DE60313082T2

DE60313082T2 - Automatisches Verfahren und Reagenz zur Messung von Körperflüssigkeitsproben, wie Zerebrospinalflüssigkeit

Info

Publication number: DE60313082T2
Application number: DE60313082T
Authority: DE
Inventors: Leonard White Plains Ornstein; Gena Harrington Park Fischer; David Monsey Zelmanovic; Pamela Wappingers Falls Elsins; Jolanta E. Peekskill Kunicka; Michael J. South Nyack Malin
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2023-05-16
Also published as: EP1376135A2; EP1376135B1; EP1376135A3; ATE359522T1; AU2003204169A1; DE60313082D1; CA2428740A1; JP3759512B2; AU2003204169B2; JP2003344393A; US7670798B2; US20030215890A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft halb- und vollautomatische Verfahren sowie Reagenzzusammensetzungen zur Testung von Körperflüssigkeitsproben, insbesondere Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Zellkomponenten, die darin gefunden werden können. Die Erfindung ist für klinische Anwendungen relevant und stellt Assays bereit, die wirksam, exakt und reproduzierbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) befindet zwischen zwei Meningealmembranen des Gehirns und wird über die Großhirnhemisphäre und das Rückenmark zirkuliert. Die CSF wirkt als Schutzkissen für das darunter liegende zentrale Nervengewebe; weitere Funktionen umfassen die Sammlung von Abfallstoffen, die Zirkulation von Nährstoffen und die Schmierung des Zentralnervensystems.
Die klinische Hauptaufgabe der CSF-Analyse besteht in der Diagnose von bakterieller Meningitis, der Differentialdiagnose von viraler und fungaler Meningitis, Enzephalitis, neurologischen Störungen und der Diagnose von Leukämien mit CSF-Beteiligung. Weitere Indikationen der CSF-Analyse umfassen das Monitoring von Patienten, die sich einer Therapie für Leukämien und Lymphome unterziehen. Die Untersuchung von CSF-Proben umfasst typischerweise chemische und immunologische Studien und insbesondere die mikrobielle Untersuchung und hämatologische Analyse zur Ableitung der roten Blutzellenanzahl (RBC), der weißen Blutzellenanzahl (WBC) und der WBC-Differentialzellzählung. Zur Bereitstellung einer klinischen Diagnose werden diese Ergebnisse mit den klinischen Befunden und den radiographischen Studien korreliert.
Die hämatologische Analyse von CSF-Proben wird derzeit in der Mehrzahl von Krankenhauslaboratorien unter Verwendung von manuellem Zellzählen und von Zelldifferenzierungsverfahren durchgeführt. Diese Analysen gehören heutzutage zu den arbeitsintensivsten manuellen Vorgängen im klinischen Labor. Beispielsweise erfordert die Analyse einer CSF-Probe unter Verwendung der derzeitigen manuellen Verfahren ungefähr 30–45 Minuten. Derzeit ist kein automatisches Verfahren zur CSF-Analyse auf existierenden hämatologischen Plattformen vorhanden.
Automatische Zellzähler oder hämatologische Analysatoren, wie der ADVIA 120^®-Analysator (Bayer Corporation, Tarrytown, NY) sind typischerweise dazu ausgelegt, Zellen aus Vollblutproben zu zählen. Die Standardreagenzien, die auf solchen Instrumenten verwendet werden, sind zur Kompensation für oder zur Nutzung von verschiedenen chemischen Wirkungen von einigen der Hauptkomponenten des Blutplasmas, z. B. Albumin, Lipoprotein und dergleichen ausgelegt (siehe beispielsweise US-Patentschriften Nrn. 3,741,875 und 4,412,004). Außerdem zählen automatische Analysatoren/Zellzähler typischerweise etwa 2000 bis 50000 Zellen in einer einzigen Blutverdünnung pro Analysezyklus. Zusätzlich verursacht die Gegenwart von nur 5 bis 10 nicht-zellulären Teilchen (oder 5 bis 10 Zellen, die von einem vorherigen Zyklus verschleppt werden, d. h. Verschleppung), die die Regionen überlappen, die von den zählbaren Zellen eingenommen werden, nur einen sehr geringen Verlust an Genauigkeit und/oder Präzision bei der Vollblutprobenanalyse. Außerdem sind Instrumente wie das ADVIA 120^® typischerweise dazu ausgelegt, ein Aliquot feststehender Größe von Vollblut aufzunehmen, welches automatisch verdünnt wird, um die erforderliche Zellkonzentration für einen feststehenden Zählzeitraum bereitzustellen.
Körperfluide, mit Ausnahme von Vollblut, beispielsweise Cerebrospinalflüssigkeit, enthalten normalerweise keine roten Zellen oder Plättchen, wenig oder gar kein gelöstes Protein und nur 0,01 % der typischen weißen Blutzellenanzahl von Vollblut. Wenn die gleichen automatischen Instrumente, die Vollblutzellanalysen ausführen, auch zur Bestimmung der Zellanzahl von solchen Nicht-Blut-Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, ist es darum erforderlich, dass Reagenzien und Verdünnungen dazu ausgelegt sind, die typischen, nahezu azellulären Bedingungen von solchen Proben auszugleichen. Ferner bildet, im Gegensatz zur Vollblutzellanalyse, wenn der Analysezyklus des Instruments ein Körperflüssigkeitsprobevolumen handhabt, das nur 5 bis 10 authentische Zellen enthält, die Interferenz von nicht-zellulären Teilchen und Verschleppung, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, ein Problem bei der Analyse solcher Nicht-Blut-Körperflüssigkeiten, die sehr wenige Zellen enthalten.
Aufgrund der geringen Konzentration an Zellen in Proben von Nicht-Blut-Aliquoten von Körperflüssigkeiten, wie CSF, muss die Probenverdünnung stark herabgesetzt werden, um geeignete Genauigkeit für den gleichen feststehenden Zählzeitraum bereitzustellen. Außerdem werden seltene Proben, wie CSF, als eine spezielle Kategorie im Vergleich mit Vollblutproben betrachtet. Beispielsweise kommen Körperflüssigkeitsproben, z. B. CSF, typischerweise im Labor nicht sehr häufig und/oder regellos an; es ist normalerweise nicht zweckmäßig, den Arbeitsfluss des automatischen Analysators auf Vollblutproben zu unterbrechen, um die Analyse der nicht-häufigen oder statistischen Nicht-Blut-Proben anzupassen. Gegebenenfalls werden diese Typen von Proben im Allgemeinen sofort als „STAT"-Proben analysiert, allerdings können sie auch beiseite gestellt werden, um sie zur späteren Analyse und für das effizientere, chargenweise Bearbeiten zu sammeln. Allerdings sind solche unbehandelten Körperflüssigkeitsproben im Allgemeinen weniger stabil als typische anti-koagulierte Vollblutproben, die oft auch nach 24 Stunden Lagerung bei 2–6 °C mit Genauigkeit analysiert werden können.
Es ist darum wünschenswert, in der Lage zu sein, solche Nicht-Blut-Körperflüssigkeitsproben mit einem Reagenz zu mischen, das die Zellen in einem Zustand fixiert, der ihre spätere genaue Analyse, auch nach Lagerung für bis zu 24 Stunden oder mehr, sicher erlaubt. Zusätzlich ist es für solche speziellen Vorgehensweisen, die Nicht-Blut-Körperflüssigkeitsproben umfassen, normalerweise notwendig, Kontrollmaterialien zu entwickeln, die für mindestens einige Monate stabil sind und die, wenn notwendig, zur Bestätigung von Systemverstärkungen verwendet werden können, so dass die Genauigkeit der Zählungen, die bei der Verwendung von Körperflüssigkeitsproben erhalten werden, sichergestellt ist. Die vorliegende Erfindung ist dazu ausgelegt, diese Probleme und Bedürfnisse zu beheben und zu behandeln.
Zusätzlich bietet die vorliegende Erfindung automatische Verfahren und Vorgehensweisen an, d. h. halb- und vollautomatische Verfahren und Vorgehensweisen, zur Analyse von Körperflüssigkeitsproben, wie CSF, und sie stattet zweckmäßigerweise den Fachmann mit einem wirksamen reproduzierbaren und weniger zeitraubenden Assay zur Analyse von Nicht-Blut-Proben aus.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen neu entwickelten Assay (Verfahren) zur Analyse von Körperflüssigkeitsproben, insbesondere von Cerebrospinalfluid-(CSF)-Proben, bereit, der die direkte Zytometrieeinrichtung eines automatischen Zellzählers oder Analysators zur Bereitstellung und Angabe von Werten und Parametern von roten und weißen Blutzellen, die in der Körperflüssigkeitsprobe, z. B. einer CSF-Probe, nachgewiesen werden, verwendet. Das Verfahren ist halb- oder vollautomatisch und wird vorzugsweise auf einem automatischen Hämatologie-Analysator oder Durchflusszytometer, wie der ADVIA 120^® Hämatologie-Analysator (Bayer Corporation, Tarrytown, NY), durchgeführt. Das Verfahren wird in Verbindung mit einem Reagenz durchgeführt, das sämtliche Zellen in der Probe sphärisiert und in Suspension hält. Außerdem werden, in Verbindung mit Steuerungssoftware, die Analyse und die Aufzeichnung der roten Blutzellenanzahl (RBC), der weißen Blutzellenanzahl (WBC) und der WBC-Differentialwerte in einer CSF-Probe, die der Analyse unterliegt, erreicht.
Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein halb- oder vollautomatisches Verfahren zum Nachweis von Blutzellenkomponenten von CSF in einem schnellen und reproduzierbaren Assay bereitzustellen. Solche Blutzellenkomponenten sind typischerweise in sehr geringer Konzentration in CSF vorhanden, was es schwierig macht, sie reproduzierbar, unter Verwendung herkömmlicher Verfahren nachzuweisen. Erfindungsgemäß können weiße Blutzellen, rote Blutzellen und WBC-Differentialwerte als Ergebnis der Analyse der CSF im automatischen Hämatologieanalysator bestimmt und quantifiziert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines wässrigen Reagenz' (Reagenzzusammensetzung) zum Mischen mit Nicht-Blut-Körperflüssigkeitsproben, die auf einem automatisierten Analysator analysiert werden sollen. Erfindungsgemäß umfassen die Körperflüssigkeitsproben beispielsweise CSF, Lungen- oder Bronchialspülflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und dergleichen, wie hier weiter beschrieben. Die Formulierung der Reagenzzusammensetzung ist besonders zur Verwendung in einem halbautomatischen erfindungsgemäßen Analyseverfahren geeignet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Fixierung und Sphärisierung von Zellen in einer Körperflüssigkeitsprobe oder einem Aliquot davon bereit, so dass die Zellen in Suspension bleiben und ihre Volumina und Inhalte für längere Zeiträume beibehalten. Gemäß dem Verfahren wird ein Aliquot einer Körperflüssigkeit mit einem Aliquot einer wässrigen Reagenzzusammensetzung vermischt, die im Gemisch eine Lösung von mindestens einem Aldehyd, mindestens einem Tensid und Cyclodextrin umfasst. Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung sind die Aldehyde Glutaraldehyd, Formaldehyd oder eine Kombination von Glutaraldehyd und Formaldehyd; das Tenside ist ein zwitterionisches, Detergens; und das Cyclodextrin ist Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein Kontrollmaterial zur Durchflusszytometrieanalyse der Zellen in Körperflüssigkeiten bereitzustellen, wobei das Kontrollmaterial ein Gemisch von Zellen einer zu analysierenden Körperflüssigkeit und die oben beschriebene wässrige erfindungsgemäße Reagenzzusammensetzung umfasst.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Kontrollmaterial zur Durchflusszytometrieanalyse der Zellen in Körperflüssigkeiten bereit, die Zellen nach Fixierung und Sphärisierung in einem Gemisch, wie vorstehend beschrieben, umfassen, wobei die Zellen in einer anderen stabilisierten wässrigen Lösung resuspendiert werden.
Weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der ausführlichen Beschreibung der Erfindung, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Figuren/Zeichnungen betrachtet wird, besser verstanden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A–1D beschreiben Zytogramme von plättchenreichem Plasma (PRP), untersucht auf einem automatisierten Hämatologieanalysator (d. h. Bayer ADVIA 120^® automatisierter Analysator, Bayer Corporation, Tarrytown, NY). 1A und 1B zeigen Direkt-Zytometrie-Zytogramme der PRP-Probe, 1:20 verdünnt mit Phosphatgepufferter Salzlösung. Weiße Blutzellen (LYMPHs, MONOs, NEUTs, Plättchen (=platelets) und EOs) bilden distinkte Cluster, die voneinander gut abgetrennt sind. Da die roten Blutzellen (RBCs) nicht sphärisiert sind, bilden sie keine distinkten Cluster und somit überlagern sie teilweise die Lymphozytenpopulation. 1C und 1D zeigen CSF-Direkt-Zytometrie-Zytogramme der gleichen PRP-Probe wie in 1A und 1B, 1:20 verdünnt mit der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung, um die Zellen zu fixieren und zu sphärisieren. Die Position der fixierten und sphärisierten weißen Zellen hat sich im Vergleich mit 1A verschoben, und sie bilden distinktere Zellcluster. Im Gegensatz zu 1A bilden nun die fixierten und sphärisierten roten Blutzellen, gesehen in 1C, einen distinkten Cluster und überlagern die Lymphozyten nicht. Im Gegensatz zu 1B kann man in 1D sehen, dass sich die Eosinophile von der klar ausgebildeten neutrophilen Population abtrennen. 1E zeigt das Zytogramm einer fixierten und sphärisierten PRP-Probe mit einer überlagerten Mie-Map, wobei ein Koordinatensatz das Zellvolumen und der andere (fast orthogonale) Satz den Brechungsindex (der proportional ist zur Trockenmassekonzentration) darstellt. Das Volumen variiert von 30–410 fl auf der Karte und ist in Inkrementen von 30 fl gezeigt. Die Trockenmasse variiert von 0–49 g/dl und ist in Inkrementen von 5 g/dl gezeigt. Neutrophile besitzen beispielsweise ein durchschnittliches Volumen zwischen 150 und 180 fl und eine durchschnittliche Trockenmasse zwischen 29–34 g/dl.
2 erläutert ein schematisches Flussdiagramm des halbautomatischen CSF-Assays oder des Assays für eine andere Körperflüssigkeiten gemäß der Erfindung, so wie es unter Verwendung des beispielhaft erläuterten ADVIA 120^® Hämatologieanalysators (Bayer Corporation, Tarrytown, NY) durchgeführt wurde.
3A bis 3C veranschaulichen die Auswirkungen von variierenden Reagenzosmolalitäten auf eine Probe (Tabelle 2). Die gleiche PRP-Probe unter Verwendung von Reagenzien mit einer vorgegebenen Osmolalität von 1070 mOsm (3A), einer hohen Osmolalität von 1140 mOsm (3B) und einer niedrigen Osmolalität von 1024 mOsm (3C) ist gezeigt. Es ist anzumerken, dass nach einer 1:1-Verdünnung das Vorgenannte Lösungen ergab, die osmotisch gleichwertig sind zu Lösungen von etwa 360 mOsm, 430 mOsm bzw. 314 mOsm von nicht-permeierenden gelösten Stoffen. Obwohl sich weiße Blutzellenpopulationen im Uhrzeigersinn mit zunehmender Osmolalität verschieben, fallen sie immer noch in entsprechende Austastbereiche in dem Zytogramm und können korrekt analysiert werden. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäße Reagenzzuammensetzung in einem Bereich von Osmolalitäten formuliert werden kann.
4 stellt WBC-Ergebnisse dar und zeigt die Korrelation von CSF-Assay-Ergebnissen gemäß der Erfindung, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse von WBC-Zählungen für 80 CSF-Proben.
5 zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse von WBC-Zählungen für 52 CSF-Proben mit WBC-Zählungen mit ≤ 5 Zellen/μl, die ± 2 SD zeigen, um die Ungenauigkeit des manuellen Ergebnisses wiederzugeben.
6 zeigt die Korrelation der erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnisse, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Ergebnisse für RBC-Zählungen zwischen 0 und 1840 in 74 CSF-Proben.
7 zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse für die Anzahl von Neutrophilen in 78 CSF-Proben. Da die Proben bei dieser Studie nicht genug Eosinophile enthielten, um sie reproduzierbar von Neutrophilen zu differenzieren, stellt der Graph von 7 nur die Gesamtanzahl von polymorphkernigen Zellen (d. h. Neutrophile (NEUTS) plus Eosinophile (EOs)) dar.
8 zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse für die Lymphozytenzahl in 78 CSF-Proben.
9 zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse für die Monozytenzahl in 78 CSF-Proben.
10 zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assay-Ergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuelle Analyseergebnisse für die Anzahl von mononukleären Zellen in 78 CSF-Proben.
11A–11H veranschaulichen die Ergebnisse aus der Analyse von CSF-Proben, erhalten aus einem Krankenhauslabor, wie in Beispiel 1 beschrieben. 11A: Analyse einer normalen nahezu azellulären CSF-Probe; 11C: Analyse einer Probe mit geringen WBC-Zählungen; 11E: Analyse einer Probe, die WBC auf einem Niveau von ungefähr 20 WBC enthält; und 11G: Analyse einer Probe auf dem Niveau von ungefähr 100 WBC/μl. Die Tabellen unterhalb der Zytogramme der 11A, 11C, 11E und 11G (d. h. die 11B, 11D, 11F bzw. 11H), stellen die CSF-Assay-Ergebnisse, erhalten unter Verwendung des ADVIA 120^® automatisierten Analyseinstruments und die manuellen Referenzergebnisse dar.
12A und 12B erläutern eine Regressionsanalyse für WBC (12A) und RBC (12B), wie in Beispiel 4 beschrieben. Die experimentell erhaltenen (beobachteten) Zellanzahlen sind mit den erwarteten Werten für weiße und rote Zellen identisch.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt exakte und empfindliche halb- und vollautomatische Assays und Verfahren zur Analyse von Körperflüssigkeitsproben, wie CSF-Proben, bereit. Ein Vorteil des Verfahrens dieser Erfindung ist die Entwicklung und Verwendung einer direkten Zytometrie-Abtasteinrichtung eines automatisierten Hämatologieanalysators oder Zellzählers in Verbindung mit einem Reagenz, das sämtliche Zellen, die in der Probe vorhanden sein können, ohne Zelllysis sphärisiert und fixiert. Der Assay/das Verfahren gestattet die Analyse von typischerweise volumenarmen, nahezu azellulären Körperflüssigkeitsproben exakt, zuverlässig und mit Empfindlichkeit.
Die Analyse von CSF und anderen Nicht-Blut-Körperflüssigkeiten macht von im Verfahren verwendeter Steuerungssoftware Gebrauch, insbesondere bei Durchführung auf einem Hämatologieanalysator, wie ADVIA 120^® automatisiertes Direktozytometrie-Instrument (Bayer Corporation, Tarrytown, NY). Neu entwickelte Hydraulikzyklen, die auf dem Analysator durchgeführt werden, gestatten die Verwendung eines kleinen Probevolumens zur Analyse und behalten die für diesen Assay benötigte Reinheit bei.
Das neue Sphärisierungs- und Fixierungsreagenz, das bei der Analyse verwendet wird, konserviert die präparierten Proben und verlängert somit die Länge der Zeit nach dem Ziehen, während der die Proben mit Genauigkeit analysiert werden können. Somit können, sofern gewünscht, Körperflüssigkeitsproben, z. B. CSF-Proben, chargenweise untersucht oder für bis zu einer Woche bei 4 °C zur weiteren Analyse gelagert werden. Präparierte CSF-Proben können mehrere Stunden bei Raumtemperatur (z. B. 18–30 °C) gelagert werden. Demnach gestatten das Verfahren und das Reagenz der vorliegenden Erfindung, dass sich Körperflüssigkeitsproben, wie CSF-Proben, hinsichtlich ihrer zeitlichen Stabilität bis zur und während der automatisierten Zytometrieanalyse wie oder sogar noch besser als Blutproben verhalten.
