DE60222149T2

DE60222149T2 - Referenzkontrolle für hochempfindliche tests des c-reaktiven proteins

Info

Publication number: DE60222149T2
Application number: DE60222149T
Authority: DE
Inventors: Alireza Aliso Viejo EBRAHIM; Jayshree Diamond Bar PARIKH; Warren Eric Fullerton VANDERSLICE
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2001-08-23
Filing date: 2002-07-17
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2022-07-18
Also published as: EP1425006A2; EP1425006B1; CA2456829C; WO2003019135A2; US6548646B1; EP1425006A4; WO2003019135A3; JP4299130B2; CA2456829A1; DE60222149D1; JP2005501247A; AU2002326403B2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich von Referenz-Kontrollen für analytische Bestimmungen von Protein-Konzentrationen in humanen Körperflüssigkeiten. Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Referenz-Kontrollen für Bestimmungen von C-reaktivem Protein.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Kardiovaskuläre Krankheiten sind der Haupt-Todesgrund weltweit. Derzeit ist der einzig allgemein akzeptierte Indikator eines Risikos eines nachteiligen kardiovaskulären Ereignisses die Cholesterin-Konzentration, und bereits die Hälfte aller kardiovaskulären Ereignisse treten in Menschen mit normalen Plasma-Lipid-Konzentrationen auf.
C-reaktives Protein (nachfolgend bezeichnet als „CRP") ist ein Plasma-Protein, das in der Leber synthetisiert wird und aus fünf identischen, nicht-glycolsylierten Polypeptid-Untereinheiten besteht, die nicht-kovalent zur Bildung eines scheibenförmigen Pentamers mit einem Molekulargewicht von etwa 125.000 miteinander verbunden sind. CRP wird synthetisiert durch Hepatozyten als Antwort auf Cytokine, die in die Leber durch aktivierte Leukozyten freigesetzt werden. CRP ist ein nicht-spezifischer Marker von Entzündung, und seine Konzentration erhöht sich als Ergebnis von Gewebe-Verletzungen oder Infektionen und steigt schnell innerhalb von 4 bis 6 Stunden vom Ausbruch auf akute Konzentrationen dieser Zustände an. Die Konzentration an CRP kann auf Werte von 25 bis 35 mg/l nach einer Operation ansteigen, und Peak-Werte finden sich bei 30 bis 35 mg/l während einer akuten bakteriellen Infektion. In Situationen von starkem Trauma steigt die CRP-Konzentration im Plasma auf Werte von 500 bis 1.000 mg/l an.
CRP ist auch ein Risiko-Indikator für Herz-Kreislauf-Krankheiten. Unter den verschiedenen Prognose-Markern einer Herzkrankheit, wie beispielsweise Serum Amyloid A, lösliches interzelluläres Adhäsions-Molekül Typ 1, Interleukin-6, Homocystein, Gesamt-Cholesterin, LDL, Apolipoprotein B-100, HDL und dem Verhältnis von Gesamt-Cholesterin zu HDL ist CRP der stärkste Prediktor kardiovaskulärer Ereignisse. Wenn scheinbar gesunde Erwachsene auf ihren CRP-Wert getestet werden, zeigte sich beim vierten Viertel von ihnen (obere 25 %), dass sie ein viermal höheres Risiko im Vergleich zu denen im ersten Viertel haben (mit einem Confidence-Wert von 95 %), wobei dieses Verhältnis signifikant größer ist als die Verhältnisse jedes der anderen oben aufgeführten Marker.
Die Verwendung von CRP als Prediktor von kardiovaskulären Ereignissen unterscheidet sich jedoch von seiner Verwendung als Detektor anderer Typen von Entzündung oder Gewebe-Verletzung oder Infektion, da die Anstiege, die ein Risiko einer Herz-Kreislauf-Erkrankung anzeigen, signifikant niedriger sind als die Anstiege, die mit anderen Zuständen verbunden sind. Für die Voraussage von Herz-Kreislauf-Krankheiten werden daher hochempfindliche CRP-Nachweis-Verfahren (high sensitivity CRP-Nachweis-Verfahren; „hsCRP"-Nachweis-Verfahren) verwendet. Automatische Analysatoren, auf denen Tests auf hsCRP durchgeführt werden können, schließen die Geräte Dade Behring BN II Plasma Protein System (Firma Dade Behring Inc., Deerfield, Illinois, USA), Abbott Laboratories IMx Immunessay Analyzer (Firma Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA), IMMULITE (Firma Diagnostics Products Corporation, Los Angeles, Kalifornien, USA) und IMMAGE (Firma Beckmann Coulter, Inc., Fullerton, Kalifornien, USA) ein. Der Dade Behring BN II-Test macht Gebrauch von einem monoklonalen Antikörper auf einem Polystyrol-Teilchen mit Fest-Zeit-nephelometrischen