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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Fachgebiet der Erfindung
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Die
Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Charakterisierung
von Transkriptionsfaktoraktivität
bereit. Insbesondere stellt die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte
bereit, die Proteinbindestellen enthalten, und Verfahren zum Detektieren
und Messen der Bindung von Proteinen, und insbesondere Transkriptionsfaktoren,
an die Bindestellen in diesen Konstrukten.
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Stand der Technik und verwandte
Techniken
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Eukaryonten
bestehen aus spezialisierten Zelltypen, die in Geweben und Organen
organisiert sind. Unabhängig
von Zelltyp und -funktion enthalten sämtliche Zellen innerhalb eines
einzelnen eukaryontischen Organismus denselben Satz von Genen, den
man als Genom bezeichnet. Unterschiede zwischen Zellen entstehen
durch die differenzielle Expression von Genen. Die Expression einzelner
Gene wird kontrolliert durch die Bindung von Proteinen an regulatorische
Sequenzen von DNA im Genom, wie z. B. Promotoren und Repressor-Elemente. Proteinbindung
an derartige Kontrollsequenzen kann einen Anstieg oder eine Abnahme
in der Transkriptionsrate eines Gens verursachen. Diese DNA-Bindungsproteine,
bezeichnet als Transkriptionsfaktoren, regulieren Gentranskription
und kontrollieren dadurch sämtliche
essenzielle Eigenschaften einer Zelle, einschließlich der zellulären Reproduktion,
Entwicklung und Differenzierung, der Antwort auf Umweltreize und
Gewebehomöostase
im normalen und im Krankheitszustand. Transkriptionsfaktoren umfassen
hunderte von spezialisierten Proteinen, die Genexpression regulieren,
indem sie entweder das Enzym RNA-Polymerase bei
der Initiation und Aufrechterhaltung der Transkription unterstützen oder
hemmen.
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Die
Aktivierung oder Inhibition von regulatorischen Transkriptionsfaktoren
findet als ein Downstream-Ereignis in Signaltransduktionskaskaden
statt, die durch Störungen
initiiert werden, wie z. B. eine Änderung des Oxidationszustands
einer Zelle, oder die Bindung eines Liganden an seinen Zelloberflächenrezeptor.
Im Fall von Zelloberflächenrezeptoren
kann ein Ligandenbindungsereignis eine Signalkaskade auslösen, die
sich auffächert,
um mehrere Gene zu regulieren, die zu biologischen Antworten beisteuern.
Crosstalk zwischen Signaltransduktionssystemen ist ebenfalls verbreitet,
wobei disparate Stimuli viele derselben Proteinkinasen, Phosphatasen
und Second-Messenger-Systeme nutzen. In hohem Maße verfeinerte Regulation von
biologischen Antworten findet somit statt als Netze von interagierenden
Signalsystemen, an denen Kinasen, Phosphatasen und Second Messenger
beteiligt sind, die durch jeden Stimulus ausgelöst werden, und die in qualitativ
und/oder quantitativ verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoraktivierungen
kulminieren. Es ist geschätzt
worden, dass es näherungsweise
1000 Transkriptionsfaktoren im humanen Genom gibt, welche die Spezifität beisteuern,
um die unabhängige
Expression von näherungsweise
40 000 Genen zu regulieren. Folglich können biologische Antworten,
die durch Änderungen
in der Genexpression gekennzeichnet sind, über verschiedene Signaturen
von Transkriptionsfaktoraktivierung definiert werden. Transkriptionsfaktoren sind
somit von bedeutendem Interesse als Angriffsziele, um spezifische
einzelne oder globale Änderungen
in der Genexpression zu bewirken.
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Zelloberflächenrezeptoren
sind ein primärer
Fokus pharmazeutischer Forschung und umfassen die Mehrheit der therapeutischen
Angriffsziele. Diese auf Rezeptoren abzielenden Strategien sind
bei der Behandlung von Krankheiten und bei lebensverlängernden
Maßnahmen
erfolgreich gewesen, aber die meisten dieser Therapien leiden an
einem Mangel an Spezifität.
In der Mehrheit der Fälle
sind Zelloberflächenrezeptoren
multifunktionell. Zum Beispiel kann ein gegebener Rezeptor auf verschiedenen
Zelltypen vorkommen und komplexe Netze von Signalkaskaden aktivieren,
um mehrere biologische Antworten zu regulieren. Ein gut untersuchtes
Beispiel für
den multifunktionellen Charakter von Rezeptoren ist der Insulinrezeptor.
Insulinrezeptoren sind in diversen Geweben weit verbreitet und aktivieren
mehrere Second-Messenger-Systeme um direkt metabolische Antworten
zu beeinflussen, die von der Glukosehomöostase bis zur Lipolyse, der
Blutplättchenaggregation
und, (wie) in jüngster
Zeit (bekannt wurde), der Bildung des Gedächtnis reichen (1–3).
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Die
Folge einer multifunktionellen Rolle für einzelne Rezeptoren besteht
darin, dass viele Arzneimittel, die heutzutage auf dem Markt sind,
nachteilige Nebenwirkungen haben, die der Gesellschaft und der pharmazeutischen
Industrie enorme Kosten abverlangen. Die Notwendigkeit, biologische
Antworten auf potenzielle therapeutische Mittel besser zu bestimmen
und den Charakter von potenziellen therapeutischen Mitteln vollständiger zu
verstehen, hat ein großes
Interesse für
die Entwicklung und Anwendung von DNA-Microarrays zur vergleichenden
Analyse von Genen geweckt.
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Das
Ergebnis von diesem Interesse sind viele Fortschritte und Erfolge
unter Verwendung von Genchip-Technologie gewesen. Durch das Screening
von zehntausenden von Genen auf DNA-Microarrays, sind Muster oder
Profile von Genexpression, die bis zu mehrere hundert Gene umfassten,
verwendet worden, um spezifische Krankheiten zu diagnostizieren
und zu klassifizieren (5).
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Dennoch
hat es sich in vielen Fällen
aufgrund der Komplexizität
der Krankheiten als schwierig herausgestellt, Profile der Genexpression
zu erhalten, die das Verständnis
des Krankheitsprozesses steigern.
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Unter
diesen Umständen
kann die Charakterisierung von Transkriptionsfaktoraktivität eine alternative Möglichkeit
bereitstellen, um Krankheiten zu diagnostizieren und zu klassifizieren.
Im Gegensatz zu Ergebnissen, die durch die Charakterisierung der
Genexpression von mRNA erhalten wurden, haben Berichte nachgewiesen,
dass signifikante qualitative und quantitative Unterschiede in der
Transkriptionsfaktoraktivität
mit der Expression von krankheitsassoziierten Genen, die für den Ausbruch
und den Verlauf von Infektionskrankheiten, Autoimmun-, inflammatorischen,
neurologischen, Zirkulations- (14) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (15, 17),
Adipositas (18) und Krebs (15, 16, 19) verantwortlich sind, verbunden
sind und diese möglicherweise
kontrollieren. Es ist nachgewiesen worden, dass Transkriptionsfaktoren
diagnostische (5) und prognostische (6) Anwendungen haben und es
sind Transkriptionsfaktoren als Angriffsziele für therapeutische Intervention
bei Krebs und inflammatorischen Erkrankungen (4) identifiziert worden.
Leider ist der Fortschritt bei der auf Transkriptionsfaktoren abzielenden
Therapie und bei transkriptionsfaktorbasierten diagnostischen und
prognostischen Anwendungen langsam gewesen, aufgrund des Engpasses,
der bei dem Screening einer großen
Anzahl von Proben auf mehrere Transkriptionsfaktoren besteht. Zurzeit
steht für
die schnelle umfassende Charakterisierung der Aktivität von mehreren
Transkriptionsfaktoren keine Technologie zur Verfügung.
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Konventionelle
Verfahren zum Detektieren und Messen von DNA-Bindungsproteinen,
wie z. B. Transkriptionsfaktoren, umfassen den Electrophoretic-Mobility-Shift-Assay
(EMSA)(24), Supershift-EMSA (25) und ELISA-basierte Methoden. Der
EMSA, oder die Gel-Retentionsanalyse,
stellt ein einfaches und schnelles Verfahren zum Detektieren von
DNA-Bindungsproteinen,
wie z. B. Transkriptionsfaktoren, bereit und ist verbreitet angewendet
worden. Der Assay basiert auf der Beobachtung, dass Komplexe aus
Protein und DNA langsamer durch ein nicht denaturierendes Polyacrylamid-Gel
wandern als freie DNA-Fragmente oder doppelsträngige Oligonukleotide. Der
EMSA wird ausgeführt,
indem man ein gereinig tes Protein oder ein komplexes Gemisch von
Proteinen, (wie z. B. nukleäre
oder Gesamtzellextrakt-Präparationen),
mit einem markierten DNA-Fragment, das die mutmaßliche Proteinbindestelle enthält, inkubiert.
Die Reaktionsprodukte werden dann mittels Elektrophorese auf einem
nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel analysiert. Die Spezifität des DNA-Bindungsproteins
für die
mutmaßliche
Bindestelle wird ermittelt, indem man Kompetitionsexperimente unter
Verwendung von DNA-Fragmenten oder Oligonukleotiden, die eine Bindestelle
für das
Protein von Interesse enthalten, und anderen, nicht verwandten DNA-Sequenzen, durchführt. Gel-Retentionsanalysen
verwenden typischerweise radioaktiv markierte DNA-Sonden, aber nicht
radioaktive Markierungen, wie z. B. Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffe
können
ebenfalls verwendet werden. Dieses Verfahren ist jedoch nicht für das schnelle Screening
einer großen
Anzahl von Proben oder mehreren Transkriptionsfaktoren gleichzeitig
geeignet.
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Der
Supershift-EMSA ist eine Ergänzung
zur Gel-Retentionsanalyse, der die spezifische Identifizierung des
DNA-gebundenen Proteins unter Verwendung von spezifischen Antikörpern erlaubt.
Der Supershift-EMSA wird ausgeführt,
indem man ein gereinigtes Protein, oder ein komplexes Gemisch von
Proteinen (wie z. B. nukleäre
oder Gesamtzellextrakt-Präparationen)
mit einem markierten oder unmarkierten DNA-Fragment, das die mutmaßliche Proteinbindestelle
enthält,
und einem Antikörper
gegen das mutmaßliche
Protein inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann mittels Elektrophorese
auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel analysiert und
der DNA-Protein-Antikörper-Komplex
kann detektiert werden, indem man die Markierung auf der DNA detektiert,
oder indem man einen Antikörper
verwendet, um den Antikörper
im DNA-Protein-Antikörper-Komplex
zu detektieren. Wiederum wird die Spezifität des DNA-Bindungsproteins
für die
mutmaßliche
Bindestelle durch Kompetitionsexperimente unter Verwendung von DNA-Fragmenten
oder Oligonukleotiden, die eine Bindestelle für das Protein von Interesse
enthalten, und anderen, nicht verwandten DNA-Sequenzen, ermittelt.
Der „Superkomplex" von DNA-Protein-Antikörper hat
eine signifikant reduzierte Mobilität im Vergleich zum DNA-Protein-Komplex,
wenn er der Elektrophorese in nicht denaturierenden Gelen unterzogen
wird. Obwohl nützlich
für die
Grundlagenforschung, sind Gel-Retentions- und Supershift-Analysen nicht
quantitativ und können
nur die Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten DNA-Bindungsproteins detektieren.
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Unlängst sind
ELISA-Methoden für
die Detektion von bekannten DNA-Bindungsproteinen erhältlich geworden
(22). In diesen ELISA-Assays sind DNA-Fragmente, die eine mutmaßliche Proteinbindestelle
enthalten, an eine feste Phase, wie z. B. die Böden der Vertiefungen (Wells)
einer 96-Well-Polystyrenplatte, gebunden. Die Probe, die ein gereinigtes
Protein enthält,
oder ein komplexes Gemisch von Proteinen (wie z. B. nukleäre oder
Gesamtzellextrakt-Präparationen)
wird in der Vertiefung inkubiert, welche das immobilisierte DNA-Fragment
enthält,
das die mutmaßliche
Proteinbindestelle enthält.
Die Vertiefung wird dann gewaschen, um sämtliche nicht gebundene Komponenten
der Probe zu entfernen, und ein Antikörper, der spezifisch für das mutmaßliche,
gebundene Protein ist, wird hinzu gegeben. Die Bindung des Antikörpers wird
unter Verwendung von Standard-ELISA-Methoden mit kolorimetrischer,
fluoreszenter oder chemilumineszenter Detektion erreicht.
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ELISA-Assays
sind ungefähr
10-fach sensitiver als Gel-Retentionsassays und können für die Hochdurchsatzanalyse
angepasst werden. Sie leiden jedoch an einem bedeutenden Nachteil,
insofern als die zielproteinbindenden Sequenzen bekannt sein müssen, und
Antikörper
zur Detektion des gebundenen Proteins erhältlich sein müssen. Demnach
sind sie auf Untersuchungen von Systemen begrenzt, die schon gut
charakterisiert worden sind. Des Weiteren können diese Assays nicht gebündelt werden,
und folglich macht das Probenvolumen, das benötigt wird, um ein Verzeichnis
von DNA-bindenden Markern zu erhalten, den breiten Einsatz dieser
Methode zum Erstellen von Profilen von DNA-Bindungsproteinen unmöglich.
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Ein
Multiplex-Transkriptionsfaktorassay, der auf einer Kombination aus
Gel-Retentionsassay und DNA-Chip-Technologie basiert, ist ebenfalls
vor kurzem beschrieben worden (23). In diesem Assay wird ein nukleäres Extrakt
mit einem Pool von biotinmarkierten doppelsträngigen Oligonukleotiden inkubiert.
Die proteingebundenen Oligonukleotide werden einer Elektrophorese
unterzogen, und der Anteil, der im Gel zurückgehalten wird, wird aus dem
Gel ausgeschnitten und eluiert. Die Sequenzen der Oligonukleotide
werden dann durch Hybridisierung mit einem Membran-Array bestimmt.
