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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf Hautverbände zur Applizierung auf einen
Teil eines menschlichen oder tierischen Körpers zur Behandlung der Haut
und bezieht sich insbesondere (aber nicht ausschließlich) auf
Wundverbände
zur Behandlung von beeinträchtigter
oder geschwächter
Haut, insbesondere von Hautläsionen,
d.h. einer Unterbrechung in der Oberfläche der Haut, die entweder
durch Verletzung oder Krankheit verursacht wurde, einschließlich Hautgeschwüre, Verbrennungen,
Schnitte, Punkturen, Laxerationen, stumpfe Traumata, Akneläsionen,
Beulen usw..
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Hintergrund
der Erfindung
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Wunden
werden häufig
infiziert. Wundverbände
können
antiseptische Substanzen tragen und der physikalische Schutz, den
sie bereitstellen, verhindert ein Eindringen von zusätzlichen
infizierenden Mikroben, obgleich dieser mikrobielle Ausschluss selten
absolut ist. Antiseptische Substanzen, die auf dem Verbandskissen getragen
werden, sind üblicherweise
nicht sehr wirksam, möglicherweise,
weil sie nicht leicht mit konstanter Rate in die Wunde diffundieren.
Darüber
hinaus sind die wirksamsten Substanzen, Antibiotika, wegen der immer
präsenten
Probleme einer Entwicklung von Arzneimittelresistenz für eine routinemäßige Verwendung nicht
verfügbar.
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Wasserstoffperoxid
(H2O2) ist eine
bekannte antimikrobielle Substanz mit vielen Vorteilen. Es wird
natürlicherweise
im Körper
durch Leukozyten als Teil der Immunabwehraktivitäten als Reaktion auf eine Infektion produziert.
Es gibt keine bekannten mikrobiellen Fluchtmechanismen, durch welchen
Mikroben seinen Wirkungen entgehen können, und es hat eine kurze
Lebenszeit, zerfällt
schnell zu Wasser und Sauerstoff in den Geweben. Daher akkumuliert
es nicht zu gefährlichen
Konzentrationen. Wenn es topisch anzuwenden ist (z.B. zur Behandlung
von Akne), wird seine Wirksamkeit durch die Tatsache erhöht, dass
es die Hautoberfläche leicht
durchdringt, um die darunter liegenden Stellen einer Infektion zu
erreichen.
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Da
Wasserstoffperoxid derart nützlich
ist, wird es seit vielen Jahren als antimikrobielle Substanz zur Reinigung
von Wunden aller Arten und als biologisch kompatibles allgemeines
Antiseptikum verwendet. Wasserstoffperoxid enthaltende Salben wurden
insbesondere zum Beispiel für
eine Behandlung von Beingeschwüren,
Druckgeschwüren,
kleineren Wunden und Infektion verwendet. Es gibt allerdings Probleme,
die mit der Verwendung von Wasserstoffperoxid verbunden sind. Wasserstoffperoxidlösung ist
sehr instabil und wird leicht zu Wasser und Sauerstoff oxidiert;
außerdem
kann Wasserstoffperoxid bei hoher Konzentration für normale Haut
und Zellen, die für
die Heilung im Wundbett verantwortlich sind, schädigend sein. Es ist sehr schwierig oder
sogar unmöglich,
Wasserstoffperoxid als Teil eines vordosierten Wundverbands zu verwenden:
Seine Instabilität
würde für ein Produkt
eine inakzeptabel kurze Haltbarkeit bedeuten und eine Dosierung
zum Zeitpunkt der Applizierung würde
keine anhaltende Abgabe über
einen einsetzbar längeren
Zeitraum bereitstellen. Bei Verwendung in der Wundbehandlung (wie
z.B. in der britischen Pharmacopöe
beschrieben) werden sehr hohe Konzentrationen (typischerweise 3%)
benötigt,
um einen starken antimikrobiellen Effekt über einen sehr kurzen Zeitraum
zu erreichen. Selbst dieser Typ eines kurzen Stoßes kann wirksam sein, und
zwar wegen der großen
Wirksamkeit von Wasserstoffperoxid, allerdings gibt es noch den
weiteren Nachteil, dass solche hohen Konzentrationen für Wirtszellen
relativ schädlich
sein können
und den Heilungsprozess behindern können. Aus diesem Grund gibt
es die Tendenz, die Verwendung von Wasserstoffperoxid auf eine anfängliche
Reinigung und Sterilisierung von Wunden zu beschränken. Dennoch
ist es eine natürliche
Abwehrsubstanz, die von körpereigenen
Zellen (in niedrigeren Konzentrationen) produziert wird, und es
wird in steigendem Maße
als interzelluläres
und intrazelluläres
Messengermolekül
anerkannt, das in der molekularen Signalübertragung und Regulierung
von Zelle zu Zelle involviert ist. Zweifellos ist Wasserstoffperoxid
möglicherweise
ein sehr nützliches
Molekül,
wenn es in den richtigen Konzentrationen und in geeignetem Zeitverlauf
verwendet werden kann.
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US 4 576 817 schlägt einen
bakteriostatischen faserigen Wundverband vor, der trockene Enzyme
wie Glucoseoxidase und Lactoperoxidase eingearbeitet hat, um z.B.
Wasserstoffperoxid und Hypoiodit bei Kontakt mit Serum zu erzeugen.
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WO
01/28600 offenbart einen Wundverband, der trockene Glucoseoxidase,
trockene Lactoperoxidase und ein Iodidsalz in einer Polymermatrix
enthält.
Die Glucoseoxidase katalysiert eine Oxidationsreaktion von Glucose,
die in Körperflüssigkeiten
einer Wundstelle vorliegt, unter Bildung von Wasserstoffperoxid.
Die Wirkung von Lactoperoxidase auf Wasserstoffperoxid und Iodid
erzeugt elementares Iod, das ein kräftiges antiinfektiöses Mittel
ist.
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Eine
wirksame Wundheilung wird durch verschiedene Faktoren, einschließlich einer
feuchten Umgebung und der Entfernung von Wundexsudat durch Absorption,
begünstigt.
Es wurden oft trockene superabsorbierende Materialien verwendet,
um den Nutzen einer Exsudatentfernung zu erzielen, da diese mit
großer Wirksamkeit
Substanzen leicht aufnehmen und Flüssigkeiten halten, die aus
Wunden exsudieren. Allerdings kann ein hocheffizientes trockenes
absorbierendes Material zu einem nicht hilfreichen Fehlen von Feuchtigkeit führen, und
ein Wundverband, der aus einem solchen Material aufgebaut ist, wird
mit antimikrobiellen Enzymsystemen nicht gut arbeiten, zumindest
nicht, bis der Verband gründlich
mit Wundflüssigkeit
benetzt wurde.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen Hautverband, in einer Verpackung
versiegelt, bereit, wobei der Verband Oxidoreduktase-Enzym und gegebenenfalls
Peroxidase-Enzym umfasst, wobei das Enzym (die Enzyme) in hydratisiertem
Zustand vorliegt (vorliegen). Das Enzym (Die Enzyme) sind demnach
im Verband vor Verwendung des Verbands, d.h. vor Applizierung des
Verbands auf die Haut, in hydratisiertem Zustand.
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Indem
das Enzym (die Enzyme) in hydratisiertem Zustand bereitgestellt
wird (werden), ist das Enzym in einem nassen, aktiven Zustand im
Verband und kann unmittelbar, wenn es mit dem geeigneten Substrat
bei Verwendung des Verbands in Kontakt gebracht wird, wirken. Dies
steht im Gegensatz zu den Verbänden
des Standes der Technik, in denen Enzyme in trockenem Zustand sind
und eine anfängliche
Hydratisierung bei Verwendung erfordern, was das Wirken des Enzyms
verzögert
und demnach auch die antimikrobiellen Effekte. Der hydratisierte
Zustand des Enzyms kann auch ermöglichen,
dass es zu einem feuchten Hydrogel oder einem anderen feuchten Verbandsmaterial
formuliert wird, so dass der Verband Feuchtigkeit an eine trockene Wunde
abgeben kann.
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Der
Verband wird verwendet, indem er auf die Haut eines Menschen oder
eines Tiers, z.B. über
eine Wunde oder eine Hautregion, die zu kosmetischen oder therapeutischen
Zwecken zu behandeln ist, z.B. zur Behandlung von Akne oder anderen
Hautzuständen,
gebracht wird. Das Oxidoreduktase-Enzym katalysiert eine Reaktion
eines geeigneten Substrats mit Sauerstoff unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid.
Das Substrat kann entweder natürlich
in Körperflüssigkeiten
vorliegen und/oder getrennt zugeführt werden und/oder im Verband
eingearbeitet sein. Oxidoreduktase-Enzyme, die zur Verwendung in
der Erfindung geeignet sind, und die entsprechenden Substrate (die
in Blut und Gewebeflüssigkeiten
vorhanden sind), umfassen die folgenden:
Enzym | Substrat |
Glucoseoxidase | β-D-Glucose |
Hexoseoxidase | Hexose |
Cholesterinoxidase | Cholesterin |
Galactoseoxidase | D-Galactose |
Pyranoseoxidase | Pyranose |
Cholinoxidase | Cholin |
Pyruvatoxidase | Pyruvat |
Glycollatoxidase | Glycolat |
Aminosäureoxidase | Aminosäure |
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Das
derzeit bevorzugte Oxidoreduktase-Enzym ist Glucoseoxidase. Dieses
katalysiert die Umsetzung von β-D-Glucosesubstrat
unter Erhalt von Wasserstoffperoxid und Gluconsäure.
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Es
kann ein Gemisch aus Oxidoreduktase-Enzymen verwendet werden.
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Wenn
die Reaktion auf oder in der Nachbarschaft der Haut erfolgt, kann
das so produzierte Wasserstoffperoxid eine lokalisierte antibakterielle
Wirkung haben.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann das auf diese Weise erzeugte Wasserstoffperoxid in einer Zweistufen-Anordnung
eingesetzt werden, wobei das Wasserstoffperoxid eine Reaktion eingeht,
die durch ein Peroxidase-Enzym katalysiert wird, wodurch eine Vielzahl
von Spezies produziert wird, einschließlich reaktiver Sauerstoffintermediate,
die antimikrobielle Eigenschaften haben und die daher eine Förderung
der Wundheilung unterstützen
können.
Für solche
Ausführungsformen
enthält
der Verband ein Peroxidase-Enzym, das vorzugsweise in hydratisiertem
Zustand vorliegt. Als weitere Möglichkeit
kann das Wasserstoffperoxid direkt in nichtkatalysierter Art mit
Substanzen, z.B. Iodidionen, unter Erzeugung von molekularem Iod
reagieren.
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Peroxidase-Enzyme,
die in der Erfindung einsetzbar sind, umfassen Lactoperoxidase,
Meerrettichperoxidase, Iodidperoxidase, Chloridperoxidase und Myeloperoxidase,
wobei Lactoperoxidase derzeit begünstigt wird.
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Es
kann ein Gemisch von Peroxidase-Enzymen eingesetzt werden.
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Die
aktiven Spezies, die durch die Wirkung von Peroxidase produziert
werden, sind schwer zu definieren und werden zu einem gewissen Grad
von der bestimmten in Frage kommenden Peroxidase abhängen. Beispielsweise
wirkt Meerrettichperoxidase ganz anders als Lactoperoxidase. Die
detaillierte Chemie ist durch die Tatsache kompliziert, dass die
Produkte so reaktiv sind, dass sie schnell zu anderen, mit ihnen
in Verbindung stehenden Produkten werden, die auch sehr reaktiv
sind. Es wird angenommen, dass Hydroxylradikale, Singulettsauerstoff
und Peroxid produziert werden, genau wie in den „oxidativen Burst"-Reaktionen, die in Neutrophilen- und
Makrophagen-Leukozyten des menschlichen Körpers identifiziert wurden,
und in der gut bekannten „Fenton"-Reaktion, die auf
den katalytischen Effekten von Eisen (III)-Ionen basiert.
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Der
Verband enthält
eine Quelle für
Wasser, so dass das Enzym oder die Enzyme in hydratisiertem Zustand
vorliegen. Der Verband kann in der Form z.B. eines feuchten Baumwollverbands
sein, oder kann ein strukturiertes Dochtmaterial mit feuchten Ingredienzien
sein. Vorzugsweise enthält
der Verband allerdings ein oder mehrere Gele auf Wasserbasis oder
wässrige
Gele, auch als hydratisierte Hydrogele bezeichnet. Solche Gele können aus
einer Vielzahl von Materialien geformt werden und können eine
Vielzahl von Reagenzien enthalten, wie es unten diskutiert wird.
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Ein
hydratisiertes Hydrogel stellt eine Wasserquelle zum Hydratisieren
des Enzyms oder der Enzyme, zur Förderung einer schnellen Reaktion
und anschließenden
Freisetzung von antimikrobiellen Substanzen bereit. Das Gel kann
auch wirken, um Wasser und andere Materialien, die von einer Wundstelle
exsudiert werden, zu absorbieren, was es möglich macht, dass der Verband
eine wertvolle und nützliche
Funktion erfüllt, indem
solche Materialien von einer Wundstelle entfernt werden. Das hydratisierte
Hydrogel stellt auch eine Quelle für Feuchtigkeit bereit, die
die Funktion haben kann, das Enzym oder die Enzyme im Verband in
hydratisiertem Zustand zu halten, und die bei Verwendung wirken
kann, um eine Wundstelle feucht zu halten, was eine Heilung unterstützt.
