DE60319872T2

DE60319872T2 - Verfahren zur auswahl eines lipolytischen enzyms

Info

Publication number: DE60319872T2
Application number: DE60319872T
Authority: DE
Inventors: Christel Thea Jorgensen; Luise Erlandsen; Kim Borch; Jesper Vind
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2023-12-12
Also published as: WO2004053152A1; CA2508812C; ATE389731T1; AU2003302808B2; DE60319872D1; EP1573052A1; US20060057250A1; US8309147B2; CA2508812A1; EP1573052B1; AU2003302808A1; DK1573052T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von lipolytischen Enzymen zum Identifizieren eines Kandidaten, zur Verwendung als ein Backzusatz, der die Eigenschaften von einer Backware verbessern kann, wenn er zu einem Teig hinzugefügt wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass zahlreiche Eigenschaften von einer Backware durch Hinzufügen eines lipolytischen Enzyms verbessert werden können. Der Stand der Technik stellt eine große Anzahl von lipolytischen Enzymen, erhalten aus natürlichen Quellen oder durch Protein-Engineering, bereit. Evaluierungen in Backtests im Originalmaßstab erfordern im Allgemeinen eine große Anstrengung zum Isolieren und Herstellen jedes Enzyms in ausreichender Quantität, daher sind Auswahlverfahren nützlich, um Kandidaten für Tests im Originalmaßstab auszuwählen. WO 0032758 offenbart ein Verfahren zur Auswahl von lipolytischen Enzymen zur Verwendung zum Backen, basierend auf ihrer Aktivität gegenüber Esterbindungen in kurzkettigen und langkettigen Triglyceriden, Digalactosyldiglycerid und einem Phospholipid, insbesondere Phosphatidylcholin (Lecithin).
Von im Weizenmehl vorhandenen Lipiden ist bekannt, dass sie hauptsächlich aus Triglyceriden, Phospholipiden und Galactolipiden bestehen. Es ist bekannt, dass die Phospholipide in Weizenmehl hauptsächlich aus Lysophosphatidylcholin und Phosphatidylcholin bestehen, aber auch N-Acylphosphatidylethanolamin (APE) und N-Acyllysophosphatidylethanolamin (ALPE) beinhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben ein Verfahren zur Auswahl von lipolytischen Enzymen entwickelt, um Kandidaten für einen Backzusatz zu identifizieren, der die Fähigkeiten von einer Backware verbessern kann, wenn er zu dem Teig hinzugefügt wird. Die verbesserten Eigenschaften können ein größeres Volumen des Laibes, einen verbesserten Formfaktor, eine verbesserte Krustenstruktur und/oder verbesserte Teigstabilität, d. h. verbesserte Toleranz gegenüber verlängertem Andrücken einschließen.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines lipolytischen Enzyms zur Verwendung als einen Backzusatz bereit, umfassend:

a) Inkubieren von mindestens einem lipolytischen Enzym mit N-Acylphosphatidylethanolamin (APE) oder N-Acyllysophosphatidylethanolamin (ALPE),
b) Detektieren der Hydrolyse einer Esterbindung in APE oder ALPE, und
c) Inkubieren des mindestens einen lipolytischen Enzyms mit Phosphatidylcholin (PC),
d) Detektieren der Hydrolyse einer Esterbindung in dem PC, und
e) Auswählen eines lipolytischen Enzyms, das Esterbindungen in APE oder ALPE hydrolysieren kann und welches eine höhere hydrolytische Aktivität gegenüber Esterbindungen in APE oder ALPE im Vergleich zu Esterbindungen in dem PC aufweist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Lipolytische Enzyme
Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar zum Auswählen von lipolytischen Enzymen. Die zu testenden lipolytischen Enzyme können aus der großen Anzahl von im Stand der Technik bekannten lipolytischen Enzymen, z. B. solchen, die in WO 0032758 beschrieben sind, ausgewählt werden. Die zu testenden Enzyme können natürlich vorkommende Enzyme einschließen, insbesondere aus Mikroorganismen, wie z. B. Pilze und Bakterien, als auch Varianten, die durch Protein Engineering hergestellt wurden, z. B. solche, die in WO 0032758 beschrieben sind.