Messungen. Der Abbott IMx-Test ist ein Zwei-Stellen-Chemilumineszenz-Enzym-immunmetrischer Test mit einem monoklonalen und einem polyklonalen Anti-CRP-Antikörper. Der Beckmann-Coulter-IMMAGE-Test macht Gebrauch von einem polyklonalen Anti-CRP-Antikörper auf Latex-Teilchen mit Messungen der nephelometrischen Rate. Die Nachweis-Grenzen für diese Tests liegen im Bereich von 0,01 mg/l bis 1,0 mg/l, und diese Instrumente müssen zum Erreichen von Genauigkeit bei den CRP-Konzentrationen innerhalb dieser Bereiche kalibriert werden, die unterhalb derjenigen liegen, die traditionell in klinischen Laboratorien bei weniger empfindlichen CRP-Tests gemessen werden.
Wegen der hohen Empfindlichkeit von hsCRP-Assays und den analytischen Schwankungen, die typischerweise auftreten, ist eine Qualitätskontrolle wichtig beim Überwachen der Präzision und Genauigkeit der Assays und der Assay-Instrumente. Referenz-Kontrollen werden auf zwei Wegen erhalten. Auf dem ersten Weg wird Plasma oder Serum von Blutspendern gescreent und so Einheiten identifiziert, die passend niedrige Konzentrationen an CRP enthalten, und die so identifizierten Einheiten werden zusammengefasst. Auf dem zweiten Weg wird CRP von Plasma oder Serum durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Anti-CRP-Antikörpern entfernt. Gereinigtes CRP wird dann der resultierenden, an CRP verarmten Basis-Matrix zugesetzt, und so werden die speziellen gewünschten Konzentrationen erhalten. Beide Verfahrensweisen sind zeitraubend und kostspielig. Ein Screening erfordert beispielsweise extensives Testen, und es kann sein, dass keine Einheiten mit den gewünschten niedrigen Konzentrations-Werten hergestellt werden, oder es kann sein, dass sie nicht zu dem benötigten Volumen führen. Ein selektives Entfernen von CRP durch Affinitäts-Chromatographie erfordert Trenntechniken wie beispielsweise Dialyse und Chromatographie, gefolgt von einem Konzentrieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass CRP-Referenz-Kontrollen mit niedriger Konzentration von Ausgangsmaterialien mit höherer Konzentration hergestellt werden können durch einfaches Filtrieren unter Verwendung von Filtermedien des Siliciumoxid-Typs. Biologische Flüssigkeiten, die von normalen gesunden Personen erhalten wurden, können als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Diese Verfahrensweise vermeidet die Notwendigkeit, dass Antikörper das Protein einfangen und macht stattdessen Gebrauch von Filtermedien, die traditionell zum Entfernen von Lipiden verwendet wurden. Überraschenderweise ist das Entfernen von CRP durch Filtermedien des Siliciumoxid-Typs selektiv gegenüber CRP und hat nur wenig oder keine Auswirkung auf andere Proteine in der Ausgangs-Matrix und dementsprechend tritt nur eine geringe oder nur vernachlässigbare Änderung des Gesamt-Protein-Gehalts auf. Bemerkenswerterweise wird der Immonoglobulin-Gehalt nicht signifikant durch die Filtration beeinträchtigt, und genauso geht es mit Albuminen.
Zubereitungen mit niedriger Konzentration, die auf diesem Weg erhalten werden, können mit Zubereitungen höherer Konzentration, wie beispielsweise weiteren Mengen des Ausgangs-Materials, gemischt werden, die nicht filtriert wurden, um Referenz-Kontrollen mit mittleren Konzentrationen an CRP zu erhalten. Durch Herstellen von Mischungen in einer Serie von verschiedenen Mengen-Verhältnissen können zahlreiche Kontrollen erhalten werden, die als Materialien für eine exakte Kontrolle des Tests und Instruments über einen weiten Bereich dienen, der die vorweggenommenen Ergebnisse der Probe umfasst. Kontroll-Werte von speziellem Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen mit CRP-Konzentrationen unterhalb des medizinischen Entscheidungs-Punkts und am meisten speziell diejenigen mit CRP-Konzentrationen, die geringer oder gleich 1,0 mg/l sind.
Details dieser und anderer Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung, die nun folgt, offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm (Plot) der Ergebnisse eines beschleunigten Stabillitäts-Tests von Kontroll-Proben in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, aufgenommen unter Bedingungen geschlossener Proben-Gefäße.