Obwohl diese Methode gebündelt
ist und ein Transkriptionsfaktorprofil erstellen kann, beinhaltet
sie mehrere Schritte und erfordert viele Manipulationen, die per Hand
ausgeführt
werden müssen,
und ist folglich ungeeignet für
Analysen mit moderatem oder hohem Durchsatz.
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Es
ist somit offenkundig, dass Zusammensetzungen und Verfahren, die
eine simultane Detektion von mehreren DNA-Bindungsproteinen in einem
Multiplex- oder Array-Format erlauben, und die Profile von DNA-Bindungsaktivität von Proteinen,
insbesondere Transkriptionsfaktoren, bereitstellen, außerordentlich wünschenswert
sind. Insbesondere ist es in hohem Maße wünschenswert, Assays zu entwickeln,
welche die Detektion und die Messung von mehreren Protein-DNA-Bindungsereignissen
in einer einzigen Probe erlauben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit neue Zusammensetzungen und Analyse-Verfahren
bereit, die eine spezifische Detektion von DNA-Bindungsproteinen
erlauben. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine wesentliche
Verbesserung gegenüber
dem vorbekannten Stand der Technik dar, insofern als sie einen quantitativen
Output bereitstellt, ohne die Notwendigkeit für spezifische Antikörper oder
Proteinbindungsreagenzien. Des Weiteren resultiert die vorliegende
Erfindung nicht in der Freisetzung von löslichen Signalmolekülen, sodass
die Detektion von DNA-Bindungsproteinen in einem Festphasen- oder
Flüssigphasen-Array-Format
ausgeführt
werden kann, wodurch der Einsatz von Signalamplifikationsverfahren
erleichtert wird, die nicht eingesetzt werden können, wenn ein lösliches
Signal erzeugt wird.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Folglich
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Zusammensetzungen
zum Detektieren von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen bereitzustellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die simultane
Detektion einer Mehrzahl von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen,
wie z. B. Transkriptionsfaktoren, bereitzustellen.
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Gemäß dieser
Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren
von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen bereitgestellt, das
Folgendes umfasst: (a) das Inkontaktbringen eines Detektions-Duplex
mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens ein
sequenzspezifisches DNA-Bindungsprotein enthält, für eine Zeitdauer, die ausreichend
ist, um eine sequenzspezifische Bindung zwischen dem besagten DNA-Bindungsprotein und
dem Duplex zu erlauben; (b) das Inkontaktbringen des Gemischs aus
Stufe (a) mit einem Spaltungsreagens, das zur Spaltung des Detektions-Duplex
in der Lage ist, wobei die Spaltung des Detektions-Duplex durch
Bindung des besagten DNA-Bindungsproteins
an den Duplex gehemmt wird; und (c) dem Detektieren der Inhibition
der Spaltung durch das DNA-Bindungsprotein. Das Spaltungsreagens
kann ein sequenzspezifisches Spaltungsreagens sein, wie z. B. eine
Restriktionsendonuklease, und der Detektions-Duplex kann die Erkennungssequenz einer
Restriktionsendonuklease umfassen. Die Restriktionsendonuklease
kann eine Typ II- oder Typ IIS-Restriktionsendonuklease sein, und
die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease kann die Erkennungssequenz
einer Typ I- beziehungsweise Typ IIS-Restriktionsendonuklease sein.
Das Spaltungsreagens kann auch eine Exonuklease sein, der eine signifikante Endonukleaseaktivität fehlt.
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Bei
diesen Verfahren kann der Detektions-Duplex umfassen: (i) ein erstes
Oligonukleotid, das eine Markierungssequenz umfasst und (ii) ein
zweites Oligonukleotid, das komplementär zu dem ersten Oligonukleotid
ist, wobei das zweite Oligonukleotid eine detektierbare Markierung
umfasst. Der Detektions-Duplex kann außerdem eine Einfangmarkierung
(Einfang-tag) umfassen. Der Detektions-Duplex kann vor dem Inkontaktbringen
mit der Probe über
die Einfangmarkierung auf einem festen Träger immobilisiert werden. Es
kann eine Mehrzahl von Detektions-Duplexen verwendet werden, wobei
jeder Detektions-Duplex eine Einfangmarkierung trägt, die
das Einfangen des Duplex auf einer vorbestimmten Position auf einer
festen Oberfläche
erlaubt.
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Gemäß einer
weiteren Aufgabe der vorliegenden Erfindung, wird ein Verfahren
zur Detektion von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen bereitgestellt,
das Folgendes Umfasst: (a) das Inkontaktbringen einer Probe, von
der angenommen wird, dass sie mindestens ein sequenzspezifisches
DNA-Bindungsprotein enthält,
mit einem Detektions-Duplex, für
eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine sequenzspezifische
Bindung zwischen dem besagten Duplex und dem Bindungsprotein zu
erlauben; und (b) die Detektion der Bindung zwischen dem Duplex
und dem Bindungsprotein. Der Duplex kann vor oder nach Stufe (a)
oder (b) auf einem festen Träger
immobilisiert werden. Die Immobilisierung kann über eine Einfangmarkierung
auf dem Duplex erfolgen. Die Detektion kann erzielt werden, in dem
man die Proteinprobe vor dem Inkontaktbringen mit dem Duplex mit
einer detektierbaren Markierung markiert. Die Detektion kann über ein
Detektionsreagens erzielt werden, das spezifisch das besagte Bindungsprotein
bindet, wie z. B. ein Antikörper.
Bei diesem Verfahren kann der Detektions-Duplex markiert werden,
und die Immobilisierungsstufe kann über das Einfangen des Bindungsproteins
auf einer Oberfläche
erzielt werden.
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Gemäß eines
weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren
von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen bereitgestellt, das
Folgendes umfasst: (a) das Inkontaktbringen einer Einfang-Oberfläche mit
einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens ein sequenzspezifisches DNA-Bindungsprotein
enthält,
für eine
Zeitdauer, die ausreichend ist, um das Einfangen des besagten sequenzspezifischen
Bindungsproteins auf der Einfang-Oberfläche zu erlauben, und (c) das
Detektieren der Bindung zwischen dem Duplex und dem Bindungsprotein.
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Die
hier beschriebene Erfindung widmet sich dem nicht gedeckten Bedarf
für einen
Hochdurchsatz-Multiplex-Assay zur Charakterisierung von Transkriptionsfaktoraktivität. Die Erfin dung
stellt Vorteile gegenüber
zurzeit erhältlichen
Technologien zur Charakterisierung von Transkriptionsfaktoraktivität bereit.
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Weitere
Aufgaben, Eigenschaften, Aspekte, Anwendungen und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung von bevorzugten
Ausführungsformen
ersichtlich werden, die folgt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
Beispiele für
Detektions-Duplexe. Alle Duplexe enthalten eine Proteinbindesequenz.
Der Detektions-Duplex kann vollständig doppelsträngig sein,
oder kann teilweise einzelsträngig
sein und teilweise doppelsträngig
sein, und kann Gaps (Lücken)
und Einzelstrangbrüche
enthalten. Der Detektions-Duplex kann aus einem oder mehreren Oligonukleotiden
aufgebaut sein und kann ein oder mehrere mit sich selbst hybridisierende
Regionen umfassen, die Haarnadel-Strukturen ausbilden. Der Detektions-Duplex
kann eine beliebige Kombination von natürlichen und nicht natürlichen
Nukleotiden enthalten und kann nicht natürliche Verknüpfungen
zwischen den Nukleotiden enthalten. Der Detektions-Duplex kann eine
oder mehrere detektierbare Markierungen umfassen und eine oder mehrere
Bindungsgruppen. Der Detektions-Duplex kann auf einem Träger immobilisiert
sein oder kann in der Lage sein, auf einem Träger immobilisiert zu werden
durch eine Bindungsgruppe oder durch Hybridisierung von einem einzelsträngigen Abschnitt
des Detektions-Duplexes mit einer komplementären Sequenz auf dem Träger. Der
Detektions-Duplex kann auch beabsichtigte oder unbeabsichtigte Basen-Fehlpaarungen
enthalten. Der Detektions-Duplex kann andere Einheiten, wie z. B.
Peptide, Kohlenhydrate, und dergleichen, umfassen.
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2 Eigenschaften
von externen Spaltungsreagenzien. Diese Figur fasst die Eigenschaften
von einigen der externen Spaltungsreagenzien der vorliegenden Erfindung
zusammen. „Polarität" beschreibt die Richtung
des Verdaus. „Substrat" beschreibt die Präferenz des
Enzyms für
einzelsträngige
(ss) oder doppelsträngige
(ds) DNA. „Struktur" gibt die bestimmten
Nukleinsäurestrukturen
an, die mit jedem Enzym kompatibel sind: „5'-PO4" gibt an, ob eine
5'-Phosphatgruppe
für die
Enzymaktivität
erforderlich ist, oder nicht. "5'-Ü" gibt an, ob das Enzym DNA mit einem
5'-Überhang
verdauen wird, oder nicht, "3'-Ü" gibt an, ob das Enzym DNA mit einem
3'-Überhang
verdauen wird, oder nicht, „blunt" gibt an, ob das
Enzym Aktivität
gegenüber
glatten (blunt) Enden von DNA-Fragmenten aufweist und „nick", gibt an, ob das
Enzym an einem Einzelstrangbruch (nick) in doppelsträngiger DNA
beginnend verdauen wird.
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3 stellt
die Detektion von Proteinbindung durch Schutz vor Spaltung durch
sequenzspezifische Spaltungsreagenzien, insbesondere Typ II-Restriktionsendonukleasen,
dar. Bei dieser Ausführungsform
enthält
der Detektions-Duplex innerhalb der Proteinbindesequenz eine Spaltungsstelle
für eine
Restriktionsendonuklease. Proben, die möglicherweise DNA-Bindungsproteine
enthalten, werden mit den Duplexen gemischt, und DNA- Bindungsproteine,
sofern vorhanden, binden an die Proteinbindesequenz. Anschließend wird
eine Restriktionsendonuklease hinzu gegeben. Wenn Protein an die
Proteinbindestelle gebunden hat, dann kann die Restriktionsendonuklease
die doppelsträngige
DNA nicht spalten, und die Markierung wird detektiert werden (3A). Wenn kein Protein an die Proteinbindestelle
gebunden hat, dann wird die Restriktionsendonuklease die DNA spalten
und die detektierbare Markierung freisetzen, die ausgewaschen werden
wird und nicht detektiert werden wird (3B).
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4.
Diese Figur stellt die Detektion von Proteinbindung durch Schutz
vor Spaltung durch sequenzspezifische Spaltungsreagenzien, insbesondere
Typ IIS-Restriktionsendonukleasen, dar, die DNA in einem bestimmten
Abstand von der Enzymbindestelle spalten. Bei dieser Ausführungsform
enthalten die Detektions-Duplexe außerhalb der Proteinbindesequenz
eine Bindestelle für
die Zielsuche von Restriktionsendonukleasen. Proben, die möglicherweise
DNA-Bindungsproteine enthalten, werden mit den Duplexen gemischt, und
DNA-Bindungsproteine,
sofern vorhanden, binden an die Proteinbindesequenz. Anschließend wird
eine Typ IIS-Restriktionsendonuklease zu der Reaktion hinzu gegeben.
Die Typ IS-Restriktionsendonuklease
bindet an ihre spezifische Bindestelle im Duplex und versucht, den
DNA-Strang in der Proteinbindesequenz zu spalten. Wenn Protein gebunden
an die Proteinbindesequenz hat, dann wird die zielsuchende Restriktionsendonuklease
nicht in der Lage sein, die doppelsträngige DNA zu spalten, und die
Markierung wird detektiert werden (4A).
Wenn kein Protein an die Proteinbindesequenz gebunden hat, dann
wird die Typ IS-Restriktionsendonuklease
die DNA spalten und wird die detektierbare Markierung freisetzten,
die ausgewaschen werden kann und nicht detektiert werden kann (4B).
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5.
Diese Figur stellt die Detektion von Proteinbindung an DNA durch
Schutz des Detektions-Duplex vor Verdau durch externe Spaltungsreagenzien
dar. In diesem Beispiel ist der Detektions-Duplex an einen Träger gebunden.
Das glatte Ende der doppelsträngigen
DNA-Sequenz ist
ein Substrat für
Exonukleasen, die spezifisch sind für glatte Enden, wie z. B. die
T7-Exonuklease und Exonuklease III. Eine detektierbare Markierung
wird an den Detektions-Duplex,
zwischen dem Träger
und der Proteinbindesequenz, angefügt. Proben, die möglicherweise
DNA-Bindungsproteine enthalten, werden mit den Duplexen gemischt
und DNA-Bindungsproteine, sofern vorhanden, binden an die Proteinbindesequenz.
Anschließend
wird eine für
glatte Enden spezifische Exonuklease hinzu gegeben. Wenn kein Protein
an die Proteinbindesequenz gebunden hat, dann ist die Exonuklease
frei, um den Detektions-Duplex in Richtung des Trägers zu
verdauen. Bei diesem Prozess wird die detektierbare Markierung freigesetzt
und wird nicht detektiert werden (5B).
Wenn Protein an die Proteinbindesequenz gebunden hat, dann wird
die Exonuklease nicht in der Lage quenz gebunden hat, dann wird
die Exonuklease nicht in der Lage sein, den Detektions-Duplex jenseits der
Bindestelle zu verdauen. Folglich wird die Markierung an den Detektions-Duplex und den Träger angebunden
bleiben und wird detektiert werden (5A).