Die lipolytischen Enzyme können in ihrer unbehandelten oder isolierten Form getestet werden. Insbesondere kann es von Interesse sein, die Enzyme ausreichend zu reinigen, um eine Bestimmung der Menge an Enzymprotein zu erlauben.
APE oder ALPE
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet ein Substrat, das N-Acylphosphatidylethanolamin (APE) oder N-Acyllysophosphatidylethanolamin (ALPE) ist, mit den folgenden Strukturen, wo ALPE das R₁-CO an der sn-1- oder der sn-2-Position der Lysophosphatidylgruppe angefügt haben kann. R₁-CO, R₂-CO und R₃-CO sind jeweils eine Fettsäure, insbesondere eine unsubstituierte, nicht verzweigte Fettsäuregruppe mit 12-22 Kohlenstoffatomen, die gesättigt oder ungesättigt sein können, z. B. Palmitoyl (C16:0), Stearoyl (C18:0), Oleoyl (C18:1) oder Linoleoyl (C18:2).
APE und ALPE können zur Verwendung in dem Auswahlverfahren aus Weizenmehl isoliert werden, oder können synthetisiert werden, z. B. wie in den Beispielen beschrieben. Ein Gemisch von APE und ALPE kann als das Testsubstrat verwendet werden.
Inkubation und Hydrolyse
Die lipolytische Enzymaktivität von Interesse agiert darauf, die Esterbindung in APE oder ALPE zu hydrolysieren. Wenn APE als das Testsubstrat verwendet wird, setzt es daher eine oder zwei Fettsäuren (R₁-COOH und/oder R₂-COOH) frei, um ALPE oder N-Acyl-L-alpha-glycerylphosphorylethanolamin (N-GPE) zu bilden. Wenn ALPE als das Testsubstrat verwendet wird, hydrolysiert die Aktivität von Interesse ALPE in die freie Fettsäure R₁-COOH und N-Acyl-L-alpha-glycerylphosphorylethanolamin (N-GPE). Es mag von Interesse sein, eine Zahl von lipolytischen Enzymen auf der Basis von gleichen Mengen an Enzymprotein zu testen.
Die Inkubation und das Testen der lipolytischen Enzyme kann zweckmäßigerweise als ein Plattenassay, durch Dünnschichtchromatographie (thin-layer chromatography, TLC) oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC), z. B. wie in den Beispielen beschrieben, durchgeführt werden. Auch das in der dänischen Patentanmeldung PA 2003 01596 offenbarte Verfahren kann verwendet werden.
Auswahlsystem
Entsprechend zu der Erfindung werden die lipolytischen Enzyme auf ihre hydrolytische Aktivität auf Esterbindungen in APE oder ALPE und PC (Phosphatidylcholin, Lecithin) getestet. Dies kann mit dem Testen auf die hydrolytische Aktivität auf Esterbindungen in anderen Substraten kombiniert werden, und die kombinierten Ergebnisse können verwendet werden, um Enzyme als Kandidaten zum Testen im Backen auszuwählen.
Daher werden lipolytische Enzyme für eine höhere Aktivität auf APE/ALPE als auf PC (Phosphatidylcholin, Lecithin) ausgewählt. Die lipolytischen Enzyme können ausgewählt sein, eine höhere hydrolytische Aktivität auf Esterbindungen in Digalactosyldiglycerid zu haben. Das lipolytische Enzym kann ausgewählt sein, eine niedrige Aktivität auf Esterbindungen in einem C₁₆-C₂₀-Triglycerid, einem C₄-C₈-Triglycerid, einem Monoglycerid, Digalactosylmonoglycerid und/oder Lysophosphatidylcholin (Lysolecithin) zu haben. Die Tests können durchgeführt werden, wie z. B. beschrieben in WO 0032758 .
Verwendung der Auswahlergebnisse
Ein Kandidat kann basierend auf der hydrolytischen Aktivität gegenüber APE/ALPE und PC ausgewählt werden und kann weiter durch Hinzufügen in einen Teig und durch Backen des Teiges, um eine Backware herzustellen, getestet werden. Das Enzym kann in einer Dosis von 0,1 bis 10 mg Enzymprotein pro kg Mehl, z. B. etwa 1 mg/kg, hinzugefügt werden. Dies kann abgeschätzt werden durch Bestimmen von Eigenschaften, wie Volumen des Laibes, Formfaktor, Krustenstruktur und/oder Teigstabilität, z. B. Toleranz gegenüber verlängertem Andrücken durch konventionelle Verfahren, z. B. wie beschrieben in WO 0032758 .
