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Gegenstand
der Erfindung sind lösliche
hochverzweigte Glukose-Polymere mit einem Gehalt an reduzierenden
Zuckern von weniger als 1%, welche einen bedeutend erhöhten Gehalt
an glykosidischen Bindungen α-1,6
von mehr als 10% bei einer sehr engen Molekulargewichtsverteilung
zwischen 0,3·105 und 2·105 Dalton und eine sehr geringe Osmolalität zwischen
1 und 15 mOsm/kg aufweisen.
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Die
löslichen
verzweigten Glukose-Polymere weisen des Weiteren eine schwache Viskosität auf und keine
Rückbildung,
selbst nach Lagerung bei Kälte
für sehr
lange Zeitspannen.
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Die
Erfindung betrifft gleichermaßen
ein Verfahren zur Herstellung der löslichen hochverzweigten Glukose-Polymere.
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Vorgesehen
sind ebenfalls Zusammensetzungen, welche die löslichen verzweigten Polymere
enthalten, welche in zahlreichen industriellen Anwendungen verwendet
werden können,
und insbesondere in der Nahrungsmittel- und Pharmaindustrie.
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Die
industriell erhältlichen
herkömmlichen
Glukose-Polymere werden insbesondere durch Hydrolyse natürlicher
oder hybrider Stärke
und ihrer Derivate hergestellt.
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Standard-Stärkehydrolysate
sind somit Produkte saurer oder enzymatischer Hydrolyse von Stärke aus Getreide
oder Knollen. Sie sind faktisch eine Mischung aus Glukose und Glukose-Polymeren mit extrem
veränderlichem
Molekulargewicht.
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Diese
Stärke-Hydrolysatprodukte
(Dextrine, Maltodextrine ...) in der Industrie (mit einem bestimmten Polymerisationsgrad
oder mittlerem Polymerisationsgrad (DP)) bestehen aus einer breiten
Verteilung von Sacchariden, welche gleichzeitig lineare Strukturen
(glykosidische Bindungen α-1,4)
und verzweigte Strukturen (glykosidische Bindungen α-1,6) aufweisen.
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Die
Stärke-Hydrolysate,
und insbesondere die Maltodextrine, werden als Carrier oder Füllstoff,
Strukturfestiger, Atomisierungshilfen, Ersatzstoff für Fette,
Filmbildner, Erstarrungs-Kontrollmittel,
Anti-Kristallisierungsmittel oder aufgrund ihres Beitrags zur Ernährung verwendet.
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Dem
Durchschnittsfachmann ist des Weiteren bekannt, dass die saccharidische
Zusammensetzung der Maltodextrine deren physikalische wie auch biologische
Eigenschaften bestimmt.
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Somit
sind ihre Hygroskopizität,
Vergärbarkeit
in den Nahrungsprodukten, ihre Viskosität, ihr Süßungscharakter, ihre Stabilität, ihr Geliercharakter
und ihre Osmolalität
Kriterien, die herkömmlich
für ihre
unterschiedlichen Anwendungsbereiche bestimmt werden.
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Die
Grundkenntnisse über
das physikalisch-chemische Verhalten der Saccharide führen also
dazu, diese beispielsweise in Sportgetränke, Flüssiggetränke mit begrenzter Löslichkeit,
parenterale oder enterale Flüssigkeiten
oder Nahrungsmittel für
Diabetiker einzubinden.
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Aufgrund
dieser Tatsache sind für
die unterschiedlichen Anwendungen verschiedene physikalische und
biologische Eigenschaften erforderlich.
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Es
ist zum Beispiel bekannt, dass die Absorptionsrate der Saccharide
durch die Magenentleerungsrate und die Darmadsorptionsrate bestimmt
wird, deren Kontrolle durch die Osmolalität der Saccharide sichergestellt
wird.
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Auf
Darmebene werden die Maltodextrine durch die α-Pankreas-Amylase hydrolysiert,
was zu einer Minderung ihrer Größe bis zu
Grenzdextrinen führt,
und eine bestimmte Anzahl an die Darmschleimhaut gebundener Enzyme
(Maltase, Sucrease und α-Dextrinase)
hydrolysieren weiter die linearen und verzweigten Saccharide zu
Glukose.
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Wenn
auch die Glukose leicht durch die Darmsperre geht (passive Diffusion),
gilt dies nicht für
Saccharide mit geringem DP. So werden lineare Oligosaccharide schneller
als verzweigte Oligosaccharide adsorbiert, obwohl Maltose und Maltotriose
schneller als Glukose absorbiert werden.
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Die
Bakterien des Colons fermentieren alle Kohlenhydrate, die nicht
von dem Dünndarm
adsorbiert wurden. Übermäßige Fermentation
durch diese Bakterien führt
zu Darmstörungen,
wie beispielsweise Krämpfen
und Blähungen.
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Es
ist gleichermaßen
bekannt, dass die Osmolalität
die Absorptions-/Sekretionsrate von Wasser im Dünndarm beeinflusst. Je höher die
Osmolalität
einer Verbindung ist, umso mehr bewirkt sie einen Flüssigkeitseintritt
in den Darm und führt
zu schweren Schäden
im Darm (osmotische Diarrhoe), begleitet von Flüssigkeits- und Elektrolytverlust.
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Die
Osmolalität
einer Lösung
ist gleich der Menge an gelösten
Mol pro kg Wasser, was impliziert, dass bei gleicher Konzentration
in Trockengewicht die Osmolalität
eines herkömmlichen
Maltodextrins mit dem Mindern seines DPs steigt.
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Auf
allgemeine Weise werden die Maltodextrine gut vom menschlichen Körper absorbiert,
aber unter extremeren körperlichen
Bedingungen, wie beispielsweise bei sportlicher Betätigung oder
bei Krankheit, muss eine bessere Zufuhr von Kohlenhydraten sichergestellt
werden.
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Zum
Beispiel muss bei Sportlern durch ein während einer körperlichen
Aktivität,
die sehr viel Leistung erfordert, konsumiertes Getränk augenblicklich
die notwendige Energie und das notwendige Wasser zugeführt werden,
um den Flüssigkeitsverlust
durch Perspiration auszugleichen.
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Aus
dem oben Dargelegten geht hervor, dass eine an Kohlenhydraten ausgewogene
Zusammensetzung notwendig ist, um ein derartiges Ergebnis zu erhalten.
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Eine
herkömmlich
vorgeschlagene Lösung
für das
optimale Getränk
ist es, kurze lineare Oligosaccharide mit einem DP von 3 bis 6 zu
wählen,
damit sie mit der höchsten
Geschwindigkeit absorbiert werden, wobei die Osmolalität auf einem
mittleren Niveau bleibt, wodurch somit Flüssigkeitsverlust und Nebenwirkungen
wie Diarrhoe und Krämpfe
vermieden werden.
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Jedoch
weisen diese Zusammensetzungen den Nachteil auf, dass sie Energiequellen
bilden, die von dem Organismus zu schnell aufgenommen werden können, was
sich durch Schwierigkeiten ausdrückt, über lange
Zeitspannen eine konstante Energiezufuhr zu bewahren.
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Also
wurden mit der Patentanmeldung WO 95/22.562 neue Stärkederivate
offenbart, die für
die Energiezufuhr für
die Vorbereitung von oder im Anschluss an körperliche Leistungen bestimmt
sind.
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Es
handelt sich um Dextrine, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht
zwischen 15·103 und 107 Dalton
und einen Grad an glykosidischer Verzweigung 1,6 zwischen 2 und
8%, vorzugsweise zwischen 3 und 7%, welche eine Erneuerung der Energiereserven
in Form von Glykogen sicherstellen.
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In
flüssiger
Form gehen diese bestimmten Dextrine nach einer schnellen Magenentleerung
in den Dünndarm.
Dieser Weg wird des Weiteren durch die Osmolalität der Dextrine gesteuert.
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Eine
erhöhte
Osmolalität
bedeutet hier, dass sich die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht
mit Wasser verbinden, was den Transport von Wasser und Nährstoffen
in die Zelle schwierig macht. Die Osmolalität des Blutes beträgt ungefähr 300 mOsm/l,
und in dem Ziel, den Transport von Nährstoffen zu erleichtern, ist
es wünschenswert,
dass die Osmolalität
der Substanz merklich unter diesem Wert liegt.
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Von
einem Dextrin gemäß WO 95/22.562
mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 720.000 und einem Verzweigungsgrad
von ungefähr
4% wird beschrieben, dass es eine Osmolalität von 20 mOsm/kg Lösung aufweist.
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Allerdings
werden die Dextrine durch Säurebehandlung
nativer Stärke,
insbesondere von Kartoffelmehl, bei sehr hohen Temperaturen, das
heißt
110 bis 140°C,
und in einer Reaktionszeit von 1 bis 15 Stunden hergestellt, was
zu einem Verzweigungsgrad 1,6 führt,
der gleichzeitig glykosidischen Bindungen α-1,6 und β-1,6 entspricht.