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Das
oder jedes Hydrogel umfasst zweckdienlicherweise hydrophiles Polymermaterial.
Geeignete hydrophile Polymermaterialien umfassen Polyacrylate und
-methacralate, z.B. wie sie von First Water Ltd in Form von eigenen
Hydrogelen geliefert werden, einschließlich Poly-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (polyAMPS)
oder Salze davon (z.B. wie in WO 01/96422 beschrieben); Polysaccharide,
z.B. Polysaccharid-Gummi, insbesondere Xanthangummi (z.B. erhältlich unter
der Marke Keltrol); verschiedene Zucker; Polycarbonsäuren (z.B.
erhältlich
unter der Marke Gantrez AN-169 BF von ISP Europe); Poly(methylvinylether-co-maleinsäureanhydrid)
(z.B. erhältlich
unter der Marke Gantrez AN 139, mit einem Molekulargewicht im Bereich
von 20.000 bis 40.000); Polyvinylpyrrolidon (z.B. in der Form von
handelsüblichen
Qualitäten,
die als PVP K-30 und PVP K-90 bekannt sind); Polyethylenoxid (z..
erhältlich
unter der Marke Polyox WSR-301); Polyvinylalkohol (z.B. erhältlich unter
der Marke Elvanol), vernetztes Polyacrylpolymer (z.B. erhältlich unter
der Marke Carbopol EZ-1), Cellulosen und modifizierte Cellulosen,
einschließlich
Hydroxypropylcellulose (z.B. erhältlich
unter der Marke Klucel EEF), Natriumcarboxymethylcellulose (z.B.
erhältlich
unter der Marke Cellulose Gum 7LF) und Hydroxyethylcellulose (z.B.
erhältlich
unter der Marke Natrosol 250 LR).
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In
einem Gel können
Gemische von hydrophilen Polymermaterialien eingesetzt werden.
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In
einem hydratisierten Hydrogel aus hydrophilem Polymermaterial ist
das hydrophile Polymermaterial wünschenswert
in einer Konzentration von wenigstens 1 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens
2 Gew.-%, bevorzugter wenigstens 5 Gew.-%, möglicherweise wenigstens 10
Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels, vorhanden.
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Durch
Verwendung eines Gels, das eine relativ hohe Konzentration (wenigstens
2 Gew.-%) an hydrophilem Polymermaterial enthält, kann das Gel besonders
wirksam zur Wasseraufnahme bei Verwendung des Verbands, z.B. aus
Serumexsudaten beim Kontakt mit einer Wunde, fungieren. Da das Gel
ein wässriges
System ist, hat eine Verwendung des Verbandes keinen Effekt eines
Induzierens einer Gesamttrockenheit der Wunde, was. unerwünscht wäre. Der
Grund ist, dass ein Wasserdampfdruck in der geschlossenen Umgebung, die
die Haut bei Verwendung des Verbandes umgibt, aufrechterhalten wird.
Das Gel fungiert somit als absorbierende Einheit zur Entfernung
von Feuchtigkeit, z.B. Wundexsudat, die auch einen hilfreichen Untergrundlevel
an Feuchtigkeit liefert.
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Das
Wasseraufnahmevermögen
eines hydratisierten Hydrogels, einschließlich eines Hochkonzentrationsgels,
ermöglicht
es dem Verband, die Wundheilung durch Entfernung von wesentlichen
Mengen an Exsudaten zu unterstützen,
wobei er aufquillt, wenn er es tut. Durch Verwendung eines sorgfältig formulierten,
bereits hydratisierten Gels wird verhindert, dass die Wunde einen
Zustand wenig dienlicher Trockenheit erreicht. Eine fertige Hydratisierung
stellt auch die schnelle Bildung einer flüssigen Grenzfläche zwischen
dem Verband und der Wunde sicher, wodurch eine Adhäsion verhindert
wird, die andernfalls ein einfaches Abheben des Verbands, wenn er
zu wechseln ist, stören
würde.
Eine gute flüssige
Grenzfläche
zwischen der Wunde und dem Verband ist auch dahingehend wichtig,
dass die antimikrobiellen Produkte der Enzyme durch die gesamte
verfügbare
Oberfläche
in die Wunde eintreten können.
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Das
Gel oder jedes Gel kann verschiedene Reagenzien, einschließlich eines
oder mehrerer der folgenden, enthalten:
ein Oxidoreduktase-Enzym
oder mehrerer Oxidoreduktase-Enzyme;
ein Perodixase-Enzym oder
mehrere Peroxidase-Enzyme;
Substrat für das Oxidoreduktase-Enzym
(unten zu diskutieren);
eine Quelle für Iodidionen (unten zu diskutieren);
Glycerin
(das als Netzmittel und Feuchthaltemittel wirkt), typischerweise
in einer Menge von bis zu 20 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des
Gels.
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Das
Enzym oder die Enzyme können
insbesondere in einem oder in mehreren hydratisierten Hydrogelen
vorliegen.
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Zum
Beispiel kann eines der Enzyme, das Oxidoreduktase-Enzym oder das
Peroxidase-Enzym,
in einem Gel vorliegen, z.B. in einem wässrigen, hydrophilen Hochkonzentrationspolymermaterialgel.
Als weitere Möglichkeit
können
beide Enzyme in einem Gel vorliegen, z.B. in einem Hochkonzentrationsgel.
Eine weitere Option ist, dass jedes Enzym in einem entsprechenden
Gel vorliegt, z.B. einem wässrigen
hydrophilen Hochkonzentrationsgel.
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Als
weitere Möglichkeit
kann der Verband ein einzelnes hydratisiertes Hydrogel (z.B. aus
Poly-AMPS) umfassen, das keine Enzyme enthält, aber möglicherweise Substrat für das Oxidoreduktase-Enzym
enthält (z.B.
eine Glucosequelle für
Glucoseoxidase), das zusätzlich
oder alternativ eine Zufuhr von Iodidionen (z.B. in Form eines oder
mehrerer Iodidsalze) enthält
und gegebenenfalls auch Glycerin enthält.
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Das
Gel oder jedes Gel kann vernetzt sein. Zum Beispiel kann das Gel
ein Alginatgel, z.B. aus Alginsäure
geformt, die in bekannter Weise z.B. durch Verwendung von Calciumchlorid vernetzt
wurde, umfassen. Vernetzte Gele bilden eine einschließende Biopolymermatrix,
die das Enzym innerhalb des Gels zurückhalten kann, wenn der Vernetzungsgrad
ausreichend dicht ist, was die Freisetzung des Enzyms in das Wundbett
bei Verwendung des Verbands verhindert. Das Gel kann in Form von
Kügelchen,
Perlen, Platten oder extrudierten Fäden usw. sein.
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Das
hydratisierte Hydrogel, insbesondere ein vernetztes Gel, kann um
eine mechanische Verstärkungsstruktur,
z.B. ein Blatt aus Baumwollgaze oder ein inertes flexibles Sieb,
gegossen werden, beispielsweise, um eine strukturell verstärkte Hydrogelschicht
oder -platte bereitzustellen.
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Das
hydratisierte Hydrogel kann alternativ in Form eines nicht-vernetzten,
sich durch Scherung verdünnenden
Gels sein, z.B. aus geeigneten Gummen, wie Xanthangummi (z.B. erhältlich unter
der Marke Keltrol); in diesem Fall allerdings ohne eine mechanische
Verstärkungsstruktur.
Solche Gummen sind flüssig, wenn
sie einer Scherbeanspruchung unterworfen werden (z.B. wenn sie gegossen
oder durch eine Düse
gequetscht werden), härten
aber, wenn sie statisch sind. Demnach kann das Gel in Form einer
gießbaren
Komponente sein, was die Herstellung von Gelen im Verband erleichtert.
Ein derartiges sich durch Scherung verdünnendes Gel kann auch in Kombination
mit einem vorgeformten, mechanisch verstärkten Gel verwendet werden,
wie es oben diskutiert wurde.
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Das
wasserabsorbierende Gel kann eine erhöhte Konzentration an hydrophiler
Substanz verwenden, welche das tatsächliche Gel-bildende Polymermaterial,
z.B. Polysaccharid, selbst sein kann oder es kann eine zusätzliche
Substanz allein zum Zwecke der Wasserabsorption in das Gemisch gegeben
werden. Ein Beispiel dieses Typs eines funktionellen Gemisches ist
das, das durch eine Kombination von vernetztem Alginat mit etwa
2 Gew.-% und Xanthangummi mit etwa 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf
das Gesamtgewicht des Gels, gebildet wird. Eine besonders begünstigte
Version ist die eines kovalent gebundenen polymeren Hydrogels, z.B. Poly-AMPS,
das stark wasserabsorbierend ist, das fähig ist, große Volumina
an Wasser oder wässrigen
Lösungen
aufzunehmen.
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Das
Enzym oder die Enzyme können
in einem Gel in einer Reihe von möglichen Formen, einschließlich in
Lösung
als freie Moleküle,
vorliegen. Um die Retentionswirksamkeit der Enzyme in Gel zu verbessern, können die
Enzyme chemisch aneinander konjugiert sein, chemisch an andere Moleküle (z.B.
Polyethylenchinin) konjugiert sein oder in einem festen Träger, z.B.
Perlen, eingebaut sein.
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Gele
verschiedenen Typs, z.B. vernetztes Alginat und sich durch Scherung
verdünnend,
können
zusammen in einem einzelnen Verband verwendet werden. Gute Resultate
wurden mit einem sich durch Scherung verdünnenden Gel, das bei Verwendung
der Haut am nächsten
kommt, und einem vernetzten strukturell verstärkten Gel von der Haut entfernt
erhalten.
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Das
Enzym oder die Enzyme können
immobilisiert sein, so dass verhindert wird, dass sie in die Wunde freigesetzt
werden, wo sie das Potential hätten,
unerwünschte
allergische Reaktionen auszulösen
(sie stammen im Allgemeinen von nicht-menschlichen Quellen, z.B.
stammt die im Handel am meisten verfügbare Glucoseoxidase von dem
Pilz Aspergillus niger und Lactoperoxidase wird typischerweise aus
Kuhmilch extrahiert), und auch für
einen Abbau durch die Wirkung von Proteasen, die in einer Wunde
vorhanden sind, anfällig sein.
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Ein
Enzym kann in bekannter Art immobilisiert werden, z.B. indem es
irreversibel an einen festen Träger,
z.B. ein Partikel, eine Perle oder eine Faser, z.B. aus Cellulose,
Siliziumdioxid, Polymer usw., gebunden wird, wobei dem Fachmann
bekannte Kopplungsverfahren verwendet werden. Ein Einbau eines Enzyms
in ein vernetztes Alginatgel, wie es oben diskutiert wurde, z.B.
in Form von Kügelchen,
Platten oder extrudierten Fäden,
hat ebenfalls den Effekt, die Enzyme zu immobilisieren. Bekannte
Einkapselungstechniken unter Verwendung von Polyamid sind ebenfalls
geeignet.
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In
Ausführungsformen,
die Oxireduktase-Enzym und Peroxidase-Enzym verwenden, können die
zwei Enzyme in getrennten hydratisierten Hydrogelen lokalisiert
sein, wobei das Oxidoreduktase-Enzym in einem ersten hydratisierten
Gel lokalisiert ist und die Peroxidase in einem zweiten hydratisierten
Gel lokalisiert ist. Das erste und das zweite hydratisierte Gel
können,
wenn es erforderlich ist, in verschiedenen Bereichen des Verbands
lokalisiert sein. Der Verband hat wünschenswerterweise einen geschichteten,
gefächerten
(stratified) Aufbau, der z.B. eine obere (äußere) Schicht aus einem Gel
und eine untere (innere) Schicht aus einem anderen Gel umfasst.
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Beispielsweise
kann das erste Gel (mit Oxidoreduktase-Enzym) in der Nähe der äußeren Teile
des Verbands, d. h. von der Haut entfernt bei Verwendung, lokalisiert
sein, wo die Sauerstoffkonzentrationen am höchsten sind, während das
zweite Gel (mit Peroxidase-Enzym)
in der Nähe
der inneren Teile des Verbands, d.h. bei Verwendung der Haut benachbart,
lokalisiert ist, so dass die antimikrobielle Spezies (von denen
wenigstens einige infolge ihrer extremen Reaktivität sehr kurzlebig
sind), die dadurch produziert werden, sehr nahe an der Haut sind
und nicht verbraucht werden, bevor sie die gewünschte Wirkstelle erreichen.
In diesem Fall hat der Verband einen geschichteten, gefächerten
Aufbau, der eine obere (äußere) Schicht
aus dem ersten Gel und eine untere (innere) Schicht aus dem zweiten
Gel umfasst. Allerdings legen Experimente nahe, dass die relative
Lokalisierung der zwei Enzyme nicht kritisch ist.