Die durch das erfindungsgemäße Auswahlverfahren ausgewählten lipolytischen Enzyme können einzeln oder in Kombination zu dem Teig hinzugefügt werden, wie z. B. beschrieben in WO 0203805 . Wahlweise kann auch ein zusätzliches Enzym zu dem Teig hinzugefügt werden. Das zusätzliche Enzym kann ein anderes lipolytisches Enzym, eine Amylase, insbesondere eine Anti-Altbacken (anti-staling) Amylase, eine Amyloglucosidase, eine Cyclodextringlucanotransferase, oder das zusätzliche Enzym kann eine Peptidase sein, insbesondere eine Exopeptidase, eine Transglutaminase, eine Cellulase, eine Hemicellulase, insbesondere eine Pentosanase, wie z. B. Xylanase, eine Protease, eine Proteindisulfidisomerase, z. B. eine Proteindisulfidisomerase, wie offenbart in WO 95/00838 , eine Glycosyltransferase, ein Verzweigungsenzym (branching enzyme) (1,4-alpha-glucan branching enzyme), eine 4-alpha-Glucanotransferase (Dextringlycosyltransferase), eine Lactase (Galactosidase), oder eine Oxidoreduktase, z. B. eine Peroxidase, eine Laccase, eine Glucoseoxidase, eine Pyranoseoxidase, eine Lipoxygenase, eine L-Aminosäureoxidase oder eine Carbohydratoxidase.
Die Amylase kann eine Pilz- oder bakterielle alpha-Amylase, z. B. aus Bacillus, insbesondere B. licheniformis oder B. amyloliquefaciens, oder aus Aspergillus, insbesondere A. oryzae, einer beta-Amylase, z. B. aus einer Pflanze (z. B. Sojabohne) oder aus mikrobiellen Quellen (z. B. Bacillus) sein. Die Amylase kann eine Anti-Altbacken-(anti-staling)-Amylase sein, wie beschrieben in WO 9953769 , d. h. eine Amylase, die wirksam ist im Verlangsamen des Altbackenwerdens (Härten der Krume) von Backwaren, insbesondere eine maltogene alpha-Amylase, z. B. aus Bacillus stearothermophilus-Stamm NCIB 11837.
Teig
Der Teig umfasst im Allgemeinen Weizenkernmehl oder Weizenmehl und/oder andere Arten von Kernmehl, Mehl oder Stärke, wie z. B. Maismehl, Maisstärke, Roggenkernmehl, Roggenmehl, Hafermehl, Haferkernmehl, Sojamehl, Hirsekernmehl, Hirsemehl, Kartoffelkernmehl, Kartoffelmehl oder Kartoffelstärke.
Der Teig kann frisch, gefroren oder vorgebacken sein.
Der Teig ist normalerweise ein gesäuerter Teig, oder ein Teig, der dem Gären unterzogen wird. Der Teig kann auf zahlreiche Arten angesäuert werden, wie z. B. durch Hinzufügen von chemischen Gärungsstoffen, z. B. Natriumbicarbonat, oder durch Hinzufügen eines Sauerteigs (Gärteig), aber es ist bevorzugt, den Teig durch Hinzufügen einer geeigneten Hefekultur, wie z. B. einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae (Backhefe), z. B. eines kommerziell erhältlichen Stammes von S. cerevisiae, anzusäuern.
Der Teig kann auch weitere konventionelle Teigzutaten, z. B. Proteine, wie Milchpulver, Gluten und Soja; Eier (entweder ganze Eier, Eidotter oder Eiweiße); eine Oxidantie, wie z. B. Ascorbinsäure, Kaliumbromat, Kaliumiodat, Azodicarbonamid (ADA) oder Ammoniumpersulfat; eine Aminosäure, wie z. B. L-Cystein; einen Zucker; ein Salz, wie z. B. Natriumchlorid, Calciumacetat, Natriumsulfat oder Calciumsulfat umfassen.