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Diese
atypischen glykosidischen Bindungen werden von den enzymatischen
Systemen des Darms nicht verdaut und können zu einer Ansammlung von
nicht verdaulichen Resten führen,
die bestimmte unerwünschte
Bakterien aufnehmen.
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In
einem anderen Anwendungsbereich werden die Maltodextrine oft Getränken hinzugefügt, um deren Viskosität zu erhöhen. Jedoch
können
bei solchen, die Alkohol enthalten, durch Zugabe von Maltodextrinen mit
hohem DP Probleme der Stabilität
der Mischung erzeugt werden.
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Eine
andere Lösung,
die darin besteht, Maltose oder Glukose hinzuzugeben, führt jedoch
dazu, der Mischung einen zusätzlichen
süßen Geschmack
zu verleihen, was nicht immer gewünscht ist. Des Weiteren können die
kleinen Oligosaccharide als Fermentationssubstrate für unerwünschte Mikroorganismen
dienen.
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Die
für diesen
Anwendungsbereich am besten angepassten Maltodextrine müssen somit
die Parameter "nicht
süß", Viskosität und Stabilität in Einklang
und Gleichgewicht bringen.
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Im
Bereich parenteraler Lösungen
werden nährstoffreiche
Lösungen
entwickelt, um einen Patienten bei guter Gesundheit zu halten und
ihm Nährstoffe
zu liefern, wenn er nicht über
sein normales Verdauungssystem ernährt werden kann.
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Da
die Lösungen
direkt auf venösem
Weg zugeführt
werden, müssen
sie isotonisch sein und die Zufuhr an Glukose ist begrenzt.
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Um
eine tägliche
Energiezufuhr von 10.000 kJ zu liefern, wird in einem Artikel der
FOOD Science Technology aus dem Jahr 1999, S. 345–355, von
MARCHAL et al. beschrieben, dass es notwendig wäre, 14 Liter isotonische Glukoselösung über den
Tropf zuzuführen
(5 Gew.-%/Glukosevolumen), was die menschlichen Kapazitäten weit überschreitet.
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Die
Zufuhr von Lösungen,
welche konzentrierter an Glukose oder Fruktose sind (10–20 Gew.-%/Volumen),
ist möglich,
aber nicht für
lange Zeitspannen.
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Es
ist möglich,
lineare Saccharide mit einem DP zwischen 2 und 5 zu verabreichen,
da diese Saccharide von Maltasen in der Niere hydrolysiert werden
und da die freigesetzte Glukose dann aufgenommen wird. Auf diese
Weise ermöglicht
die Verwendung kurzer linearer Oligosaccharide, in einer isotonischen
Lösung
ausreichend Energie zuzuführen,
ohne den Patienten mit Flüssigkeit überzuversorgen.
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Des
Weiteren wird, da die linearen Oligosaccharide mit einem DP kleiner
7 in Lösung über lange
Zeitspannen stabil sind, herkömmlich
gewählt,
den DP zwischen 2 und 7 zu variieren, um zu ermöglichen, den Patienten über lange
Zeitspannen stets die gesamte erforderliche Energie zuzuführen.
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Aber
diese Lösung
ist nicht vollständig
zufriedenstellend, und es ist nur die Nutzung linearer glykosidischer
Strukturen vorgesehen.
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Bezüglich enteraler
Ernährung,
betrifft sie Getränke,
die oral eingenommen werden können
oder per Sonde in den Magen oder den Dünndarm verabreicht werden.
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Bei
diesen enteralen Flüssigkeiten
ist Diarrhoe aufgrund einer zu starken Osmolalität das Hauptproblem. Im Prinzip
kann die für
die Sportler gefundene Lösung
gleichermaßen
auch hier Anwendung finden.
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Auf
herkömmliche
Weise werden somit Maltodextrine, die eine komplexe Mischung linearer
und verzweigter Saccharide einschließen, mit einem DP von 10 bis
20 verwendet, was aber nicht vollständig zufriedenstellend ist.
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Die
Spezialisten für
diese Anwendungsbereiche suchen die Lösung für die technischen Probleme
in der Ausarbeitung von von Stärke
abgeleiteten verzweigten Strukturen.
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Das
Amylopektin, Hauptbestandteil von Stärke, gruppiert sich um lineare
Bindungen α-1,4
und Bindungen α-1,6,
die sich verzweigen. Die Kenntnis über Mikrostrukturen hat aufgezeigt,
dass die beiden Bindungsarten nicht auf einheitliche Weise verteilt
sind, sondern dass sehr dichte Zonen von Bindungen α-1,6 neben Zonen
liegen, die nur aus Bindungen α-1,4
gebildet sind.
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In
dem US-Patent 4.840.807 oder der japanischen Patentanmeldung JP
11/187.708 wurde vorgeschlagen, nur die dichten Zonen von Bindungen α-1,6 als
Quelle für
Kohlenhydrate mit langsamer Absorption zu extrahieren, in dem Sinn,
dass die Bindungen α-1,6
schwieriger abzubauen sind als die Bindungen α-1,4.
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Auf
diese Weise wurden zwei Produktfamilien entwickelt. Die erste betrifft
Grenzdextrine, die durch Abbau der Zonen zu Bindungen α-1,4 einzig
durch eine α-Amylase
hergestellt werden, und die Dextrine, die durch Abbau der Zonen
zu Bindungen α-1,4
durch gleichzeitige Wirkung einer α-Amylase und einer β-Amylase hergestellt
werden.
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Die
Widerstandsfähigkeit
der Grenzdextrine gegenüber
menschlichen Verdauungsenzymen ermöglicht es, sie zu verwenden,
um die Verdauung zu regulieren, aber auch, um den Blutzu cker (Anwendung
für Nahrungsmittel
für Diabetiker)
zu steuern. Diese Wirkung erfolgt aufgrund einer Verzögerung der
Adsorptionsgeschwindigkeit der Verdauung.
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Jedoch
haben die Verbindungen den Nachteil, ein sehr geringes Molekulargewicht
(zwischen 10.000 und 55.000 Dalton) aufzuweisen, was die Nutzung
in anderen Anwendungsbereichen einschränkt.
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Das
Patent
EP 207.676 informiert
darüber,
dass für
eine kontinuierliche und ambulante Nutzung bei der Peritonealdialyse
Stärkehydrolysate
bevorzugt werden, die klare und ungefärbte Lösungen zu 10% in Wasser mit
einem Mw von 5·10
3 bis 10
6 Dalton
und einem schwachen Polymolekularitätsindex oder Ip bilden.
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Dies
wird durch Zusammensetzungen umgesetzt, die hauptsächlich Glukosepolymere
mit hohem Molekulargewicht zwischen 5·103 und
5·106 Dalton einschließen, die keine oder nur sehr
wenig Glukose oder Oligosaccharide mit einem DP von kleiner oder
gleich 3 einschließen
und keine oder nur sehr wenige Glukosepolymere mit einem Mw größer als
106 Dalton.
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Bei
dieser Anwendung ist tatsächlich
leicht verständlich,
dass die Monomere oder Polymere mit geringem Molekulargewicht schnell
die Peritonealwand durchqueren und somit ohne nachhaltiges Interesse
für das Erzeugen
eines osmotischen Druckgradienten sind und dass die Polymere mit
sehr hohem Molekulargewicht, die ohne Osmosekraft sind, zu vermeiden
und sogar zu verbieten sind, da sie potentiell gefährlich sind,
falls es geschieht, dass sie im Anschluss an ihren Abbau ausfallen.
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Die
Peritonealdialyse besteht darin, eine Dialyselösung in die Peritonealhöhle mittels
eines Katheters einzubringen. Nach Ablauf einer bestimmten Zeit
findet ein Austausch an gelösten
Stoffen zwischen dem Dialysat und dem Blut statt. Die Verwendung
eines geeigneten Osmosemittels ermöglicht die Drainage von überschüssigem Wasser
von dem Blut zu dem Dialysat.
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Das
Standardverfahren bei der Peritonealdialyse zum Entfernen des Wasserüberschusses
(Ultrafiltration) und der gelösten
Stoffe von dem Organismus im Fall eines Nierenfehlers bestand darin,
eine Dialyselösung
zu verwenden, die auf das Plasma bezogen hypertonisch gemacht wurde,
indem Glukose als Osmosemittel hinzugefügt wurde. Der Fluss durch eine
ideale semipermeable Membran wird hauptsächlich durch die Gesamtzahl
an Partikeln des gelösten
Stoffes (Osmolalität)
bestimmt, die in der Lösung
vorhanden sind, unabhängig
von ihrer Größe. Im Gegensatz
dazu hängt
bei einer biologischen Membran wie der Peritonealmembran der Fluss
einzig von den gelösten
Stoffen ab, die nicht oder nur wenig die Membran durchqueren, und
ist somit nicht notwendigerweise mit der Gesamtosmolalität der Lösung verbunden.