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6 und 7 stellen
die Detektion von Proteinbindung an einen Detektions-Duplex durch
den Schutz einer Sonden-Einfangsequenz und die anschließende Detektion
der Sonden-Einfangsequenz
durch Hybridisieren mit einer detektierbaren Sonde dar. In diesem
Beispiel ist der Detektions-Duplex an einen Träger gebunden. Der erste Strang
der DNA ist kovalent am 3'-Ende
an den Träger
gebunden und ist am 5'-Ende
mit einer Phosphatgruppe markiert. Der zweite DNA-Strang ist durch
Hybridisierung an den ersten gebunden. Der Detektions-Duplex enthält eine
Proteinbindesequenz und eine Sonden-Einfangsequenz, wobei die Sonden-Einfangsequenz
sich zwischen dem Träger
und der Proteinbindesequenz befindet. Die Sonden-Einfangsequenz
ist so konstruiert, dass sie komplementär zu einer markierten Oligonukleotid-
oder Nukleinsäure-Sonde
ist. Die DNA wird mit einer Probe gemischt, und Proteine, sofern
vorhanden, binden an die Proteinbindesequenz. Anschließend wird
Lambda-Exonuklease
zu der Reaktion hinzu gegeben. Die Lambda-Exonuklease verdaut spezifisch
nur DNA-Stränge
vom 5'-Ende her,
die phosphoryliert sind. Wenn Protein an die Proteinbindesequenz
gebunden hat, dann wird der DNA-Strang vor dem Verdau durch Lambda-Exonuklease geschützt sein
(6). Als Nächstes
wird das Reaktionsgemisch hitzedenaturiert und gewaschen. Die Hitzedenaturierung
und das Waschen werden die Lambda-Exonuklease inaktivieren und entfernen,
das Protein von der Bindesequenz auf der DNA trennen, und die DNA-Stränge trennen,
welche allesamt ausgewaschen werden. Der erste DNA-Strang, der die
Sonden-Einfangsequenz enthält,
bleibt an den Träger
gebunden. Ein markiertes Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure wird
mit dieser Sondensequenz hybridisiert, um die Anwesenheit dieses
Stranges zu detektieren. Alternativ kann die Proteinbindesequenz
auch als Sonden-Einfangsequenz verwendet werden. Ein solches Format
würde jedoch
bei einem Multiplexformat für
jede Protein-Einfangsequenz ein unterschiedliches markiertes Oligonukleotid
erfordern, während
die Anordnung mit einer separaten Sonden-Einfangssequenz so konstruiert werden
kann, dass jede Sonden-Einfangssequenz dieselbe ist, während sämtliche
Proteinbindesequenzen verschieden seien können.
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Wenn
kein Protein an die Proteinbindesequenz gebunden hat, (7),
dann wird die Lambda-Exonuklease den ersten DNA-Strang bis auf den
Träger
herab verdauen und der zweite DNA-Strang, der mit dem ersten Strang
hybridisiert war, wird freigesetzt werden, da es keinen komplementären Strang
mehr gibt, mit dem er hybridisieren könnte. Wenn das Gemisch hitzedenaturiert
und gewaschen wird, werden der zweite DNA-Strang und der ver daute
erste Strang beide ausgewaschen und lassen nichts zurück, woran
das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure binden
könnten.
Demzufolge wird keine Markierung detektiert werden.
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8 Diese
Figur stellt die Detektion von Proteinbindung an DNA durch die Bindung
von markierten Proteinen an einen Detektions-Duplex dar. In diesem
Beispiel werden die Komponenten der Probe mit einer reaktiven Gruppe,
wie z. B. N-Hydroxysuccinimid-Derivaten von Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffen
wie z. B. Cy3 oder Cy5 (Amersham Biosciences), markiert. Nach dem
Markieren werden die markierten Proteine in Kontakt mit dem Detektions-Duplex
auf einem Träger
gebracht. Nachdem ungebundenes Material ausgewaschen wurde, werden
Proteine, die an die Proteinbindesequenz auf dem Detektions-Duplex
binden, über
die Markierung detektiert, die jetzt an den Träger gebunden ist. Alternativ
können
die markierten Proteine in Lösung
mit dem Detektions-Duplex in Kontakt gebracht werden, und der Detektions-Duplex
kann anschließend
auf einem Träger
eingefangen werden.
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9.
Diese Figur stellt die Detektion von Proteinbindung an Detektions-Duplexe
durch die Verwendung von Detektionsreagenzien zum Detektieren der
an den Detektions-Duplex gebundenen Proteine dar. In diesem Beispiel
lässt man
die Probe direkt mit einem immobilisierten Detektions-Duplex reagieren
und erlaubt Proteinen an die Proteinbindesequenz zu binden. Die
gebundenen Proteine werden anschließend mit einem Detektionsreagens
detektiert, das bestehen kann aus, zum Beispiel, Antikörpern, die
gegen spezifische Proteine gerichtet sind, Antikörpern, die gegen allgemeine
Klassen von Proteinen gerichtete sind, Antikörpern, die gegen spezifische
biochemische Motive, wie z. B. Phosphotyrosinreste, gerichtet sind,
oder ein Gemisch von Antikörpern
gegen viele Proteine, Klassen oder Motive. Alternativ können die
gebundenen Proteine mit anderen Biochemikalien detektiert werden,
wie z. B. Proteinen, die als SH2-Domänen-Proteine bekannt sind,
oder anderen rekombinanten oder synthetischen Protein-Aminosäuren, die
an die Proteine binden, die an die DNA gebunden sind. Alternativ
können
chemische Färbemittel
verwendet werden, um die an die DNA gebundenen Protein zu detektieren.
Derartige Färbemittel
können
die Farbe wechseln, wenn sie an bestimmte Arten von Proteinen gebunden
sind, oder es kann die Bindung des Färbemittels an bestimmte Arten
von Proteinen einen Wechsel von einem nicht fluoreszierenden Zustand
in eine fluoreszierenden Zustand induzieren (das PhosPhoQ-Proteinfärbemittel
von Pierce, zum Beispiel, färbt
nur phosphorylierte Proteine).
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10 stellt
die Detektion von Proteinbindung an Detektions-Duplexe durch ein
Einfangreagens dar. In diesem Beispiel wird ein markierter Detektions-Duplex
zu der Probe hinzu gegeben und man lässt Proteine an den Detektions-Duplex
binden. Protein-Duplex-Komplexe
werden dann auf einem Träger
eingefangen, der modifiziert wurde, sodass er ein Einfangreagens
auf seiner Oberfläche
umfasst. Nachdem die Komplexe eingefangen worden sind, wird die
Markierung auf dem Detektions-Duplex detektiert. Bei diesem Format
könnte das
Einfangreagens, zum Beispiel, ein für das Protein spezifischer
Antikörper
sein.
-
11. 11 stellt
die Detektion von Proteinbindung an Detektions-Duplexe durch ein
Einfangreagens dar. In diesem Beispiel wird ein markierter Detektions-Duplex
zu der Probe hinzu gegeben und man lässt Proteine an den Detektions-Duplex
binden. Dann wird ein erstes Einfangreagens hinzu gegeben, das an
die Protein-Komponente der Protein-Duplex-Kompiexe bindet. Diese ersten Einfangreagens-Protein-Duplex-Komplexe
werden dann auf einem Träger
eingefangen, der modifiziert wurde, sodass er ein zweites Einfangreagens
auf der Oberfläche
umfasst. Nachdem die Komplexe eingefangen worden sind, wird die
Markierung auf dem Detektions-Duplex detektiert. Bei diesem Format
könnte
das erste Einfangreagens, zum Beispiel, ein polyklonaler Ziegen-Antikörper sein,
der spezifisch für
das Protein ist, und das zweite Einfangreagens könnte ein Antikörper-spezifisches
Reagens sein, wie z. B. Protein G.
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12 zeigt
die Ergebnisse eines Experiments, das die Detektion von Proteinbindung
an Detektions-Duplexe mit Detektionsreagenzien demonstriert. Ein
Detektions-Duplex, der eine Einfangmarkierung enthält, wurde
durch das Annealing von zwei Oligonukleotiden erzeugt. Der so gebildete
Detektions-Duplex enthielt eine Bindestelle für NFκB-p50 und eine Einfangmarkierung.
Der Detektions-Duplex wurde mit einer Auswahl von Konzentrationen
des NFκB-p50-Proteins
inkubiert und wurde dann auf Beads (Kügelchen) eingefangen durch
Hybridisierung der Einfangmarkierung mit einem komplementären Oligonukleotid,
das an das Bead gebunden war. Gebundenes Protein wurde unter Verwendung
eines Kaninchen-Antikörpers gegen
das NFκB-p50-Protein,
gefolgt von einem phycoerythrinmarkierten Anti-Kaninchen-Antikörper, detektiert. Fluoreszenz-Signale
auf den Beads wurden in einem Luminex 100-Durchflusszytometer gemessen.
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13 zeigt
die Detektion von NFκB-p50-DNA-Bindungsprotein
durch Schutz des Detektions-Duplex vor Verdau durch das Typ IIS-Restriktionsenzym
Fok I. In diesem Beispiel wurde ein Detektions-Duplex verwendet,
der eine Einfangmarkierung, eine Markierung, eine Proteinbindestelle
und eine Fok I-Bindestelle umfasste. Der Detektions-Duplex umfasste
eine Fok I-Bindestelle und eine NFκB-p50-Bindestelle, dergestalt, dass
das Fok I(-Enzym) die DNA innerhalb der p50-Bindestelle spalten
würde.
Eine Biotin-Markierung wurde bei der Synthese in den Detektions-Duplex
eingebracht, sodass die Biotin-Markierung freigesetzt werden würde, wenn
der Duplex durch Fok I gespalten werden würde. Der Detektions-Duplex
wurde mit und ohne NFκB-Protein
inkubiert. Fok I-Enzym wurde hinzu gegeben und man ließ es reagieren.
Die Detektions-Duplexe wurden dann durch Hybridisierung der Einfangmarkierung
mit komplementären
Oligonukleotiden, die an die Beads gebunden waren, auf Beads eingefangen.
Die Biotin-Markierung wurde mit einem Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat
detektiert. Die Probe, die mit p50-Protein inkubiert wurde, erzeugte
ein erhebliches Signal, während
die Probe ohne p50-Protein fast gar kein Signal erzeugte, was darauf
hinweist, dass die Bindung des p50-Proteins den Duplex vor dem Verdau
durch das Fok I-Enzym schützte.
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14.
Detektion von NFκB-p50-Protein
durch Schutz des Detektions-Duplex vor Verdau durch die Lambda-Exonuklease.
In diesem Beispiel umfasste der Detektions-Duplex eine Proteinbindesequenz,
eine Biotin-Markierung und eine 5'-Phosphatgruppe am 5'-Ende von einem der DNA-Stränge, die
an Polystyren-Beads gekoppelt waren. Nach der Kopplung wurden die
an Beads gekoppelten Detektions-Duplexe mit und ohne NFκB-p50-Protein
inkubiert. Anschließend
wurde Lambda-Exonuklease hinzu gegeben und inkubiert, um dem Enzym
Zeit zu geben, den mit der 5'-Phosphatgruppe
markierten DNA-Strang zu verdauen. Im Anschluss an den Verdau wurde
Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat hinzu gegeben, um die Biotin-Markierung
zu detektieren, die auf dem Detektions-Duplex verblieben war, der
an die Beads gekoppelt war. In der Abwesenheit von p50-Protein wurde
die Detektions-Markierung vollständig
verdaut, während
in der Gegenwart von p50-Protein ein Signal von näherungsweise
3600 Fluoreszenz-Einheiten gemessen wurde, was zeigt, dass p50 anhand seiner
Fähigkeit,
die Aktivität
der Lambda-Exonuklease gegenüber
einem Detektions-Duplex zu hemmen, detektiert werden konnte.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Detektieren
und Identifizieren von sequenzspezifischen Nukleinsäure-Bindungsproteinen
in einer Probe bereit. Die Probe kann eine beliebige Probe sein,
wie z. B. ein Zell- oder Gewebeextrakt, von dem angenommen wird,
dass er derartige Bindungsproteine enthält. Die Verfahren und Zusammensetzungen
können
zum Detektieren eines beliebigen Proteins verwendet werden, das
in sequenzspezifischer Weise an Nukleinsäuren bindet. Beispiele für derartige
Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, eukaryontische Transkriptionsfaktoren.
Die Verfahren sind geeignet für
die schnelle und sensitive Multiplex-Detektion von Nukleinsäure-Bindungsproteinen.
-
Die
Verfahren umfassen entweder einen spaltungsbasierten Mechanismus
oder einen auf einem Proteinerkennungselement basierten Mechanismus.
Bei dem spaltungsbasierten Mechanismus wird ein markierter Detektions-Duplex
mit einer Probe in Kontakt gebracht, von der angenommen wird, dass
die ein sequenzspezifisches Nukleinsäure-Bindungsprotein enthält, dass
an eine Sequenz innerhalb des Duplex binden wird. In allen Fällen, kann
der Detektions-Duplex außerdem
eine Gruppe enthalten, die das Einfangen des Duplex auf einem festen
Träger
oder einer festen Oberfläche
erlaubt. Das Einfangen des Duplex kann vor oder nachdem Mischen
mit der Probe stattfinden. Die Verwendung dieser Einfanggruppe erlaubt
die Herstellung von Arrays zum Detektieren von mehreren Bindungsproteinen
in einer Probe, d. h., es erlaubt das „Multiplexen" der Methode.
-
Nach
einer Zeitdauer, die ausreichend ist, die Bindung zwischen dem Duplex
und jeglichen Proteinen in der Probe zu erlauben, wird der Duplex
mit einem Spaltungsreagens behandelt. Wenn Protein an den Duplex
gebunden ist, wird die Spaltung des Duplex durch das Spaltungsreagens
gehemmt. In umgekehrter Weise kann, wenn kein Protein gebunden ist,
die Spaltung ablaufen. Der Duplex ist, in solch einer Weise markiert, dass
die Gegenwart oder Abwesenheit einer Spaltung durch eine Änderung
des Signals der Markierungsgruppe, die anfangs auf dem Duplex vorhanden
ist, identifiziert werden kann. Diese Änderung des Signals zeigt dann
nicht nur die Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinbindung an den
Duplex an, sondern es stellt die Änderung in der Größenordnung
des Signals auch ein quantitatives Maß für die Menge der Proteinbindung bereit.
