher anwenden.
Aus all diesen Gründen hat die medizinische Welt lange eine zuverlässige Methode zur Detektion von Penicillinallergie oder -überempfindlichkeit gesucht.
Der chemische Mechanismus, durch den Penicillin allergische Reaktionen an Patienten mit Allergie oder Überempfindlichkeit auslöst und der Stand der Technik in "scratch" und "intradermalen" Hauttests zur Detektion dieser Allergie oder Überempfindlichkeit wird ausführlich in der Literatur dargelegt. Das Folgende sind nur repräsentative Zitate, welche einen brauchbaren technischen Hintergrund vom Umfeld der Erfindung zur Verfügung stellen.
1. Ressler C., Mendelson L.M.: Skin test for diagnosis of penicillin allergy - current status. Annals of Allergy 1987;59:167.
2. Levine B.B., Zolov D.M.: Prediction of penicillin allergy by immunological tests. J. Allergy 1969;43:231.
3. Adkinson N.F. Jr., Thompson W.L., Maddrey W.C., et al.: Routine use of penicillin skin testing as an inpatient service. N. Engl. J. Med. 1971;285:22.
4. Chandra R.K., Joglekar S.A., Tomas E.: Penicillin allergy. Arch. Dis. Child 1980;55:857.
5. Mendelson L.M., Ressler C., Rosen J.P., et al.: Routine elective penicillin allergy skin testing in children and adolescents: study of sensitization. J. Allergy Clin. Immunol. 1984;73:76.
6. Adkinson, N.F. Jr.: Private Communication, 1981.
7. Green G.R., Rosenblum A.H., Sweet L.C.: Evaluation of penicillin hypersensitivity: value of clinical history and skin-testing with penicilloylpolylysine and penicillin G. J.Allergy Clin. Immunol. 1988;60:339.
8. Sullivan T.J., Wedner H.J., Shatz G.S., et al.: Skin testing to detect penicillin allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 1981;68:171.
9. Solley G.O., Gleich G.J., Van Dellen R.G.: Penicillin allergy: clinical experience with a battery of skin-test reagents. J. Allergy Clin. Immunol. 1982;69:238.
10. Warrington R.J., Simons F.E.R., Ho H.W., et al.: Diagnosis of penicillin allergy by skin testing: the Manitoba experience. Can. Med. Assoc. J. 1978;118:787.
11. Van Dellen R.G., Walsh W.E., Peters G.A., et al.: Differing patterns of wheal and flare skin reactivity in patients allergic to the Penicillins. J. Allergy 1971;47:230.
12. Sogn D.D., Casale T.B., Condemi J.J., et al.: Interim results of the NIAID collaborative clinical trial of skin testing with major and minor penicillin derivatives in hospitalized adults. (abstract) J. Allergy Clin. Immunol. 1983;71 (suppl.):147.
13. Kerns D.L., Shira J.E., Go S. et al.: Ampicillin rash in children: relationship to penicillin allergy and infectious mononucleosis. Am. J. Dis. Child 1973;125:187.
14. Levine B.B:, Ovary Z.: Studies on the mechanism of the formation of the penicillin antigen. III. The N-(D-a- benzylpenicilloyl) group as an antigenic determinant responsible for hypersensitivity to penicillin G.J. Exp. Med. 1961;114:875.
15. Budd M.A., Parker C.W., Norden C.W.: Evaluation of intradermal skin tests in penicillin hypersensitivity. J. AM. Med. Assoc. 1964;190:203.
16. Levine B.B., Redmond A.P.: Minor haptenic determinant- specific reagents of penicillin hypersensitivity in man. Int. Arch Allergy 1969;35:445.
17. Levine B.B:, Redmond A.P., Fellner M.J., et al.: Penicillin allergy and the heterogeneous immune response of man to benzylpenicillin. J. Clin. Invest. 1966;45:1895.
18. Adkinson N.F. Jr., Spence M., Wheeler B.: Randomized clinical trial of routine penicillin skin testing. (abstract) J. Allergy Clin. Immunol. 1984;73(suppl.):163.
19. Saxon, Beall, Rohr, Adelman: Am. Internal Med. 1987; 107:204-215
Siehe ebenfalls U.S.-Patent Nr. 4,316,882, 4,252,784, 4,228,147 und 4,183,910 für Levine und U.S.-Patent Nummern 3,979,508 und 3,867,365 für Stahmann und Wagle patentiert.
In früheren Studien, wie den oben zitierten, wurde gezeigt, daß bei Reaktionen von Penicillin und seinen Abbauprodukten mit Körpergewebe Immunogene gebildet werden, die zum Hervorrufen einer Immunantwort befähigt sind. Die vorherrschende gewebegebundene Komponente ist Benzylpenicilloyl. Wegen ihrer Vorherrschaft wird sie die Hauptantigendeterminante genannt. Penicillin bildet auch in geringeren Mengen noch weitere Antigendeterminanten. Weil diese Determinanten im Vergleich zur Hauptdeterminante in kleineren Mengen gebildet werden, werden sie als Nebendeterminanten (engl.: minor antigenic determinants) bezeichnet. "MDM" steht für "Minor Determinant Mixture".
Die Strukturen von den wichtigen Penicillindeterminanten werden unten gezeigt:
Benzylpenicillin Benzylpenicillosäure Penicilloyl Benzylpenillosäure
Weil Penicillin mit Körpergewebe reagiert, entwickeln Patienten, die mit Penicillin behandelt werden, Antikörper gegen die Medikation. Die meisten Patienten bilden IgG- oder IgM-Antikörper. Diese Antikörper induzieren keine unmittelbare Überempfindlichkeit oder allergische Reaktion.
Andere Patienten entwickeln jedoch IgE-Antikörper. Es sind die IgE-Antikörper, die eine unmittelbare allergische Reaktion auf Penicillin auslösen und diese Reaktionen sind die gefährlichsten. Daher signalisiert die Anwesenheit von IgE-Antikörpern Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin in einem Patienten.
Einige IgE-Antikörper sind spezifisch für die Hauptantigendeterminante Benzylpenicilloyl und andere IgE-Antikörper sind spezifisch für MDM-Stoffe. Während beide, Haupt- und Nebendeterminante, lebensbedrohliche allergische Reaktionen hervorrufen können, werden die MDM-Stoffe mit der Mehrheit von schlimmen unmittelbaren Reaktionen auf Penicillin in Verbindung gebracht.
Testreagenzien, die entweder die Hauptdeterminate oder die MDM-Stoffe enthalten, sind effektiv zur Detektion der Anwesenheit von IgE-Antikörpern. Das am meisten verbreitete Testreagenz zur Detektion jener für die Hauptdeterminante spezifischen IgE-Antikörper ist Penicilloylpolylysin. Dieses Reagenz ist eine synthetische Verbindung von der Benzylpenicilloyldeterminante und einem nichtimmunogenen Trägerstoff.
Bis jetzt haben Testreagenzien zur Detektion jener für MDM- Stoffe spezifischen IgE-Antikörper Kombinationen aus Benzylpenicillin, Benzylpenillosäure, Benzylpenicillosäure, Benzylpenicilloylaminen und N-Penicilloylaminen eines aliphatischen Amins oder einer α-Aminosäure enthalten. Vor kurzem wurde jedoch erkannt, daß die ersten drei dieser aufgelisteten Stoffe die relevanten Nebenantigendeterminanten sind. Daher wird angenommen, daß die Benzylpenicilloylamine keinen klinischen Vorteil für Hauttests bieten.
