DE60308338T2

DE60308338T2 - Verfahren zur aufkonzentrierung von makromolekülen oder agglomeraten aus molekülen oder teilchen

Info

Publication number: DE60308338T2
Application number: DE60308338T
Authority: DE
Inventors: Jean Berthier; Laurent Davous
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2023-03-25
Also published as: ATE339522T1; EP1488004A2; EP1488004B1; DE60308338D1; WO2003080209A3; JP2005530131A; JP4391829B2; WO2003080209A2; FR2837401B1; FR2837401A1; US20050181367A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum (Auf)Konzentrieren von Makromolekülen oder Agglomeraten von Molekülen oder Teilchen, im Hinblick auf einen eventuellen Nachweis oder eine spezifische Extraktion der genannten Makromoleküle oder der genannten Agglomerate.
Stand der Technik
Derzeit sind die Verfahren zum (Auf)Konzentrieren von Makromolekülen oder von Agglomeraten von Molekülen größtenteils bestimmt für das Gebiet der medizinischen Diagnostik, insbesondere für das Gebiet des Nachweises von DNA-Strängen oder Protein-Komplexen, wie z.B. Antigenen oder Prionen.
Für den Nachweis von DNA-Strängen besteht die derzeitige Technik meistens darin, DNA-Stränge aufzukonzentrieren durch Verstärkung (Amplifikation) in einem flüssigen Medium nach dem allgemein unter der Abkürzung PCR ("Polymerase-Ketten-Reaktion") bekannten Verfahren.
Dieses Verfahren besteht darin, die in einer flüssigen Probe enthaltenen DNA-Stränge auf ein sehr hohes Vielfaches zu vervielfältigen (bis zum 10⁵–10⁶-fachen) durch Injizieren von Polymerase in die Probe, die einer Serie von thermischen Zyklen unterworfen wird.
Nach einer ausreichend großen Anzahl von thermischen Zyklen, die in jedem Fall über 10 liegt, ist die Aufkonzentrierung der DNA ausreichend hoch, um ihren Nachweis zu erlauben.
Dieses Verfahren, wie es vorstehend erläutert worden ist, erfordert jedoch eine beträchtliche Zeitdauer aufgrund der Anzahl der thermischen Zyklen, die wiederholt werden müssen, um eine ausreichende DNA-Menge zu erhalten. Darüber hin aus ist dieses Verfahren von einem starken Hintergrund-Rauschen begleitet, weil die Polymerase auch DNA-Segmente, die in der flüssigen Probe vorhanden sind, verstärken kann, die hinsichtlich ihrer Natur von den nachzuweisenden DNA-Segmenten verschieden sind.
Um diese Nachteile zu überwinden, wurden alternative Verfahren zu der PCR entwickelt. Unter diesen Verfahren ist ein Verfahren zu nennen, das keine Verstärkung (Amplifikation) erfordert. Das Prinzip dieses Nachweisverfahrens ohne Verstärkung (Amplifikation) beruht darauf, dass Target-DNA-Segmente eingefangen werden, so wenig zahlreich sie auch sein mögen. Es besteht darin, die Target-DNA-Segmente mit paramagnetischen Nanokügelchen zu hybridiseren, die so funktionalisiert worden sind, dass sie die genannten Segmente an der Oberfläche dieser Kügelchen vor dem Nachweis aufkonzentrieren. Bei diesem Verfahren tritt jedoch das Problem einer nicht-spezifischen Adsorption bestimmter paramagnetischer Kügelchen, die mit einem Latex umhüllt sind, auf, die an den festen Wänden des Reaktors in dem Bereich haften, in dem das Verfahren durchgeführt wird, unter dem Einfluss einer Hydrophobie oder von elektrischen Kräften. Die erzielte Empfindlichkeit ist dann nicht mehr so hoch wie erhofft.
Das Dokument US-A-6 020 131 (K. Ijiro, M. Shimomura) betrifft verschiedene Verfahren zur Identifizierung einer Target-Nucleinsäure, die in einer flüssigen Probe vorhanden ist, die auf der Bildung einer Monoschicht eines Pigments basieren können, das zwischen die Basen einer Nucleinsäure an der Wasser-Luft-Grenzfläche der flüssigen Probe eingebaut werden kann. Die in der flüssigen Probe enthaltene Target-Nucleinsäure verbindet sich dann mit dem Pigment unter Bildung der Monoschicht und auf diese Weise wird der Oberflächendruck dieser Monoschicht modifiziert. Die Messung der Druckschwankungen spiegelt die Anwesenheit der Target-Nucleinsäure wieder.
Was den Nachweis von Proteinen, wie z.B. Antikörpern oder Antigenen, angeht, so unterscheidet man zwei Test-Typen voneinander: die so genannten Tests "in homogener Phase" und die Tests in "heterogener Phase". Die Tests in homogener Phase werden in Lösung durchgeführt. Die Messung der Antikörper-Menge erfolgt direkt in der Lösung durch Fixieren dieses Antikörpers an dem komplementären Antigen, ohne dass eine physikalische Trennung zwischen den freien Antikörpern und den an ein Antigen gebundenen Antikörpern stattfindet. Diese Unterscheidung zwischen einem freien Antikörper und einem gebundenen Antikörper wird gemacht aufgrund von verschiedenen Kunstgriffen, die insbesondere basieren beispielsweise auf einer Fluoreszenz-Übertragung zwischen zwei Antikörpern (das Antigen wird sandwichartig eingeschlossen beispielsweise zwischen zwei markierten Antikörpern). Diese Tests bieten den Vorteil, dass sie sehr schnell und wenig kostspielig sind. Sie werden daher in sehr großem Umfange in Selektionier-Programmen mit hohem Durchsatz, beispielsweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Ihre Empfindlichkeit ist jedoch begrenzt auf Werte in der Nähe von etwa 1 nM, was die Tests angeht, die auf Nucleinsäuren basieren.
