DE60221161T2

DE60221161T2 - Einfaches, effizientes und beschleunigtes verfahren zur enzym-katalysierten in vitro modifizierung und herstellung von nukleinsäuren unter verwendung von bestrahlung im mikrowellenbereich

Info

Publication number: DE60221161T2
Application number: DE60221161T
Authority: DE
Inventors: Rakha Hari Das; Pradip Nahar
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2022-07-05
Also published as: ATE366805T1; DK1521826T3; JP4163686B2; KR20050016977A; IL166136A0; CN1650002A; KR100910280B1; JP2005531324A; WO2004005505A1; CN1309827C; EP1521826B1; AU2002345298B2; CA2491629C; US20030232342A1; CA2491629A1; AU2002345298B9; EP1521826A1; AU2002345298A1; DE60221161D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein einfaches, effizientes und beschleunigtes Verfahren zur Enzym-katalysierten in vitro-Modifizierung und Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung einer nicht-unterbrochenen und kurzen Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz, welche von 2300 und 2500 MHz eingeschlossen reicht, wobei die Leistungsabgabe von 600 bis 900 Watt eingeschlossen reicht, und für eine Zeitspanne, welche von 5 bis 120 Sekunden eingeschlossen reicht, und des Weiteren eine Vorrichtung zur Anwendung des Verfahrens.
Den Hintergrund bildender Stand der Technik
Enzymatische Reaktionen von Nukleinsäuren sind für Molekularbiologen von entscheidender Bedeutung. Die am häufigsten verwendeten enzymatischen Reaktionen in der Molekularbiologie sind ortsspezifische Spaltungs-, Ligations-, Dephosphorylierungs-, Phosphorylierungs-(Kinations-) und in vitro-DNA- und -RNA-Synthese-Reaktionen. Diese Reaktionen werden durch unterschiedliche Enzyme, wie Restriktionsendonuklease, Ligase, Phosphatase, Kinase, DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und RNA-Polymerase, ausgeführt. Diese Reaktionsprodukte haben ein breites Spektrum von Anwendungen im Rahmen der Molekularbiologie.
Die Entdeckung von mehreren Restriktionsendonukleasen (RENS) war der Startschuss für die moderne Biotechnologie. Diese Enzyme katalysieren die sequenzspezifische hydrolytische Spaltung von doppelsträngiger DNA durch Einführen eines Schnitts („Nicking") in den gegenüberliegenden Strängen.
Ligase ist ein anderes wichtiges Enzym, welches die Nukleinsäuren durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei kompatiblen Enden von doppelsträngiger DNA und einzelsträngigen Brüchen (Nicks) in DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybriden modifizieren kann [Engler, M. J., und Richardson, C. C. (1982) in The Enzymes (Boyer, P. D., Hrsg.), Band 5, S. 3, Academic Press, San Diego]. Die Produkte von durch DNA-Ligase katalysierten Reaktionen werden zum Klonieren und für die Manipulation von Genen benötigt.
Phosphatase katalysiert die Entfernung von endständigen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren [Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] und ist erforderlich, um den Vektor-Hintergrund beim Klonieren und Endmarkieren mit [γ³²P]-ATP zu verringern.
Polynukleotidkinase modifiziert die Nukleinsäuren durch Transferieren oder Austauschen der Phosphatgruppe von der γ-Position von ATP zu dem 5'-Hydroxylterminus von Polynukleotiden (doppel- und einzelsträngige DNA und RNA) und Nukleosid-3'-monophosphaten [Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York].
Die Matrizen-gesteuerte Synthese von DNA und RNA, die durch jeweilige Polymerasen katalysiert wird, wird im Rahmen der Forschung an rekombinanter DNA routinemäßig ausgeführt. Die durch DNA-Matrizen gesteuerte DNA-Synthese wird verwendet bei der Herstellung von radioaktiv markierten Hybridisierungssonden durch Nick-Translation [Rigby et al. (1977), J. Biol. Chem. 113:237] und bei Endenauffüllreaktionen zur Ligation und Markierung von DNA-Fragmenten, bei der Synthese von den zweiten Strang bildender cDNA, Polymerasekettenreaktion (PCR), DNA-Sequenzierung u.s.w.
Die durch RNA-Matrizen gesteuerte DNA-Synthese, die durch reverse Transkriptase katalysiert wird, wird für die Synthese von cDNA und die Amplifizierung von Genen durch RT-PCR benötigt. Die durch DNA-Matrizen gesteuerte RNA-Synthese (Transkription) wird eingesetzt für die Identifizierung von RNA-Polymerase-spezifischen Promotoren, gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen und die Herstellung von hochgradig markierten RNA-Sonden u.s.w.
Traditionell werden die Reaktionen durch Inkubation in einem bei der optimalen Temperatur, bei welcher das Enzym maximale Aktivität zeigt, gehaltenen Wasserbad ausgeführt. Die Inkubationsdauer variiert von Minuten bis zu Stunden abhängig von dem jeweiligen Enzym und dem Substrat wie auch von deren Konzentrationen. Die meisten dieser Reaktionen müssen oftmals reihenweise ausgeführt werden, um ein jeweiliges Ziel zu erreichen, da das oder die Produkt(e) von einer Reaktion das Substrat für eine andere ist bzw. sind. Sogar obwohl die meisten von diesen Reaktionen einige wenige Minuten bis Stunden benötigen, ist die Gesamtzeit, welche verstreicht, um einen jeweiligen Satz von Reaktionen vollständig ablaufen zu lassen, relativ hoch. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, eine längere Reaktionszeit zuzugestehen, um den vollständigen Ablauf einer Reaktion sicherzustellen.
Ein Hauptnachteil der traditionellen Vorgehensweisen ist die lange Reaktionszeit und die Molekularbiologen haben viel von ihrer kostbaren Zeit damit verbracht, die zeitaufwändigen Experimente mit diesen Enzymen auszuführen. Eine der Arten und Weisen, um die Enzym-katalysierte Reaktion schneller zu machen, besteht darin, entweder das Enzym oder das Substrat oder beide zu aktivieren. Eine organische Reaktion wird üblicherweise beschleunigt durch thermisches Erwärmen, was im Falle von Enzymen nicht immer möglich ist, da die meisten von diesen gegenüber einer Hitzeinaktivierung empfindlich sind. Eine der alternativen Weisen, um eine chemische oder biologische Reaktion zu beschleunigen, besteht darin, Mikrowellen als Energiequelle zu verwenden. Tatsächlich ist die Verwendung von Mikrowellen zum Beschleunigen der Geschwindigkeit von organischen Reaktionen seit langem bekannt.
1986 zeigten Gedbye et al. und Giguere et al., dass viele organische Reaktionen durch Mikrowellenbestrahlung sehr schnell ausgeführt werden konnten [Gedye, R. N., et al., Tetra hedron Lett. (1986), 26, 279; Giguere, R. J. et al., Tetrahedron Lett. (1986), 27, 4945–4948]. Seit damals ist die Vielseitigkeit der „Microwave-induced Organic Reactions Enhancement" (MORE; Mikrowellen-induzierte Verstärkung von organischen Reaktionen)-Chemie von vielen Autoren bei verschiedenen organischen Reaktionen, wie katalytischer Hydrierung, Diels-Alder-Reaktion, radikalischen Reaktionen, Acylierung, Deacylierung u.s.w., gezeigt worden [Bose, A. K., et al., Res. Chem. Intermed. (1994) 20, 1–11; Bose, A. K., et al., J. Org. Chem. (1991) 56, 6968–6970; Nahar, P., Tetrahedron Lett. (1997), 38, 7253–7254]. Praktisch alle diese Reaktionen wurden in einem Haushalts-Mikrowellenherd, welcher bei einer Frequenz von 2450 MHz betrieben wird, ausgeführt und die maximale Leistungsabgabe beträgt etwa 700 Watt. Diese Herde haben üblicherweise 10 unterschiedliche Einstellungsmöglichkeiten oder Stufen, welche der unterschiedlichen Leistungsabgabe entsprechen, wobei die Einstellungsmöglichkeit bzw. Stufe zehn die maximale oder höchste Leistungsabgabe aufweist, wohingegen die Einstellungsmöglichkeit bzw. Stufe eins die geringste Leistungsabgabe des Mikrowellenherds aufweist. Obwohl eine drastische Verringerung der Zeit der Hauptvorteil von Mikrowellenreaktionen ist, wurde auch über die Selektivität oder Spezifität der Reaktionen berichtet [Nahar, P., Tetrahedron Lett. (1997), 38, 7253–7254].
Mikrowellen-Energie ist auch erfolgreich für Proteinassays [Akins, Jr., et al.; U.S.-Patente Nr. 5,403,747 und 5,478,748 ] und Immunhistochemie [Bonn, M. E., et al.; Am. J. Clin. Pathol. (1989), Boon, M. E., et al.; in: Microwave Cookbook of Pathology: The art of Microscopic Visualisation] verwendet worden. Es ist auch die Hydrolyse von Adenosintriphosphat durch Mikrowellenbestrahlung untersucht worden [Jahngen, E. G. E., et al., J. Org. Chem. (1990) 55, 3406–3409].
Die Wirkung von Mikrowellenbestrahlung auf Biopolymere, speziell auf Enzyme und DNA, ist von mehreren Forschern untersucht worden. Es gab jedoch widersprüchliche Berichte über die Wirkung von Mikrowellenbestrahlung auf die Biomoleküle. In einigen Fällen wurden Mikrowellen verwendet, um Hirnenzyme von kleinen Labortieren zu inaktivieren [Galli, Claudio, und Racagni, Giogio, Methods in Enzymology, (1982) 86, 636–642]. Byus, C. V., et al. haben jedoch eine Zunahme der Ornithindecarboxylase-Aktivität in kultivierten Zellen bei Verwendung von Mikrowellen-Energie gefunden [Byus et al., Cancer Res. (1988) 48, 4222–4226]. Es existieren auch Berichte, wo eine Verstärkung wie auch eine Repression von zellulärer Enzymaktivität beobachtet worden ist [Dutta, S. K., und Verma, M., Current Science (1989) 58, 58–63; Dutts, S. K., und Verma, M., Current Science (1988) 57, 779–786]. Maleev, V. Ya., et al. konnten keinerlei Wirkung einer verstärkten Mikrowellen-Absorption durch DNA feststellen (Maleev, V. Ya., et al., Biopolymers (1987) 26, 1965–1970). Jedoch kann gemäß Narasimhan et al. ein DNA-Molekül einen Einzelstrangbruch, Doppelstrangbruch, lokalisierte Strangtrennungen u.s.w. zeigen, wenn es Mikrowellen ausgesetzt wird [Narasimhan, V., und Huh, W. K.; Biochem. International (1991) 25, 363–370].