Die Verwendung von Reagenzien für Haupt- und Nebendeterminanten zur Untersuchung von Penicillinallergie oder -überempfindlichkeit ist sicher und wirksam. Ungeachtet der Patientenvorgeschichte bezüglich Penicillinallergie schließt ein negativer Test mit beiden, Haupt- und Nebendeterminante, eine ernste allergische Reaktion auf Penicillin faktisch aus. Viel weniger ernste verzögerte Reaktionen werden durch einen negativen Test jedoch nicht völlig ausgeschlossen. Andererseits zeigt ein positiver Test, daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit allergisch oder überempfindlich gegenüber Penicillin ist. Solche Patienten sollten nicht auf Penicillin umgestellt werden.
Trotz seiner Wirksamkeit bleiben Probleme mit den zur Detektion von Penicillinallergie oder -Überempfindlichkeit angewandten MDM-Zusammensetzungen bestehen. Vor allem sind MDM- Stoffe in Lösung infolge Abbau von Benzylpenicillin, Benzylpenillosäure und Benzylpenicillosäure instabil. Dieser Abbau erfolgt zum großen Teil durch Epimerisierung dieser Stoffe. Zum Beispiel ist die Epimerisierung so schnell, daß 34 % der Benzylpenicillosäure und 30 % der Benzylpenillosäure in nur einer Stunde bei Raumtemperatur epimerisieren. Daher konnten bis vor kurzem nur frisch hergestellte MDM-Zusammensetzungen zuverlässig angewandt werden. Wegen der Instabilität der MDM-Stoffe waren sie kommerziell nicht verfügbar.
Wie im vorherigen Stand der Technik offenbart, können bestimmte MDM-Stoffe zur Herstellung von Zusammensetzungen mit akzeptabler Haltbarkeit lyophilisiert werden. Die U.S.-P 4,316,882 von Levin offenbart eine lyophilisierte MDM-Zusammensetzung, die Benzylpenicillin, Natriumbenzylpenicilloat und ein N-Penicilloylamin von einem aliphatischen Amin oder einer α-Aminosäure enthält. Um eine MDM-Zusammmensetzung mit einer akzeptablen Haltbarkeit zu erhalten, werden diese Stoffe in Einzeldosisfläschchen lyophilisiert, die unmittelbar vor Gebrauch mit einem wässrigen Puffer zu rekonstituieren sind.
Die MDM-Zusammensetzungen von Levine müssen jedoch aufgrund der inhärenten Instabilität der MDM-Stoffe in Lösung bei sehr kalten Temperaturen und daher mit sehr langsamen Raten lyophilisiert werden. Folglich wird die Lyophilisation über 48 Stunden durchgeführt. Während der Lyophilisation wird die Temperatur für 10 Stunden bei ungeführ -40ºC gehalten und anschließend bis zum Erreichen der Umgebungstemperatur um 2ºC pro Stunde angehoben.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe unserer Erfindung, eine lagerstabile MDMZusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die bei höherer Temperatur und daher mit einer schnelleren Rate als aus dem vorigen Stand der Technik bekannt, lyophilisiert werden kann.
Eine weitere Aufgabe unserer Erfindung ist, eine lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die mit Wasser rekonstituiert werden kann, um eine isotonische Lösung mit physiologischem pH zu erhalten, welche zur Detektion von Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin verwendet wird.
Es ist außerdem eine Aufgabe unserer Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, wie aus der folgenden Beschreibung ersichtlich werden wird.
In einer Hinsicht umfassen die erfinderischen Zusammensetzungen: Benzylpenillosäure; Benzylpenicillin; Benzylpenicillosäure; eine Menge eines Alkalimetallsalzes, die eine Anhebung des Schmelzpunktes der gefrorenen MDM-Zusammensetzung bewirkt, so daß sie bei einer höheren Temperatur unter Bedingungen, die zur Vermeidung von Schmelze oder Kollabierung geeignet sind, lyophilisiert werden kann; eine geeignete Menge Puffersubstanz, wobei die Puffersubstanz und das Alkalimetallsalz es gestattet, daß die lyophilisierte MDM-Zusammensetzung mit Wasser zu einer isotonischen Lösung mit einem physiologischen pH rekonstituierbar ist und eine Menge Wasser, die gering genug ist, so daß der Abbau von Benzylpenillosäure, Benzylpenicillin und Benzylpenicillosäure im wesentlichen verhindert wird.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden nach einem neuen Verfahren hergestellt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wässrige Lösung aus Benzylpenillosäure, einem Alkalimetallsalz und einer pH-Puffersubstanz hergestellt. Die Benzylpenillosäure in dieser Lösung wird mit einer ausreichenden Menge wässrigen Natriumhydroxids neutralisiert, so daß die Zugabe von Natriumhydroxid eine Konzentration an Natriumkationen ergibt, die Epimerisierung wirksam verhindert und folglich ein stabilisierendes Salz mit Benzylpenillosäureanionen bildet. Die erhaltene Lösung wird auf eine Temperatur von ungefähr 0ºC bis 5ºC gekühlt.
Unter Aufrechterhaltung einer Temperatur dieser Lösung von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC werden folgende Schritte durchgeführt: Zuerst werden das Benzylpenicillin und die Benzylpenicillosäure in der Lösung gelöst. In der Lösung wird die Benzylpenicillosäure mit einer Menge wässrigen Natriumhydroxids neutralisiert, so daß die Zugabe des Natriumhydroxid zu einer Konzentration an Natriumionen führt, die wirksam Epimerisierung verhindert und folglich ein stabilisierendes Salz mit Benzylpenicillosäure bildet. Anschließend wird der pH-Wert der Lösung auf einen physiologischen pH-Wert eingestellt. Diese Lösung wird dann sterilfiltriert. Diese filtrierte Lösung wird dann in dehydratisierte Behälter verteilt.
Nach Durchführung dieser Schritte, bei denen die Lösung bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gehalten wird, wird die Lösung in den dehydratisierten Behältern bei einer Temperatur von ungefähr -45ºC bis ungefähr -15ºC eingefroren. Nach Einfrieren wird die gefrorene Lösung unter Bedingungen, die wirksam Schmelze und Kollabierung vermeiden, lyophilisiert, wobei ein Produkt gebildet wird, welches einen ausreichend geringen Wassergehalt enthält, so daß der Abbau von der Benzylpenillosäure, dem Benzylpenicillin und der Benzylpenicillosäure im wesentlichen verhindert wird.
Die lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind zur Testung von Patienten auf Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillinen entsprechend den bekannten Testverfahren anwendbar.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung wird aus Sicht der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Verkörperungen besser zu würdigen sein.

