DE68911178T2

DE68911178T2 - Klinische Entwicklungen mit Amnionzellen.

Info

Publication number: DE68911178T2
Application number: DE68911178T
Authority: DE
Inventors: Douglas Mitchell Hollow Butler; Rajagopallan Krishnan; Jonathon Mark Sackier; Gordon Roy Wiggington; Christopher Barry Wood
Original assignee: Genethics Ltd
Current assignee: Genethics Ltd
Priority date: 1988-02-17
Filing date: 1989-02-17
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2009-02-18
Also published as: DE68911178D1; ATE98111T1; WO1989007425A3; ES2060750T3; EP0333328B1; WO1989007425A2; US5612028A; GB8803697D0; EP0333328A2; EP0333328A3; CA1330418C

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die klinische Verwendung von Amnionmembranzellen oder -geweben.

Hintergrund der Erfindung

Das Amnion ist eine einzigartige Membran aus einer einzelnen Schicht von Zellen, die die Höhle, in der der Fötus heranwächst und sich entwickelt, vollständig auskleiden. Es wird aus der gleichen kleinen Gruppe von Zellen gebildet, die gebildet werden, wenn das durch ein Spermium befruchtete Ei sich zu teilen beginnt. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, sich in alle Zellen des menschlichen Körpers zu entwickeln und differenzieren sich durch die Wirkung von Wachstumsfaktoren und nach einem noch nicht definierten Prozeß, entweder zu Muskeln, Knochen, Herz, Leber oder jeder beliebigen benötigten Struktur. Es besteht nun Grund zu der Annahme, daß die Zellen, die das Amnion bilden, ihren pluripotenten Charakter der Fähigkeit, sich zumindest teilweise in andere Gewebe zu differenzierten, beibehalten.
Eine weitere einzigartige Besonderheit der Amnionmembran ist das vollkommene Fehlen einer Expression von Oberflächen-Antigenen, die für das Auslösen einer Immunreaktion verantwortlich sind. So induziert das Amnion keine Immunoantwort, wenn es an eine "fremde" Stelle transplantiert wird, eine Eigenschaft, die von größerer Bedeutung für den Fötus ist.
Das Immunsystem des Körpers erkennt rasch fremdes Material und löst eine Immunantwort aus, die die fremden Zellen oder Organismen rasch zerstört. Solche Überlegungen legen nahe, daß das befruchtete Ei von dem Körper als ein fremdes oder "nicht-eigenes" Gewebe erkannt wird und von dem Immunsystem zerstört wird. In der Tat ist das Ei und später der entwickelnde Fötus von der Immunantwort ausgenommen und kann in dem mütterlichen Uterus, vollständig geschützt von den angreifenden Lymphocyten des mütterlichen Immunsystems, wachsen und gedeihen. Obwohl der Mechanismus noch nicht vollständig verstanden ist, ist das Amnion der Schlüssel zum Schutz des Fötus. Er ist die immunologische Barriere zwischen der Mutter als Wirt und dem Embryo als dem "fremden" Gewebe.
Noch im Eileiter teilt sich das befruchtete Ei wiederholt unter Bildung eines runden Zellhaufens, der Morula, aus dem sich sowohld er Fötus als auch die Placenta und das Amnion entwickeln. Es ist dieser zentrale Ursprung des Amnions und seine enge Beziehung zu dem sich entwickelnden Embryo, was das Amnion zu einem solchen faszinierenden Forschungsobjekt macht. Ein exzentrischer Raum erscheint in der Morula, was zu einem Hohlraum oder der Blastozyste mit einem Zellhaufen auf einer Seite der inneren Oberfläche - dem inneren Zellhaufen - führt. Die äußere Schale des Blastozyste wird zum Trophoblasten, der für die Ernähung des Embryos verantwortlich ist (siehe Fig. 1).
Der innere Zellhaufen differenziert sich und bildet zwei getrennt Haufen, die äußere (ectodermale) Schicht und die innere (endodermale) Schicht. Eine weitere Differenzierung ergibt eine dritte Schicht zwischen diesen beiden Schichten, das Mesoderm (siehe Fig. 2). Die Kombination aus dem Trophoblasten und dem primitiven Mesoderm wird als Chorion bezeichnet (siehe Fig. 3). Zwei kleine Höhlen treten auf, eine in dem Ectoderm, welche den Amnionsack bildet, die andere in dem Endoderm, welche den Dottersack bildet.
Etwa am 12. Tag nach der Befruchtung wird die Amnionhöhle gebildet, und das embryonale Ectoderm des inneren Zellhaufens nimmt die Form eines Bodens der Amnionhöhle (Hertig 1968) an, wobei das Dach davon durch das Amnionepithel gebildet wird (Hertig, 1945, Bourne 1942).
Mit fortschreitender Ausdehnung der Amnionhöhle erreicht das Amnion die Wand der Blastozyste. Gleichzeitig wird der Dottersack abgeschnürt. Ein Teil des Dottersacks wird in dem Embryo eingeschlossen, während der Rest ein rudimentäres Rohr bildet, das an die ursprüngliche Mesodermrinne angelegt wird.
Blutgefäße entwickeln sich in dem embryonalen Mesoderm und in dem Mesoderm des Trophoblasten. Die Ausdehnung dieser Gefäße entlang der verbindenden Rinne führt zur Bildung der Arterien und Venen der Nabelschnur (siehe Fig. 4).
Im Embryo differenziert sich das Gefäß am Kopfende zu dem Herzen. Die fötale Blutbildung tritt in den primitiven Blutgefäßen des Trophoblasten und des Fötus auf. Der Austausch zwischen der Mutter und dem Fötus wird durch die Bildung dieses fötal-trophoblastischen Kreislaufs erleichtert. Die Bildung und die Differenzierung des hämopoetischen Gefäßsystems tritt zwischen der dritten und vierten Schwangerschaftswoche ein. Von da an kann die volle Entwicklung des Fötus stattfinden.
Mit Sauerstoff beladenes Blut aus der Placenta kehrt über die Nabelschnurvene in den Fötus zurück. Dieses Gefäß durchdringt die Leber und teilt sich in kleine Abzweigungen in dieses Organ ab. Der Hauptteil des Blutes wird über den Ductus venosus in die untere Vena cava geleitet, die das zurückkehrende, von Sauerstoff befreite Blut aus den unteren Gliedmaßen, den Nieren, der Leber und den anderen Organen trägt. Es gibt nur eine teilweise Vermischung der beiden Blutströme, und die Hauptmenge des mit Sauerstoff beladenen Bluts wird durch die Crista dividens am oberen Ende der unteren Vena cava durch das Foramen ovale in den linken Vorhof und von da in die linke Kammer und die Aorta geführt. Dieses relativ gut mit Sauerstoff beladene Blut versorgt den Kopf und die oberen Extremitäten. Der Rest des Bluts von der oberen Vena cava vermischt sich mit dem der unteren Cava, gelangt in die rechte Kammer und von dort in die Lungenarterien. Eine sehr kleine Blutmenge fließt tatsächlich durch die Lungen. Das meiste davon gelangt über den Ductus arteriosus in die Aorta hinter den Gefäßen, die den Kopf und die anderen Extremitäten versorgen. Danach fließt es die Aorta hinab, um die Eingeweide und die unteren Gliedmaßen zu versorgen. Wenig Blut fließt tatsächlich durch die unteren Gliedmaßen. Das meiste fließt auf dieser Stufe in die Arterien der Nabelschnur, die als Verzweigungen der rechten und linken internen Darmbeinadern auftreten. Bei der Geburt ziehen sich die Gefäße der Nabelschnur zusammen. Atmen hilft, einen negativen Druck im Brustkorb zu erzeugen, wodurch mehr Blut von den Lungenarterien in die Lungen gesaugt wird und aus dem Ductus arteriosus abgeleitet wird, der sich daher schrittweise schließt. Das Foramen ovale ist eine ventilartige Öffnung, wobei das Ventil von der rechten zur linken Seite des Herzens funktioniert. Der linke Ohrendruck steigt an, und dieses Ventil schließt sich.
Der primitive Trophoblast höhlt die Oberfläche der Decidua durch einen enzymatischen Prozeß aus, zerstört die Drüsen und die Stroma und dringt schließlich daher durch die großen mütterlichen Sinusoiden, die sich in der Auskleidung des Uterus gebildet haben. Die Blastozyste liegt nun in einem Pool aus mütterlichem Blut, das von den mütterlichen Arteriolen stammt und durch die mütterlichen Venen abgeführt wird. Die Trophoblastenzellen proliferieren und bilden pseudopodienartige Massen, die sich wiederholt verzweigen. Dies erhöht die spezifische Oberfläche sehr und erleichtert den Austausch zwischen Fötus und Mutter. Der Trophoblast verankert die Blastozyste durch Anhaften an die dazwischenliegenden decidualen Stroma. Der Trophoblast differenziert sich in zwei Schichten. Die äußere Schicht oder der Syncytiotrophoblast ist in Kontakt mit dem mütterlichen Blut und wird zu dem multinucleären Syncytium ohne deutliche Zellgrenzen, die innere Schicht oder der Cytotrophoblast (auch Langhans-Schicht genannt) bildet eine einzige Schicht aus cuboidalen Zellen.
Zotten sind auf der ganzen Oberfläche der Blastozyste vorhanden. Mit ihrer Vergrößerung komprimiert sie die oberflächlichen Decidua oder die Decidua capsularis und die Schwangerschaft drückt in die Uterushöhle hinein. Die Kompression der Decidua capsularis unterbindet schrittweise die Zirkulation dadurch. Dies führt zu einer Atrophie und zu einem Verschwinden der damit assoziierten Zotten. Die Oberfläche der Blastozyste wird glatt, und dieser Teil des Chorions ist als Chorion laeve bekannt. Am entgegengesetzten Ende der Blastozyste proliferieren die Zotten und vergrößern sich, und dies ist als das Chorion frondosum bekannt. Der verknüpfende Kanal des Embryos wird an die Wand der Blastozyste an diesem Punkt geheftet. Schließlich kommt bei Ausdehnung der Blastozyste die Decidua capsularis in Kontakt mit der Decidua vera, und die Uterushöhle wird vernichtet.
Die vollständig ausgebildete Placenta ist eine etwa 2 cm dicke Scheibe, die sich zu den Kanten hin verjüngt. Sie wiegt etwa 500 g und ist dunkelrot, wobei die Farbe hauptsächlich auf das mütterliche Blut in den Räumen zwischen den Zotten zurückzuführen ist. Die Nabelschnur besitzt zwei Arterien und eine Vene, die in die Wharton-Sulze eingebettet sind, welches ein loses myxödematöses Gewebe mesodermalen Ursprungs ist. Die Sulze wirkt als physikalischer Puffer und verhindert ein Knicken der Nabelschnur und eine Störung des mütterlich-fötalen Kreislaufs.
Die Nabelschnurgefäße sind im allgemeinen an die Placenta in der Nähe ihrer Mitte angeheftet. Sie teilen sich sofort wiederholt und bilden Verzweigungen, die sich über die ganze Oberfläche verzweigen. Dies ist als der "gestreute" Typ der Placenta bekannt. Gelegentlich können sich die Hauptgefäße fast bis zu den Rändern der Placenta vor der Teilung ausdehnen (obwohl sich kleine Verzweigungen in ihrem Verlauf abzweigen). Dies ist der "Magistral"-Typ einer Placenta. Es gibt eine kurze kommunizierende Verzweigung zwischen den beiden Nabelschnurarterien an dem Punkt, an dem sie die Placentaoberfläche erreichen. Dies dient dem Druckausgleich und dem Flußausgleich in jede Hälfte der Placenta.
Die Funktionen der Placenta hängen von der Struktur und der Gesundheit der Placentazotten ab. Diese Zotten schwimmen im mütterlichen Blut, aber es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem fötalen und dem mütterlichen Blut. Es gibt eine Fötus-Placenta-Schranke. Nach 16 bis 20 Wochen bildet sich der Cytotrophoblast zurück. Der Syncytiotrophoblast verliert mit fortschreitender Schwangerschaft an Dicke. Die fötalen Blutgefäße der Zotten erweitern sich, und die Menge des Mesoderms wird verringert. Dies verringert die physikalische Barriere zwischen dem fötalen und dem mütterlichen Blutkreislauf. Tn der Tat beträgt nach 12 Wochen die Barriere 0,025 mm und zum Geburtstermin beträgt sie 0,002 mm. Die Funktionen der Placenta können wie folgt zusammengefaßt werden.