Über eine Verstärkung von enzymatischen Reaktionen für Nukleinsäuresynthese und -modifizierungen durch Mikrowellen ist bislang nicht berichtet worden, obwohl über den Nukleinsäureverdau durch Restriktionsenzyme von Jhingan berichtet worden war ( U.S.-Patent Nr. 5,350,686 ). Der Autor verdaute DNA durch ein Restriktionsenzym unter Verwendung von Mikrowellenenergie bei einer niedrigsten Leistungsstufe, d. h. 10% der Abgabeleistung von 700 Watt eines Standard-Mikrowellenherds. Während der Reaktion verwendete der Autor auch eine Reihe von Intervallen, in welchen Mikrowellenleistung nicht auf die Reaktionsmischung angewendet wird. Bei diesem Verfahren betrug die gesamte Reaktionszeit für Verdauungsreaktionen mit den meisten der Enzyme zwischen 6 und 15 min. Jedoch zeigten einige der Kontrollproben von Plasmid-DNA, wenn sie bei 37°C inkubiert wurden, nahezu vollständig verdaute Produkte. Aus diesem Experiment wird nicht klar, wie viel Mikrowellenbestrahlung für die obigen enzymatischen Reaktionen verantwortlich war, da den größten Teil der Reaktionszeit das Enzym nicht korrekte bzw. geeignete Mikrowellenstrahlung erreichte. Es scheint, dass in diesen Fällen die Zeitdauer eine wichtigere Rolle als die Mikrowellen gespielt hat.
Das berichtete Verfahren ( U.S.-Patent Nr. 5,350,686 ) für eine Mikrowellen-vermittelte Enzym-katalysierte Modifizierung von Makromolekülen weist mehrere Nachteile auf, wie (1), dass der Zeitgewinn nicht attraktiv war. Es könnte möglich sein, vergleichbare Ergebnisse für einige der Restriktionsenzymverdauungsreaktionen außerhalb eines Mikrowellenherds in der gleichen Zeit bei 37°C zu erhalten; (2) die Prozedur erfordert eine Reihe von Intervallen, in denen keine Mikrowellenenergie oder -leistung auf die Reaktionsmischung angewendet wird; (3) es gab keine einheitlichen Bedingungen für enzymatische Reaktionen. In den meisten der Fälle verwendete der Autor unterschiedliche Mikrowellen-Expositionszeiten für die Verdauungsreaktion unter Verwendung von Restriktionsenzymen; und (4) eine Automatisierung des Verfahrens wird nicht sehr effektiv sein aufgrund (a) einer längeren Reaktionsdauer und (b) fehlender Einheitlichkeit von Reaktionsbedingungen.
Die Anmelder haben bei der vorliegenden Erfindung alle der obigen Nachteile überwunden. Für eine jegliche Reaktion werden optimale Bedingungen benötigt. Optimale thermische Energie beschleunigt eine enzymatische Reaktion, unter milden Bedingungen (unterhalb von optimalen Bedingungen) verlangsamt sich die Reaktion, wohingegen unter drastischen Bedingungen (oberhalb von optimalen Bedingungen) das Enzym inaktiviert wird. Das Gleiche trifft auf Reaktionen unter Verwendung von Mikrowellenenergie zu. Wenn optimale Bedingungen nicht aufrechterhalten werden, können enzymatische Reaktionen ruiniert werden oder ein unvollständiges Reaktionsprodukt liefern. Im Rahmen der Erfindung wurden geeignete Bedingungen gefunden, von denen die meisten im Widerspruch zu dem Verfahren, über welches bereits berichtet worden ist, stehen oder im Stand der Technik nicht bekannt sind.
Darüber hinaus hängt eine enzymatische Reaktion durch Mikrowellen abgesehen von dem Enzym und dem Substrat stark von der Zusammensetzung der Reaktionsmischung ab.
Puffer, sein pH, Salzkonzentration und andere Inhaltsstoffe spielen bei enzymatischen Reaktionen eine wichtige Rolle, insbesondere wenn sie durch Mikrowellen erfolgen. Wir haben erfunden, dass in einem Verdünnungspuffer, welcher 50% (Vol./Vol.) Glycerol enthält, das Restriktionsenzym inaktiviert wurde, wenn es kontinuierlichen Mikrowellen mit hoher Leistung ausgesetzt wurde, sogar für einen kurzen Zeitraum (15 s und mehr), wohingegen es bei einer konventionellen Reaktion bei 37°C aktiv blieb. Durch den Lieferanten wird Verdünnungspuffer empfohlen, um das hochkonzentrierte Enzym zu verdünnen, sofern erforderlich.
Im Gegensatz zu den von Jhingan ( U.S.-Patent Nr. 5,350,686 ) berichteten Arbeiten haben wir jetzt erfunden, dass eine enzymatische Modifizierung eines biologischen Makromoleküls ausgeführt werden konnte bei der höchsten Leistungseinstellung eines Mikrowellenherds, welcher bei einer Frequenz von 2450 MHz und einer Leistung von 700 Watt betrieben wird. Darüber hinaus haben wir auch festgestellt, dass es keine Notwendigkeit für irgendeine Unterbrechung während der Mikrowellen-vermittelten enzymatischen Reaktionen gibt, was erneut im Gegensatz zu den obigen Arbeiten steht.
Ziele der Erfindung
Das Hauptziel der Erfindung besteht darin, ein schnelles und effizientes Verfahren für enzymatische Reaktionen bereitzustellen, um spezielle Produkte dieser Enzym-katalysierten Reaktionen herzustellen, die für Analyse und Manipulation von Genen im Rahmen der Molekularbiologie und der Technik der in vitro-DNA-Rekombination und auf anderen Gebieten essentiell sind.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren, welches einfach, reproduzierbar ist und keine zusätzlichen Fachkenntnisse oder kostspielige Ausrüstung erfordert, bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das auf einfache Weise automatisiert werden kann, um die meisten der enzymatischen Reaktionen, die in der Biotechnologie oder Molekularbiologie verwendet werden, in einem einzigen Instrument auszuführen.
Noch ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein eine Bestrahlung umfassendes Verfahren zu entwickeln, das nicht zu einer nachteiligen Wirkung für das Enzym führt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein einfaches, effizientes und beschleunigtes Verfahren zur Enzym-katalysierten in vitro-Modifizierung und Synthese von Nukleinsäure unter Verwendung einer nicht-unterbrochenen und kurzen Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz, welche von 2300 bis 2500 MHz eingeschlossen reicht, wobei die Leistungsabgabe von 600 bis 900 Watt einge schlossen reicht, und für eine Zeitspanne, die von 5 bis 120 s eingeschlossen reicht; und des Weiteren eine Vorrichtung zur Anwendung des Verfahrens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein einfaches, effizientes und beschleunigtes Verfahren zur Enzym-katalysierten in vitro-Modifizierung und Synthese von Nukleinsäure unter Verwendung einer nicht-unterbrochenen und kurzen Mikrowellenbestrahlung.