Des Weiteren ist die Fähigkeit der
gelösten
Stoffe, die Membran zu durchqueren, gekennzeichnet durch die Form
der Moleküle
und ihrer ionischen Ladung sowie durch ihre Größe.
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Die
Wahl eines idealen Osmosemittels ist heikel: das Letztgenannte muss
einen Osmosegradienten ermöglichen,
so dass das Wasser und die giftigen Substanzen im Blut gegen die
Dialyselösung über das Bauchfell
ersetzt werden. Es muss gleichermaßen nicht toxisch und biologisch
inert sein, wobei es gleichzeitig von dem Organismus umsetzbar ist,
wobei ein Teil desselben in dem Blut aufgenommen wird. Es darf die
Peritonealmembran nicht zu schnell durchqueren, damit dauerhaft
ein Ultrafiltrationsgradient bewahrt wird, ohne dass sich unerwünschte Substanzen
in dem Blut ansammeln.
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In
ihrem Patent
EP 667.356 hat
die Anmelderin der vorliegenden Erfindung ein Herstellungsverfahren offenbart
aus Waxy-Stärke,
einem Stärkehydrolysat,
das vollständig
in Wasser löslich
ist und einen schwachen Polymolekularitätsindex, kleiner als 2,8, mit
einem Mw zwischen 5·10
3 und 1·10
6 Dalton aufweist.
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Dieses
Verfahren besteht darin, auf saurem Weg eine Stärkemilch zu hydrolysieren,
die ausschließlich aus
Amylopektin gebildet ist, dann die saure Hydrolyse durch eine enzymatische
Hydrolyse mit bakterieller α-Amylase
zu vervollständigen
und auf makroporösen
stark kationischen Harzen in Alkali- oder Erdalkaliform zu chromatographieren.
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Es
wird darauf hingewiesen, dass seinerzeit die Anmelderin empfohlen
hat, nur Stärke,
die annähernd ausschließlich aus
Amylopektin zusammengesetzt ist und häufig Waxy-Stärke oder
Wachsstärke
genannt wird, als Hauptbestandteil in diesem Verfahren zu verwenden,
Stärke
oder Stärkemehl
mit einem nicht vernachlässigbaren
Anteil Amylose waren nicht geeignet.
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Das
Stärkehydrolysat,
auch Icodextrin genannt, hat eine bedeutende Senkung der täglichen
Absorption von Glukose ermöglicht,
die vorher als Osmosemittel in Lösungen
für die
Dialyse verwendet wurde, was somit einen möglichen Vorteil für die Behandlung
von Patienten mit Diabetes oder dickleibige Patienten bildet, für die der
Kaloriengehalt ein kritischer Faktor ist. Dies konnte weiter verbessert
werden, indem ein den Blutzucker weniger beeinflussendes Osmosemittel
verwendet wurde, dessen Osmosekraft länger anhielt, was ermöglicht hat,
das Verfahren der Dialysebehandlung wesentlich zu erleichtern. Der
Wirkungsgrad des Dialysats wurde verbessert, die Wechselhäufigkeit
der Dialysebeutel konnte gemindert werden, was eine gewisse Verbesserung
der Lebensqualität
des Patienten darstellt.
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Folglich
muss das für
die Peritonealdialyse ideale Kohlenhydrat:
- – in Wasser
löslich
sein
- – einen
osmotischen Druck ausüben
- – eine
niedrige Viskosität
aufweisen
- – sich
nicht zurückbilden
- – in
der systemischen Zirkulation eine schwache Glukose-Entstehungskinetik
bewirken
- – langsam
durch Amylase hydrolysiert werden, um einen dauerhaften osmotischen
Druck auszuüben.
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Bezogen
auf den letzten Punkt wird das Schicksal der in Lösung in
die Peritonealhöhle
verabreichten Osmosemittel bei Niereninsuffizienzen durch ihre Stabilität in der
Peritonealflüssigkeit,
die Bedeutung der Absorption in der systemischen Zirkulation und
die Hydrolysegeschwindigkeit durch Amylase bestimmt. Jedoch weisen
die Osmosemittel im Stand der Technik den Nachteil auf, schnell
hydrolysiert zu werden.
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Gleichermaßen wurden
als resistent bezeichnete Stärken
als Regulatoren für
den Blutzucker vorgeschlagen. Jedoch sind diese im Allgemeinen in
den Zusammensetzungen nicht stabil, können nicht sterilisiert werden,
was schließlich
einen Verlust des Produkts verursacht, und sie können fermentiert sein und erbringen somit
nicht den erwarteten kalorischen Anteil.
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Aus
dem Vorgenannten geht somit hervor, dass es ein nicht erfülltes Bedürfnis gibt,
Glukose-Polymere vorzusehen,
die bedeutende Eigenschaften aufweisen, insbesondere hinsichtlich
Stabilität,
Löslichkeit
und gegebenenfalls Viskosität,
und die selbst den Produkten, die diese enthalten, eine längere Lebensdauer
und eine kontrollierte Verdaulichkeit verleihen, was die Verwendung
in unterschiedlichen Bereichen ermöglicht, wie beispielsweise
der Peritonealdialyse, der enteralen oder parenteralen Ernährung, als
Inhibitor und/oder Regulator für
den Blutzucker, als Energiezufuhr bei körperlichen Aktivitäten und
als Verdauungsregulator.
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Der
Anmelderin ist es gelungen, all diese gewünschten Ziele, die bis jetzt
schwer zu vereinen waren, durch zahlreiche Forschungen zu vereinen,
indem sie neue lösliche
hochverzweigte Glukose-Polymere ersonnen und entwickelt hat.
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Die
löslichen
hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung weisen einen
Gehalt an reduzierenden Zuckern von weniger als 1% auf und sind
somit durch die Tatsache gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an
glykosidischen Bindungen α-1,6
von mehr als 10%, vorzugsweise zwischen 12 und 30%, ein Mw, bestimmt
durch Lichtstreuung, zwischen 0,3·105 und
2·105 Dalton, und eine Osmolalität, bestimmt
gemäß einem
Test A, zwischen 1 und 15 mOsm/kg aufweisen.
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Die
löslichen
verzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
weisen einen geringen Gehalt an reduzierenden Zuckern auf.
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Die
Bestimmung der reduzierenden Kraft der verzweigten Glukose-Polymere
gemäß der Erfindung
ergibt auf jede dem Durchschnittsfachmann bekannte Weise Werte von
weniger als 1%.
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Der
Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6 der löslichen verzweigten Glukose-Polymere
gemäß der Erfindung
wird durch Protonen-NMR-Analyse bestimmt. Der Gehalt an Verzweigungen
wird also in Prozent ausgedrückt,
entsprechend der Größe des Protonensignals,
das durch das C1 einer Anhydroglukoseeinheit erzeugt wird, die eine
andere Anhydroglukoseeinheit durch eine Bindung α-1,6 bindet, wenn man allen
Protonensignalen von allen C1 des Glukoserests der löslichen
Glukose-Polymere einen Wert von 100 gegeben hat.
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Unter
diesen Bedingungen wird bestimmt, dass die löslichen hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
einen Gehalt an Bindungen α-1,6
aufweisen, der größer als
10% ist, vorzugsweise zwischen 12% und 30% liegt.
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Dieser
Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6 bringt jedem hochverzweigten
Glukose-Polymer
gemäß der Erfindung
hinsichtlich Verzweigungsgrad und/oder Länge der verzweigten Ketten
bezogen auf die Stärke
oder das Stärkederivat,
aus dem es hervorgegangen ist, eine bestimmte Struktur bei.
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Dieser
besonders erhöhte
Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6 macht die hochverzweigten
Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
schwer verdaulich, was dazu beiträgt, diese als Regulator für die Verdauung
und als Inhibitor für
Glykämie
verwenden zu können,
wie oben beschrieben.
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Sie
können
somit Diabetikern oder anderen anfälligen Personen als Nahrungsmittel,
Getränke
oder Nahrungsergänzungsmittel,
deren Funktion es ist, den Anstieg des Blutzuckers zu hemmen, verabreicht
werden.
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Die
löslichen
hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung bilden sich
des Weiteren in wässriger
Lösung
nicht zurück
und weisen eine beachtliche Stabilität auf.
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Durch
diese Eigenschaft sind die verzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
auf ganz natürliche
Weise für
Zusammensetzungen im Bereich der Nahrungsmittelindustrie verwendbar,
die dann eine bessere Lagerstabilität aufweisen.