1. Atmungsfunktion

Der Druckabfall bei Eintreten des mütterlichen Bluts in die Placenta und der daraus folgende niedrige Fluß unterstützen den fötal-mütterlichen Austausch. Das mütterliche Blut besitzt einen relativ hohen Sauerstoff- und einen niedrigen Kohlendioxidgehalt. Die Passage des Sauerstoffs in den Fötus und des Kohlendioxids zur Mutter wird somit erleichtert. Zusätzlich nimmt man an, daß das fötale Hämoglobin leichter Sauerstoff aufnehmen kann, selbst wenn die Konzentration an mütterlichem Sauerstoff niedrig ist.

2. Nährfunktion

Aktive Transportmechanismen sind in der Placenta vorhanden und unterstützen den Austausch von Substanzen zwischen der Mutter und dem Fötus. Beispielsweise werden natürlich vorkommende Aminosäuren, die linksdrehend sind, durch die Placentaschranke rascher als synthetische rechtsdrehende Formen transportiert.

3. Endocrine Funktion

Die Placenta produziert eine Anzahl von Hormonen: Östrogene, Progesteron, Choriongonadotropin, wachtstumshormonartige Substanzen (menschliches Chorionsomatotropin), Corticosteroide und den posthypophysären Substanzen ähnliche Substanzen. Ostrogene und Progesteron werden hauptsächlich von dem Eierstock während der ersten zwölf Wochen der Schwangerschaft produziert. Während dieser Zeit wird Choriongonadotropin von der Placenta in großen Mengen sezerniert, um den Gelbkörper aufrechtzuerhalten. Danach übernimmt die Placenta schrittweise die Produktion der Östrogene und des Progesterons. Der Gelbkörper bildet sich zurück, und die Sekretion von Choriongonadotrophin wird stark verringert.
Die Östrogene und die Progesterone erhalten das Wachstum des Uterus und kontrollieren seine Aktivität während der Schwangerschaft. Sie sind auch für die Veränderungen in dem mütterlichen Körper, wie das Wachstum der Brust, verantwortlich.
Auf ähnliche Weise steigen die Corticosteroide während der Schwangerschaft stark an, und einige werden von der Placenta produziert. Sie sind auch an Veränderungen des mütterlichen Stoffwechsels beteiligt. Eine Substanz, die dem posthypophysären Hormon ähnelt, soll von der Placenta gebildet werden. Dies ist jedoch kontrovers.

4. Membranentwicklungen

Die Membran leitet sich von dem Teil des Trophoblasten ab, der bei Expansion der Blastozyste atrophiert - das Chorion laeve plus dem Amnion. Das Amnion wird leicht von dem Chorion abgestreift, und dies ist bei der Unterscheidung zwischen dizygotischen (zweieiigen) und monozygotischen (eineiigen) Zwillingen hilfreich. Wenn die Membranen in drei getrennten Schichten über der Oberfläche aufgelagert sind, können die Zwillinge entweder eineiig oder zweieiig sein. Wenn die übereinander gelagerten Membranen nur aus zwei Schichten bestehen, den zwei Amnionschichten, sind die Zwillinge eindeutig eineiig.