Deshalb werden in der Diagnostik-Industrie vorzugsweise Tests in heterogener Phase angewendet, bei denen ein Antikörper an einem festen Träger immobilisiert wird, wobei es dann möglich ist, den Träger zu waschen, um die Gesamtmenge der Markierungsreagentien zu eliminieren. Darüber hinaus wird eine Verstärkung (Amplifikation) des Signals durchgeführt durch Verwendung eines Enzyms als Markierungsmolekül (Marker-Molekül). Diese Tests an einem festen Träger sind langsamer und umständlicher als diejenigen in homogener Phase, sie erlauben jedoch die Erzielung von Empfindlichkeiten, die viel höher sind und bei etwa 0,1 pM liegen, d.h. 10 000 mal höher sind als die Tests in homogener Phase. Die Verwendung eines festen Trägers macht diese Tests jedoch schwierig in der Durchführung.
Was die Protein-Komplexe, wie z.B. die Prionen, angeht, so müssen diese ebenfalls, um nachweisbar zu sein, in physiologischen Flüssigkeiten, z.B. in Blut, einer Aufkonzentrierungsphase unterworfen werden. Für diese Moleküle ist die PCR-Technik, wie sie weiter oben beschrieben ist, nicht anwendbar, weil diese keine Nucleotide enthalten. Daher haben Untersuchungen in Bezug auf das Gebiet der Prionen vor kurzem dazu geführt, ein so genanntes "Verfahren zum Amplifizieren (Verstärken) von anormal gefalteten Proteinen" (abgekürzt als PMCA), für "Protein Misfolding Cyclic Amplification" bezeichnet) zu verwenden.
Die Prionen, die insbesondere für spongiforme Encephalopathien verantwortlich sind, stellen Komplexe oder Agglomerate dar, die bestehen aus einem natürlichen Protein, dem Glycoprotein PrP^c, das normalerweise an der Oberfläche zahlreicher Zellen im Organismus vorhanden ist, und einem infektiösen Protein PrP^sc, das sich von dem normalen Glycoprotein PrP^c nur durch seine Konformation unterscheidet, die anormal gefaltet ist. Die Proteine PrP^sc sind einerseits in der Lage, sich mit den Proteinen PrP^c zu assoziieren, und andererseits sind sie in der Lage, die Transformation von normalen Proteinen in infektiöse Proteine einzuleiten. Der Nachweis der Prionen wird erschwert durch den Umstand, dass sie nur in dem Gehirn in nachweisbarer Menge vorhanden sind, während sie im Blut nur in Spurenmengen zu finden sind.
Die PMCA-Methode erlaubt somit das (Auf)Konzentrieren der Prionen in dem Entnahme-Medium, d.h. in dem Blut, sodass sie nachgewiesen werden können.
Um dies zu erreichen, wird eine Ultraschallbehandlung angewendet, die dazu dient, die Prionen zu fragmentieren (zu zerkleinern). Alle Prionen, die aus dieser Fragmentierung durch Ultraschall resultieren, wachsen wieder in vitro mit Hilfe der Proteine PrP^c der Probe. Dieser elementare Zyklus (Fragmentierung-erneutes Wachsen) wird so oft wie erforderlich wiederholt, bis die Menge der Prionen nachweisbar wird.
Die Stufe des Nachweises, erleichtert durch die Verstärkungsstufe, wird durchgeführt durch Fluoreszenz-Spektroskopie. Die nachzuweisenden Proteine werden mit Hilfe einer fluoreszierenden Sonde markiert, deren Anwesenheit sich zeigt, wenn sie durch eine Lichtquelle mit einer charakteristischen Wellenlänge beleuchtet wird. Dieses Verfahren bringt jedoch meistens ein nicht vernachlässigbares Hintergrundrauschen mit sich aufgrund des Umstandes, dass die Sonden sich auch mit anderen Molekülen als den nachzuweisenden Prionen assoziieren können.
Bei einem weiterentwickelten Verfahren, als Fluoreszenz-Korrelations-Verfahren bezeichnet, verwendet man zwei fluoreszierende Sonden, die Licht mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, und die sich beide symmetrisch und spezifisch mit den Proteinen PrP^c verbinden, wobei die letzteren im Innern der Prionen in einer hohen Konzentration vorliegen. Man belichtet anschließend mit Lichtbündeln mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen ein sehr kleines Volumen der Flüssigkeit, welche die nachzuweisenden Prionen enthält, und weist auf interstationäre Weise die beiden starken Fluoreszenzemissionen nach, die ein Agglomerat von normalen oder infektiösen Proteinen PrP darstellen, an denen die fluoreszierenden Sonden verankert sind. Es bleibt jedoch ein Hintergrundrauschen bestehen, das insbesonde re auf die Anwesenheit von fluoreszierenden Sonden, die keine spezifische Adsorptionsstelle gefunden haben, und auf die Anwesenheit von isolierten normalen Proteinen PrP^c zurückzuführen ist, an die fluoreszierende Sonden gebunden sind.