Früher entwickelte Reagenzien zur Sphärisierung von Blutzellen umfassen zwitterionische Tenside, um sowohl rote Blutzellen als auch weiße Blutzellen isovolumetrisch zu sphärisieren (siehe US-Patentschriften Nrn.: 4,412,004, 4,575,490, 5,045,472, 5,350,695, 5,360,739, 5,411,897, 5,438,003 und 5,633,167). Wenn ein zwitterionisches Tensid (oberflächenaktives Mittel), wie Tetradecyl-N,N-dimethylammoniopropansulfonat (TDAPS) in einer Konzentration von 8,3 ml/l in einer ansonsten isotonischen physiologischen Lösung zur Verdünnung von plättchenreichem Plasma (PRP), 1:20, verwendet wird, und die Zellen durch Direktzytometrie im RBC-Modus auf einem automatisierten ADVIA 120^® Analysator untersucht werden, wird ein Zytogramm, wie dasjenige von 1C erhalten.
Unter weiterer Bezugnahme auf PRP ist gut bekannt, dass, wenn eine frisch gemischte anti-koagulierte Probe von normalem Blut beiseite gestellt wird, die bikonkaven roten Zellen beginnen, Zellstapel, wie Münzstapel, zu bilden. Diese beginnen mit Geschwindigkeiten zu sedimentieren, die viel größer sind als die Absetzgeschwindigkeiten einzelner Zellen (rote Zellen, weiße Zellen oder Plättchen). Nach einer Zeitdauer von etwa 30 min bis etwa 120 min (in Abhängigkeit von der bestimmten Blutprobe) hat sich das Blut in zwei Zonen getrennt: eine dunkelrot gefärbte, untere Zone gepackter roter Zellen und eine gelblich-pinkfarbene obere Schicht von weißen Zellen und Plättchen, suspendiert in Plasma, mit ebenfalls etwa 1 bis 2 unsedimentierten roten Zellen pro weißer Zelle. Wenn die Sedimentierung zu lange ausgedehnt wird, fallen auch viele der weißen Zellen auf den oberen Teil der roten Blutzellenschicht herab, um etwas zu bilden, was als Buffy Coat bezeichnet wird. Die obere Schicht wird in der Regel als plättchenreiches Plasma (PRP) bezeichnet.
Die Punktcluster, die Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile, Plättchen und rote Blutzellen darstellen, sind einzeln auf den Zytogrammen der 1A, 1C und 1E markiert. Die Lage dieser Zellen in diesen repräsentativen Zytogrammen dient als brauchbares Bezugsraster für die weitere Diskussion der Erfindung.
Es ist demnach wünschenswert, dass eine Körperflüssigkeit wie CSF, die normalerweise wenige Zellen aufweist, so bearbeitet wird, dass ein Zytogramm mit fast der gleichen Lage für jede der Zelltypen, wie in 1C gezeigt, erzeugt wird. Dies beruht darauf, dass die Zellzahlen in jedem Zellcluster, mit entsprechenden Schwellenalgorithmen unter Verwendung automatischer Zellzähler, die typischerweise zur Blutanalyse eingesetzt werden, exakt gezählt werden können. Zusätzlich zeichnet die Position jeder sphärisierten Zelle zwei wertvolle Parameter zur Charakterisierung der sphärisierten Zelle auf: nämlich ihr exaktes Volumen und ihre Trockenmassekonzentration (1E) (siehe Tycko, D.H. et al., 1983, „Cell by cell determination of and hemoglobin of isovolumetrically-sphered human red blood cells: A precision cytophotometric surrogate for red cell ,morphology''', Proc. Clinical Application of Flow, Sea Island, Georgia; Tycko, D.H. et al., 1985, „Flow-cytometric light scattering measurements of red blood cell volume and hemoglobin concentration", Appl. Optics, 24, 1355–1365; und US Patentschriften Nrn. 4,735,504 und 6,025,201).
Es ist bekannt, dass wässrige Lösungen von Aldehyden, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd, zur Fixierung von Zellen sowohl für typische histologische Zwecke als auch für Durchflusszytometrieanalyse (siehe z. B. US-Patentschriften Nrn. 3,741,875, 4,412,004 und 4,475,490) verwendbar sind. Glutaraldehyd ist üblicherweise bei geringeren Konzentrationen wirksamer als Formaldehyd und fixiert die Zellen schneller. Andererseits darf die Fixierung nicht so schnell sein, dass die Form der nicht-sphärisierten Zellen, bevor das Sphärisierungsmittel seine Arbeit verrichtet, fixiert wird. Darum ist die Wahl der Verhältnisse von Aldehyd- zu Sphärisierungsmittelkonzentration sowie die absoluten Konzentrationen der Reagenzien bei einem Fixierverfahren und beim Reagenz für Proben, die zu analysieren sind, jeweils maßgeblich.
Weiterhin kann auch das Verhältnis von Sphärisierungsmittel zu Protein bei dem fertigen Reagenz-plus-Proben-Gemisch maßgeblich sein, da eine angemessene Konzentration an Protein zur „Pufferung" des oberflächenaktiven Mittels benötigt wird. Es wurde allerdings gezeigt, dass mit der Verwendung von zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteln das Problem für rote Blutzellen weniger gravierend ist (siehe z. B. US-Patentschrift Nr. 5,633,167). Wenn beispielsweise verschiedene Kombinationen von Glutaraldehyd und TDAPS mit PRP, verdünnt 1:20 mit isotonischer Salzlösung bei neutralem pH, gemischt wurden, wurde festgestellt, dass die Konzentration an TDAPS, die gerade ausreichend war, um die roten Blutzellen in perfekter Weise zu sphärisieren, zu den Positionen von einigen der weißen Zellen führte, die in der Regel zur Linken der und unter die Positionen in dem Referenzzytogramm von 1C fallen. Auf der Grundlage der Position der weißen Zellen im 1C-Zytogramm wurde unter Bezugnahme auf die Mie-Karte festgestellt, dass diese Zellen ein verändertes Volumen aufwiesen, aus ihnen gelöste Stoffe austraten und dass sie Trockenmasse verloren. Wenn jedoch das PRP mit zellfreiem Plasma anstelle isotonischer Salzlösung verdünnt wurde, unter Verwendung der gleichen Konzentrationen an TDAPS und Glutaraldehyd, kehrten die Zellen wieder in ihre korrekten Positionen auf dem Zytogramm zurück. Obwohl somit ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel hinsichtlich der Beschädigung roter Blutzellmembranen in Gegenwart großer Schwankungen in der Proteinkonzentration „nachlässiger" ist, ist dies anscheinend für weiße Zellen in der Blutprobe weniger der Fall.
Für die Zwecke der Formulierung einer Reagenzzusammensetzung für eine Körperflüssigkeitsprobenverdünnung und/oder ein -gemisch ist es nicht dienlich, Reagenzien herzustellen, die Plasma oder Proteine als Bestandteile oder Komponenten enthalten, insbesondere in Gegenwart von Aldehyden, da Aldehyde typischerweise mit Proteinen reagieren und sie vernetzen, wodurch sich ihre Löslichkeit, Stabilität und ihr Pufferungsvermögen ändern. Somit wurde erfindungsgemäß eine Reagenzzusammensetzung zur Verwendung mit anderen Körperflüssigkeitsproben als Vollblutproben konzipiert, die ein relativ Aldehyd-inertes Material zum Ersatz von Plasmaprotein einschließt, um als Puffer für das Tensid zu wirken und es reversibel zu binden.
Die verwendeten und als geeignete Bestandteile zum Einschluss in die Reagenzzusammensetzung zum Mischen mit Nicht-Vollblut-Körperflüssigkeiten entdeckten Materialien sind Cyclodextrine. Bevorzugt aufgrund ihrer größeren Wasserlöslichkeit sind hydroxypropylierte β-Cyclodextrine. Unmodifizierte alpha-(α)-, beta-(β)- und gamma-(γ)-Cyclodextrine sind ebenfalls geeignet; es wird allerdings davon ausgegangen, dass die geringeren Wasserlöslichkeiten dieser letzteren Typen von Cyclodextrinen die Formulierungen, die zur Herstellung von konzentrierten Stammlösungen verwendet werden, die zur Zweckmäßigkeit der Herstellung beitragen, etwas einschränken.
Somit stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine wässrige Reagenzzusammensetzung, die insbesondere zum Mischen mit Körperflüssigkeiten, wie CSF, geeignet ist, zur Analyse unter Verwendung eines automatisierten hämatologischen Analyseinstruments bereit. Erfindungsgemäß wird das Reagenz zur Fixierung und Sphärisierung von Zellen in einem Aliquot von Körperflüssigkeit eingesetzt, so dass die Zellen in Suspension verbleiben und ihr Volumen und Gehalt für längere Zeiten beibehalten. Das Verfahren umfasst das Mischen eines Aliquots einer Körperflüssigkeit mit einem Aliquot des wässrigen Reagenz, d. h. der Reagenzzusammensetzung, die eine Lösung von geeigneten Aldehyden, oberflächenaktivem Mittel und Cyclodextrin umfasst, um ein Reagenzgemisch zu bilden, und das Analysieren des Gemisches, praktisch eine Zelle nach der anderen, auf einem automatisierten Analysator unter Verwendung der Direktzytometrie.