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Einige
Verbandstypen enthalten wünschenswerterweise
eine Schicht aus Barrierematerial, die bei Verwendung an der Grenzfläche mit
der Haut ist, z.B. angrenzend an das zweite Gel (mit Peroxidase-Enzym) in
der obigen Anordnung, um ein unerwünschtes Eintreten von Catalase
aus der Haut in den Verband, z.B. aus Wundflüssigkeit oder aus Mikroben,
die den Bereich besiedeln, zu verhindern. Ein Eindringen von Catalase
in den Verband ist unerwünscht,
da dieses Enzym mit der Peroxidase zur Reaktion mit Wasserstoffperoxid
in Wettbewerb treten würde
und somit die Wirksamkeit reduzieren würde. Geeignetes Barrierematerial
umfasst z.B. eine semipermeable Folie oder Membran mit einer relativ
niedrigen Molekulargewichts-Ausschlussgrenze, die für die antimikrobielle
Spezies, die durch die peroxidative Peroxidase produziert wird,
permeabel ist, für
Catalase aber nicht durchlässig
ist. Geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt und umfassen
Celluloseacetatfilm, z.B. der, der zur Herstellung von Dialysemembranen
verwendet wird, mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von
etwa 15 kD.
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Wie
oben erwähnt
wurde, enthält
der Verband wünschenswerterweise
eine Quelle für
Substrat für
das Oxidoreduktase-Enzym, z.B. Glucose für Glucoseoxidase. Vorzugsweise
ist die Glucose in der Form von reinem Material mit pharmazeutischer
Qualität.
Glucose kann auch in Form von Honig zugeführt werden, der natürlicherweise
andere Vorzüge
liefert, z.B. Heilung und antimikrobielle Faktoren. Das Substrat
wird vor Verwendung des Verbandes wünschenswerterweise physikalisch
von dem Oxidoreduktase-Enzym getrennt, um eine vorzeitige Reaktion
zu verhindern, obgleich, da Sauerstoff für eine Reaktion erforderlich
ist, unter der Voraussetzung, dass die Sauerstoffzufuhr begrenzt
ist, nur eine geringe Reaktion auftreten kann. Dies wird unten diskutiert
werden. Das Substrat kann in einem Einschluss aus einem semipermeablen
Membranmaterial, z.B. Material wie solches, das als Dialysemembran
verwendet wird, beispielsweise Celluloseacetat (das oft auch als „Visking
Tubing" bekannt
ist), oder in einer Gelplatte oder einem Gelkissen, z.B. aus Agarose,
enthalten sein. Eine solche Gelplatte oder ein Gelkissen ist wünschenswerterweise
um eine mechanische Verstärkungsstruktur,
z.B. ein Blatt aus Baumwollgaze usw., wie es oben diskutiert wurde,
gegossen. Das Substrat kann zweckdienlicherweise in Form eines sich durch
Scherung verdünnenden
Gels, beispielsweise eines geeigneten Gummis wie Xanthangummi, was
oben diskutiert wurde, vorzugsweise ohne mechanische Verstärkungsstruktur
für eine
gießbare
Produktion, sein. Das Substrat kann alternativ in einem hydratisierten
Gel, z.B. aus einem hydrophilen Polymermaterial, wie es oben diskutiert
wurde, vorliegen. Das Substrat, z.B. Glucose, ist typischerweise
in einer Menge bis zu etwa 25 Gew.-% des Gewichts des Verbandes
vorhanden.
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Es
ist hilfreich, die relativen Mengen an Enzym und Substrat so gegeneinander
abzuwägen,
dass es einen Überschuss
an Wasserstoffperoxid gibt, der, obgleich weniger wirksam als die
Produkte der Lactoperoxidasewirkung, über eine längere Zeit wirken kann als
reaktivere Spezies. Es wird auch angenommen, dass Wasserstoffperoxid
die Bildung von neuen Blutgefäßen bei
der Wundheilung (Angiogenese oder neovaskuläres Wachstum) stimulieren kann,
die Proliferation von neues Gewebe bildenden Zellen stimulieren
kann und Enzyme (Proteasen) aktivieren kann, die zur Unterstützung der
Neuformung des sich entwickelnden neuen Gewebes verantwortlich sind.
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Das
Substrat, z.B. Glucose, kann in verschiedenen Formen vorliegen,
einschließlich
gelöst
innerhalb einer hydratisierten Hydrogelstruktur, kann als sich langsam
auflösender
Feststoff vorliegen oder in einer anderen Struktur zur langsamen
Freisetzung eingekapselt vorliegen.
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In
der Ausführungsform
eines Verbands mit geschichtetem Aufbau, wie er oben erwähnt wurde,
kann die Substratquelle (bei Verwendung des Verbands) zwischen der
oberen Schicht aus dem ersten Gel, das Oxidoreduktase-Enzym enthält, und
der unteren Schicht aus dem zweiten Gel, das Peroxidase-Enzym enthält, lokalisiert
sein. In diesem Fall kann Oxidoreduktase-Enzym gegebenenfalls auch
im zweiten Gel enthalten sein, um Substrat zu oxidieren, das wahrscheinlich
zu dem zweiten Gel diffundiert. Eine derartige Oxidation ist vom Vorliegen
von Wasserstoff abhängig,
der an dieser Stelle beschränkt
zugeführt
wird, da die Oxidationsreaktion proportional zu dem verfügbaren Sauerstoff
ist.
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Ein
einer anderen alternativen Anordnung sind das Peroxidase-Enzym und
das Substrat beide im zweiten hydratisierten Gel. In diesem Fall
ist das erste hydratisierte Gel (mit Oxidoreduktase-Enzym) wünschenswerterweise über und/oder
unter dem zweiten Gel in einer geschichteten Anordnung lokalisiert.
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Noch
eine andere Option besteht in einer vierschichtigen Struktur mit
einer oberen Schicht (von der Haut entfernt) aus dem ersten hydratisierten
Gel, die über
einer Substratschicht angeordnet ist, die wiederum über einer
weiteren Schicht aus erstem hydratisiertem Gel liegt, die wiederum über einer
Schicht aus zweitem hydratisiertem Gel am Boden (bei Verwendung
nahe der Haut) liegt.
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Indem
ein Substratüberschuss
bereitgestellt wird, ist der Verband fähig, bei Verwendung zur Erzeugung
antimikrobieller Spezies über
einen ausgedehnten Zeitraum, typischerweise wenigstens zwei Tage,
zu wirken, wobei Substrat enthaltendes hydratisiertes Gel oder Substrat
enthaltende hydratisierte Gele so formuliert ist/sind, dass sie
einen Substratfluss zu den Enzymen verzögern, z.B. durch ausgedehnte
Wasserstoffbindung, um eine Diffusion durch das Hydrogel oder aus
dem Hydrogel, in dem sie ursprünglich
zugeführt
wurden, zu verhindern.
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Die
mikrobielle Wirksamkeit des Systems kann weiter durch den Einschluss
von Iodidionen verstärkt werden,
die durch die Wirkung von Wasserstoffperoxid mit oder ohne katalytische
Wirkung zu elementarem Iod oxidiert werden können (welches ein bekanntes
kräftiges
antimikrobielles Mittel ist, z.B. wie es in WO 01/28600 offenbart
ist). Somit enthält
der Verband wünschenswerterweise
eine Quelle für
Iodidionen, z.B. Kaliumiodid oder Natriumiodid. Da Iod für Wirtszellen
in der Wunde (z.B. Epithelzellen, Keratinocyten, Leukozyten) relativ
toxisch ist, kann es nicht günstig
sei, Iod kontinuierlich bei hoher Konzentration während der
Zeit, in der die Formulierung bei Verwendung in Kontakt mit der
Haut ist, zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach die
Quelle für
Iodidionen, z.B. Iodidsalz, in einer Form mit relativ schneller
Freisetzung, entweder im Substratgel oder in einer zusätzlichen
Membran oder in Gaze oder einer anderen geeigneten Schicht bereitgestellt.
Auf diese Weise wird das Wasserstoffperoxid, das zuerst in einer
ersten Aktivitätsphase
produziert wird, im Wesentlichen in einer Iod-erzeugenden Reaktion
verbraucht, indem die Haut (z.B. die Wunde) einem Iodschwall ausgesetzt
wird, dessen Dauer durch die Menge, Freisetzungsrate und Position der
Iodidquelle kontrolliert werden kann. Ein derartiger Iodschwall
kann bei einer schnellen Befreiung einer Wunde von einer mikrobiellen
Last sehr nützlich
sein und seine relativ kurze Dauer erlaubt eine Heilung, indem eine
Schädigung
an wachsenden Zellen und ihre Reparaturaktivität minimiert wird. Sobald das
Iodid verbraucht ist, kehrt das System in einer anschließenden Aktivitätsphase
automatisch zur Produktion von Wasserstoffperoxid und verwandter
reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zurück, was die Sterilität aufrecht
erhält
und eindringende Bakterien nahe der Haut, z.B. an der Wundoberfläche, abtötet. In
anderen Ausführungsformen kann
es allerdings erwünscht
sein, dass die Quelle für
Iodidionen bei Verwendung einen anhaltenden Iodfluss (und/oder Hypoiodsäure) zur
Freisetzung in die Wunde zusätzlich
(und im Verhältnis)
zu Wasserstoffperoxid aufrechterhält. Die Iodidquelle kann alternativ
zusammen mit der Substratquelle für das Oxidoreduktase-Enzym,
wie es oben diskutiert wurde, z.B. in einem hydratisierten Gel,
lokalisiert sein. Das Iodid kann in verschiedenen Formen vorliegen,
einschließlich
gelöst
in einer hydratisierten Gelstruktur, kann als ein sich langsam auflösender Feststoff
vorliegen oder kann innerhalb einer anderen Struktur zur langsamen
Freisetzung eingekapselt sein. Iodidsalz kann z.B. in einer Menge
von bis zu etwa 2 Gew.-% vorliegen. Allerdings werden selbst in
Abwesenheit von Iodid noch antimikrobielle aktive Intermediate gebildet,
wie es oben diskutiert wurde.
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In
Ausführungsformen,
in denen das Enzym oder die Enzyme nicht in einem oder mehreren
hydratisierten Gelen vorliegen, ist das Enzym oder sind die Enzyme
zweckmäßigerweise
irreversibel an einen inerten Träger
oder Trägerstoff
gebunden. Der Träger
umfasst geeigneterweise eine Gaze, z.B. aus gewebtem Material wie
Baumwolle, oder eine andere geeignete Form von Cellulose usw. Der
Träger
kann in bekannter Weise aktiviert werden, so dass er fähig ist,
mit Protein (Enzym) unter Bildung stabiler Imin-Bindungen zu reagieren, so
dass das Enzym an dem Träger
zurückgehalten
wird. Das befestigte Enzym kann gegebenenfalls mit einem Konservierungsmittel,
z.B. Polyvinylalkohol (PVA), z.B. mit 5%, Saccharose, z.B. mit 10%,
Gelatine, z.B. mit 2%, und/oder Glycerin beschichtet sein, um die
Erhaltung der Enzymaktivität
zu unterstützen.
Der Verband ist so konzipiert, dass das Enzym oder die Enzyme im
Verband in hydratisiertem Zustand vorliegt/vorliegen.
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Kovalent
vernetzte Gele, z.B. Poly-AMPS, können in einfacher Weise so
hergestellt werden, dass sie Enzymmoleküle ausschliessen, während sie
für Wasserstoffperoxid
und Iod permeabel sind. In Gelen mit dieser Natur kann das Enzym
oder können
die Enzyme eingearbeitet werden, indem sie oben auf die Oberfläche eines
Substrat enthaltenden Hydrogels als wässrige Lösung dosiert werden und die
Flüssigkeit
in das Gel einsickern gelassen wird. Obgleich das Wasser das Gel
durchdringt, werden die Enzymmoleküle an der oberen Oberfläche zurückgehalten.
Wenn die Enzymlösung
PVA (z.B. 6% W/V) enthält,
bildet das Enzym/PVA-Gemisch eine dünne hydratisierte Membran,
da das Wasser in das Gel gezogen wird. Außerdem stabilisiert die PVA-Matrix
das Enzym, mit dem es assoziiert ist.
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Es
wurde gefunden, dass Verbände
gemäß der Erfindung
als effiziente Transportmittel für
Sauerstoff aus der Umgebungsatmosphäre zu einer Wundstelle wirken,
was für
die Wundheilung Vorteile hat. Die Rate an Sauerstoff, die durch
einen Verband gemäß der Erfindung
transportiert wird, ist insbesondere größer als die eines ähnlichen
Verbands ohne Oxidoreduktase-Enzym. Der Grund dafür und die
resultierenden Vorteile werden unten beschrieben.