A. Die Zusammensetzungen der Erfindung

Mit den neuen, lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann eine verbesserte Detektion von Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillinen erreicht werden. Diese Zusammensetzungen enthalten Benzylpenillosäure, Benzylpenicillin, Benzylpenicillosäure, ein Alkalimetallsalz, eine pH-Puffersubstanz und eine sehr geringe Menge an Wasser. Die Zusammensetzungen der Erfindung werden durch einen geringen Epimerisierungsgrad der MDM-Stoffe charakterisiert. Zum Beispiel werden vorzugsweise solche Bedingungen angewandt, die Epimerisierung vermeiden, so daß mindestens etwa 94,5 % der Benzylpenicillosäure das Stereoisomer (5R,6R)-Benzyl-D-Penicillosäure ist.
Allgemein müssen die MDM-Stoffe, um eine lagerstabile MDM-Zusammensetzung zu erhalten, lyophilisiert werden. Lyophilisation führt zu einem Produkt mit einem Wassergehalt, der ausreichend gering ist, um den Abbau der MDM-Stoffe im wesentlichen zu verhindern. Zur Entfernung einer ausreichenden Menge Wassers wird die MDM-Zusammensetzung in gefrorenem Zustand lyophilisiert. Einfrieren ist erforderlich, weil die Zusammensetzung im gefrorenen Zustand Kristalle bildet, von welchen Wasser rasch extrahiert werden kann. Wenn diese kristalline Struktur während der Lyophilisation nicht aufrechterhalten wird, tritt Schmelze und Kollabierung ein und die MDM-Zusammensetzung kann nicht ausreichend getrocknet werden, um eine lagerstabile Zusammensetzung mit einem geringen Epimerisierungsanteil zu erhalten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine wirksame Menge eines Alkalimetallsalzes zur Erhöhung des Schmelzpunktes von der gefrorenen MDM, so daß die Zusammensetzung bei höherer Temperatur unter Bedingungen, die ausreichen, Schmelze oder Kollabierung zu vermeiden, lyophilisiert werden kann. Als ein Ergebnis kann die kristalline Struktur von dem gefrorenen Lyophilisat über einen höheren Temperaturbereich aufrechterhalten werden als die gefrorene kristalline Struktur einer MDM-Zusammensetzung, die das Alkalimetallsalz nicht enthält. Bei diesen höheren Temperaturen wird Wasser aus dem gefrorenen Lyophilisat viel schneller entfernt. Also lyophilisieren die MDM-Zusammensetzungen infolge der Anwesenheit dieses Salzes bei einer höheren Temperatur und deshalb mit einer schnelleren Rate als Zusammensetzungen, die ein solches Salz nicht enthalten.
Diese Benutzung höherer Temperaturen und einer schnelleren Lyophilisationsrate ist vorteilhaft, weil die Chancen der Produktkollabierung abnehmen. Außerdem wird das Wasser aus der MDM-Zusammensetzung während der Lyophilisation viel einfacher entfernt. Auf das Produkt übertragen erhöht die effizientere Wasserentfernung die Haltbarkeit des lyophilisierten Produktes.
Jedes Alkalimetallsalz, wie z.B. Alkalimetallchlorid, wird in den Zusammensetzungen der Erfindung brauchbar sein. Natriumchlorid und Kaliumchlorid werden bevorzugt, Kaliumchlorid wird besonders bevorzugt. Kaliumchlorid ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besonders gut geeignet, da dieses Salz eine geordnetere kristalline Struktur der gefrorenen MDM-Stoffe als andere Alkalimetallsalze zur Verfügung stellt. Weiterhin erhöht Kaliumchlorid die eutektische Temperatur der gefrorenen Matrix stärker als andere Alkalimetallsalze. Obgleich die physikochemischen Gründe hierfür nicht völlig verstanden werden, resultieren diese überlegenen Lyophilisationseigenschaften von Kaliumchlorid in einer schnelleren Wasserentfernung durch die gefrorene Matrix und erlauben es, daß Lyophilisation bei höheren Temperaturen stattfindet.
Die erfinderische Zusammensetzung enthält eine ausreichend große Menge einer pH-Puffersubstanz, so daß die Puffersubstanz und das Alkalimetallsalz gestatten, daß die lyophilisierte MDM-Zusammensetzung mit Wasser zu einer isotonischen, einen physiologischen pH-Wert von ungefähr 7,3 bis ungefähr 7,5 aufweisenden Lösung rekonstituiert werden kann. Natriumphosphat wird wegen seinen überlegenen Puffereigenschaften bevorzugt. Jedoch können auch andere Puffersubstanzen verwendet werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine ausreichend geringe Menge an Wasser. Es ist bekannt, daß Wasser den Abbau der Benzylpenillosäure, des Benzylpenicillins und der Benzylpenicillosäure bewirkt. Zum Beispiel epimerisiert Benzylpenicillosäure in Anwesenheit von Wasser, was eine Mischung von vier Stereoisomeren ergibt: die Ausgangsverbindung (5R,6R)- Benzyl-D-penicillosäure, (5S,6R)-Benzyl-D-penicillosäure, (5R,6S)-Benzyl-D-penicillosäure und (5S,6S)-Benzyl-D-penicillosäure. Die Ausgangsverbindung epimerisiert in wässriger Lösung innerhalb von 24 Stunden bei ungefähr 4ºC vollständig zu den drei anderen Stereoisomeren.
Zur Veranschaulichung führt Beispiel I Daten über den Abbau beider Substanzen, des Benzylpenicillins und der Ausgangsverbindung der Benzylpenicillosäure in wässriger Lösung auf. Beispiel I - Stabilität von Benzylpenicillosäure und Benzylpenicillin in einer auf pH 7,3 gepufferten Lösung Stunden bis zum Erhalt eines Konzentrationsverlustes von Verbindung Temperatur Grad Celsius berechnete Ratenkonstante erster Ordnung k hr &supmin;¹ MONONATRIUM (5R,6R)-BENZYL-D-PENICILLOAT-TETRAHYDRAT PENICILLIN G KALIUM
In diesem Beispiel wurden Lösungen von Mononatrium (5R,6R)- benzyl-D-penicilloattetrahydrat und Penicillin G Kalium mit der bei Vandino, W.A., et al.: J. Pharm. Sci. 1979; 68: 1316 beschriebenen HPLC-Untersuchungsmethode getestet.
Das Ergebnis in diesem Beispiel zeigt die Stundenanzahl, die in einem Temperaturbereich von 0ºC bis 25ºC zur Erreichung eines Konzentrationsverlustes von 5 % und 10 % von dem Benzylpenicillin und der Benzylpenicillosäure benötigt werden.
Wasser führt durch den Abbau von der Benzylpenillosäure, dem Benzylpenicillin und der Benzylpenicillosäure zu starker Verkürzung der Haltbarkeit von jeder lyophilisierten MDM-Zusammensetzung. Folglich enthalten die lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzungen der Erfindung eine Wassermenge, die ausreichend gering ist, daß der Abbau von der Benzylpenillosäure, dem Benzylpenicillin und der Benzylpenicillosäure im wesentlichen verhindert wird.
Zur Maximierung der Haltbarkeit ist es äußerst vorteilhaft, die Zusammensetzungen der Erfindung in dehydratisierten Behältern zu lagern, die derart getrocknet werden, daß substantiell das gesamte Wasser entfernt worden ist. Auf diese Art gelagert, sind die Zusammensetzungen der Erfindung bei ungefähr 4ºC ungefähr zwei Jahre und bei Raumtemperatur ungefähr ein Jahr stabil.
Die bevorzugte Zusammensetzung enthält: Benzylpenillosäure; von ungefähr 1,60 bis ungefähr 1,85 Mole Benzylpenicillin für jedes Mol Benzylpenillosäure; ungefähr 1,0 Mol Benzylpenicillosäure für jedes Mol Benzylpenillosäure; von ungefähr 9,38 bis ungefähr 10,86 Mole eines Alkalimetallsalzes für jedes Mol Benzylpenillosäure und eine Menge Waser, die ausreichend gering ist, daß Abbau von der Benzylpenillosäure, dem Benzylpenicillin und der Benzylpenillosäure im wesentlichen verhindert wird.