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Ein
weiterer Vorteil der Erfindung ist es, dass möglich wird, ein Endprodukt
zu erhalten, das zum Beispiel in gekühlten oder tiefgekühlten Produkten
als lösliches
Bindemittel verwendbar ist.
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Die
Bestimmung der Molekularmassen der löslichen verzweigten Glukose-Polymere
gemäß der Erfindung
wird durch Messen des mittleren Molekulargewichts (Mw) durchgeführt.
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Dieser
Wert wird durch Größenausschluss-Chromatographie
auf Säulen
PSS SUPREMA 100 und PSS SUPREMA 1000 erhalten, die in Reihe angebracht
sind und mit einem Detektor für
Lichtstreuung verbunden sind.
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Die
verzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
weisen somit einen Wert für
das Mw zwischen 0,3·105 und 2·105 Dalton auf.
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Die
löslichen
Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
weisen gleichermaßen
eine bemerkenswert geringe Osmolalität auf.
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Der
Test A besteht darin, die Osmolalität einer Lösung mit 100 g trocken der
hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung, welche in
1 kg Wasser angeordnet sind, zu bestimmen.
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Das
Messen der Osmolalität
dieser Lösung
wird anschließend
mit einem Osmometer MARK 3 von FISKE® ASSOCIATES
durchgeführt,
indem die Anweisungen des Herstellers befolgt werden.
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Die
verzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
weisen also einen bemerkenswert niedrigen Osmolalitätswert zwischen
1 und 15 mOsm/kg auf.
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Nach
Kenntnis der Anmelderin gibt es keine Glukose-Polymere, die einen
derartigen Osmolalitätswert aufweisen
für Produkte,
die des Weiteren einen Verzweigungsgrad und ein Molekulargewicht
wie beschrieben aufweisen.
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Tatsächlich ergeben
Vergleichsmessungen, die an herkömmlichen
Maltodextrinen durchgeführt
werden, welche ein Dextrose-Äquivalent
(DE) zwischen 5 und 20 aufweisen, Osmolalitätswerte zwischen 25 und 85
mOsm/kg.
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Andere
Messungen, die an Grenzdextrinen, die wie zuvor beschrieben durch
Behandlung verflüssigter Stärke mit α-Amylase,
unter dem Namen BLD 8 von SANMATSU vermarktet, durchgeführt wurden,
wiesen für ein
Molekulargewicht zwischen 0,4 und 0,5·105 Dalton
und einen Verzweigungsgrad α-1,6
zwischen 8 und 9% einen Osmolalitätswert von mehr als 35 mOsm/kg
auf.
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Dieser
sehr niedrige Osmolalitätswert
verleiht folglich den löslichen
hochverzweigten Polymeren gemäß der Erfindung
Eigenschaften, die es ermöglichen,
in Zubereitungen verwendet zu werden, die für Sportler bestimmt sind, um
die Energiequellen zu erneuern, die sie für körperliche Anstrengungen über lange
Zeitspannen benötigen.
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Aber
gleichermaßen
und insbesondere können
die Zusammensetzungen vorteilhafterweise im Rahmen einer enteralen
oder parenteralen Ernährung
für Patienten
verwendet werden, die sich nicht mehr normal ernähren können.
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Des
Weiteren sind, verbunden mit der Eigenschaft geringer Osmolalität, dem Nichtauftreten
von Rückbildung,
dem geringen Molekulargewicht und dem geringen Polydispersitätsindex,
die hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung perfekt als
Osmosemittel für
Peritonealdialyse-Anwendungen geeignet, wie nachstehend beispielhaft
dargelegt wird. Die Anmelderin hat des Weiteren aufgezeigt, dass
die Polymere gemäß der Erfindung
eine Widerstandsfähigkeit
gegen α-Amylase
aufweisen, was wesentliche Vorteile bezogen auf Polymere gemäß dem Stand
der Technik erbringt, bei gleichem Molekulargewicht, da sie weniger
glykämisch
sind und eine Osmosekraft aufweisen, die länger andauert, was somit ihre
Verwendung bei Dialysebehandlungen mit langer Dauer ermöglicht.
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Auf
vorteilhafte Weise können
die hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung entsprechend
ihrer Osmolalität
in drei Unterfamilien eingeteilt werden.
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Die
erste Unterfamilie enthält
hochverzweigte Polymere, welche für ein Mw, das durch Lichtstreuung bestimmt
wurde, zwischen 0,5·105 und 1,5·105 Dalton
eine Osmolalität,
die gemäß Test A
bestimmt wurde, von wenigstens gleich 1 und weniger als 2 mOsm/kg
aufweist.
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Die
zweite Unterfamilie enthält
hochverzweigte Polymere, welche für ein Mw, das durch Lichtstreuung bestimmt
wurde, zwischen 0,5·105 und 0,8·105 Dalton
eine Osmolalität,
die gemäß Test A
bestimmt wurde, von wenigstens gleich 2 und weniger als 5 mOsm/kg
aufweist.
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Die
Anmelderin hat des Weiteren verzweigte Glukose-Polymere gefunden,
die zu den beiden Unterfamilien gehören und einen beachtlich erhöhten Verzweigungsgrad α-1,6, das
heißt
zwischen 15 und 30%, aufweisen.
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Die
dritte Unterfamilie enthält
hochverzweigte Polymere, welche ein Mw, das durch Lichtstreuung
bestimmt wurde, zwischen 0,3·105 und 0,7·105 Dalton
und eine Osmolalität,
die gemäß Test A
bestimmt wurde, von wenigstens gleich 5 und weniger als 15 mOsm/kg
aufweisen.
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Um
die löslichen
verzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
herzustellen, werden der Reihe nach die folgenden Schritte durchgeführt:
- a. Herstellen einer wässrigen Suspension aus Stärke oder
einer Lösung
aus einem Stärkederivat
einer Trockensubstanz von wenigstens gleich 1 Gew.-%, vorzugsweise
10 bis 50 Gew.-%,
- b. Behandeln der Suspension oder der Lösung mit einem Verzweigungsenzym
bei einer Temperatur zwischen 25 und 80°C für eine Dauer von 1 bis 24 Stunden,
- c. zu der Suspension oder zu der so erhaltenen Lösung wenigstens
ein Enzym zum Agieren bringen, das aus der Gruppe gewählt ist,
die aus α-Amylase, β-Amylase,
Amyloglukosidase und α-Transglukosidase
gebildet ist,
- d. Durchführen
einer Fraktionierung mittels wenigstens einer Technik, die aus der
Gruppe von Trennungen auf Membran oder Chromatographien gewählt ist,
um die Fraktionen mit hohem Molekulargewicht zu erhalten,
- e. Gewinnen der so erhaltenen verzweigten Glukose-Polymere.
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Die
Stärke
wird in Suspension, oder die Stärkederivate
in wässrige
Lösung,
mit einer Trockensubstanz von wenigstens gleich 1 Gew.-%, vorzugsweise
zwischen 10 und 50 Gew.-%, gebracht.
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Die
Wahl der Herkunft oder der Qualität der Stärke oder ihrer bestimmten Derivate
hat nur eine relative Bedeutung.
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Tatsächlich hat
die Anmelderin ein neues Verfahren entwickelt, welches es ermöglicht,
hochverzweigte Glukose-Polymere gemäß der Erfindung zu erhalten,
die beispielsweise bei der Peritonealdialyse verwendbar sind, das
es nicht erfordert, sich auf eine bestimmte Art Stärke zu beschränken, in
diesem Fall eine Stärke,
die reich an Amylopektin ist.
-
Somit
kann natürliche
oder hybride Stärke
gewählt
werden, welche stammt aus Kartoffeln, Kartoffeln mit hohem Amylopektingehalt
(Waxy-Stärkemehl),
aus Erbsen, Reis, Maniok, Weizen, Mais, an Amylopektin reichem Mais
oder Weizen (Waxy-Mais oder -Weizen), Mais mit hohem Amylosegehalt,
Schnitten oder Fraktionen, die aus Stärken gemacht oder erhalten
werden können,
wie beispielsweise Amylose, Amylopektin, granulometrische Schnitte,
die dem Durchschnittsfachmann unter den Begriffen Weizenstärke "A" und Weizenstärke "B" bekannt
sind, und Mischungen aus wenigstens zwei der oben genannten Produkte.
-
Die
Stärkederivate
können
modifizierte Stärken
sein, die aus der enzymatischen, chemischen und/oder physikalischen
Modifikation in einem oder mehreren Schritten aus der Stärke hervorgegangen
sind.
-
Die
Stärkederivate
können
insbesondere die Stärken
sein, die durch wenigstens eine der bekannten Techniken der Veretherung,
Veresterung, Vernetzung, Oxidation, Alkalibehandlung, saurer und/oder
enzymatischer Hydrolyse (ursprünglicher
Maltodextrine und Dextrine) modifiziert wurden.