2 ist ein Diagramm (Plot) der Ergebnisse eines Realzeit-Stabilitäts-Tests von Kontrollen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wiederum aufgenommen unter Bedingungen geschlossener Proben-Gefäße.
3 ist ein Diagramm (Plot) der Ergebnisse eines Stabilitäts-Tests von Kontrollen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, aufgenommen unter Bedingungen offener Proben-Gefäße.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Filtermedien, die in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Medien des Siliciumoxid-Typs oder sind Siliciumoxidenthaltende Medien, d.h. Medien, die Siliciumoxid in bestimmter Form enthalten, einschließlich verarbeiteter Formen, natürlich auftretender Formen und gereinigter Formen. Eine Form von Siliciumoxid, die verwendet werden kann, ist Perlit, das ein natürlich auftretendes silikatartiges Gesteinsmaterial ist. Perlit ist im Handel erhältlich von Lieferanten wie beispielsweise der Firma American Perlite Company Redco II und Redco International, alle mit Firmensitzen in North-Hollywood, Kalifornien, USA. Ein anderes Medium des Siliciumoxid-Typs ist gebranntes Siliciumoxid, erhältlich als AEROSIL, ein Produkt der Firma Degussa Corporation, Parsippany, New Jersey, USA. Ein weiteres Beispiel ist gefälltes Siliciumoxid. Noch andere Formen von Medien des Siliciumoxid-Typs sind für Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich in einfacher Weise offensichtlich.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein Filter-Medium des Siliciumoxid-Typs trägermäßig auf einem Filter-Träger aufgetragen, der für eine hohe Oberfläche und strukturelle Unversehrtheit sorgt. Cellulose und Cellulose-Derivate sind Beispiele geeigneter Träger, und andere sind Fachleuten mit Sachverstand im technischen Bereich der Filtration und Chromatographie in einfacher Weise offensichtlich. Ein Beispiel eines Trägers für ein Filter-Material des Siliciumoxid-Typs ist ZETA PLUS^®, ein AEROSIL-Filter auf Cellulose als Träger, erhältlich von der Firma Cuno Incorporated Meriden, Connecticut, USA. Das Filter kann jede beliebige von verschiedenen physikalischen Formen annehmen, in denen Filter allgemein erhältlich sind. Beispiele sind Vorfilter-Kartuschen, Scheiben, Membrane, Pads und Kapseln. Eine Filtration kann auch durchgeführt werden mit einem Aufschlämm-Filter, gefolgt von einer Fest-Flüssig-Trennung durch einfache Filtration.
Vor der Siliciumoxid-basierten Filtration zum Entfernen von CRP kann das Ausgangs-Material (d.h. die Basis-Matrix) auf eine bestimmte Gesamt-Protein-Konzentration entweder konzentriert oder verdünnt werden, sofern dies erwünscht ist. Dies kann wünschenswert sein, wenn beispielsweise die Filtration zum Entfernen von CRP am besten bei einer speziellen Konzentration oder in einem speziellen Konzentrations-Bereich durchgeführt wird. Sowohl eine Konzentration als auch eine Verdünnung kann erreicht werden durch in diesem technischen Gebiet bekannte Verfahrensweisen. Eine Konzentration kann beispielsweise erreicht werden durch Ultra-Filtration unter Verwendung von Ultra-Filtrations-Membranen mit einem Molekulargewichts-Rückhalte-Wert (Cutoff) von 1.000, um ein Entfernen von Wasser und Salzen zu ermöglichen, und eine Verdünnung kann erreicht werden durch Zusatz von Kochsalz-Lösung. Eine typische Ziel-Konzentration an Gesamt-Protein kann innerhalb des Bereichs von etwa 3 g/dl bis etwa 10 g/dl liegen.
Eine Einstellung des pH-Werts auf einen Wert nahe dem Neutral-Punkt kann ebenfalls vor einer Filtration erfolgen, wenn die Matrix nicht bereits bei einem pH-Wert nahe dem Neutral-Punkt ist. Ein bevorzugter End-pH-Wert-Bereich liegt bei etwa 6,5 bis etwa 7,5 oder am meisten bevorzugt bei etwa 7,0 bis etwa 7,5. Eine Einstellung kann erreicht werden durch Zusatz irgendeiner geeigneten Säure oder Base, die darüber hinaus gegenüber den Matrix-Komponenten inert ist.