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Wenn
ein herkömmlicher
Verband auf die Oberfläche
einer Wunde aufgebracht wird, ist die Zufuhr von Sauerstoff aus
der Atmosphäre
im Allgemeinen inhibiert und die Wunde verarmt relativ an Sauerstoff
(hypoxisch oder sogar anoxisch). Hypoxie oder schlimmer Anoxie sind
häufig
anzutreffende Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie für eine Wundheilung
sehr schlecht sind, da die für
die Heilung verantwortlichen Zellen (Keratinocyten und Epithelzellen)
und die Leukozyten, die eine Infektion bekämpfen und den Prozess kontrollieren,
alle Sauerstoff benötigen,
wenn sie Erfolg haben sollen. Phagozytische Leukozyten benötigen reichlich
Sauerstoff, wenn sie ihre „respiratory
burst"-Biochemie
betreiben sollen, mit der sie Bakterien abtöten. Collagen ist für die Neubildung
der geschädigten
Gewebe und für
die Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese) essentiell,
welche Collagen-Fasern benötigen,
mit denen sie Kapillarwände
aufbauen. Die Collagen-Synthese kann nur erfolgen, wenn Hydroxylaseenzyme
Lysin und Prolin hydroxylieren können,
wodurch Hydroxylysin und Hydroxyprolin erhalten werden, die beide
essentielle Baublöcke
von Collagen sind. Hydroxylaseenzyme brauchen eine reichliche Sauerstoffzufuhr
für ihr
effizientes Funktionieren. Aus diesen Gründen ist es weithin anerkannt,
dass Wunden gut mit Sauerstoff versorgt werden müssen, wenn sie wirksam heilen,
und es wird oft beansprucht, dass die Sauerstoffzufuhr der geschwindigkeitslimitierende
Faktor bei der Wundheilung sein kann. Es wird angenommen, dass mangelnde
Heilung oft durch das Fehlen von adäquatem Sauerstoff verursacht
wird. Darüber
hinaus inhibiert eine hohe Sauerstoffspannung in einer Wunde das
Wachstum von pathogenen anaeroben Bakterien, die auch für die Erzeugung
von schlechtem Geruch verantwortlich sind.
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Aus
diesen Gründen
sind bestimmte sekundäre
Verbände,
z.B. Tegaderm von 3M Healthcare Ltd oder OpSite von Smith & Nephew (Tegaderm
und OpSite sind Marken) aus dünnem
Polyurethanfilm, der an einer Seite mit einer Klebstoffschicht beschichtet
ist, hergestellt. Diese werden als für Sauerstoff (und Wasserdampf) als
relativ permeabel vermarktet, und zwar infolge ihrer besonderen
Molekülstruktur
und ihres dünnen
Querschnitts. Dies ist ein rein passiver Effekt und die Effizienz
der Sauerstoffpermeation steht in umgekehrter Beziehung zu der Dicke
des Films.
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Hydrogele
sind für
Sauerstoff nicht sehr permeabel, da die in erster Linie aus Wasser
bestehen und Sauerstoff in Wasser nicht sehr löslich ist. Ihre Permeabilität für Sauerstoff
wird auch in umgekehrter Beziehung zu der Dicke des Verbandes stehen.
Bis zum Auftreten der vorliegenden Erfindung bestand der einzige Weg
zur Erhöhung
der Sauerstoffkonzentrationen in einer Wunde in der Verabreichung
von Sauerstoff an den Patienten, entweder durch Erhöhung der
Menge im Blut (z.B. indem veranlasst wird, dass der Patient Sauerstoff-angereicherte
Luft atmet oder Patient in eine hyperbarische Sauerstoffumgebung
gebracht wird, z.B. wie sie in einer Druckkammer verfügbar ist)
oder indem gasförmiger
Sauerstoff auf die Wunde selbst angewendet wird.
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Wie
oben betont wurde, haben Verbände
gemäß der Erfindung
die Fähigkeit,
Sauerstoff effizient von der Umgebungsatmosphäre außerhalb der Wunde in das Wundbett
zu transportieren, und zwar speziell in Fällen, in denen der Verband
eine Schicht aus Oxidoreduktase-Enzym, z.B. Glucoseoxidase, an der äußeren Oberfläche in Kontakt
mit der Umgebungsatmosphäre
umfasst. Sauerstoff aus der Umgebungsatmosphäre wird in Wasserstoffperoxid
umgewandelt (katalysiert durch das Oxidoreduktase-Enzym). Wasserstoffperoxid ist
in Wasser viel mehr löslich
als molekularer Sauerstoff, so ist der Wasserstoffperoxidtransport
durch den Verband (typischerweise durch ein oder mehrere hydratisierte
Hydrogele) im Allgemeinen viel effizienter und schneller als der
von molekularem Sauerstoff ist. Wasserstoffperoxid diffundiert somit
rasch durch den Verband. Wenn das Wasserstoffperoxid auf Catalase
trifft (die natürlicherweise
in einer Wunde vorliegt oder die als eine Komponente des Verbands
enthalten sein kann), zerfällt
es in Sauerstoff und Wasser. Auf diese Weise wird Sauerstoff in
Form von Wasserstoffperoxid weitaus effizienter durch den Verband
transportiert, als es der Transport von molekularem Sauerstoff ist.
Experimente haben gezeigt, dass die Rate des Sauerstofftransports in
Verbänden
gemäß der Erfindung
im Vergleich zu ähnlichen
Verbänden
ohne Oxidoreduktase-Enzym mehr als verdoppelt werden kann. Die resultierenden
erhöhten
Sauerstofflevel verstärken
den Heilungsprozess, wie es oben beschrieben wurde.
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Der
Verband enthält
zweckmäßigerweise
eine Deckschicht oder eine äußere Schicht
zum Ankleben des Verbands an die Haut eines Menschen oder eines
Tiers (in bekannter Weise) oder wird damit verwendet. Wenigstens
ein Teil der Abdeckung sollte aus Sauerstoff-permeablem Material sein, um zu ermöglichen,
dass Sauerstoff aus der Umgebungsluft durch die Deckschicht geht
und in den Körper
des Verbandes bei Verwendung eintritt, wo er als Cosubstrat der
durch Oxidoreduktase katalysierten Reaktion benötigt wird. Das Sauerstoff-permeable Material
kann in Form eines „Fensters" sein, das in einer
ansonsten relativ Sauerstoff-undurchlässigen Deckschicht, die beispielsweise
aus robusterem Material besteht, eingesetzt ist.
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Optional
enthält
die Deckschicht ein Fenster (oder ein weiteres Fenster), in dem
oder durch das Indikatormittel gesehen werden können, z.B. eine Indikatorfolie
oder eine ähnliche
Struktur, die anzeigt (z.B. durch Farbänderung), wenn die Verbandschemie
aktiv ist. Gegebenenfalls kann ein weiterer Indikator bereitgestellt werden,
der anzeigt (z.B. durch Farbänderung),
wenn die Verbandschemie aufgehört
hat.
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Eine
weitere nützliche
Option ist die Bereitstellung von immobilisiertem Catalase-Enzym
an der inneren Oberfläche
der Deckschicht (z.B. sichergestellt, dass sie dafür adhäsiv ist).
Dieses wird schnell zur Zersetzung von überschüssigem Wasserstoffperoxid,
das aus einem Wundbereich entweichen kann, wirken. Dieses Merkmal
wird wirksam einen schädigenden
Aufbau von Wasserstoffperoxid in Bereichen normaler unbeschädigter Haut
verhindern.
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Der
Verband kann als ein Mehrkomponentensystem mit verschiedenen getrennt
verpackten Elementen zum Zusammenbau und zur Verwendung durch einen
Endverbraucher gemäß den gelieferten
Instruktionen geliefert werden. In Ausführungsformen, die eine Substratquelle
enthalten, z.B. Glucose, kann diese insbesondere getrennt verpackt
von anderen Komponenten, insbesondere dem Oxidoreduktase-Enzym,
geliefert werden, um eine vorzeitige Oxidationsreaktion zu verhindern.
Alternativ kann der Verband faltbar sein. Eine typische Ausführungsform
dieser Art umfasst eine lineare Anordnung von verbundenen Platten
oder Plättchen, die
eine Platte aus dem ersten hydratisierten Gel, eine Platte aus dem
zweiten hydratisierten Gel und eine Platte aus Substrat umfassen,
wobei benachbarte Platten durch ein entsprechendes Scharnierteil
verbunden sind. Hydrophobes Barrierematerial, z.B. Wachs, ist wünschenswerterweise
in die Scharnierteile imprägniert,
um eine laterale Diffusion zu verhindern. Gute Resultate wurden
mit einer Ausführungsform
erzielt, die in Sequenz eine Platte aus Substrat, eine Platte aus
zweiten hydratisiertem Hydrogel (enthaltend Peroxidase-Enzym) und eine
Platte aus erstem hydratisiertem Hydrogel (enthaltend Oxidoreduktase-Enzym)
umfasst, wobei benachbarte Platten durch einen entsprechenden faltbaren
Scharnierteil verknüpft
sind. Um einen solchen Verband zur Verwendung vorzubereiten, werden
die zwei äußeren Platten
gefaltet, um die Substratplatte über
die Platte aus zweitem Gel zu bringen und die Platte aus erstem
Gel über
die Substratplatte zu bringen, wodurch eine geschichtete Anordnung
gebildet wird, wie sie oben beschrieben wurde. Die resultierende
geschichtete Anordnung wird auf die Haut, z.B. eine Wunde, mit der
Platte aus zweitem Gel in Kontakt mit der Haut gelegt und kann z.B.
durch Verwendung einer Klebstoffdeckschicht an Ort und Stelle gehalten
werden.
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Eine
Komponente oder mehrere Komponenten des Verbands können in
einem Einschluss, z.B. einem Sachet oder Beutel aus Barrierematerial
enthalten sein, der/das für
Sauerstoff, Wasser und Wasserstoffperoxid permeabel ist, aber eine
unerwünschte
Migration von Materialien verhindert. Ein solcher Einschluss hat
inter alia den Effekt, möglicherweise
störende
Substanzen, z.B. Catalase, Eisenionen usw., daran zu hindern, von
einer Wundstelle in den Verband aufgenommen werden. Der Einschluss
kann auch eine unerwünschte Migration
von Enzym(en) in eine Wunde verhindern. Geeignetes Barrierematerial
umfasst z.B. eine semipermeable Folie oder Membran, z.B. Celluloseacetat
oder Celluloseester, z.B. eine, die nur für Moleküle mit einem Molekulargewicht
von weniger als 350 Da durchlässig
ist (möglicherweise
mit einer nominalen Gewichtsausschlussgrenze von 500 Da, aber mit
einer tatsächlichen
Grenze von kleiner als 350 Da). Geeignete Membranen umfassen Celluloseacetatmembran,
Code Z368024, geliefert von Sigma, Spectrum SpectraPor-Celluloseestermembran,
Code 131054, geliefert von NBS Biologicals, und derzeit begünstigt,
insbesondere für
eine Antiakneverband, Polyurethan, z.B. Tegaderm-Film von 3M (Spectrum,
SpectraPor und Tegaderm sind Marken).
-
Die
Wasser-absorbierenden Komponenten des Verbands können in einfacher Weise auf
die Wunde oder die Infektionsstelle appliziert werden, speziell
wenn sie in einer verarbeitbaren oder fließfähigen Form formuliert sind.
Es gibt viele mögliche
Formulierungen, die diesen Effekt erreichen, und diese können durch
einfaches Experimentieren in einfacher Weise bestimmt werden. Solche
Formulierungen können
mit besonderer Leichtigkeit und Bequemlichkeit aus komprimierbaren
Tuben oder spritzenartigen Röhren
(mit einem Kolben) mit einer Düse
mit etwa 3 mm Durchmesser appliziert werden. Es kann speziell hilfreich
sein, die Komponenten in einer einfachen Anordnung aus zwei oder
mehr Röhren
zuzuführen,
wenn dies durch die besondere Verwendungsformulierung erforderlich
ist, so dass das gewünschte
Gemisch aus Gelen durch eine einzelne Betätigung auf eine bestimmte Stelle
ausgedrückt
werden kann. Solche Mehrröhrenanordnungen
sind gut bekannt und werden in der Industrie für andere Anwendungen häufig eingesetzt.
Diese Anordnung genügt
perfekt und zweckmäßig dem
Bedarf, die Gele bis zum Verwendungszeitpunkt getrennt voneinander
zu halten. Es wurde auch festgestellt, dass eine Komponente oder
mehrere Komponenten aus einem Druckbehälter appliziert werden kann/können, so
dass das Gel als Schaum, Spray oder sogar als Aerosol appliziert
wird. Innerhalb der hier gegebenen Richtlinien kann die Formulierung,
die die bestimmten physikalischen Eigenschaften (Viskosität usw.)
liefert, die für
diesen Abgabemodus erforderlich sind, durch einfaches Experimentieren
leicht bestimmt werden. Verarbeitbare Kunststoffgele aus Tuben oder
unter Druck gesetzte Abgabegele können in Kombination mit strukturierten
Platten verwendet werden, um eine passende Anordnung der Grundingrendienzien
zu liefern.
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Verbände mit
geschichtetem Aufbau bzw. Schichtaufbau, die sich durch Scherung
verdünnende
Gele umfassen, können
in einfacher Weise hergestellt werden, z.B. vom Endverbraucher,
indem die Gele in geeigneter Reihenfolge aufeinander gegossen oder
getropft werden, um eine gewünschte
geschichtete Anordnung von Gelen zu erzeugen. So können die
verschiedenen Verbandskomponentengele in getrennten Behältern, z.B.
Tuben oder Flaschen oder möglicherweise
einem Mehrkompartimentbehälter,
geliefert werden. Die verschiedenen Gele können zur Identifizierungsvereinfachung
mit geeigneterweise gefärbtem
Latex farbkodiert sein. Die Gele können direkt auf die Haut eines
Verbrauchers appliziert werden. Eine Deckschicht oder eine äußere Schicht
braucht bei solchen Ausführungsformen
nicht erforderlich zu sein.