-
Die
Anmelderin hat herausgefunden, dass die hochverzweigten Glukose-Polymere
gemäß der Erfindung
leicht aus Stärke
oder ihren Derivaten, welche bereits einen Verzweigungsgrad von
wenigstens gleich 1% aufweisen, synthetisiert werden können.
-
Die
Stärkesuspension,
oder die Stärkederivat-Lösung, kann
dann gegebenenfalls einer Behandlung durch spezielles Kochen unterzogen
werden, die darin besteht, sie bei einer Temperatur von mehr als
130°C, vorzugsweise
zwischen 140 und 150°C,
bei einem Druck von mehr als 3,5 bar, vorzugsweise zwischen 4 und 5
bar, für
eine Dauer von 30 Sekunden bis 15 Minuten, vorzugsweise 1 bis 5
Minuten, zu behandeln.
-
Die
Behandlung wird vorzugsweise in einem rohrförmigen Kocher mit Doppelmantel
durchgeführt,
der durch thermisches Fluid geheizt wird, was eine Ausrüstung ist,
die sich der Durchschnittsfachmann leicht beschaffen kann.
-
Der
zweite Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin,
die Stärkesuspension
oder die Stärkederivat-Lösung mit
einem Verzweigungsenzym zu behandeln.
-
Vorteilhafterweise
werden 50.000 bis 500.000 U des gereinigten Verzweigungsenzyms für 100 g
trocken der Stärke
oder des Stärkederivats
verwendet, bei einer Temperatur zwischen 25 und 95°C, vorzugsweise
bei einer Temperatur zwischen 70 und 95°C, für eine Dauer von 1 bis 24 Stunden.
-
Unter
Verzweigungsenzym werden im Sinn der Erfindung die Verzweigungsenzyme
verstanden, die aus der Gruppe gewählt sind bestehend aus den
Verzweigungsenzymen von Glykogen, Verzweigungsenzymen von Stärke und
beliebigen Mischungen dieser Enzyme.
-
Insbesondere
werden die Verzweigungsenzyme von Organismen und/oder Mikroorganismen
extrahiert, die gewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus den Verzweigungsenzymen von Glykogen,
Verzweigungsenzymen von Stärke
und beliebigen Mischungen dieser Enzyme.
-
Die
Anmelderin empfiehlt, zur Durchführung
der Behandlung mit einem Verzweigungsenzym der Lehre ihrer Patentanmeldung
WO 00/18.893 zu folgen.
-
Dieser
Schritt führt
zur Herstellung löslicher
verzweigter Glukose-Polymere, jedoch mit einem Gehalt an glykosidischen
Bindungen α-1,6
von bestens gleich 10%.
-
Um
diesen Wert zu erhöhen
und um Gehalte an Bindungen α-1,6
bis zu 30% zu erhalten, hat die Anmelderin herausgefunden, dass
eine ergänzende
enzymatische Behandlung durchgeführt
werden muss, was den dritten Schritt des Verfahrens zum Erhalten
löslicher
hochverzweigter Glukose-Polymere gemäß der Erfindung bildet.
-
Der
dritte Schritt besteht darin, mit der so erhaltenen, mit einem Verzweigungsenzym
behandelten Suspension oder Lösung
wenigstens ein Enzym agieren zu lassen, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus α-Amylase, β-Amylase,
Amyloglukosidase und α-Transglukosidase.
-
Die
Einsatzbedingungen (Temperatur und pH) der verschiedenen in dem
Verfahren gemäß der Erfindung
verwendeten Enzyme werden aus den folgenden gewählt (die Mengen werden unter
Bezug auf das betreffende Substrat festgelegt, wie nachstehend beispielhaft
dargelegt wird):
- – α-Amylase: der Art LYSASE 2000
von GENENCOR, bei einer Temperatur von 55 bis 65°C, einem pH von 6,5 bis 6,7,
für 30
Minuten bis 1 Stunde.
- – β-Amylase:
der Art SPEZYME BBA von GENENCOR, bei einer Temperatur von 40°C, einem
pH von 4,9 bis 5, für
1 Stunde 30 Minuten bis 2 Stunden.
- – Amyloglukosidase:
entweder der Art OPTIDEX L300 A von GENENCOR, bei einer Temperatur
von 55°C, einem
pH von 4,7; oder der Art A-7420 von SIGMA, bei einer Temperatur
von 50 bis 60°C,
einem pH von 4,7 bis 4,9, für
1 Stunde 30 Minuten bis 2 Stunden.
- – α-Transglukosidase:
der Art α-TGase
von L-AMANO, bei einer Temperatur von 55°C, einem pH von 5 bis 5,2, für eine Stunde.
-
Die
verwendeten Enzyme können
bakterieller oder pilzlicher Herkunft sein.
-
Am
Ende dieser ergänzenden
Behandlung werden lösliche
hochverzweigte Glukose-Polymere in Mischung mit ihren enzymatischen
Abbauprodukten, hauptsächlich
gebildet aus Glukose, Maltose und/oder Isomaltose, erhalten, wie
nachstehend beispielhaft dargelegt wird.
-
Der
vierte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Fraktionierung
durchzuführen
mittels einer Technik gewählt
aus der Gruppe von Trennungen auf Membran und Chromatographien, um
Fraktionen mit hohem Molekulargewicht und Fraktionen mit niedrigem
Molekulargewicht zu erhalten.
-
Die
Fraktionen mit hohem Molekulargewicht entsprechen den hochverzweigten
Glukose-Polymeren gemäß der Erfindung,
wohingegen es die Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht ermöglichen,
an Maltose und/oder Isomaltose angereicherte Zusammensetzungen mit
einer hervorragenden Ausbeute zu erhalten.
-
Vorteilhafterweise
wird eine Fraktionierungstechnik gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Trennung auf Ultrafiltrationsmembran und chromatographischer
Trennungstechnik auf einem Träger
der Art Gel.
-
In
einer ersten Ausführungsweise
zur Durchführung
des vierten Schritts des Verfahrens wird die Fraktionierung mittels
einer Trennungstechnik auf Ultrafiltrationsmembran durchgeführt, indem
eine Membran mit einem Abtrennungs-Schwellenwert von wenigstens
gleich 3000 Dalton, vorzugsweise wenigstens gleich 5000 Dalton,
verwendet wird.
-
Die
Fraktionen mit hohem Molekulargewicht entsprechen den hochverzweigten
Glukose-Polymeren, gleich
dem Ultrafiltrationsretentat, welche dann ungefähr 60% der verwendeten Trockensubstanz
entspricht.
-
In
einer zweiten Ausführungsweise
zur Durchführung
des vierten Schritts des Verfahrens wird die Fraktionierung mittels
einer Chromatographietechnik bewirkt, die auf einem gelartigen Harz
durchgeführt
wird.
-
Die
erhaltenen Profile ermöglichen
die Trennung der die hochverzweigten Glukose-Polymere einschließenden Fraktionen
mit einem optimalen Ertrag zwischen 40 und 45%.
-
Unabhängig von
dem verwendeten Verfahren ermöglichen
die erhaltenen Profile die Trennung der Polysaccharid-Fraktion mit
hohem Molekulargewicht, welche den löslichen verzweigten Glukose-Polymeren
gemäß der Erfindung
entsprechen, der Oligosaccharid-Fraktionen
mit niedrigem Molekulargewicht, die in der Hauptsache aus Glukose
und Maltose und/oder Isomaltose gebildet sind.
-
Der
letzte Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht somit
darin, einerseits die Fraktionen mit hohem Molekulargewicht zu sammeln,
die den hochverzweigten Glukose-Polymeren
entsprechen, und andererseits die Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht
zu sammeln, die mit Glukose und Isomaltose und/oder Maltose angereichert
sind.
-
Die
Produkte mit hohem Molekulargewicht können als solche gesammelt werden,
oder können
durch 3 Volumen Ethanol ausgefällt,
gereinigt und unter Vakuum für
24 Stunden ge trocknet werden oder auch atomisiert werden, auf jede
dem Durchschnittsfachmann bekannte Weise.
-
Bezüglich der
Zusammensetzungen, die an Maltose und/oder Isomaltose angereichert
sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Fraktionen mit niedrigem
Molekulargewicht des Schritts d des Verfahrens gemäß der Erfindung
aufweisen, können
diese als solche verwendet werden oder mit jeder dem Durchschnittsfachmann
weiterhin bekannten Hydrierungstechnik hydriert werden.