Die Verfahren können
unter Verwendung von bekannten Proben geeicht werden, und die Ergebnisse können außerdem mit
Kontrollreaktionen verglichen werden.
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Das
Spaltungsreagens kann unspezifisch sein, wie z. B. eine Exonuklease,
die einen oder beide Stränge
des Duplex von einem Ende aus spalten kann, oder kann sequenzspezifisch
sein, wie z. B. eine Restriktionsendonuklease, die an den Duplex
an einer spezifischen Stelle bindet und an dieser Stelle spaltet
(d. h. eine Typ II-Restriktionsendonuklease) oder an einer bestimmten
Stelle in einiger Entfernung von der spezifischen Stelle (d. h.
eine Typ IIS-Restriktionsendonuklease).
In jedem Fall hemmt die Gegenwart eines Bindungsproteins, wie z.
B. eines Transkriptionsfaktors, der an den Duplex gebunden ist,
sterisch die Spaltung des Duplex. Die Abwesenheit von Proteinbindung
lässt die
Spaltung stattfinden, und diese Spaltung setzt die Markierung aus
dem Duplex frei.
-
Bei
den Verfahren, die einen auf einem Proteinerkennungselement basierten
Mechanismus verwenden, können
die Proteine in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie ein Bindungsprotein
enthält,
vor dem Kontakt mit dem Detektions-Duplex markiert werden, wobei
in diesem Fall das Bindungsprotein selbst als das Erkennungselement
fungiert, oder das Bindungsprotein wird, vor oder nach der Bindung
an den Detektions-Duplex, spezifisch an ein Reagens gebunden, wie
z. B. einen Antikörper
oder ein anderes spezifisches Erkennungselement. Wenn das Bindungsprotein
vor dem Mischen mit dem Detektions-Duplex an ein Reagens gebunden
ist, kann der Duplex selbst direkt markiert werden, um die Detektion
der Bindung zu erleichtern. Die Detektion der Markierung kann durch
direkte Beobachtung erfolgen oder kann durch eine sekundäre Detektion erleichtert
werden. Zum Beispiel könnte
eine sekundäre
Detektion erzielt werden, durch Behandlung mit einem Spaltungsreagens,
dass eine Markierung freisetzt. Die Spaltung kann nur stattfinden,
wenn der Detektions-Duplex
vorhanden ist, was seinerseits nur stattfinden kann, wenn der Duplex
an ein spezifisches Bindungsprotein gebunden ist.
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Definitionen
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Protein oder DNA-Bindungsprotein
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet „Protein" und „DNA-Bindungsprotein" ein beliebiges Peptid,
Polypeptid, oder einen Peptid enthaltenden Stoff oder Komplex, der
spezifisch an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz binden kann. Das
DNA-Bindungsprotein kann ein Komplex von zwei oder mehr einzelnen
Molekülen sein.
Derartige Komplexe werden für
gewöhnlich
als „Homodimere", „Heterodimere", „Homotypische
Komplexe" und „Heterotypische
Komplexe" bezeichnet.
Derartige Komplexe bestehen aus einer beliebigen Anzahl von einzelnen
Einheiten, die durch kovalente Bindungen oder nicht kovalente Wechselwirkungen
zusammengehalten werden. Das DNA-Bindungsprotein kann natürlich oder
synthetisch sein und es ist nicht erforderlich, dass es in einer
bestimmten Form vorliegt. Beispiele für wohlbekannte DNA-Bindungsproteine
umfassen AP-1, Jun, Fos, CREB, ATF-1, Myc, Max, NF-kappa B, PPARγ und Ubx.
Nukleinsäure-Bindungsproteine
aller Arten, wie z. B. Polymerasen, Proteine des Telomerase-Komplexes,
Gyrasen und Splicing-Proteine, sind ebenfalls in dieser Definition
eingeschlossen.
-
Probe
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet „Probe" ein beliebiges Material,
dass ein DNA-Bindungsprotein
enthalten könnte,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf menschliche und tierische Gewebe, kultivierte Zellen, kultivierte
oder natürlicherweise
auftretende Mikroorganismen, Körperflüssigkeiten,
Blut, Serum, und dergleichen. Die Probe muss nicht ausschließlich das
biologische Material enthalten. Die Probe kann auch aus einem DNA-Bindungsprotein enthaltenden
Material auf oder in einer physikalischen Matrix bestehen.
-
Detektions-Duplex
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet „Detektions-Duplex" ein DNA-Molekül, das eine
doppelsträngige
Region enthält,
die eine Proteinbindestelle umfasst. Der Detektions-Duplex kann
teilweise einzelsträngig
und partiell doppelsträngig
sein und kann Gaps (Lücken)
und Einzelstrangbrüche
enthalten. Der Detektions-Duplex kann aus einem oder mehreren Oligonukleotiden
aufgebaut sein und kann ein oder mehrere mit sich selbst hybridisierende
Regionen umfassen, die Haarnadel-Strukturen ausbilden. Der Detektions-Duplex
kann eine beliebige Kombination von natürlichen und nicht natürlichen
Nukleotiden enthalten und kann nicht natürliche Verknüpfungen
zwischen den Nukleotiden enthalten. Der Detektions-Duplex kann ein
oder mehrere detektierbare Markierungen umfassen. Der Detektions-Duplex
kann eine oder mehrere Bindungsgruppen umfassen. Der Detektions-Duplex
kann eine oder mehrere Modifikationen umfassen, welche die Stabilisierung
von einzelsträngiger
oder doppelsträngiger
DNA beeinflussen. Derartige Modifikationen können invertierte ,T'-Reste, thiolierte
Reste, Peptid-Nukleinsäure-Verknüpfungen,
Chimären
aus RNA und DNA, und dergleichen umfassen. Der Detektions-Duplex
kann auf einem Träger
immobilisiert werden, oder kann in der Lage sein, auf einem Träger immobilisiert
zu werden durch eine Bindungsgruppe oder durch Hybridisierung eines
einzelsträngigen Abschnitts
des Detektions-Duplex mit einer komplementären Sequenz auf dem Träger. Der
Detektions-Duplex kann auch beabsichtigte oder unbeabsichtigte Basenfehlpaarungen
enthalten. Beispiele für
Detektions-Duplexe sind in 1 gezeigt.
Der Fachmann wird erkennen, dass eine große Auswahl von geeigneten Detektions-Duplexen
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, und dass die
in 1 dargestellten Beispiele nicht beschränkend für die vorliegende
Erfindung sein sollen.
-
Einfang-Markierung
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet „Einfang-Markierung" eine Sequenz in
dem Detektions-Duplex,
die verwendet werden kann, um den Duplex auf einem Träger einzufangen.
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Bindungsgruppe
-
Wie
hier verwendet, ist eine „Bindungsgruppe" eine chemische oder
biochemische Gruppe, die verwendet werden kann, um einen Stoff,
wie z. B. DNA oder Protein, an einen festen Träger anzufügen. Die Bindungsgruppe kann
eine nicht kovalente Bindung, eine reversible kovalente Bindung
oder eine irreversible kovalente Bindung zwischen dem Stoff und
dem festen Träger
ausbilden. Beispiele für
chemische Bindungsgruppen umfassen die Aldehydgruppe (CHO) und die
Aminogruppe (-NH2), die verwendet werden können, um den Stoff chemisch
an den festen Träger
zu binden unter Verwendung von Methoden, die im Fachge biet wohlbekannt
sind. Der Fachmann wird erkennen, dass andere geeignete Bindungsgruppen
im Fachgebiet bekannt sind und in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können.
Beispiele von biochemischen Gruppen umfassen Biotin, IgG und DNA.
Ein Stoff, der mit Biotin markiert ist, wird starke nicht kovalente
Bindungen mit einem avidinbeschichteten Träger ausbilden. IgG wird an
einen festen Träger
binden, der mit Protein G beschichtet ist, und DNA wird an einen
festen Träger
binden, der mit einer komplementären
RNA- oder DNA-Sequenz
beschichtet ist. Andere derartige Eindungs-Wechselwirkungen, die
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im
Fachgebiet bekannt.
-
Detektionsreagens
-
Wie
hier verwendet, ist ein „Detektionsreagens" eine detektierbare
Einheit, die in der Lage ist, an eine zweite Einheit zu binden,
um die Detektion der zweiten Einheit direkt oder indirekt zu ermöglichen.
Detektionsreagenzien können
Nukleinsäuren,
Proteine oder Peptide oder andere Biomoleküle sein, die eine Markierung umfassen
können,
oder nicht. Beispiele für
Detektionsreagenzien umfassen Peptide, Oligonukleotide, monoklonale
und polyklonale Antikörper,
Antikörperfragmente,
Lektine, Färbemittel,
Farbstoffe, und dergleichen und chimäre Formen von diesen Einheiten.
Detektionsreagenzien, die nicht direkt detektierbar sind, können eine Markierung
umfassen oder können
durch ein sekundäres
Detektionsreagens, das eine Markierung umfasst, detektiert werden.
Zum Beispiel können
Antikörper
mit markiertem Protein G detektiert werden.
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Markierung
-
Wie
hier verwendet, ist eine „Markierung" eine detektierbare
Signaleinheit oder ein Reporterelement. Eine große Auswahl an Markierungen
oder Reporterelementen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
einschließlich,
zum Beispiel, radioaktiver Isotope, Fluoreszenz-Markierungen, Chemiluminiszenz-Markierungen,
Bioluminiszenz-Markierungen und Enzym-Markierungen. Markierungen
können
direkt oder indirekt gebunden sein. Die Markierungen können auch
Haptene sein, die durch Sekundärreagenzien
erkannt werden, wie z. B. Antikörper,
Peptide, direkte chemische Wechselwirkung und andere Verfahren,
die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Die Markierung kann auch ein
Oligonukieotid sein, oder eine Nukleinsäure, die durch Hybridisierung,
Polymerisierung, Ligation und/oder Amplifikation durch Verfahren,
die im Fachgebiet wohlbekannt sind, detektiert werden kann. Die
Markierung kann verwendet werden, um eine Zunahme oder Abnahme in
einem Signal-Anzeigewert
zu erzeugen. Die Markierung kann auch zwei Chromophore umfassen, die
in unmittelbarer Nachbarschaft gebunden sind, um ein Phänomen zu
nutzen, das als Fluoreszens-Resonanz-Energie-Transfer (FREI) bezeichnet
wird. Wenn es mit Licht der passenden Wellenlänge bestrahlt wird, absorbiert
das eine Chromophor ein Photon und befindet sich dann im angeregten
Zustand. Die Energie des angeregten Chromophors wird auf ein Akzeptormolekül übertragen,
wenn das Chromophor und der Akzeptor sich in unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft zueinander befinden. Dieser Energietransfer verhindert,
dass das angeregte Chromophor die Energie in Form eines Licht-Photons
freisetzt und dämpft
somit die Fluoreszenz des Chromophors. Wenn das Akzeptormolekül sich nicht
in ausreichender räumlicher
Nähe befindet,
findet der Energietransfer nicht statt, und das angeregte Chromophor
kann dann fluoreszieren. Paare von geeigneten interagierenden Signaleinheiten
sind im Fachgebiet wohlbekannt. Ein ähnliches Phänomen, das als Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer
(LRET) bekannt ist, findet zwischen sensitisierten Lanthanid-Metallen und
Akzeptor-Farbstoffen statt und kann in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Zusätzlich
umfassen andere Markierungen, die verwendet werden können, um
die Detektion zu beschleunigen, Chemilumineszenz-Markierungen, Immunoaffinitäts-Markierungen,
wie z. B. c-Myc, Affinitäts-Markierungen,
wie z. B. die Zellulose-Bindedomäne,
Streptavidin, Biotin, Streptavidin oder ein beliebiges ganzes oder
Teil-Makromolekül
mit einer abgestimmten Passform, Reporter-Enzyme mit chromogenen,
lumineszenten, fluoreszenten oder anderen Tracer-Fähigkeiten.
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Träger
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Wie
hier verwendet, kann „Träger" ein beliebiges poröses oder
nicht poröses
Material oder eine Matrix sein, das/die geeignet ist, zum Anfügen von
Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren,
und dergleichen. Die Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, und dergleichen können kovalent
oder nicht kovalent an den Träger
gebunden sein durch eine beliebige Methode oder Kombination von
Methoden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Träger im Sinne der Erfindung
können
Nylon, Nitrozellulose, Diazonitrozellulose, Glas, Silikon, Polystyren,
Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Sepharose,
Agar, Stärke
oder ein beliebiges anderes Material, dass die Immobilisierung von
Biomolekülen
erlaubt, umfassen. Das Material kann in Form von Filtern, Membranen,
flachen Oberflächen,
Schläuchen,
Kanälen,
Vertiefungen (Wells), Blättern,
Partikeln, Beads, Mikrosphären,
Säulen,
Fasern (z. B. optischen Fasern), und dergleichen vorliegen. Der
Träger
kann auch ein Multiwell-Format (wie z. B. Mikrotiterplatten), wie
z. B. 12-Well-, 24-Well-, 48-Well-, 96-Well-, 384-Well- und 1536-Well-Platten,
umfassen. Partikel oder Beads können
aus Glas, Latex, einem magnetischen Material (magnetische, paramagnetische
oder supermagnetische Beads) oder einem anderen Material gefertigt
sein. Ein Beispiel für
einen Träger,
der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein
Satz von farbcodierten Mikrosphären,
wie z. B. jene, die von der Luminex Corporation (Austin, Texas)
hergestellt und vertrieben werden.