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Verbände gemäß der Erfindung
(oder Komponenten davon) werden geeigneterweise in sterilen, versiegelten,
wasserundurchlässigen
Verpackungen, z.B. laminierten Aluminiumfolien-Taschen geliefert.
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Verbände gemäß der Erfindung
können
in einem Bereich verschiedener Größen und Formen zur Behandlung
von Bereichen der Haut, z.B. Wunden verschiedener Größen und
Gestalt, hergestellt werden. Geeignete Mengen an Enzymen und Substraten
und Iodid, wenn vorhanden, können
für einen
bestimmten Verband experimentell leicht bestimmt werden.
-
Die
Erfindung wird durch Erläuterung
in den folgenden Beispielen und anhand der beigefügten Zeichnungen
näher beschrieben,
wobei:
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1 bis 6 schematische
Querschnittsdarstellungen von 6 verschiedenen Ausführungsformen von
Wundverbänden
gemäß der Erfindung
sind.
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Detaillierte
Beschreibung von Ausführungsformen
-
Was
die Figuren angeht, so stellen die 1 bis 4 verschiedene
unterschiedliche Ausführungsformen
von Wundverbänden
gemäß der Erfindung
schematisch dar. In all diesen Zeichnungen stellt ein kreuzschraffiertes
Element ein Sachet einer semipermeablen Membran, z.B. Celluloseacetat,
oder eine Gelplatte, enthaltend eine wässrige Lösung von Glucose und Kaliumiodid,
dar; ein Element mit fetten Schraffierungslinien, die sich von oben links
nach unten rechts erstrecken, stellt eine hydratisierte Hydrogelplatte
dar, die Glucoseoxidase im Gel eingeschlossen enthält; und
ein Element mit fetten Schraffierungslinien, die sich von oben rechts
nach unten links erstrecken, stellt eine hydratisierte Hydrogelplatte
dar, die Lactoseperoxidase im Gel eingeschlossen enthält.
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Ausgefüllte Kreise
stellen Kügelchen
aus Alginatgel (typischerweise etwa 2 mm im Durchmesser) dar, die
Glucoseoxidase eingeschlossen enthalten. Alternativ könnten andere
Gele (z.B. Agarose) oder Polymere verwendet werden, um Kügelchen
zu bilden. Glucose ist fähig,
in diese Kügelchen
zu diffundieren und Wasserstoffperoxid ist fähig, herauszudiffundieren.
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Nicht
ausgefüllte
Kreise stellen Kügelchen
aus Alginatgel (typischerweise etwa 2 mm Durchmesser) dar, die eingeschlossene
Lactoperoxidase enthalten. Alternativ könnten andere Gele (z.B. Agarose)
oder Polymere verwendet werden, um die Kügelchen zu bilden. Wasserstoffperoxid
ist fähig,
in diese Kügelchen
zu diffundieren, und reaktive Sauerstoffspezies sind fähig, herauszudiffundieren.
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Schattierte
Kreise stellen Kügelchen
aus Alginatgel (typischerweise etwa 2 mm Durchmesser) dar, die eingeschlossene
Glucose und Kaliumiodid enthalten. Alternativ könnten andere Gele (z.B. Agarose)
oder Polymere verwendet werden, um die Kügelchen zu bilden. Glucose
ist fähig,
aus diesen Kügelchen
zu diffundieren.
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1 stellt
eine bevorzugte Ausführungsform
eines Wundverbands gemäß der Erfindung
dar. Der Verband hat einen geschichteten Aufbau und umfasst eine äußere Schicht
oder eine Deckschicht bzw. Bedeckung 10 in Form eines Sauerstoff-permeablen
selbstklebenden Pflasters, das zum Ankleben an die Haut 12 eines
Subjekts geeignet ist, so dass es eine Wunde 14 bedeckt.
Die Bedeckung 10 schließt Folgendes ein: eine obere
Schicht, die ein erstes feuchtes Pad 16 mit immobilisierter
Glucoseoxidase umfasst; eine Zwischenschicht, die eine Lösung von
Glucose und Kaliumiodid in einem semipermeablen Sachet oder einer
semipermeablen Gelplatte 18 umfasst, und eine untere Schicht,
die ein zweites feuchtes Pad 20 mit immobilisierter Lactoperoxidase
umfasst. Unter Pad 20 ist eine Lage 22 aus Gaze
zum Kontakt mit der Wunde 14. Die Pads und das Sachet können im
Allgemeinen wie unten beschrieben sein.
-
Der
Verband wird zunächst
als Multikomponentensystem mit den einzelnen Komponenten getrennt verpackt
in entsprechenden versiegelten sterilen Verpackungen geliefert.
Wenn er zur Verwendung benötigt wird,
werden die Verbandskomponenten aus den Verpackungen entfernt und
in geeigneter Weise und Reihenfolge zur Herstellung des fertigen
Verbands, wie er gezeigt ist, appliziert.
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2 stellt
eine andere bevorzugte Ausführungsform
des Wundverbands dar, im Allgemeinen ähnlich der in 1,
mit ähnlichen
Komponenten, die durch gleiche Bezugszeichen identifiziert sind.
In dieser Ausführungsform
umfasst die obere Schicht ein erstes feuchtes Pad 24 mit
Calciumalginatperlen, die Glucoseoxidase eingeschlossen enthalten.
Die Zwischenschicht umfasst ein Pad 26 mit Gelperlen, die
Glucose und Kaliumiodid enthalten. Die untere Schicht umfasst ein
zweites feuchtes Pad 28 mit Calciumalginatperlen, die Lactoperoxidase
eingeschlossen enthalten.
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3 veranschaulicht
eine weitere im Allgemeinen ähnliche
Ausführungsform,
die aber eine obere Schicht in Form eines Pads mit Gelperlen, die
Glucose und Kaliumiodid enthalten, und eine untere Schicht, die ein
feuchtes Pad (oder eine Gelplatte) 32 mit Calciumalginatperlen,
die eingeschlossene Glucoseoxidase enthalten, und Calciumalginatperlen,
die eingeschlossene Lactoperoxidase enthalten, umfasst.
-
4 ist
eine Variante von 3, in der die obere Schicht
ein semipermeables Sachet oder eine semipermeable Gelplatte 34,
welches/welche Glucose und Kaliumiodid enthält, umfasst.
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Beispiele
-
Konstruktion von Glucoseoxidase-
und Lactoperoxidase-Kügelchen
-
Das
Enzym, entweder Lactoperoxidase (LPO) (von Sigma, Kat.-Nr. L2005)
oder Glucoseoxidase (GOX) (von Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 105147)
wird in reinem Wasser mit einer Rate von 1 Mikrogramm pro ml (LPO)
oder 10 Mikrogramm pro Liter (GOX) aufgelöst. Eine Lösung von Alginsäure (Manucol
DM (Manucol DM ist eine Marke) von C P Kelco) (1 Gramm pro 100 ml
Wasser) wird bei erhöhter
Temperatur hergestellt und gekühlt.
Enzymlösung
wird mit der gekühlten
Alginsäure
bei geeigneter Rate vermischt. Die resultierende Alginsäure/Enzym-Lösung wird
dann durch eine peristaltische Pumpe in eine Röhre gepumpt, welche zu einer
Ausgangsdüse
führt,
die zweckdienlicherweise durch eine Standardlaborglaspasteurpipette
gebildet wird, welche über
einem Härtebad
aus Calciumchloridlösung
(10% G/V) platziert ist. Der Fluss der Pumpe und die Höhe der Ausgangsdüsen werden
so eingestellt, dass der ausfließende Strom der Alginsäure-Enzym-Lösung zu getrennten Tröpfchen geformt
wird, wenn er in die Calciumchloridlösung eintritt. Jedes Tröpfchen beginnt
schnell, sich zu verfestigen, wenn das Calcium beginnt, die Alginsäuremoleküle zu vernetzen,
und 10 Minuten nach Abgabe des letzten Tröpfchens ist der Herstellungsprozess
vollständig.
Alle neugebildeten Kügelchen
werden aus der Calciumchloridlösung
entfernt, indem das Ganze durch ein Sieb geeigneter Maschengröße gegossen
wird. Restliches Calciumchlorid wird durch Spülen mit reinem Wasser entfernt.
Die Kügelchen werden
in Wasser oder in wasserdichten Behältern oder in physiologischer
Pufferlösung,
z.B. Phosphat-gepufferter Salzlösung,
gelagert. Alternativ können
sie in Glycerin oder Glycerin-in-Wasser-Lösungen gelegt werden, um den
Gehalt an eingeschlossenem Wasser zu verringern. Welche Lagerungsbedingungen
auch verwendet werden, sie dürfen
kein Austrocknen oder Härten
in Abwesenheit von Wasser oder Glycerin zulassen.
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Aufbau von
Glucose-Kügelchen
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Es
wird dem oben beschriebenen Verfahren gefolgt, außer dass
keine Enzyme zugesetzt werden und Glucose mit einer Rate von 12,5
g pro 100 ml sowohl im reinen Wasser als auch im Calciumchlorid-Härtungsbad
enthalten ist. Die Gelkügelchen
werden mit Calcium-freier Glucoselösung gewaschen, was eine Entfernung
von überschüssigem Calcium
ohne Verarmung an Glucose erlaubt.
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Herstellung
eines Enzym-Kügelchen
enthaltenden Pads
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Baumwollmull
geeigneter Größe wird
auf eine geeignete Oberfläche
gelegt, durch die Wasser fließen kann
(z.B. ein flaches Kunststoffsieb). Eine Suspension aus Enzymkügelchen
wird auf den Baumwollmull derart gegossen, dass die Kügelchen
in dem entstehenden Flor des Gewebes eingeschlossen sind, wenn das suspendierende
Wasser abfließt.
Ein zweites Stück
Mull wird dann über
das erste gelegt, so dass die Enzymkügelchen zwischen den zwei Gewebeschichten
eingeschlossen sind. Es kann ein Klebstoff oder ein Nähen oder
ein Heften verwendet werden, um die obere Schicht an der Bodenschicht
zu befestigen. Überschüssige Flüssigkeit
wird ablaufen gelassen, allerdings wird das Pad nicht austrocknen
gelassen.
-
Die
Zahl der Kügelchen,
die pro Pad enthalten ist, sollte auf der Basis bestimmt werden,
dass jedes Oxidasepad etwa 100 mg GOX tragen sollte und jedes Peroxidasepad
etwa 100 mg LPO tragen sollte.
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Herstellung eines Pads,
das Glucosekügelchen
und Iodid enthält
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Das
oben beschriebene Verfahren wird mit Glucose enthaltenden Kügelchen
angewendet, um ein Pad herzustellen, das eingeschlossene Glucose
enthält,
allerdings mit der Ausnahme, dass ein zusätzlicher Schritt am Ende des
Verfahrens eingeschlossen ist, in dem das Pad in eine Kaliumiodidlösung (10
mM) eingeweicht wird.
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Herstellung eines Glucose/Iodid-enthaltenden
Sachets bzw. Briefchens
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Glucose
wird in einer wässrigen
5 mM-Lösung
von Kaliumiodid mit einer Rate von 12,5 g pro 100 ml aufgelöst. Diese
Lösung
wird dann in einen Dialysebeutel (vorher in siedendes Wasser für 10 Minuten
gelegt und gründlich
gespült)
mit einem zugänglichen
Bereich von etwa 40 × 20
mm gegeben und versiegelt.
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Beweis der
oxidativen Aktivität
eines zusammengesetzten Verbundverbands
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Eine
1%-ige wässrige
Lösung
von Agarose wird hergestellt, Kaliumiodid wird mit einer Konzentration von
10 mM und lösliche
Stärke
mit einer Konzentration von 1% G/V zugesetzt. Die Lösung wird
geschmolzen und in einer Petrischale unter Bildung einer kontinuierlichen
Schicht mit etwa 5 mm Dicke ausgebreitet und härten gelassen. Sobald sie gehärtet ist,
wird ein Peroxidasepad, wie es oben beschrieben ist, auf die Oberfläche gelegt,
anschließend
wird ein Glucosepad oder -sachet, wie es oben beschrieben ist, oben
auf dieses gelegt und schließlich
wird ein Glucoseoxidasepad, wie es oben beschrieben ist, oben auf
diese beiden gelegt, um einen dreischichtigen Stapel zu bilden.
Die Entwicklung einer blauen Farbe innerhalb des Stärkeagars
zeigt die oxidative Aktivität
des Verbundverbands an.
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Verwendung
des kombinierten Verbundverbands als Wundbehandlung
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Die
Pads oder Sachets zu diesem Zweck, die wie oben beschrieben hergestellt
wurden, werden in geeignetem passend versiegelt und einer Gamma-Bestrahlung
unterworfen, um die mikrobiologische Sterilität sicherzustellen, wobei Techniken
eingesetzt werden, die bekannt sind und routinemäßig in der Industrie eingesetzt
werden.