Beispiel II - Wirksamkeit der lyophilisierten Minor Determinant Mixture

Die Zusammensetzungen der Erfindung sind entsprechend den bekannten Testmethoden zur Patiententestung auf Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin verwendbar.
Eine entsprechend Beispiel IV hergestellte lyophilisierte MDM- Zusammensetzung wurde ungefähr eine Woche bei ungefähr 4ºC gelagert. Wegen der verbesserten Stabilität der MDM-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die folgenden Ergebnisse ebenso mit einer entsprechend Beispiel IV hergestellten lyophilisierten MDM-Zusammensetzung erzielt werden, die bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC für bis zu ungefähr zwei Jahre oder bei ungefähr Raumtemperatur für bis zu einem Jahr gelagert wurde. Vor Testung wurde die lyophilisierte MDM-Zusammensetzung mit Wasser zu einer isotonischen Lösung mit einem physiologischen pH-Wert von ungefähr 7,5 rekonstituiert. Die Konzentration der Inhaltsstoffe in der rekonstituierten MDM-Lösung wird in Beispiel VII gezeigt.
Hauttestung wurde mit den Methoden "Ritztest" und "intradermaler Injektionstest" durchgeführt. Der Ritztest beinhaltet oberflächliche Hautanritzung und Inkubation der Ritzfläche mit einem Tropfen MDM-Lösung. Bei negativem Ergebnis des Ritztests wurde zusätzlich ein intradermaler Injektionstest durchgeführt. Der intradermale Test war eine Injektion von ungefähr 0,010 ml bis ungefähr 0,050 ml einer MDM-Lösung. Klinikmuster wurden vor Gebrauch bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gelagert.
Bei Durchführung dieser Tests wurde ein positiver Hauttest, der Penicillinallergie anzeigt, entsprechend den bekannten Richtlinien über Hauttestreagenzien interpretiert. An Patienten mit positivem Ergebnis kann Penicillin aus ethischen Gründen nicht gegeben werden. Ein negativer Test weist keine Reaktionen an der Hautteststelle auf.
In diesen Tests hatten alle Patienten eine Penicillinallergievorgeschichte. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt: Hauttestergebnisse Patient Lyophilisiertes MDM frisches MDM Penicilloylpolylysin Negative Positive
Die Daten veranschaulichen die Wirksamkeit der MDM-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Genauer zeigen diese Ergebnisse, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nach längerer Lagerung genauso effektiv wie eine frisch hergestellte MDM-Zusammensetzung sind. Die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen MDM-Zusammensetzungen wird durch ihre Fähigkeit hervorgehoben, Allergie und Überempfindlichkeit an Personen anzuzeigen, deren Allergie oder Überempfindlichkeit mit Penicilloylpolylysin nicht aufgezeigt werden kann.

