DE102009034119A1

DE102009034119A1 - Verfahren, insbesondere Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern, Mikrotiterplatte und Testkit

Info

Publication number: DE102009034119A1
Application number: DE102009034119A
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Bacher; Karthikeyan Balaktrishnan; Richard Prof. Dr. Dodel
Original assignee: Philipps Universitaet Marburg
Current assignee: Philipps Universitaet Marburg
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2009-07-20
Publication date: 2011-01-27
Also published as: US20130109033A1; EP2457093A1; WO2011009435A1

Abstract

Bei einem Verfahren, insbesondere einem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Aβ-Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase, Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung, Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe, immunologischer Nachweis des Aβ-Autoantikörpers auf der Festphase und Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes ist es vorteilhaft, wenn das Bereitstellen der Antigen-beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3, aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere einen Enzyme-linked Immunosorbend Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1, eine Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 17, sowie ein Testkit gemäß Anspruch 23.
In vitro Nachweisverfahren für Antikörper, insbesondere ELISAs, sind allgemein bekannt. Sie gehören zur Gruppe der Immunassay-Verfahren.

Deren Grundprinzip ist die Erkennung eines Analyten durch einen Bindungspartner in der Form der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen. Im Sinne der vorliegenden Anmeldung meint

Analyt:	Ein in einer zu untersuchenden Probe nachzuweisendes Antigen oder ein nachzuweisender Antikörper.
Antigen:	Ein Protein/Polypeptid, das die Produktion von Antikörpern bewirkt, wenn es einem tierischen Organismus injiziert wird (Antigen-Stimulus).
Antikörper:	Ein Protein, das als Reaktion auf den Antigen-Stimulus produziert wird und spezifisch das Stimulus erzeugende Antigen erkennt und bindet.
anti-Spezies Antikörper:	Ein Antikörper, der produziert wird, wenn Proteine (inklusive Antikörper) einer Spezies einer anderen Spezies injiziert werden, erkennen und binden alle Antigene, die aus der ersten Speziesstammen.
Bindungspartner:	Ein Antigen oder Antikörper, der spezifisch an den Analyten bindet.
Detektionsantikörper:	Bindet an den Analyten, nicht jedoch an den Bindungspartner des Analyten und ist entweder mit einem Detektionsmittel oder mit einer unmittelbar nachweisbaren Substanz, wie bspw. einem Fluoreszenzfarbstoff, gekoppelt (= konjugiert). Bei dem Detektionsmittel kann es sich beispielsweise um ein Enzym handeln, welches in der Lage ist ein spezielles Substrat derart zu spalten, dass eine Farbreaktion hervorgerufen wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung kann der Detektionsantikörper auch als Zweitantikörper bezeichnet werden.