In einer Ausführungsform der Erfindung Bereitstellen einer Reaktionsmischung, umfassend (i) ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Restriktionsendonuklease, Ligase, Phosphatase, Kinase, reverse Transkriptase, DNA-Polymerase und RNA-Polymerase, (ii) ein Biomolekül, ausgewählt aus DNA, RNA oder Oligonukleotiden, um als ein Substrat für das ausgewählte Enzym zu wirken, (iii) einen geeigneten Puffer für das spezielle Enzym und (iv) andere Inhaltsstoffe, in einem kleinen Eppendorf-Reaktionsgefäß oder auf einem kleinen Stück Parafilm.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung Platzieren des mit der Reaktionsmischung beladenen Eppendorf-Reaktionsgefäßes oder Parafilm-Stücks in einen Mikrowellenherd.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung Bestrahlen des Eppendorf-Reaktionsgefäßes oder Parafilms kontinuierlich durch Mikrowellen mit einer Frequenz, welche von 2300 bis 2500 MHz eingeschlossen reicht, wobei die Leistungsabgabe von 600 bis 900 Watt eingeschlossen reicht.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung für eine Zeitspanne, die von 5 bis 120 s eingeschlossen reicht.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung Beenden der Reaktion durch Zugeben von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und/oder Erwärmen in einem Wasserbad bei 75°C für 3–15 min, gefolgt von der Zugabe von Gelauftragsfarbstoff.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung Analysieren des Reaktionsprodukts bzw. der Reaktionsprodukte durch Agarose-Gelelektrophorese, Autoradiographie, Radioaktivitätszählungen und andere Techniken, wie sie in den herkömmlichen Verfahren verwendet werden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die Nukleinsäure aus DNA, RNA und Oligonukleotiden ausgewählt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei andere Inhaltsstoffe, die verwendet werden, aus einer Gruppe, umfassend MgCl₂, MgSO₄, NaCl, KCl, CH₃COOK, Ethylendiamintetraacetat, Dithiothreitol, Spermidin, BSA (Rinderserumalbumin), Triton X-100, Nukleotide, Matrizen-DNA, Matrizen-RNA und Oligonukleotid-Primer, ausgewählt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die Restriktionsendonuklease aus HindIII, BamHI, EcoRI, HaeIII, BglII, PstI, BstEII und BstNI ausgewählt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendete Ligase T4-DNA-Ligase ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendete Kinase T4-Polynukleotidkinase (TPNK) ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendete Phosphatase alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die Polymerase aus der Gruppe bestehend aus E. coli-DNA-Polymerase I, dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T7-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase ausgewählt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendete reverse Transkriptase die reverse Transkriptase des Vögel-Myeloblastosevirus (AMV-RT) ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendete DNA aus der Gruppe, umfassend genomische DNA, Lambda-Phagen-DNA, Plasmid-DNA, Baculovirus-DNA, Pflanzen-DNA und Säugetier-DNA, ausgewählt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei mehr als eine Restriktionsendonuklease für einen doppelten Verdau von Nukleinsäure verwendet wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die verwendeten Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII für einen doppelten Verdau sind.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei die Mikrowellen-Bestrahlung in einem jeglichen Gerät oder einer jeglichen Kammer, wo Mikrowellen erzeugt werden können, ausgeführt werden kann.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei das Verfahren teilweise oder vollständig durch ein speziell gestaltetes Gerät automatisiert werden kann.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, eine Vorrichtung, welche für das Ausführen der enzymatischen Reaktion, wie oben angegeben, geeignet ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, eine Reaktionskammer, bestehend aus Magnetron, Sauggebläse, faseroptischem Thermometer, Kühlsystem und sich drehender Reaktionsplattform.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, ein auf Mikroprozessoren basierendes Berechnungsmittel, um einen vorprogrammierten Befehl zum Ausführen von unterschiedlichen Reaktionen durch geeignete Hardware und Software zu geben.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei ein Magnetron die Mikrowellen-Quelle ist, die bei einer Frequenz von etwa 2450 MHz betrieben wird, wobei die Leistungsabgabe von 100 Watt bis 800 Watt eingeschlossen reicht.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung betrifft diese Erfindung ein schnelles und effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Spaltung, Modifizierung und Synthese von biologischen Molekülen. Insbesondere wird die Herstellung von gestalteten Biomolekülen durch Enzym-katalysierte Reaktionen unter Verwendung einer kurzen und nicht-unterbrochenen Mikrowellenbestrahlung beschrieben. Das erfundene Verfahren ist in der Biotechnologie, insbesondere in der Molekularbiologie, im Rahmen einer auf Enzymen basierenden industriellen Verarbeitung und Abwasserbehandlung adaptierbar und auch für eine Automatisierung in dem betreffenden Gebiet geeignet.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung betrifft diese Erfindung insbesondere ein schnelles und effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Biomolekülen durch durch Mikrowellen verstärkte enzymatische Reaktionen. Diese Erfindung betrifft insbesondere ein schnelles und effizientes Verfahren, um die Enzym-katalysierte ortsspezifische Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren durch kurze und kontinuierliche Mikrowellenbestrahlung ohne eine jegliche Unterbrechung auszuführen. Die bevorzugte Mikrowellenfrequenz beträgt 2000 bis 2800 MHz eingeschlossen mit einer Leistungsabgabe von 500 bis 900 Watt eingeschlossen. Die bevorzugte Mikrowellenbestrahlungsdauer beträgt 5 bis 120 Sekunden eingeschlossen. Die Spaltung, Modifizierung und Synthese von Nukleinsäuren werden erzielt in Reaktionen, die insbesondere durch Restriktionsendonuklease, Ligase, Phosphatase, Kinase, reverse Transkriptase, DNA-Polymerase und RNA-Polymerase katalysiert werden. Die speziellen Produkte von diesen Enzym-katalysierten Reaktionen sind essentiell für Analyse und Manipulation von Genen in der Molekularbiologie und der Technik der in vitro-DNA-Rekombination.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung betrifft diese Erfindung ein schnelles Verfahren zur Herstellung von Enzym-katalysierten Reaktionsprodukten. Diese Erfindung betrifft insbesondere ein schnelles und effizientes Verfahren, um die Enzym-katalysierte ortsspezifische Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren auszuführen. Die Synthese, Modifizierung und Spaltung von Nukleinsäuren werden erzielt in Reaktionen, die insbesondere durch Restriktionsendonuklease, Ligase, Phosphatase, Kinase, DNA-Polymerase, reverse Transkriptase und RNA-Polymerase katalysiert werden. Dies ist ein sehr schnelles Verfahren bei der Ausführung von ortsspezifischen Spaltungs-, Ligations-, Dephosphorylierungs-, Phosphorylierungs-(Kinations-) und in vitro-DNA- und RNA-Synthesereaktionen. Die speziellen Produkte von diesen Enzym-katalysierten Reaktionen sind essentiell für Analyse und Manipulaton von Genen in der Molekularbiologie und der Technik der in vitro-DNA-Rekombination.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung mit einem Blick darauf, das Ziel der Erfindung zu erzielen und den Nachteil des bekannten Verfahrens für die enzymatische Reaktion zu überwinden, wird ein schnelles und effizientes Verfahren für die ortsspezifische Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren durch Mikrowellen-vermittelte enzymatische Reaktionen bereitgestellt. Die enzymatischen Reaktionen, die in der Molekularbiologie verwendet werden, nämlich ortsspezifische Spaltung, Ligation, Dephosphorylierung, Phosphorylierung (Kination), in vitro-DNA-Synthese und in vitro-RNA-Synthese, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die Erfindung, (a) die Reaktionsmischung, welche das Enzym, Substrat, geeigneten Puffer und andere Inhaltsstoffe (wie in den Beispielen beschrieben) enthält, einer Mikrowellen-Exposition in dem Mikrowellenherd bei der höchsten Leistungsabgabe des Mikrowellenherds (700 Watt) für eine kurze Zeitspanne ohne eine jegliche Unterbrechung zu unterwerfen.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung führt das Verfahren zu der ortsspezifischen Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren in 5 bis 120 Sekunden. Die durch das erfundene Verfahren ausgeführten enzymatischen Reaktionen zeigten reproduzierbare Ergebnisse, welche das Verfahren vielseitig machen. Es wird diese neue Entdeckung für die Spaltung, Modifizierung und Synthese von Makromolekülen, insbesondere Nukleinsäuren, in weniger als 140 Sekunden durch die Exposition der Enzym-Substrat-Reaktionsmischung gegenüber kurzen und nicht-unterbrochenen Mikrowellen offenbart.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist dies ein sehr schnelles Verfahren, das bislang für die Enzym-katalysierte ortsspezifische Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren bekannt ist. Die in vitro-Synthesen in dem erfundenen Verfahren umfassen DNA-Matrizen-gesteuerte DNA- und RNA-Synthesen und die durch RNA-Matrizen gesteuerte DNA-Synthese (Umkehrtranskription). Das Verfahren verfügt über das Potential zur Automatisierung.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht die Neuheit der Erfindung darin, dass die meisten der Reaktionen innerhalb von 5–150 Sekunden abgeschlossen sind, wobei die Mikrowellen-Wirkung klar aufgrund des Zeiteffekts gezeigt wird In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht eine andere Neuheit der Erfindung in der Feststellung, dass Restriktionsenzyme in Verdünnungspuffer, welcher 50% (Vol./Vol.) Glycerol enthält, ihre enzymatischen Eigenschaften verloren, wenn sie Mikrowellen-Energie sogar auch nur für eine kurze Zeitspanne bei hoher Leistungsabgabe ausgesetzt wurden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht eine andere Neuheit der Erfindung darin, dass die Restriktionsenzyme in Verdauungspuffer aktiv blieben, wenn sie Mikrowellen-Energie bei hoher Leistungsabgabe (700 Watt) für eine kurze Zeitspanne (wenigstens 140 s) ohne eine jegliche Unterbrechung ausgesetzt wurden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht eine andere Neuheit der Erfindung darin, dass die Reaktionsbedingungen einheitlicher sind im Gegensatz zu dem be richteten Verfahren, wo in den meisten Fällen ein Verdau von DNA durch unterschiedliche Restriktionsenzyme unterschiedliche Reaktionsbedingungen erforderte.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht eine andere Neuheit der Erfindung darin, dass nahezu alle enzymatischen Reaktionen, die in der Molekularbiologie üblicherweise verwendet werden, durch das erfundene Verfahren ausgeführt werden können.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht eine andere Neuheit der Erfindung darin, dass die Erfindung auf einfache Weise automatisiert werden kann, um die meisten der enzymatischen Reaktionen, die in der Molekularbiologie verwendet werden, in einem einzigen Instrument auszuführen.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung stellt die Erfindung ein schnelles und effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren durch Mikrowellen-induzierte enzymatische Reaktionen, nämlich ortsspezifische Spaltung, Ligation, Dephosphorylierung, Phosphorylierung (Kination), in vitro-DNA-Synthese und in vitro-RNA-Synthese, bereit. Das Verfahren umfasst, die Reaktionsmischung, welche das Enzym enthält, einer Mikrowellen-Exposition in dem Mikrowellenherd bei der höchsten Leistungsstufe für eine kurze Zeitspanne ohne eine jegliche Unterbrechung zu unterwerfen. Enzymatische Reaktionen sind ein empfindliches Verfahren, wo ungeeignete Bedingungen die Ergebnisse beeinträchtigen können.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung haben die Erfinder enzymatische Aktivität nach Mikrowellen-Exposition bei der höchsten Leistungsstufe eines Mikrowellenherds (700 Watt) für eine kurze Zeitspanne, welche von 5 bis 120 s eingeschlossen reicht, gefunden. Unsere Feststellungen stehen in Gegensatz zu dem Bericht ( U.S.-Patent Nr. 5,350,686 ), wo eine Inaktivierung der Enzyme nach einer Mikrowellen-Exposition bei einer viel geringeren Leistungsstufe gefunden wurde. Dies kann zurückzuführen sein auf die Tatsache, dass der Stand der Technik viel längere Bestrahlungszeiten, welche von 15 bis 31 Minuten mit einer unterschiedlichen Anzahl von Intervallen reichten, verwendete. Die Erfinder führten die enzymatischen Reaktionen durch Mikrowellenbestrahlung bei der höchsten Leistungsstufe für eine kurze Zeitspanne ohne eine jegliche Unterbrechung aus.