Der Teig kann Fett (Triglycerid), wie z. B. granuliertes Fett oder Backfett umfassen, aber die Erfindung ist insbesondere anwendbar auf einen Teig, wo weniger als 1 Gew.-% Fett (Triglycerid) hinzugefügt wird, und insbesondere auf einen Teig, der ohne Hinzufügen von Fett hergestellt wird.
Der Teig kann weiterhin einen Emulgator, wie z. B. Mono- oder Diglyceride, Diacetylweinsäureester von Mono- oder Diglyceriden, Zuckerester von Fettsäuren, Polyglycerolester von Fettsäuren, Milchsäureester von Monoglyceriden, Essigsäureester von Monoglyceriden, Polyoxyethylenstearate oder Lysolecithin umfassen, aber die Erfindung ist insbesondere anwendbar auf einen Teig, der ohne die Zugabe von Emulgatoren (außer gegebenenfalls Phospholipid) hergestellt wird.
BEISPIELE
Beispiel 1: Zubereitung von Substraten
Isolierung von APE und ALPE aus Weizenmehl
Weizenmehl (1 kg) wurde zweifach mit MeOH (1,5 l, Rühren für 30 min) extrahiert. Die Extrakte wurden konzentriert und die Reste in Hexan (1 l) wiedergelöst und konzentriert. Ausbeute an Lipidextrakt: 8,5 g. Der Lipidextrakt wurde auf eine mit Silicagel (120 g) gepackte Säule aufgetragen, die mit 1 l Hexan/2-Propanol/Butanol/H₂O (60:30:7:3) präequilibriert war. Neutrale Lipide und Carotenoide wurden durch Elution mit Hexan (800 ml) und dann EtOAc (1,2 l) entfernt. Galactolipide wurden durch Eluieren mit Toluol/Aceton (1:1, 800 ml, MGDG) und Aceton (9 l, DGDG) entfernt. Schließlich konnten die Phospholipide (~ 1,1 g) mit MeOH (1 l) eluiert werden. Die einzelnen Phospholipide konnten durch Flash-Chromatographie (CHCl₃/MeOH/H₂O: 65:25:4) isoliert werden, um reine Fraktionen an APE und ALPE zu ergeben. Die Strukturen wurden verifiziert durch ¹H NMR und MS-Analyse.
N-Linoleoyl-1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamid (synthetisches ALPE)
1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (750 mg) wurde in trockenem Chloroform (25 ml) gelöst und Triethylamin (270 μl) wurde unter Schutzatmosphäre hinzugefügt. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und Linolsäureanhydrid (930 mg, 1.1 eq.) wurde tropfenweise unter Rühren hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur (Stickstoffatmosphäre) stehen gelassen und dann konzentriert, um ein Rohöl zu ergeben, welches durch Flash-Chromatographie (CHCl₃/MeOH/H₂O) gereinigt wurde, um das reine Produkt N-Linoleoyl-1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamid (0,54 g, 45%) zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch ¹H-NMR (CDCl₃/CD₃OD): 5,30 ppm (m, 6H, 3 × CH=CH), 3,6-3,8 ppm (m, 7H, sn-1,2,3-CH₂OPO), 3,12 ppm (t, 2H, CH₂N), 2,74 ppm (t, 2H, =CHCH₂CH=), 2,32 ppm (t, 2H, CH₂COO), 2,18 ppm (t, 2H, CH₂CONH), 2,00 ppm (m, 8H, CH₂CH=), 1,60 ppm (m, 4H, CH₂CH₂CH=), 1,30 ppm (m, 18 × CH₂), 0,89 ppm (m, 6H, 2 × CH₃).
Eine unsaubere Fraktion (0,82 g), die das Produkt (~ 30%) und Linolsäure enthielt, wurde zur weiteren Aufreinigung gesammelt.
Beispiel 2: Auswahl durch Plattenassay
Zubereitung von ALPE-Platten
Aus Weizenmehl isoliertes ALPE wurde verwendet, um Platten für Assays wie folgt zuzubereiten:

A) 50 ml 2% Agarose wurde in gereinigtem Wasser in einem Mikrowellenofen geschmolzen/gerührt und auf 60°C gekühlt.
B) 20 ml 2% ALPE in 0,2 M NaOAc, 10 mM CaCl₂, pH 5,5 wurde bei 60°C für 10 min gehalten und für 30 sec. Mit einem Ultrathorax vermischt.