Der Ablauf eines solchen Nachweis-Verfahrens stellt sich grundsätzlich wie folgt dar:
Der Bindungspartner des Analyten wird an einer Festphase immobilisert. Anschließen wird die Festphase mit einer Probe inkubiert, in welcher sich möglicherweise der nachzuweisende Analyt befindet. Sofern Analyt in der Probe vorhanden ist, bindet er an den auf der Festphase immobilisierten Bindungspartner und wird auf diese Weise ebenfalls immobilisiert. Die Bindung des Analyten an seinen Bindungspartner wird dann mit Hilfe eines Detektionsantikörpers nachgewiesen. Dazu wird die Festphase, auf der nun der Bindungspartner den Analyten festhält, mit einer Lösung inkubiert, welche den Detektionsantikörper enthält. Dieser bindet an den immobilisierten Analyten und kann dann beispielsweise dadurch nachgeweisen werden, dass eine Enzym-Substrat-Reaktion mit Hilfe des an den Detektionsantikörper konjugierten Enzymes durchgeführt wird.
Solche Nachweisverfahren werden bevorzugt in der medizinischen Diagnostik eingesetzt, um Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben von Tier und/oder Mensch auf das Vorhandensein oder Fehlen von Antigenen hin untersuchen zu können. Aus dem Ergebnis des Nachweises können dann beispielsweise Aussagen über mögliche Erkrankungen des zu Untersuchenden getroffen werden.
Ein prominentes Beispiel für auf diesem Weg untersuchbare Erkrankungen ist der Morbus Alzheimer. Diese Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine Reihe von neuropathologischen Charakteristiken, von denen eine besonders typische die Bildung von sogenannten neuritischen Plaques im Gehirn der Patienten ist. Diese Plaques bestehen aus extrazellulär abgelagerten Amyloid-beta-Peptiden (Aß), die bei der Spaltung des amyloid precursor Proteins (APP) entstehen (Kang et al. „The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 Protein resembles a cell-surface receptor" Nature 1987; Tanzi et al. "Amyloid beta Protein gene: cDNA, mRNA distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus" Science, 1987).
Problematisch bei herkömmlichen ELISAs zum Nachweis von Aβ ist, dass nicht alle Aβ-Formen tatsächlich pathologisch sind, und dass Antikörper, die spezifisch die pathologischen Formen erkennen, nur in sehr begrenztem Umfang zur Verfügung stehen und entsprechend sehr teuer sind. So werden zum Nachweis wenigstens zwei spezifische Antikörper benötigt – ein erster als immobilisierter Bindungspartner auf der Festphase und ein zweiter als Detektionsantikörper. Diese sollten entsprechend auch aus unterschiedlichen Spezies stammen, da die Detektion ansonsten die Gefahr eines sehr hohen Hintergrundes und dementsprechend die Gefahr, einer hohen Anzahl falsch positiver Ergebnisse zu liefern, birgt.
Die Bildung von unspezifischem Hintergrund kann zwar dadurch reduziert werden, dass der Detektionsantikörper nicht unmittelbar an das gebundene Aβ-Peptid bindet, sondern an einen Zweitantikörper, der den gebundenen Analtyten erkennt und bindet jedoch nicht Enzym-konjugiert ist. Dies ist jedoch ebenfalls mit Nachteilen behaftet. So sind hierfür verhältnismäßig viele Antikörper-Antigen-Bindungsschritte notwendig – Einfangen des nachzuweisenden Aβ-Peptides durch einen auf der Platte gebundenen Erstantikörper, Binden des Zweitantikörpers an das eingefangene Antigen, Binden des Zweitantikörpers durch den Detektions-Antikörper – was die Fehleranfälligkeit und mithin die Chance für falsch-positive bzw. falsch-negative Testergebnisse nicht wirklich verbessert.
Du et al. haben jedoch 2001 beobachtet, dass sowohl in Körperflüssigkeiten von gesunden Individuen, als auch in Körperflüssigkeiten von erkrankten Alzheimer-Patienten natürliche Antikörper gegen Aβ-Peptide vorhanden sind (vgl. Du et al. „Reduced levels of amyloid β-peptide antibody in Alzheimer disease", Neurology 2001), sogenannte Amyloidbeta Autoantikörper (Aβ-Autoantikörper). Dabei verändert sich der Titer dieser sogenannten Autoantikörper, wenn eine Alzheimer-Erkrankung vorliegt.
Diese Beobachtung kann im Prinzip ausgenutzt werden, um einen modifizierten ELISA durchzuführen. Dabei wird anstelle des Aβ-Peptides der Autoantikörper nachgewiesen. Dazu werden entweder Proben der Cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) oder Serum- bzw. Plasma-Proben entnommen und untersucht. Beides ist jedoch mit deutlichen Nachteilen verbunden. So ist einerseits die Entnahme von CSF-Proben für den Patienten nicht unproblematisch und unangenehm. Andererseits ist die Analyse von Serum-Proben, die im Gegensatz dazu leicht gewonnen werden können, nur mit einem stark erhöhten Aufwand möglich. So liegt eine besondere Schwierigkeit in der enormen allgemeinen Antikörperdichte in der Serum-Matrix, die das spezifische Herausfischen der Aβ-Autoantikörper durch die entsprechende auf der Festphase des Test immobilisierten Bindungspartner behindert und häufig unspezifische Bindungen bzw. unerwünschte Kreuzreaktionen hervorruft.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen verbesserten ELISA zum Nachweis von Aβ-Autoantiköpern zur Verfügung zu stellen, der eine rasche Auswertung mit einfachen und kostengünstigen Mitteln erlaubt. Der ELISA soll insbesondere mit humanen Serum- und/oder Plasma-Proben sowie CSF-Proben rasch und einfach durchführbar sein. Desweiteren ist es Aufgabe eine entsprechende Mikrotiterplatte sowie ein Testkit für die Durchführung einen erfindungsgemäßen ELISA bereitzustellen.
Hauptmerkmale der Erfindung sind im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1, 17 und 23 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 16, 18 bis 22, 24 und 25.
Bei einem Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte

a) Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase,
b) Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung,
c) Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe,
d) immunologischer Nachweis des Amyloid beta Autoantikörpers auf der Festphase und
e) Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes

Dabei hat es sich insbesondere als Vorteilhaft erwiesen, wenn die Festphase mit einem Antigen, das eine Peptid-Sequenz entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 hat, beschichtet ist. Überraschenderweise zeigen nämlich solche 40 bis 46 Aminosäure-langen Peptiden eine sehr schnelle Aggregationskinetik mit natürlichen humanen Aβ-Autoantikörpern. Die im ELISA nachzuweisenden Autoantikörper binden daher rasch und zuverlässig an die auf der Festphase immobilisierten Antigene. Dabei ist es besonders günstig, wenn das Antigen eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 aufweist.
Ein besonders kritischer Punkt bei der Etablierung eines ELISAS ist, wie oben bereits ausgeführt, die Beschichtung der Festphase mit dem Bindungspartner des Analyten. Ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist. So hat sich nämlich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Antigene im basischen Milieu, insbesondere bei einem pH-Wert von 9.6 deutlich besser an die Festphase binden, als im herkömmlicherweise verwendeten neutralen Milieu bei etwa pH 7.
Das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung kann dabei sowohl bei 4°C über Nacht erfolgen, was besonders günstig bei der Verwendung eines Antigens mit einer Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 ist, als auch bei 37°C und 5% CO₂ für 2 Stunden, was bevorzugt bei der Verwendung eines Antigens mit einer Sequenz entsprechend SEQ ID No. 2 der Fall ist.
Ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens ist das Blocken. Dieser Schritt dient dazu, die Bereiche der Festphasenoberfläche abzudecken, an denen kein Antigen gebunden ist, so dass der nachzuweisende Analyt bei der anschließend folgenden Inkubation mit der Probe ausschließlich an die Antigene und nicht an die Festphase selbst binden kann. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens. So kann beispielsweise die kommerziell erhältliche Blocking-Lösung Superblock TBS^® oder Superblock^® der Firma Pierce, Deutschland verwendet werden. Die Inkubation mit der Blockinglösung wird bevorzugt bei 4°C über Nacht durchgeführt. Auf diese Weise kann die freie Oberfläche der Festphase an den Stellen, an denen kein Antigen gebunden ist besonders gut mit dem in der Blockinglösung enthaltenen Protein bedeckt werden. So wird effektiv verhindert, dass in der Probe vorhandene Antigene oder Antikörper unspezifisch an die Festphase binden und so unerwünschte falsch-positive Signale, die auch als unspezifischer störender Hintergrund bezeichnet werden, liefern.
Bei der Durchführung von immunologischen Assays zu diagnostischen Zwecken hat es sich bewährt, stets nicht nur eine einzelne Patienten-Probe, sondern gleichzeitig eine standardisierte Vergleichsprobe (in der Folge als Standard bezeichnet), die tatsächlich zu untersuchende Patienten-Probe und wenigstens eine Kontrolle unter gleichen Bedingungen zu analysieren. Es ist daher von Vorteil, wenn die Festphase eine Mikrotiterplatte ist. Diese hat üblicherweise mehrere Abschnitte zur Analyse von Patienten-Proben bzw. Standard und Kontrolle, sogenannte Wells. Alle Wells einer Mikrotiterplatte können identisch vorbereitet werden. Üblicherweise werden dazu alle Wells gleichzeitig mit Antigen beschichtet und anschließend geblockt. Anschließend werden jeweils bestimmte Wells mit einer definierten Menge Standard, Patienten-Probe und Kontrolle befüllt und weiter behandelt. Dabei wird in jedes Well das gleichen Volumen an Flüssigkeit gefüllt. Die jeweilige Konzentration von Standard, Patienten-Probe und Kontrolle wird jedoch durch geeignete Verdünnung von Well zu Well variiert, um eine möglichst präzise Konzentrationsbestimmung des nachzuweisenden Analyten zu erlauben.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Wells mit einem relativ hohen Gesamtvolumen, nämlich bis zu 300 μl befüllt werden, welches jedoch nur einen relativ geringen Anteil an Probe (also entweder Standard, Patienten-Probe oder Kontrolle) enthält.
So sieht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens vor, dass die Wells zunächst mit 250 μl eines Assay-Puffers befüllt werden. In diesen Puffer werden anschließend nur 10 μl der zu untersuchenden Probe gegeben. Der Assay-Puffer dient dabei der definierten Verdünnung der Probe. Insbesondere bei der Analyse von aus Serum gewonnenen Patienten-Proben ist es vorteilhaft, wenn nur ein geringes Volumen von Serum für den Nachweis eingesetzt werden muss. Dies minimiert unerwünschte Kreuzreaktionen und erhöht auf diese Weise die Spezifität des Tests.
Dabei ist es auch denkbar, dass Serum-Proben, die einen besonders hohe Konzentration an Serum-Bestandteilen aufweisen, bereits vor dem Einbringen in den Assay-Puffer mit Hilfe eines sogenannten Proben-Verdünnungs-Puffers vorverdünnt werden. Dieser Proben-Verdünnungs-Puffer ist bevorzugt so beschaffen, dass die Serum-Matrix bei der Verdünnung nicht beeinträchtigt wird. Ein weiteres Ausführungsbeispiel sieht dementsprechend vor, dass die Wells mit 200 μl vorverdünnter Probe befüllt werden.
Nach dem Befüllen der Wells mit den Proben (also mit Standard, Patienten-Probe und Kontrolle) wird die Mikrotiterplatte für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur inkubiert. Diese Bedingungen haben sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, um einerseits sicher zu gehen, dass in der Patienten-Probe vorhandene Analyte wirklich an ihre auf der Mikrotiterplatte immobilisierten Bindungspartner binden, und um andererseits unerwünschte Kreuzreaktionen bzw. unspezifische Bindungen so gering wie möglich zu halten.