Detaillierte Beschreibung der begleitenden Zeichnungen
1
Stabilität von HindIII bei einer Mikrowellen-Exposition bei 700 Watt
HindIII in seinem Verdauungspuffer wurde Mikrowellen für unterschiedliche Zeitspannen ausgesetzt: 0 (Bahn 1), 30 (Bahn 2), 50 (Bahn 3), 70 (Bahn 4), 90 (Bahn 5), 110 (Bahn 6) und 130 (Bahn 7) Sekunden. Für unterschiedliche Zeitspannen bestrahltes HindIII wurde durch Verdau von lambda-DNA durch Exponieren von diesen gegenüber Mikrowellen bei 700 Watt für 50 s getestet. Jede Bahn des 1,0%-igen Agarosegels wurde mit 1,0 μg verdauter DNA beladen (Beispiel 1).
2
Restriktionsendonuklease-Verdau von DNA durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt.
Verdaue von lambda-DNA durch HindIII (Bahn 2), BamHI (Bahn 3), EcoRI (Bahn 4), doppelte Verdaue von lambda-DNA durch EcoRI und HindIII (Bahn 5) und ein Verdau eines Erbsen-Lectin-cDNA-Klons an der PstI-Stelle des PUC19-Vektors durch PstI (Bahn 6) wurden ausgeführt unter Verwendung von 2,0 μg DNA, 1,0 μl von jedem Enzym in seinem jeweiligen Verdauungspuffer in 20,0 μl Reaktionsvolumen. Ein doppelter Verdau mit HindIII und EcoRI erfolgte in EcoRI-Verdauungspuffer. In der Kontrollreaktion (Bahn 1) wurden 2,0 μg lambda-DNA in 20,0 μl HindIII-Verdauungspuffer ohne Enzym verwendet. Jede Bahn des 1,0%-igen Agarosegels wurde mit 1,0 μg DNA beladen (Beispiel 2).
3
Durch T4-DNA-Ligase katalysierte Ligation von lambda-HindIII-Fragmenten und Fragmentierung von ligierter DNA durch HindIII im Mikrowellenherd.
Bahn 1 wurde mit ungeschnittener lambda-DNA (1,0 μg) beladen, die 50 s in HindIII-Verdauungspuffer mit Mikrowellen bestrahlt worden war. Bahn 2 repräsentiert durch HindIII geschnittene lambda-DNA (1,0 μg), hergestellt durch Exponieren der Reaktionsmischung gegenüber Mikrowellen für 50 s. Bahn 3 wird mit den Produkten, die im Rahmen der bei 37°C für 45 min ausgeführten Ligationsreaktion von durch HindIII geschnittener lambda-DNA erhalten wurden, beladen. Bahn 5 wurde mit den Produkten, die im Rahmen der durch Mikrowellenbestrahlung für 20 s ausgeführten Ligationsreaktion von durch HindIII geschnittener lambda-DNA erhalten worden sind, beladen. Ligierte DNAs, wie in Bahn 3 und 5 erhalten, wurden erneut mit HindIII durch Mikrowellenbestrahlung für 50 s geschnitten und damit wurden die Bahnen 4 bzw. 6 des 1,0%-igen Agarosegels beladen. Jede dieser Bahnen enthielt 1,5 μg DNA (Beispiel 3).
4
Kination (Phosphorylierung) eines 60-meren Oligonukleotids durch T4-Polynukleotidkinase.
Kination (Phosphorylierung) eines 60-meren Oligonukleotids (5'-CCCCGCCCCGCG-3')₅ durch T4-Polynukleotidkinase bei Exposition gegenüber Mikrowellen für 20 (Bahn 1), 30 (Bahn 2), 50 (Bahn 3) und 0 (Bahn 4) Sekunden (Beispiel 5b).
5. Bahn 1.
Mikrowellen-vermittelte DNA-Synthese durch das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I.
Autoradiogramm eines 1%-igen Agarosegels der Produkte, hergestellt durch HindIII-Verdau von lambda-DNA, gefolgt von einer Endenauffüllreaktion durch E. coli-DNA-Polymerase I. Beide Reaktionen wurden durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt für 50 bzw. 20 s ausgeführt (Beispiel 7).
5. Bahn 2.
Mikrowellen-vermittelte Verdauungs-, Dephosphorylierungs- und Kinations-(Phosphorylierungs-)reaktionen.
TPNK-katalysierte Kination (Phosphorylierung) von durch CIP dephosphorylierten EcoRI-Fragmenten von lambda-DNA. Autoradiogramm eines 1%-igen Agarosegels der Produkte, hergestellt durch EcoRI-Verdau von lambda-DNA, gefolgt von einer Dephosphorylierung von 5'-Enden von EcoRI-Fragmenten durch CIP und Kination (Phosphorylierung) von dephosphorylierten 5'-Enden von EcoRI-Fragmenten durch TPNK (Beispiel 5a).
6
Mikrowellen-vermittelte E-Selectin-mRNA-Matrizen-gesteuerte cDNA-Synthese durch AMV-RTase.
Eine spezifische cDNA von 501 bp wurde erhalten, wenn durch AMV-RTase-Katalyse in 10 (Bahn 1), 30 (Bahn 3) und 50 (Bahn 4) Sekunden durch Mikrowellenbestrahlung und in 45 min bei 48°C (Bahn 2) erhaltene Reaktionsprodukte unter Verwendung von Tfl 1-DNA-Polymerase PCR-amplifiziert wurden. RT-PCR-Reaktionsprodukte wurden in einem 1,4%-igen Agarosegel analysiert (Beispiel 8).
7
Mikrowellen-vermittelte synthetische mRNA-Matrizen-gesteuerte cDNA-Synthese durch AMV-RTase.

Eine spezifische cDNA von 323 bp wurde erhalten, wenn durch AMV-RTase-Katalyse in 30 (Bahn 5) und 50 (Bahn 6) Sekunden durch Mikrowellenbestrahlung und in 45 min bei 48°C (Bahn 3) erhaltene Reaktionsprodukte unter Verwendung von Tfl 1-DNA-Polymerase PCR-amplifiziert wurden. RT-PCR-Reaktionsprodukte wurden in einem 1,4%-igen Agarosegel analysiert. In Kontrollreaktionen wurde in Bahn 2 (45 min bei 48°C) und Bahn 4 (50 s Mikrowellen-Exposition) keine RNA-Matrize (eine in vitro-synthetisierte 1151 nt-RNA von Promega) zugesetzt. Bahn 1 wurde mit pBR 322-BstN1-Marker-DNA beladen. TABELLE 1 Vergleich zwischen dem Stand der Technik und der Erfindung und die Vorteile der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik

	Stand der Technik ( U.S.-Patent Nr. 5,350,686 )	Vorliegende Erfindung
1.	Beschleunigung der Restriktionsenzym-katalysierten ortsspezifischen Spaltung von DNA durch unterbrochene Mikroesellen-Bestrahlung bei 70 Watt.	In vitro-Synthese von Nukleinsäuren, ortsspezifische Spaltung, Ligation, Kination (Phosphorylierung) und Dephosphorylierung von DNA werden ausgeführt durch kontinuierliche Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt unter Verwendung der jeweiligen Enzyme.
2.	Spaltungsreaktion benötigte 2–24 min.	Alle Reaktionen sind sehr schnell. Für den vollständigen Abschluss der Reaktion werden nur 5–120 Sekunden benötigt.
3.	Nicht-einheitliche Reaktionsbedingungen. Unterschiedliche Restriktionsenzyme erforderten unterschiedliche Mikroesellen-Expositions- und -Nicht-Expositionszeiten.	Einheitliche Reaktionsbedingungen. Kurze und kontinuierliche Mikrowellenbestrahlung. Gleiche Bedingungen trafen für die meisten der Reaktionen der gleichen Art, wie Spaltung, Kination (Phosphorylierung) u.s.w., zu.
4.	Verfahren weniger geeignet zur Automatisierung, da der Zeitgewinn nicht attraktiv ist; die Reaktionsbedingungen variierten für die Spaltungsreaktion durch verschiedene Enzyme der gleichen Art.	Verfahren besser geeignet zur Automatisierung, da der Zeitgewinn sehr attraktiv ist und es allgemeine Anwendbarkeit aufweist. Es kann auf die meisten der Reaktionen, die in der Molekularbiologie verwendet werden, angewendet werden.
5.	Restriktionsenzym verlor seine Aktivität bei hoher Leistungseinstellung. Daher wurde eine enzymatische Reaktion mit DNA durch Mikrowellenbestrahlung bei hoher Leistung (700 Watt) nicht ausgeführt.	Restriktionsenzym in Verdünnungspuffer verlor seine Aktivität, wenn es kontinuierlicher Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt sogar auch nur für einen kurzen Zeitraum (über 20 s) ausgesetzt wurde. Jedoch wurde in einer Durchbruch-Feststellung erfunden, dass Restriktionsenzym in Verdauungspuffer aktiv blieb, wenn es Mikrowellen bei hoher Leistung (700 Watt) für einen kurzen Zeitraum (wenigstens 130 s) ausgesetzt wurde. Diese Feststellung führte zu der Erfindung, im Rahmen von welcher Synthese, Modifizierung und Spaltung von Nukleinsäuren unter Verwendung des jeweiligen Enzyms durch eine kurze und kontinuierliche Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt ausgeführt wurden.
6.	Eine Restriktionsenzym-katalysierte ortsspezifische Spaltung von DNA wurde durch unterbrochene Mikrowellenbestrahlung bei 70 Watt ausgeführt. Es wurde keine andere enzymatische Reaktion ausgeführt.	Es wurden unterschiedliche Reaktionen, die in der Molekularbiologie üblicherweise verwendet werden, wie Restriktionsendonukleaseverdau von DNA, Ligation durch T4-DNA-Ligase, Dephosphorylierung durch alkalische Phosphatase, Kination (Phosphorylierung) durch T4-Polynukleotidkinase, DNA-Synthesen durch E. coli-Polymerase I, reverse Transkriptase und RNA-Synthese durch T4-RNA-Polymerase, durch kontinuierliche und kurze Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt ausgeführt.