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Zuerst
wird die Wunde mit einer dünnen
Lage aus steriler Gaze bedeckt. Als nächstes werden die drei Schichten
steriler Pads als dünner
Stapel hinzugefügt,
wobei das Peroxidasepad das erste ist, gefolgt von dem Glucosepad
oder -sachet als nächstes
und dem Glucoseoxidasepad als letztes. Die Pads werden zu einer
Größe geschnitten,
die gerade die offene Wunde bedeckt. Schließlich wird der Verbundverband
vorzugsweise durch einen Klebefilm, z.B. als normales „sticking
plaster" oder „Micropore" chirurgisches Tate,
an Ort und Stelle gehalten.
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Andere Ausführungsformen
-
Die
Enzyme können
an verschiedenen Partikel- oder Fasertypen immobilisiert werden,
wobei Kopplungsverfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt
sind. Die Partikel können
aus Cellulose, Siliziumdioxid oder verschiedenen ungefährlichen
Polymeren bestehen. Alginat kann in anderen Formen als Kügelchen,
z.B. als Platten oder extrudierte Fäden, verwendet werden, wobei
Calcium als Härtungsmittel
verwendet wird. Mikrokapseln, z.B. solche, die durch bekannte Techniken
mit Polyamid hergestellt werden, können verwendet werden, um jede
der Komponenten einzukapseln.
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Weitere
Verbandskomponenten wurden wie folgt hergestellt.
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Herstellung
eines Enzym-enthaltenden Pads
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Lose
gewebte Baumwollgaze wird in einer Reihe von Stücken mit etwa 100 mm × 100 mm
geschnitten und jedes Stück
wird in einen entsprechenden geeigneten Behälter mit flachem Boden gelegt.
1% G/V Alginsäure
(auch „Alginat" genannt; z.B. Manucol
DM (Manucol DM ist eine Marke) von CP Kelco) wird hergestellt, indem
das Gel in einer geeigneten, erhitzten wässrigen Lösung gelöst wird. Nach dem Abkühlen wird
Enzym zu dem Alginat gegeben, wodurch eine Endkonzentration von
5 μg/ml
Glucoseoxidase (GOX, von Boehringer Mannheim, Kat.-Nr.: 105147)
oder 10 μg/ml
Lactoperoxidase (LPO, von Sigma, Kat.-Nr.: L2005) erhalten wird. 10
ml jeder Enzym-Alginat-Lösung
werden hergestellt und gleichmäßig auf
die einzelnen Baumwollgaze-Pads gegossen. Das Gel wird durch Zusatz
eines Überschusses
an 10% G/V Calciumchlorid (CaCl2) gehärtet und für 10 Minuten
stehen gelassen. Die Pads werden dann zweimal für jeweils 5 Minuten in überschüssigem destilliertem/entionisiertem
Wasser zur Entfernung des CaCl2 gewaschen.
Die Pads können
dann in feuchter Umgebung gelagert werden, um ein Austrocknen zu
verhindern.
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Herstellung von Glucose-enthaltendem
Pad
-
Lose,
gewebte Baumwollgaze wird auf etwa 100 mm mal 100 mm geschnitten
und in einen geeigneten Behälter
mit flachem Boden gelegt. 1% G/V Agarose und 40% G/V-Glucose werden
in einer geeigneten wässrigen
Lösung
aufgelöst
und auf die Gaze gegossen, während
es noch in geschmolzenem Zustand ist. Das Gel wird durch Abkühlen härten gelassen.
Das Gelpad wird dann in einer feuchten Umgebung gelagert, um ein Austrocknen
zu verhindern. Um ein Pad zu produzieren, das Glucose und Kaliumiodid
enthält,
wird ein ähnliches
Verfahren durchgeführt,
aber nachdem Glucose und Agarose gelöst wurden, wird Kaliumiodid
(KI) zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt. Die Lösung kann
dann wie oben gegossen, härten
gelassen und gelagert werden.
-
Beweis der
antimikrobiellen Eigenschaften eines kombinierten Verbundverbands
-
Beispiel 1
-
Unter
Anwendung von Standardpraktiken wird eine mikrobielle Wachstumsplatte
mit 1,5% Agarose hergestellt, allerdings wird Glucose durch Fructose
als einzige Kohlenstoffquelle ersetzt. Die Platten haben typischerweise
eine Dicke im Bereich von 5 mm. Pseudomonas aeruginosa wurde auf
der Oberfläche
der Platte in einem gleichmäßigen „Rasen" ausgebreitet. Ein
Pad, das LPO-Alginat (hergestellt wie unmittelbar oben beschrieben)
enthielt, mit etwa 20 mm2 wurde auf die
Oberfläche
der Platte gelegt. Direkt auf dieses Pad wird ein 20 mm2-Pad
gelegt, das Glucose-Agar enthält
(hergestellt wie unmittelbar oben beschrieben) (mit oder ohne KI).
Schließlich
wurde ein 20 mm2-Pad, das GOX-Alginat (hergestellt
wie unmittelbar oben beschrieben) enthielt, auf das Glucose-Agar-Pad
geschichtet. Nach 24 Stunden kann eine Clearance-Zone um den Padstapel deutlich
erkannt werden, was die Produktion und Diffusion von aktiven antimikrobiellen
Spezies zeigt, die das Wachstum der aufgetragenen Bakterien verhindert.
Die Entfernung eines beliebigen der drei Pads (Kontrollexperimente)
führte
zu keiner Clearance-Zone um den Padstapel, was zeigt, dass beide
Enzyme und Glucose vorhanden sein müssen, damit die Kaskade effektiv
abläuft.
-
Beispiel 2
-
Um
die Produktion von reaktiven oxidativen Spezies durch das gestapelte
Enzymsystem zu zeigen, wird alternativ eine Platte mit 1% G/V Agar
gegossen, die 1% lösliche
Stärke
(z.B. ARCOS, Kat.-Nr.: 177132500) und 10 mM KI enthält. Die
Platte wird durch Abkühlen
härten
gelassen. Das LPO-Alginat-Pad, gefolgt vom Glucose-Agar-Pad und
schließlich
dem GOX-Alginat-Pad
können
wie oben in Beispiel 1 gestapelt werden. Die Produktion der reaktiven oxidativen
Spezies kann dann durch das intensiv blau gefärbte Chromogen sichtbar gemacht
werden, das durch die gut dokumentierte Wechselwirkung von elementarem
Iod (die oxidative Spezies oxidieren das Iodid zu Iod) und Stärke produziert
werden. Diese Verfärbung
kann nach 5 Minuten klar gesehen werden, wobei sich Intensität und Ausbreitung über die
Zeit aufbauen. Nach 30 Minuten war die Farbintensität so hoch,
dass es ein tiefes Blau wurde, was eine fortgesetzte Produktbildung
anzeigt. Dies zeigt, dass beide reaktiven oxidativen Spezies und
Iod produziert werden, die beide die antimikrobielle Aktivität des Verbundverbands
unterstützen.
-
Beispiel 3
-
Eine
Variation an Beispiel 2 besteht darin, eine geringe Konzentration
an GOX (0,25 μg/ml)
in das LPO-Alginat-Pad einzuschließen, um eine anfängliche
Produktion von reaktiven oxidativen Spezies zu begünstigen.
Diese nutzt Sauerstoff, der im Gel verfügbar ist, und wird durch die
Glucose initiiert, die in das LPO-Alginat-Pad diffundiert. Diese
Reaktion ist infolge der Verfügbarkeit
von Sauerstoff limitiert und wird aufhören, wenn Sauerstoff erschöpft ist.
Um die Produktion von reaktiven oxidativen Spezies über das
gestapelte Enzymsystem zu zeigen, wird eine 1% G/V-Agarplatte gegossen,
die 1% lösliche
Stärke
(z.B. ARCOS, Kat.-Nr.: 177132500) und 10 mM/KI enthält. Die
Platte wird durch Abkühlen
härten
gelassen. Das kombinierte LPO- und GOX-Alginat-Pad, gefolgt von
dem Glucose-Agar-Pad und schließlich
dem GOX-Alginat-Pad, können
wie oben beschrieben gestartet werden. Die beschleunigte Produktion
der reaktiven oxidativen Spezies kann dann durch das intensiv blau
gefärbte
Chromogen sichtbar gemacht werden, das durch die wohlbekannte Wechselwirkung
von elementarem Iod (die oxidative Spezies oxidiert das Iodid zu
Iod) und Stärke
produziert wird. Diese Verfärbung
kann nach nur kurzer Zeit wie 1 Minute deutlich gesehen werden,
wobei sich Intensität und
Ausbreitung mit der Zeit aufbauen. Die Verfärbung wird nach 15 Minuten
langsam deutlich abnehmen, wenn das obere GOX-Alginat-Pad nicht
verwendet wird. Wenn das GOX-Alginat-Pad wie oben beschrieben verwendet
wird, wird die Verfärbung
sich stark fortsetzen, wie es in Beispiel 2 oben zu sehen ist. Nach
30 Minuten hat die Farbintensität
zugenommen und die Farbe wird dunkelblau, was eine fortgesetzte
Produktbildung anzeigt. Dies zeigt, dass beide oxidativen Spezies
und Iod produziert werden, welche beide die antimikrobielle Aktivität des Verbundverbands
unterstützen.
-
Es
wurden weitere Arbeiten durchgeführt,
die Gels mit relativ hoher Xanthangummi-Konzentration verwendeten.
-
Herstellung von Enzym
enthaltenden Xanthangummi/Alginat-Gelen
-
Es
wurde eine Reihe von Xanthangummi (Keltrol)-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen
(5 Gew.-%, 10 Gew.-% und 20 Gew.-%) hergestellt, indem geeignete
Mengen an Keltrol in destilliertem/entionisiertem Wasser mit Raumtemperatur
(etwa 20°C)
aufgelöst
wurden. Eine Reihe von Lösungen
von Alginsäure (Manucol
DM (Manucol DM ist eine Marke) von CP Kelco) mit verschiedenen Konzentrationen
(2 Gew.-% und 4 Gew.-%) wurden ebenfalls hergestellt, indem geeignete
Mengen von Manucol DM in destilliertem/entionisiertem Wasser mit
geeigneter erhöhter
Temperatur gelöst
wurden. Die resultierenden Alginsäurelösungen wurden abgekühlt.
-
Eine
Reihe von Xanthangummi/Alginat-Gelen, die die zwei Materialien in
verschiedenen Behältnisanteilen
enthielten, wurden hergestellt, indem die Lösungen in geeigneten Mengen
vermischt wurden, bis ein homogenes Gemisch erhalten wurde. Beispielsweise
wurden Gele hergestellt, deren Gewichtsverhältnis von Xanthangummi zu Alginat
von 5:1 (z.B. gleiche Mengen von 5%-iger und 1%-iger Lösung oder
10%-iger und 2%-iger Lösung),
5:2, 10:1 usw., je nach Bedarf, haben, hergestellt.
-
Enzym
enthaltende Gele wurden durch den Zusatz der geeigneten Menge der
Enzyme Glucoseoxidase (GOX) oder Lactoperoxidase (LPO) zu den Gelproben
hergestellt. Enzymlösung
kann entweder zu einer Xanthangummi- oder Alginat-Lösung vor
dem Vermischen oder zu einem Xanthangummi/Alginat-Gel nach Vermischen
gegeben werden. Experimente wurden unter Verwendung von LPO von
Sigma (Katalognummer L2005), gelöst
in reinem Wasser mit einer Rate von 1 Mikrogramm pro Milliliter
und GOX von Boehringer Mannheim (Katalognummer 105147), gelöst in reinem
Wasser mit einer Rate von 10 Mikrogramm pro Milliliter, durchgeführt.
-
Aufbau von vernetzten
Xanthangummi/Alginat-Gelpads, getragen von Baumwollgaze
-
Ein
Gelgemisch aus 10% Xanthangummi, 2% Alginsäure wurde hergestellt, indem
gleiche Volumina von 20% Xanthangummi-Stammlösung und 4% Alginsäure-Stammlösung, die
wie oben beschrieben hergestellt worden waren, vermischt wurden.
LPO und GOX wurden zu getrennten Proben dieses Gelgemischs gegeben,
um eine LPO-enthaltendes Gel und ein GOX-enthaltendes Gel herzustellen.
Die Enzymlevel können entsprechend
dem erforderlichen Level an Aktivität variiert werden. In diesem
Fall waren die verwendeten Enzymlevel 100 μg/ml für LPO und 50 μg/ml für GOX.
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Etwa
5 ml des LPO-enthaltenden Gels wurde auf einen Streifen aus Baumwollgaze
mit etwa 40 mm × 50
mm glatt aufgetragen. Eine zweite Gazeschicht gleicher Größe wurde
oben auf das LPO-Gel unter leichtem Druck gelegt, um eine gleichmäßig Verteilung
des Gels sicherzustellen. Etwa 5 ml des GOX-enthaltenden Gels wurden
dann auf der Oberseite der zweiten Schicht aus Baumwollgaze verteilt,
wobei eine dritte Gazeschicht gleicher Größe oben auf das GOX-enthaltende
Gel, wiederum mit leichtem Druck, um eine gleichmäßige Verteilung
des GOX-enthaltenden Gels sicherzustellen, aufgebracht. Dies produzierte
ein Pad oder eine Platte mit sandwichartigem Aufbau, die drei Lagen
aus Baumwollgaze umfasste, die durch eine Schicht aus LPO-enthaltendem
Gel bzw. eine Schicht aus GOX-enthaltendem Gel getrennt waren.