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Array
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff „Array" eine systematische Anordnung von verschiedenen Molekülen oder
Stoffen auf einem Träger,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, biologische Moleküle,
wie z. B. DNA, RNA, Proteine, und dergleichen oder Chemikalien,
die auf einem Träger
angeordnet oder immobilisiert sind. Arrays von biologischen Molekülen wie
z. B. Oligonukleotiden, Sonden, Rezeptoren, Antikörpern oder
einer beliebigen Einheit, die mit Zielmolekülen reagiert, sind ein in zunehmendem
Maße wichtiges
Werkzeug in der biotechnologischen Industrie und verwandten Fachgebieten
geworden. Arrays, die eine Mehrzahl von biologischen Molekülen umfassen,
finden in einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung, einschließlich des
Arzneimittel-Screenings, der Nukleinsäuresequenzierung, der Mutationsanalyse,
genomischer und proteomischer Anwendungen, und dergleichen. Derartige
Arrays können
auf Mikroplatten, Glasobjektträgern,
Beads, Mikrosphären,
Mikrofluid-Vorrichtungen oder Standard-Blotting-Membranen ausgebildet
werden und können
als „Arrays", Microarrays, oder
Chips bezeichnet werden. Einfangmoleküle können durch kovalente oder nicht
kovalente Wechselwirkungen an den Träger gebunden sein. Wenn sie
an eine ebene Oberfläche
gebunden sind, sind die Einfangmoleküle in einer systematischen
Weise gebunden, sodass die Identität eines jeden, bestimmten Einfangmoleküls anhand
seiner Position auf dem Array identifiziert werden kann.
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Derartige
Arrays können
auf ebenen Objekten konstruiert sein, wie z. B. Glas- oder Plastik-Mikroskop-Objektträgern. Arrays
können
auch auf der Innenfläche
eines Schlauchs oder eines Mikrotiterplatten-Wells konstruiert sein
oder auf der Innenseite der Kanäle
einer Mikrofluid-Vorrichtung konstruiert sein. Im Allgemeinen gibt
es keine Einschränkung
bezüglich
des Formats des Arrays, vorausgesetzt, die einzelnen Stellen, an welche
die Einfangmoleküle
gebunden sind, können
identifiziert werden. Wenn der Träger ein Satz von Beads oder
Mikrosphären
ist, dass müssen
Sätze von
Beads oder Mikrosphären,
die mit verschiedenen Einfangmolekülen verknüpft sind, in irgendeiner Weise
unterscheidbar sein. Bei einer Ausführungsform sind Beads von der
Luminex Corporation (Austin, Texas), durch den Zusatz von zwei verschiedenen
Farbstoffen in zehn verschiedenen Konzentrationen farbcodiert, woraus
sich 100 verschiedene farbige Beads ergeben. Einfangmoleküle können an
Beads einer spezifischen Farbe gebunden werden, und die Farbe eines
jeden Beads kann durch Durchflusszytometrie identifiziert werden.
Ein Bead-Array wird angefertigt durch die Bindung spezifischer Einfangmoleküle an Sätze von
Beads einer spezifischen Farbe und dann dem Mischen verschiedener Sätze von
farbigen Beads, um einen Array zu erzeugen. Bei einer anderen Ausführungsform
können
Mikropartikel von Pharmaseq (Princeton, New Jersey), die jedes eine
einzigartige Radiofrequenz-Markierung enthalten, verwendet werden,
um spezifische Mikropartikel zu identifizieren.
-
Andere
Verfahren können
verwendet werden, um einzelne Beads zur Identifizierung zu markieren,
wie z. B. Nukleinsäure-
und Peptid-Markierungen. Der Array kann eine beliebige Anzahl von
zwei bis 100 000 Elementen, bevorzugt zwischen 3 und 5000 Elementen,
enthalten. Bei einer Ausführungsform
wendet die Erfindung ein Bead-Array-Format an, wie z. B. die kommerziell
erhältliche
LabMAPTM-Technologie, aber sie kann für praktisch
jede Art von Ar ray-Plattform oder -formst angewendet werden. Die
Erfindung umfasst ein Assay-System mit der Kapazität zur quantitativen
und qualitativen Charakterisierung von Aktivitäten von bis zu 100 000 verschiedenen
regulatorischen Proteinen in einem einzigen Reaktionsgefäß, -well,
oder -röhrchen.
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Einfangreagens
-
In
der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein „Einfangreagens" ein beliebiges Molekül, das spezifisch ein
DNA-Bindungsprotein oder einen Detektions-Duplex aus einer Lösung einfangen
wird, die ein oder mehrere biologische Moleküle enthält. Beispiele für Einfangreagenzien
sind poly- und monoklonale Antikörper
und Antikörperfragmente.
Einfangreagenzien können
Moleküle
sein, die an Haptene oder Bindungsgruppen binden. Proteine, die
eine natürliche
Affinität
für spezifische
DNA-Bindungsproteine besitzen und Proteine, die modifiziert worden
sind, sodass sie spezifisch an die DNA-Bindungsproteine binden,
sind ebenfalls in dieser Definition eingeschlossen. Einfangmoleküle können auch
Moleküle
sein, die an ein anderes Molekül
binden, welches das DNA-Bindungsprotein bindet. Zum Beispiel kann
Anti-Kaninchen-IgG
verwendet werden, um einen Kaninchen-Antikörper-Protein-Komplex einzufangen.
Auf ähnliche
Weise kann Protein G verwendet werden, um einen Ziegen-Antikörper-Protein-Komplex einzufangen.
Beispiele für
Einfangreagenzien und die entsprechenden Bindungsgruppen sind in
Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1. Beispiele für Einfangreagenzien und die
Haptene, an die sie binden
Hapten/Bindungsgruppe | Einfangreagens |
Biotin | Avidin,
Streptavidin |
Sialinsäure, Kohlenhydrate,
Glycoproteine | Lektine,
wie z. B. Concanavalin A |
Digoxigenin | Anti-Digoxigenin |
Fc-Fragment
von IgG | Protein
A, Protein G, Protein A/G |
5-BrdU
(5-Bromdesoxyuridin) | Anti-BrdU |
Dinitrophenyl
(DNP) | Anti-DNP |
Fluoresceinisothiocyanat
(FITC) | Anti-FITC |
N-2-Acetylaminofluoren
(AAF) | Anti-AAF |
N-2-Acetylamino-7-iodofluoren
(AAIF) | Anti-AAIF |
Oligo-
oder Poly-dA | Oligo-
oder Poly-dT |
Oligo-
oder Poly-dC | Oligo-
oder Poly-DG |
Phenylboronsäure (PBA) | Salicylhydroxamsäure |
Aldehyd-
und Ketongruppen | Hydrazide |
Sulfhydrylgruppe | Maleimide |
Aminogruppe | N-Hydroxysuccinimidester |
Thiole
(Glutathion) | Schwermetalle
(Hg2+) |
-
Einfangreagenzien
können
auch Chemikalien oder Farbstoffe umfassen, die an DNA, Proteine
oder DNA-Protein-Komplexe binden können. Einfangreagenzien umfassen
auch Reagenzien, die spezifische Konformationen von Biomolekülen erkennen
oder bestimmte Modifikationen erkennen können. Zum Beispiel können Antikörper, die
gegen Phosphoserin gerichtet sind, als Einfangreagenzien verwendet
werden, um Proteine einzufangen, die einen exponierten Phosphoserinrest
enthalten. Zusätzlich
können
SH2-Domänen
verwendet werden, um Proteine einzufangen, die ein bestimmtes Motiv
aus vier Aminosäuren
enthalten, das Phosphotyrosin enthält.
-
Profil
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Wie
hier verwendet, ist ein „Profil" eine Kombination
der Messungen von zwei oder mehr Eigenschaften eines biologischen,
biochemischen oder chemischen Systems. Die Messungen können gleichzeitig
oder aufeinander folgend erfolgen. Zum Beispiel kann ein Profil
die Konzentration von zwei oder mehr Proteinen in einer Probe umfassen.
Ein anderes Beispiel für
ein Profil ist der Phosphorylierungszustand von zwei oder mehr Proteinen
in einer Probe. Profile können
qualitative oder quantitative Messungen umfassen und können sowohl
subjektive als auch objektive Daten umfassen.
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Sequenzspezifisches Spaltungsreagens
-
Wie
hier verwendet, ist ein „sequenzspezifisches
Spaltungsreagens" ein
Reagens, das DNA an einer spezifischen Stelle, basierend auf der
Erkennung einer spezifischen DNA-Sequenz, spalten kann. Beispiele für sequenzspezifische
Spaltungsreagenzien umfassen Typ II-Restriktionsendonukleasen, wie z. B.
EcoRI, HindIII und BamHI. Sequenzspezifische Spaltungsreagenzien
umfassen auch die Klasse der Typ IIS-(oder zielsuchenden) Restriktionsendonukleasen,
die an eine spezifische DNA-Sequenz binden und die DNA in einem
bestimmten Abstand von der Enzymbindestelle spalten.
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Externes Spaltungsreagens
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Wie
hier verwendet, bezeichnet ein „externes Spaltungsreagens" ein Reagens, dass
den Verdau oder die Spaltung von einem oder mehreren Strängen von
Nukleinsäure
an oder in der Nähe
von einem oder mehreren Enden der Nukleinsäure initiiert. Der Verdau oder
die Spaltung läuft
in einer einzigen Richtung bezogen auf die Initiationsstelle ab.
Externe Spat tungsreagenzien umfassen die Enzyme, die für gewöhnlich als
Exonukleasen bezeichnet werden. Beispiele für externe Spaltungsreagenzien
und ihre Eigenschaften sind in 2 dargestellt.
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Sonden-Einfang-Sequenz
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Wie
hier verwendet, bezeichnet „Sonden-Einfang-Sequenz" eine DNA-Sequenz,
die verwendet werden kann, um eine markierte oder unmarkierte Oligonukleotid-
oder Nukleinsäuresonde
einzufangen. Die Sequenz kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
Die Sonden-Einfang-Sequenz
kann verwendet werden um Detektions-Duplexe oder DNA-Protein-Komplexe einzufangen.
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Signalamplifikation
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Wie
hier verwendet, bezeichnet „Signalamplifikation" eine beliebige Methode,
die verwendet wird, um das Signal eines biologischen Assay über das
Signal hinaus zu verstärken,
das mit einer „Einzelmarkierungs"-Detektions-Strategie
erreicht werden kann. Signalamplifikation kann auf einer enzymkatalysierten
Reporter-Abscheidung basieren, wie z. B. bei der Tyramid-Signalamplifikation
oder kann auf einer Enzym-Amplifikation basieren. Alternativ können Strategien,
welche die Anzahl von Markierungen erhöhen, verwendet werden. Derartige
Strategien umfassen die Bindung von Dendrimeren, verzweigten Polymeren,
und langen linearen Polymeren, die mehrere Bindestellen für eine sekundäre detektierbare
Markierung enthalten. Beispiele für diese Strategien umfassen,
ohne Einschränkung,
Oligonukleotid-Dendrimere,
verzweigte DNA und das Hybrid-Einfangen. Andere Amplifikationsstrategien
sind auf dem Fachgebiet bekannt und können im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können auch
Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren,
wie z. B. die Polymerasekettenreaktion und die Rolling-Circle-Amplifikation
verwendet werden, um das erhaltene Signal zu amplifizieren. Obwohl
viele dieser Strategien anfangs entwickelt wurden, um die Sensitivität des Detektierens
von Nukleinsäuren
zu erhöhen,
können
sie leicht zur Detektion anderer Moleküle angepasst werden, einfach
indem ein geeignetes Nukleinsäuremolekül an ein
Detektionsreagens, wie z. B. einen Antikörper, ein Peptid, Avidin, oder
Streptavidin, angefügt
wird. In der vorliegenden Erfindung kann jedes Verfahren zur Signalamplifikation
verwendet werden, um das Signal, das durch den Assay erzeugt wird,
zu verstärken.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit Zusammensetzungen und Verfahren
zum Detektieren und Messen von DNA-Bindungsproteinen bereit. Zusätzlich stellt
die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren für die simultane oder beinahe
simultane Detektion von mehreren DNA-Bindungsproteinen in einem
Multiplex- oder Array-Format bereit und stellt außerdem Zusammensetzungen
und Verfahren bereit zum Erstellen von Profilen von DNA-Bindungsaktivität von Proteinen,
insbesondere Transkriptionsfaktoren. In noch speziellerer Hinsicht
stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Detektieren
und Messen von mehreren Protein-DNA-Bindungsereignissen in einer
einzigen Probe in einem Hochdurchsatzformat bereit.
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Bei
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Proteinbindung
an einen Detektions-Duplex bereit, wobei die Bindung des Proteins
an den Detektions-Duplex die Spaltung des Duplex durch ein sequenzspezifisches
Spaltungsreagens hemmt und dadurch ein Signal verstärkt oder
abschwächt.
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Bei
dieser Ausführungsart
umfasst der Detektions-Duplex eine DNA-Sequenz, die von einem sequenzspezifischem
Spaltungsreagens erkannt wird, sodass das sequenzspezifische Spaltungsreagens
den Detektions-Duplex spalten wird, wenn kein Protein an die Proteinbindestelle
gebunden hat. Wenn jedoch Protein an die Proteinbindestelle des
Detektions-Duplex gebunden hat, wird die Spaltung des Detektions-Duplex gehemmt
werden und dadurch ein Signal verstärkt oder abgeschwächt. Typ
II-Restriktionsenzyme können
bei dieser Ausführungsart
der Erfindung verwendet werden, wenn die Proteinbindestelle im Detektions-Duplex eine
bekannte Schnittstelle für
ein Typ II-Restriktionsenzym umfasst, oder sich in ausreichender
räumlicher Nähe zur Restriktionsenzymbindestelle
befindet, sodass durch die Bindung eines spezifischen Bindungsprotein
an die Proteinbindestelle die Bindung des Restriktionsenzyms an
die Enzymerkennungssequenz gehemmt oder verhindert wird. Zum Beispiel
kann ein Detektions-Duplex verwendet werden, der eine Bindungsgruppe,
eine Markierung, und eine Proteinbindestelle zwischen der Bindungsgruppe
und der Markierung umfasst, wobei die Proteinbindestelle eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle
umfasst. Der Detektions-Duplex wird mit der Probe in Kontakt gebracht,
und DNA-Bindungsproteine, sofern vorhanden, binden an den Detektions-Duplex.