Die vorstehend erläuterten (Auf)Konzentrierungsverfahren weisen somit alle einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:

– sie erlauben keine spezifische (Auf)Konzentrierung der Makromoleküle oder Agglomerate, die konzentriert werden sollen, weil bestimmte dieser Verfahren Species erzeugen können, die insbesondere bei einem eventuellen Nachweis ein beträchtliches Hintergrundrauschen mit sich bringen;
– sie erlauben keine ausreichende (Auf)Konzentrierung der Makromoleküle oder Agglomerate im Hinblick auf einen eventuellen Nachweis.

Beschreibung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, ein Verfahren zur (Auf)-Konzentrierung von Makromolekülen oder Agglomeraten von Molekülen oder Teilchen vorzuschlagen, das insbesondere eine selektive (Auf)Konzentrierung der genannten Makromoleküle oder der genannten Agglomerate für einen eventuellen Nachweis derselben erlaubt, bei dem das Hintergrundrauschen so weit wie möglich begrenzt ist oder die Durchführung einer eventuellen Reinigung einer Probe, erlaubt, welche die genannten Makromoleküle oder Agglomerate enthält.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß erreicht mit einem einen Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren zur selektiven (Auf)Konzentrierung eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

– Herstellung einer stabilisierten Dispersion vom Schaum- oder Emulsions-Typ ausgehend von einem Medium, das die genannte flüssige Probe und eine Grenzflächenschicht enthält, die in der Lage ist, das genannte Makromolekül oder das genannte Agglomerat, das aufkonzentriert werden soll, selektiv zu fixieren, und
– Resorption der in der vorhergehenden Stufe gebildeten Dispersion zur erneuten Bildung der genannten Grenzflächenschicht.

Unter einer Grenzflächenschicht versteht man erfindungsgemäß eine Monoschicht (oder eine quasi bidimensionale Zone), die an der Oberfläche der flüssigen Probe angeordnet ist (der so genannten ersten flüssigen Phase), die das Makromo lekül oder Agglomerat, das aufkonzentriert werden soll, enthält. Aufgrund seiner spezifischen Natur und seiner spezifischen Eigenschaften ist diese Schicht in der Lage, die selektive Übertragung des Makromoleküls oder des Agglomerats der flüssigen Probe auf die Grenzflächenschicht zu gewährleisten und damit das genannte Makromolekül oder das genannte Agglomerat mit seinem sehr kleinen Volumen, verglichen mit dem der flüssigen Probe, aufzukonzentrieren.
Je nach Art des Makromoleküls oder Agglomerats, das aufkonzentriert werden soll, kann die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase entsprechen, die auf der Oberfläche der flüssigen Probe abgeschieden worden ist (dies ist beispielsweise der Fall, wenn es sich darum handelt, ein Makromolekül vom DNA-Typ aufzukonzentrieren), wobei diese Phase solche Eigenschaften aufweist, dass sie die Anziehung des Makromoleküls oder Agglomerats in die Phase erlaubt. Die Grenzflächenschicht kann auch der Grenzfläche zwischen der umgebenden Atmosphäre und der flüssigen Probe entsprechen (beispielsweise dann, wenn das Makromolekül oder Agglomerat, das aufkonzentriert werden soll, einen hydrophoben Charakter hat, wie z.B. die Prionen, und die es enthaltende flüssige Probe ein wässriges Medium ist).
Für den Fall, dass die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase entspricht, kann das erfindungsgemäße Verfahren eine Vorstufe umfassen (die vor der Stufe der Bildung der Dispersion angeordnet ist), die darin besteht, auf der Oberfläche der flüssigen Probe die genannte zweite flüssige Phase oder Grenzflächenschicht abzuscheiden.
Im Allgemeinen wird die Stufe der Bildung der Dispersion durchgeführt durch mechanisches Rühren des Mediums, das die flüssige Probe und die Grenzflächenschicht enthält, oder durch direktes Einspritzen von Gas- oder Flüssigkeits-Kapillarstrahlen in die flüssige Probe oberhalb der Grenzflächenschicht.
Es sei darauf hingewiesen, dass ein Schaum eine Dispersion darstellt, die eine Vielzahl von Gasblasen (in der Regel Luftblasen) enthält, die zusammen mit einem interstitiellen flüssigen Medium in Form von dünnen interstitiellen Filmen zwischen den Blasen vorliegen. Dieser Dispersions-Typ enthält somit eine Vielzahl von Flüssig-Gas-Grenzflächen. Der erfindungsgemäße Schaum kann beispielsweise erhalten werden durch starkes mechanisches Rühren des oben genannten Mediums oder durch Injektion von Gaskapillarstrahlen (in der Regel Luftstrahlen) in das Innere dieses Mediums.
Es sei darauf hingewiesen, dass erfindungsgemäß eine Emulsion eine Dispersion darstellt, in der die Grenzflächenschicht im Innern der flüssigen Probe in Kügelchen unterteilt ist, wobei die genannte flüssige Probe ein interstitielles Medium darstellt. Man bildet auf diese Weise eine Vielzahl von Flüssig-Flüssig-Grenzflächen aus und vergrößert dadurch beträchtlich die Kontaktoberfläche zwischen der flüssigen Probe und der Grenzflächenschicht.