Die erfindungsgemäße wässrige Reagenzformulierung umfasst mindestens ein Fixierungsmittel, vorzugsweise Formaldehyd, Glutaraldehyd oder eine Kombination davon. Der Formaldehyd-Gehalt in dem Reagenz wird durch die Zugabe von Formalin kontrolliert, das eine 37-Gew.-%-Lösung von Formaldehyd in Wasser ist. Im CSF-Reagenz ist Formaldehyd in einer Menge von etwa 10 g/l bis etwa 25 g/l vorhanden; speziell von etwa 15 g/l bis etwa 23 g/l; spezieller von etwa 17 g/l bis etwa 23 g/l; und ganz speziell von etwa 17,03 g/l bis etwa 23,05 g/l, vorzugsweise von etwa 18,0 g/l bis etwa 21,0 g/l und noch stärker bevorzugt von etwa 19,0 g/l bis etwa 21,0 g/l vorhanden.
Der Glutaraldehyd-Gehalt in dem Reagenz wird durch die Zugabe von Glutaraldehyd als eine 25-Gew.-%-Lösung oder als eine 5-Gew.-%-Lösung kontrolliert. Glutaraldehyd ist in dem CSF-Reagenz in einer Menge von etwa 1 g/l bis etwa 5 g/l, insbesondere von etwa 2 g/l bis etwa 3 g/l, stärker bevorzugt von etwa 2,1 g/l bis etwa 2,9 g/l, noch stärker bevorzugt von etwa 2,3 g/l bis etwa 2,8 g/l, vorzugsweise von etwa 2,25 g/l bis etwa 2,75 g/l und stärker bevorzugt von etwa 2,4 g/l bis etwa 2,6 g/l vorhanden. Die Formulierung umfasst auch ein Cyclodextrin, vorzugsweise hydroxypropyliertes β-Cyclodextrin in einer Menge von etwa 10 g/l bis etwa 35 g/l, insbesondere von etwa 14 g/l bis etwa 35 g/l, stärker bevorzugt von etwa 14,1 g/l bis etwa 35,2 g/l, vorzugsweise von etwa 15 g/l bis etwa 21 g/l; insbesondere von etwa 15,5–15,8 g/l bis etwa 21–21,1 g/l und stärker bevorzugt von etwa 16,7 g/l bis etwa 18,5 g/l. Zusätzlich umfasst ein oberflächenaktives Mittel, d. h. ein Detergens oder ein Tensid, die Reagenzformulierung in einer Menge von etwa 1,5 g/l bis etwa 3,0 g/l, vorzugsweise von etwa 1,8 g/l bis etwa 2,5 g/l, stärker bevorzugt von etwa 1,8 g/l bis etwa 2,2 g/l, noch stärker bevorzugt von etwa 1,9 g/l bis etwa 2,1 g/l und sogar noch mehr bevorzugt von etwa 1,88 g/l bis etwa 2,12 g/l.
Geeignete oberflächenaktive Mittel, d. h. Tenside oder Detergentien, die in dem erfindungsgemäßen Reagenz eingesetzt werden können, umfassen nicht-ionische und zwitterionische oberflächenaktive Mittel. Mehrere allgemeine Klassen von zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteln oder ionischen oberflächenaktiven Mitteln können als Sphärisierungsmittel in der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung verwendet werden. Das oberflächenaktive Mittel ist in der Zusammensetzung in einer Menge vorhanden, die wirksam ist, um im Wesentlichen jede Zelle zu sphärisieren, die in der Körperflüssigkeitsprobe, die die Analyse durchläuft, vorhanden sein kann.
Nicht einschränkende Beispiele für geeignete Klassen von zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteln umfassen Betaine, einschließlich Carboxybetaine, Sulfobetaine (auch als Sultaine bekannt), Amidobetaine und Sulfoamidobetaine. Von besonderem Interesse zur Verwendung in der Reagenzzusammensetzung sind die C₈-C₁₈, vorzugsweise C₁₀-C₁₈-Alkylbetaine, Sulfobetaine, Amidobetaine und Amidobetaine, beispielsweise diejenigen vom Typ eines Laurylamidopropylbetains (LAB).
Nicht einschränkende Beispiele für geeignete zwitterionische oberflächenaktive Mittel in der Betain-Klasse umfassen n-Alkyldimethylammoniomethancarboxylat (DAMC), n-Alkyldimethylammonioethancarboxylat (DAEC) und n-Alkyldimethylammoniopropancarboxylat (DAPC). Beispiele für die Sulfobetain-Klasse von zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteln umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, n-Alkylsultaine oder n-Alkyldimethylammonioalkylsulfonate, wie n-Alkyldimethylammoniomethansulfonat (DAMS), n-Alkyldimethylammonioethansulfonat (DAES), n-Alkyldimethylammoniopropansulfonat (DAPS) und N-Alkyldimethylammoniobutansulfonat (DABS). In der „DAPS"-Serie der oberflächenaktiven Mittel ist TDAPS, wobei „T" n-Tetradecyl ist; DDAPS, wobei „D" Dodecyl ist, besonders geeignet und ist bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Amidobetaine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, n-Alkylamidomethandimethylammoniomethancarboxylat oder n-Alkylamidomethandimethylammonioethancarboxylat. Ein bevorzugtes Amidobetain ist Laurylamidopropylbetain (LAB). Ebenfalls geeignet sind die analogen Amidobetainsulfonate wie n-Alkylamidomethandimethylammoniomethansulfonat, n-Alkylamidoethandimethylammonioethansulfonat und n-Alkylamidopropandimethylammoniopropansulfonat. Zusätzlich können Amidobetaine, die Kokosöl als ihre Fettsäurequelle aufweisen, z. B. Cocoamidopropylbetain (CAPB) und Cocoamidosulfobetain (CASB) zur Verwendung in Erwägung gezogen werden. Weitere Beschreibungen von Betainen, Sulfobetainen, Amidobetainen und Amidosulfobetainen können in der gängigen Literatur, beispielsweise S. Takano et al., 1977, J. Amer, Oil Chem. Soc., 54: 139–143 und 484-486; Z. El Rossi, C. Horvath, 1982, Chromatographia, 15: 75–82; Kaminski und Linfield, 1979, J. Amer. Oil Chem. Soc., 56: 771–773, gefunden werden.
Weitere zwitterionische oberflächenaktive Mittel, die zur Verwendung geeignet sind, umfassen 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-2-propansulfonat (CHAPSO).
Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen im Allgemeinen Alkylglycoside. Bevorzugte nichtionische oberflächenaktive Mittel umfassen n-Dodecyl-β-D-maltosid, n-Tetradecyl-β-D-maltosid und n-Tetradecyl-β-D-glucosid.
Puffermittel sind ebenfalls in der Formulierung der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung eingeschlossen, um den pH im Bereich von etwa pH 4,0 bis pH 7,0, vorzugsweise von pH 4,5 bis pH 6,5; und stärker bevorzugt von pH 5,0 bis pH 6,4; und noch stärker bevorzugt von etwa pH 5,0 bis 5,6 zu halten. An der Obergrenze des pH-Wert-Bereiches wird die Haltbarkeit der Glutaraldehyd-Komponente des Reagenz im Allgemeinen herabgesetzt; an der Untergrenze des pH-Bereiches kann der Glutaraldehyd den Formaldehyd verdrängen, was zu einem frühzeitigen Einsetzen von Zell- und Proteinverklumpung führt. Nicht-einschränkende Beispiele für Puffermittel umfassen Salze, wie Na₂HPO₄ und/oder NaH₂PO₄, Citronensäure und ihre Salze, Succinsäure und ihre Salze und EDTA und ihre Salze, z. B. K₃ EDTA etc. in einer Menge von etwa 40 mMol bis etwa 60 mMol, stärker bevorzugt von etwa 48 mMol bis etwa 52 mMol.
Citronensäure besitzt drei pKa-Werte, nämlich 3,13, 4,67 und 6,40; darum ist sie für den Zweck der vorliegenden Erfindung ein guter Puffer, insbesondere in einem pH-Bereich zwischen etwa pH 4,5 und etwa pH 6,4. Oberhalb von 6,4 würde vorzugsweise Phosphatpuffer verwendet. Die Reagenzzusammensetzung kann auch einen Chelatbildner, beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Salze davon, (z. B. K₃EDTA) zur Aufrechterhaltung der Reagenzstabilität enthalten.
Insbesondere bevorzugt ist in der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung eine Kombination von Glutaraldehyd und Formaldehyd (Formaldehyd füllt schnell die Zelloberflächenstellen aus, die ansonsten zu verzögerter Glutaraldehyd-induzierter Zell-an-Zell- und Plasma-Proteinvernetzung führen, was anschließend zu Zellverklumpung und/oder Proteinausfällung führt); mit Hydroxylpropyl-β-cyclodextrin und mit dem zwitterionischen oberflächenaktiven Mittel TDAPS.
Eine beispielhafte und nicht-einschränkende Endformulierung einer konzentrierten Stammlösung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Reagenz zur Endverdünnung auf eine Arbeitslösung, wie nachstehend beschrieben, enthält wässriges (20–67,6 g/l) Formalin (7,4–25 g/l Formaldehyd), 1–6 g/l Glutaraldehyd, 15–42 g/l Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin ((erestar 82004) und 2–6g/l TDAPS, eingestellt auf pH 5–8 mit einem Puffer-Salz, wie Natriumcitrat oder Na₂HPO₄. Eine Liste der bevorzugten Komponenten der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung und ihrer bevorzugten Mengen, wie bei der halbautomatischen Assay-Ausführungsform der Erfindung verwendet, ist in Tabelle 1 gezeigt. Der bevorzugte pH-Bereich für das CSF- Reagenz, das in Tabelle 1 dargestellt ist, beträgt etwa 5,3–5,5. Diese Reagenzzusammensetzung zeigt Stabilität sowohl für Verwendung bei dem Verfahren als auch für die Langzeitaufbewahrung, z. B. mindestens ein Jahr. Es ist selbstverständlich, dass die bevorzugten Reagenzien und Mengen als Beispiel und als Leitlinie bereitgestellt sind und nicht einschränkend sein sollen.