Ein sequenzspezifisches Spaltungsreagenz, wie z. B. eine TypII-Restriktionsendonuklease wird
hinzu gegeben. Wenn Protein an die Proteinbindestelle gebunden hat,
dann bleibt der Detektions-Duplex intakt. Wenn keine Protein an
den Detektions-Duplex gebunden hat, dann wird der Detektions-Duplex
gespalten, womit die Bindungsgruppe von der Markierung getrennt
wird und somit die Detektion der Markierung verhindert wird. Ein
Beispiel für
diese Ausführungsform
der Erfindung ist in 3 dargestellt.
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Es
kann eine andere Art von sequenzspezifischem Spaltungsreagenz in
dieser Ausführungsart
der Erfindung verwendet werden. Typ IIS-Restriktionsendonukleasen
erkennen und binden an eine spezifische DNA-Sequenz, aber spalten
die DNA an einer bestimmten Region, die von der Enzymbindestelle
entfernt liegt. Assays, die diese Enzyme einsetzen, sind vorteilhaft,
weil die Proteinbindestelle nicht eine Erkennungssequenz für das sequenzspezifische
Spaltungsreagens umfassen muss. Stattdessen kann die Bindestelle
für das
sequenzspezifische Spaltungsreagenz in den Detektions-Duplex eingebaut
werden. In diesem Beispiel umfasst ein Detektions-Duplex eine Bindungsgruppe,
eine Markierung, eine Proteinbindestelle und eine Bindestelle für ein sequenzspezifische
Spaltungsreagenz, sodass das sequenzspezifische Spaltungsreagenz, wenn
es an den Detektions-Duplex gebunden ist, den Duplex in oder in
der Nähe
der Proteinbindestelle spaltet. Der Detektions-Duplex wird in Kontakt
mit der Probe gebracht und DNA-Bindungsproteine, sofern vorhanden,
binden an den Detektions-Duplex. Ein sequenzspezifisches Spaltungsreagens,
wie z. B. eine Typ IIS-Restriktionsendonuklease,
wird hinzu gegeben. Wenn Protein an die Proteinbindestelle gebunden
hat, dann bleibt der Detektions-Duplex intakt. Wenn kein Protein
an den Detektions-Duplex
gebunden hat, dann wird der Detektions-Duplex gespalten, wobei die
Bindungsgruppe von der Markierung getrennt wird und somit die Detektion
der Markierung verhindert wird. Ein Beispiel für diese Ausführungsform
der Erfindung ist in 4 dargestellt. Der Duplex kann
auf einem Träger
eingefangen werden, um die Detektion der Markierung zu erleichtern.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Proteinbindung
an einen Detektions-Duplex bereit, wobei die Bindung des Proteins
an den Detektions-Duplex die Spaltung des Duplex durch ein externes
Spaltungsreagens hemmt und dadurch ein Signal verstärkt oder
abschwächt.
Das externe Spaltungsreagens kann einen oder beide Stränge des
Detektions-Duplex spalten, beginnend an einem oder an mehreren Enden
des DNA-Strangs in dem Duplex. Bei einer Ausgestaltung dieser Ausführungsform
wird der Detektions-Duplex zunächst
auf einem Träger
immobilisiert. Die Probe wird mit dem Detektions-Duplex auf dem
Träger
in Kontakt gebracht und man lässt
Protein an den Detektions-Duplex binden. Anschließend wird
ein externes Spaltungsreagens mit dem Detektions-Duplex auf dem
Träger
in Kontakt gebracht. Wenn Protein an den Detektions-Duplex gebunden hat,
dann wird das externe Spaltungsreagens nicht in der Lage sein, den
Detektions-Duplex vollständig
zu verdauen, weil dieser durch die Gegenwart des Proteins geschützt sein
wird. Wenn kein Protein an den Detektions-Duplex gebunden hat, dann
wird das externe Spaltungsreagens einen oder beide Stränge des
Detektions-Duplex verdauen und wird die Markierung ins Medium freisetzen,
woraus sie ausgewaschen werden kann. Wenn Protein an den Detektions-Duplex
gebunden hat, dann wird die Markierung an den Träger gebunden bleiben und wird
detektiert werden. Ein Beispiel für diese Ausführungsform
der Erfindung ist in 5 dargestellt.
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Ein
weiteres Beispiel für
diese Ausführungsform
ist in den 6 und 7 dargestellt.
In diesem Beispiel umfasst der immobilisierte Detektions-Duplex
eine Sonden-Einfang-Sequenz
und eine Proteinbindesequenz und eine Phosphatgruppe am 5'-Ende des immobilisierten
oder immobilisierbaren Stranges. Der Detektions-Duplex kann auf
einem Träger
immobilisiert werden oder kann in anderen Stufen auf einem Träger eingefangen
werden, wie es vorteilhaft ist. Die Einfangsequenz und die Proteinbindesequenz
können
dieselbe sein oder verschieden sein. In einem Array-Format wird
es vorteilhaft sein, wenn die Sonden-Einfangsequenz und die Protein-Einfangsequenz
verschieden sind, sodass dasselbe Detektionsreagens mit vielen verschiedenen
Detektions-Duplexen verwendet werden kann.
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In
diesem Beispiel wird der Detektions-Duplex mit der Probe, die möglicherweise
DNA-Bindungsproteine
enthält,
in Kontakt gebracht. Sofern vorhanden, binden die Proteine an die
Proteinbindestelle im Detektions-Duplex. Der Detektions-Duplex wird
dann mit der Lambda-Exonuklease
in Kontakt gebracht, einem externen Spaltungsreagens, welches den
5'-phosphorylierten
DNA-Strang in 5'–3'-Richtung verdaut.
Wenn Protein an den Detektions-Duplex
gebunden hat, dann wird das Enzym daran gehindert werden, den phosphorylierten
Strang des Detektions-Duplex zu spalten. Wenn kein Protein gebunden
hat, dann wird der 5'-phosphorylierte
Strang des Detektions-Duplex vollständig verdaut werden. Der Detektions-Duplex wird dann
hitzedenaturiert und gewaschen, um das externe Spaltungsreagens
zu inaktivieren, die Stränge
des Detektions-Duplex zu trennen, und die Spaltprodukte zu entfernen.
Wenn der Detektions-Duplex durch Proteinbindung geschützt war,
dann bleibt der Strang, der die Sonden-Einfang-Sequenz enthält, an den
Träger
gebunden. Wenn der Duplex nicht geschützt war, weil kein Protein
an den Detektions-Duplex gebunden hat und den Verdau gehemmt hat,
dass wird sich der Strang, der die Sonden-Einfang-Sequenz enthält, nicht
länger
auf dem Träger
befinden. Eine markierte Oligonukleotid- oder Nukleinsäure-Sonde wird dann hinzu
gegeben, die man mit der Sonden-Einfangsequenz, sofern vorhanden,
hybridisieren lässt.
Das Vorhandensein von Signal weist darauf hin, dass der Detektions-Duplex
durch gebundenes Protein geschützt
war (6). Die Abwesenheit eines Signals weist darauf
hin, dass der Strang durch das externe Spaltungsreagenz verdaut
wurde und nicht durch Proteinbindung geschützt war (7).
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von Proteinbindung an
einen Detektions-Duplex bereit, wobei die Proteine in einer Probe
vor oder im Anschluss an die Bindung an einen Detektions-Duplex
markiert werden. Nach dem Waschen werden Proteine, die an den Detektions-Duplex
gebunden haben, anhand des Vorhandenseins der Markierung, die an
den Detektions-Duplex gebunden ist, detektiert. Proteine in der Probe
werden durch Verfahren markiert, die allgemein im Fachgebiet verwendet werden,
einschließlich
aktiver Ester, wie z. B. N-Hydroxysuccinimidester von Fluoreszenzfarbstoffen,
wie z. B. Cy3 und Cy5, sulfhydrylreaktiven Markierungen und anderen
Verfahren, die allgemein im Fachgebiet verwendet werden. In einem
Beispiel für
diese Ausführungsform
wird eine Probe mit einem aminreaktiven Farbstoff markiert, wie
z. B. dem N-Succinimidester des Fluoreszenzfarbstoffs Cy3 (Amersham
Biosciences). Das Verfahren wird im Wesentlichen alle oder nahezu
alle der Proteine in der Probe markieren. Die markierte Probe wird
dann mit einem Detektions-Duplex in Kontakt gebracht werden. Der
Detektions-Duplex kann auf einem Träger immobilisiert sein oder
kann in Lösung
vorliegen. Eine Inkubationszeitdauer schließt sich an, sodass Proteine
Gelegenheit haben, an die Proteinbindestelle im Detektions-Duplex
zu binden. Wenn der Detektions-Duplex in Lösung vorliegt, wird er nun
auf einem Träger
eingefangen, und die ungebundenen Moleküle werden ausgewaschen. Proteine,
die an den Detektions-Duplex gebunden haben, werden anhand der Markierung
detektiert. Ein Beispiel für
diese Ausführungsform
der Erfindung ist in 8 dargestellt.
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Bei
einer weiteren Variante dieser Ausführungsform werden zwei oder
mehrere Proben separat mit verschiedenen Markierungen markiert und
dann gemischt. Diese gemischte Probe wird dann mit dem Detektions-Duplex
in Kontakt gebracht. Eine Inkubationszeitdauer schließt sich
an, um den markierten Proteinen Zeit zu geben, an den Detektions-Duplex
zu binden. Wenn der Detektions-Duplex in Lösung vorliegt, wird er nun auf
einem Träger
eingefangen, und die ungebundenen Moleküle werden ausgewaschen. Proteine,
die an den Detektions-Duplex gebunden haben, werden anhand der Markierungen
detektiert. Da zwei oder mehr Proben mit verschiedenen Markierungen
markiert wurden, wird jede Markierung detektiert und unabhängig voneinander
gemessen, und die Ergebnisse können
als eine differentielle Analyse von DNA-Bindungsproteinen in den beiden
Proben ausgedrückt
werden, in einer ähnlichen
Weise zu der Art, in der RNA-Moleküle auf DNA-Microarrays differentiell
markiert und gemessen werden (27).
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Noch
eine weitere Ausführungsform
stellt ein Verfahren zum Detektieren von Proteinbindung an einen Detektions-Duplex
bereit, wobei die Proteine in einer Probe an einen Detektions-Duplex gebunden werden, woraufhin überschüssige Protein
ausgewaschen werden und gebundene Proteine anschließend mit
einem Detektionsreagens detektiert werden. Der Detektions-Duplex
kann zunächst
auf einem Träger
eingefangen werden oder kann nach anderen Stufen auf einem Träger eingefangen
werden, wie es vorteilhaft ist. Die Reihenfolge des Inkontaktbringens
von Duplex, Probe und Detektionsreagens kann in jeder Reihenfolge
ausgeführt werden.
In einem Beispiel für
diese Ausführungsform
wird ein immobilisierter Detekti ons-Duplex mit einer Probe in Kontakt
gebracht, die möglicherweise
DNA-Bindungsproteine enthält.
Der immobilisierte Detektions-Duplex wird mit der Probe inkubiert,
um Proteinen Gelegenheit zu geben, an den Detektions-Duplex zu binden. Ungebundene
Stoffe werden ausgewaschen, und die gebundenen Proteine werden mit
einem Detektionsreagens detektiert. Dieses Beispiel ist in 10 dargestellt.
Die Proteine können
mit spezifischen Antikörpern
detektiert werden, die nur ein einziges Protein detektieren, oder
können
mit Antikörpern
detektiert werden, die Klassen von Proteinen oder bestimmte Proteinmotive
detektieren. Zum Beispiel enthalten viele DNA-Bindungsproteine phosphorylierte
Tyrosin-, Threonin- oder Serin-Reste, und Proteine können mit
Anti-Phosphotyrosin-, Anti-Phosphoserin- und Anti-Phosphothreonin-Antikörpern detektiert
werden. Proteine können
auch mit anderen Proteinen detektiert werden, die an bestimmte Motive
binden. Zum Beispiel können
DNA-Bindungsproteine
mit einer Klasse von Proteinen detektiert werden, die als SH2-Domänen(-Proteine) bezeichnet wird.
SH2-Domänen
binden an ein Motiv aus vier Aminosäuren, das Phosphotyrosin einschließt. Gebundene Proteine
können
auch mit einem chemischen oder biochemischen Färbemittel detektiert werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von Proteinbindung an
einen Detektions-Duplex bereit, wobei das Protein zunächst an
einen markierten Detektions-Duplex gebunden wird, woraufhin der
Protein-Detektions-Duplex-Komplex mit einem Einfang-Reagenz auf
einem Träger eingefangen
wird und detektiert wird. Alternativ können zunächst das Einfangreagens, Protein
und der markierte Detektions-Duplex in Kontakt gebracht werden und
anschließend
auf einem Träger
eingefangen werden. Im Allgemeinen können die Zugabe von Einfangreagens,
Probe und markiertem Detektions-Duplex in jeder beliebigen Reihenfolge
ausgeführt
werden. In einem Beispiel für
diese Ausführungsform
wird das Einfangreagens auf einem Träger immobilisiert. Der markierte
Detektions-Duplex
wird mit der Probe, die möglicherweise DNA-Bindungsproteine
enthält,
in Kontakt gebracht. Die Probe wird mit dem Detektions-Duplex inkubiert,
um Proteinen, sofern welche (vorhanden sind), Gelegenheit zu geben,
an den Detektions-Duplex zu binden. Nach der Inkubation wird das
Gemisch mit einem immobilisierten Einfangreagens in Kontakt gebracht,
das den Protein-Detektions-Duplex-Komplex auf dem Träger einfängt, und
die Markierung auf dem Detektions-Duplex wird detektiert. Dieses
Beispiel ist in 11 dargestellt. Wenn kein Protein
an den Detektions-Duplex gebunden hat, dann kann das Protein immer
noch durch das Einfangreagens eingefangen werden, aber es wird keine Markierung
detektiert werden, da die Markierung an dem Detektions-Duplex angefügt ist.