Die Emulsion mit dem gleichen Titer wie der Schaum kann erhalten werden durch mechanisches Rühren des Mediums, das die flüssige Probe und die Grenzflächenschicht enthält, aber auch durch direkte Injektion von Flüssigkeits- oder Gas-Kapillarstrahlen in die flüssige Probe unterhalb der Grenzflächenschicht.
Erfindungsgemäß trägt somit das Durchlaufen einer Dispersion vom Schaum oder Emulsions-Typ, um die (Auf)Konzentrierung eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen zu gewährleisten, zur Behandlung einer Vielzahl von interstitiellen Zonen zwischen der flüssigen Probe und der Grenzflächenschicht bei, wodurch die Oberflächengröße zwischen diesen beiden Medien beträchtlich vergrößert und dadurch die Fixierung der Makromoleküle oder der Agglomerate von Molekülen durch die dispergierte Grenzflächenschicht beträchtlich verbessert wird. Diese Fixierung läuft ab in quasi bidimensionalen Zonen, weil sie im Bereich der interstitiellen Zonen stattfindet, wodurch die Wirksamkeit und die Einfangzeit für die aufzukonzentrierenden Makromoleküle durch die Grenzflächenschicht stark erhöht werden.
Wenn die Struktur der funktionalisierten Grenzflächenschicht potentiell instabil ist unter dem Einfluss der Bildung der Grenzflächen-Oberfläche, kann man die Instabilität nach Rayleigh dazu benutzen, eine Emulsion herzustellen unter quasi statischen Bedingungen, wobei die Flüssigkeit mit der höchsten Dichte oberhalb der Flüssigkeit mit der geringsten Dichte unter den Anfangsbedingungen zu finden ist.
Nach der Resorption der Dispersion befindet man sich so wieder in Gegenwart einer Grenzflächenschicht, die sich wieder gebildet hat und konzentriert ist an Makromolekülen oder Agglomeraten von Molekülen, und einer flüssigen Phase, die der flüssigen Probe entspricht, die vollständig oder teilweise frei von den genannten Makromolekülen oder Agglomeraten ist.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, dass man die Makromoleküle oder Agglomerate schnell und ohne Amplifikation (Verstärkung) (auf)konzentrieren kann und dies auf selektive Weise, indem man die Bildung einer Dispersion durchläuft, welche die Wirksamkeit der (Auf)Konzentrierung erhöht.
Wie weiter oben beschrieben, wird nach dem Einfangen der Makromoleküle oder Agglomerate von Molekülen oder Teilchen, die (auf konzentriert werden sollen, die Dispersion einer Resorptionsstufe unterworfen. Diese Stufe kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann diese Stufe zur Resorption der Dispersion durchgeführt werden durch Drainage der interstitiellen Filme im Falle eines Schaums oder des interstitiellen Mediums im Falle einer Emulsion. Die Kinetik der Resorption kann gegebenenfalls durch eine sorgfältige Auswahl der die Grenzflächenschicht aufbauenden Moleküle der Makromoleküle oder Agglomerate in Bezug auf die Kettenlänge der Moleküle beispielsweise mit Hilfe einer mechanischen Scherung der Dispersion durchgeführt werden.
Je nach Art der Grenzflächenschicht und des Makromoleküls oder Agglomerats, das (auf)konzentriert werden soll, und insbesondere dann, wenn die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase entspricht, kann die Grenzflächenschicht mindestens ein Molekül umfassen, das in der Lage ist, die Makromoleküle oder Agglomerate von Molekülen oder Teilchen, die in Frage kommen, selektiv zu fixieren.
Bei dieser Ausführungsform ist das Molekül, das in der Lage ist, das Makromolekül oder Agglomerat von Molekülen oder Teilchen, das (auf)konzentriert werden soll, von Anfang an in der Grenzflächenschicht vor der Bildung des Schaums oder der Emulsion enthalten; es kann ein Molekül sein, das Gruppen trägt, die geeignet sind, das Makromolekül oder das genannte Aggregat durch chemische Affinität, durch elektrische oder magnetische Polarisation und/oder durch Ionisation zu fixieren, wobei das genannte Molekül vorzugsweise ein Tensid-Molekül sein kann.
Wenn das genannte Molekül kein Gemisch mit anderen (weiteren) Tensidmolekülen darstellt, kann das genannte Molekül wegen der Tensideigenschaften auch ein Molekül zur Stabilisierung der Dispersion sein, die sich im Verlaufe einer der Verfahrensstufen gebildet hat.
In diesem Fall übt das Molekül eine doppelte Funktion aus, die darin besteht, das Makromolekül oder Agglomerat, das (auf)konzentriert werden soll, zu fixieren, sowie darin, die Stabilisierung der Dispersion zu gewährleisten, um auf diese Weise zu einer Verlängerung der Kontaktzeit im Bereich der interstitiellen Zone zwischen den anziehenden Molekülen und den Makromolekülen oder Agglomeraten, die (auf)konzentriert werden sollen, zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewendet werden auf das (Auf)Konzentrieren von Makromolekülen oder Agglomeraten jeden beliebigen Typs.
Als Beispiele für Makromoleküle, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (auf)konzentriert werden können, können genannt werden die Nucleinsäuren, die Proteine, wie z.B. die Antikörper oder die Antigene. Als Beispiele für Agglomerate von Molekülen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (auf)konzentriert werden können, können die Prionen genannt werden. Als Beispiele für Agglomerate von Teilchen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (auf)konzentriert werden können, können kolloidale Teilchen, wie z.B. Gold-Teilchen, genannt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit für die (Auf)Konzentrierung einer speziellen Nucleinsäure, bei der es sich um die DNA handelt, verwendet werden.