Die Menge an CRP, die durch Filtration entfernt wird, ist für die Erfindung nicht kritisch, sondern kann jede beliebige Menge sein, die die CRP-Konzentration auf einen Wert verringert, der geeignet dafür ist, als niedrigster Konzentrations-Kontroll-Wert zu dienen, und der mit höheren Konzentrationen in verschiedenen Mengenverhältnissen gemischt werden kann, um einen Satz von Kontroll-Werten bei abgestuften Konzentrationen zu liefern, die den gewünschten Bereich abdecken. In der bevorzugten praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung ist die CRP-Konzentration nach der Filtration geringer als 0,1 mg/l, noch mehr bevorzugt weniger als 0,05 mg/l und am meisten bevorzugt innerhalb des Bereichs von 0,01 mg/l bis 0,05 mg/l. Ein Mischen des Filtrats mit nicht-filtrierten Mengen-Portionen erfolgt dann, um einen Bereich von Konzentrationen zu erreichen, von denen die ungemischte, an CRP verarmte Kontroll-Probe die niedrigste ist. Der Bereich selbst ist niedrig genug, um analytische Schwankungen nachzuweisen. Allgemein liegt der Bereich unterhalb des Bereichs von CRP in normalen gesunden Patienten, d. h. unterhalb von 3 mg/l. Drei oder mehr Konzentrations-Werte werden vorzugsweise auf diese Weise hergestellt, die beispielsweise im Bereich von unter 0,05 mg/l bis 3 mg/l oder mehr bevorzugt von etwa 0,1 mg/l bis etwa 1,0 mg/l liegen. Sobald einmal dieser Bereich von Kontroll-Proben niedriger Konzentrationen hergestellt wurde, kann er durch zusätzliche Kontroll-Proben bei höheren Konzentrationen ergänzt werden, einschließlich derjenigen, die im Handel erhältlich sind. Diese Kontroll-Proben höherer Konzentration werden allgemein hergestellt, indem man entweder natives oder rekombinantes CRP normalem menschlichem Serum zusetzt, statt CRP aus dem Serum zu extrahieren. Kontroll-Proben höherer Konzentration sind erhältlich beispielsweise von der Firma Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornien, USA, unter den Bezeichnungen LIQUICHEK^TM Immunology Control und LYPHOCHEK^® Immunology Plus Control.
Nach Filtration des Ausgangs-Materials durch das Filter des Siliciumoxid-Typs und nach Mischen – sofern ein Mischen durchgeführt wird – kann ein anti-mikrobielles Mittel zugesetzt werden, um dem Material Stabilität zu verleihen. Natriumazid ist ein Beispiel eines anti-mikrobiellen Mittels. Andere Beispiele sind Gentamycin, Ciprofloxacin, Neomycinsulfat und Chloramphenicol. Noch weitere Beispiele ergeben sich für Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich in einfacher Weise offensichtlich. Die passende Menge an anti-mikrobiellem Mittel ist jede beliebige Menge, die eine antimikrobielle Wirkung erreicht, d. h. die die Proteine und andere Spezies in der Matrix stabil gegen einen mikrobiellen Angriff macht. In den meisten Fällen liegen geeignete Mengen im Bereich von etwa 0,01 mg/dl bis etwa 0,5 mg/dl. Sobald die Kontroll-Probe einmal hergestellt ist, kann sie einem Vorgang der Steril-Filtration unterworfen werden, in einem aseptischen Fläschchen versiegelt werden und eingefroren werden, bis sie zum Gebrauch fertig ist.
Jede Human-Körperflüssigkeit, die CRP enthält, kann als Ausgangsmaterial verwendet werden. Beispiele sind Cerebrospinal-Flüssigkeit, Urin, Speichel, Gesamtblut, Serum und Plasma. Serum und Plasma sind bevorzugt.
Das folgende Beispiel wird für Veranschaulichungs-Zwecke angeboten, und es ist nicht beabsichtigt, dass dieses den Umfang der Erfindung beschränkt.
Beispiel
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von an CRP verarmtem Human-Serum und das Mischen des verarmten Serums mit normalem Human-Serum zur Herstellung von Kontroll-Proben niedriger Konzentration, die für klinische Test-Verfahren für hsCRP in Konzentrationen bei oder unter 1,0 mg/l vorgesehen sind.
Herstellung von normalem Human-Serum
Einheiten von normalem Human-Plasma wurden zusammengefasst und nach herkömmlichen Verfahrensweisen unter Bildung einer Basis-Serum-Matrix defibriniert. Die Gesamt-Protein-Konzentration der Matrix wurde auf 6,0 g/dl eingestellt durch Konzentrieren der Matrix oder Verdünnen der Matrix mit normaler Kochsalz-Lösung. Der pH-Wert der Matrix wurde dann auf 7,3 eingestellt. Die Konzentration an endogenem CRP in der Matrix wurde dann bestimmt durch den BN 100-Test der Firma Dade Behring Inc., und durch einen hsCRP-Test, erhalten von der Firma Kamiya Biomedical Company (Seattle, Washington, USA). Die Proben zeigten, dass die Konzentration an endogenem CRP 1,1 mg/l betrug.
Herstellung von an CRP verarmtem Human-Serum