Man erkennt, dass das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung vorteilhaft die folgenden Schritte umfasst: Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, und Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur.
Der Assay-Puffer ist dabei bevorzugt ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend 3 bis 9% BSA, 0,01 bis 3% TWEEN sowie wenigstens ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe 5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxan (BND), 2-Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin.
Der nächste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der immunologische Nachweis des durch den Bindungspartner eingefangenen Aβ-Autoantikörpers auf der Festphase. Dies geschieht durch folgende Schritte: Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-Konjugat in jedes Well, 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur, Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well, 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur und Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jedes Well.
Die Waschlösung ist dabei bevorzugt ein Tris-Puffer, enthaltend 0,01 bis 3% Tween.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen ELISAs liegt darin, dass die Bindungskinetik des Aβ-Autoantikörpers an die erfindungsgemäßen Antigene so optimal ist, dass für den immunologischen Nachweis eine chromogene Enzym-Substrat-Reaktion verwendet werden kann, deren Ergebnis durch das Bestimmen der optischen Dichte bei 450 nm gemessen werden kann. Dementsprechend erfolgt das Auslesen des Nachweisergebnisses bei 450 ±10 nm. Dabei ist es günstig, wenn das Auslesen innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung erfolgt.
Das nach dem ersten Waschvorgang in die Wells eingebrachte Enzym-Konjugat enthält den Detektionsantikörper. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen gegen Humane IgG gerichteten Antikörper (α-human IgG). Dieser kann beispielsweise aus einer der folgenden Spezies stammen: Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf oder Schwein. Andere sind zwar im Allgemeinen weniger üblich, jedoch auch denkbar. Der a-human IgG Antikörper ist mit einem Enzym oder einem Farbstoff konjugiert, so dass er entweder durch direkt – wenn es sich beispielsweise um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt – oder durch die Umsetzung eines Substrates mit Hilfe des Enzyms sichtbar gemacht werden kann. Bei dem Enzym kann es sich beispielsweise um ein aus der Gruppe Peroxidase (POD), Meerrettichperoxidas (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), β-Galactosidase (β-Gal) ausgewähltes Enzym handeln. Weitere Enzyme, die mit einem entsprechenden Substrat eine Farbreaktion bewirken, sind vorstellbar. Auch eine Kopplung mit Biotin oder Polymeren an welche eine Vielzahl von Enzymen gekoppelt ist, ist denkbar.
Man erkennt, dass das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), β-Galactosidase (β-Gal).
Jedes dieser Enzyme kann unterschiedliche Substrate umsetzen, so dass eine auswertbare Farbreaktion hervorgerufen wird. Die Wahl des Substrates richtet sich dementsprechend nach der Wahl des Enzyms und umgekehrt. Geeignete Substrate können beispielsweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: 3,3'-Diaminobenzid in (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal), 5-Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Y-Gal), 5-Iod-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), N-Methylindolyl-β-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG). Die Reaktionsbedingungen richten sich dann jeweils nach dem ausgewählten Enzym. Vorteilhaft ist es, wenn das ausgewählte Substrat derart löslich ist, dass es in einem Volumen von 50 bis 100 μl in die Wells der Mikrotiterplatte eingebracht werden kann.
Man erkennt, dass die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal), 5-Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Y-Gal), 5-Iod-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), N-Methylindolyl-β-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt.
Als besonders günstig hat sich die Verwendung eines HRP-gekoppelten α-human IgG Antikörper in Kombination mit dem Substrat TMB gezeigt.
Da das durch das Enzym zu spaltende Substrat üblicherweise im Überschuss zugegeben wird, ist es erforderlich, die Enzym-Substrat-Reaktion nach einem definierten Zeitraum kontrolliert zu beenden. Dies kann beispielsweise durch Zugeben von Stopplösung geschehen. Diese verändert die Reaktionsbedingungen derart, dass die Enzym-Substrat-Reaktion nicht fortgesetzt werden kann. Ist das Enzym beispielsweise HRP und das Substrat TMB, so wird die Reaktion bevorzugt durch das Zugeben einer Säure, üblicherweise Schwefelsäure, gestoppt. Die Stopp-Lösung besteht dann im einfachsten Fall aus der verdünnten Säure. Man erkennt, dass die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salz- oder Schwefelsäure ist.
Die Erfindung sieht außerdem eine Mikrotiterplatte mit wenigstens einem Well vor, wobei jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist. Eine solche Mikrotiterplatte kann mit großem Vorteil eingesetzt werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Für ein übliches Test-design ist es günstig, wenn die Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells aufweist. Die 24 Wells können dann in drei Gruppen unterteilt werden. Die ersten acht Wells werden mit acht verschiedenen Konzentrationen des Standards beladen. Aus den daraus erhaltenen Messwerten kann die Vergleichskurve bestimmt werden. Die zweiten acht Wells werden mit acht verschiedenen Verdünnungsstufen einer Serum-Probe, die einer gesunden Kontroll-Person entnommen wurde beladen. Die dritten acht Wells werden mit den entsprechenden acht Verdünnungsstufen einer Serum-Probe einer möglicherweise erkrankten Person beladen. Diese dreimal acht Wells bilden so gemeinsam eine Testeinheit.