Im Falle der DNA entspricht die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase, die ein Molekül umfasst, das die DNA fixieren kann, bei dem es sich beispielsweise handelt um ein Molekül, das durch eine Sonde funktionalisiert ist (wie z.B. eine DNA, die komplementär ist zu der DNA, die aufkonzentriert werden soll), um so die spezifische Hybridisierung der aufzukonzentrierenden DNA beispielsweise mit einem Lipid, das durch eine DNA funktionalisiert ist, die zu der aufzukonzentrierenden DNA komplementär ist, zu ermöglichen.
Der Umstand, dass das Molekül ein Lipid sein kann, ist besonders vorteilhaft im Rahmen der vorliegenden Erfindung, da diese Kategorie von Molekülen dazu beiträgt, die Stabilisierung der gebildeten Dispersion zu gewährleisten. Darüber hinaus erlaubt die Funktionalisierung dieses Moleküls durch eine DNA, die komplementär zu der aufzukonzentrierenden DNA ist, eine (Auf)Konzentrierung und eine selektive Extraktion der genannten DNA.
Als Beispiele für funktionalisierte Lipide, die wirksam sind bei der (Auf)Konzentrierung von DNA, können genannt werden, biotinylierte Lipide, die eine Avi dingruppe aufweisen, oder ein Avidin-Derivat, auf das die komplementäre DNA durch ein vorher biotinyliertes Ende aufgepfropft worden ist, das der komplementären DNA einverleibt worden ist, oder kationische Lipide, die mindestens eine Spermin-Gruppe aufweisen, an der die komplementäre DNA adsorbiert ist. Derartige kationische Lipide können Lipide vom DOGS-Typ oder Dioctadecylamidoglycylspermin-Typ sein, die unter dem Warenzeichen Transfectam^TM im Handel erhältlich sind. Diese Lipide weisen zwei gesättigte C₁₈-Kohlenstoffketten sowie einen polaren Kopf auf, der aus einer Spermin-Gruppe besteht, die eine starke Affinität gegenüber DNA aufweist. Die komplementäre DNA wird dabei an den Spermin-Stellen adsorbiert. Die resultierenden Lipide stellen gute funktionalisierte Sonden dar, welche die spezifische Hybridisierung der aufzukonzentrierenden DNA, als "Ziel-DNA" bezeichnet, erlauben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewendet werden zum selektiven (Auf)Konzentrieren von Antigenen oder Antikörpern, die in einer flüssigen Probe enthalten sind, ohne einen festen Träger zu passieren, wie dies im Falle der Herstellung des Standes der Technik ist. Bei dieser Ausführungsform entspricht die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase, die auf der Oberfläche der flüssigen Probe abgeschieden worden ist und Vesicula oder Liposome enthält, die aus Phospholipiden aufgebaut sind und einen Antikörper oder ein Antigen, der (das) komplementär zu dem Antigen oder dem Antikörper, der aufkonzentriert werden soll, enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem für die (Auf)Konzentrierung von Agglomeraten von Molekülen, wie z.B. Prionen, angewendet werden. Im Falle von Prionen entspricht die Grenzflächenschicht der Grenzfläche (flüssige Probe/Umgebungsatmosphäre), wobei die Grenzflächenschicht geeignet ist für die selektive (Auf)Konzentrierung von Prionen aufgrund des hydrophoben Charakters der Prionen (wobei die flüssige Probe ein wässriges Medium, wie z.B. Blut, ist).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem für die (Auf)Konzentrierung von kolloidalen Teilchen verwendet werden. Diese können beispielsweise sein Gold-Teilchen im Submikron-Bereich, die in Wasser solubilisiert sind (nach der Terminologie der Erfindung der flüssigen ersten Phase entsprechend). In diesem Fall entspricht die Grenzflächenschicht einer zweiten flüssigen Phase, die Moleküle umfasst, die geeignet sind, diese kolloidalen Gold-Teilchen zu fixieren, wobei die genannten Moleküle beispielsweise Moleküle darstellen, die Thiolgruppen -SH tragen.
Das erfindungsgemäße (Auf)Konzentrierungsverfahren, das vorstehend beschrieben worden ist, dient, wie sein Name sagt, dazu, in einer Grenzflächenschicht ein Makromolekül oder ein gegebenes Aggregat von Makromolekülen aufzukonzentrieren. Es kann angewendet werden, um das Makromolekül oder ein gegebenes Agglomerat von Molekülen oder Teilchen zu reinigen, nachzuweisen oder zu verstärken (amplifizieren).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher außerdem ein Verfahren zur Reinigung eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das ursprünglich in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren umfasst das (Auf)Konzentrieren des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats innerhalb der genannten Grenzflächenschicht durch Anwendung des erfindungsgemäßen (Auf)Konzentrierungsverfahrens, wie es vorstehend beschrieben worden ist, an das sich eine Eliminierung der flüssigen Probe anschließt, die an dem genannten Makromolekül oder dem genannten Agglomerat verarmt ist, nach der Stufe der Aufkonzentrierung.
Beispielsweise kann dieses Verfahren angewendet werden im Falle der Reinigung der DNA. In diesem Fall besteht das erfindungsgemäße Verfahren darin, ausgehend von Molekülen, die durch eine spezifische komplementäre DNA funktionalisiert worden sind, eine Target-DNA spezifisch zu extrahieren aus einer flüssigen Probe, die beispielsweise eine Mischung von verschiedenen DNA oder verschiedenen DNA-Abschnitten umfasst, wobei die genannte Probe anschließend eliminiert wird.