Gleiche Volumina von A) und B) wurden gemischt, 100 μl 4 mg/ml Crystal Violet in gereinigtem Wasser wurde als Indikator hinzugefügt. Das Gemisch wurde in angemessene Petrischalen gegossen (z. B. 40 ml in eine 14 cm Durchmesser Schale oder 20 ml in eine 9 cm Durchmesser Schale), und zur Applikation der Enzymlösung wurden angemessene Löcher in den Agar gemacht (3–5 mm).
Auswahl von lipolytischen Enzymen
Eine Anzahl von lipolytischen Enzymen wurde in isolierter Form zubereitet. Die Enzymproben wurden auf eine Konzentration verdünnt, die einer OD₂₈₀ = 0,5–1,0 entspricht und 10 μl wurden in die Löcher in der Agarose-/ALPE-Matrix appliziert. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert und Aufklarungszonen in den Platten wurden nach einer Inkubation für 20 Stunden identifiziert. Die Ergebnisse wurden formuliert auf einer semiquantitativen Skala von A (größte Aufklarungszone) bis E (nahezu keine Aufklarungszone).
Auswahlergebnisse
Die Fusarium oxysporum-Lipase wurde als eine Kontrolle ausgewählt und eine größere Aufklarungszone als für die Kontrolle wurde für 2 der 20 getesteten lipolytischen Enzyme beobachtet.
Beispiel 3: Auswahl durch TLC-Assay
Lipolytische Enzymproben
Zehn lipolytische Enzyme mit Phospholipase-Aktivität wurden auf APE-/ALPE-Aktivität und PC-Aktivität getestet. Sie schließen zwei Monokomponentenenzyme ein, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden, und acht Varianten, die durch Aminosäuremodifikationen von lipolytischen Enzymen aus Pilzen erhalten wurden.
TLC-Assay
Jedes der zehn lipolytischen Enzyme (verdünnt auf OD₂₈₀ = 0,5) wurde mit 1–2% ALPE/APE in Puffer (0,1 M Tris-HCl bei pH 7,0 oder 0,1 M Acetatpuffer bei pH 5,5) bei 30–32°C für 4 Stunden inkubiert. Nach der Reaktion wurden die Eppendorfröhrchen in ein Eisbad überführt.
Proben für TLC wurden entnommen und auf ein Silicagel 60 F₂₅₄ Aluminiumblech (Merck) appliziert. Die Platte wurde eluiert in Chloroform-Methanol-Wasser 65:25:4 (Vol/Vol/Vol) und luftgetrocknet (Abzug). Die Phospholipide wurden sichtbar gemacht durch Eintauchen der Platte in ein Bad von 10% Kupfersulfat in 8% H₃PO₄ (Abzug) oder alternativ dazu in 2 M H₂SO₄. Nach dem Lufttrocknen wurde die Platte unter Verwendung einer Heizpistole (bis Flecken sichtbar wurden) oder im Ofen (5 min bei 200°C) erhitzt.
Von der exakten Zusammensetzung des Elutionsmittels war bekannt, dass sie die Migrationsdistanz stark beeinflusst, daher wurden immer frisch zubereitete Elutionsmittel verwendet. Es wurde darauf geachtet, dass der TLC-Behälter dicht verschlossen war, um ein Verdampfen zu verhindern. Die typischen Rf-Werte für die Referenzbestandteile waren nicht immer reproduzierbar, daher wurden immer Standards auf die Platte appliziert:

FFA (freie Fettsäure) 0,80

APE 0,55

ALPE 0,40
Backverhalten
Jedes der zehn lipolytischen Enzyme wurde zu einem Teig in einer Dosis im Bereich von 0,1–10 mg Enzymprotein pro kg Mehl (z. B. etwa 1 mg/kg) hinzugefügt.
Die Teige wurden zubereitet entsprechend einem standardeuropäischen ordentlichen Teigverfahren mit 100 Teilen (an Gewicht) an Mehl, 4 Teilen an Hefe, 1,5 Teilen an Salz, und 1,5 Teilen an Zucker, und, optimiert zu dem Mehl, Wasser. Die Teige wurden für Brötchen und Kastenbrot gewogen. Das Volumen des Brotes wurde durch das Rapssaat-Verdrängungsverfahren gemessen.