Denkbar ist auch, dass die Mikrotiterplatte mehrere Testeinheiten aufweist, die unabhängig von einander verwendbar sind. So ist beispielsweise eine große Mikrotiterplatte mit mehreren linear hintereinander angeordneten Testeinheiten denkbar, die mit Hilfe einer Perforation oder Nut vor dem Gebrauch von der Mikrotiterplatte abgeknickt bzw. abgebrochen werden können.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dank der hohen Sensitivität des Verfahrens sowohl Mikrotiterplatten deren Wells einen flachen Boden haben als auch Wells mit rundem, v-förmigen oder c-förmigen Boden geeignet. Men erkannt daher, dass es auch bei der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte von Vorteil ist, dass die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben.
Man erkennt weiter, dass eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte mit besonderem Vorteil nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte, Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μg/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1, 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
Dabei ist es einerseits besonders günstig, wenn die Beschichtung der Mikrotiterplatte mit dem Antigen im basischen Milieu erfolgt, weil dann – wie bereits oben ausgeführt – die Antigene besonders gut und effektiv an die Mikrotiterplatte binden. Andererseits wird durch das Inkubieren mit der erfindungsgemäßen Blockinglösung die Oberfläche der Festphase an den Stellen, an denen kein Antigen gebunden ist, besonders gut und gleichmäßig mit dem in der Blockinlösung enthaltenen Protein abgesättigt. Auf diese Weise wird sehr effektiv verhindert, dass in der Probe enthaltene Antigene oder Antikörper an die Festphase anstatt an die daran gekoppelten Antigene binden. Mithin wird der unspezifische Hintergrund des Assay deutlich reduziert.
Man erkennt, dass es daher besonders vorteilhaft ist eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzusehen.
Die Erfindung sieht außerdem ein Testkit zum Nachweis von Aβ-Autoantikörpern in Serum-Proben vor, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, bei dem das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1, 2 oder 3 entspricht. Besonders günstig ist es, wenn das Testkit außerdem bereits vorgefertigte Reagenzien zur Durchführung des Tests enthält. Der Durchführende muss dann nur noch die entsprechende zu untersuchende Serum-Probe sowie eine entsprechende passende Kontroll-Probe zufügen. Denkbar ist auch, dass das Testkit bereits eine Auswahl an Kontroll-Proben enthält.
Man erkennt, dass das Test-Kit bevorzugt einen Standard, Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und/oder Stopplösung enthält.
Man erkennt außerdem, dass das erfindungsgemäße Testkit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Abbildungen und Ausführungsbeispielen.
1 Vergleich der Antigen-Sequenzen der Ausführungsbeispiele 1 bis 5,
2 OD 450-Messwerte eines entsprechend Ausführungsbeispiel 3 durchgeführten ELISA,
3 mit Hilfe des erfindungsgemäßen ELISA entsprechen Ausführungsbeispiel 3 bestimmte Amyloid-beta-Autoantikörper-Konzentration in zwei an Morbus Alzheimer erkrankten und einer gesunden Person.
Man erkennt in 1, dass alle drei erfindungsgemäß für das Beschichten der Festphase verwendbaren Peptide wenigstens die Aminosäuren 1 bis 40 des natürlich vorkommenden Aβ-Peptides aufweisen. Dabei entsprechen die eingerahmten Sequenzbereiche jeweils der Sequenz des Aß_1-40-Peptids, die grau unterlegten Sequenzbereiche der Sequenz des Aβ_1-42-Peptids.
Die als Cys Amyloid-beta 1-42 bezeichnete und der SEQ ID No. 1 entsprechende Sequenz umfasst außerdem C-Terminal die Aminosäuren 41 und 42 des Amyloid beta Peptides (Aβ) und N-terminal vier zusätzliche Aminosäuren, nämlich das Tetrapeptid CGKR. Mithin handelt es sich, bei dem der SEQ ID No. 1 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 46 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches zusammengesetzt ist aus dem Tetrapeptid CGKR gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 42 des Aβ_1-42-Peptides. Anders ausgedrückt ist die mit SEQ ID No. 1 bezeichnete Sequenz ein modifiziertes humanes Peptid, dessen Aminosäuren 5 bis 46 die Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-42 Peptids darstellen, an welche N-terminal das Tetrapeptid Cys Gly Lys Arg angehängt ist, welches den Aminsäuren 1 bis 4 der SEQ ID No. 1 entspricht.
Man erkennt in 1 weiter, dass die SEQ ID No. 2, welche als Amyloid-beta 1-42 bezeichnet wird, der natürlichen Sequenz des Amyloid beta 1-42 Peptides (Aβ1-42) entspricht. Mithin handelt es sich bei dem der SEQ ID No. 2 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 42 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches den Aminosäuren 1 bis 42 des Aβ_1-42-Peptides enspricht.
Die als Cys Amyloid-beta 1-40 bezeichnete SEQ ID No. 3 entspricht dem natürlichen Amyloid-beta 1-40-Peptid (Aβ_1-40). Allerdings wurde das Peptid am N-Terminus durch das Anhängen eines Cystein modifiziert. Mithin handelt es sich bei dem der SEQ ID No. 3 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 41 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches zusammengesetzt ist aus den Aminosäuren 1 bis 40 des Aβ_1-40-Peptides und einem N-terminal angefügten Cystein. Anders ausgedrückt ist die mit SEQ ID No. 3 bezeichnete Sequenz ein modifiziertes humanes Peptid, dessen Aminosäuren 2 bis 41 die Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-40 Peptids darstellen, an welche N-terminal die Aminosäure Cystein angehängt ist, welche der Aminosäuren 1 der SEQ ID No. 3 entspricht.