Dieses Verfahren kann auch angewendet werden für die Reinigung von Proteinen. Das selektive Einfangen von Proteinen mittels der funktionalisierten Lipid-Schicht, gefolgt von einer späteren Kristallisationsstufe der genannten Proteine, kann es ermöglichen, diese Proteine zu isolieren, um ihre Struktur zu untersuchen oder auch um eine Lösung des fraglichen Proteins zu reinigen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, die anfänglich in einer flüssigen Probe enthalten sind, wobei das Verfahren umfasst das Aufkonzentrieren im Innern einer Grenzflächenschicht des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats durch Anwendung des vorstehend beschriebenen (Auf)Konzentrierungsverfahrens, an das sich der Nachweis des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern der genannten Schicht unter Anwendung geeigneter Nachweisverfahren anschließt.
Wenn das Makromolekül die DNA ist, kann der Nachweis der DNA nach dem selektiven (Auf)Konzentrieren erfolgen mittels einer durch einen Laser angeregten Fluoreszenz oder durch Nachweis der elektrischen Potentialschwankung der Oberfläche im Bereich der funktionalisierten Schicht oder auch durch ein Grenzflächen-Rhoelogieverfahren. Das Leistungsvermögen des Nachweises durch Fluoreszenz oder auf elektrischem Wege kann insbesondere verbessert werden, indem man durch Anwendung eines mechanischen oder hydrodynamischen Verfahrens die Grenzflächenschicht, welche die hybridisierten Target-DNA enthält, an einem Punkt der Grenzfläche (beispielsweise im Zentrum) konzentriert, der mit dem Anregungslaser-Volumen oder auch mit der Anwesenheit einer elektrischen Sonde zusammenfällt.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich noch ein Verfahren zur Verstärkung eines Makromoleküls oder auch eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, die anfänglich in einer flüssigen Probe enthalten sind, wobei das Verfahren umfasst die (Auf)Konzentrierung des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern einer Grenzflächenschicht durch Anwendung des vorstehend beschriebenen (Auf)Konzentrierungsverfahrens, wobei man die genannte flüssige Probe nach der Stufe der Aufkonzentrierung des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern der genannten Schicht ersetzt durch eine Flüssigkeit, die Verstärkungsmittel (Amplifikationsmittel) enthält, woran sich die Stufe der Verstärkung (Amplifikation) mittels der genannten Agentien anschließt.
Auf diese Weise kann dann, wenn das Verstärkungsverfahren auf DNA angewendet wird, nach dem Aufkonzentrieren der Target-DNA-Segmente in der Grenzflächenschicht die flüssige Probe, die an diesen Segmenten verarmt ist, abgezogen und ersetzt werden durch eine gereinigte Flüssigkeit, die Verstärkungsmittel (Amplifikationsmittel), wie z.B. Polymerase und Desoxyribonucleotide, enthält. Die Verstärkungsphase durch PCR kann dann in Anwesenheit von parasitären DNA-Segmenten durchgeführt werden und das Hintergrundrauschen der PCR ist dabei beträchtlich vermindert.
Wenn beispielsweise das Verstärkungsverfahren auf Agglomerate von Molekülen, wie z.B. Prionen, angewendet wird, kann nach dem Aufkonzentrieren der Prionen in einer gegebenen Grenzflächenschicht nach dem vorstehend beschriebenen Aufkonzentrierungsverfahren die flüssige Probe, die an den genannten Prionen verarmt ist, abgezogen und durch eine reine Flüssigkeit ersetzt werden, die Verstärkungsmittel, wie z.B. normale PrP^c-Proteine, die noch nicht transformiert worden sind, enthält. Anschließend können die klassischen Stufen der PMCA (Ultraschallbehandlung...) angewendet werden, ohne durch parasitäre Moleküle gestört zu werden.
An dieses Verstärkungsverfahren kann sich ein ultraempfindlicher Nachweis anschließen, der beispielsweise in Korrelation zu der Fluoreszenz gemeinsam mit der PMCA oder ohne diese durchgeführt wird. Durch diese Methode kann man das Leistungsvermögen des Nachweises verbessern, wobei man mit Hilfe eines mechanischen oder hydrodynamischen Verfahrens die lokal vorliegenden Prionen an einem Punkt der Grenzflächenschicht konzentriert, der mit dem Volumen der Lasermessung oder auch mit der Anwesenheit einer elektrischen Sonde zusammenfällt.
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung von speziellen Ausführungsformen hervor, die unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen nachstehend beschrieben werden. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die verschiedenen Stufen, um zu einer (Auf)Konzentrierung einer Target-DNA nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aufkonzentrierungsverfahrens zu gelangen.
2 zeigt eine detaillierte Ansicht eines interstitiellen Films, der bei der Bildung eines Schaums gebildet wurde.
3, 4 und 5 repräsentieren Reinigungs-, Nachweis- und Aufkonzentrierungsverfahren, die nach dem in der 1 im Detail dargestellten Aufkonzentrierungsverfahren durchgeführt werden.
Beschreibung einer speziellen Ausführungsform der Erfindung
Die 1 zeigt zur Erläuterung der Erfindung, und ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum (Auf)Konzentrieren einer Target-DNA in vier Stufen (a), (b), (c) und (d).