7.	Mit Ausnahme von DNA wird kein anderes Molekül als ein Substrat in der enzymatischen Reaktion verwendet.	Es wurde auch Oligonukleotid als Substrat verwendet.
8.	Der Zeitgewinn war nicht attraktiv. Es ist möglicherweise möglich, für einige der Restriktionsenzymverdauungsreaktionen außerhalb eines Mikrowellenofens in der gleichen Zeit bei 37°C vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.	Die Neuheit der Erfindung besteht darin, dass die meisten der Reaktionen in Sekunden abgeschlossen sind, wodurch die Wirkung der Mikrowellen eindeutig aufgrund des Zeiteffekts gezeigt wird.
9.	Das Verfahren ist nicht schnell, einfach, einheitlich und universell.	Das Verfahren ist schnell, einfach, einheitlich und universell.
10.	Das im Stand der Technik erhaltene Produkt war spezifisch geschnittene DNA.	Die im Stand der Technik erhaltenen Produkte sind DNA, modifizierte DNA, RNA, modifizierte Oligonukleotide oder Oligonukleotide.
11.	Allgemein muss in der Molekularbiologie eine Reihe von (mehr als eine) Reaktionen ausgeführt werden, um ein bestimmtes Ziel zu erreichen. Der Stand der Technik lieferte ein Beispiel für nur eine Art von Reaktion, welche eine ortsspezifische Spaltung von DNA ist.	Da die Erfindung das Verfahren für unterschiedliche enzymatische Reaktionen, die in der Molekularbiologie üblicherweise verwendet werden, durch kurze und nichtunterbrochene Mikrowellen-Exposition lehrt, weist die Erfindung dementsprechend mehr Vorteile auf, um eine Reihe von Experimenten in kurzer Zeit auszuführen.

In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die Erfindung ein schnelles und effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Spaltung, Modifizierung und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren durch durch Mikrowellen induzierte enzymatische Reaktionen, nämlich Restriktionsendonukleaseverdau, Ligation, Dephosphorylierung, Phosphorylierung (Kination), in vitro-DNA-Synthese, reverse Transkription und in vitro-RNA-Synthese. Das Verfahren umfasst, die Reaktionsmischung, welche das Enzym und das Substrat enthält, einer Mikrowellen-Exposition in dem Mikrowellenherd bei dessen höchster Leistungsabgabe für eine kurze Zeitspanne ohne eine jegliche Unterbrechung zu unterwerfen.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung führt das Verfahren zu einer hochgradig selektiven spezifischen Spaltung, Modifizierung und Synthese von Nukleinsäuren in 5 bis 120 Sekunden. Alle Reaktionen wurden für eine unterschiedliche Dauer von Mikrowellen-Expositionszeit ausgeführt, um die optimale Reaktionszeit herauszufinden. Die durch das jeweilige Enzym bei Mikrowellenbestrahlung von deren Reaktionsmischungen hergestellten Produkte waren identisch mit jenen, die durch die herkömmlichen Verfahren, die bei optimaler Temperatur (37°C oder darunter) für 30 min bis mehrere Stunden ausgeführt wurden, hergestellt wurden.
Kontrollreaktionen, die außerhalb eines Mikrowellenherds für die gleiche Zeitdauer (wie bei durch Mikrowellen vermittelten Reaktionen verwendet) ausgeführt wurden, ergaben nicht die gewünschten Reaktionsprodukte. Das Fehlen von nicht-spezifischen DNA-Banden mit oder ohne Enzym zeigte, dass Mikrowellen durch die erfundenen Reaktionsbedingungen weder nicht-spezifische Nuklease-Aktivität induzieren noch eine Fragmentierung von DNA verursachen.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde die Stabilität von HindIII bei einer Mikrowellen-Exposition für 0–130 Sekunden bei der höchsten Leistungsstufe (700 Watt) untersucht. Es wurde beobachtet, dass festgestellt wurde, dass HindIII in seinem Verdünnungspuffer, welcher 50% Glycerol (Vol./Vol.) enthielt, seine Aktivität verlor, wenn es 0–130 Sekunden bei 700 Watt bestrahlt wurde.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde im Gegensatz dazu festgestellt, dass das gleiche Enzym (HindIII) in seinem Verdauungspuffer (gesamter Glycerolgehalt der Reaktionsmischung betrug 6,25% (Vol./Vol.)) stabil war, wenn es Mikrowellen bei 700 Watt für 0–130 Sekunden ausgesetzt wurde (Beispiel 1, 1).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung haben wir festgestellt, dass ein Restriktionsenzymendonuklease-Verdau durch das erfundene Verfahren, das durch eine kontinuierliche Exposition der Reaktionsmischung gegenüber Mikrowellen für eine kurze Zeitspanne ohne eine jegliche Unterbrechung bei der höchsten Leistungsstufe erfolgt, ausgeführt werden kann. Dies steht in Gegensatz zu dem berichteten Verfahren, wo festgestellt worden war, dass Enzym seine Aktivität bei hoher Leistungsstufe verlor.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung führte das Verfahren zu einem hochgradig selektiven Verdau von Nukleinsäuren mit hoher Spezifität (verdaute DNA war religierbar) in beträchtlich weniger Zeit. Endonukleaseaktivitäten der Restriktionsenzyme, wie BamHI, EcoRI, HindIII, HaeIII, BglII, PstI und BstEII, wurden verstärkt, wenn die Reaktionsmischung, welche Substrat-DNA, Enzym und verträglichen Puffer enthielt, Mikrowellen bei der höchsten Leistungsstufe ausgesetzt wurde. In einem typischen Experiment wurde in 20 μl Reaktionsvolumen ein μg lambda-DNA durch 5–20 Einheiten (wie durch New England Biolabs definiert) von jedem Restriktionsenzym vollständig verdaut, wenn dieses Mikrowellen für 30–70 s ausgesetzt wurde (Beispiel 2, 2). Es wurde gleichfalls festgestellt, dass der doppelte Verdau der Substrat-DNA mit zwei Enzymen, wie EcoRI und HindIII, innerhalb der gleichen Zeit abgeschlossen war, wenn diese Mikrowellen ausgesetzt wurden. Ein anderer Vorteil des Restriktionsendonukleaseverdaus durch das erfundene Verfahren besteht darin, dass das Verfahren über ein breites Spektrum von Restriktionsendonukleasen wie auch Substrat-DNAs hinweg relativ einheitlich ist. Substrat-DNA umfasst solche von lambda-Phage, Baculovirus, Plasmiden, Pflanzen und Säugetieren. Die ortsspezifische Spaltung von Substrat-DNA durch die Restriktionsenzyme gemäß dem erfundenen Verfahren wurde verifiziert durch Ligationsreaktionen, die durch die erfundenen und herkömmliche Vorgehensweisen ausgeführt wurden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden versetzt geschnittene DNA-Fragmente, die durch HindIII erzeugt worden sind, und stumpfe Enden aufweisende DNA-Fragmente, die durch HaeIII erzeugt worden sind, durch T4-DNA-Ligase in 10 bis 15 Sekunden durch Mikrowellenbestrahlung komplett ligiert. Ein Kontrollexperiment wird bei 16°C für 8 h wie bei der herkömmlichen Vorgehensweise ausgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden durch Restriktionsendonuklease erzeugte DNA-Fragmente (erzeugt durch herkömmliche und erfundene Vorgehensweisen) als Substrat für Ligationsreaktionen verwendet und die ligierten DNAs erzeugten die gleichen spezifischen Fragmente, wenn sie einem Restriktionsendonukleaseverdau mit wieder dem gleichen Enzym unterworfen wurden (Beispiel 3, 3).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind modifizierte Nukleinsäuren, nämlich dephosphorylierte, phosphorylierte und ligierte DNAs wichtige Werkzeuge in der Molekularbiologie. Alle diese Produkte wurden innerhalb von 10–60 Sekunden Mikrowellenexposition der Reaktionsmischung in ausreichenden Mengen erhalten, eine bemerkenswerte Verringerung der Reaktionszeit im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren. So wurde die Dephosphorylierung von terminalen Phosphatgruppen von durch Restriktionsendonuklease erzeugten DNA-Fragmenten unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) im Mikrowellenherd für eine unterschiedliche Zeitdauer, welche von 20–50 s eingeschlossen reichte, ausgeführt. Die Mikrowellen-vermittelten Reaktionsprodukte (dephosphorylierte DNA) wurden verifiziert, wenn sie durch T4-DNA-Ligase nicht ligiert werden konnten, aber durch T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert werden konnten (Beispiel 4). Dephosphorylierte, durch Restriktionsendonuklease gespaltene DNA-Fragmente wurden durch T4-Polynukleotidkinase (TPNK) und [γ³²P]-ATP im Mikrowellenherd innerhalb von 10 bis 50 Sekunden phosphoryliert. Die Phosphorylierung von DNA wird sowohl anhand der Zählung von durch Trichloressigsäure ausfällbarer Radioaktivität als auch durch Autoradiographie abgeschätzt. Das in 30 s Mikrowellenreaktion erhaltene Phosphorylierungsausmaß ist gleich zu jenem, das in der herkömmlichen Reaktion, die bei 37°C für 20 min ausgeführt wird, erhalten wird (Beispiel 5).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden auch synthetische Oligonukleotide als Substrat für eine Kinations-(Phosphorylierungs-)-reaktion und spätere Dephosphorylierungsreaktion im Mikrowellenherd verwendet. Es wurde festgestellt, dass beide Reaktionen mit der gleichen Effizienz wie in dem Falle von Nukleinsäure ablaufen (Beispiel 5b, 4).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die Enzym-katalysierten in vitro-Synthesen in dem erfundenen Verfahren eine DNA-Matrizen-gesteuerte DNA- und RNA-Synthese und eine RNA-Matrizen-gesteuerte DNA-Synthese (Umkehrtranskription).