Weitere Einheiten von normalem Human-Plasma wurden zusammengefasst und defibriniert, und die Gesamt-Protein-Konzentration wurde auf 6,0 g/dl eingestellt, und der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt, wie dies oben beschrieben wurde. Die resultierende Matrix wurde dann durch Filter-Pads oder Kapseln filtriert, die aus einem gefällten Siliciumoxid oder Perlit auf Cellulose bestanden, wofür man ein mit Druck beaufschlagtes Filtrations-Gehäuse verwendete. Die Konzentration an CRP in dem Filtrat wurde dann wie oben bestimmt, und die Ergebnisse zeigten an, dass die Konzentration unterhalb der Men gengrenze sowohl des BN 100-Tests lag (dessen Grenzwert 0,175 mg/l betrug) und des Kamiya-hsCRP-Tests lag (dessen Grenzwert 0,05 mg/l betrug), was ein effizientes und erfolgreiches Entfernen von CRP aus der Serum-Basis-Matrix anzeigte. Lipide und Lipid-Komponenten wurden auch bei der Filtration entfernt. Dies erhöhte die Klarheit und Lagerstabilität des Produkts. Die nachfolgende Tabelle 1 listet die Konzentrationen an CRP und Lipid-Komponenten von einer typischen Serum-Probe sowohl vor als auch nach der Filtration auf, wobei die CRP-Werte so angegeben sind, wie sie durch jeden der beiden Tests bestimmt wurden. Tabelle 1 Konzentrationen an CRP und Lipid im Serum vor und nach einer Filtration