5. Amnionflüssigkeit

Das Volumen dieser Flüssigkeit nimmt bis zur 38. Woche zu, fällt bis zum Geburtstermin geringfügig ab und fällt danach rascher ab. Die Flüssigkeit wird alle drei Stunden ersetzt, und ihre Bildung und Zirkulation ist immer noch ein Gegenstand der Forschung. Sie kann aus einer Vielzahl von Quellen stammen. Die Zusammensetzung der Flüssigkeit ist nicht einfach; sie ist nicht nur ein Transsudat. Die Konzentrationen der Substanzen sind selten die gleichen wie sie im mütterlichen Plasma gefunden werden, obwohl einige zusammen mit dem mütterlichen Blut ansteigen und abfallen. Eine Vielzahl von Hormonen findet sich in der Flüssigkeit - Choriongonadotropin, Placenta-Somatotropinhormon, ästrogene, Progesteron und Hydroxycorticosteroide finden sind in wechselnden Mengen. Zwei Typen von Prostoglandinen finden sich. Typ E findet sich in der frühen Schwangerschaft, wohingegen bei dem Geburtstermin Typ F am reichlichsten vorhanden ist. Zusätzlich wurde eine große Anzahl von Enzymen in der Amnionflüssigkeit und deren Zellen nachgewiesen. Eine Anzahl von Zelltypen kann in der Flüssigkeit während der frühen Schwangerschaft gefunden werden - große Eosinophile, große Basophile und kleine Basophile. Diese leiten sich von der fötalen Haut, dem Mund, der Vagina und der Blase ab. Nach der 36. Woche finden sich anucleäre, polygonale, eosinophile Zellen, die sich mit Nilblausulfat orange färben und die Schuppen von der fötalen Haut sind. Die Amnionflüssigkeit kann durch die Membranen unter Verwendung eines Amnioskops sichtbar gemacht werden. Zusätzlich ist nun die Amniocentese oder die Entnahme der Flüssigkeit ein übliches Verfahren. Chemische Bewertungen und mikroskopische Studien können zu folgenden Zwecken durchgeführt werden.
1. Prognose in Fällen von Rhesusunverträglichkeit durch Bestimmung des Bilirubingehalts.
2. Bestimmung des Verhältnisses Lecithin/Sphingomyelin, das während des Reifens der fötalen Lunge zunimmt.
3. Vorgeburtliche Geschlechtsbestimmung in Fällen von vermuteten geschlechtsgebundenen Störungen.
4. Nachweis von Chromosomenabnormalitäten.
5. Diagnose von fötalen Speicherkrankheiten.
6. Diagnose von fötalen Enzymdefekten.
Die Chromosomen und die sie bildenden Gene legen schließlich die Eigenschaften jedes Individuums fest. Die Zellen jedes beliebigen Individuums bilden eine Vielzahl von Proteinen und Mucopolysacchariden, die als Marker auf der Oberfläche und dem Inneren der Zellen vorhanden sind, und diese Marker sind als Antigene bekannt. Wenn ein Körper fremden Antigenen exponiert wird, d.h. Antigenen, die nicht innerhalb dieses Gewebes unter normalen Umständen vorkommen, erkennt der Körper diese als fremd und produziert Antikörper.
Die Antikörper binden an die Antigene, genau wie ein Schlüssel in ein Schloß paßt. Das Nettoergebnis dieser Erkennung ist die Zerstörung des Fremdmaterials. Ein gutes Beispiel für diese Funktion ist die Blutgruppenbestimmung in dem AB-System. Wenn beispielsweise eine Person die Blutgruppe A besitzt, dann trägt sie auf der Oberfläche ihrer Blutzellen das A-Antigen. Wenn Blut, das von der Blutgruppe A stammt, dem Patienten transfundiert wird, dann erkennt der Körper dieses nicht als fremd, und die Transfusion wird angenommen - dies ist die Basis für die nationalisierten Bluttransfusionsdienste. Wenn jedoch Blut der Gruppe B dem gleichen Patienten infundiert wird, enthält dieses Blut B-Antigene auf der Oberfläche der Erythrocyten, und in dem transfundierten Blut gibt es Antikörper gegen die Blutgruppe A. Zusätzlich zirkulieren im Plasma des Empfängers der Bluttransfusion Antikörper gegen die Blutgruppe B. Das Ergebnis dieser irrtümlichen Transfusion ist, daß die kleine Menge des transfundierten Anti-A die Empfängerzellen schädigt, aber noch wichtiger, der Empfänger das B-Antigen auf den transfundierten Zellen erkennt und sie prompt zerstört. Dies führt zu einer lebhaften Transfusionsreaktion, die unter ungünstigen Umständen zum Tod des Patienten führen kann und in der Geschichte, als Bluttransfusionen zuerst versucht wurden, gut charakterisiert ist.
Es gibt in der Tat zahlreiche Blutgruppen-Antigene, und folglich ist die Anpassung einer Blutkreuzung ein zeitaufwendiges, einen Experten benötigendes Verfahren. Die gleichen Techniken wurden verwendet, um Organe für Transplantationen, wie Niere, Leber, Herz und Lunge, zu typisieren. Wenn eine enge Anpassung erhalten wird, dann kann das Ergebnis ganz gut sein. Dies wird durch die Gabe von Immunsupressiva unterstützt, welche Substanzen sind, die die Immunreaktion in dem Emfänger unterdrücken, aber die auch den Patienten gegenüber opportunistischen Infektionen und der Entwicklung bestimmter Krebsarten empfänglich machen. Wenn so einem eine Niere, die nicht gut angepaßt wurde, transplantiert werden soll, würde der Empfänger dieses Organ innerhalb von 24 Stunden abstoßen, und es würde nicht funktionieren, wohingegen eine Niere, die von einem identischen eineiigen Zwilling gespendet wurde, vollständig akzeptabel sein würde, da die Nieren beider Spender aus dem gleichen Ei und Spermium stammen.
Eine unübliche Eigenschaft der Amnionepithelzellen ist ihr offensichtliches Unvermögen, Klasse 1-Histokompatibilitäts-Antigene (HLA-ABC) in einer Form oder Dichte, die immunhistologisch identifziert werden kann, zu exprimieren (Hsi 1982, Adinolfi 1982). Amnionzellen scheinen auch für Klasse 2-Antigene (HLA-D-Antigen) negativ zu sein. Gegenwärtig sind die Gründe für die Unfähigkeit der Amnionzellen, Histokompatibilitäts-Antigene auf normale Weise zu exprimieren, nicht bekannt, aber mögliche Erklärungen umfassen:
1. Gene für die Expression der Klasse 1-Antigene können deletiert sein.
2. Die Gene können defekt sein.
3. Die Gene können durch positive oder negative Kontrollmechanismen "herabreguliert" sein (Hunt & Wood 1986).
Hunt und Wood schlugen vor, daß das Unvermögen der Transkription für die Unfähigkeit zu einer normalen Expression von Klasse 1-HLA-Antigenen und β2-Mikroglobu1in durch die Zellen des Amnionepithels verantwortlich sein könnte, obwohl die Produktion winziger Mengen diese Antigene mit empfindlichen radiologischen Techniken festgestellt wurde (Adinolfi 1982). Dies scheint nach einer Transplantation kein Problem zu verursachen.
Berichte über die Immunogenität menschlicher Amnionepithelzellen nach der Transplantation in menschliche Freiwillige wurden veröffenticht (Akle 1981, Adinolfi 1982). Stücke aus Amnlon, bestehend aus einer einlagigen Schicht aus Epithel auf einer Grundmembran mit einer darunterliegenden Collagenmatrix, die wenige Fibroblasten enthält (die theoretisch die HLA-Antigene exprimieren würden, obwohl dem Epithel selbst die Antigene fehlen) wurden in subkutane Taschen normaler menschlicher Freiwilliger transplantiert.
Keiner der Freiwilligen zeigte klinische Anzeichen einer akuten Abstoßung, und die Amnionepithelzellen wurden durch Biopsie bis zu sieben Wochen nach der Implantation nachgewiesen. HLA-Antikörper wurden in den Serumproben nicht nachgewiesen, und es gab keine in vitro Lymphocytenreaktion auf die Amnionzellen bei zwei der Freiwilligen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die akute Immunabstoßung nach der Allotransplantation menschlicher Amnionepithelzellen nicht eintritt. Diese Autoren schlagen vor, daß, falls eine Immunantwort gegen das Transplantat auftrat, diese sicherlich von geringem Ausmaß und chronisch als aktiv ist und klar ineffektiv ist, da die Amnionepithelzellen anscheinend überleben und in einigen Fällen sogar proliferieren (Akle 1981, Adinolfi 1982).
Bei der Transplantation menschlicher Organe, sei es der Haut, der Niere oder der Leber etc., ist das Hauptproblem die Abstoßung des transplantierten Gewebes infolge der Immunantwort. Das Amnion wurde erfolgreich als Hauttransplantat verwendet, ohne daß Sorge um die korrekte Gewebstypisierung und die Anpassung des Spenders an den Empfänger zu tragen war.
Zusätzlich zur Wirkung als immunologische Barriere funktioniert das Amnion auch auf eine Vielzahl von anderen Wegen zugunsten des Fötus. Noch im Uterus und insbesondere während der frühen Entwicklungsstadien können die embryonalen Nieren nicht adeguat einen Flüssigkeitsausgleich und die Entsorgung von Abfallprodukten gewährleisten. Diese Funktionen werden von der Amnionmembran kontrolliert und mehrere Liter Flüssigkeit werden zwischen dem Fötus, der Amnionhöhle und der Mutter im Verlauf eines jeden Tages ausgetauscht. Zusätzlich wird Harnstoff, der eines der Hauptabfallprodukte ist, aktiv durch das Amnion transportiert. Jüngste Beweise zeigten, daß für alle Aufgaben und Zwecke das Amnion als eine einfache Niere funktioniert (Lingwood und Wintour 1983).
Alle menschlichen Zellen mit Ausnahme der Keimzellen und der Erythrocyten besitzen die gesamte genetische Tnformation, die für eine vollständigen Menschen benötigt wird. Jedoch besitzt bei Herausnahme aus ihrer üblichen Situation im Körper eine Zelle nur die Fähigkeit, das Gewebe zu regenerieren, aus dem es stammte. Verschiedene Gewebe besitzen verschiedene Regenerationsfähigkeiten, wobei diese in der Leber beispielsweise extrem gut ist, im zentralen Nervensystem aber fast nicht vorhanden ist.
Die fötalen Membranen wurden in eine Vielzahl von chirurgischen Membranen zur Hautbedeckung in der Vergangenheit eingepflanzt. Stern (193) und Sabella (1913) benutzten Amnion zur Behandlung von Verbrennungen und Hautgeschwüren und beschrieben eine Schmerzerleichterung, eine erhöhte Epithelialisierungsrate und keine Infektion. Es gab mehrere jüngere Berichte zur Verwendung von Amnion als zeitweiligem Verband für Geschwüre, Verbrennungen und andere freigelegte Flächen (Tronsegaard-Hansen 1950, Robson, 1973, Robson 1974). Es wurde gefunden, daß gelagerte und getrocknete Membranen keine signifikanten Verbesserungen gegenüber anderen herkömmlicheren, sterilen Verbänden bieten. Aber bei Anwendung in frischem Zustand oder nach Konservierung bei 4ºC in isotoner Kochsalzlösung scheint das Amnion Vorteile zur besitzen, die, wie berichtet wurde, die Verringerung der Bakterienzahlen, die Schmerzlinderung und eine beschleunigte Heilung umfassen (Trelford 1975). Es wurde postuliert, daß das Amnion Faktoren produziert, die die Bildung von Granulationsgewebe, die Neovaskularisation und die Reepithelialisierung fördern, obwohl dies ein kontroverses Gebiet ist (Treford 1975, (1,2,3) Walker 1977, Faulk 1980).
Andere beschriebene chirurgische Verwendungen des menschlichen Amnions umfassen dessen erfolgreiche Anwendung zur Reparatur von Hornhautdefekten (De Roth 1940), als Ersatz für das parietale Peritoneum (Massee 1962) und zur Auskleidung des Beckenbodens nach Totaloperationen (Trelford-Sauder 1979). Volkow (1973) beschrieb die Verwendung von menschlichem Amnion für die Arthroplastik in 44 Patienten mit congenitaler Hüftdislokation mit übereinstimmend guten Ergebnissen; Vishwakarma (1986) beschrieb die erfolgreiche Verwendung von menschlichem Amnion zur Arthroplastik in 28 Patienten mit Hüfttuberkulose und Ray et al. (1986) beschrieb die Verwendung von menschlichem Amnion für mikrovaskuläre interpositionale Transplantate bei Ratten mit extrem günstigen Erebnissen. Jedoch verarbeiteten diese Autoren (Volkov 1973, Vishwakarma 1986, Gray 1986) das Amnion vor der Transplantation durch Techniken, die entweder die Zellen abtöteten oder das Amnion deepithelialisierten, wobei nur das Mesenchym zurückgelassen wurde. Im Gegensatz dazu ist die Grundlage der vorliegenden Erfindung die Verwendung von lebenden Amnionzellen, die beispielsweise in einer sterilen Gewebskultur konserviert und gezüchtet wurden.
Aus der vorstehenden Diskussion geht hervor, daß die Amnionzellen als pluripotent in ihrem natürlichen Zustand, d.h. während der Bildung des Fötus, bekannt waren. Es war auch bekannt, daß menschliche Allotransplantate der Amnionzellen keine signifikaten immunologischen Probleme hervorriefen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, daß menschliches Amnion in das Kniegelenk des Kaninchens, die Achillessehne des Kaninchens und in Rattenlebern und Bauchhöhlen, ohne eine größere Immunantwort hervorzurufen, transplantiert werden kann. Dies ist ein äußerst beachtliches Phänomen, da die Transplantation jedes anderen menschlichen Gewebes an diese Stellen zu der fast sofortigen Zerstörung des transplantierten Organs oder Gewebes führen würde. Ferner wurde gefunden, daß das Amnion in das Wirtsgewebe inkorporiert wird und zu einem Teil davon wird. Diese beachtliche Ergebnis konnte nicht vorhergesehen werden und war unerwartet. Es wurde weiter gefunden, daß das Amnion die Heilung von gerissenen Sehnen induziert, und mit der Zeit von der ursprünglichen Sehne ununterscheidbar ist.
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verbundimplantat zur chirurgischen Verwendung, umfassend eine Prothese, die mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Amniongewebe beschichtet und/oder laminiert und/oder infundiert ist, bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein biologisch verträglicher Träger mit der Eignung zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper, der mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Amniongewebe beschichtet ist, bereitsgestellt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen biologisch verträglichen Träger mit der Eignung zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Gewebe beschichtet.
Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung von lebensfähigen Amnionzellen oder lebensfähigem Amniongewebe zur Aufbringung auf eine Prothese oder einem biologisch verträglichen Träger zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper zur Regeneration oder als Ersatz von erkranktem oder geschädigten Gewebe bereitgestellt.
Bei der Gefäßchirurgie sind prosthetische Transplantate, die gegenwärtig verfügbar sind, üblicherweise bei der Aortal- oder Aortoiliakal-Chirurgie erfolgreich, können dem großen erzeugten Druck widerstehen und die Thrombose des Transplantats ist kein größeres Problem, was fast sicher auf den hohen Geschwindigkeitsfluß zurückzuführen ist. Jedoch bieten periphere vaskuläre Bereiche, wie das feinoralpopliteale Segment oder die distalen Gefäße im allgemeinen ein größeres Problem für Transplantate, sei es in der Vena saphena (die schlecht gehandhabt werden kann) oder bei prosthetischen Transplantaten aus PTFE und Dacron, die verwendet werden, da die Thrombose den Erfolg der Operation begrenzt. Die ausgedehnte Verwendung der koronaren Bypass-Chirurgie hängt vollständig von der Qualität der gewonnenen langen Vena saphena und deren Handhabung bei der Operation ab. Die Häufigkeit peripherer vaskulärer Operationen im Vereinigten Königreich beträgt etwa 4,1 pro 10.000 Einwohner pro Jahr und etwa 25.000 Koronar-Arterien-Bypass-Verfahren werden jedes Jahr durchgeführt, wobei die Anzahl der Verfahren weltweit ähnlich ist.
Ein weiteres Problemgebiet ist die hepatobiliäre Chirurgie, bei der gegenwärtig verfügbare chirurgische Optionen für gutartige und bösartige Verengungen in den allgemeinen Distrikthospitälern nicht immer möglich sind. Ein zuverlässiges posthetisches Transplantat, um eine stenotische Lücke zu überbrücken oder um einen geschädigten Gang zu reparieren, würde viele Probleme bewältigen helfen. Cholecystectomien werden etwa 7 pro 10.000 Einwohner pro Jahr durchgeführt, und 1,7 pro 10.000 Einwohner haben Operationen am endocrinen System jedes Jahr in dem U.K.
In der folgenden Beschreibung wird auf die Verwendung von menschlichem Amnion Bezug genommen, obwohl es zu verstehen ist, daß die Erfindung nicht auf die ausschließliche Verwendung von menschlichem Amnion beschränkt ist. Das menschliche Amnion ist in frischem Zustand leicht bei Kaiserschnitten in den gynäkologischen Stationen erhältlich und kann in Organkultur gehalten werden. Eine Option zur Herstellung eines Verbundimplantats ist die Verwendung von intakten lebenden Amnionschichten. Die Erfinder haben Verfahren zur Aufschichtung des intakten Amnions auf die Oberfläche von prosthetischen Transplantaten entwickelt, um eine Auskleidung in dem Transplantatlumen zu bilden.
Obwohl schwierig, ist es möglich, vollständig durchgehende Nähte auf Amnionschichten aufzubringen und ein Amnionrohr im Lumen einer vorgebildeten Prothese anzufertigen. Um die Delaminierung oder Dissektion der Amnionschicht von der Wand des Transplantats zu verhindern, kann Fibrinkleber verwendet werden, um die Adhäsion zu fördern. Ein anderes Verfahren ist die Aufschichtung von intaktem Amnion auf die Oberfläche von Schichten aus gewebtem Dacron und die anschließende Ausbildung eines Rohres aus dem Verbundmaterial. Dies ist sicherlich möglich und weniger schwierig als die erste Technik.
Eine weitere Option zur Produktion eines Verbundimplantats im Falle von praktischen Problemen mit dem intakten Amnion ist die Verwendung von disaggregierten Amnionepithelzellen zur Auskleidung des Lumens von prosthetischen Transplantaten. Die Erfinder haben dieses Verfahren als eine Alternative zu einem intakten Amnion entwickelt. Die Lumenoberfläche eines Dacronrohrs kann mit großen Mengen von disaggregierten Amnionepithelzellen (im Gegensatz zu vaskulären oder kapillären Endothelzellen, bei denen die Gewinnung von Zellen in solchen Mengen ein Problem ist) ausgekleidet werden, die dann bis zur Konfluenz in einer Gewebskultur in vitro wachsen gelassen werden können. Der Zeitfaktor bis zur Konfluenz und die Dimension der Prothese müssen berücksichtigt werden, aber die Technik ist möglich und ein alternatives Verfahren.
Wegen der pluripotenten Fähigkeit der Amnionzellen können sie stimuliert werden, um köperliche Organgewebe zu regenerieren, Hormone, Neurotransmitter, endocrine und exocrine Sekretionen zu erzeugen, und um monoclonale und polyclonale Antikörper zu produzieren.
Die Amnionzellen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind lebensfähige Zellen, die entweder frisch sind oder aus Gewebs- oder Zellkulturen in geeigneten Medien stammen. Die Amnionzellen oder das Amniongewebe kann direkt oder nach Aufbringung auf ein Zwischenmaterial, z.B. eine Prothese oder einen biologisch verträglichen Träger, z.B. Mikrokugeln aus beispielsweise Sepharose, verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 bis 4 erläutern die Entwicklungsstadien des menschlichen Embryos.
Die Fig. 5 ist ein menschliches Kniegelenk, und die Fig. 6 und 7 zeigen femoral-popliteale Bypass-Segmente bei Menschen.
An verschiedenen Punkten der vorliegenden Anmeldung wird auf die vorstehenden Figuren Bezug genommen.