TABELLE 1 Bevorzugte Ausführungsform der CSF-Reagenzkomponenten
Typischerweise wird eine Arbeitslösung durch Verdünnen der Stammlösung, z. B. 1:5 bis 1:20 mit isotonischer (z. B. 290 miliOsmolat, mOsmol/kg; mOsm) Kochsalzlösung oder einer anderen physiologischen Lösung hergestellt. Für einige Zwecke können Kochsalzlösungen einer Tonizität so gering wie 200 und so hoch wie 400 mOsm verwendet werden. Die Arbeitslösung wird vorzugsweise in einer Arbeitstonizität von etwa 1060 mOsm bis etwa 1080 mOsm formuliert und wird im Allgemeinen mit einer Körperflüssigkeitsprobe, wie CSF, in einer Verdünnung von 1:1 vermischt. Es ist festzustellen, dass der größte Teil der Tonizität der Arbeitslösung auf dem Formaldehyd beruht, das leicht und schnell die Membranen durchtritt und somit wenig zu dem ansonsten schwerwiegenden osmotischen Schrumpfen, das ansonsten von einer 1000-mOsm-Lösung von nicht-permeierendem gelösten Stoff erwartet werden würden, beiträgt. In der Tat entspricht nach einer 1:1-Verdünnung die osmotische Wirkung der Arbeitslösung etwa einer 360-mOsm-Salzlösung.
Tabelle 2 und die 3A–3C zeigen die Ergebnisse des CSF-Assays, durchgeführt unter Verwendung von Reagenzien mit mehreren unterschiedlichen Osmolalitäten. Die weiße Blutzellenpopulation fällt in die Austastbereiche in den Zytogrammen (3A-3C) und können trotz einer Verschiebung im Uhrzeigersinn mit zunehmender Osmolalität korrekt analysiert werden. Demnach wird das erfindungsgemäße Reagenz zweckmäßigerweise in einem Bereich von Osmolalitäten, wie hier gezeigt, formuliert.
Tabelle 2
Als Beispiel wird bei einer bevorzugten Ausführungsform für das CSF-Analyseverfahren ein gleiches Volumen CSF-Probe mit einem gleichen Volumen CSF-Reagenz vermischt und auf einem automatisierten Instrument, wie dem automatisierten Analysator Bayer ADVIA 120^®, durchgeführt. Das Volumen der CSF-Probe, das durch das Instrument analysiert werden kann, ist 3,7 Mal größer als das maximale Volumen (z. B. 1 μl), das derzeit durch mikroskopische Untersuchung von CSF in einem Hämazytometer analysiert werden kann. Als Ergebnis entsteht eine Quadratwurzelvon-3,7-Verbesserung (d. h. √3,7) in der Zählgenauigkeit. Das vorliegende Verfahren ist somit aufgrund seiner Fähigkeit zum schnellen, exakten, reproduzierbaren und wirksamen Analysieren von Proben, wie CSF, die typischerweise azellulär oder nahezu azellulär sind, vorteilhaft.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse von Körperflüssigkeiten zusätzlich zu und andere als Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), beispielsweise Pleuralflüssigkeitsproben, Lungen- oder Bronchialspülflüssigkeitsproben, Synovialflüssigkeitsproben, Peritonealflüssigkeitsproben, Knochenmarkaspiratproben, Aszitesflüssigkeitsproben, Sputumproben, Salivaproben, Lymphe, Tränen, Serum, Plasma, Samen, Urin oder Blasenspülungsproben und dergleichen. Solche Proben enthalten häufig, wenn auch nicht zwangsläufig, sehr wenige Zellen. Wenn die Konzentration der Zellen wesentlich höher ist als in CSF, wird eine Verdünnung von größer als 1:1 mit Sphärisierungs/Fixierungsreagenz verwendet. Demnach ist die Empfindlichkeit des vorliegenden Verfahrens gut zur Analyse von Zellen bei einer Vielzahl verschiedener Körperflüssigkeitsproben geeignet. Solche Körperflüssigkeitsproben können auch mit der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung vermischt werden, um ein stabileres Reagenzgemisch mit mindestens einer achtstündigen Stabilität bei Raumtemperatur und einer mehr als 24-stündigen Stabilität bei 4 °C herzustellen.
Bei einer bestimmten, jedoch nicht einschränkenden Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Analyse von CSF-Proben auf einem ADVIA 120^® Hämatologieanalysator. Mit entsprechenden System-/Software-Modifikationen, einschließlich Änderungen der zeitlichen Steuerungszyklen und Analysealgorithmen können andere Anwendungen dieser Erfindung das Überwachen von frisch eingefrorenen Plasmaeinheiten in Blutbanken auf die Gegenwart von Rest-RBSs, – WBCs und – Plättchen einschließen. Typische annehmbare Zellspiegel für die Qualitätskontrolle dieser Einheiten sind: weniger als 1 – 6 × 10³ RBC/μl, weniger als 100 WBC/μl bzw. weniger als 20 × 10³ PLT/μl.
Wie durch die Erfindung mit eingeschlossen und wie hier beschrieben, wurde eine Reagenzzusammensetzung entwickelt, die das ADVIA 120^® CSF-Reagenz hier genannt wird, um CSF-Proben zur Analyse auf dem ADVIA 120^® Analysator herzustellen. Es ist selbstverständlich, dass Reagenz und Verfahren, wie für CSF-Proben beschrieben, ebenfalls zur Analyse von anderen Körperflüssigkeitsproben geeignet sind, wie durch die vorliegende Erfindung betrachtet und vorstehend dargelegt. Wie hier verwendet, sollen somit die Begriffe „CSF-Assay" oder „CSF-Reagenz" Assays und Reagenzien für andere typischerweise nahezu azelluläre Körperflüssigkeiten, zusätzlich zu CSF, wie anderswo hier dargelegt, einschließen.
Bei einer Ausführungsform umfasst das ADVIA 120^® CSF-Verfahren eine Offline-Herstellung, wobei gleiche Volumina der Flüssigkeitsprobe, z. B. der Spinalflüssigkeitsprobe und die sphärisierende/fixierende Reagenzzusammensetzung kombiniert und unter Bildung eines Reagenz-/Probengemisches vermischt werden. Das heißt, der Anwender stellt manuell die Probe für die Analyse durch Mischen gleicher Mengen an Probenflüssigkeit (CSF-Probe) und CSF-Reagenz her und saugt das Gemisch in das automatische ADVIA 120^® Instrument.
Die hergestellte und gemischte Probe, die das Reagenzgemisch, das ein Aliquot einer Körperflüssigkeitsprobe (beispielsweise CSF) und die CSF-Reagenzzusammensetzung umfasst, befindet sich vor dem Ansaugen in den ADVIA 120^® Analysator in einem Glas- oder Kunststoffröhrchen. Eine Probenansaugung reicht aus, um reproduzierbare weiße Zell- und rote Zellparameter (z. B. WBC, RBC und ein vierteiliges WBC-Differential, d. h. die Anzahlen und prozentualen Angaben für Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile) für die Probe, die der Analyse unterliegt, zu ergeben.
Der größte Teil der Zell-enthaltenden CSF-Proben schließen kleine Anzahlen von weißen Blutzellen, mit noch kleineren Anzahlen von roten Blutzellen und Plättchen ein. Diese Faktoren machen es möglich, gleichzeitig alle Zelltypen in einer CSF-Probe leichter als in Vollblutproben zu zählen und zu klassifizieren. Im Gegensatz dazu enthalten Vollblutproben eine große Anzahl an roten Zellen, Plättchen und weißen Zellen. Die Konzentration der roten Zellen ist so hoch, dass die Blutproben wesentlich verdünnt werden müssen, um eine entsprechende Zählung zu erzielen. Selbst unter diesen Bedingungen beträgt die Anzahl von gleichzeitigem Auftreten („Koinzidenzen") von zwei oder mehreren roten Zellen in der Abtastzone eines typischen Hämatologieanalysators 4–7 % der gesamten Anzahl von gezählten Ereignissen.
Bei dem automatischen Nachweissystem, wie hier nachstehend beschrieben, nehmen rote Zellen, Plättchen und weiße Zellen distinkte Signalnachweisregionen oder Cluster ein. Allerdings nehmen die Koinzidenzsignale der roten Zellen die gleiche Signalnachweisregion ein wie Neutrophile, Eosinophile und in einigen Fällen Monozyten. Da in Vollblut das Verhältnis der roten Zellen zu den weißen Zellen typischerweise 500:1 beträgt, maskieren die Koinzidenzsignale der roten Zellen diese Signale der weißen Zellen so, dass sie nicht ordnungsgemäß klassifiziert werden können. Darum ist es notwendig, weiße Zellen getrennt von den roten Zellen und Plättchen in Vollblutproben zu analysieren. Dies wird in der Regel zunächst durch Lyse der roten Blutzellen und anschließender Analyse der verbleibenden Plättchen und weißen Zellen erreicht.
Im Gegensatz dazu machen die kleinere Anzahl und relative Konzentration von roten Zellen und Plättchen zu den weißen Zellen in CSF, oder anderen Nicht-Blut-Körperflüssigkeitsproben, es in der Regel möglich, alle diese Probenkomponenten innerhalb eines einzigen Messkanals bei einem einzigen Analysezyklus zu zählen und zu klassifizieren. Die niedrige Konzentration der roten Zellen in solchen Nicht-Vollblut-Proben führt zu wenig oder gar keiner Koinzidenz von roten Zellen, so dass Neutrophile, Eosinophile und Monozyten nicht maskiert sind.
Auf der Grundlage des Vorgenannten umfasst ein geeignetes Verfahren zur zellulären Körperflüssigkeitsanalyse, z. B. CSF-Zellanalyse, die Passage der Zellen in einer Körperflüssigkeitsprobe in Reihe (d. h. praktisch eine Zelle nach der anderen) durch die Abtastzone (Durchflusszelle) eines optischen Durchflusszytometers. Da jede Zelle einen Strahl von monochromatischem Licht, der auf die Durchflusszelle ausgerichtet ist, unterbricht, streut sie das Licht in einer Art und Weise, die für die Zellgröße und den Brechungsindex charakteristisch ist. Drei passend platzierte Detektoren erzeugen Signale im Streu-/Streuraum und im Streu-/Absorptionsraum, die distinkte Cluster von roten Blutzellen, Lymphozyten+Basophilen, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen, sowie Plättchen bilden.