Korrelation zwischen der APE-/ALPE-Hydrolyse und dem Backen
Bei vier der zehn lipolytischen Enzyme wurde festgestellt, dass sie gute APE-/ALPE-Hydrolyse ergeben sowie, dass sie das Volumen des Laibes erhöhen. Bei den verbleibenden sechs lipolytischen Enzymen wurde festgestellt, dass sie eine geringe oder keine APE-/ALPE- Hydrolyse ergeben sowie, dass sie einen geringen oder keinen Anstieg des Volumens des Laibes ergeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass von einem lipolytischen Enzym, das gute APE-/ALPE-Hydrolyse ergibt, daher erwartet werden kann, ein gutes Backverhalten zu haben.
Beispiel 4: HPLC-Test
ALPE
ALPE wird in NaOAc-Puffer, pH 5, gelöst. 500 μl Substratlösung werden für 10 min auf 30°C erwärmt. 50 μl Enzymlösung werden für eine Reaktionsdauer von 10–180 min hinzugefügt. Nach der Reaktion wird eine 100-μl-Probe bei 95°C für 5 min inaktiviert. 900 μl Chloroform/Methanol (1:1) werden zu der Probe hinzugefügt. Die gesamte Probe wird zentrifugiert und durch HPLC analysiert (Microsorb-MV 100Si 250 mm Säule, Analytical Instruments). Mobile Phasen: A: 80% CHCl₃, 19,5% MeOH, 0,5% NH₄OH; B: 60% CHCl₃, 34% MeOH, 0,5% NH₄OH, 5,5% H₂O, laufen gelassen mit einem Gradienten. Detektor: Sedere, Sedex 75 Lichtstreuung, Temp. 40°C, Druck 3,5 bar.
APE
APE und N-GPE (z. B. 1:1) werden in einem NaOAc-Puffer, pH 5, 30°C, durch Mischen mit einem Ultrathorax vermischt. 500 μl Substratlösung werden für 10 min auf 30°C erwärmt. 50 μl Enzymlösung werden für eine Reaktionsdauer von 10–180 min hinzugefügt. Nach der Reaktion wird eine 100-μl-Probe bei 95°C für 5 min inaktiviert. 900 μl Chloroform/Methanol (1:1) werden zu der Probe hinzugefügt. Die gesamte Probe wird zentrifugiert und durch HPLC analysiert (Microsorb-MV 100Si 250 mm Säule, Analytical Instruments). Mobile Phasen: A: 80% CHCl₃, 19,5% MeOH, 0,5% NH₄OH; B: 60% CHCl₃, 34% MeOH, 0,5% NH₄OH, 5,5% H₂O, laufen gelassen mit einem Gradienten. Detektor: Sedere, Sedex 75 Lichtstreuung, Temp. 40°C, Druck 3,5 bar.
Beispiel 5: Auswahl durch einen Plattentest
Zubereitung von Lecithinplatten pH 5,5
10 g Agar in 0,1 M Trinatriumcitratdihydratpuffer (pH 5,5) in einem Gesamtvolumen von 11 wurden in einem Mikrowellenofen erhitzt, bis der Agar gelöst war. Dann wurden 6 g Lecithin (L-α-Phosphatidylcholin 95%) und 2 ml 2% Crystal Violet hinzugefügt. Die Mischung wurde mit einem Ultrathorax behandelt, bis das Lecithin dispergiert war, wonach es auf Deckel für Mikrotiterplatten gegossen wurde.
Zubereitung von APE-/ALPE-Platten, pH 5,5
1 g Agarose wurde in 50 ml H₂O hinzugefügt und in einem Wasserbad auf 65°C erhitzt, bis die Agarose gelöst war.
0,5 g APE/ALPE wurden zu einem 0,2 M Trinatriumcitratdihydratpuffer (pH 5,5) hinzugefügt und in einem Wasserbad bei 65°C erhitzt. 0,1 ml 2% Crystal Violet wurden hinzugefügt und Triton-x-100 wurde zu einer Konzentration von 0,1% hinzugefügt. Die zwei Lösungen wurden gemischt und das Gemisch wurde mit einem Ultrathorax behandelt, bis das APE/ALPE dispergiert war, wonach es auf Deckel für Mikrotiterplatten gegossen wurde.