Ausführliche Beschreibung

Die jüngste Arbeit der Erfinder zur Transplantation von Kaninchen-Amnion in Kniegelenke von Kaninchen, aus denen der Knorpel vollständig herausgeschnitten worden war, zeigte, daß das Amnion fest in das Gelenk inkorporiert wird, eine vollständige Schicht aus neuem Knorpel gebildet wird und das Amnion als Synovialmembran wirkt, die die Gelenkoberfläche schützt u:nd gleichfähig macht. Diese dramatische Veränderungen treten in Abwesenheit des Axnnions nicht ein. Es wurden viele Beweise gefunden, um zu zeigen, daß die Amnionzellen zur Reparatur von Schaden, der an den Gelenken infolge von Oesteoarthritis oder rheumatoider Arthritis erzeugt wurde, fähig sind.
Es wurde seit vielen Jahrhunderten bemerkt, daß eine der mehr unüblichen Besonderheiten des Amnions die Art ist, auf die Blutgerinsel nicht an dessen Oberfläche haften. Aus einigen Gründen ist das Amnion nicht thrombogen, und Blutgerinsel gleiten von dem Amnion ab, was im vollständigen Gegensatz zu jeder beliebigen anderen Zellmembran im Körper steht. Wir nehmen an, daß diese erheiternde Entdeckung zum großen Vorteil in Situationen, bei denen die Blutgerinnung ein größeres Problem ist, verwendet werden kann.
Wann immer synthetische Transplantate verwendet werden, um beschädigte Blutgefäße zu reparieren, neigen sie zum Verstopfen durch Blutgerinsel. Dies trifft besonders bei synthetischen Transplantaten mit kleinem Durchmesser zu, und aus diesem Grund können diese Transplantate nicht verwendet werden, um Koronarartherien zu ersetzen, eine Operation, die zu einer der häufigsten chirurgischen Verfahren, die in der westlichen Welt durchgeführt werden, geworden ist. Bei der Transplantation von Koronararther ien-Bypässen müssen Segmente aus einer Artherie oder einer Vene von dem Patienten selbst verwendet werden. Gefäße aus anderen Spendern können wegen der Wahrscheinlichkeit der Abstoßung nicht verwendet werden, und selbst Gefäße von dem Wirt sind nicht frei von der Gefahr einer Thrombose oder einer Gerinselbildung.
Es wurde gefunden, daß die einzigartigen Besonderheiten des Amnions zur Bildung von Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser oder zur Auskleidung von bestehenden synthetischen Transplantaten mit einer nichtimmunogenen, nichtthrombogenen Oberfläche mit guter Wirkung eingesetzt werden können.