In 2 erkennt man die OD 450 Messwerte eines entsprechend dem Protokoll vom Ausführungsbeispiel 3 durchgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens. 3 verdeutlicht, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnene Daten unter anderem zur Diagnose von Morbus Alzheimer oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen herangezogen werden können.
Ausführungsbeispiel 1:
In einem ersten Ausführungsbeispiel werden Mikrotiterplatten mit einem Antigen entsprechend der SEQ ID No. 1, also einem Aβ-Peptid, welches die Aminosäuren 1 bis 42 umfasst und N-terminal zusätzlich die Aminosäurefolge CGKR trägt, beschichtet. Dazu wird das Antigen in einem Carbonatpuffer mit pH 9.6 gelöst. Nach der Inkubation mit der so hergestellten Beschichtungslösung wird die Mikrotiterplatte mit Blockinglösung inkubiert.
Als nächstes werden 250 μl Assay-Puffer in jedes Well eingebracht. In jedes so vorbereitete Well werden dann 10 μl Probe, wobei es sich entweder um den Standard, eine Kontrolle oder die tatsächlich zu messende Probe handelt, zu dem Assay-Puffer gegeben. Die Probe wird auf diese Weise derart in Assay-Puffer verdünnt, dass letztlich in jedem Well Volumen von 260 μl verdünnter Probe vorliegt.
Die Platte mit den so verdünnten Proben wird für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wird der Inhalt der Wells sofort ausgeschüttet und jedes Well 3 mal mit 400 ml Waschlösung gewaschen. Zum Entfernen von verbleibenden Flüssigkeitstropfen werden die Wells auf Saugpapier ausgeklopft.
In die gewaschenen Wells werden jeweils 50 μl Enzym-Konjugat gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm inkubiert. Danach werden die Wells erneut wie oben beschrieben gewaschen und ausgeklopft.
Anschließend werden in jedes Well 50 μl Substrat-Lösung gegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die während dieser Zeit stattfindende enzymatische Reaktion wird nach Ablauf der 20 Minuten durch Zugabe von 100 μl Stopp-Lösung beendet. Innerhalb von 10 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion wird für jedes Well die optische Dichte (OD) bei 450 ±10 nm mit einem Lesegerät bestimmt.
Ausführungsbeispiel 2:
Das Ausführungsbeispiel 2 entspricht im Wesentlichen dem bereits oben beschriebenen Ausführungsbeispiel 1. Die Wells werden jedoch mit einem Gesamtvolumen von 200 μl verdünnter Probe beladen. Nach dem Entfernen der Probe werden die Wells jeweils fünfmal mit Waschlösung gewaschen, danach wird in jedes Well 100 μl Enzym-Konjugat gegeben.
Die Reaktion des Enzyms mit dem Chromophor erfolgt während einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Ausführungsbeispiel 3:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Antigen entsprechend SEQ ID No. 2, also das Peptid Aβ_1-42, in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer des pH 9.6 verdünnt. Mit dieser Lösung wird eine Festphase, nämlich eine 96-well hochbindende ELISA Platte, für zwei Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator bei 5% CO₂ inkubiert. Im Anschluss daran wird die Platte mit einer kommerziell erhältlichen Blockinglösung über Nacht inkubiert.
Die so vorbereitete Platte wird viermal mit einer erfindungsgemäßen Waschlösung gewaschen. Anschließend werden entsprechende Standards und verdünnte Proben zugegeben und für 4 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator bei 5% CO₂ inkubiert. Im Anschluss wird die Platte erneut viermal gewaschen. Als Waschlösung wird PBS-Puffer, welcher 0,05% Tween enthält verwendet.
Zum Nachweis von auf der Platte gebundenen Aβ-Autoantikörper wird ein HRP-gekoppelter anti-human-Zweitantikörper verwendet. Dieser wird im Verhältnis 1:4000 in der zuvor verwendeten Blocking-Lösung verdünnt. Als chromogenes Substrat wird TMB verwendet. Die Farbreaktion wird mit Hilfe von Schwefelsäure gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm durch Bestimmung der OD ausgewertet.
Bei der Auswertung wird zunächst die OD der Standards bestimmt und dann mit den Proben bzw. Kontrollen verglichen. Dazu wird zunächst mit Hilfe einer festgelegten Konzentrationsreihe des Standards eine Vergleichskurve bestimmt. Die Proben und Kontrollen werden jeweils mehrfach und in unterschiedlichen Verdünnungen aufgetragen.
Die beispielhafte Beladung einer Mikrotiterplatte kann dabei wie folgt aussehen: Wells 1 bis 8: Standard in verschiedenen Konzentrationen zur Erstellung einer Vergleichskurve
Wells 9 bis 16: Kontroll-Probe aus einer nicht erkrankten Person in verschiedenen Verdünnungen
Wells 17 bis 24: Zu messende Probe einer möglicherweise erkrankten Person in verschiedenen Verdünnungen
Das jeweilige Design des Tests kann dabei je nach Bedarf variiert werden. So wurden für ein entsprechend der Ausführungsvariante 3 beispielhaft durchgeführtes Nachweisverfahren insgesamt 40 zu messende Wells einer Mikrotiterplatte wie in Tabelle 1 dargestellt beladen. Dabei wurden zwei erkrankte Personen und eine Kontrollperson, deren Alter dem Alter der erkrankten Person Nr. 1 entspricht, untersucht. Allen drei Personen wurde dazu jeweils eine Serumprobe entnommen.
Die ersten 16 Wells werden mit einer Standard-Verdünnungsreihe beladen, um eine Vergleichskurve zu erstellen, anhand derer dann aus den OD-Messwerten der Proben die in den Proben vorhandene Konzentration an Aβ-Autoantikörper errechnet werden kann.