Platten wurden ähnlich mit PC (Phosphatidylcholin, Lecithin) zubereitet.
Auswahl von lipolytischen Enzymen.
Aspergillus-Transformanden, die unterschiedliche lipolytische Varianten exprimieren, wurden in 0,2 ml YPM Wachstumsmedium in Mikrotiterplatten angeimpft und für 3 Tage bei 34°C wachsen gelassen.
96 Löcher wurden in die Lecithinplatten und die APE-/ALPE-Platten geschaffen. 5 μl von Kulturüberstand wurden in jedes Loch transferiert und bei 37°C für 20 Stunden inkubiert. Die Ergebnisse wurden semiquantitativ formuliert durch die Größe der Aufklarungszone.
Korrelation zwischen der APE-/ALPE-Hydrolyse und dem Backen
Fünf Varianten, die durch Aminosäuremodifikation von lipolytischen Enzymen aus Pilzen erhalten wurden, wurden in den oben angegebenen Plattentests und auch in Backtests getestet. Bei vier Varianten wurde festgestellt, dass sie ein gutes Backverhalten (erhöhtes Volumen des Laibes) haben, zwei von ihnen zeigten eine höhere Aktivität auf APE/ALPE als auf PC; eine zeigte beinahe gleiche Aktivität auf APE/ALPE und auf PC. Eine zeigte eine niedrigere Aktivität auf APE/ALPE als auf PC und wurde daher als nicht beweiskräftig betrachtet, da dies dadurch verursacht sein könnte, dass die Enzymmenge in der Kulturbrühe zu gering war.
Bei einer Variante wurde festgestellt, dass sie ein schwaches Backverhalten ergab und auch eine kleinere Zone auf den APE-/ALPE-Platten als auf PC zeigte.
Daher zeigen die Ergebnisse, dass von einem lipolytischen Enzym mit einer höheren Aktivität auf APE/ALPE als auf PC erwartet werden kann, ein gutes Backverhalten zu zeigen.
Beispiel 6: Auswahl von lipolytischen Enzymen
14 lipolytische Enzyme wurden auf ihre Aktivität auf APE/ALPE getestet. Die getesteten Enzyme schlossen vier Monokomponentenenzyme, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden, und 10 Varianten, die durch Aminosäuremodifikation von lipolytischen Enzymen aus Pilzen erhalten wurden, ein. Das Testen wurde durch Verfahren durchgeführt, die in der dänischen Patentanmeldung PA 2003 01596 beschrieben sind.
Die 14 lipolytischen Enzyme wurden auch in Backtests beurteilt. Bei sieben wurde festgestellt, dass sie ein gutes Backverhalten haben (erhöhtes Volumen des Laibes), und bei den anderen sieben wurde festgestellt, dass sie ein schwaches Backverhalten ergeben.
Ein Vergleich des Backverhaltens und der APE-/ALPE-Aktivität zeigte, dass die sieben Enzyme mit gutem Backverhalten eine höhere APE-/ALPE-Aktivität ergaben als die sieben mit schwachem Backverhalten.
Daher zeigen die Ergebnisse, dass von einem lipolytischen Enzym mit einer relativ hohen Aktivität auf APE/ALPE (pro mg Enzymprotein) erwartet werden kann, ein gutes Backverhalten zu zeigen.

Claims

Verfahren zur Auswahl eines lipolytischen Enzyms zur Verwendung als ein Backzusatz, umfassend: a) Inkubieren von mindestens einem lipolytischen Enzym mit N-Acyl-Phosphatidylethanolamin (APE) oder N-Acyl-Lysophosphatidylethanolamin (ALPE), b) Detektieren der Hydrolyse einer Esterbindung in APE oder ALPE, und c) Inkubieren des mindestens einen lipolytischen Enzyms mit Phosphatidylcholin (PC), d) Detektieren der Hydrolyse einer Esterbindung in PC, und e) Auswählen eines lipolytischen Enzyms, das Esterbindungen in APE oder ALPE hydrolysieren kann und welches eine höhere hydrolytische Aktivität gegenüber Esterbindungen in APE oder ALPE im Vergleich zu Esterbindungen in PC aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkubieren und das Detektieren einen Plattenassay, eine Dünnschichtchromatographie (DC), oder eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) umfasst.