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde eine durch E. coli-DNA-Polymerase I katalysierte DNA-abhängige DNA-Synthese durch Mikrowellenbestrahlung unter Verwendung einer einen Schnitt in einem der beiden Stränge aufweisenden („nicked") DNA-Matrize (Nick-Translation) und von versetzt geschnittenen Restriktionsendonuklease-Fragmenten mit Überhänge aufweisenden 3'-Enden als Matrizen ausgeführt. Nick-Translationsreaktionen wurden im Mikrowellenherd für unterschliedliche Zeitdauer ausgeführt. Die DNA-Synthese wurde überwacht durch Einbau von [α³²P]-dCTP in durch Trichloressigsäure (TCA) ausfällbare Counts. Es wurde festgestellt, dass die durch TCA ausfällbaren Counts pro Mikrogramm einen Schnitt in einem der beiden Stränge aufweisender („nicked") DNA in 45 Sekunden Mikrowellen-Reaktion die gleichen waren wie jene einer herkömmlichen Reaktion, die bei 16°C 60 min lang ausgeführt wurde. Es wurde jedoch festgestellt, dass jene, die in 30 Sekunden Mikrowellen-Reaktion erhalten wurden, weniger waren, wohingegen sie in 60 Sekunden ein besseres Ergebnis lieferte als die herkömmliche Reaktion (Beispiel 6).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde die Wiedergabetreue von im Rahmen einer Nick-Translation durch das erfundene Verfahren synthetisierter DNA weiter verifiziert durch eine Southern-Hybridisierung mit Matrizen-DNA (ohne einen Schnitt in einem der beiden Stränge). Stumpfe Enden aufweisende DNA wurde in 20 s hergestellt, wenn die Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und DNA-Matrizen mit Überhänge aufweidenden 3'-Enden enthaltende Reaktionsmischung Mikrowellen ausgesetzt wird. Es wurde festgestellt, dass das Ausmaß an DNA-Synthese in 20 Sekunden Mikrowellenbestrahlung das gleiche wie in dem bei 37°C für 30 min ausgeführten Kontrollexperiment war. Eine Mikrowellenexposition für geringere Zeit ergibt ein unvollständiges Ergebnis, wohingegen mehr Zeit die gleichen oder geringfügig bessere Ergebnisse ergibt. Die unter den Mikrowellen synthetisierte DNA wurde verifiziert durch (i) Einbau von [α³²P]-dCTP, (ii) Autoradiographie und (iii) Ligation an stumpfe Enden aufweisende Vektor-DNA (Beispiel 7; 5, Bahn 1).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde auch festgestellt, dass katalytische Aktivitäten von RNA-Polymerase und reverser Transkriptase unter dem Einfluss von Mikrowellen schneller wurden. Dementsprechend wurde eine durch die reverse Transkriptase des Vögel-Myeloblastosevirus (AMV-RT) katalysierte, RNA-gesteuerte DNA-(cDNA-)-Synthese mit zwei Matrizen-RNAs und Matrizen-spezifischen Primern durch Mikrowellenbestrahlung in unterschiedlicher Zeit ausgeführt. Die optimale Expositionszeit wurde zu 50 Sekunden ermittelt, welche das gleiche Ausmaß an Synthese wie in der Kontrollreaktion, die durch das herkömmliche Verfahren bei 48°C für 45 min ausgeführt wurde, ergab. Ein bemerkenswertes Ausmaß an Reaktion trat sogar in 10 Sekunden Mikrowellenexposition auf. Die Synthese von cDNAs wurde nach Amplifizierung durch Tfl-Polymerase in einer reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) überwacht (Beispiel 8, 6 und Beispiel 9, 7).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung benötigt eine DNA-gesteuerte RNA-Synthese (Transkription) eine spezielle DNA-Sequenz (Promotor) für das Binden von RNA-Polymerase an Matrizen-DNA, um die Transkription zu initiieren. Die in vitro-Synthesen von RNA, die durch T7-RNA-Polymerasen katalysiert werden, wurden ausgeführt unter Verwendung von pSPT 18- bzw. pSPT 19-neo-DNA-Matrizen (Boehringer Mannheim Deutschland, Kat. Nr. 999644). Durch Mikrowellenbestrahlung der Reaktionsmischungen für unterschiedliche Zeitspannen, welche von 5–20 Sekunden eingeschlossen reichten, erhaltene Produkte wurden durch [α³²P]-UTP-Einbau und die Synthese des Transkripts von spezieller Größe bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die durch Trichloressigsäure ausfällbaren Counts, die in 5 s Mikrowellenreaktion erhalten wurden, nahezu gleich zu jenen, die in einer bei 37°C für 20 min ausgeführten herkömmlichen Reaktion erhalten werden, waren.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden alle Reaktionen in einem Haushalt-Mikrowellenofen (BPL, Indien), welcher bei einer Frequenz von etwa 2450 MHz mit einer maximalen Leistungsabgabe von etwa 700 Watt betrieben wird, ausgeführt. Alle Reaktionen wurden in dem Mikrowellenherd bei der höchsten Leistungseinstellung (Stufe 10), d. h. 100% Magnetron-Auslastungsgrad der Abgabeleistung von 700 Watt, ausgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden Reaktionen aufgesetzt durch nacheinander erfolgendes Mischen von Puffer, Substrat(en) und Enzym in einem definierten Volumen, wie in dem herkömmlichen Protokoll vorgeschrieben. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden alle diese Enzym-katalysierten Reaktionen bei dem pH und in der ionischen Umgebung, die in den herkömmlichen Reaktionen verwendet wurden, ausgeführt. Die Reaktionsmischung wurde in das Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und in die Mitte der sich drehenden Scheibe des Mikrowellenherds gesetzt. Die Reaktionsmischung wurde Mikrowellen für einen Zeitraum von vorzugsweise 5–120 Sekunden ausgesetzt. Während der Mikrowellenbestrahlung wurde das Eppendorf-Reaktionsgefäß unverschlossen gehalten. Die Reaktionen wurden gestoppt, unmittelbar nachdem die Mikrowellenbestrahlung vorüber war, durch Zugeben von Ethylendiamintetraacetat (EDTA, pH 8,0) und/oder Erwärmen bei 75°C für 3–15 min. Die Reaktionsprodukte wurden durch herkömmliche Vorgehensweisen, wie Agarosegelelektrophorese, Autoradiographie, Zählung von durch Trichloressigsäure (TCA) ausfällbarer Radioaktivität, Ligation, Kination (Phosphorylierung), Hybridisierung und Transformation, analysiert. Die Ergebnisse von allen Reaktionen, die durch die erfundenen Vorgehensweisen ausgeführt worden waren, wurden mit jenen verglichen, die in der herkömmlichen Reaktion, die durch Inkubieren der Reaktionsmischung in dem beim Temperaturoptimum des Enzyms gehaltenen Wasserbad ausgeführt wird, erhalten werden.
Die Erfindung ist ein klarer Fall einer Verbesserung für die ortsspezifische Spaltung, Modifizierung und Synthese von Nukleinsäuren gegenüber den existierenden Verfahren, die bislang bekannt sind.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Einzelheiten der Erfindung und werden nur zur Veranschaulichung aufgeführt und sollten dementsprechend nicht so aufgefasst werden, als dass sie den Umfang der Erfindung einschränken. Es wird mit in Betracht gezogen, dass die Erfindung, wie nachfolgend beansprucht, verschiedenen Modifizierungen innerhalb ihres Umfangs unterliegen wird.
Beispiel 1
Stabilität von HindIII in dessen Verdauungspuffer nach Exposition gegenüber Mikrowellen bei 700 Watt
16 μl-Aliquote von HindIII wurden in die Eppendorf-Reaktionsgefäße gegeben, nachdem 5 μl (100 Einheiten) davon mit einer Mischung von 16 μl 10 × HindIII-Verdauungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,9, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT) und 107 μl Wasser auf 144 μl verdünnt worden waren. Jedes Aliquot wurde Mikrowellen bei 700 Watt (Leistungsstufe 10) für unterschiedliche Zeitspannen: 0, 30, 50, 70, 90, 110 und 130 Sekunden, ausgesetzt. Jedes bestrahlte Enzym wurde durch Verdau von lambda-DNA durch herkömmliche und Mikrowellen-vermittelte Reaktionen getestet.
Ein Verdau mit dem bestrahlten Enzym wurde ausgeführt, nachdem 4 μl (2,0 μg) lambda-DNA in jedes Reaktionsgefäß gegeben worden waren. Die Hälfte von deren Inhalt wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und wie bei der herkömmlichen Vorgehensweise bei 37°C 4 h inkubiert.
Bei der Mikrowellen-vermittelten Reaktion wurde die verbleibende Hälfte als Fleck auf ein Stück Parafilm aufgetragen, dieses in die Mitte des Mikrowellenherds gelegt und durch Mikrowellen bei 700 Watt für 50 s bestrahlt.
Alle Reaktionsprodukte wurden auf einem 1,0%-igen Agarosegel aufgetrennt, wo jede Vertiefung mit 1,0 μg verdauter DNA beladen wurde (1).
Beispiel 2
Restriktionsendonuklease-Verdaue von DNA durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt.
Alle Verdaue wurden zu einem Zeitpunkt im Mikrowellenherd für 50 s ausgeführt, indem die Reaktionsmischungen als Fleck auf einen Parafilm aufgetragen wurden. Verdaue von lambda-DNA durch HindIII, BamHI, EcoRI, doppelte Verdaue von lambda-DNA durch EcoRI und HindIII und ein Verdau eines Erbsen-Lectin-cDNA-Klons an der PstI-Stelle des PUC19-Vektors durch PstI wurden ausgeführt unter Verwendung von 2,0 μg DNA, 1,0 μl von jedem Enzym in ihrem jeweiligen Verdauungspuffer in 20,0 μl Reaktionsvolumen. Ein Doppelverdau mit HindIII und EcoRI wurde in EcoRI-Verdauungspuffer ausgeführt. In der Kontrollreaktion wurden 2,0 μg lambda-DNA in 20,0 μl HindIII-Verdauungspuffer ohne Enzym verwendet. Jeder μl des Enzyms enthielt entweder 20,0 (HindIII und EcoRI) oder 10,0 (BamHI und PstI) Einheiten. Jede Bahn des 1,0%-igen Agarosegels wurde mit 1,0 μg DNA beladen (2).