-
Die
resultierenden Pads wurden für
10 Minuten in ein Bad einer Calciumchloridlösung (10% G/V) gelegt. Die
Pads wurden aus dem Bad entfernt und wurden zur Entfernung von restlichem
Calciumchlorid durch zwei zehnminütige Waschgänge in destilliertem/entionisiertem
Wasser gewaschen. Überschüssiges Wasser wurde
durch Trocknen der Pads für
mehrere Minuten in Adsorbensgewebe entfernt.
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Beweis der Aktivität des vernetzten
Xanthangummi/Alginat-Gelpads
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Beispiel 4
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Die
Stärke/Iod-Komplex-Reaktion
wurde verwendet, um die enzymatische Produktion von reaktiven oxidativen
Spezies (ROS) in dem vernetzten Xanthangummi/Alginat-Gel-Pad, das
wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, sichtbar zu machen.
In Gegenwart von ROS wird Iodid unter Herstellung von elementarem
Iod oxidiert, welches mit Stärke
einen Komplex bildet, wodurch ein intensives blaues Chromogen erzeugt
wird.
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Experimente
wurden unter Verwendung einer Platte mit 1% G/V Agar, das 1% lösliche Stärke (ARCOS,
Katalognummer 177132500) und 10 mM Kaliumiodid enthielt, durchgeführt. Eine
Scheibe des vernetzten Xanthangummi/Alginat-Pads, wie es oben beschrieben
wurde (etwa 20 mm × 10
mm × 4
mm) wurde auf die Stärke/Iodid-Platte
mit der GOX als oberster Schicht gelegt. Darauf wurde ein Gelpad,
das 40% Glucose in 1% Agar umfasste, gelegt, um die Reaktion zu
initiieren. Nach etwa 30 Minuten war das untere Pad gelb geworden,
was deutlich die Produktion von elementarem Iod anzeigte (Iodid
war infolge einer Diffusion aus der Platte in das Gel vorhanden).
Nach ungefähr
einer Stunde war unter dem Pad eine blaue Färbung sichtbar, die das Vorliegen
von ROS in der Stärke/Iodid-Platte
anzeigte. 24 Stunden nach Initiierung war ein großer Bereich der
Platte blau geworden, was eine fortgesetzte Produktion von ROS anzeigte.
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Beispiel 5
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Zwei ähnliche
Experimente wurden unter Verwendung einer Anordnung durchgeführt, die
allgemein wie die oben in Beispiel 4 beschriebene war, allerdings
mit dem Glucosepad unter dem vernetzten Xanthangummi/Alginat-Pad.
Es wurden zwei Experimente durchgeführt, und zwar mit den Xanthangummi/Alginat-Gel-Pads
in verschiedenen Orientierungen, in einem Fall mit der GOX-Schicht
als oberster und im anderen Fall mit der LPO-Schicht als oberster.
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Mit
dem Pad, das mit der GOX-Schicht als unterste nahe dem Glucosepad
positioniert war, konnte nach etwa einer Stunde eine Blaufärbung unter
dem Pad gesehen werden. Bei dem anderen Experiment mit der LPO-Schicht
als unterste nahe dem Glucosepad konnte nach etwa 2 Stunden eine
Blaufärbung
unter dem Pad gesehen werden. Dies zeigt, dass selbst bei einer
Anordnung unter Verwendung eines Pads mit nicht optimaler Folge
ROS noch in ausreichender Menge produziert werden können, um
einen oxidativen Effekt in der Indikatorplatte zu erzeugen.
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In
beiden Experimenten wurde in beiden Gelen in den LPO-Schichten eine
gelbe Verfärbung
gesehen, die das Vorliegen von Iodproduktion zeigt. Nach 24 Stunden
war in beiden Fällen
ein großer
Bereich der Iod/Iodid-Platte blau geworden, was wiederum die Erzeugung
von ROS zeigt.
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Beweis der
Feuchtigkeitsabsorptionsfähigkeit
eines Xanthangummigels
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Eine
10 Gew.-%-ige Zubereitung von Keltrol in Wasser wurde wie oben beschrieben
hergestellt. 1,06 g des 10%-igen Gels wurden dann zu 10,22 g destilliertem/entionisiertem
Wasser gegeben, bei 21°C
gehalten und versiegelt, um Verdampfungseffekte zu minimieren. Das
Wasser wurde abdekantiert und sein Gewicht wurde gemessen, um den
Grad der Absorptionsfähigkeit
zu bestimmen.
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Nach
15 Minuten waren 8,34 g Wasser zurückgeblieben, nach 45 Minuten
waren 7,56 g zurückgeblieben,
nach 2 Stunden waren 6,51 g zurückgeblieben;
nach 18 Stunden waren 2,1 g zurückgeblieben.
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Dieses
Experiment zeigt, dass das 10% Keltrol-Gel fähig ist, wenigstens das 8-fache
seines Gewichts an Wasser zu absorbieren.
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Beweis der Feuchtigkeitsabsorptionsfähigkeit
eines vernetzten Xanthangummi/Alginat-Gel-Gemisches.
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Ein
Gemisch aus 5 Gew.-% Keltrol und 1 Gew.-% Alginsäure wurde wie oben beschrieben
hergestellt. Zwei Schichten Gel wurden zwischen zwei Schichten aus
Baumwollgaze gegossen, um ein Pad herzustellen, das vernetzt war,
wobei eine 10% Calciumchloridlösung
verwendet wurde, und das zweimal für 10 Minuten in Wasser gewaschen
wurde, wie es oben beschrieben ist. Das Pad wurde unter Verwendung
von absorbierendem Küchenpapier
trocken getupft.
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Ein
Stück des
Pads mit 10 mm × 10
mm × 3
mm wurde zur Bestimmung des Anfangsgewichts gewogen (0,28 g). 1
ml Wasser wurde zu dem Pad gegeben. Das Pad wurde entfernt und nach
verschiedenen Zeiten gewogen, um die Gewichtszunahme (durch Wasserabsorption)
zu bestimmen. Nach 1 Stunde war das Gewicht des Pads 0,37 g; nach
2 Stunden 0,44 g; nach 3 Stunden 0,49 g und nach 6 Stunden 0,5 g.
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Dieses
Experiment zeigt, dass das vernetzte Xanthangummi/Alginat-Gel noch
fähig ist,
Wasser zu absorbieren. Verglichen mit dem obigen Beispiel unter
Verwendung von 10% Keltrol resultiert die Verwendung eines geringeren
Prozentgehalts an Keltron und vernetztem Alginat in einer geringeren
Wasserabsorptionsfähigkeit.
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Vernetzte
Xanthangummi/Alginat-Gele, die wie oben beschrieben hergestellt
worden waren, wurden in der Herstellung eines Wundverbands gemäß der Erfindung
eingesetzt, wie es schematisch in 1 gezeigt ist.
Solche Gele wurden zusammen mit einem Glucose/Iodid-enthaltenden Sachet,
das wie oben beschrieben hergestellt worden war, verwendet. Glucose
wurde in einer wässrigen
5 mM-Lösung
von Kaliumiodid mit einer Rate von 12,5 g pro 100 ml aufgelöst. Die
Lösung
wurde in einen Dialysebeutel (vorher in siedendes Wasser für 10 Minuten
gelegt und gründlich
gespült)
mit einer zugänglichen
Fläche
von etwa 40 × 120
mM gefüllt
und versiegelt.
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Die
Komponenten wurden unter Bildung eines Verbands mit dem in 1 gezeigten
Aufbau kombiniert. Der Verband hat einen geschichteten Aufbau und
umfasst eine äußere Schicht oder
Abdeckung 10 in Form eines für Sauerstoff durchlässigen selbstklebenden
Pflasters, das zum Ankleben an die Haut 12 eines Subjekts,
so dass eine Wunde bedeckt ist, geeignet ist. Die Abdeckung 10 schließt eine
obere Schicht, die ein Pad aus Glucoseoxidase enthaltendem, vernetztem
Xanthangummi/Alginat-Gel, das wie oben beschrieben hergestellt worden
war, umfasst; eine Zwischenschicht, die eine Lösung von Glucose und Kaliumiodid
in einem semipermeablen Sachet 18, das wie oben beschrieben
hergestellt worden war, umfasst; und eine untere Schicht, die eine
Platte aus Lactoseperoxidase enthaltendem, vernetztem Xanthangummi/Alginat-Gel,
das wie oben beschrieben hergestellt worden war, umfasst, ein. Unter
Pad 20 ist eine Lage 22 aus Gaze zum Kontakt mit
der Wunde 14.
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Der
Verband wird zunächst
als Mehrkomponentensystem geliefert, wobei die einzelnen Komponenten getrennt
in entsprechenden versiegelten, sterilen Verpackungen verpackt sind.
Wenn eine Verwendung erforderlich ist, werden die Verbandskomponenten
aus den Verpackungen entfernt und in geeigneter Weise auf eine Wunde
appliziert, um den fertigen Verband, wie er gezeigt wurde, zu produzieren.
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5 stellt
eine weitere Ausführungsform
eines Verbands gemäß der Erfindung
schematisch dar. Diese Verbandsform ist derzeit bevorzugt. Der Verband
hat Hauptabmessungen von 100 mm × 100 mm in Form eines Quadrats.
-
Der
dargestellte Verband umfasst eine weiche, hydratisierte Hydrogelplatte 50,
die aus Poly-AMPS
besteht (wie in WO 01/96422 beschrieben, geliefert von First Water
Ltd.). Das Hydrogel enthält
bis zu 23% Glucose (das als Substrat für das Oxidoreduktase-Enzym
wirkt) und Iodidsalze, z.B. 1,6% G/V Kaliumiodid (das ein Vorläufer für Iod ist).
Das Hydrogel kann auch bis zu 20% G/V Glycerin enthalten (das als
Feuchthaltemittel und Netzmittel wirkt). Die Hydrogelplatte 50 bildet
die untere Schicht des Verbands.
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Der
Verband umfasst auch eine obere Schicht, die durch ein gewebtes
Cellulosegaze 52 gebildet wird, an die Glucoseoxidase und
Lactoperoxidase irreversibel (kovalent) gebunden sind. Die Gaze 52 wird
wie folgt hergestellt.
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Die
Gaze wird zu einer geeigneten Größe und Gestalt
geschnitten (ein Quadrat 100 mm × 100 mm) und wird zur Entfernung
von gelösten
Stoffen oder teilchenförmigen
Stoffen in Wasser gewaschen. Übermäßige Flüssigkeit
wird entfernt. Die Gaze wird dann in eine 10 mM-Lösung von
Natriummetaperiodat für
60 Minuten bei 25°C
eingeweicht. Nach diesem Oxidationsschritt, in dem reaktive Aldehydgruppen
gebildet werden, wird die Gaze ausgiebig in Wasser gewaschen, um
das Periodat zu entfernen. Nach dem Waschschritt wird die Gaze in
einer Lösung
von Glucoseoxidase (Biocatalysts – Code G638P) mit 100 μg Pulver
pro 50 ml Natriumhydrogencarbonat mit pH 9,0 eingeweicht. Dies entspricht
7000 U/ml. Lactoperoxidase (DMV International) wird ebenfalls mit
100 μl Pulver
pro ml 50 mM Natriumhydrogencarbonat mit pH 9,0 eingearbeitet. Diese Dosen
können
reduziert werden, da sie eine überschüssige Aktivitätsmenge
darstellen. Die Gaze wird mit der Enzymlösung für 4 Stunden bei etwa 20°C reagieren
gelassen, wonach die Gaze entfernt wird und extensiv zwischen einer
Lösung
mit geringer Ionenstärke
(entionisiertes Wasser) und einer Lösung mit hoher Ionenstärke (50
mM NaH2CO3 pH 9,0
+ 1 M NaCl) gewaschen wird, um lose gebundenes Enzym zu entfernen.
Die Gaze wird dann mit einem Konservierungsmittel, z.B. 5% PVA,
10% Saccharose oder 2% Gelatine, überzogen und entweder bei Raumtemperatur
(etwa 21°C)
oder vorzugsweise bei 40°C
getrocknet.
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Die
untere und obere Schicht werden miteinander in einer Stickstoffatmosphäre (um eine
vorzeitige Reaktion zu verhindern) kombiniert und zusammen verpackt,
indem sie in einer sauerstoffundurchlässigen Tasche oder einem Einschluss,
z.B. hergestellt aus Aluminiumfolientaschen, wie sie von Sigma geliefert
werden (Code Z 183407), versiegelt werden. Die Wechselwirkung der
Glucose in dem Gel mit der immobilisierten Glucoseoxidase wird durch
die Rate limitiert, bei der die Glucose in die immobilisierte Enzymschicht
diffundieren kann. Diese Wechselwirkung ist ausreichend, um es zu
ermöglichen,
dass die Schichten in Gegenwart von Sauerstoff kombiniert werden
und dann in eine sauerstofffreie Verpackung gebracht werden, bevor
eine wesentliche Reaktion stattfinden kann. Sobald Sauerstoff von
dem zusammengebauten bzw. kombinierten Produkt ausgeschlossen ist,
stoppt die Reaktion auf jeden Fall und sie kann nur wieder beginnen,
wenn die Sauerstoffzufuhr wieder aufgenommen wird (z.B. wenn das
Produkt zur Verwendung auf einer Wunde aus der Verpackung entfernt
wird). Dieser Sauerstoffmangel innerhalb der Verpackung verhindert,
dass die Glucose in einer vorzeitigen Peroxidproduktion verbraucht
wird. Die Enzyme, die ursprünglich
in trockener Form an der Gaze in der Anordnung sind, werden mit
Wasser aus der Hydrogelplatte 52 hydratisiert und werden
durch Wasser aus der Hydrogelplatte 52 in hydratisiertem
Zustand gehalten, während
sie vor einer Verwendung in der Tasche oder in dem Einschluss versiegelt
sind.