B. Das Herstellverfahren der Erfindung

Im Herstellverfahren der Erfindung wird eine wässrige Lösung hergestellt, die Benzylpenillosäure, ein Alkalimetallsalz und eine pH-Puffersubstanz enthält. Vorzugsweise enthält diese Lösung von ungefähr 9,38 bis ungefähr 10,86 Mole von dem Alkalimetallsalz für jedes Mol von der Benzylpenillosäure und ungefähr 1,0 Mol von der pH-Puffersubstanz für jedes Mol von der Benzylpenillosäure.
Die Benzylpenillosäure in dieser Lösung wird mit einer ausreichenden Menge Natriumhydroxid neutralisiert, was zu einer Natriumkationenkonzentration führt, die bewirkt, ein stabilisiertes und lösliches Salz mit der Benzylpenillosäure zu bilden. Der Grund für diese Neutralisation ist, daß Benzylpenillosäure in wässriger Lösung in ein Wasserstoffkation und ein Benzylpenillosäureanion dissoziiert, wobei jedes Ion eine einzige elektrische Ladung trägt. In dieser Form ist die Benzylpenillosäure in wässriger Lösung besonders abbaugefährdet. Folglich müssen zur Stabilisierung des Benzylpenillosäureanions diese elektrischen Ladungen neutralisiert werden. Dies wird durch die Zugabe von dem Natriumhydroxid gewährleistet.
Obwohl andere Basen, wie z.B. Kaliumhydroxid, auch zur Neutralisation verwendet werden können, ist Natriumhydroxid besonders gut zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Im allgemeinen dissoziiert Natriumhydroxid in wässriger Lösung in ein Natriumkation und ein Hydroxidanion, wobei jedes Ion eine einzige elektrische Ladung trägt. Weil jedes Ion von Natriumhydroxid eine einzige Ladung trägt, welche gleich groß, jedoch entgegengesetzt zu den Ladungen der Ionen von Benzylpenillosäure ist, ist Natriumhydroxid mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ionisch vereinbar. Weiter ist entscheidend, daß vor allem Natriumkationen eine große Ionenstärke in wässriger Lösung aufweisen.
Bei Natriumhydroxidzugabe in wässrige Lösung neutralisiert das Hydroxidanion das Hydrogenkation und das Natriumkation bildet ein stabilisierendes Salz mit dem Benzylpenillosäureanion. Nach der Natriumhydroxidzugabe sollte die Natriumkationenkonzentration in der Lösung für eine wirksame Neutralisation der Benzylpenillosäure zwischen ungefähr 95 % bis ungefähr 110 % der Benzylpenillosäureanionenkonzentration liegen.
Nach Neutralisation wird die Lösung auf eine Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gekühlt. Unter Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC werden Benzylpenicillin und Benzylpenicillosäure in der Lösung gelöst. Die entstehende Lösung enthält vorzugsweise ungefähr 1,60 bis ungefähr 1,85 Mole Benzylpenicillin für jedes Mol Benzylpenillosäure und ungefähr 1,0 Mol Benzylpenicillosäure für jedes Mol Benzylpenillosäure. Die Benzylpenicillosäure wird analog Benzylpenillosäure durch Zugabe einer ausreichenden Menge Natriumhydroxid neutralisiert, was zu einer Natriumkationenkonzentration führt, die wirksam ist, ein stabilisierendes Salz mit Benzylpenicillosäureanionen zu bilden. Nach Neutralisation sollte die sich aus dieser Natriumhydroxidzugabe ergebende Konzentration an Natriumkationen in der Lösung für eine wirksame Neutralisation von der Benzylpenillosäure bei ungefähr 95 % bis ungefähr 110 % der Konzentration den Benzylpenillosäureanionen liegen.
Unter Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis 5ºC wird der pH-Wert auf einen physiologischen pH-Wert von ungefähr 7,3 bis ungefähr 7,5 eingestellt. Diese Einstellung des pH-Wertes sollte mit wässrigen Lösungen von entweder Natriumhydroxid oder Salzsäure durchgeführt werden. Nach pH- Werteinstellung wird die Lösung unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC sterilfiltriert. Nach Filtration wird die Lösung in dehydratisierte Behälter verteilt.
Nach Durchführung dieser Schritte, in denen die Lösung bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gehalten wurde, wird die Lösung auf eine Temperatur von ungefähr -45ºC bis ungefähr -15ºC gefroren. Vorzugsweise sollte die Lösung über eine Zeitdauer von ungefähr 20 bis ungefähr 30 Minuten eingefroren werden.
Nach Auflösung der Benzylpenicillosäure in der Lösung sollte, um Epimerisierung von mehr als ungefähr 5,5 % des Stereoisomers (5R,6R)-Benzyl-D-Penicillosäure im wesentlichen zu vermeiden, die Lösung vor Fortfahren zu besagtem Einfrieren nur für eine hinreichend kurze Zeitdauer bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis 5ºC gehalten werden. Schutz vor einem solchen Epimerisierungsausmaß kann gewährleistet werden, wenn die Lösung innerhalb von 15 Stunden nach der Auflösung der Benzylpenicillosäure eingefroren wird.
Nach Einfrieren wird die gefrorene Lösung unter Bedingungen, die wirksam Schmelzrückstand und Kollabierung vermeiden, lyophilisiert, wobei ein lyophilisiertes Produkt mit einem Wassergehalt gebildet wird, der ausreichend gering ist, um Abbau von der Benzylpenillosäure, dem Benzylpenicillin und der Benzylpenicillosäure im wesentlichen zu verhindern. Im allgemeinen können viele lyophilisierte Systeme für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Beispielsweise wird in dem bevorzugten Verfahren die gefrorene Lösung zunächst für ungefähr 8 bis ungefähr 13 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr -45ºC bis ungefähr -15ºC unter einem Vakuum von ungefähr 15 bis ungefähr 30 µm lyophilisiert. Unter Aufrechterhaltung dieses Vakuums wird die gefrorene Lösung weiterhin für ungefähr 7 bis ungefähr 14 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC über eine Gesamttrocknungszeit von ungefähr 20 bis ungefähr 22 Stunden lyophilisiert.
Nach Lyophilisation wird das Vakuum in den dehydratisierten Behältern vorzugsweise mit filtriertem und getrocknetem Stickstoff aufgehoben. Die dehydratisierten Behälter sollten unmittelbar nach Aufhebung des Vakuums versiegelt werden. Nach Versiegelung können die Behälter bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis 5ºC über längere Zeiträume bis zu 2 Jahren oder bei ungefähr Raumtemperatur über längere Zeiträume bis zu ungefähr einem Jahr gelagert werden.
Die im Verfahren der Erfindung verwendeten Behälter kann jeder entsprechend dehydratisierbare Behälter sein. Beispielsweise können die lyophilisierten MDM-Zusammensetzungen der Erfindung in versiegelten Glasampullen oder in mit Gummistopfen verschlossenen Vials hergestellt und gelagert werden. Im Falle der mit Gummistopfen verschlossenen Vials fehlt im Stand der Technik jeglicher Hinweis einer speziellen Behandlung der Gummistopfen. Wir haben jedoch herausgefunden, daß Autoklavierung der Gummistopfen zur Sterilisierung, d.h. Sterilisierung der Gummistopfen mit überhitztem gespanntem Wasserdampf Wassereintritt in die Gummistopfen bewirkt. Falls nicht bei erhöhter Temperatur getrocknet wird, tritt dieses Wasser aus den Gummistopfen aus und kommt mit dem lyophilisierten Produkt in Berührung. Falls dies eintritt, bewirkt das Wasser durch chemische Reaktionen den Abbau der Benzylpenillosäure, des Benzylpenicillins und der Benzylpenicillosäure. Zur Vermeidung dieses Problems sollten die Gummistopfen und Vials bei einer Temperatur von ungefähr 160ºC für ungefähr 1 bis ungefähr 2 Stunden getrocknet werden.
Die lyophilisierten MDM-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sollten bei Lagerung bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC bis zu ungefähr 2 Jahren und bei Lagerung bei Raumtemperatur bis zu ungefähr einem Jahr lagerstabil sein. Bei Rekonstitution mit Wasser sollte die sich ergebende wässrige Lösung der MDM-Zusammensetzung einen physiologischen pH-Wert von ungefähr 7.3 bis ungefähr 7.5 aufweisen.