In diesem Beispiel könnte
das Einfangreagens ein Antikörper
gegen ein spezifisches DNA-Bindungsprotein sein, das auf dem Träger immobilisiert
worden ist.
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In
einem weiteren Beispiel für
diese Ausführungsform,
dargestellt in 12, wird der markierte Detektions-Duplex
mit der Probe in Kontakt gebracht, die möglicherweise DNA-Bindungsproteine
enthält.
Diese Probe wird mit dem Detektions-Duplex inkubiert, um Proteinen,
sofern welche (vorhanden sind), Gelegenheit zu geben, an den Detektions-Duplex
zu binden. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit einem ersten
Einfangreagens in Kontakt gebracht, das an den Protein-Detektions-Duplex-Komplex
bindet. Der erste Einfangreagens-Protein-Detektions-Duplex-Komplex
wird dann durch ein zweites Einfangreagens auf einem Träger eingefangen,
und die Markierung auf dem Detektions-Duplex wird detektiert. In
diesem Beispiel könnte
das erste Einfangreagens ein Antikörper sein, der spezifisch für ein DNA-Bindungsprotein
ist und das zweite Einfangreagens auf dem Träger könnte ein Molekül sein,
wie z. B. Protein A oder Protein G, welches das erste Antikörper-Einfangreagens
binden kann.
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Die
bereits beschriebenen Ausführungsformen
der Erfindung sind leicht zur Anwendung in einem Array-Format adaptierbar.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren
von DNA-Bindungsproteinen bereit, das zwei oder mehr Detektions-Duplexe
umfasst, die auf einem Träger
immobilisiert sind. Bei einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung
ein Verfahren zum Detektieren einer Mehrzahl von DNA-Bindungsproteinen
bereit, unter Verwendung von zwei oder mehr Detektions-Duplexen.
Die Duplexe werden mit der Probe in Lösung gemischt und anschließend auf
einem Träger
in einem Array-Format eingefangen. Zum Beispiel können Detektions-Duplexe,
die einzigartige einzelsträngige
Abschnitte enthalten, an einen Träger gebunden werden, der einen
Array von Oligonukleotiden umfasst, die komplementär zu den
einzelsträngigen
Abschnitten des Detektions-Duplexes sind. Zusätzlich können Detektions-Duplexe durch
eine Bindungsgruppe entweder vor oder im Anschluss an den Kontakt
mit der Probe auf einem Träger
in einem Array-Format eingefangen werden. Der Array kann auch einen
Array von Antikörpern
oder anderen Einfangreagenzien umfassen, die verwendet werden können, um
DNA-Bindungsprotein-Detektions-Duplex-Komplexe einzufangen.
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Die
hier beschriebene Erfinddung ist gut geeignet für die Anwendung auf einem durchflusszytometrischen
Bead-Array mit Multiplex-Fähigkeit,
wie z. B. dem von der Luminex Corporation entwickelten LabMAP-System
(28). Um einen Bead-Array herzustellen, werden Polystyren-Mikrosphären von
Innen mit präzisen
Anteilen von zwei spektral verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
gefärbt.
Jedes Bead wird mit einer von 10 verschiedenen Konzentrationen von
jedem Fluorochrom gefärbt,
woraus sich ein Bead-Array ergibt, der aus 100 spektral verschiedenen
Mikrosphären-Sätzen besteht.
Jeder Mikrosphären-Satz
kann anhand seiner spektralen Kennzeichnung (dem Verhältnis von
zwei Farbstoff-Farben) unterschieden werden, und sie können in
einem einzigen Test kombiniert werden, was es erlaubt, bis zu 100
verschiedene Analyte gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäß zu messen.
Stoffe, wie z. B. Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, und dergleichen, können unter
Verwendung von Standardchemie, die im Fachgebiet wohlbekannt ist,
an die Mikrosphären
gekoppelt werden. Ein dritter Fluoreszenzfarbstoff wird an ein Reportermolekül gekoppelt,
und quantifiziert die biomolekulare Wechselwirkung, die auf der
Mikrosphären-Oberfläche aufgetreten
ist. Mikrosphären
werden in einem schnell fließenden
Fluidstrom einzeln abgefragt, wenn sie zwei getrennte Laser passieren.
Digitale Hochgeschwindigkeits-Signalverarbeitung klassifiziert die
Mikrosphären
anhand ihrer spektralen Kennzeichnung und quantifiziert das Reportersignal
auf der Oberfläche
des Beads. Waschen, um ungebundenen Reporter zu entfernen, ist im
Allgemeinen nicht notwendig, was den Assay im Wesentlichen homogen
macht. Tausende von Mikrosphären
werden pro Sekunde abgefragt, woraus sich ein Analysesystem ergibt,
das in der Lage ist, innerhalb weniger Sekunden bis zu 100 verschiedene
Reaktionen in einem einzigen Reaktionsgefäß zu analysieren und zu melden.
Die Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
durch die Bindung von Detektions-Duplexen, Oligonukleotiden oder
Einfang-Reagenzien an Beads leicht an ein Bead-Array-Format angepasst
werden. Detektions-Duplexe können
auf den Beads immobilisiert werden oder können nach Kontakt mit der Probe
auf den Beads eingefangen werden. Antikörper oder andere Einfangreagenzien
können auf
den Beads immobilisiert werden, oder es können Komplexe nach Kontakt
mit der Probe auf den Beads eingefangen werden.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können leicht für die Verwendung
in Verbindung mit Signalamplifikationsverfahren angepasst werden,
die verwendet werden, um die Sensitivität der Detektion zu erhöhen. Enzym-Amplifikation,
Rolling Circle-Amplifikation, Ligasekettenreaktion und andere Verfahren,
die ein detektierbares Signal amplifizieren können, sind im Rahmen dieser
Erfindung eingeschlossen.
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Verfahren
der vorliegenden Erfindung können
bei der Detektion, dem Screening und der Diagnose von verschiedenen
Krankheiten, Störungen
oder Zuständen
in biologischen Proben verwendet werden. Die Verfahren der Erfindung
können
auch für
die Beobachtung des Verlaufs einer Krankheit oder Behandlung verwendet
werden. Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch zum Screening von
biologischen Verbindungen oder biologischen Molekülen verwendet
werden, welche die Aktivität
oder die Menge von DNA-Bindungsproteinen
in einer Probe beeinflussen oder ändern können. Die vorliegende Erfin dung
kann auch verwendet werden, um den Effekt einer genetischen Variation
auf die Bindungsfähigkeit
von DNA-Bindungsproteinen zu bestimmen. Zum Beispiel könnte die
Erfindung verwendet werden, um gleichzeitig die Affinität einer
einzigen oder mehrerer DNA-Bindungsproteine
zu einer großen
Anzahl von verschiedenen Proteinbindesequenzen zu messen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die verwendet werden
können,
um zelluläre
Netzwerke und zelluläre
Signalwege aufzuklären
und zu verstehen. Profile von DNA-Bindungsproteinen, die durch Verfahren
und Zusammensetzungen dieser Erfindung erstellt wurden, können mit
Software kombiniert werden, welche die erzeugten Daten und Profile
analysiert. Derartige Software kann Funktionen umfassen wie z. B. Mustererkennungs-
und Musterfindungs-Algorithmen, unüberwachte oder überwachte
hierarchische Cluster-Analyse, und dergleichen, welche die Entdeckung
von neuen Bio-Markern, Diagnose und Stadienbestimmung von Krankheiten
erleichtern, und den Effekt von potenziellen neuen Arzneimitteln
voraussagen können. Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch in Verbindung mit
Software verwendet werden, die Proteine und Proteinbindesequenzen
mit ihren funktionellen und biologischen Eigenschaften korreliert.
Derartige Eigenschaften können
strukturelle, regulatorische, oder enzymatische Funktionen der entdeckten
Proteine umfassen, die biologischen „Zielstellungen", zu denen die Proteine
oder Gene beitragen, die funktionelle Beziehung des entdeckten Proteins
zu einem oder mehreren anderen Proteinen oder Genen, die funktionelle
Beziehung von Proteinbindesequenzen zu anderen Proteinen oder Nukleinsäuresequenzen,
die Beziehung der entdeckten Proteine zu wichtigen biologischen
Prozessen und biochemischen Funktionen.
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Kombinationen
der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren mit Computersoftware
und Computer- und Labor-Hardware sind von dieser Erfindung umfasst.
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Beispiele
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Beispiel 1. Bead-Kopplung.
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Oligonukleotide
wurden unter Anwendung von Standard-EDC-Carboxylat-Kopplungschemie
gekoppelt. In Kürze,
es werden Beads in MES-Puffer, pH 4,7, suspendiert, und Oligonukleotide
werden hinzu gegeben bis zu einer Endkonzentration von 2 μM. Frisches
EDC wird hinzu gegeben, um eine Endkonzentration von 1–2 mg/mg
bereitzustellen, und man lässt
es mit der Bead-Suspension 30 Minuten lang im Dunkeln unter Rotation
reagieren. Eine ähnliche
Konzentration von frischem EDC wird erneut zu der Bead-Suspension
hinzu gegeben, und man lässt
für weitere
zwei Stunden im Dunkeln unter Rotation reagieren. Gekoppelte Beads
werden einmal mit 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,05% Tween-20,
einmal mit 0,2% SDS in PBS, zweimal mit PBS, pH 7,5, die 0,02% Tween-20
enthält,
einmal mit PBS, pH 7,5, gewaschen und in PBS, pH 7,5, auf eine Endkonzentration
von 1000–2000
Beads/Mikroliter resuspendiert.
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Beispiel 2. Detektion von Proteinbindung
an Detektions-Duplexe mit Detektionsreagenzien unter Verwendung einer
Einfang-Markierung.
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Oligonukleotid-Annealing:
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Detektions-Duplexe
wurden aus dem Oligonukleotid PO4Kbfor (PO4-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG)
zusammengesetzt, das eine Markierungssequenz, eine NF-κB-Bindestelle
und eine 5'-Phosphatgruppe
trägt,
und dem komplementären
Oligonukleotid KBrev (TCCTGGGGATCCCCTCAACT) dem die Markierungssequenz
fehlt.
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Das
Annealing von PO4Kbfor und KBrev wurden durchgeführt, indem zunächst 100 μM Oligonukleotid-Stammlösungen mit
Annealing-Puffer (40 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, und 1 mM EDTA)
verdünnt
wurden, um ein Verhältnis
von 20 nM PO4Kbfor zu 1 μM
KBrev zu erhalten. 100 μl
des Oligonukleotid-Gemischs wurden dann für eine Minute auf 95°C erhitzt
und über
eine Zeitdauer von 45 Minuten in linearer Weise auf Raumtemperatur
abgekühlt.
1 μl des
hybridisierten Gemischs, das die Detektions-Duplexe enthielt, die
eine einzelsträngige
Markierungssequenz aufwiesen, wurde zu 19 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer (10
mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2),
der 250 ng Poly(dI-dC) und 0,5% Bovines Serumalbumin (Fraktion V)
enthielt, und wurde mit variierenden Mengen von NF-κB-p50-Protein
für 15
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 1800 Beads, suspendiert in
25 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer,
der 0,35% BSA enthielt, wurden zu angemessenen Reaktionsansätzen hinzu
gegeben und wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss
an die Hybridisierung von DNA-Bindungsprotein-Detektions-Duplex-Komplexen an
Bead-Oberflächen
wurden 25 μl
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer, der (0,1 μg) NF-κB-p50-spezifische Primärantikörper (Santa
Cruz Biotechnology Katalognr. SC-114) enthielt, zu dem Detektions-Duplex-Proben-Bead-Gemisch hinzu
gegeben und für
20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Agitation inkubiert.
Unter Verwendung einer Filterplatte (Millipore MABV1250) und einem
Vakuum-Mehrfachansaugstutzen, wurden Beads einmal mit 100 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer, der
0,35% BSA enthielt, gewaschen. 50 μl einer 1:500 Verdünnung von
phycoerythrinmarkiertem Anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper (Sigma Katalognr. P9537)
wurden zu jedem Assay im Anschluss an eine 30-minütige Inkubation
im Dunkeln unter bation im Dunkeln unter Agitation bei Raumtemperatur
hinzu gegeben. 25 μl
von jedem Assay wurden unter Verwendung der Luminex 100-Instrumentierung
ausgelesen. Daten von diesem Experiment sind in 12 gezeigt, und
das Signal, das erhalten wurde, zeigt eine dosisabhängige Antwort
auf die Menge an DNA-Bindungsprotein, das zu dem Detektions-Duplex gegeben wurde.
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Beispiel 3. Detektion von Proteinbindung
an DNA mit einem Einfangreagens.
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Zwei
Mikrogramm des Einfangreagens (Santa Cruz Biotechnologies NF-κB-p65-Antikörper, Katalognr. SC-372)
wird mit Bead-Trägern
inkubiert, die kovalent mit rekombinantem Protein G (Upstate Biotechnology) gekoppelt
sind. Diese Inkubation wird für
zwei Stunden unter Agitation bei Raumtemperatur unter Ausschluss von
Licht ausgeführt.
Beads werden dann mit 3-mal 200 μl-Volumen
Transkriptionsfaktor-Puffer gewaschen, um Antikörper zu entfernen, die nicht
an die Protein G-Oberfläche
gebunden haben. 200 fmol des Biotin-HPNFKB65-Haarnadel-Detektions-Duplex
werden für 10 Minuten bei Raumtemperatur
in 20 μl
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl,
2 mM KCl, 2 mM MgCl
2), der 250 ng Poly(dI-dC)
und 0,5% Bovines Serumalbumin (Fraktion V) enthielt, mit 2 μg von nukleären Zellextrakten
inkubiert, die aus Kontroll- und TNF-alpha-stimulierten HeLa-Zellen
erhalten wurden. Im Anschluss an die Inkubation der Proben mit Detektions-Duplexen
wurden 25 μl
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer,
der 1000 an Einfangreagens gebundene Protein-G-Beads enthielt, zu
jedem Assay hinzu gegeben und für
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Beads werden dann mit 2-mal
200 μl-Volumen
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer gewaschen, um Haarnadel-Oligonukleotide zu
entfernen, die nicht auf Bead-Oberflächen eingefangen wurden. Jeder
Assay wird dann in 100 μl
Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)-Konjugat (2 μg/ml in Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer)
resuspendiert, für
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und unter Verwendung der
Luminex 100-Instrumentierung analysiert.