Orthopädische Chirurgie

Jedes Gelenk in dem menschlichen Körper besitzt eine ähnliche Grundstruktur - es besteht aus zwei Knochen, die mit Knorpel ausgekleidet sind, und einer Synovialmembran, die in einem Gelenkraum eingeschlossen ist und die Synovialflüssigkeit enthält, die als Gleitmittel und als Puffer gegen Erschütterungen wirkt. Eine Anzahl von Bändern gewährleisten die Steifheit und Stabilität, und Muskeln kreuzen das Gelenk und erlauben die Bewegung und unterstützen ebenfalls die Stabilität (siehe Fig. 5). Eine Anzahl von Krankheitsprozessen stört die Struktur und die Funktion von Gelenken und viele tun dies durch Zerstören des Knorpels und der Synovialmembran.
Eine solche "Arthritis" bedeutet nur eine Entzündung eines Gelenks. Sie kann primär sein; in diesem Fall ist die Ursache nicht unmittelbar offensichtlich. Ein Beispiel dafür würde die Osteoarthritis oder die "Verschleiß"-Arthritis sein, die üblicherweise eine Begleiterscheinung eines hohen Alters ist. Zusätzlich ist die rheumatoide Arthritis eine Immunerkrankung, die zur Selbstzerstörung des Synoviums führt, wodurch der Knochen freigelegt wird, der an den gegenüberliegenden Knochen reibt, was zu einer sekundären Osteoarthrose führt. Eine Anzahl von infektiösen Zuständen, wie Tuberkulose, besitzen die gleiche Wirkung.
Wenn der verursachende Krankheitsprozeß durch Ruhe, Gewichtsverlust, verändertes Tempo oder Arzneimittel im Falle der rheumatoiden Arthritis gestoppt wird, dann schreitet die Erkrankung nicht weiter fort, aber der Schaden, der zugefügt wurde, repariert sich nicht von selbst und kann leicht schlechter werden.
Die Biotechnologie führt zu einigen erstaunlichen Entwicklungen, von denen keine im mindesten die Entwicklung von prosthetischen Gelenken ist, die üblicherweise aus Metallen und schlagfesten Kunststoffen gefertigt werden, die zum Ersatz des geschädigten Knochens verwendet werden. Diese operativen Verfahren sind extrem teuer - einige Hüftprothesen kosten Tausende von englischen Pfund. Die Operationen benötigen viel Zeit zur Durchführung und die Langzeitergebnisse sind nicht immer zufriedenstellend, da die Bestandteile des Gelenks genauso wie der ersetzte Knochen verschleißen.
Die Erfinder haben die Verwendung von Amnionepithel zum Ersatz von geschädigtem Synovium und Knorpel getestet und haben gefunden, daß dies eine echte Alternative zu gegenwärtigen Behandlungsoptionen ist.
Tn den von den Erfindern bisher durchgeführten Forschungsarbeiten wurden Amnionschichten über die freigelegten und geschädigten Gelenke genäht, aber diese Technik kann für die weitverbreitete klinische Anwendung nicht praktisch sein.
In den zwei veröffentlichten Berichten (Volkov 1973 und Vishwakarma 1986) bezüglich der Verwendung von Amnion für die Arthroplastik wird eine übliche Technik, die zuerst von Volkov beschrieben wurde, verwendet. Die Amnionmembran wurde aus der Geburtsstation bezogen und unter laufendem Leitungswasser 10 min lang gewaschen (nicht in insotoner Kochsalzlösung). Das Amnion wurde dann von Schleim und Mesenchym durch mechanisches Abkratzen mit Rasierklingen befreit, dann in Stücke geeigneter Größe (zur Transplantation in Hüftgelenke von Hunden oder von Menschen) geschnitten, in Mehrfachschichten auf Glasformen aufgebracht, 6 bis 8 h lang oder länger bei Raumtemperatur getrocknet, und die getrockneten Kapseln wurden dann in 1 % β-Propiolacton sterilisiert.
Die in Neu Delhi zur Amnionarthroplastik der Hüfttuberkulose durchgeführte Arbeit war grundsätzlich eine Verfeinerung der Technik nach Volkov und keine Lebensfähigkeitsstudien wurden an dem verarbeiteten Amnion durchgeführt (Krishnan 1980, Viswakarma und Krishnan 1981, Viswakarma 1986). Eine sorgfältige Untersuchung der vorausgehenden Technik der Amnionverarbeitung zeigt, daß jedes einzelne Verfahren das Uberleben der Amnionzellen immer schwierig machen würde. Waschen in Leitungswasser, mechanisches Abkratzen, Trocknen und anschließende Sterilisierung in β- Propiolacton tötet jede Zelle ab, und in der Tat waren die Amniontransplantate, die von Volkov (1973) und Vishwakarma (1986) verwendet wurden, überhaupt nicht lebensfähig.
Diese Tatsache wurde durch gegenwärtige Studien (Krishnan, unveröffentlichte Daten) an Amnion, das auf ähnliche Weise verarbeitet wurde, bestätigt. Jedoch waren die klinischen Ergebnisse trotz der Verwendung von nichtlebensfähigen Transplantaten in beiden Berichten ermutigend, und eine mögliche Erklärung wird nachstehend diskutiert.
Gemäß dem anderen relevanten Bericht von Gray et al. (1986) zur Verwendung von menschlichem Amnion für mikrovaskuläre Transplantate bei Ratten wird eine total verschiedene Technik zur Amnionverarbeitung verwendet. Das abgeschälte Amnion wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Schleim und das Blut zu entfernen, und dann mit 0,25 % Trypsin 2 h lang behandelt, um die Membran zu deepithelialisieren. Die Membran wurde dann in 1%igen phosphatgepufferten Glutaraldehyd bei 4ºC 24 h lang gegeben. Die Membranen wurden dann in 70%igem Isopropylalkohol bei 4ºC bis zur Transplantatherstellung gelagert. Es ist offensichtlich, daß diese Forscher nicht Amnionzellen im wirklichen Sinn verwendet haben. Bei ihrem Transplantat war das Epithel (das die nichtimmunogene Komponente und ein geeigneteres Material ist) tatsächlich durch Trypsinbehandlung entfernt worden, und daher bestand das Transplantat fast sicher aus azellulärem Amnionmesenchym mit ein paar Fibroblasten (die sehr stark immunogen sind, da sie HLA-Antigene tragen).
Wieder kann die Tatsache, daß die Autoren gute Ergebnisse mit einer beträchtlichen Re-Endothelialisierung des Transplantats (Gray et al. 1986) mit wenig Hinweis auf eine inflammatorische Antwort (eine ausführliche Diskussion einer Immunantwort, sofern vorhanden, fehlte in dem Bericht, und immunhistologische Techniken zur Identifizierung des zellulären Ursprungs wurden nicht durchgeführt) erhalten hatten, auf verschiedene Faktoren zurückgeführt werden. Fixierung mit Glutaraldehyd würde vermutlich die Antigenität (wie bei einer Schweineherzklappe eintritt) und so den Mangel an jeder signifikanten zellulären Antwort auf das menschliche Amnionmesenchym, das in die Ratte transplantiert wurde, verringern. Ferner kann das Mesenchym einen induktiven Effekt auf die Endothelzellen des Wirts haben.
Bei den Versuchen der Erfinder, die die direkte Implantation von lebenden menschlichen Amnionzellen in geschädigte Kniegelenke von Kaninchen betreffen, zeigen Kontrolltiere fast universell eine signifikante Bewegungseinschränkung im Knie, und dies ist eine Besonderheit aus den sehr frühen Stadien nach dem chirurgischen Eingriff. Bei der Autopsie sind eine jntraartikuläre Fibrose und Adhäsionen eine hervorstechende Besonderheit in dem Kontrollkniegelenk; in den meisten Fällen sind die Gelenkoberflächen rauh und entzündet und bei der Langzeitverlaufskontrolle der Tiere ist das Gelenk deutlich arthritisch. Im Gegensatz dazu ist ein Bewegungsverlust oder eine Bewegungseinschränkung bei den behandelten Kniegelenken selten. Die Bewegung bleibt gut erhalten und ist der normalen bei diesen Gelenken vergleichbar. Intraartikuläre Adhäsionen sind keine Besonderheit der behandelten Gelenke
Nichtlebensfähige menschliche Amnionscheiben scheinen physikalisch mehrere Monate lang in dem Gelenk intakt zu bleiben. Der histologische Nachweis des Amnions (nichtlebenfähige Amniongruppe) wurde mehrere Monate lang beobachtet und die längste Verlaufskontrolle, die verfügbar ist, ist ein Jahr nach der Operation. Es gab keinen Beweis einer akuten, manifesten Transplantatabstoßung im Falle von nichtlebensfähigen Ainniontransplantaten. Das fibrovaskuläre Reparationsgranulationsgewebe ragt aus den Grundschichten des nichtlebensfähigen menschlichen Amnions hervor, was eine Organisation dieses Transplantats nahelegt.
Es gibt einen Hinweis auf die Knorpelerneuerung auf den Gelenkoberflächen, die unter und direkt anschließend an die tiefste Schicht des toten menschlichen Amnions liegen, die vier bis sechs Wochen nach dem chirurgischen Eingriff beobachtet wurde und bei längerer Verlaufskontrolle deutlicher war. Dies legt die Möglichkeit nahe (da die Besonderheit der Knorpelerneuerung bei den Kontrollgelenken minimal ist), daß die toten Amnionscheiben einen mechanischen schützenden "Polster"-Effekt für den sich regenerierenden Wirtsknorpel bieten (der vermutlich von den Stammzellen in dem Knochenmark stammt) . Es wurde festgestellt, daß lebendes menschliches Amnion offensichtlich eine Immunantwort von sehr niedrigem Ausmaß in subkutanen Implantatproben nach sechs Wochen hervorruft. Es muß jedoch daran erinnert werden, daß dies im Kaninchen vorkommt, das überhaupt keine Ähnlichkeit zum Menschen zeigt.
Wieder scheinen lebende menschliche Amnionschichten mehrer Wochen lang physikalisch intakt zu bleiben, wobei die längste Verlaufskontrolle, die verfügbar war, zwei Monate nach einem chirurgischen Eingriff im Kniegelenk war. Eine große Anzahl von Gelenksproben werden gegenwärtig in EDTA von Calcium befreit, und eine ausführliche Anamnese von lebenden menschlichen und lebenden Kaninchen-Amniontransplantatproben ist bald verfügbar.
Sehnenbedeckungsversuche mit lebendem menschlichem Amnion zeigen, daß im Gegensatz zu Sehenreparaturen zur Kontrolle (ohne Amnionbedeckung), die massive Adhäsionen am benachbarten Gewebe und der Haut entwickeln, die von Amnion bedeckten Sehnen glatt und frei von Adhäsion sind. Dies wird bei klinischen Versuchen wiedergespiegelt, bei denen sie das volle Bewegungsspektrum und eine Freiheit von abnormalem Tempo besitzen. Sowohl Sehnen- als auch Subkutan-Implantatproben der lebenden menschlichen Amniongruppe liefern den Beweis einer Immunantwort auf das Amnion, aber in einigen Fällen scheint das Amnionepithel proliferiert zu haben.
Wenn jedoch die Annahme angenommen wird, daß die transplantierten toten Amnionkapseln als inerte, biokompatible, nichtimmonogene und nichtlebensfähige Fremdkörper funktionieren, dann würde man erwarten, den Organisationsprozeß und den schließlichen Abbau, der absolut nicht gesehen wurde, zu sehen. Die Wirtsantwort (d.h. die subchondrale Amnionkapsel der Knochengrenzfläche in dem Gelenk) der fibrovaskulären Granulationsgewebsbildung würde im Verlauf der Zeit eine geeignete Matrix für den metaplastischen Fibrinknorpel mit Ursprung aus dem Wirtsgewebe ergeben, der vielleicht durch die Inkorporation von Peptiden einer abgebauten und organisierten, nichtlebensfähigen Amnionmembranschicht supplementiert sein würde.
Eine andere und noch wichtigere Möglichkeit ist die Knorpelregeneration aus pluripotenten Stammzellen in dem subchondralen Knochenmark (das der Oberfläche durch Anbohren des Oberschenkelkopfes und des Azetabulums als Teil des chirurgischen Standardverfahrens in früheren Berichten exponiert wurde, und das nun als Mechanismus zur Knorpelreparatur gut angenommen ist)
Wedge (1986) demonstrierte eine solche Knorpelerneuerung in freigelegten Hüftgelenken von Hunden durch den einfachen Versuch, eine synthetische, biologisch abbaubare Polymerkapsel aus Poly-l-lactid in die Hüfte des Hundes zwischen dem rohen Oberschenkelkopf und den Azetabularoberflächen einzubauen. Er schlug vor, daß die Polymerkapsel als ein inertes, biokompatibles und biologisch abbaubares Polster in dem Gelenk funktionierte und einen mechanischen Schutzeffekt für den regenerierenden Knorpel ergab, was sonst eine Fehlantwort in den Kontrollexperimenten war. Ähnliche Beobachtungen wurden in gegenwärtigen Studien (Krishnan, unveröffentlichte Daten) unter Verwendung von toten menschlichen Amnionscheiben an Kaninchenkniegelenken erhalten, aber benötigen eine weitere Begründung. Es liegt auch der Vorschlag vor, daß einige Komponenten des Amnions einen induktiven Einfluß zur Verstärkung der Wirtsknorpelregeneration beigetragen haben könnten.
Aus der in Neu Delhi durchgeführten Arbeit geht hervor, daß die Transplantation der Amnionscheiben in menschliche Hüftgelenke, die von einer durch Tuberkulose hervorgerufenen Arthritis befallen sind, extrem erfolgreich ist, um Schmerzen zu lindern und um diese Patientengruppe beweglich zu machen. Es scheint daher offensichtlich, daß, wenn totes Amnion nur als Schutzpolster wirken würden, dann sehr bald nach der anfänglichen guten Antwort sich die Situation verschlechtern würde, wenn das Polster durch die Wirkung des Gelenks zerstört wird.
Arbeit mit monoclonalen Antikörpern, die unter der Leitung von der Erfindern durchgeführt wurde, zeigte, daß bei Kaninchen, die mit lebendem Kaninchen-Amnion behandelt worden waren, das Knorpelneuwachstum nicht aus dem Wirtsknochen, wie ursprünglich angenommen, sondern aus dem lebenden Kaninchen-Amnion entspringt.
Die vorläufigen Ergebnisse der Erfinder an Kaninchen-Amnion-Transplantaten in von Knorpel befreiten Kaninchenkniegelenken sind extrem aufregend. Diese Entdeckungen umfassen einen vollständigen Bewegungsbereich in dem Knie, das Fehlen von intraartikulären Adhäsionen, intakte Kaninchen-Amnionschichten in situ und am ermutigensten von allem den sichtbaren Beweis einer durchgehenden und ausgebreiteten Knorpelbedeckung der freigelegten Gelenkoberflächen. Die Kaninchen-Amnionschichten wurden an die Knorpelbereiche fest gebunden, was zwei Möglichkeiten nahelegt:
a) Regeneration des Wirtsknorpels durch Induktion, was weitere Beweiskraft gegen den rein mechanischen Schutz hinzufügt,
b) Knorpelmetaplasie des Kaninchen-Amnions selbst, da speziesspezifische Unterschiede nicht gelten. Fünf derartige Kaninchen wurden getötet, und alle fünf zeigten ähnliche Befunde. Die Histologie bestätigt die Natur dieser Substanz als Knorpel und immunologische Studien bestätigen das Schicksal des Kaninchen-Amnions. Es wurde bereits eine große Anzahl von weiteren Versuchen durchgeführt, und die Ergebnisse sind in Kürze verfügbar. Klinisch sind diese Tiere alle gesund und besitzen ein volles Bewegungsspektrum in den Gelenken.
Es wurde somit gezeigt, daß lebendes Amnion erfolgreich eine Knorpelregenation in zerstörten Gelenken hervorruft.