-
Die
besonderen physiko-chemischen Eigenschaften der Polymere gemäß der Erfindung
ermöglichen deren
Anwendungen besonders in der Papier-/Pappindustrie, Textilindustrie,
Kosmetikindustrie und insbesondere in der Pharmazie und Nahrungsmittelindustrie,
und ganz besonders in den Bereichen der enteralen und parenteralen
Ernährung,
der Peritonealdialyse als Osmosemittel, als Inhibitor für Glykämie, als
Energiezufuhr bei körperlichen
Aktivitäten
und als Regulator für
die Verdauung.
-
Bezüglich des
besonderen Bereichs der Peritonealdialyse hat die Anmelderin mittels
eines Tests zur Widerstandsfähigkeit
gegen α-Amylase
herausgefunden, dass eine Familie der Polymere gemäß der Erfindung
besonders geeignet für
die Herstellung von Lösungen
für die
Peritonealdialyse ist, wie nachfolgend beispielhaft erläutert wird.
Die Polymere werden dort als Osmosemittel verwendet.
-
Gegenstand
der Erfindung ist somit eine Zusammensetzung für die Peritonealdialyse, dadurch
gekennzeichnet, dass sie als Osmosemittel wenigstens ein lösliches
hochverzweigten Polymer mit einem Gehalt an reduzierenden Zuckern
von weniger als 1% aufweist und weiterhin:
- – einen
Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6 von mehr als 8%, vorzugsweise
zwischen 10 und 30%,
- – ein
Mw, bestimmt durch Lichtstreuung, zwischen 0,3·105 und
2·105 Dalton,
- – eine
Osmolalität,
bestimmt gemäß einem
Test A, zwischen 1 und 15 mOsm/kg.
-
Gemäß einer
bevorzugten Variante der Erfindung weist das Polymer auf:
- – ein
Mw, bestimmt durch Lichtstreuung, zwischen 0,3·105 und
0,7·105 Dalton,
- – eine
Osmolalität,
bestimmt gemäß einem
Test A, von wenigstens gleich 5 und kleiner als 15 mOsm/kg.
-
Die
Zusammensetzung für
Peritonealdialyse gemäß der Erfindung
kann des Weiteren physiologisch geeignete Elektrolyte aufweisen,
wie beispielsweise Natrium, Kalium, Kalzium, Mag nesium, Chlor, um
den Verlust durch Elektrolyttransfer von dem Serum zu dem Bauchfell
zu vermeiden.
-
Diese
Zusammensetzung kann in fester Form für die extemporane Zubereitung
oder in flüssiger
Form, zum Beispiel in wässriger
Lösung,
vorliegen. Im letztgenannten Fall muss die durch Auflösung der
hochverzweigten Polymere gemäß der Erfindung
in Wasser erhaltene Lösung
klar und ungefärbt
sein. Die Lösung muss
vorzugsweise ohne Endotoxine, Peptidoglukane und Betaglukane sein,
sowie ohne Stickstoff-Verunreinigungen, die von dem Ausgangsmaterial
stammen, oder für
deren Herstellung verwendete enzymatische Zubereitungen.
-
Zu
diesem Zweck wurden die in der Lösung
verwendeten hochverzweigten Polymere vorzugsweise einer Reinigung
unterzogen, um jede Färbung
oder alle unerwünschten
Verunreinigungen, wie Proteine, Bakterien, bakterielle Toxine, Fasern,
Metallspuren etc. zu entfernen.
-
Dieser
Reinigungsschritt kann entsprechend den dem Durchschnittsfachmann
bekannten Reinigungstechniken durchgeführt werden.
-
Die
Lösung
für Dialyse
gemäß der Erfindung
kann gleichermaßen
Pufferlösungen
(insbesondere Lactat, Acetat, Glukonat) und andere Additive wie
beispielsweise Aminosäuren,
Insulin, Polyole, wie zum Beispiel Sorbitit, Erythritit, Mannitit,
Maltitit, Xylitit, aufweisen.
-
Das
Hinzufügen
von Polyolen zu der Zusammensetzung, und vorzugsweise von pyrogenfreien
Polyolen, die ohne die zuvor beschriebenen Verunreinigungen (insbesondere
Endotoxine und andere Reste bakterieller Herkunft) sind, ermöglicht es,
die Osmolalität
der Lösung
auf vorteilhaftere Weise zu steigern als mit Glukose oder Maltose,
aufgrund ihres geringeren Kaloriengehalts, der besseren osmotischen
Kraft und da sie nicht reduzierend sind.
-
Die
Zusammensetzung für
Dialyse gemäß der Erfindung
ist bezogen auf Produkte gemäß dem Stand der
Technik vorteilhaft, da das Osmosemittel, das in ihr enthalten ist,
ermöglicht,
einen nachhaltigen osmotischen Druck auszuüben und eine schwache Glukose-Entstehungskinetik
bewirkt, wobei sie gleichzeitig gegen Rückbildung stabil ist, womit
sie den zuvor beschriebenen Hauptkriterien entspricht.
-
Andere
charakteristische Merkmale und Vorteile der Erfindung werden beim
Lesen der nicht einschränkenden,
untenstehenden Beispiele offenbar.
-
Beispiel 1
-
Es
wird eine Lösung
von Stärkederivaten
mit einem Gehalt an Trockensubstanz von 25 Gew.-% durch Erwärmen auf
80°C unter
langsamem und kontinuierlichem Rühren
hergestellt.
-
Es
handelt sich in diesem Fall um zwei unter dem Namen GLUCIDEX® 2
(Substrat A) und GLUCIDEX® 6 (Substrat B) von der
Anmelderin vermarktete Maltodextrine zu 250 g/l.
-
Diese
Lösung
wird auf 30°C
abgekühlt,
und der pH wird durch NaOH 1 N auf 6,8 gebracht.
-
Dann
werden diese Lösungen
mit dem Verzweigungsenzym aus gereinigtem Glykogen, Extrakt des Mikroorganismus
B. stearothermophilus, behandelt.
-
Man
fügt das
Verzweigungsenzym im Verhältnis
von 1600 U/g des Substrats hinzu und bringt die Temperatur nach
und nach auf 65°C.
-
Die
Inkubation wird unter moderatem Rühren für 4 Stunden durchgeführt. Die
Reaktion wird dann durch Senken des pH auf einen Wert von 5 und
durch Sieden für
6 Minuten gestoppt.
-
In
der untenstehenden Tabelle I sind für die beiden getesteten Substrate
die hinsichtlich des Gehalts an glykosidischen Bindungen α-1,6, der
Mw-Werte, des Gehalts an reduzierenden Zuckern und der Osmolalität erlangten
Ergebnisse für
die erhaltenen Produkte (Produkt C aus Substrat A und Produkt D
aus Substrat B) zusammengefasst.
-
-
Der
Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6 ist wesentlich gestiegen,
erreicht aber noch nicht die gewünschten
Werte.
-
Die
Anmelderin hat somit befunden, dass eine ergänzende Behandlung durchgeführt werden
muss, durch Wirkung von Enzymen, die spezifisch die glykosidischen
Bindungen α-1,4
hydrolysieren (beispielsweise α-Amylase, β-Amylase
oder Amyloglukosidase), oder durch Verwendung von Enzymen, die die
Verzweigung an Bindungen α-1,6
vervollständigen
(beispielsweise α-Transglukosidase),
und zwar auf die folgende Weise.
-
Für die ergänzenden
enzymatischen Behandlungen werden die Lösungen der verzweigten Maltodextrine
C und D zuallererst auf die Temperatur und den pH des gewählten Enzyms
gebracht.
- 1) Für die ergänzende Behandlung mit α-Amylase
(LYSASE 2000 bis 2444 UBR/g enzymatisches Extrakt) werden die Lösungen aus
C oder aus D auf die Temperatur von 60°C und den pH von 6,5 bis 6,7
gebracht, und es werden 6 U α-Amylase
pro g Substrat hinzugefügt.
Die
Inkubation wird für
30 Minuten durchgeführt
und die Reaktion durch Sieden für
6 Minuten gestoppt.
- 2) Für
die ergänzende
Behandlung mit β-Amylase
(BBA SPEZYME von GENENCOR) werden die Lösungen aus C oder aus D auf
die Temperatur von 40°C
und den pH von 4,9 bis 5 gebracht, und es werden 30 U β-Amylase
pro g Substrat hinzugefügt.
Die
Inkubation wird für
2 Stunden durchgeführt
und die Reaktion durch Sieden für
6 Minuten gestoppt.
- 3) Für
die ergänzende
Behandlung mit Amyloglukosidase (AMG von SIGMA AA-7420 aus A. niger,
zu 40 U/mg an Proteinen) werden die Lösungen aus C oder aus D auf
die Temperatur von 55°C
und den pH von 4,7 bis 4,9 gebracht, und es werden 20 U AMG pro
g Substrat hinzugefügt.