Die Stufe (a) der 1 zeigt einen Mikrobecherglas 10, in dem mittels einer Mikropipette oder einer Spritze eine flüssige Probe 12, welche die Ziel-DNA 14 enthält, die in der 1 in Form von Strängen dargestellt ist, abgeschieden ist. Oberhalb der Probe 12 befindet sich die umgebende Atmosphäre 11.
Im Verlaufe der in der 1 mit (b) bezeichneten Stufe wird eine Monoschicht 16, die eine Mischung von Liganden-Lipiden 18 und Verdünnungsmittel-Lipiden 17 (das Verhältnis zwischen den Liganden-Lipiden und den Verdünnungsmittel-Lipiden beträgt 1 : 4) umfasst, auf der Oberfläche der flüssigen Probe 12 abgeschieden. Diese Monoschicht 16 entspricht nach der Terminologie der Erfindung einer Grenzflächenschicht. Diese Liganden-Lipide 18 sind der Art, dass die Target-DNA sich mit den genannten Lipiden hybridisieren können. Damit dies geschehen kann, müssen diese Lipide im Verlaufe einer Vorstufe funktionalisiert werden. Die Liganden-Lipide können somit anfänglich biotinylierte Lipide vom Biotin-(LC)-DPPE-Typ sein, an denen in einer ersten Stufe Avidin absorbiert wird und dann in einer zweiten Stufe eine zu der Target-DNA komplementäre DNA aufgepfropft wird auf das Avidin mittels einer Biotin-Gruppe, die an einem der Enden der komplementären DNA fixiert ist. Das Ganze (biotinylierte Lipid-Avidin-biotinylierte komplementäre DNA) stellt ein Lipid dar, das durch eine Sonde funktionalisiert ist, die eine spezifische Hybridisierung der Target-DNA-Stränge erlaubt.
Die Lipide können auch kationische Lipide sein, die mindestens ein Spermin-Ende umfassen, an dem eine DNA absorbiert ist, die zu der aufzukonzentrierenden Target-DNA komplementär ist.
Selbstverständlich können die Moleküle, die die Target-DNA fixieren können, beliebige Moleküle sein, die in der Lage sind, die Target-DNA selektiv zu fixieren. Erfindungsgemäß und wie in der Stufe (c) der 1 erläutert, wird eine Dispersion vom Schaum-Typ hergestellt durch Einleiten von Luft in die flüssige Probe, wobei der genannte Schaum aus einer Ansammlung von Blasen besteht, die durch interstitielle flüssige Film zusammengehalten werden. Die temporäre Stabilität des Schaums wird durch die Lipide, welche die Phase aufbauen, in Form der Monoschicht 16 gewährleistet.
Eine detaillierte Ansicht eines interstitiellen flüssigen Films, der die Dispersion vom Schaum-Typ aufbaut, ist in der 2 dargestellt. In dieser Figur weist der Film eine octaedrische Form 22 mit einem sehr kleinen Volumen auf, in dessen Innern gleichzeitig die flüssige Probe 12 und die Monoschicht 16 oder eine Grenzflächenschicht vorhanden sind. Deshalb steht die Target-DNA 14 praktisch in direktem Kontakt mit den funktionalisierten Lipiden 18 der Monoschicht oder der Grenzflächenschicht und sie wird daher sehr schnell durch diese Lipde 18 adsorbiert. Dadurch, dass sie einen Schaum passieren muss, werden die Wirksamkeit und die Kinetik des Einfangens der DNA durch die Lipide vervielfacht aufgrund des sehr geringen Volumens der interstitiellen Film, die den Schaum aufbauen.
Schließlich wird im Verlaufe einer Schlussstufe, in der 1 als Stufe (d) bezeichnet, der Schaum resorbiert, wobei wiederum Platz entsteht für ein nichtdispergiertes biphasisches Medium, das die Lipid-Monoschicht 24 mit einer sehr geringen Dicke umfasst, in deren Bereich die Target-DNA an den hybridisierten Lipiden 19 adsorbiert sind, wobei diese Monoschicht einer Bezugs-Grenzflächenschicht 24 in der Zeichnung entspricht, und eine Phase 26 der flüssigen Probe 12, die an der Target-DNA verarmt ist, entspricht. Selbstverständlich brauchen in der 1 die Lipide 17, 18 und 19 nicht nur im Bereich der Monoschicht 16 oder der Grenzflächenschicht 24 (für die 1d) mit einer sehr geringen Dicke lokalisiert zu sein. Aus Gründen der besseren Sichtbarkeit sind die genannten Lipide jedoch stark vergrößert dargestellt.
Die 3, 4 und 5 erläutern unterschiedliche Anwendungen, die für das erfindungsgemäße (Auf)Konzentrierungsverfahren denkbar sind, bei denen eine spezielle Ausführungsform, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, angewendet wird.
So erläutert die 3 den Fall, bei dem nach dem (Auf)Konzentrieren der genannten Target-DNA nach dem in der 1 erläuterten Verfahren die genannten DNA durch Fluoreszenz-Methoden nachgewiesen werden. In diesem Fall umfassen die Lipide 19, die durch eine DNA funktionalisiert sind, die komplementär zu der Target-DNA ist, und die hybridisiert worden sind, außerdem einen fluoreszierenden Marker. So kann man die Anwesenheit der Target-DNA im Bereich der Grenzflächenschicht 24 durch eine Fluoreszenz-Messung bestimmen.