Beispiel 1

Amnion von Kaninchen oder von Menschen oder anderen Arten wird durch einen Kaiserschnitt gewonnen, und bei Verwendung von Kaninchen wurden zeitgepaarte trächtige Tiere nach 27- bis 28-tägiger Trächtigkeit ausgewählt. Die Mehrfachmembranen aus jedem Trächtigkeitssack werden in dem Gewebskulturmedium gehalten und Lebensfähigkeitstests werden unter Verwendung von Bromdesoxyuridin als Marker durchgeführt. Lebensfähige Amnionmembranen werden transfixiert und dann an die speziellen Gewebe in den Transplantatversuchen genäht.
Danach wurden aplastische Versuche in dem rechten Kniegelenk der Kaninchen durchgeführt, und die Standardoperation wurde durchweg verwendet, die Bänder wurden intakt gelassen und die Gelenke wurden vollständig von dem Gelenksknorpel befreit. Die anschließenden Verfahren unterschieden sich nur hinsichtlich des in die Gelenke eingelegten Materials. Die Kniegelenksversuche bestanden aus den folgenden Gruppen:
a) Kontrollen, bei denen nur Knorpel herausgeschnitten wurden - 17 Kanichen,
b) Transplantate von mehrschichtigen Scheiben von verarbeitetem, nichtlebensfähigem, menschlichen Amnion - 31 Kaninchen,
c) Transplantate von lebensfähigem menschlichem Amnion - 31 Kaninchen,
d) Transplantate von lebensfähigen Kaninchen-Amnion - 29 Kaninchen,
e) Implantat einer inerten, biologisch abbaubaren Polymerschicht in das Kniegelenk - 7 Kaninchen.
Die Gelenke waren nach dem chirurgischen Eingriff stabil und eine unbegrenzte Aktivität wurde in den meisten Fällen zugelassen.
Die Sehnenexperimente wurden an 22 Kaninchen durchgeführt, und das Verfahren war mit der Abtrennung der Plantaris longus und der Achillessehnen nach Herausschneiden von Sehnenscheiden und mit anschließender Reparatur der Sehnen und kurzzeitiger Schienung durch eine Gipsbinde verbunden. Die Verlaufskontrollen umfaßten die vergleichende Bewertung des Bewegungsbereichs in ipsilateral operierten und kontralateralen, normalen Gelenken in jedem Tier und den Vergleich zwischen den Kontrollgelenken und den transplantierten Gelenken. Es wurden Experimente auf einer Tretmühle entwickelt, bei denen man die Kaninchen auf eine zweckgerichtet gebaute Tretmühle setzte und ihre Bewegung an den beiden hinteren Gliedmaßen auf einem Videofilm und anschließend eine Videodigitalisierung für die computerunterstützte Analyse des Tempomusters vornahm.
Autopsiestudien umfaßten die Exposition von zuvor operierten Stellen und die genaue Untersuchung und eine anschließende radikale Resektion des Gelenks und anderer Proben. Scheiben des distalen Femurs und der proximalen Tibia wurden zur langsamen Decalcifizierung in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) herausgeschnitten.
Die Proben wurden dann für histologische Schnitte durch einen Cryostaten gefroren oder guick-gefrostet. Die histologischen Studien umfaßten eine routinemäßige Anfärbung mit Hämatoxylin und Eosin und Toluidinblau und immunhistologische Untersuchungen. Verschiedene monoclonale Antikörper gegen verschiedene Komponenten des menschlichen Amnions und andere monoclonale und polyclonale Antikörper wurden verwendet.

Ergebnisse der Verlaufskontrolle

Knieexperimente - Kontrolle

Periode der Verlaufskontrolle - Bereich von 1 Woche bis 15 Monaten.
Anzahl der Kaninchen - 17, Sterblichkeit - keine.
Anzahl der Autopsierten - 17, Infektionen - keine.
Gelenkbewegung - Bewegungseinschränkungen aus frühen Stadien. Progressive Steifheit bei längerer Verlaufskontrolle. Verlust der Extension im Bereich von 10º bis 45º.
Mittelwert 23,53; Standardabweichung = 9,81; REM = 2,38.
Gesamtbefund - Intraartikuläre Adhäsionen und Fibrose. Mehrere Gelenke aufgelöst und arthritisch.
Histologie - Fibröses Gewebe auf den Gelenkoberflächen. Minimaler Hinweis auf Knorpelinseln. Keine signifikante Neochondrogenese.

Versuche am Knie - Totes menschliches Amnion

Periode der Verlaufskontrolle - im Bereich von einer Woche bis 20 Monaten
Anzahl der Kaninchen - 31, Sterblichkeit - 3
Anzahl der Autopsierten - 27, Infektionen - 2
Gelenkbewegung - Anfängliche postoperative Beschränkung der ROM. Nahezu normale ROM nach 3 bis 4 Wochen wieder erhalten. Verlust der Extension im Bereich von 0º bis 15º.
Mittelwert = 5, Standardabweichung - 4,6, REM = 0,89
Gesamtbefund - Geringe oder keine intraartikulären Adhäsionen. Amnionscheiben wurden bis zu 4 bis 6 Monaten beobachtet. Die Gelenkoberflächen sind in mehreren Fällen glatt, aber nicht in der lateralen Hälfte des Gelenks.
Histologie - Amniongewebsreste waren bis zu eine Jahr zu sehen. Kein offensichtliches Anzeichen einer Abstoßung, meist eosinophile und polymorphe Infiltration. Ein gewisses Anzeichen einer Neochondrogenese, hauptsächlich ein Organisationsprozeß.

Versuche am Knie - Lebendes menschliches Amnion

Periode der Verlaufskontrolle - im Bereich von einer Woche bis 12 Monaten
Anzahl der Kaninchen - 31, Sterblichkeit - 3
Anzahl der Autopsierten - 26, Infektionen - 2
Gelenkbewegung - In der Tat normale ROM bei den meisten Kaninchen.
Verlust der Extension im Bereich von 0º bis 10º.
Mittelwert = 3,08, Standardabweichung - 3,78, REM = 0,74
Gesamtbefund - Amnionschichten wurden bis zu 6 Monaten identifiziert. Keine intraartikulären Adhäsionen oder Fibrose. Die Gelenkoberflächen waren in vielen Proben glatt, jedoch auf das mittlere TF-Gelenk beschränkt.
Histologie - Das Amniongewebe färbte sich klar mit MAks an. Das Amnion scheint kurzzeitig unter Epithelproliferation zu überleben. Anzeichen für eine chronische Immunantwort vom niedrigen Typ auf das Amniongewebe.
Neochondrogenese war ausgeprägt, aber auf das mittlere TF-Gelenk beschränkt und kann eine Folge einer ungleichförmigen Belastung infolge der Umformungsprobleme während des chirurgischen Eingriffs sein. Versuche am Knie - Lebensfähiges Kaninchen-Amnion Periode der Verlaufskontrolle - 1 Woche bis 9 Monate.
Anzahl der Kaninchen - 29, Sterblichkeit - 2
Anzahl der Autopsierten - 23, Infektionen - 1
Gelenkbewegung - Normale ROM bei der Hauptzahl der Kaninchen. Verlust der Extension im Bereich von 0º bis 20º.
Mittelwert = 2,50, Standardabweichung - 3,81, REM = 0,75
Gesamtbefund - Amniongewebe wurde bis zu 4 Monaten identifiziert. Keine intraartikuläre Fibrose oder Adhäsionen. Die Gelenkoberflächen waren bei Hauptzahl der Fälle glatt und erneut eine Besonderheit des mittleren TF-Gelenks.
Histologie - Amnionschichten wurden mit Anti-BUDR identifiziert. Kein Anzeichen für eine akute Abstoßung wurde beobachtet.
Die Neochondrogenese war in dem mittleren tibio-femoralen Gelenk bei den untersuchten Proben hervorragend.

Versuche am Knie - Polymerimplantat

Periode der Verlaufskontrolle - 6 Wochen bis 6 Monate,
Anzahl der Kaninchen - 7, Sterblichkeit - keine
Anzahl der Autopsierten - 4, Infektionen - keine
Gelenkbewegung - Beschränkung der ROM aus den frühen Zuständen. Verlust der Extension im Bereich von 15º bis 30º.
Mittelwert = 19,29, Standardabweichung - 5,35, REM = 2,02
Gesamtbefund - Ausgeprägte Fibrose und Adhäsionen in den Gelenken. Die Polymerschicht schien sich früh abzubauen. Die Gelenkoberflächen waren den Kontrollgelenken ähnlich.
Histologie - Entzündliches Ansprechen auf das Polymerimplantat. Kein Hinweis auf eine Neochondrogenese in den untersuchten Gelenkproben.