Beispiel 3
Verdau von lambda-DNA durch HindIII, gefolgt von einer Ligationsreaktion durch T4-DNA-Ligase durch Mikrowellenbestrahlung
HindIII-Fragmente für Ligationsreaktionen wurden hergestellt, indem 8,0 μg DNA in 160,0 μl Reaktionsvolumen, enthaltend 5,0 μl (100 Einheiten) HindIII und 16,0 μl 10 × HindIII-Verdauungspuffer, in einem 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß 50 s in dem Mikrowellenherd verdaut wurden.
20,0 μl Ligationsreaktionsmischung, enthaltend 6,0 μg HindIII-Fragmente, 2,0 μl 10 × Ligationspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM DDT, 1 mM ATP und 25 μg/ml BSA (Rinderserumalbumin)) und 20 kohäsive Einheiten von T4-DNA-Ligase (New England Biolab Inc. USA) wurden in 10,0 μl-Aliquots in zwei 0,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße gegeben. Eines der Reaktionsgefäße, welche die Reaktionsmischung enthielten, wurde 20 s Mikrowellen ausgesetzt und das andere Reaktionsgefäß wurde 45 min bei 37°C gehalten. Die Reaktionen wurden durch Erwärmen für 5 min bei 65°C beendet. Die Hälfte der DNA (1,5 μg) aus jedem der Eppendorf-Reaktionsgefäße wurde für ein erneutes Schneiden mit HindIII durch Mikrowellenbestrahlung, wie oben beschrieben, verwendet. Die übrige Hälfte wurde verwendet, um die Erzeugung von ligierten Fragmenten durch Agarosegelelektrophorese sicherzustellen.
In einem Kontrollexperiment wurde ungeschnittene lambda-DNA (1,0 μg) durch Mikrowellen 50 s in HindIII-Verdauungspuffer bei 700 Watt bestrahlt, um eine nicht-spezifische Spaltung, sofern eine solche auftrat, herauszufinden (3).
Beispiel 4
Dephosphorylierungsreaktion durch alkalische Phosphatase
Eine Dephosphorylierung von 5'-Phosphatgruppen von lambda-EcoRI-Fragmenten wurde im Mikrowellenherd ausgeführt unter Verwendung von 5 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim) in 20 μl Reaktionsvolumen, enthaltend 1,0 μg DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl und 1 mM DTT. Nach 30 s Mikrowellenexposition wurde die Reaktion durch die Zugabe von 2 μl 0,5 mM EDTA (pH 8,0), gefolgt von einer Inkubation bei 75°C für 15 min, beendet. DNA wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion von Protein befreit und schließlich mit Ethanol ausgefällt. Es wurde festgestellt, dass die so erhaltenen, mit Phosphatase behandelten DNA-Fragmente durch T4-DNA-Ligase nicht ligierbar waren, aber durch Polynukleotidkinase effizient phosphoryliert wurden, was die Effizienz der Dephosphorylierungsreaktion in 30 s bestätigt.
Beispiel 5
Kinationsreaktion (Phosphorylierungsreaktion) durch T4-Polynukleotidkinase

a) Eine Fragmentierung von lambda-DNA durch EcoRI erfolgte in 50 s durch Mikrowellenbestrahlung, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Die Dephosphorylierungsreaktion durch CIP wurde in einem Reaktionsvolumen von 20,0 μl in einem 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß für 30 s im Mikrowellenherd unter Verwendung von 1,0 μg DNA und 1,0 Einheit CIP ausgeführt, wie oben beschrieben.
Die Phosphorylierung von 5'-Hydroxylgruppen von dephosphorylierten EcoRI-Fragmenten von 0,5 μg lambda-DNA wurde ausgeführt, indem 20 μl Reaktionsmischung, umfassend T4-Polynukleotidkinase (Bangalore Genei), 70 mM Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT und 20 μCi [γ³²P]-ATP (Spez. Aktivität > 4000 Ci/mmol), als Fleck auf Parafilm aufgetragen wurden und diese 20 s Mikrowellen ausgesetzt wurden. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von EDTA (pH 8,0) bis zu 5 mM (Endkonzentration), gefolgt von einem Erwärmen auf 65°C für 10 min. Nicht-eingebaute Radioaktivität wurde durch Gelfiltration an einer Sephadex G50-Spin-Säule entfernt. Phosphorylierungen von DNA-Fragmenten werden durch Autoradiographie verifiziert, indem ein zu 0,1 μl äquivalentes Reaktionsvolumen aufgetragen wird.

b) Eine Phosphorylierung von 5'-Hydroxylgruppen von 0,1 μg 60-merem Oligonukleotid (5'-CCCCGCCCCGCG-3')₅ durch T4-Polynukleotidkinase wurde durch Mikrowellenbestrahlung in unterschiedlichen Zeitspannen (0, 50, 30 und 20 s), wie oben, ausgeführt (4).

Beispiel 6
DNA-Synthese durch E. coli-Polymerase I.
Durch E. coli-DNA-Polymerase I katalysierte DNA-Synthesereaktionen wurden in 50 μl Reaktionsvolumen, enthaltend 1 μg einen Einzelstrangbruch aufweisende lambda-Phagen-DNA oder Autographa Californica nucleopolyhedrosis-Virus (AcNPV)-DNA-Matrize (behandelt mit 5 Femtogramm DNase I), 5 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (NEB), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO₄, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Pentax Fraktion V), unmarkiertes dATP, dTTP, dGTP (jeweils 1 nM), 100 μCi [α³²P]-dCTP (Spez. Aktivität> 4000 Ci/mmol), im Mikrowellenherd für unterschiedliche Zeitdauer ausgeführt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) nach der Exposition gegenüber Mikrowellen gestoppt. Die DNA-Synthese mit jeder DNA-Matrize wurde durch Trichloressigsäure (TCA)-Präzipitationsassays nach der Entfernung von nicht-eingebautem radioaktivem Nukleotid durch Zentrifugation durch eine kleine Säule von Sephadex G-50 gemessen. Die Menge von in einer 45-sekündigen Mikrowellenreaktion synthetisierter DNA war gleich zu jener, die in der bei 16°C für 60 min ausgeführten herkömmlichen Reaktion synthetisiert wird. Die durch das erfundene Verfahren synthetisierten markierten DNAs hybridisierten effizient mit den unmarkierten Restriktionsendonuklease-Verdauen der Matrizen-DNAs.
Beispiel 7
DNA-Synthese durch das Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase I
Durch das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I katalysierte DNA-Synthesereaktionen erfolgten in 20 μl Reaktionsvolumen, enthaltend 1 μg HindIII-Fragmente von lambda-Phagen-DNA (hergestellt durch Mikrowellenbestrahlung, wie in Beispiel 1 beschrieben), 1 μl (8 Einheiten) Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM MgSO₄, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, 4 pmol [α³²P]-dCTP (Spez. Aktivität > 4000 μCi/mmol) und 2 nmol von jeweils dTTP, dATP, dGTP, im Mikrowellenherd. Die Reaktionsmischung wurde als ein Fleck auf Parafilm aufgetragen und wurde 20 s Mikrowellen ausgesetzt, wonach die Reaktion durch Zugabe von 4 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) gestoppt wird. Nicht-eingebaute Nukleotide werden durch eine Sephadex G-50-Spin-Säule entfernt, wenn radioaktives Nukleotid verwendet wird. Das Auffüllen der Überhänge aufweisenden 3'-Enden von Matrizen-DNA durch DNA-Synthese wird durch Zählung von durch TCA ausfällbarer Radioaktivität gemessen und die Spezifität der DNA-Synthese wird durch Autoradiographie und Ligation an stumpfe Enden aufweisende Vektor-DNA sichergestellt. Das Ausmaß an DNA, die durch die erfundene Mikrowel lenreaktion synthetisiert wird, war gleich zu jenem, das durch das herkömmliche Verfahren bei 37°C für 30 min erhalten wird (5, Bahn 1).
Beispiel 8
Mikrowellen-vermittelte E-Selectin-mRNA-Matrizen-gesteuerte cDNA-Synthese durch AMV-RTase.
Es wurden drei unterschiedliche Sätze von Experimenten für die durch die reverse Transkriptase des Vögel-Myeloblastosevirus (AMV-RTase) katalysierte Synthese von cDNA unter Verwendung von E-Selectin [Tucker et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 2466–2473] mit spezifischen Vorwärts-Primern durch Exponieren der Reaktionsmischung gegenüber Mikrowellen für 10, 30 bzw. 50 s ausgeführt. Die cDNA von spezieller Größe wurde durch Agarosegelelektrophorese identifiziert nach Amplifizierung des erster Strang-cDNA-Reaktionsprodukts nach der Zugabe von Matrizen-spezifischen Rückwärts- und Vorwärts-Primern und Tfl-DNA-Polymerase. Die für E-Selectin-mRNA-Matrizen verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren 5'-GAGTGGGCATGTGGAATGATG-3' bzw. 3'-GGTCTCGGAAGTCACATGGA-5'. Die zweiter Strang-cDNA-Synthese und PCR-Amplifizierung nach Inaktivierung von reverser Transkriptase von AMV (94°C für 2 min) erfolgten in 40 Zyklen (94°C für 30 s/Denaturierung, 60°C für 1 min/Anhybridisierung („Annealing"), 68°C für 2 min/Verlängerung). Die Zusammensetzung der RT-PCR-Reaktion in einem Reaktionsvolumen von 50 μl war 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM Spermidin, 10 mM DTT, 0,2 mM dNTP (jeweils), 1 μM Vorwärts-Primer, 1 μM Rückwärts-Primer, 1 mM MgSO₄, 5 Einheiten AMV-Rtase und 5 Einheiten Tfl-DNA-Polymerase. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von RNA gestartet. Alle RT-PCR-Reaktionsbestandteile mit Ausnahme der E-Selectin-mRNA und von deren Primern werden von Promega beschafft.
Die Bildung von amplifizierten Produkten von spezieller Größe, d. h. 501 bp mit E-Selectin-mRNA-Matrize sowohl bei der erfundenen als auch der herkömmlichen Reaktion, bestätigte die spezifische erster Strang-cDNA-Synthese mit der mRNA. Die Mengen von amplifizierten cDNAs, die in 50 s synthetisiert wurden, waren höher als jene, die im Rahmen der herkömmlichen Reaktion erhalten wurden (6).