Beispiel III - Stabilität von MDM: Effekt von ungetrockneten Gummistopfen

In diesem Beispiel werden entsprechend dem Beispiel IV hergestellte lyophilisierte Zusammensetzungen in Behälter mit entweder getrockneten oder ungetrockneten Gummistopfen überführt. Die Proben werden rekonstituiert und mit der von Vandino, W.A. et al.: J. Pharm. Sci. 1979; 68: 1316 beschriebenen HPLC-Methode getestet. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Probe¹ Verbindung Initiale Menge (%) verbleibende Menge² Veränderung X1 ungetrocknete Stopfen X5 getrocknete Stopfen Penicillin Penicilloat Penilloat 1. Getrocknete Gummistopfen wurden bei 160ºC für 1-2 Stunden getrocknet, ungetrocknete Stopfen wurden nach Autoklavierung luftgetrocknet. 2. X1 wurde nach 4 Monaten Lagerung bei Raumtemperatur untersucht. X5 wurde nach 10 Monaten Lagerung bei Raumtemperatur untersucht.
Diese Daten zeigen, daß bei Verwendung ungetrockneter Gummistopfen in der Herstellung lyophilisierter MDM-Zusammensetzungen das Benzylpenicillin, die Benzylpenillosäure und die Benzylpenicillosäure einem substanziellen Abbau unterworfen sind, was zur Reduzierung der Haltbarkeit der lyophilisierten MDM- Zusammensetzung führt. Nach nur 4 Monaten wurde im Falle der Verwendung von ungetrockneten Gummistopfen eine 10fache Zunahme des Verlustes an Benzylpenicillin gefunden, verglichen mit dem Fall der Verwendung von getrockneten Stopfen.

Beispiel IV - Herstellung einer lagerstabilen lyophilisierten MDM-Zusammensetzung, die mit Wasser zu einer Lösung rekonstituiert werden kann, die zur Detektion von Allergie oder Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin verwendet wird.