	CRP (bestimmt durch BN 100) (mg/l)	CRP (bestimmt durch Kamiya) (mg/l)	Cholesterin (mg/dl)	Triglyceride (mg/dl)	HDL (mg/dl)
Vor der Filtration	1,1	1,02	117	75,7	30,5
Nach der Filtration	< 0,175	< 0,05	< 3	< 4	< 3

Serum-Protein-Konzentrationen, einschließlich Albumin, Immunglobulin und Gesamt-Protein, wurden auch bestimmt, und zwar vor und nach einer Filtration. Dies erfolgte mittels herkömmlicher Verfahrensweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, die angibt, dass die Änderungen nicht signifikant waren. Tabelle 2 Konzentrationen an Serum-Protein vor und nach einer Filtration

Zu analysierende Substanz Einheiten vor der Filtration nach der Filtration

Gesamt-Protein g/dl 6,7 6,4

Albumin g/dl 3,8 3,8

Immunoglobulin-G mg/dl 957 826
Mischen von normalen und an CRP verarmten Seren
Die an CRP verarmten und die normalen Seren wurden gemischt in einem Bereich von Mengen-Verhältnissen, dass man Referenz-Kontroll-Proben mit niedriger CRP-Konzentration in abgestuften Konzentrations-Werten erhielt. Beispielsweise wurde zur Herstellung von 1 Liter jeder der Kontroll-Proben mit Ziel-CRP-Konzentrationen von 0,3, 0,6 und 0,9 mg/l an CRP verarmtes Serum in Mengen von 725, 450 und 100 ml mit normalem Serum in Mengen von 275, 550 bzw. 900 ml gemischt. Die CRP-Konzentration wurde für jeden Kontroll-Wert bestimmt, und sofern dies nötig war, wurde die CRP-Konzentration in jeder Kontroll-Probe auf den Ziel-Wert durch Zugabe entweder von weiterem, an CRP verarmtem Serum oder durch Zugabe von normalem Serum eingestellt. Natriumazid (0,084 mg/dl) wurde danach jeder Kontroll-Probe zugesetzt, und die Kontroll-Proben wurden 30 min lang bei Raumtemperatur gemischt, durch ein 0,2 μm-Filter steril filtriert und aseptisch in sterile Glasfläschchen gegeben, die dann mit sterilen Stopfen und Aluminium-Dichtungen versiegelt wurden. Die Fläschchen wurden dann bei –10 bis –20°C gelagert.
Durchführung der Kontroll-Messungen

Die Schwankung der Kontroll-Proben wurde bewertet durch die oben angesprochenen Tests, also den Dade-Behring-Test und den Kamiya-Test. Werte für den Mittelwert, die Standard-Abweichung (SD) und den Schwankungs-Koeffizient (CV) für jeden dieser drei Werte sind in der nachfolgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Produkt-Schwankung

Test-Verfahren	Wert 1			Wert 2			Wert 3
	Mittelwert (mg/l)	SD	%CV	Mittelwert (mg/l)	SD	%CV	Mittelwert (mg/l)	SD	%CV
Dade Behring	0,30	0	0	0,59	0,03	5,1	0,91	0,03	3,3
Kamiya	0,19	0,01	5,3	0,50	0,01	2,0	0,87	0,04	4,6