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TNF-stimulierte
Extrakte enthalten NF-κ6-p65-Protein,
das einen Komplex mit Haarnadel-Oligonukleotiden
ausbildet, die zur Detektion verwendet werden. Die NF-κB-p65-Haarnadel-Oligonukleotid-Komplexe werden
durch die Anti-p65-Antikörper
eingefangen, die auf Bead- Oberflächen immobilisiert
sind, und NF-κB-p65-biotinylierte-DNA-Komplexe,
die mit der Bead-Oberfläche
verbunden sind, werden unter Verwendung von SA-PE detektiert.
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Beispiel 4. Detektion von Proteinbindung
an DNA mit Inhibition von sequenzspezifischer Spaltung.
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In
diesem Beispiel werden Typ II-Restriktionsendonukleasen verwendet
mit Detektions-Duplexen,
die Haarnadel-Oligonukleotide umfassen, die an Beads gekoppelt sind.
Typ II-Restriktionsenzyme
spalten doppelsträngige
DNA an derselben Stelle, an der sie DNA erkennen und daran binden.
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Haarnadel-Oligonukleotide
(KBREHP, Biotin-TCCAAGGGGATTCCCCAGTG-amino-C-6-TACTGGGGAATCCCCTTGGA), die überlappende
Transkriptionsfaktor-(NF-κB)
und Restriktionsenzym (EcoRI) – Bindestellen
aufweisen, werden über
Amino-C6 unter Verwendung von Standard EDC-Chemie an Bead-Oberflächen gekoppelt,
wie zuvor beschrieben. Ungefähr
1000 der gekoppelten Beads werden pro 25 μl Assay verwendet. KBREHP-gekoppelte Beads
werden für
10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 μg nukleärem Extrakt (erhalten aus Kontroll-
und TNF-behandelten HeLa-Zellen) in einem 25 μl-Volumen Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer
(10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2),
der 250 ng Poly(dI-dC) und 0,5% Bovines Serumalbumin (Fraktion V)
enthielt, inkubiert. Im Anschluss an die Bindung wurden die Reaktionen
mit Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer
auf 50 μl
gebracht und mit 1 M MgCl2 versetzt, um
eine Endkonzentration von 10 mM MgCl2 zu
erhalten. Proben werden dann mit 10 μl Restriktionsendonuklease EcoRI für 10 Minuten
bei 37°C
inkubiert. 50 μl
Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)(2 μg/ml) werden zu jeder Reaktion hinzu
gegeben und vor der Analyse unter Verwendung der Luminex 100-Instrumentierung
für 10
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Aktives NF-κB-p50 bindet
an DNA und schützt
vor dem Verdau durch die EcoRI Endonuklease. NF-κB wird gemessen an dem Signal,
das auf der Bead-Oberfläche
zurückgehalten
wird, quantifiziert.
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Beispiel 5. Detektion von Proteinbindung
an DNA mit Inhibition von sequenzspezifischer Spaltung durch Typ II-Restriktionsendonukleasen.
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Detektions-Duplexe
wurden zusammengesetzt durch die Hybridisierung von Oligonukleotiden,
mit der Bezeichnung FOR (Biotin-AAGGATGAGCGGGGGATCCCAATAGGCGGCTGCTTATCGGTCTAT),
die eine NF-κB-Bindesteile, eine
Fok I-Bindestelle und eine Markierungssequenz umfassen, mit Oligonukleotiden,
mit der Bezeichnung bREV (CTATTGGGATCCCCGCTCATCCTT), die komplementär zu dem
FOR-Oligonukleotid sind, denen aber eine komplementäre Markierungssequenz
fehlt.
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Die
Hybridisierung der Oligonukleotid-Paare wurde wie folgt erreicht:
bREV
und FOR wurden auf 1 μM
beziehungsweise 40 μM
in Puffer verdünnt,
der 40 mM Tris. pH 7,5, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA enthielt. Oligonukleotide
wurden dann für
eine Minute auf 95°C
erhitzt, und man ließ sie über eine
Zeitdauer von 45 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen.
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Bindung
von Transkriptionsfaktoren wurde durchgeführt durch Inkubieren von 1 μl des hybridisierten Oligonukleotids
mit rekombinantem NF-κB-p50
Transkriptionsfaktor (Promega, Katalognr.) in einem Gesamtvolumen
von 15 μl
Bindungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2), der 250 ng Poly(dI-dC) und 0,5% Bovines
Serumalbumin (Fraktion V) enthielt. Im Anschluss an eine 10-minütige Inkubation
bei Raumtemperatur wurde jeder Assay mit 15 μl Bindungspuffer, der mit 20
mM MgCl2 versetzt war und 1 μl Fok I (4
Einheiten) oder 1 μl
Fok I-Aufbewahrungspuffer enthielt, gemischt und für weitere
10 Minuten bei 37°C
inkubiert. 30 μl
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer, der Luminex-Beads (1000 Beads)
enthielt, die mit einem einzelsträngigen Einfang-Oligonukleotid
(ATAGACCGATAAGCAGCCGC) gekoppelt waren, wurden zu jedem Assay hinzu
gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die verdauten
und unverdauten Detektions-Duplexe auf Bead-Oberflächen zu
immobilisieren. Um biotinylierte Oligonukleotide, die mit Bead-Oberflächen verbunden
waren, sichtbar zu machen, wurden 10 Minuten vor der Analyse unter
Verwendung der Luminex 100-Instrumentierung 60 μl Streptavidin-Phycoerythrin
(SA-PE) (2 μg/ml)
zu jeder Reaktion hinzu gegeben. Aktives NF-κB-p50 bindet an DNA und schützt vor
dem Verdau durch die Fok I Typ IIS-Restriktionsendonuklease. NF-κB wird gemessen
an dem zurückgehaltenen
Signal quantifiziert.
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Beispiel 6. Detektion von Proteinbindung
an DNA durch Inhibition eines externen Spaltungsreagens.
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Lambda-Exonuklease
ist in hohem Maße
spezifisch für
doppelsträngige
DNA, die eine 5'-Phosphatgruppe trägt, und
hat eine in großem
Maße reduzierte
Aktivität
gegenüber
DNA, die nicht phosphoryliert ist. Der Lambda-Exonuklease-Verdau
von DNA findet in der 5'–3'-Richtung statt.
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Oligonukleotid
PO4Kbfor (PO4-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG),
das eine Markierungssequenz, eine NF-κB-Bindestelle und eine 5'-Phosphatgruppe trägt, wurde
mit dem biotinylierten komplementären Oligonukleotid biotinKBrev
(TCCTGGGGATCCCCTCAACT-biotin) hybridisiert, dem die Einfangmarkierungssequenz
fehlt.
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Annealing
wurde durchgeführt,
indem zunächst
100 μM Oligonukieotid-Stammlösungen mit
Annealing-Puffer (40 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, und 1 mM EDTA)
verdünnt
wurden, um ein Verhältnis
von 400 nM PO4Kbfor:10 μM
biotinKBrev zu erhalten. Das Oligonukleotidgemisch wurde dann für eine Minute
auf 95°C erhitzt
und über
eine Zeitdauer von 45 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt, um
ein doppelsträngiges
Paar auszubilden, das eine einzelsträngige Markierungssequenz aufweist.
Ungefähr
50 000 Beads, gekoppelt mit Einfangmarkierungssequenz, wurden mit
50 μl des
hybridisierten Oligonukleotids für
eine Stunde bei Raumtemperatur hybridisiert. Beads wurden dann gewaschen,
um nicht hybridisierte Oligonukleotide zu entfernen und in Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer
resuspendiert.
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DNA-Bindung
an den p50 Transkriptionsfaktor wurde durchgeführt durch Inkubieren von 0,5
Gel-Retentions-Einheiten von rekombinantem p50 (definiert als die
Menge von p50, die erforderlich ist, um unter Verwendung eines konventionellen
Gel-Retentionsassay (Promega) die Retention von 190 fmol doppelsträngigem NF-κB-bindenden
Oligonukleotid zu bewirken) (Promega, Katalognr. E3770) mit 1000
hybridisierten Beads in einem 20 μl-Volumen
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl,
2 mM KCl, 2 mM MgCl2), der 250 ng Poly(dI-dC)
und 0,5% Rinderserumalbumin (Fraktion V) enthielt. Im Anschluss
an eine 10-minütige
Inkubation bei Raumtemperatur wurden 20 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer,
dem MgCl2 auf 3 mM zugesetzt wurden, und
der 3 Einheiten der Lambda-Exonuklease oder die gleiche Menge an Lambda-Exonuklease-Aufbewahrungspuffer
enthielt, zu angemessenen Reaktionen hinzu gegeben und für 15 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Im Anschluss an den Enzymverdau wurden 10 Minuten vor
der Analyse unter Verwendung der Luminex 11-Instrumentierung 40 μl Streptavidin-PE-Konjugat
(4 μg/ml)
in PBS, pH 7,5, zu den Proben hinzu gegeben. Ergebnisse dieses Experiments
sind in 13 dargestellt, die eine Dosis-Antwort
des erhaltenen Signals zeigt mit der Menge von hinzu gegebenem DNA-Bindungsprotein.
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Beispiel 7. Detektion von Proteinbindung
an DNA durch Inhibition eines externen Spaltungsreagens und einer markierten
Oligonukleotid-Sonde.
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Einzelsträngige Oligonukleotide
PO4P50 (5'-PO4-AGTTGAGGGGATCCCCAAGGGCGAAGGAACTCGACGTGGAGCCGTTTTT-aminoC6)
mit einer Transkriptionsfaktorbinde sequenz und einer Sonden-Einfangsequenz
werden über
Amino-C6 an Beads gekoppelt, wie zuvor beschrieben. Oligonukleotid PO4P50rev
wird in Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5,
50 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2) für eine Stunde
mit Beads hybridisiert, die an PO4P50 gekoppelt sind (1 pmol pro
1000 Beads). Die Beads werden dann gewaschen und in Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer
auf eine Konzentration von 1000 Beads/μl resuspendiert. Bindungsreaktionen
werden dann durch Inkubieren von 1000 Beads mit Proben in einem
20 μl -Volumen
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer, der 0,35% BSA und 0,1–2 μg Poly-(dI-dC)
enthielt, für
10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Im Anschluss an die Bindungsreaktion
werden 20 μl
Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer, der mit MgCl2 auf
3 mM versetzt war, und der 3 Einheiten der Lambda-Exonuklease oder
ein Äquivalent
an Lambda-Exonuklease-Aufbewahrungspuffer enthielt, zu angemessenen
Reaktionen hinzu gegeben und für
15 Minuten bei 37°C
inkubiert. 1 pmol der biotinmarkierten einzelsträngigen Sonden-DNA wird dann
zu jeder Reaktion hinzu gegeben und mit Beads hybridisiert durch
Erhitzen auf 95°C
für eine
Minute gefolgt von Abkühlen über eine
Zeitdauer von 30 Minuten, um Raumtemperatur zu erreichen. Im Anschluss
an die Hybridisierung der Sonde an beadgekoppelte DNA wurden Assays
mit 2-mal 100 μl
SA-PE (2 μg/ml)
in PBS, pH 7,5, gewaschen. Im Anschluss an eine 10-minütige Inkubation
bei Raumtemperatur wurden die Assays unter Verwendung der Luminex
100-Instrumentierung analysiert.
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Beispiel 7. Detektion von Proteinbindung
an DNA durch direkte Markierung von Protein
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Getrennt
werden 10 μg
Kontroll-Zellextrakt und 10 μg
HeLa-Zellextrakte, versetzt mit 10 Gel-Retentions-Einheiten von rekombinantem
NF-κB-p50
in 20 μl
Markierungspuffer (PBS, pH 8,0) suspendiert. 0,5 mg der wasserlöslichen
Form von N-Hydroxysuccinimid-Biotin (NHS-Biotin) wurden zu jeder Markierungs-Reaktion
hinzu gegeben. Mit dem Vortex-Schüttler mischen und für 2 Stunden
bei Raumtemperatur inkubieren. 30 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer (10
mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2)
zu jeder Markierungs-Reaktion hinzu geben und nicht eingebautes
NHS-Biotin durch Entsalzen über
eine G-25 Spin-Säule entfernen.
Eine Gel-Retentionseinheit der entsalzten und markierten Probe mit
Beads inkubieren, die mit einem Haarnadel-Detektionsmolekül gekoppelt
sind, das eine NF-κB-p50-Bindestelle
trägt.
Diese Inkubation wird in einem Gesamtvolumen von 20 μl Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer
durchgeführt,
der 100 ng Poly-(dI-dC) und 0,35% BSA, Fraktion V, enthält. Im Anschluss
an eine 10-minütige
Inkubation bei Raumtemperatur, 80 μl Streptavidin-Phycoerythrin
(2 μg/ml)
in Transkriptionsfaktor-Bindungspuffer hinzu geben, 10 Minuten inkubieren
und unter Verwendung der Luminex 100-Instrumentierung analysieren.
Beads, die mit markiertem HeLa-Zellextrakt inkubiert wurden, das
mit rekombinantem NF- κB-p50 versetzt
war, haben im Vergleich zu Beads, die mit markierten HeLa-Zellextrakten
inkubiert wurden, die nicht mit rekombinantem NF-κB-p50 versetzt
waren, signifikantes Phycoerythrin-Signal, das mit ihrer Oberfläche verbunden
ist.
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Fachleute
werden erkennen oder in der Lage sein, unter Verwendung von nicht
mehr als Routine-Experimenten, viele Äquivalente zu den spezifischen
Ausführungsformen
der hier beschriebenen Erfindung zu ermitteln. Derartige Äquivalente
sollen von den folgenden Ansprüchen
umfasst werden.