Zuerst wurden alle Glaswaren und Utensilien vor Gebrauch depyrogenisiert. Füllung und Handhabung der offenen Vials erfolgte unter aseptischen, partikelfreien Bedingungen.
Es wurden 0,1 M Natriumhydroxid- und 0,1 M Salzsäurelösungen hergestellt. Zur Herstellung der Natriumhydroxidlösung wurde 1,00 g Natriumhydroxid ausgewogen und in einen 250 ml Meßkolben überführt. Das Natriumhydroxid in dem Meßkolben wurde dann mit Wasser für Injektionszwecke bis zur Kolbenmarkierung verdünnt. Zur Herstellung der Salzsäure wurden 0,83 ml konzentrierte Salzsäure in einen 100 ml Meßkolben pipettiert. Die Salzsäure in dieser Flasche wurde dann mit Wasser für Injektionszwecke bis zur Kolbenmarkierung verdünnt.
Danach wurden 1,632 g Benzylpenillosäuremonohydrat, 3,680 g Kaliumchlorid und 0,710 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat in einen 250 ml Meßzylinder überführt. Zur Durchmischung wurde ein kleiner Magnetrührkern mit 25 mm Länge und 9 mm Durchmesser in den Meßzylinder plaziert.
Danach wurden zur Neutralisation und Auflösung der Benzylpenillosäure 44,0 ml der 0,1 M Natriumhydroxidlösung in den Meßzylinder zugegeben. Die Innenseite des Meßzylinders wurde dann mit 10 ml Wasser für Injektionszwecke gespült, so daß sich alle festen Bestandteile in der Lösung befanden. Diese Lösung wurde in einem Eisbad auf eine Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gekühlt.
Unter Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC wurden der Lösung in dem Meßzylinder 3,136 g Kaliumbenzylpenicillin (Penicillin G Kalium) zugefügt. Nach der Benzylpenicillinzugabe wurde die Innenseite des Meßzylinders mit 10 ml Wasser für Injektionszwecke gespült. Die Lösung wurde dann bis zu vollständigen Auflösung des Benzylpenicillin durchmischt.
Unter weiterer Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC wurden der Lösung in dem Meßzylinder 2,232 g Mononatriumbenzylpenicilloatmonohydrat zugegeben. Nach Zugabe der Benzylpenicillosäure wurde die Innenseite des Meßzylinders mit 10 ml Wasser für Injektionszwecke gespült. Die Lösung wurde dann bis zur vollständigen Auflösung der Benzylpenicillosäure gerührt. Nach Auflösung der Benzylpenicillosäure wurden zur Neutralisation der Benzylpenicillosäure 48,0 ml der 0,1 M Natriumhydroxidlösung zugegeben.
Danach wurde unter Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC der pH-Wert der Lösung mit 0,1 M Natriumhydroxidlösung oder 0,1 M Salzsäurelösung auf ungefähr 7,30 eingestellt, wobei eine mit Wasser für Injektionszwecke gespülte Kombinations-pH-Elektrode verwendet wurde, die anschließend aus dem Meßzylinder entfernt wurde.
Danach wurde, unter weiterer Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC die Lösung auf das Endvolumen verdünnt, die die für die Lyophilisation vorgesehene Lösung ergab. Zur Durchführung wurde der Rührkern mittels eines an der Außenseite des Meßzylinders befindlichen Magneten aus der Lösung angehoben. Nach Entfernung des Rührkerns wurde das Lösungsvolumen in dem Meßzylinder mit Wasser für Injektionszwecke auf 200 ml aufgefüllt. Nach dieser Verdünnung wurde der Magnetkern wieder in die Lösung abgesenkt, gefolgt von intensiver Durchmischung. Beispiel V legt die Konzentrationen der Inhaltsstoffe in der für die Lyophilisation vorgesehen Lösung dar.
Unter Aufrechterhaltung einer Lösungstemperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC wurde die zur Lyophilisation vorgesehene Lösung durch eine 0,2 µm Membran mit einem Durchmesser von 47 mm in einer Laminarbox ("HEPA") sterilfiltriert. Verwendung der HEPA-Laminarbox gewährleistet partikelfreie Handhabung der Materialien. Der Filter wurde zuerst mit ungefähr 30 ml Lösung gespült. Von diesem anfänglichen Filtrat wurde eine Probe zur HPLC-Analyse in einem Vial gesammelt. Nach Probennahme wurden von der filtrierten Lösung mit einem sterilen 10 ml Meßzylinder Anteile von ungefähr 9 ml bis ungefähr 10 ml in sterile Serumvials verteilt. Mittlerweile wurde entsprechend den Herstellungsangaben ein bubble point Membranintegritätstest durchgeführt. Der Zweck dieses Integritätstests war, sicherzustellen, daß der Filter keine Brüche, Leckagen oder andere Defekte aufweist. Vorzugsweise sollten während der Durchführung des bubble point Membranintegritätstests die sterilen Serumvials unverzüglich verschlossen und in einen -10ºC Gefrierapparat gestellt werden.
Danach wurden die dehydratisierten Behälter mit der zur Lyophilisation vorgesehenen Lösung gefüllt. Das Füllen der dehydratisierten Behälter wurde in einer HEPA-Laminarbox durchgeführt. Zur Durchführung wurde ein Vial mit der Lösung aus dem Gefrierapparat, der auf eine Temperatur von -10ºC eingestellt war, genommen und in einem Eisbad aufgetaut. Während die Lösung in dem Vial auftaute, wurden einige 2 ml Vials in eine Metallschale gestellt. Diese 2 ml Vials wurden dann durch Überführung der Metallschale auf gestoßenes Eis abgekühlt. Nach Auftauen der zur Lyophilisation vorgesehenen Lösung auf eine Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC wurden ohne Verzögerung ungefähr 0.100 ml bis ungefähr 0,105 ml Anteile dieser Lösung unter Verwendung eines Handpipettors mit autoklavierter Polypropylenspitze in die gekühlten 2 ml Vials verteilt. Danach wurden die 2 ml Vials mit getrockneten Gummistopfen verschlossen. Die Gummistopfen sind vor Verwendung ungefähr 1 bis 2 Stunden bei 160ºC getrocknet worden. Nach Verschluß der Vials wurden zwischen ungefähr 35 und 40 Vials mit einer langen Pinzette auf mit gestoßenem Eis gekühlte Stoppering-Tainer (FTS Systems, Inc., Stone Ridge, NY) überführt. Die Inhalte von jedem der 2 ml Vials werden unten in Beispiel VI aufgeführt.
Nach Füllen der Vials wurde die zur Lyophilisation vorgesehene Lösung gefroren. Zur Durchführung wurde ein Gefrierbad mit einer Temperatur von ungefähr -50ºC bis ungefähr -40ºC durch Kühlung einer Mischung von 60 Gew.-% Ethanol und 40 Gew.-% Wasser mit Trockeneispellets hergestellt. Nach Herstellung des Gefrierbades wurde die in den 2 ml Vials enthaltene zur Lyophilisation vorgesehene Lösung gefroren, indem die Stoppering- Tainer für ungefähr 30 Minuten in das Gefrierbad eingetaucht wurden.
Nach Einfrierung wurde die Lyophilisation durchgeführt. Lyophilisation fand in zwei Schritten statt. Zunächst wurde in dem ersten Schritt die gefrorene Lösung bei einer Temperatur von ungefähr -45ºC bis ungefähr -15ºC für ungefähr 8 bis ungefähr 13 Stunden lyophilisiert. Gemessen mit einer McLeod-Meßapparatur betrug das Vakuum während des ersten Trocknungsschrittes ungefähr 15 bis ungefähr 30 µm.
Dem ersten Trocknungsschritt folgte ein zweiter Trocknungsschritt. Während dieses Schrittes wurde die gefrorene Lösung bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC für ungefähr 7 bis ungefähr 14 Stunden bei einem Vakuum von ungefähr 15 bis ungefähr 30 µm, gemessen mit einer McLeod-Meßapparatur, weiter lyophilisiert. Die Gesamttrocknungszeit für beide Schritte betrug ungefähr 20 bis ungefähr 22 Stunden. Wahrscheinlich können die Lyophilisationsbedingungen geändert werden, vorausgesetzt, daß die Produktstabilität unverändert bleibt.
Nach Lyophilisation wurden die zu den Stoppering-Tainern führenden Vakuumröhren abgeklemmt und die Stoppering-Tainer aus dem System entfernt. Danach wurde das Vakuum in den Stoppering-Tainern mit molekularsiebgetrocknetem und durch eine sterile 0,2 µm Filtereinheit mit einem Durchmesser von 50 mm (Millex-GF 50, Millipore Corp. oder ein Äquivalent) filtriertem Stickstoff aufgehoben. Danach wurden die 2 ml Vials in den Stoppering-Tainern versiegelt, indem der Griff des Stoppering- Tainers zur Absenkung der Stopfenplatte entgegen dem Uhrzeigersinn gedreht wurde. Nach Versiegelung der 2 ml Vials wurden die Vials begutachtet. Jedes Vial mit einem Pulverrückstand im Vialhals wurde verworfen. Solche Rückstände sind unerwünscht, da sie die Qualität der Versiegelung von den 2 ml Vials vermindern. Nach Verschluß und Etikettierung der 2 ml Vials wurden diese bei einer Temperatur von ungefähr 0ºC bis ungefähr 5ºC gelagert. Die Vials könnten auch bei Raumtemperatur für bis zu einem Jahr gelagert werden.
Als die lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zusammensetzung in einer der 2 ml Vials mit Wasser auf 0,25 ml rekonstitutiert wurde, wies die entstandene isotonische MDM-Lösung einen physiologischen pH-Wert von ungefähr 7,5 auf. Die Konzentration der Inhaltsstoffe in einer von diesen rekonstituierten Lösungen wird in Beispiel VII aufgeführt. Beispiel V - Konzentrationen der Inhaltsstoffe in der zur Lyophilisation vorgesehenen MDM-Lösung Verbindung Konzentration Benzylpenicillosäure Benzylpenicillin Benzylpenillosäure Kaliumchlorid Natriumphosphat

Beispiel VI - Inhalte von jedem Vial, das die zur Lyophilisation vorgesehene gefrorene Lösung enthält

Jedes Vial enthält folgendes:
Füllungsvolumen der zur Lyophilisation vorgesehenen Lösung 0.10 ml
Kaliumchlorid 1.840 mg
Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 0.355 mg
Benzylpenillosäuremonohydrat 0.816 mg
Benzylpenicillin Kalium 1.568 mg
Mononatriumbenzylpenicilloattetrahydrat 1.116 mg

Beispiel VII - Konzentrationen der Inhaltsstoffe in der rekonstituierten MDM-Lösung

Bei Rekonstitution mit Wasser auf 0,25 ml betragen die Konzentrationen in jedem Vial: Verbindung Konzentration Benzylpenillosäure Benzylpenicillin Benzylpenicillosäure Kaliumchlorid Natriumphosphat
Die sich ergebende isotonische MDM-Lösung dürfte einen pH-Wert von ungefähr 7,5 aufweisen.