Derzeitige automatisierte Analysatoren und durchflusszytometrische Analysesysteme, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden oder die zur Verwendung adaptiert werden können, umfassen die BAYER-H^*TM-Serien von automatisierten Hämatologieanalysatoren, z. B. der BAYER-H^*3^TM-Analysator und der ADVIA-120^®-Analysator, die von der Fa. Bayer Corporation, Tarrytown, New York, im Handel erhältlich sind. Solche Analysatorgeräte sind zur Verwendung mit Streu-/Streu- und Streu-/Absorptionssystemen zum Zellnachweis und zur qualitativen und quantitativen Analyse von Zellparametern geeignet. Nicht einschränkende Beschreibungen für solche Analysatoren werden in US-Patentschrift Nr. 5,817,519 von D. Zelmanovic et al.; den US-Patentschriften Nrn. 5,438,003 und 5,350,659 von G. Coletta et al. und in der US-Patentschrift Nr. 4,735,504 von D. Tycko gefunden. Es wird davon ausgegangen, dass andere Hämatologie-Analysator-Systeme mit entsprechenden Hardware- und Systemkomponenten verwendet werden können, oder zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung adaptiert werden können.
Durch die erfindungsgemäß niedrige Probenverdünnung kann, gegenüber einer manuellen Bestimmung, eine größere Anzahl von Zellen automatisch gezählt werden, und somit werden genauere und exaktere Ergebnisse bereitgestellt. Die Ausführungsvorschriften basieren auf normalen und anormalen CSF-Proben, die auf einem automatisierten ADVIA 120^® System, das mit CSF-Software konfiguriert ist, gefahren wurden. Das Reagenzgemisch, das die Probe umfasst, wird durch den hydraulischen Direktzytometrie-Pfad des ADVIA 120^® Hämatologieanalysators unter Verwendung von analytischen und Gebrauchs-Zyklen für die CSF-Analyse angesaugt.
Der CSF-Analysezyklus gestattet das Ansaugen eines möglichst kleinen Volumens der vorbereiteten Probe. Die Gebrauchszyklen (auffrischen und waschen) sind innovative hydraulische Zyklen, die die Reinheit des Flüssigkeitsweges aufrechterhalten. Über sein Computerbauteil berechnet der ADVIA 120^® Analysator typischerweise die absoluten RBC- und WBC-Anzahl, und die differentiellen WBC-Parameterwerte von der angesaugten Probenkomponente des Reagenzgemisches. Wahlweise können auch das Volumen und die Trockenmassekonzentration von jeder Zelle und die Durchschnittswerte und Verhältnisse dieser Parameter aufgezeichnet werden.
Das Volumen der CSF-Probe, die während des Assays durch das Instrument analysiert wird, ist 3,7 Mal größer als das Volumen, das typischerweise durch mikroskopische Untersuchung der CSF in einem Hämazytometer analysiert wird. Somit stellt das vorliegende Verfahren eine √3,7-fache Verbesserung der Zählgenauigkeit bereit.
Bei einer anderen Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein vollautomatisiertes Verfahren betrachtet. Das vollautomatisierte Verfahren umfasst das automatisierte Mischen eines Aliquots der Körperflüssigkeitsprobe mit der Reagenzzusammensetzung in dem Instrument nach dem Ansaugen und die anschließende Durchführung des Assays durch den automatisierten Analysator. Ein solcher vollautomatisierter Assay erhöht den Wirkungsgrad durch die Beseitigung des Erfordernisses manueller Handhabungen durch den Anwender. Es ist allerdings davon auszugehen, dass, wenn Proben länger als vier Stunden gelagert werden müssen, das halbautomatische Verfahren bevorzugt ist, da es Probenverschlechterung durch Zellfixierung verhindert.
Das erfindungsgemäße CSF-Reagenz umfasst Reagenzverbindungen, die sämtliche Zellen innerhalb der Probe sphärisieren und fixieren. Zur Verifizierung der ordnungsgemäßen Reagenzleistung werden Qualitätskontroll-(QC)-Produkte vorzugsweise vor dem Assay einer jeden Probe oder jeder Charge von Proben (z. B. CSF-Proben) geprüft. Vorzugsweise ist der CSF-Assay nur einem Anwender zugänglich, der Zugang hat zu der CSF-Software. Verschiedene Wege der selektiven Zugänglichkeit können beispielsweise einen Reagenz-Strichcode, einen Wizard-Key oder eine Smart-Card einschließen.
Bei den besonderen Ausführungsformen, in denen das ADVIA 120^® Instrument den halb- oder vollautomatisierten CSF-Assay durchführt, führt der automatische Analysator mehrere Zyklen in Verbindung mit der Probeanalyse, wie hier beschrieben, durch. Zur Direktzytometrieanalyse, vorzugsweise zur halbautomatisierten erfindungsgemäßen Analyse, erfolgt das Einbringen einer Körperflüssigkeitsprobe, z. B. einer Spinalflüssigkeitsprobe, zur Analyse durch das System durch Ansaugen mit einem offenen Rohr. Der Anwender taucht die Ansaugsonde in die präparierte Probe und löst das Ansaugen durch Drücken des Ansaugfeldes an der Front des Systems aus. Der CSF-Analysezyklus erfolgt in drei Schritten: Shuttle, Zählung und Reinigung.
Während der Shuttle-Phase öffnen sich die Vakuum-Shuttle-Kammer-(VSC)-Belüftungs- und Abfallventile fast gleichzeitig, um sämtliche zurückbleibenden Flüssigkeiten, die in der Shuttle-Kammer gehalten werden, auszuspülen. Anschließend schließt sich die VSC-Belüftungsöffnung, der VSC-Probeneinlass öffnet sich, und das RBC-Direkzytometrieventil öffnet sich und erlaubt dem Systemvakuum, die Probe durch die RBC-Direktzytometrie-Leitungen aufzuziehen. Die Probe passiert schnell den Unified-Fluidics-Kreislauf (UFC) in die Probenleitung des konzentrischen RBC-Strömungsmoduls (CFM) und aus der CFM-Shuttle-Öffnung zu der Shuttle-Kammer heraus zu der Shuttle-Kammer im UFC. Während die Probe hin- und herbewegt wird, wird eine exakte Menge an Probe in die Probenpumpe gezogen, wenn der Plunger nach unten gefahren wird.
Die Zählphase beginnt, wenn das RBC-Mantelstromventil und die Durchflusszellenauslassventile sich öffnen und die Probenpumpe nach oben gefahren wird, während die Mantelstrompumpe gleichzeitig nach unten gezogen wird. Der Effekt besteht darin, die Probe und den Mantelstrom mit konstanter Geschwindigkeit durch das CFM und die Durchflusszelle zu ziehen. Während des Durchgangs der Probe durch die Durchflusszelle werden die durch die Zellen in der Probe erzeugten Signale gesammelt. Am Ende der Probenzählung schließen sich das RBC-Mantelstromventil und der Durchflusszellenauslass, und das RBC-Mantelstrom-Spritzen-Abfall-Ventil öffnet sich. Die Mantelstromspritze stößt dann nach oben und schickt die ausgewertete Flüssigkeit zum Abfall. Die Reinigungsphase folgt unmittelbar, wobei Spüllösung (z. B. universelle Spülreagenzlösung, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,888,752 beschrieben) durch die Probenleitungen gepresst wird, und sie in Vorbereitung für die nächste Probe getrocknet werden.
Zusätzlich zu dem CSF-Analysezyklus wurden zwei weitere Zyklen zur Verwendung mit dem automatisierten CSF-Assay entwickelt. Der CSF-Auffrischzyklus wurde zum Lesen der Hintergrundzählung der Spülung in der Durchflusszelle konzipiert, um Systemreinheit vor dem Ansaugen der vorbereiteten Probe zu gewährleisten. Auf Anforderung des Anwenders drückt der CSF-Auffrischzyklus Spüllösung in sämtliche Reaktionskammern in dem UFC-Block, und wäscht und trocknet die Eingangswege (d. h. Ansaugsonde, Probenschärventil und zugehörige Leitungen) des Analysators. Anschließend saugt das System die Spüllösung durch die Durchflusszelle unter Anwendung der gleichen Technik, die in der Zählphase des CSF-Analysezyklus beschrieben ist, an und erfasst dadurch eine Zählung der Flüssigkeit, die gerade die Durchflusszelle passiert.
Der CSF-Waschzyklus ist zur Bereitstellung eines zusätzlichen Reinigungszyklus ausgelegt, der spezifisch die Direktzytometrieleitungen und -ventile anspricht. Beim Start öffnet das System die RBC-Mantelstromleitung und sowohl das RBC- als auch das Perox-Direktzytrometrieventil. Bei fortschreitendem Zyklus wird Spüllösung durch die CFM-Probenleitung über die Direktzytometriewege zurück in die Perox-Kammer gespült. Die Perox-Abfallventile öffnen sich, um den zurückgespülten Ablauf wirksam zum Abfall abzuziehen.
Zur vollautomatischen Analyse wird die rohe CSF-Probe direkt in die ADVIA 120^® Probensonde angesaugt, und Verdünnung mit einem gleichen Volumen Sphärisierungs-/Fixierungsreagenz erfolgen intern.
Die CSF-Probenvorbereitung für die halbautomatisierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst manuelle Verdünnung der CSF-Probe mit dem erfindungsgemäßen CSF-Reagenz. Die Zelldichte der CSF-Probe, wie durch das CSF-Probenaussehen wiedergegeben, bestimmt das Verhältnis von CSF-Probe zu CSF-Reagenz, das zu verwenden ist. Beispielsweise erscheinen Proben, die eine große Anzahl von roten Zellen enthalten, rosafarben bis rot, und Proben, die eine große Anzahl von weißen Zellen enthalten, erscheinen weißlich-opak. Solche Proben erfordern vor der 1:1-Verdünnung mit Arbeitslösung eine Vorverdünnung, im Vergleich mit einer klaren farblosen Lösung, die relativ wenige Zellen enthält, die keine Vorverdünnung erfordern. Nach einer möglichst kurzen Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die vorbereitete Probe auf dem ADVIA 120^® Analysator im CSF-Modus analysiert. Eine CSF-Probe, die zur automatisierten Analyse, z. B. über ein halbautomatisiertes Verfahren, vorbereitet wurde, ist für etwa 5 Minuten bis etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 °C stabil.