Die
Inkubation wird unter moderatem Rühren für 2 Stunden durchgeführt und
die Reaktion durch Sieden für
6 Minuten gestoppt.
- 4) Für
die ergänzende
Behandlung mit α-Transglukosidase
(α-TGase
L-AMANO, Aktivität
von 27,7 μMol
in Glukose) werden die Lösungen
aus C oder aus D auf die Temperatur von 55°C und den pH von 5 bis 5,2 gebracht,
und es werden 2 U α-TGase
pro g Substrat hinzugefügt.
Die
Inkubation wird für
1 Stunde durchgeführt
und die Reaktion durch Sieden für
6 Minuten gestoppt.
-
Anschließend werden
die physiko-chemischen Eigenschaften bestimmt:
- – der Produkte
E und F (erhalten durch ergänzende
Behandlung mit α-Amylase
der jeweiligen Produkte C und D),
- – der
Produkte G und H (erhalten durch ergänzende Behandlung mit β-Amylase
der jeweiligen Produkte C und D),
- – der
Produkte I und J (erhalten durch ergänzende Behandlung mit AMG der
jeweiligen Produkte C und D) und
- – der
Produkte K und L (erhalten durch ergänzende Behandlung mit α-TGase der
jeweiligen Produkte C und D),
-
-
Die
Osmolalität
und der Gehalt an reduzierenden Zuckern, die steigen, bringen hier
hauptsächlich
die begleitende Erzeugung von Glukose, DP2 (Maltose und Isomaltose)
zum Ausdruck, die somit entfernt werden müssen, um die hochverzweigten
Glukose-Polymere gemäß der Erfindung
zu erhalten.
-
Es
wird gewählt,
eine Fraktionierung durch Ultrafiltration auf Membran mit einem
Abtrennungs-Schwellenwert von 5000 Dalton (Membran 5K AMICON) zu
verwenden.
-
Die
für die
Produkte der Ultrafiltration M, O, Q, S der jeweiligen Verbindungen
E, G, I und K einerseits (also hervorgegangen aus GLUCIDEX® 2)
und für
die Produkte der Ultrafiltration N, P, R, T der jeweiligen Verbindungen
F, H, J, L (also hervorgegangen aus GLUCIDEX® 6)
erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III dargestellt.
-
-
Die
Ergebnisse bringen die Tatsache zum Ausdruck, dass die so erhaltenen
hochverzweigten Glukose-Polymere die perfekte Ausgewogenheit zwischen
dem Gehalt an glykosidischen Bindungen α-1,6, der merklich gestiegen
ist (bis auf 18%), für
die Produkte aufweisen, die einen solchen Mw-Wert und einen ebenfalls
niedrigen Osmolalitätswert
aufweisen.
-
Die
hochverzweigten Glukose-Polymere können einfach mit anderen Elektrolyten
gemischt werden, um für
die Peritonealdialyse höchst
leistungsfähige
Osmosemittel zu erhalten, oder um so, wie sie sind, in Zusammensetzungen
verwendet zu werden, die dazu bestimmt sind, die Verdauung zu regulieren,
für die
enterale oder parenterale Ernährung,
für Zusammensetzungen,
die für
Diabetiker bestimmt sind, oder auch in flüssigen Getränken, um die Energiereserven
von Sportlern während
einer körperlichen
Anstrengung von langer Dauer aufzufüllen.
-
Es
wird darauf hingewiesen, dass das Verfahren ermöglicht, außer den hochverzweigten Glukose-Polymeren
ebenfalls Fraktionen zu sammeln, die an Maltose und/oder Isomaltose
angereichert sind.
-
Zum
Beispiel sind in dem Fall der Herstellung der Produkte S und T (hervorgegangen
aus der kombinierten Behandlung mit dem Verzweigungsenzym und α-TGase) Isomaltose
und Glukose die einzigen hergestellten Nebenprodukte (in den jeweiligen
Konzentrationen von 25 bis 30 g/l und 75 bis 80 g/l).
-
Auf
gleiche Weise ist in dem Fall der Herstellung der Produkte O und
P (hervorgegangen aus der kombinierten Behandlung mit dem Verzweigungsenzym
und β-Amylase)
Maltose das einzige hergestellte Nebenprodukt (in einer Konzentration
von 130 g/l).
-
Diese
Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht können somit vorteilhafte Quellen
für an
Maltose und/oder Isomaltose reiche Zusammensetzungen sein.
-
Beispiel 2
-
Die
hochverzweigten Glukose-Polymere gemäß der Erfindung können gleichermaßen aus
Standard-Maisstärke
hergestellt werden. Dazu werden 110 g Trockengewicht Stärke trocken
in einem Liter Wasser bei Umgebungstemperatur und unter langsamem
und kontinuierlichem Rühren
in Suspension gebracht.
-
Der
pH wird auf 6,8 bis 7 gebracht und unter diesen Bedingungen für 15 Minuten
stehen gelassen und der pH, falls notwendig, berichtigt. Das Verzweigungsenzym
des gereinigten Glykogen von B. stearothermophilus wird in einem
Verhältnis
zu 4000 U/g des Substrats hinzugefügt und die Temperatur nach
und nach auf 72 bis 75°C
gebracht.
-
Die
Inkubation erfolgt dann unter moderatem Rühren für 30 Minuten bewirkt, danach
Abkühlung
auf eine Temperatur von 65 bis 68°C.
Die enzymatische Reaktion wird für
4 Stunden durchgeführt.
Die Reaktion wird dann durch Absenken des pHs auf einen Wert von
4,5 bis 5 gestoppt, dann für
6 Minuten zum Sieden gebracht.
-
Wie
in Beispiel 1 wird die Reaktion durch Behandlungen mit β-Amylase
oder Amyloglukosidase vervollständigt,
anschließend
durch einen Schritt der Ultrafiltration auf Membran mit einem Abtrennungs-Schwellenwert
von 5000 Dalton unter den bei Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
-
In
Tabelle IV sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst.
-
Die
Standard-Maisstärke
ist mit U bezeichnet, das Produkt der Behandlung mit dem Verzweigungsenzym
V, jene, die ergänzend
behandelt wurden mit β-Amylase:
mit W, mit AMG: mit X, die ultrafiltrierten Endprodukte: mit Y und
Z.
-
-
Die
erhaltenen Produkte Y und Z weisen die gleichen ausgewogenen Profile
auf wie die bei Beispiel 1 beschriebenen Produkte und können somit
vorteilhafterweise in den gleichen Anwendungsbereichen verwendet
werden.
-
Beispiel 3
-
Zwei
andere hochverzweigte Glukose-Polymere werden aus zwei Arten von
an Amylopektin reicher Stärke
unter industriellen Bedingungen hergestellt. Es handelt sich um
zwei Proben verflüssigter
saurer Waxy-Maisstärke
mit einem Fluidifikationsgrad WF von ungefähr 90, ebenfalls von der Anmelderin
unter dem Markennamen CLEARGUM® CB 90 vermarktet.
-
In
der Tabelle V sind die angewendeten Verfahrensbedingungen dargelegt,
um zu den hochverzweigten Glukose-Polymeren gemäß der Erfindung zu gelangen.
-
-
Tabelle
VI stellt die erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich Gehalt an glykosidischen
Bindungen α-1,6, Mw-Werten,
Gehalt an reduzierenden Zuckern und Osmolalität für die erhaltenen Produkte dar:
- – "a" betrifft das aus CLEARGUM® CB
90 hervorgegangene Produkt nach einer Behandlung mit dem Verzweigungsenzym
und Amyloglukosidase und
- – "b" betrifft das aus CLEARGUM® CB
90 hervorgegangene Produkt nach einer Behandlung mit dem Verzweigungsenzym
und β-Amylase.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass das verwendete Verfahren es ermöglicht,
hochverzweigte Glukose-Polymere gemäß der Erfindung unabhängig von
der als Grundlage gewählten
Stärke
oder dem als Grundlage gewählten
Stärkederivat
zu erhalten.
-
Beispiel 4
-
Es
werden wässrige
Lösungen
aus hochverzweigten Polymeren gemäß der Erfindung hergestellt,
die mit Amylase pankreatischem Ursprungs in Kontakt gebracht werden.
Die Hydrolyse durch Amylase wird über die Zeit durch das Messen
der gebildeten reduzierenden Zucker und das Messen von Glukose,
die in dem Reaktionsmedium entsteht, verfolgt. Dieser Test ermöglicht es,
die Widerstandsfähigkeit
der Polymere gegen Hydrolyse durch Amylase zu bewerten, welche ein
wesentliches Kriterium bei der Wahl eines Osmosemittels für eine Dialyselösung darstellt.
-
Mehrere
Polymere gemäß der Erfindung
wurden im Vergleich zu Icodextrin (Osmosemittel im Stand der Technik)
getestet. Die Polymere werden so gewählt, dass sie ein Molekulargewicht
nahe dem des Letztgenannten aufweisen:
Produkte A und B werden
gemäß Beispiel
3 hergestellt und Produkt Z gemäß Beispiel
2 hergestellt.