Als Standard wird ein Gemisch an natürlich im Serum vorkommenden Aβ-Autoantikörpern verwendet, das aus einem kommerziell erhältlichen Produkt zur intravenösen Applikation von Immunglobulinen, hergestellt wurde.

Standard: Aβ Autoantikörper aus IVIg in PBS
Well Nr.	Konzentration	Well Nr.	Konzentration
1	2000 μg/ml	9	25 μg/ml
2	1000 μg/ml	10	12,5 μg/ml
3	500 μg/ml	11	5 μg/ml
4	250 μg/ml	12	2,5 μg/ml
5	125 μg/ml	13	1,25 μg/ml
6	100 μg/ml	14	1 μg/ml
7	75 μg/ml	15	0,5 μg/ml
8	50 μg/ml	16	-

Erkrankte Person Nr. 1 Serumprobe	Erkrankte Person Nr. 2 Serumprobe	Kontrollperson Serumprobe
Well Nr.	Verdünnung	Well Nr.	Verdünnung	Well Nr.	Verdünnung
17	1:1.000	25	1:1.000	33	1:1.000
18	1:5.000	26	1:5.000	34	1:5.000
19	1:10.000	27	1:10.000	35	1:10.000
20	1:25.000	28	1:25.000	36	1:25.000
21	1:50.000	29	1:50.000	37	1:50.000
22	1:100.000	30	1:100.000	38	1:100.000
23	1:500.000	31	1:500.000	39	1:500.000
24	1:1.000.000	32	1:1.000.000	40	1:1.000.000