Bei einem bevorzugten Aspekt wird der ADVIA 120^® Analysator konfiguriert, um Proben in dem CSF-Assay als ein integraler Teil des Systems laufenzulassen und zu analysieren. Im Allgemeinen wird das verfügbare WinMDI-Software-Paket (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) zur Analyse der Durchflusszytometriedaten auf dem ADVIA 120^® System verwendet, so dass eine CSF-Probenanalyse durchgeführt werden kann. Die CSF-Proben werden mit der klinischen ADVIA 120^® Software im CSF-Modus bearbeitet. CSF-Proben können einzeln oder chargenweise vom Manual-Open-Tube (MOT)-Probennehmer gefahren werden. Die physikalischen Merkmale der CSF-Patientenprobe werden als codierte Kommentare in das Gerät eingegeben. Das Bayer ADVIA 120^® Instrument stellt einen neuen CSF-Run-Screen zur Analyse jeder neuen CSF-Probe bereit. CSF-Proben besitzen ihren eigenen eindeutigen Satz von Einheitswahlmöglichkeiten, d. h. Zählungen können in Einheiten von Zellen/μl oder Zellen/l aufgezeichnet werden. Der Zugriff auf die im Computer enthaltene CSF-Software kann beispielsweise durch eine Smart Card, Wizard, Strichcode oder einen Schlüssel bereitgestellt werden.
Die durch den erfindungsgemäßen CSF-Assay gemessenen Parameter sind in Tabelle 3 bereitgestellt.
TABELLE 3 Wiedergebbare Parameter
Bei dem halbautomatisierten CSF-Verfahren führt der Analysator eine WBC-Zählung, RBC-Zählung und ein vierteiliges WBC-Differential an CSF-Proben durch. Das Verfahren gestattet den Probendurchsatz für bis zu 120 Proben pro Stunde.
Das vorliegende halbautomatisierte Verfahren zur Analyse von Körperflüssigkeiten liefert zahlreiche Vorteile bei der Assay-Leistung und für den Kunden. Die Automatisierung des Assays von Körperflüssigkeiten, wie CSF, stellt Ergebnisse bereit, die wesentlich schneller erhalten werden als diejenigen, die unter Verwendung von manuellen Verfahren erhalten werden. Während beispielsweise die halbautomatisierten erfindungsgemäßen Assay-Ergebnisse mit einer Rate von etwa 60 bis 120 Proben pro Stunde bereitgestellt werden, werden die vollständig manuellen Assay-Ergebnisse mit einer Rate von 1 bis 2 Proben pro Stunde bereitgestellt.
Zusätzlich erfordert das halbautomatisierte Verfahren weniger Fertigkeit des Anwenders, als es für die manuelle Zellzählung erforderlich ist. Es besteht eine schnellere Umsatzzeit für Zellzählungen, differentiellen Prozentangaben und absoluten Zählungen, da diese Werte und Parameter automatisch berechnet werden. Der Endanwender profitiert von der geringeren Arbeit, den geringeren Materialkosten, dem verbesserten Laborwirkungsgrad und der herabgesetzten Durchsatzdauer. Zusätzlich liefert das Verfahren erhöhte Genauigkeit und Präzision von Patientenergebnissen; die Patientenergebnisse können dem Arzt schneller übermittelt werden. Die Laborzeit ist ebenfalls reduziert, z. B. um mindestens etwa 20 Minuten pro Probe.
Der erfindungsgemäße CSF-Assay, der vorzugsweise unter Verwendung eines ADVIA 120^® automatisierten Analysators durchgeführt wird, stellt sowohl klinische als auch relative Genauigkeit bereit. Die ADVIA 120^® WBC-Zählung in CSF-Proben wird mit manuellen Referenzzählungen verglichen. Normale Proben sind definiert als Proben mit ungefähr 0–5 WBC-Zellen/μl; anormale Proben sind typischerweise definiert als Probe mit ungefähr > 5 WBC-Zellen/μl. Eine Studie mit 54 normalen Proben und 26 anormalen CSF-Proben, wie bestimmt durch Referenzverfahren, zeigte, dass das ADVIA 120^® Instrument eine Empfindlichkeit von ≥ 95 % und eine Spezifität von ≥ 85 % aufweist (Beispiel 5). Es wird davon ausgegangen, dass aufgrund der sehr geringen Anzahl von Zellen, die in vielen der Proben gezählt wurden, insbesondere bei den manuellen Referenzzählungen, die Leistung des Assays nur aus statistischen Gründen als optimal betrachtet wird.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele beschreiben spezielle Aspekte der Erfindung, um die Erfindung zu erläutern und um eine Beschreibung der vorliegenden Verfahren für die Fachleute bereitzustellen. Die Beispiele sollten nicht als Einschränkung der Erfindung gedacht sein, da die Beispiele hauptsächlich spezielle Methodik bereitstellen, die zum Verständnis und für die Praxis der Erfindung und ihrer verschiedenen Aspekte dienlich ist.
Beispiel 1
Analyse von erfindungsgemäßen CSF-Proben
Die in den 11A–H gezeigten Zytogramme stellen die Ergebnisse aus der Analyse von CSF-Proben dar, die von einem Krankenhauslabor erhalten wurden. Die Proben waren weniger als zwei Stunden alt, als sie zur Analyse erhalten wurden. Die CSF-Proben wurden durch Zugabe von 0,5 ml Probe zu 0,5 ml erfindungsgemäßem CSF-Reagenz hergestellt. Das Gemisch aus Probe und Reagenzzusammensetzung wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und auf einen automatisierten ADVIA 120^® Analysator in Direktzytometrie-Modus angesaugt. Die Rohdaten-Files aus den Probenakquisitionen wurden in das Durchflusszytometrie-Standard-(FCS)-Format übergeführt und Offline unter Verwendung der WinMDI-Software analysiert. 11A zeigt die Ergebnisse der Analyse einer normalen, nahezu azellulären CSF-Probe; 11B stellt automatisierte ADVIA 120^®- und manuelle Referenz-CSF-Ergebnisse in Bezug auf 11A bereit; 11C zeigt die Ergebnisse der Analyse einer Probe mit niedrigen WBC-Zählungen; 11D stellt ADVIA 120^® automatisierte und manuelle Referenz-CSF-Ergebnisse in Bezug auf 11C dar; 11E zeigt die Ergebnisse der Analyse einer Probe, die WBC auf einem Niveau von ungefähr 20 WBC enthält; 11F stellt ADVIA 120^® automatisierte und manuelle Referenz-CSF-Ergebnisse in Bezug auf 11E bereit; 11G zeigt die Ergebnisse der Analyse einer Probe auf dem Niveau von ungefähr 100 WBC/μl; und 11H stellt ADVIA 120^® automatisierte und manuelle Referenz-CSF-Ergebnisse in Bezug auf 11G dar. Ein Vergleich von automatisierten und manuellen Werten zeigt eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Verfahren.
Beispiel 2
Genauigkeitsergebnisse
Daten, die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des automatisierten ADVIA 120^® Analysators erhalten wurden, wurden mit manuellen Referenzwerten für 80 CSF-Probenakquisitionen verglichen. Tabelle 4 nachstehend fasst die Regressionsstatistik für den Vergleich von absoluten RBC-, WBC- und WBC-Differentialwerten, die für die 80 CSF-Proben erhalten wurden, zusammen. Sämtliche CSF-Proben wurden wie folgt hergestellt: Die CSF-Proben wurden durch Zugabe von 0,5 ml Probe zu 0,5 ml erfindungsgemäßen CSF-Reagenz hergestellt; das Gemisch aus Probe und Reagenz wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und auf den ADVIA 120^® Analysator im Direktzytometrie-Modus angesaugt. Rohdaten-Files aus den Probenakquisitionen wurden in Durchflusszytometrie-Standard-(FCS)-Format umgewandelt und Offline unter Verwendung von WinMDI-Software analysiert. TABELLE 4

* RBC-Werte aufgerundet; NA: nicht verfügbar.

Syx, der „abgeschätzte Standardfehler" ist der Grad, zu dem sich die Datenpunkte um die Regressionskurve Clustern. Je näher die Punkte an der Linie liegen, desto geringer ist der abgeschätzte Standardfehler und desto besser die Übereinstimmung zwischen den beiden Verfahren, die verglichen werden.
4 stellt WBC-Ergebnisse dar, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten erhalten wurden, und zeigt die Korrelation von erfindungsgemäßen CSF-Assayergebnissen, durchgeführt auf einem ADVIA 120^® Analysator, vs. manuellen Analyseergebnissen der WBC-Zählungen für die 80 CSF-Proben. Für 4 und diejenigen, die nachstehend beschrieben sind, wurden sämtliche CSF-Proben wie vorstehend beschrieben hergestellt.
5 zeigt den Korrelationsplot der CSF-Assayergebnisse, die aus in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen Experimenten erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse der WBC-Zählungen für Proben mit WBC-Zählungen mit ≤ 5 Zellen/μl und die ± 2 SD zeigen, um die Unexaktheit von solchen niedrigen Zählungen für 52 CSF-Proben wiederzugeben.
6 zeigt den Korrelationsplot der CSF-Assayergebnisse, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen Experimenten erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse für RBC-Zählungen zwischen 0 und 1840 in 74 CSF-Proben.
7 zeigt den Korrelationsplot von CSF-Assayergebnissen, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen Experimenten erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse für die Anzahl von Neutrophilen in 78 CSF-Proben. Da die Probe bei dieser Studie nicht genug Eosinophile enthielten, um sie von Neutrophilen zu unterscheiden, stellt dieser Graph die gesamte Anzahl von polymorphonukleären (PMN) Zellen dar.