-
Das
Icodextrin wird gemäß dem in
der Beschreibung genannten Patent
EP
667.356 hergestellt.
-
Ein
Maltosevergleich wird hergestellt, um das in vitro-Modell der enzymatischen
Verdauung zu bestätigen.
-
Die
Verfahrensbedingungen für
die Amylase-Verdauung sind wie fölgt:
- – Abwiegen
von ungefähr
0,6 g des Produkts, um die Genauigkeit zu testen
- – Hinzufügen von
150 ml Maleatpuffer von Na mit pH 7 zu 0,1 mol/l,
- – Rühren, bis
sich das Produkt aufgelöst
hat,
- – Entnehmen
von 1,5 ml der erhaltenen Lösung
(Anfangslösung
= si),
- – Anordnen
der Kolben im Wasserbad für
15 Minuten, damit die Temperatur der Lösung 37°C beträgt,
- – Hinzufügen von
0,15 g Pankreatin vom Schwein (α-Amylase
tierischer Herkunft),
- – Inkubieren
bei 37°C
im Temperaturbad unter Rühren
für 300
Minuten fTA,
- – Durchführen von
Entnahmen von 1,5 ml zu den Zeiten: 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180,
240, 300 Minuten,
- – Anhalten
der enzymatischen Reaktion, indem die Entnahmen in einem Trockenbad
bei 100°C
für 10
Minuten angeordnet werden,
- – Dosieren
der Glukose auf die Entnahmen, um den Einfluss auf den Blutzucker
des untersuchten Produkts zu simulieren,
- – Dosieren
der reduzierenden Zucker auf die Entnahmen, um die Hydrolysegeschwindigkeit
zu untersuchen.
-
Für das Dosieren
der Glukose wird ein kolorimetrisches Verfahren verwendet, das mit
dem Gerät
HITACHI 704 (ROCHE) durchgeführt
wird. Das verwendete Reagens ist ein Reagens, das die Enzyme GOD/PAP (Glukoseoxidase,
Peroxidase) enthält.
Das Volumen des verwendeten Reagens beträgt 500 Mikroliter, das Volumen
der Probe ist 5 Mikroliter und die Reaktionstemperatur beträgt 30°C.
-
Das
für die
Dosierung der reduzierenden Zucker verwendete Verfahren ist das
Verfahren von SOMOGYI NELSON. In ein verkorktes Rohr werden 200
Mikroliter der Probe eingebracht, es werden 200 Mikroliter der Arbeitslösung (Reagenzien
Natriumtartrat und Kupfersulfat) hinzugefügt. Es wird zum Sieden gebracht, nach
Abkühlen
wird das Reagens Arsenomolybdän
hinzugefügt,
danach Wasser. Die erhaltene Lösung
wird in einer Mikroplatte abgelagert, dann wird die optische Dichte
auf dem Lesegerät
für Mikroplatten
bei einer Wellenlänge
von 520 Nanometern abgelesen.
-
Die
Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen vermerkt:
-
1.
Kinetik des Entstehens von Glukose (freigesetzt in % des Trockengewichts)
-
2.
Kinetik des Entstehens von reduzierenden Zuckern (freigesetzt in
% des Trockengewichts)
-
3.
Zusammenfassung der Ergebnisse
-
Es
wird anhand der erhaltenen Ergebnisse festgestellt, dass je mehr
der Verzweigungsgrad (der Grad an Bindungen α-1,6) steigt, die Hydrolyse
durch Amylase gemindert wird.
-
Die
Letztgenannte ist gleichermaßen
abhängig
von dem Molekulargewicht. Folglich wird, je höher der Verzweigungsgrad ist
und je geringer das Molekulargewicht ist, das Molekül weniger
von Amylase angegriffen.
-
Für eine Verwendung
bei der Intraperitonealdialyse sind die Produkte A und Z besonders
geeignet und weisen eine deutlich höhere Widerstandsfähigkeit
auf als Icodextrin, was bedeutet, dass die Produkte einen gewissen
Vorteil hinsichtlich der Dauer der Osmosekraft und der glykämischen
Kraft bei gleichem Molekulargewicht aufweisen.
-
Beispiel 5
-
Es
werden wässrige
Lösungen
aus hochverzweigten Polymeren gemäß der Erfindung hergestellt,
die mit Amylase pankreatischen Ursprungs und einer Darm-Amyloglukosidase
(Ace tonpulver des Darms) in Kontakt gebracht werden. Die Hydrolyse
wird durch das Messen von Glukose, die in dem Reaktionsmedium entsteht,
verfolgt. Dieser Test ermöglicht
es, die Widerstandsfähigkeit
der Polymere gegen Hydrolyse durch an der Verdauung von Lebensmittel-Kohlenhydraten beteiligte
Enzyme zu bewerten, welche ein wesentliches Kriterium bei der Wahl
eines Nahrungsbestandteils, das in die Zusammensetzung von Formulierungen
für die Verwendung
durch Sportler eingeht oder für
die enterale oder parenterale Ernährung bestimmt ist, darstellt.
-
Mehrere
Polymere gemäß der Erfindung
wurden im Vergleich zu Icodextrin, Glykogen und Standard-Maltodextrin
getestet. Die gewählten
Polymere sind die folgenden:
Produkte A gemäß Beispiel 3 hergestellt, Produkt
Y gemäß Beispiel
2 hergestellt und Produkt Y' gemäß Beispiel
2 aus an Amylopektin reicher Stärke,
die mit dem Verzweigungsenzym behandelt und ultrafiltriert wurde, hergestellt.
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Das
Icodextrin wird gemäß dem in
der Beschreibung genannten Patent
EP
667.356 hergestellt. Das Glykogen ist ein Glykogen aus
Rindsleber, das von der Firma SIGMA-ALDRICH geliefert wird.
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Ein
Vergleich mit Standard-Maltodextrin wird durchgeführt, um
das in vitro-Modell der enzymatischen Verdauung zu bestätigen.
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Die
Verfahrensbedingungen für
die enzymatische Verdauung sind wie folgt:
- – Abwiegen
von ungefähr
0,6 g des Produkts, um die Genauigkeit zu testen
- – Hinzufügen von
150 ml Natriummaleatpuffer mit pH 7 zu 0,1 mol/l,
- – Rühren, bis
sich das Produkt aufgelöst
hat,
- – Entnehmen
von 1,5 ml der erhaltenen Lösung,
- – Anordnen
der Kolben im Wasserbad für
15 Minuten, damit die Temperatur der Lösung 37°C beträgt,
- – Hinzufügen von
0,15 g Pankreatin vom Schwein,
- – Inkubieren
bei 37°C
im Temperaturbad unter Rühren
für 30
Minuten,
- – Durchführen von
Entnahmen von 1,5 ml zu den Zeiten: 0 Minuten und 30 Minuten,
- – Anhalten
der enzymatischen Reaktion, indem die Entnahmen in einem Trockenbad
bei 100°C
für 10
Minuten angeordnet werden,
- – Hinzufügen von
0,15 g Darmschleimhaut von der Ratte,
- – Inkubieren
für 5 h
30 bei 37°C
im Temperaturbad unter Rühren,
- – Durchführen von
Entnahmen von 1,5 ml alle 60 Minuten zu den Zeiten: 60, 120, 180,
240, 300, 330 und 360 Minuten,
- – Anhalten
der enzymatischen Reaktion, indem die Entnahmen in einem Trockenbad
bei 100°C
für 10
Minuten angeordnet werden,
- – Dosieren
der Glukose auf die Entnahmen, um den Hydrolyse-Prozentsatz des
untersuchten Produkts zu berechnen.
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Für das Dosieren
der Glukose wird das gleiche Verfahren wie bei Beispiel 4 verwendet.
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Die
Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen vermerkt:
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1.
Kinetik des Auftretens von Glukose (freigesetzt in % des Trockengewichts)
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2.
Zusammenfassung der Ergebnisse
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Die
Maltodextrine gemäß der Erfindung
sind besonders geeignet für
eine Verwendung als Nahrung für Sportler
oder allgemeiner, um den Blutzucker zu regulieren. Die Produkte
A und Y gemäß der Erfindung
ermöglichen
es, einen Prozentsatz an Glukosefreisetzung zwischen 50 und 70%
zu erhalten oder eine Widerstandsfähigkeit gegen Hydrolyse, die
deutlich besser ist als bei herkömmlichen
Maltodextrinen und vergleichbar mit Glykogen, was bedeutet, dass
die Produkte einen gewissen Vorteil hinsichtlich der glykämischen
Kraft aufweisen und somit vorteilhafterweise einen Ersatz für Glykogen
bilden können,
da sie gleiche Verdauungsmerkmale aufweisen.