Versuche am Knie - Gezüchtete Amnionzellen, die in das Kniegelenk injiziert wurden

Periode der Verlaufskontrolle - 2 bis 4 Monate
Anzahl der Kaninchen - 6, Sterblichkeit - keine
Anzahl der Autopsierten - 5, Infektionen - 1
Gelenkbewegung - Anfängliche postoperative Beschränkung der ROM. Guter Bewegungsbereich. Verlust der Extension im Bereich von 0º bis 15º.
Mittelwert = 4,5, Standardabweichung = 4,3
Gesamtbefund - Anzeichen einer Neochondrogenese. Kein Anzeichen einer akuten Abstoßung.
Histologie - Das Amniongewebe färbte sich mit MAks an.

Versuche am Knie - Gezüchtete Amnionzellen auf biologisch abbaubaren Kugeln

Periode der Verlaufskontrolle - 2 bis 4 Monate
Anzahl der Kaninchen - 6, Sterblichkeit - keine
Anzahl der Autopsierten - 6, Infektionen - keine
Gelenkbewegung - Anfängiche Bewegungseinschränkung gut. ROM nach einer Woche. Verlust der Extension im Bereich von 0º bis 15º.
Mittelwert = 3,0, Standardabweichung = 2,81.
Gesamtbefund - Keine intraartikuläre Fibrose oder Adhäsionen. Gelenkoberfläche in den meisten Proben glatt. Anzeichen einer Neochondrogenese.
Histologie - Das Amniongewebe färbt sich mit MAks an. Niedergradige Immunantwort.
Die Befunde legen nahe, daß die Neochondrogenese eine Besonderheit der transplantierten Gelenke im Gegensatz zu den Kontrollgelenken und den polymerimplantierten Geweben ist. Die Knorpelregeneration war hauptsächlich auf das mittlere tibio--femorale Gelenk (TF-Gelenk) in den untersuchten Proben beschänkt und schien hervorragend zu sein, wenn lebensfähige Amnionmembranen verwendet wurden. Die Befunde in einigen der Gelenkproben legten eine Möglichkeit metaplastischer Veränderungen in dem Amniongewebe an sich in den Bereichen der Knorpelregeneration nahe. Dies würde nahelegen, daß das Amnion einer Transformation in dem Wirtsgewebe unterliegt, d.h. dem Knorpel oder der Sehne. Alternativ kann der regenerierte Knorpel aus pluripotenten Wirtsstammzellen in dem Knochenmark unter dem Stimulus spezifischer Wachstumsfaktoren hervorgehen. Demgegenüber steht der Mangel an Knorpelentwicklung bei Gelenken, die mit Polymerimplantaten eingepaßt wurden.

Versuche mit Sehnen

Periode der Verlaufskontrolle - im Bereich von 2 Wochen bis 3 Monaten
Anzahl der Kaninchen - 22, Versager - 2
Anzahl der Autopsierten - 20
Kontrollen = 6, Menschliche Amnionbedeckung 0,7, Kaninchen-Amnionbedeckung = 7
Befunde - C Adhäsionen auffällig, Grad 3 oder 4 die Sehne verheilte zu einer fibrotischen Masse
- H Wenig Adhäsionen, Grad 1 und 2 die Sehne heilte zufriedenstellend
- R Minimale Adhäsion, Grad 1 die Sehne heilte zufriedenstellend
Die Amnionmembranen scheinen die Adhäsionen nach dem chirurgischen Eingriff an der Sehne bei dem Kaninchen zu verhindern. Die Adhäsionen waren minimal, wenn Kaninchen-Allo-Amnion verwendet wurde. Eine chronische Immunantwort niedrigen Grades wurde bei menschlichem Amnion beobachtet. Die Achillessehnen und die Plantaris longus-Sehne heilten bei den Amnionbedeckungsexperimenten gut, aber bei den Kontrollen heilten die Sehnen üblicherweise mit Adhäsionen.

Gefäßtransplantate

Blut ist der Lebensspender. Es trägt den Sauerstoff und die Metaboliten durch den Körper und nimmt Kohlendioxid und Abfallprodukte aus den funktionierenden Organen auf. Wie Blut der Lebensspender ist, so sind die Blutgefäße die Autobahnen.
Tm Verlauf der Zeit verengen sich die Arterien durch die Ablagerung von Artheromen (aus dem Griechischen und bedeutet wörtlich Brei). Diese Artherome verringern das Lumen oder den Innendurchmesser der Gefäße und stören somit die Blutzufuhr zu den Zielorganen. Die unregelmäßige Wand der Blutgefäße verursacht eine Turbulenz im Blutfluß und erzeugt eine Prädisposition der Blutgefäße für die Ablagerung von mehr Blutgerinseln und Artheromen. Eine Anzahl von Faktoren verursachen bekanntlich eine Prädisposition für die Ablagerung von Artheromen und umfassen Bluthochdruck, Rauchen, Bewegungsmangel und erhöhte Blutfettgehalte. Die Folgen von verschlechterter Blutzufuhr infolge der Arterienverengungen können extrem sein:
- Sollte die Blutzufuhr zum Gehirn unterbrochen werden, dann stirbt das Gewebe dieses Gehirnbereiches, das von diesem Gefäß versorgt wird, ab und führt zu einem Schlaganfall oder einem cerebrovaskulären Ereignis (CVA). Dies verursacht, daß die Bereiche des Körpers, die von diesem Teil des Gehirns gesteuert werden, arbeitsunfähig werden, was entweder zur Paralyse, zum Sprachverlust oder anderen derartigen katastrophalen Folgen führt.
- Das Herz, das das Blut durch den Körper pumpt, ist ein Muskel, der eine Blutzufuhr benötigt, und wenn die Koronararterien (so genannt, weil sie wie eine Korona oder eine Krone geformt sind) verschlossen werden, dann stirbt der Teil des Herzmuskels, der von dieser Arterie versorgt wird, ab, und das Herz pumpt weniger effektiv. Dies ist als Myokardinfarkt bekannt und seine Wirkungen sind im Sprachgebrauch als Herzanfall bekannt, der zum Tode führen kann.
- Wenn die Blutgefäße, die die Beine versorgen, verschlossen werden, dann erhalten die Muskeln, die uns das Gehen ermöglichen, zu wenig Sauerstoff und krampfartige Schmerzen werden bei Bewegung von den Patienten verspürt. Dies führt zu einem Bewegungsmuster, das von der Fähigkeit, nur kurze Entfernung zu gehen und dann anzuhalten, um auszuruhen und eine anständige Blutzufuhr zu erhalten, geprägt ist. Dieser Zustand ist als Claudicatio intermittens bekannt (bekannt nach Kaiser Claudius, der ausgeprägt hinkte).
Solche kardiovakulären Erkrankungen sind die häufigste Todesursache oder Invaliditätsursache in der westlichen Welt.

Therepeutische Implikationen

Die Bedeutung einer gesunden Gefäßzufuhr ist Ärzten seit vielen Jahren bekannt, aber erst in der vergleichsweisen jüngeren Vergangenheit ist die Medizin in der Lage, irgendetwas zu tun, um die Situation zu korrigieren. Die Identifizierung der Risikofaktoren ist offensichtlich von Bedeutung, und Ärzte behandeln nun Patienten mit erhöhtem Blutdruck, raten vom Rauchen ab, ermutigen zur Bewegung und versuchen, Bevölkerungsmitglieder mit einem Risiko für hohen Blutfettgehalte herauszusuchen. Sollten jedoch die Koronararterien verschlossen sein, was zu Schmerzen in der Brust führt, die einem Herzanfall vorausgehen, oder zeigt der Patient eine stark behinderte Bewegung infolge einer Claudicatio intermittens oder leidet an vorübergehenden Schlaganfällen, dann kann es für den Arzt angebracht sein, eine Bypass-Operation zu empfehlen.
Im Falle der Claudicatio intermittens ist eines der am häufigsten befallenen Gefäße die femorale Arterie in der unteren Hüfte, und es würde dann üblich sein, eine Bypass-Operation von der Hüfte bis unter das Knie zu empfehlen. Der Chirurg wird ein Loch oder eine Arteriotomie in dem Gefäß über und unter der Verengung oder Stenose in dem Gefäß vornehmen (siehe Fig. 5). Ein Bypass-Transplantat wird dann an diese zwei Arteriotomien genäht werden, wodurch das Blut an der Verengung vorbeifließen kann (siehe Fig. 6)
Wenn der Chirurg festgestellt hat, daß eine Verengung in den Koronararterien vorliegt, dann muß sich der Patient einer Koronararterien-Bypass-Transplantatoperation (CABG) unterziehen. Dies ist in Fällen notwendig, in denen eine kritische Stenose eines oder mehrerer der Gefäße vorliegt (siehe Fig. 7). Das beste gegenwärtig verfügbare Transplantat für diese Operation ist die lange Vena saphena im Bein. Dieses Gefäß nimmt das Blut vom Fuß auf und führt es zum Herzen zurück, kann aber geopfert werden, da es zahlreiche andere Rückkehrwege für das Blut aus dem Bein gibt.
Deshalb besteht der erste Teil der Operation darin, einen langen Einschnitt von der Hüfte bis zu dem Knöchel zu machen und die lange Vena saphena herauszuschneiden, jede einzelne Verzweigung abzubinden und die Vene aus ihrem Bett herauszuheben und anschließend die Wunde zu verschließen. Sobald dies durchgeführt wurde, muß das Gefäß umgedreht werden, da es Ventile enthält, die den Fluß in eine Richtung gewährleisten.
Im nächsten Schritt der Operation wird der Patient an eine Herz-Lungen-Bypass-Maschine angeschlossen, und das Herz wird gestoppt. Die Vene wird dann in das erkrankte Gefäß in dem Herzmuskel eingenäht, und danach wird sie nach erneutem Ingangsetzen des Herzens an die Aorta genäht (siehe Fig. 8). Sobald alle Leitungen zu der Bypass-Maschine entfernt wurden, läuft das umgedrehte Vena saphena-Transplantat von der Aorta zu der Koronararterie (hinter dem Punkt der Stenose), in das mit Sauerstoff beladenes Blut vom Herzen abgegeben wird (siehe Fig. 9).
Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um erkrankte Carotis-Arterien, die Blut an das Gehirn liefern, durch einen Bypass zu überbrücken, wobei eine Vene verwendet wird, die von der Carotis-Arterie im Nacken unter dem Punkt des erkrankten Segments verläuft und im Gehirn befestigt wird. Alternativ wird eine der Arterien, die Blut in das Gesicht transportiert, in die Gehirngefäße eingesetzt.
Die am häufigsten verwendeten synthetischen Materialien zur Legung eines Bypasses über periphere Stenosen sind Teflon und gewebtes oder gewirktes Dacron. Die im Handel erhält1ichen Transplantate sind extrem teuer und kosten im Durchschnitt 200 englische Pfund pro Transplantat. Ein Hauptvorteil, verglichen mit der Verwendung der langen Vena saphena ist die Tatsache, daß diese Transplantate aus dem Lager genommen werden können und einen größeren Durchmesser als die Vena saphena besitzen. Jedoch besitzen sie nicht die geeignete Auskleidung und sind so für die Bildung neuer Atherome prädispositioniert. Sie werden sehr oft blockiert, was zu einer zweiten oder gar dritten Bypass-Operation führt oder vielleicht sogar zu dem Verlust des Glieds.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von amniontischem Material als lebende Auskleidung für prosthetische Transplantate in der Gefäßchirurgie. Es wurde gezeigt, daß das Amnionepithel einzigartige Gleiteigenschaften (Hills 1986) besitzt und der für die Koagulation so notwendige Thrombocyten-aktivierende Faktor (1-O-Alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholin) in dem Amnion vor der Geburt nicht nachweisbar ist (Billah, 1985).
Gegenwärtige prosthetische Transplantate sind üblicherweise bei der Chirurgie des aortalen oder aortoiliakalen Segments erfolgreich und können dem erzeugten hohen Druck widerstehen. Die Thrombose in dem Transplantat ist kein Hauptproblem, was fast sicherlich auf die hohe Geschwindigkeit des Flusses zurückzuführen ist. Jedoch stellen periphere vaskuläre Bereiche, wie das femoral-popliteale Segment oder die Koronararterie ein größeres Problem für Transplantate dar, sei es die Vena saphena oder prosthetische Transplantate aus Polytetrafluorethylen und Dacron.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden gewirkte Dacrontransplantate mit einer einlagigen Schicht von Amnionepithelzellen, die in einer Gewebskultur gezüchtet worden waren, eingeimpft. Die Versuche der Erfinder haben gezeigt, daß diese Zellen innerhalb von 5 Tagen zur Konfluenz wachsen können. Die Zellen verhalten sich so, daß sie sich nicht "anhäufen" und bei Gabe in ein vaskuläres Milieu verhalten sie sich als vaskuläres Endothel und können Thrombose verhindern.
Das eingeimpfte Transplantat kann in einer Lösung aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einer Anzahl von Antibiotika gelagert werden, und eine Lagerzeit von bis zu 5 Jahren wird ins Auge gefaßt. Es ist vollständig möglich, einen breiten Bereich an Produkten für verschiedene anatomische Stellen und Größen zu produzieren.
Die Verwendung der Amnionmembran zur Bildung einer Auskleidung für prosthetische vaskuläre Transplantate liefert in der Tat eine lebende Epithelauskleidung. Die Idee ist extrem neu dahingehend, daß sie auf die Entwicklung eines bioprosthetischen Amnionverbundimplantats für spezielle chirurgische Zwecke abzielt. Es wurden Verfahren entwickelt, das intakte Amnion auf die Oberfläche von prosthetischen Transplantaten zu schichten, um eine Auskleidung innerhalb des Lumens zu bilden.
In einem Verfahren werden Amnionröhren nach sorgfältigem Herausschneiden einer Amnionschicht aus dem Chorion gebildet. Das Mesenchym wird dann mit einer Rasierklinge abgekratzt, wobei nur die einlagige Schicht der Amnionepithelzellen zurückbleibt. Diese wird zu einem Rohr geformt, in ein vorgeformtes Dacrontransplantat eingesetzt und an beiden Enden vernäht. Eine feste Einheit muß gebildet werden, um eine aneurysmale Dissektion zwischen den beiden Schichten zu verhindern.