Die 4 erläutert einen speziellen Fall der Reinigung einer vorher (auf)konzentrierten DNA unter Anwendung des (Auf)Konzentrierungsverfahrens, wie es in der 1 detailliert dargestellt ist. Wenn einmal die Resorption des Schaums stattgefunden hat, wird die Phase 26, die an DNA verarmt ist, wobei die genannte DNA größtenteils an der Schicht 24 adsorbiert ist, mit Hilfe einer Mikropipette 23 abgezogen und man erhält eine Grenzflächenschicht 24 der gereinigten DNA.
Die 5 erläutert den Fall, bei dem das (Auf)Konzentrierungsverfahren mit dem alleinigen Ziel angewendet wird, eine noch konzentriertere Phase an einer gegebenen DNA zu erhalten als die ursprüngliche Phase der genannten DNA. In diesem Fall wird die an Target-DNA reiche Schicht 24 mit Hilfe einer Mikropipette 23 abgezogen, um für verschiedene Anwendungen verwendet zu werden.
Selbstverständlich sind auch andere Anwendungen denkbar, die in den beiliegenden Zeichnungen nicht dargestellt sind.

Claims

Verfahren zum selektiven Aufkonzentrieren eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: – Herstellung einer stabilisierten Dispersion vom Schaum- oder Emulsions-Typ aus einem Medium, das die genannte flüssige Probe und eine Grenzflächenschicht enthält, die in der Lage ist, das genannte Makromolekül oder das genannte Agglomerat, das aufkonzentriert werden soll, selektiv zu fixieren, und – Resorption der in der vorhergehenden Stufe gebildeten Dispersion zur Rückbildung der genannten Grenzflächenschicht.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach Anspruch 1, in dem die Stufe der Bildung der Dispersion durchgeführt wird durch mechanisches Rühren des Mediums, das die genannte flüssige Probe und die genannte Grenzflächenschicht enthält.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach Anspruch 1, bei dem die Stufe der Bildung der Dispersion durchgeführt wird durch direkte injektion von Gas- oder Flüssigkeits-Kapillarstrahlen in die flüssige Probe.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Grenzflächenschicht mindestens ein Molekül umfasst, welches das genannte Makromolekül oder das genannte Agglomerat selektiv fixieren kann.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach Anspruch 4, bei dem das Molekül, welches das Makromolekül oder das Agglomerat von Molekülen oder Teilchen, das aufkonzentriert werden soll, fixieren kann, ein Molekül ist, das Gruppen umfasst, die das Makromolekül oder das Agglomerat durch chemische Affinität, durch elektri sche oder magnetische Polarisation und/oder durch Ionisation fixieren können, wobei das genannte Molekül vorzugsweise ein grenzflächenaktives Molekül ist.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Makromolekül ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Nucleinsäuren und Proteinen, beispielsweise aus Antigenen und Antikörpern.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Agglomerat von Molekülen ein Prion ist.
Verfahren zum Aufkonzentrieren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Agglomerat von Teilchen ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus kolloidalen Teilchen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Makromolekül, das aufkonzentriert werden soll, DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem dann, wenn das Makromolekül, das aufkonzentriert werden soll, DNA ist, das Molekül, das DNA fixieren kann, mittels einer Sonde so funktionalisiert ist, dass es die spezifische Hybridisierung der DNA, die aufkonzentriert werden soll, erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Molekül, das die DNA fixieren kann, ein Lipid ist, das durch eine DNA-Sonde funktionalisiert ist, die komplementär zu der DNA ist, die aufkonzentriert werden soll.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Lipid ein biotinyliertes Lipid ist, das eine Avidin-Gruppe oder eine von Avidin abgeleitete Gruppe enthält, auf das die komplementäre DNA aufgepfropft ist mittels eines biotinylierten Endes, das vorher der DNA einverleibt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Lipid ein kationisches Lipid ist, das mindestens eine Spermin-Gruppe aufweist, an dem die komplementäre DNA adsorbiert ist.
Verfahren zum Reinigen eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das anfänglich in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren umfasst das Aufkonzentrieren des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern einer Schicht durch Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und das Eliminieren der an dem genannten Makromolekül oder dem genannten Agglomerat verarmten flüssigen Probe nach dem Aufkonzentrieren.
Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das anfänglich in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren umfasst das Aufkonzentrieren im Innern einer Schicht aus dem genannten Makromolekül oder dem genannten Agglomerat durch Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und den Nachweis des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im innern der genannten Schicht durch geeignete Nachweismethoden.
Verfahren zur Amplifikation (Verstärkung) eines Makromoleküls oder eines Agglomerats von Molekülen oder Teilchen, das anfänglich in einer flüssigen Probe enthalten ist, wobei das Verfahren umfasst das Aufkonzentrieren des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern einer Schicht durch Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und den Ersatz der genannten flüssigen Probe nach dem Aufkonzentrieren des genannten Makromoleküls oder des genannten Agglomerats im Innern der genannten Schicht durch eine Flüssigkeit, die Amplifikationsmittel (Verstärkungsmittel) umfasst, gefolgt von einer Stufe zur Amplifikation (Verstärkung) mittels der genannten Amplifikationsmittel.
Verfahren zur Amplifikation nach Anspruch 16, bei dem das Makromolekül DNA ist.
Verfahren zur Amplifikation nach Anspruch 16, bei dem das Agglomerat von Molekülen ein Prion ist.