Die CV-Werte in Tabelle 3 sind vergleichbar den Werten, wie sie von typischen Patienten-Proben erhalten wurden, wenn sie mittels hsCRP-Tests getestet wurden. Die Kontroll-Werte gemäß der vorliegenden Erfindung genügen damit einem der wichtigsten Kriterien eines Qualitäts-Kontroll-Materials, das gegenüber allen vorweggenommenen Testschwankungen und analytischen Schwankungen so empfindlich wie eine tatsächliche Patienten-Probe sein muss. Typischerweise sagen hsCRP-Test-Kits einen Schwankungs-Wert (CV) für Patienten-Proben von weniger als 6 % voraus.
Die Stabilität der Kontroll-Proben unter Bedingungen geschlossener Fläschchen wurde durch ein beschleunigtes Stabilitäts-Modell bewertet. In Übereinstimmung mit diesem Modell wurden Fläschchen der Kontroll-Proben bei 25°C für verschiedene Zeitdauern gelagert und dabei der Abbau oder die Zersetzung der zu analysierten Substanz schneller beobachtet als bei der empfohlenen Lager-Temperatur von –10 bis –20°C. Am Ende der Inkubations-Perioden von einem, zwei und drei Tagen wurde der Gehalt der Glas-Fläschchen auf seine jeweilige CRP-Konzentration getestet. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, in der die Rauten für die Kontroll-Probe des Werts 1, die Quadrate für die Kontroll-Probe des Werts 2 und die Dreiecke für die Kontroll-Probe des Werts 3 stehen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Änderungen der CRP-Konzentration entweder unnachweisbar oder nicht signifikant waren. Diese Ergebnisse sind äquivalent denjenigen, die über eine Zwei-Jahres-Periode erhalten würden, wenn die Fläschchen ungeöffnet bei –10 bis –20°C gelagert würden.
Ein Realzeit-Test mit geschlossenem Fläschchen wurde über einen längeren Zeitraum durchgeführt, indem man die geschlossenen Fläschchen bei –10 bis –20°C lagerte. Analysen wurden abgenommen zum Zeitpunkt des Starts des Tests und nach drei Monaten. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, in denen die Symbole die gleichen sind wie diejenigen, die in 1 verwendet wurden. Hier zeigen die Ergebnisse ebenfalls, dass die Änderungen der CRP-Konzentration entweder nicht nachweisbar oder nicht signifikant waren.
Die Stabilität der Kontroll-Proben unter Bedingungen offener Fläschchen wurde bewertet durch Simulieren der Bedingungen, unter denen die Kontroll-Proben tatsächlich von Klinik-Ärzten verwendet würden. Dies erfolgte durch Lager der Fläschchen in einem Eisschrank bei 2 bis 8°C und Entfernen der Fläschchen aus dem Eisschrank einmal täglich für sieben aufeinanderfolgende Tage, Belassen der Fläschchen zum Equilibrieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten und anschließend Öffnen der Fläschchen und In-Kontakt-Bringen ihres Inhalts mit der Labor-Umgebung, und anschließendes Schließen der Fläschchen und erneutes Zurückbringen der Fläschchen in den Eisschrank. Die Ergebnisse für die Tage 3, 5 und 7 sind in 3 gezeigt, und diese zeigen an, dass die Änderungen der CRP-Konzentration entweder nicht nachweisbar oder nicht signifikant waren.
Die vorangehenden Ausführungen werden in erster Linie für Zwecke der Veranschaulichung präsentiert.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Referenz-Kontrolle mit subnormaler Konzentration für eine Analyse von C-reaktivem Protein bei einem Körper-Fluid eines Menschen, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein Anpassen des pH-Werts einer Probe eines Körper-Fluids eines Menschen, das eine Gesamt-Protein-Konzentration von wenigstens 4,0 g/dl aufweist, an einen pH-Wert innerhalb des Bereichs von 6,5 bis 7,5, wenn die Probe nicht innerhalb des Bereichs liegt, um eine im wesentlichen neutrale Probe zu erhalten; und (b) ein Durchleiten der im wesentlichen neutralen Probe durch ein Siliciumoxid enthaltendes Filter-Medium unter Extrahieren von C-reaktivem Protein von der Probe in selektiver Weise, relativ zu anderen Proteinen in der Probe, unter Produzieren einer an C-reaktivem Protein verarmten Probe.
Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1, weiter umfassend ein Zusetzen eines antimikrobiellen Mittels zu der an C-reaktivem Protein verarmten Probe.
Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Körper-Fluid eines Menschen ein Fluid ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Blut, Serum und Plasma.
Verfahren in Übereinstimmung mit Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Körper-Fluid eines Menschen ein Fluid ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Serum und Plasma.
Verfahren in Übereinstimmung mit einem vorangehenden Anspruch, worin das Siliciumoxid enthaltende Filter-Medium ein Medium ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Kieselpuder und Perlit.
Verfahren in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Siliciumoxid-enthaltende Filter-Medium ein Medium ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Kieselpuder und Perlit auf Cellulose als Träger.