Claims

1. Lagerstabile, lyophilisierte Minor Determinant Mixture (MDM) Zusammensetzung, die mit Wasser zu einer Lösung rekonstituiert werden kann, die zur Detektion von Allergie oder Übersensibilität gegenüber Penicillinen verwendet wird, enthaltend:

(a) Benzylpenillosäure,

(b) im Bereich von 1,60 bis zu 1,85 Mole Benzylpenicillin für jedes Mol der Benzylpenillosäure,

(c) ungefähr 1,0 Mol Benzylpenicillosäure für jedes Mol der Benzylpenillosäure, worin wenigstens ungefähr 94,5 % der Benzylpenicillosäure das Stereoisomer (5R,6R)-benzyl-D-penicillosäure ist,

(d) im Bereich von 9,38 bis zu 10,86 Mole eines Alkalimetallsalzes für jedes Mol der Benzylpenillosäure,

(e) ungefähr 1,0 Mol einer pH-Puffer-Substanz für jedes Mol Benzylpenillosäure und

(f) eine Menge Wasser, die ausreichend gering ist, den Abbau der Benzylpenillosäure, des Benzylpenicillins und der Benzylpenicillosäure substantiell zu verhindern.

2. Lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zubereitung nach Anspruch 1, in der das Alkalimetallsalz ein Alkalimetallchlorid ist.

3. Lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zubereitung nach Anspruch 1, in der das Alkalimetallsalz Kaliumchlorid ist.

4. Lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zubereitung nach Anspruch 1, in der das Alkalimetallsalz Natriumchlorid ist.

5. Lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zubereitung nach Anspruch 1, in der die pH-Puffersubstanz Natriumphosphat ist.

6. Lagerstabile, lyophilisierte MDM-Zubereitung nach Anspruch 1, daß diese MDM-Zubereitung sich in einem dehytratisierten Behälter befindet, der derart getrocknet wurde, um das gesamte Wasser substantiell zu entfernen.

7. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen lyophiliserten Minor Determinate Mixture (MDM) Zusammensetzung, in der wenigstens 94,5 % der Benzylpenicillosäure das Stereoisomer (5R,6R)-benzyl-D-penicillosäure ist, das mit Wasser zu einer Lösung rekonstituiert werden kann, die zur Detektion der Allergie oder Hypersensitivität gegenüber Penicillinen verwendet wird, das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Herstellung einer wässrigen Lösung, enthaltend:

(1) Benzylpenillosäure;

(2) von 9.38 bis zu 10.86 Mole eines Alkalimetallsalzes für jedes Mol der Benzylpenillosäure,

und

(3) 1,0 Mol einer pH-Puffersubstanz für jedes Mol der Benzylpenillosäure;

(b) Neutralisierung der Benzylpenicillosäure in der Lösung von (a) mit einer ausreichenden Menge wässrigen Natriumhydroxids bis zum Erreichen einer Konzentration an Natriumkationen, die ausreichend ist, ein stabiles Salz mit den Anionen der Benzylpenillosäure zu bilden;

(c) Kühlen der aus Schritt (b) erhaltenen Lösung auf eine Temperatur von 0ºC bis zu 5ºC;

(d) Ausführen der folgenden Schritte unter Vorhaltung der Lösung aus Schritt (c) bei einer Temperatur von 0ºC bis zu 5ºC;

(i) Auflösen von 1,60 bis zu 1,85 Mole Benzylpenicillin für jedes Mol Benzylpenillosäure in der aus Schritt (c) erhaltenen Lösung;

(ii) Auflösen eines 1.0 Moles Benzylpenicillosäure für jedes Mol Benzylpenillosäure in der aus Schritt (d) (i) erhaltenen Lösung;

(iii) Neutralisieren der Benzylpenicillosäure mit einer Menge wässrigen Natriumhydroxids, die ausreichend ist zum Erreichen einer Konzentration von Natriumkationen, die effektiv sind, ein stabilisiertes Salz mit den Benzylpenicillosäureanionen zu bilden;

(iv) Einstellen des pH der von Schritt (d) (iii) erhaltenen Lösung auf einen Wert von 7,3 auf bis zu 7,5;

und

(v) Sterilfiltration der aus Schritt (d) (iv) erhaltenen Lösung;

(vi) Verbringen der filtrierten Lösung, die aus Schritt (d) (v) erhalten wurde in wasserfreie Behältnisse;

(e) Einfrieren der in den wasserfreien Behältnissen enthaltenen Lösung auf eine Temperatur von -45ºC auf bis zu -15ºC über bis zu 30 Minuten;

(f) Lyophilisieren der eingefrorenen Lösung, worin während des Lyophilisationsvorganges die gefrorene Lösung zuerst für 8 bis 13 Stunden bei einer Temperatur von -45ºC bis zu -15ºC unter einem Vakuum von 15 bis zu 30 µm lyophilisiert wird und weiter für 7 bis zu 14 Stunden bei einer Temperatur von 0ºC bis zu 5ºC unter einem Vakuum von 15 bis zu 30 µm bis zu einer Gesamttrocknungszeit von 20 bis zu 22 Stunden.

8. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Alkalimetallsalz ein Alkalimetallchlorid ist.

9. Verahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Alkalimetallsalz Natriumchlorid ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Alkalimetallsalz Natriumchlorid ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der die pH-Puffersubstanz Natriumphosphat ist.

12. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, das weiter beinhaltet, daß die in Schritt (d) (i) gebildete wässrige Lösung bei einer Temperatur von 0ºC bis zu 5ºC für eine Höchstdauer von 15 Stunden gehalten wird, bevor mit Schritt (e) fortgefahren wir, um die Epimerisation von mehr als 5,5 % des Stereoisomers (5R,6R)-benzyl-D-penicillosäure zu verhindern.

13. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zubereitung nach Anspruch 7, das weiterhin die Schritte beinhaltet, das Vakuum in den wasserfreien Behältnissen mit filtriertem, getrocknetem Stickstoff aufzuheben.

14. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, das ferner die Schritte beinhaltet, die wasserfreien Behältnisse unmittelbar nach Aufhebung des Vakuums zu versiegeln.

15. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen, lyophilisierten MDM-Zusammensetzung nach Anspruch 7, in dem während dieser Lyophilisation die gefrorene Lösung zuerst für 8 bis zu 13 Stunden bei einer Temperatur von -45ºC bis zu -15ºC unter einem Vakuum von 15 bis zu 30 µm lyophilisiert wird und dann für 7 bis zu 14 Stunden bei einer Temperatur von 0ºC bis zu 5ºC unter einem Vakuum von 15 bis zu 30 µm für eine Gesamttrocknungszeit von 20 bis zu 22 Stunden lyophilisiert wird.