8 zeigt den Korrelationsplot von CSF-Assayergebnisse, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen Experimenten erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse für die Anzahl von Lymphozyten in 78 CSF-Proben.
9 zeigt den Korrelationsplot von CSF-Assayergebnissen, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen Ergebnissen für die erfindungsgemäßen Experimente erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse für die Anzahl von Monozyten in 78 CSF-Proben.
10 zeigt den Korrelationsplot von CSF-Assayergebnissen, die aus den in diesem Beispiel beschriebenen erfindungsgemäßen Experimenten erhalten wurden, die auf einem ADVIA 120^® Analysator durchgeführt wurden, vs. den Ergebnissen der manuellen Analyse für die Anzahl von mononukleären (MN) Zellen (Lymphozyten plus Monozyten) in 78 CSF-Proben.
Beispiel 3
Präzisionsergebnise
Dieses Beispiel stellt die Präzisionsergebnisse dar, die aus 31 CSF-Krankenhausproben erhalten wurden, die in doppelter Ausführung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, durchgeführt auf einem automatisierten ADVIA 120^® Analysator, gesammelt wurden. Die Proben wurden auf Reproduzierbarkeit unter Verwendung der folgenden Formel bewertet: [(ΣΔ2)/2n]1/2 wobei: ΣΔ die Summe der Differenzen zwischen den Probenduplikaten ist und n die Anzahl von Proben ist. Die Standardabweichung (SD) und %CV (Variationskoeffizient), (100 × (SD/Mittelwert)) wurden für die WBC-, RBC-, PMN- und MN-Zellzählungen berechnet und sind in Tabelle 5 angegeben:
TABELLE 5
Beispiel 4
Linearitätsergebnisse
Ein Linearitätspool von 0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 %, 1 %, 10 % und 100 % wurde aus einer plättchenreichen Plasmaprobe hergestellt. Diese Proben wurden 1:1 in CSF-Reagenz verdünnt und auf einem ADVIA 120^® Zytometrieanalysator im Direktzytometrie-Modus gefahren. Tabelle 6A stellt die gemessenen vs. erwarteten WBC- und RBC-Werte von fünf Replikaten dar, die aus der in diesem Beispiel beschriebenen Analyse hervorgehen. Die Ergebnisse lagen innerhalb der Linearitätspezifikationen für maximale Abweichungen, wie in Tabelle 6B gezeigt.
Tabelle 6A
Tabelle 6B
12A und 12B stellen die Regressionsanalyseergebnisse für WBC (12A) und RBC (12B) dar. Wie bestimmt, sind die experimentell erhaltenen (festgestellten) Zellanzahlen identisch mit den erwarteten Werten für weiße und rote Zellen.
Beispiel 5
Klinische Empfindlichkeit und Spezifität
Klinische Empfindlichkeit und Spezifität wurden unter Verwendung der Wahrheitstabellenanalyse für WBC-Zählungen berechnet, wobei ein Wert von > 5 WBC Zellen/μl als positiv angesehen wurde. Tabelle 7 zeigt ein Schema zur Bewertung von Proben bezüglich der Distributionsklassifizierung. Tabelle 8 zeigt die Verteilung von 80 CSF-Proben, die unter Verwendung von automatisierten und manuellen Referenzmethoden analysiert wurden. Die Gegenwart von > 5 WBC/μl klassifizierte eine Probe als anormal. Die Ergebnisse des Verfahrensvergleichs sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Statistik, die sich von der Probenverteilung ableitet, gibt eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Verfahren an. Sieben Proben wurden als falsche Positive bei diesem Vergleich klassifiziert (Tabelle 7), was folgendermaßen erklärt werden könnte: das automatisierte Verfahren zählt ein höheres Probenvolumen und mehr Zellen als das manuelle Verfahren und ist darum exakter als das manuelle Verfahren beim Nachweis von zellulären Ereignissen.
TABELLE 7
In der obigen Tabelle 7 gilt:

TP (echte Positive): = Anzahl von Proben, die in Übereinstimmung beider Verfahren anormal waren
TN (echte Negative): = Anzahl von Proben, die in Übereinstimmung beider Verfahren normal waren
FS (falsche Negative): = Anzahl von Proben, die gemäß Referenzverfahren als anormal und als normal durch das Testverfahren erachtet wurden
FP (falsche Positive): = Anzahl von Proben, die gemäß Referenzverfahren als normal und als anormal durch das Testverfahren erachtet wurden.

Wahrheitstabellenberechnungen

– Übereinstimmungsrate = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN) × 100
– Falsche Negativenrate = FN/(FN + TP) × 100 %
– Falsche Positivenrate = FP/(FP + TN) × 100 %
– Empfindlichkeit % = (100 – FN-Rate) = Rate von korrekten Entscheidungen in Proben mit Anormalität
– Spezifität % = (100 – FP-Rate) = Rate von korrekten Entscheidungen in Proben ohne Anormalität.

Tabelle 8 Wahrheitstabellenergebnisse

Tabelle 9 CSF-Analyse: ADVIA 120^® Verfahren vs. manuelles Verfahren

Übereinstimmungsrate	90 (%)
Falsche Negativenrate	4 (%)
Falsche Positivenrate	13 (%)
Empfindlichkeit	96 (%)
Spezifität	87 (%)
Positiver vorausberechneter Wert	78 (%)
Negativer vorausberechneter	98 (%)
Wert

Die obigen Prozentangaben in Tabelle 9 vorstehend zeigen, wie häufig eine Analyse, an der solche kleinen Anzahlen von Zellen beteiligt sind, zu korrekten Ergebnissen führt, d. h. zu echten positiven (TP) oder echten negativen (TN) Ergebnissen oder zu inkorrekten Ergebnissen, d. h. zu falschen positiven (FP) oder zu falschen negativen (FN) Ergebnissen, aufgrund von statistischen Probenahmefehlern führt.

Claims

Verfahren zur Fixierung und Sphärisierung von Zellen in einem Aliquot von Körperflüssigkeit, wobei die Zellen in Suspension verbleiben und ihre Volumina und ihren Inhalt für mehr als 24 h beibehalten, umfassend: Mischen eines Aliquots der Körperflüssigkeit mit einem Aliquot einer wässrigen Reagenszusammensetzung, umfassend mindestens einen Aldehyd, mindestens ein Tensid und Cyclodextrin.
Verfahren zur Analyse einer Nichtblut-Körperflüssigkeit, umfassend: a) Mischen eines Aliquots der Körperflüssigkeit mit einer Reagenszusammensetzung, umfassend, in wässriger Lösung, mindestens einen Aldehyd, mindestens ein Tensid und Cyclodextrin, um ein Reagens gemisch zu bilden; (b) Ansaugen des Reagensgemisches in einen automatischen Analysator; (c) Analysieren der Bestandteile in dem Reagensgemisch, praktisch Zelle für Zelle, durch direkte Zytometrie; und (d) Erhalten von Zählungen von Zellbestandteilen der Körperflüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aldehyd mindestens ein Aldehyd ist, der aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, und einer Kombination davon ausgewählt ist; das Tensid mindestens ein Tensid ist, das aus der Gruppe bestehend aus zwitterionischen Tensiden und nicht-ionischen Tensiden ausgewählt ist; und das Cyclodextrin mindestens ein Cyclodextrin ist, das aus der Gruppe bestehend aus α-Cyclodextrin, β-Ccyclodextrin und γ-Cyclodextrin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Aldehyd mindestens ein Aldehyd ist, der aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, und einer Kombination davon ausgewählt ist; das Tensid mindestens ein Tensid ist, das aus der Gruppe bestehend aus zwitterionischen Tensiden und nicht-ionischen Tensiden ausgewählt ist; und das Cyclodextrin mindestens ein Cyclodextrin ist, das aus der Gruppe bestehend aus α-Cyclodextrin, β-Ccyclodextrin und γ-Cyclodextrin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Körperflüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), Pleuralflüssigkeit, Lungenspülflüssigkeit, Bronchialspülflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Knochenmarksaspirationsflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Sputum, Saliva, Lymphe, Tränen, Serum, Plasma, Samen, Urin und Blasenspülung ausgewählt ist.
Reagenszusammensetzung zum Mischen mit Nichtblut-Flüssigkeitsproben, die, in wässriger Lösung, mindesten einen Aldehyd, mindestens ein Tensid und Cyclodextrin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Aldehyd mindestens ein Aldehyd ist, der aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, und einer Kombination davon ausgewählt ist; das Tensid mindestens ein Tensid ist, das aus der Gruppe bestehend aus zwitterionischen Tensiden und nichtionischen Tensiden ausgewählt ist; und das Cyclodextrin mindestens ein Cyclodextrin ist, das aus der Gruppe bestehend aus α-Cyclodextrin, β-Ccyclodextrin und γ-Cyclodextrin ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Reagenszusammensetzung außerdem ein Puffermittel umfasst, um den Reagens-pH im Bereich von etwa pH 4,0 bis pH 7,0 zu halten.
Kontrollmaterial zur Durchflusszytometrieanalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei das Material ein Gemisch aus einem Aliquot der Körperflüssigkeit und einer wässrigen Reagenszusammensetzung, umfassend mindestens einen Aldehyd, mindestens ein Tensid und Cyclodextrin, umfasst.
Kontrollmaterial nach Anspruch 9, wobei der Aldehyd mindestens ein Aldehyd ist, der aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, und einer Kombination davon ausgewählt ist; das Tensid mindestens ein Tensid ist, das aus der Gruppe bestehend aus zwitterionischen Tensiden und nicht-ionischen Tensiden ausgewählt ist; und das Cyclodextrin mindestens ein Cyclodextrin ist, das aus der Gruppe bestehend aus α-Cyclodextrin, β-Ccyclodextrin und γ-Cyclodextrin ausgewählt ist.