Beispiel 9
Mikrowellen-vermittelte synthetische mRNA-Matrizen-gesteuerte cDNA-Synthese durch AMV-RTase.
Es wurden drei unterschiedliche Sätze von Experimenten für die durch die reverse Transkriptase des Vögel-Myeloblastosevirus (AMV-RTase) katalysierte Synthese von cDNA unter Verwendung von synthetischen mRNA-Matrizen (einer in vitro synthetisierten 1151 nt-RNA von Promega) mit spezifischen Vorwärts-Primern durch Exponieren der Reaktionsmi schung gegenüber Mikrowellen für 10, 30 bzw. 50 s ausgeführt. Die cDNA von spezieller Größe wird durch Agarosegelelektrophorese identifiziert nach Amplifizierung des erster Strang-cDNA-Reaktionsprodukts nach der Zugabe von Matrizen-spezifischen Rückwärts- und Vorwärts-Primern und Tfl-DNA-Polymerase. Die für synthetische mRNA-Matrizen verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren 5'-GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3' bzw. 3'-GACTGAACTGCCGCCGA-5'. Die Bildung von amplifizierten Produkten von spezieller Größe, d. h. 323 bp mit einer synthetischen mRNA-Matrize sowohl bei der erfundenen als auch der herkömmlichen Reaktion, bestätigte die spezifische erster Strang-cDNA-Synthese mit der mRNA. Die Mengen von amplifizierten DNAs, die in 50 s synthetisiert wurden, waren gleich jenen, die im Rahmen der herkömmlichen Reaktion erhalten wurden.
Die zweiter Strang-cDNA-Synthese und PCR-Amplifizierung nach Inaktivierung von reverser Transkriptase von AMV (94°C für 2 min) erfolgten in 40 Zyklen (94°C für 30 s/Denaturierung, 60°C für 1 min/Anhybridisierung („Annealing"), 68°C für 2 min/Verlängerung). Die Zusammensetzung der RT-PCR-Reaktion in einem Reaktionsvolumen von 50 μl war 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM Spermidin, 10 mM DTT, 0,2 mM dNTP (jeweils), 1 μM Vorwärts-Primer, 1 μM Rückwärts-Primer, 1 mM MgSO₄, 5 Einheiten AMV-Rtase und 5 Einheiten Tfl-DNA-Polymerase. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von RNA gestartet. Alle RT-PCR-Reaktionsbestandteile werden von Promega beschafft (7).
Beispiel 10
RNA-Synthese durch T7-RNA-Polymerase
Eine durch SP6- und T7-RNA-Polymerase katalysierte RNA-Synthese wurde ausgeführt unter Verwendung von durch EcoRI gespaltener pSPT18-neo- bzw. pSPT19-neo-DNA (Boehringer Mannheim, Deutschland) in 20 μl Reaktionsvolumen. Jede Reaktionsmischung enthielt 0,5 μg DNA-Matrize, 0,5 mM von jeweils ATP, GTP, CTP, UTP, 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 10 mM DTT. Für die markierte Synthese wird 0,5 mM UTP durch 50 μCi [α³²P]-UTP (> 400 Ci/mmol) ersetzt. Die Reaktionsmischung wurde 20 s Mikrowellenbestrahlung ausgesetzt, wonach die Reaktion durch Zugabe von 2 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) beendet wurde. Die RNA-Synthese wurde durch Einbau von [α³²P]-UTP in die durch TCA ausfällbaren Counts gemessen. Es wurde festgestellt, dass die durch TCA ausfällbare RNA, die durch das erfundene Verfahren synthetisiert wird, mehr ist als bei dem herkömmlichen Verfahren, das bei 37°C für 45 min ausgeführt wird. Die Größe von unter Verwendung von nicht-radioaktiven NTPs synthetisierter RNA wurde durch ein Formaldehyd-Agarose-Gel bestimmt und es wurde festgestellt, dass sie identisch mit jener, die in herkömmlichen Reaktionen erhalten wird, ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Diese Erfindung ist nützlich für ein schnelles und effizientes Verfahren zur Herstellung von Produkten, die durch Enzym-katalysierte Reaktionen bei kurzer und nicht-unterbrochener Mikrowellenexposition hergestellt werden. Das erfundene Verfahren kann adaptiert werden in der Biotechnologie, insbesondere in der Molekularbiologie, der industriellen Verarbeitung und der Abwasserbehandlung. Das erfundene Verfahren wird auch für eine Automatisierung in dem betreffenden Gebiet geeignet sein.
Das auf Mikrowellen basierende Verfahren der Erfindung ist besonders nützlich für eine schnelle ortsspezifische Spaltung von DNA, Modifizierung von DNA und Oligonukleotiden und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren. Die Reaktionen umfassen einen Restriktionsendonukleaseverdau von DNA, Ligation, Dephosphorylierung, Kination (Phosphorylierung) und in vitro-Synthese von Nukleinsäuren. Die darin erhaltenen Produkte sind essentiell für die Molekularbiologie und werden für Genomkartierung, DNA-Amplifizierung, DNA-Sequenzierung, Genexpression, Reinigung von gewünschten Produkten, Isolierung von gewünschten Produkten, Manipulation von Genen im Rahmen der Technik der in vitro-DNA-Rekombination u.s.w. benötigt. Die Erfindung ist für eine Automatisierung in der Molekularbiologie geeignet.
Vorteile

1. Die drastische Verringerung der Reaktionszeit für die ortsspezifische Spaltung, Modifizierung von DNA und Oligonukleotiden und die Synthese von Nukleinsäuren ist der Hauptvorteil der Erfindung. Die Reaktionszeit wird für Restriktionsendonukleaseverdau, Ligation, Dephosphorylierung, Phosphorylierung (Kination), Umkehrtranskription, in vitro-DNA-Synthese und in vitro-RNA-Synthese auf 5–70 s reduziert.
2. Nahezu alle enzymatischen Reaktionen, die in der Molekularbiologie wie auch in anderen Gebieten verwendet werden, können durch das erfundene Verfahren in einer außerordentlich kurzen Zeitspanne ausgeführt werden, was eine Menge kostbarer Zeit spart und folglich das Verfahren wirtschaftlich und vielseitig macht.
3. Die Reaktionsbedingungen sind sehr einfach und es besteht keine Notwendigkeit für irgendwelche kostspielige Ausrüstung.
4. Das erfundene Verfahren kann für eine Automatisierung in der Molekularbiologie verwendet werden.
5. Das erfundene Verfahren kann in der biotechnologischen Industrie, welche enzymatische Reaktionen mit umfasst, verwendet werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Einfaches, effizientes und beschleunigtes Verfahren zur Enzym-katalysierten in vitro-Modifizierung und Synthese von Nukleinsäure unter Verwendung einer nicht-unterbrochenen und kurzen Mikrowellenbestrahlung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, umfassend (i) ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Restriktionsendonuklease, Ligase, Phosphatase, Kinase, reverse Transkriptase, DNA-Polymerase und RNA-Polymerase, (ii) ein Biomolekül, ausgewählt aus DNA, RNA oder Oligonukleotiden, um als ein Substrat für das ausgewählte Enzym zu wirken, (iii) einen geeigneten Puffer für das spezielle Enzym und (iv) andere Inhaltsstoffe, in einem kleinen Eppendorf-Reaktionsgefäß oder auf einem kleinen Stück Parafilm, (b) Platzieren des mit der Reaktionsmischung beladenen Eppendorf-Reaktionsgefäßes oder Parafilm-Stücks in einen Mikrowellenherd, (c) Bestrahlen des Eppendorf-Reaktionsgefäßes oder Parafilms kontinuierlich durch Mikrowellen mit einer Frequenz, welche von 2300 bis 2500 MHz eingeschlossen reicht, wobei die Leistungsabgabe von 600 bis 900 Watt eingeschlossen reicht, (d) für eine Zeitspanne, die von 5 bis 120 s eingeschlossen reicht, (e) Beenden der Reaktion durch Zugeben von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und/oder Erwärmen in einem Wasserbad bei 75°C für 3–15 min, gefolgt von der Zugabe von Gelauftragsfarbstoff, (f) Analysieren des Reaktionsprodukts bzw. der Reaktionsprodukte durch Agarose-Gelelektrophorese, Autoradiographie, Radioaktivitätszählungen und andere Techniken, wie sie in den herkömmlichen Verfahren verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure aus DNA, RNA und Oligonukleotiden ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei andere Inhaltsstoffe, die verwendet werden, aus einer Gruppe, umfassend MgCl₂, MgSO₄, NaCl, KCl, CH₃COOK, Ethylendiamintetraacetat, Dithiothreitol, Spermidin, BSA (Rinderserumalbumin), Triton X-100, Nukleotide, Matrizen-DNA, Matrizen-RNA und Oligonukleotid-Primer, ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuklease aus HindIII, BamHI, EcoRI, HaeIII, BglII, PstI, BstEII und BstNI ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete Ligase T4-DNA-Ligase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete Kinase T4-Polynukleotidkinase (TPNK) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete Phosphatase alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polymerase aus der Gruppe bestehend aus E. coli-DNA-Polymerase I, dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T7-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete reverse Transkriptase die reverse Transkriptase des Vögel-Myeloblastosevirus (AMV-RT) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verwendete DNA aus der Gruppe, umfassend genomische DNA, Lambda-Phagen-DNA, Plasmid-DNA, Baculovirus-DNA, Pflanzen-DNA und Säugetier-DNA, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehr als eine Restriktionsendonuklease für einen doppelten Verdau von Nukleinsäure verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die verwendeten Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII für einen doppelten Verdau sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikrowellen-Bestrahlung in einem jeglichen Gerät oder einer jeglichen Kammer, wo Mikrowellen erzeugt werden können, ausgeführt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren teilweise oder vollständig durch ein speziell gestaltetes Gerät automatisiert werden kann.