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Bei
Verwendung wird der Verband aus der Tasche oder dem Einschluss entfernt
und auf die Haut eines Patienten über eine Wundstelle gelegt,
wie es schematisch bei 54 gezeigt ist, wobei die untere
Hydrogelschicht 50 mit der Haut in Kontakt ist. Eine sauerstoffdurchlässige und
feuchtigkeitsdurchlässige
Bedeckung oder Deckschicht 56 (die Teil des Verbands sein kann
oder nicht) befindet sich über
der oberen Schicht 52 und ist mit Hilfe eines geeigneten
Klebstoffs, der an der Unterseite der Deckschicht 56 angeordnet
ist, an die Haut, die die Wundstelle umgibt, geklebt. Auf diese
Weise wird der Verband auf der Haut in Position gehalten und bedeckt
die Wundstelle.
-
Die
Glucoseoxidase in der oberen Schicht (die in hydratisiertem Zustand
ist) katalysiert eine Reaktion der Glucose in der unteren Schicht
mit Sauerstoff, der durch die Deckschicht 56 aus der Umgebung
geht, wodurch Wasserstoffperoxid, wie oben diskutiert wurde, produziert
wird. Der Wasserstoffperoxid selbst hat vorteilhafte antimikrobielle
Wirkungen, wie es oben diskutiert wurde. Der Wasserstoffperoxid
kann auch eine weitere Reaktion eingehen, die durch die Lactoperoxidase
katalysiert wird, um eine Vielzahl von Spezies mit antimikrobiellen
Eigenschaften zu erzeugen, wie es oben diskutiert wurde. Außerdem reagieren
die Iodidsalze in der unteren Schicht unter Erzeugung von elementarem
Iod und möglicherweise
auch Hypoiodsäure,
weiteren kräftigen
antimikrobiellen Mitteln, wie es oben diskutiert wurde. Der Verband
hat somit eine Reihe von sehr wirksamen Mechanismen für die in-situ-Produktion
von antimikrobiellen Mitteln, die bei der Förderung der Wundheilung sehr
wirksam sein können.
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Außerdem ist
das Hydrogel der unteren Schicht hoch Flüssigkeit-absorbierend, was
die Aufnahme hoher Volumina an Exsudat aus der Wunde ermöglicht.
Aus der Wunde exsudierte Flüssigkeit,
die möglicherweise
gefährliche
Bakterien usw. enthält,
kann demnach in den Verband absorbiert werden und durch die darin erzeugten
antimikrobiellen Spezies abgetötet
werden. Der Verband kann somit selbst sterilisierend sein. Das Hydrogel
ist auch fähig,
Flüssigkeit
abzugeben, sollte die Wunde es erfordern, wodurch es möglich gemacht wird,
dass die Wundstelle zu jeder Zeit feucht gehalten wird, was den
Heilungsprozess fördert.
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In
einer Modifikation der oben beschriebenen Ausführungsform von 5 ist
keine Lactoperoxidase vorhanden. Obgleich das Wasserstoffperoxid
durch die Reaktion erzeugt wird, die durch die Glucoseoxidase katalysiert
wird, erfolgt keine durch Lactoperoxidase katalysierte Reaktion.
Trotzdem machen nützliche
Mengen des Wasserstoffperoxids spontan eine nicht katalysierte Reaktion
mit Iodidionen durch, um molekulares Iod zu erzeugen, und es werden
dennoch wertvolle antimikrobielle Effekte erzielt.
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6 stellt
noch eine weitere Ausführungsform
eines Verbands gemäß der Erfindung
schematisch dar. Diese Verbandsform ist derzeit am stärksten favorisiert.
Der Verband hat die Hauptabmessungen 100 mm × 100 mm in Form eines Quadrats.
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Der
dargestellte antibakterielle und antifungale Wundverband umfasst
eine Glucose-enthaltende
Hydrogelplatte 60 als die untere Schicht des Verbands.
Auf die Oberseite der Platte 60 ist ein Film 62 aus
PVA (Polyvinylalkohol) gegossen, der Glucoseoxidase eingearbeitet
hat.
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Die
Hydrogelschicht 60 wurde so formuliert, dass sie die folgenden
Reagenzien, bezogen auf das Gewicht, enthielt: 20% Natrium-AMPS
(2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, Natriumsalz (Lubrizol,
Code 2405)), 20% Glucose (Fisher, Analysenqualität), 10% Glycerin (Fisher, Analysenqualität), 50%
entionisiertes Wasser, 0,1% Polyethylenglycol 400-Diacrylat (UCB
Chemicals) und 0,01% Photoinitiator (1-Hydroxycyclohexylphenylketon
(Aldrich)). Das Gemisch wurde in Gusstabletts zu einer Tiefe von
2 bis 3 mm verteilt. Das Hydrogel wurde dann durch Bestrahlung unter
einer UV-Lampe für
bis zu 60 Sekunden und mit einem Energieranking von etwa 100 mW/cm2 gehärtet.
Das Hydrogel wurde dann auf 30°C
oder darunter abkühlen
gelassen.
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Der
Enzym-enthaltende PVA-Film 62 wurde durch Auflösen von
PVA mit hohem Molekulargewicht (MG 124.000 bis 186.000, Aldrich)
in Wasser durch Erwärmen
des Gemisches hergestellt. Der PVA wurde zu einer Endkonzentration
von 6% G/V eingearbeitet. Sobald er aufgelöst war, wurde die Lösung auf
30°C oder darunter
abkühlen
gelassen, bevor Enzym (Glucoseoxidase (GOX, Biocatalysts G638P))
zu einer Konzentration von 100 μg/μl (Gewicht
an gefriergetrocknetem Pulver pro Volumen) zugesetzt wurde. 50-100 μl des PVA/GOX-Gemisches
wurden dann zu einer 20 mm2-Oberfläche des
gekühlten
Hydrogels gegeben und härten
gelassen. Nach etwa 30 Minuten hatte sich ein dünner Film gebildet. Um eine
Enzymaktivierung zu verhindern, kann der Zusatz der PVA-GOX-Lösung zu
dem Glucosehydrogel in einer sauerstofffreien Atmosphäre (z.B.
unter Stickstoff) durchgeführt
werden. Wenn Film 62 mit dem Hydrogel 60 in Kontakt
kommt, wird das meiste des Wassers aus dem Film in das Hydrogel
gezogen, der PVA bleibt als feuchte Membran zurück, die das Enzym in hydratisiertem
Zustand enthält.
Ausreichend Wasser bleibt in dem Film zurück, damit der PVA hydratisiert
wird und flexibel bleibt.
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Der
resultierende Verband wird in eine für Sauerstoff undurchlässige Tasche
oder einen für
Sauerstoff undurchlässigen
Einschluss, z.B. hergestellt aus laminierten Aluminiumfolientaschen,
wie sie von Sigma geliefert werden (Code Z 183407) verpackt. Die
Wechselwirkung der Glucose in dem Gel mit der immobilisierten Glucoseoxidase
wird durch die Rate limitiert, mit der Glucose in die immobilisierte
Enzymschicht diffundieren kann.
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Diese
Verzögerung
ist ausreichend, um zu gestatten, dass die zwei Schichten in Gegenwart
von Sauerstoff kombiniert werden und dann in eine sauerstofffreie
Verpackung gegeben werden, bevor eine wesentliche Reaktion erfolgen
kann. Sobald Sauerstoff aus dem kombinierten Produkt ausgeschlossen
ist, wird die Reaktion auf jeden Fall gestoppt und sie kann nur
wieder aufgenommen werden, wenn die Sauerstoffzufuhr erneuert wird
(z.B. wenn das Produkt zur Verwendung bei einer Wunde aus der Verpackung
entfernt wird). Dieser Sauerstoffmangel in der Verpackung verhindert,
dass die Glucose in einer vorzeitigen Peroxidproduktion verbraucht
wird. Das Enzym wird in hydratisiertem Zustand gehalten, während es
in der Tasche oder dem Einschluss vor Verwendung versiegelt ist.
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Bei
Verwendung wird der Verband aus der Tasche oder dem Einschluss entfernt
und auf die Haut eines Patienten über eine Wundstelle gelegt,
wie es schematisch bei 64 gezeigt ist, und zwar mit der
unteren Hydrogelschicht 60 in Kontakt mit der Haut. Eine
für Sauerstoff
permeable und für
Feuchtigkeit permeable Deckschicht oder Überschicht 66 (die
die Form des Verbandes haben kann oder nicht) befindet sich über dem
Film 62 und wird mit Hilfe eines geeigneten Klebstoffs,
der an der Unterseite der Überschicht 66 angeordnet
ist, auf die Haut, die die Wunde umgibt, geklebt. Auf diese Weise
wird der Verband auf der Haut in Position gehalten und bedeckt die
Wundstelle.
-
Die
Glucoseoxidase in Film 62 (die in hydratisiertem Zustand
ist) katalysiert eine Reaktion der Glucose in der unteren Schicht
mit Sauerstoff, der durch die Oberschicht 66 aus der Umgebung
geht, wodurch Wasserstoffperoxid produziert wird, wie es oben diskutiert
ist. Das Wasserstoffperoxid hat günstige antimikrobielle Wirkungen,
wie es oben diskutiert wurde, und der Sauerstoff, der freigesetzt
wird, wenn es durch endogene Catalase zersetzt wird, unterstützt den
Heilungsprozess durch Stützung
des Zellmetabolismus, Potenzierung der Aminosäurehydroxylierung und Inhibierung
des Wachstums von anaeroben Bakterien.
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Um
die Erzeugung von oxidativen Spezies zu beweisen, wurde eine Indikatorplatte,
bestehend aus 1% Stärke
(Aldrich), 100 mM Kaliumiodid (Fisher) und 1% Agar (Sigma) verwendet.
Der Verband, der Hydrogel 60 mit PVA/GOX-Film 62 umfasste,
wurde auf die Indikatorplatte in Luft gelegt, wobei das GOX durch
den verfügbaren
Sauerstoff aktiviert wird. Wasserstoffperoxid wird in ausreichender
Menge produziert, um fähig
zu sein, durch das Hydrogel zu diffundieren und die Indikatorplatte
unten zu erreichen. Die oxidative Kraft des Wasserstoffperoxids
oxidiert dann Iodid zu Iod, welches mit der Stärke unter Bildung eines intensiven
dunkelblauen Komplexes komplexiert. Durch Entfernung des aktivierten
Hydrogelverbands und Legen desselben auf neue Indikatorplatten in
24 Stunden-Intervallen kann eine anhaltende Wasserstoffperoxidfreisetzung über einen Zeitraum
von wenigstens 5 Tagen bewiesen werden.
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Um
außerdem
die Stabilität
des GOX-Enzyms in dem PVA-Film zu beweisen, wurde der Film zudem aus
einem Hydrogel nach viertägiger
Verwendung entfernt und auf frisches 20 mm2 Glucose-Hydrogel
gelegt und auf eine Indikatorplatte gelegt. Nach 24 Stunden war
der intensive blaue Stärke/Iodid-Komplex
deutlich sichtbar, was anzeigt, dass noch Enzymaktivität in dem
PVA-Film war.
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Um
die lokalisierte GOX-Aktivität
in einem glucosefreien Hydrogel zu beweisen, wurde ein PVA/GOX-Film
wie oben beschrieben produziert. Das Hydrogel wurde auf ein Bett
aus PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung)-gesättigter Baumwollgaze gelegt
und langsam über
24 Stunden quellen gelassen. Das Hydrogel wurde dann durch die horizontale
Ebene in zwei Scheiben geschnitten und in eine Lösung aus 1% Stärke + 100
mM Kaliumiodid + 1% G/V Glucose + 5 mM EDTA + 50 μg/ml Lactoperoxidase
gelegt. Das Vorliegen von GOX kann sehr schnell durch die Detektion
von Wasserstoffperoxid lokalisiert werden. Die GOX-Aktivität wird klar
auf dem PVA-Film und der Kontaktoberfläche des Hydrogels, wo der PVA-Film
gegossen war, lokalisiert. Darunter gab es keine Farbentwicklung,
was zeigt, dass GOX in dem AMPS-Hydrogel selbst in gequollenem Zustand
nicht mobil ist.
-
Die
Hydrogelplatte 60 ist stark Flüssigkeits-absorbierend und
hat so die Eigenschaften und Vorzüge, die oben in Verbindung
mit der Ausführungsform
von 5 beschrieben sind.