Zellkulturprotokoll

Abgeworfenen Amnionchorions aus normalen Schwangerschaften werden während ausgewählten Kaiserschnitten in eiskaltem Minimalnährmedium mit Hank-Salzen und unter Pufferung mit HEPES gewonnen. Die Membranen werden unter mehrmaligem Austauschen der ausgewogenen Salzlösung nach Earles, der zweiwertige Kationen fehlen (EBSS), gewaschen, um Blutgerinsel und Decidua, die auf der Chorionoberfläche verblieben, zu entferne:n. An eine weitere 15-minütige Inkubation in EBSS schließt sich eine manuelle Abtrennung des Amnions aus dem Chorion an. Die Amnionmembranen werden dreimal in EBSS, welcher 100 Einheiten pro ml Benzylpenicillin und 100 ug pro ml Streptomycin enthält, gewaschen. Das Amnion wird in Stücke geschnitten, und jedes Stück wird kurz in EBSS, das 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA und Antibiotika enthält, abgebaut. Daran schließt sich eine 30-minütige länge Inkubation in frischem Trypsin-EDTA an, wobei intermittierend gerührt wird, um das Epithel abzulösen. Der Abbau wird durch Zugabe von fötalem Kälberserum (FCS) bis zu einer Endkonzentration von 10 % gestoppt. Nichtabgebaute Membran wird entfernt, und die Amnionzellen werden durch Zentrifugation bei 400 UpM gewonnen, anschließend zweimal im Medium gewaschen, bis zur Resuspension getrocknet und plattiert.
Die Amnionepithelzellen werden in Gewebskulturkolben geimpft, und die Kulturen werden in RPMI 1640-Medium (das mit 2 mmol Glutamin, 10 % hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum und Antibiotika wie vorstehend supplementiert war) bei 37ºC in 5 % CO2 für fünf Tage etabliert, wonach das Medium, das nichtadhärente Zellen enthält, durch frisches Meddium ersetzt wird, und die Kultur bis zur Konfluenz weitergeführt wird. Etwa 1 bis 2 hunderttausend Zellen können pro Kultur aus einer vollständigen Membran erhalten werden.

Beispiel 2

Sterile gewebte Dacron-Transplantate und Transplantate, die mit Collagen vorbeschichtet waren und einen Innendurchmesser von 6 mm hatten, wurden als 1 cm lange Segmente hergestellt. Die Amnionepithelzellen wurden wie folgt erhalten:
a) Direkt zum Zeitpunkt der Gewinnung der Membranen,
b) nach einer ersten Passage in Kultur und Konfluenz, durch Trypsinbehandlung der einlagigen Schichten mit 0,04 % Trypsin und 0,02 % EDTA in ausgewogener Salzlösung.
Die Amnionzellen wurden in Wachstumsmedium (RPMI 1640) mit den vorstehenden Additiven suspendiert und mit 25 mmol HEPES gepuffert und in das Transplantatlumen geimpft. Das Transplantat wurde zuerst in einer vertikalen Position angebracht, und das Lumen wurde mit der Zellsuspension gefüllt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden die Transplantatsegmente horizontal angeordnet und 90 Grad jede Minute für drei Rotationen gedreht und dann über eine Rotation alle fünf Minuten für 30 Minuten. Einige der beimpften Transplantate wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und 15 min lang mit 95%igem Alkohol bei Umgebungstemperatur fixiert, während die anderen in das Kulturmedium 48 h lang bei 37ºC vor einer solchen Fixierungsbehandlung gegeben wurden. Die Transplantate wurden mit destilliertem Wasser gespült und 2 min lang mit Gills Hämatoxillin angefärbt und anschließend weiter in Wasser und Alkohol gewaschen. Es wurde eine lichtmikroskopische Untersuchung durchgeführt, und die sichtbaren Zellen wurden gezählt.
Anfängliche Versuche zeigten, daß die direkten Zellen eine niedrige Impfeffizienz besitzen, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein von nichtlebensfähigen Zellen zurückzuführen ist. Jedoch besitzen Zellen, die in der ersten Passage waren, den Vorteil, eine Population von lebensfähigen, reinen Epithelzellen zu sein. Da eine hohe Impfintensität für eine hohe anfängliche Befestigungsdichte benötigt wird, ist diese Technik sehr bevorzugt. Bei Impfdichten von 1,5 bis 200 hundertausend Zellen/cm² und nach mehrstündiger Inkubation und Sättigung wurde eine Zellbefestigung erzielt.
Die so hergestellten Gefäßtransplantate wurden Versuchstieren insertiert, um einen erfolgreichen Koronararterien-Bypass, einen aortal-iliakalen Bypass und einen femoral-poplitealen Segement-Bypass erfolgreich zu erzielen.

Claims

1) Verbundimplantat zur chirurgischen Verwendung, umfassend eine Prothese, die mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Amniongewebe beschichtet und/oder laminiert und/oder infundiert ist.

2) Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Vorrichtung für die Insertion in eine Arterie, eine Vene, einen Gallengang oder einen Harnleiter dimensioniert ist.

3) Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Amnionzellen frei von Mesenchym sind.

4) Vorrichtung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Amnionzellen zur Bildung eines Überzugs auf dem Innenlumen eines synthetischen oder bioprothetischen Transplantats verwendet werden.

5) Vorrichtung nach Anspruch 4, worin der Überzug eine einlagige Schicht ist.

6) Biologisch verträglicher Träger mit der Eignung zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper, der mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Amniongewebe beschichtet ist.

7) Träger nach Anspruch 6 in Form einer Mikrokugel.

8) Träger nach Anspruch 6 oder 7, worin die Amnionzellen frei von Mesenchym sind.

9) Träger oder Vorrichtung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Amnionzellen oder das Amniongewebe menschlichen Ursprungs ist.

10) Verwendung von lebensfähigen Amnionzellen oder lebensfähigem Amniongewebe zur Aufbringung auf eine Prothese oder einen biologisch verträglichen Träger zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper zur Regeneration oder als Ersatz von erkranktem oder geschädigtem Gewebe.

11) Verwendung nach Anspruch 10, worin die Prothese oder der biologisch verträgliche Träger zur Implantation in menschliche oder tierische Skelettgelenke zur Regeneration oder als Ersatz von erkranktem oder geschädigtem Knorpel- oder Sehnengewebe verwendet wird.

12) Verwendung nach den Ansprüchen 10 oder 11, worin die Amnionzellen frei von Mesenchym sind.

13) Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin die Amnionzellen oder das Amniongewebe menschlichen Ursprungs ist.

14) Verfahren zur Herstellung eines Verbundimplantats zur chirurgischen Verwendung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Prothese mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Ainniongewebe beschichtet und/oder laminiert und/oder infundiert.

15) Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man einen biologisch verträglichen Träger mit der Eignung zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper mit lebensfähigen Amnionzellen oder mit lebensfähigem Amniongewebe beschichtet.

16) Verfahren nach den Ansprüchen 14 oder 15, worin die Amnionzellen frei von Mesenchym sind.

17) Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Amnionzellen oder das Amniongewebe menschlichen Ursprungs ist.