Tabelle 1: Beladungsschema für 40 Wells einer erfindungsgemaßen Mikrotiterplatte:

Wells 1 bis 16: Standard-Konzentrationsreihe zur Erstellung einer Vergleichs-Standardkurve,
Wells 17 bis 24: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer ersten erkrankten Person,
Wells 25 bis 32: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer zweiten erkrankten Person,
Wells 33 bis 40: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer gesunden Kontrollperson.

Die wie in Tabelle 1 dargestellt mit Probe bzw. Standard beladenen Wells der Mikrotiterplatte werden entsprechend dem oben beschriebenen Protokoll für 4 Stunde bei 37°C inkubiert, anschließend gewaschen, mit Enzymkonjugat inkubiert, erneut gewaschen und mit Substratlösung inkubiert. Nach dem Stoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wird die OD 450 mit einem entsprechenden Lesegerät bestimmt.
In 2a sind die Messwerte einer solchen OD 450-Bestimmung dargestellt. Kurve 1 zeigt die OD-Messwerte der mit der Standardreihe beladenen Wells, Kurve 2 die Messerwerte der verdünnten Serum-Proben der erkrankten Person 1, Kurve 3, die Messwerte der verdünnten Serum-Proben der erkrankten Person 2 und Kurve 4 die Messerwerte der verdünnten Serum-Proben der Kontrollperson.
Durch Vergleich der Messwerte der erkrankten Personen bzw. der Kontrollperson mit den gemessenen Standardwerten bekannter Antikörper-Konzentration, lassen sich im Anschluss an die Messung aus den OD 450 Werten die Konzentrationen von Aβ-Autoantikörper in den jeweiligen Serum-Proben berechnen.
In 2b erkennt man, dass beide erkrankte Personen jeweils mehr als 900 μg/ml Aβ-Autoantikörper im Serum aufweisen. Die gesunde Kontrollperson zeigt einen demgegenüber deutlich geringeren Wert von nur etwa 840 μg/ml.
Ausführungsbeispiel 4:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden 96-well-ELISA Platten mit einem Antigen entsprechend SEQ ID No. 3, also einem Aβ_1-40-Peptid, welches N-terminal mit einem Cystein versehen ist, beschichtet.
Hierzu werden die ELISA-Platten bei 4°C über Nacht mit einer Beschichtungslösung inkubiert. Zur Herstellung der Beschichtungslösung werden unmittelbar vor der Inkubation 5 μg/ml Antigen in einem 100 mM Natriumbicarbonat-Puffer mit pH 9.6 gelöst.
Im Anschluss werden die Platten mit Blockinglösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur, oder alternativ bei 4°C über Nacht inkubiert. Als Blockinglösung wird eine kommerziell erhältliche Lösung verwendet, beispielsweise SuperBlock der Firma Pierce, Deutschland.
Zur Etablierung von Standards werden humane IVIgG affinitätsgereinigte Autoantikörper mit Salzlösung, welche einen pH von 7.4 hat, derart verdünnt, dass sie in Konzentrationen von 50 bis 0,78 μg/ml vorliegen. Die so hergestellten Standards werden bei 4°C über Nacht auf den Antigen-beschichteten Platten inkubiert.
Als Zweitantikörper wird ein HRP-konjugierter α-human-Antikörper aus Ziege verwendet, der spezifisch die schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen erkennt (HRP-labeled H&L chain specific Goat anti-human von Calbiochem, Darmstadt, Deutschland). Dieser wird in einer Verdünnung von 1:3000 eingesetzt. Die Inkubation erfolgt für eine Stunde bei 37°C. Als chromogenes Substrat wird 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) verwendet. Die enzymatische Reaktion wird mit 2N Schwefelsäure (H₂SO₄) terminiert. Die Platten werden mit Hilfe eines Lesegerätes von Thermo Electron Corp bei 450 nm ausgewertet.
Die Waschschritte, sowie die enzymatische Reaktion erfolgen bei diesem Ausführungsbeispiel entsprechend den oben bereits beschriebenen Ausführungsbeispielen.
Ausführungsbeispiel 5
In einer weiteren Ausführungsvariante umfasst die Erfindung ein Testkit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen ELISA. Das Testkit enthält eine Mikrotiterplatte, welche mit einem Peptid beschichtet ist, das eine Sequenz entsprechend SED ID No. 1 hat und als Antigen der immobilisierte Bindungspartner für die nachzuweisenden Aβ–Autoantikörper ist. In dem Testkit sind außerdem Blocking-Lösung, Waschlösung, Assay-Puffer, eine konzentrierte Menge an Standard, Enzym-Konjugat, Substrat- und Stopplösung vorhanden.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar.
Man erkennt, dass es bei einem Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Aβ–Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase, Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung, Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe, immunologischer Nachweis des Aβ-Autoantikörpers auf der Festphase und Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes vorteilhaft ist, wenn das Bereitstellen der Antigenbeschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist. Dabei ist es besonders günstig, wenn das Antigen bevorzugt eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 aufweist. Vorteilhaft ist es außerdem, wenn die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist und wenn die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens. Das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung erfolgt bei 4°C über Nacht oder bei 37°C und 5% CO₂ für 2 Stunden. Die Inkubation mit der Blocking-Lösung wird bei 4°C über Nacht durchgeführt.
Bevorzugt ist die Festphase eine Mikrotiterplatte und das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung umfasst die folgenden Schritte: Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur.
Der immunologische Nachweis des Aβ–Autoantikörpers umfasst die folgenden Schritte: Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-Konjugat in jedes Well, 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur, Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well, 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur, Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jedes Well.
Das Auslesen des Nachweisergebnisses erfolgt bei 450 ±10 nm, bevorzugt innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung.
Günstig ist es, wenn der Assay-Puffer ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend 3 bis 9% BSA, 0,01 bis 3% TWEEN sowie wenigstens ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe Gruppe 5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxan (BND), 2-Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin, wenn die Waschlösung ein Tris-Puffer ist, enthaltend 0,01 bis 3% Tween, wenn das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), beta-Galactosidase (β-Gal), wenn die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal), 5-Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Y-Gal), 5-Iod-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), N-Methylindolyl-β-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt und wenn die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salz- oder Schwefelsäure ist.
Man erkennt, dass es bei einer Mikrotiterplatte zum Nachweis von Aβ–Autoantikörpern mit wenigstens einem Well, vorteilhaft ist, dass jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist. Bevorzugt weist die Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells auf. Dabei weist die Mikrotiterplatte ganz besonders bevorzugt mehrere Testeinheiten auf, die unabhängig von einander verwendbar sind. Dabei können die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben. Eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte ist nach einem Verfahren hergestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte, Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μl/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1, 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein antimikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
Zweckmäßig ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Man erkennt, dass außerdem ein Testkit zum Nachweis von Aβ–Autoantikörpern in Serum-Proben, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, wobei das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1, 2 oder 3 entspricht, eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist. Dabei ist es günstig, wenn das Test-Kit Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und/oder Stopplösung enthält. Das erfindungsgemäße Testkit kann vorteilhaft in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.
Bezugszeichenliste

SEQ ID No. 1

Cys-Amyloid-beta 1-42

SEQ ID No. 2

Amyloid-beta 1-42

SEQ ID No. 3

Cys-Amyloid-beta 1-40

Kurve 1

Standard

Kurve 2

erkrankte Person 1

Kurve 3

erkrankte Person 2

Kurve 4

Kontrollperson

N-Terminus

N-terminale Aminosäure des natürlichen Aβ–Peptides

1

Aminosäure Nr. 1 des natürlichen Aβ

10

Aminosäure Nr. 10 des natürlichen Aβ

20

Aminosäure Nr. 20 des natürlichen Aβ

30

Aminosäure Nr. 30 des natürlichen Aβ

40

Aminosäure Nr. 40 des natürlichen Aβ

Abkürzungen

Aβ

Amyloid beta

Aβ1-40

Amyloid beta-Peptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 40

Aβ1-42

Amyloid beta-Peptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 42

AEC

3-Amino-9-Ethylcarbazol

AP

alkalische Phosphatase

APP

Amyloid percursor Protein

BCIP

5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat

Blue-Gal

Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

BND

5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxan

CAA

2-Chloroacetamid

CN

4-Chlor-1-Naphtol

CSF

Cerebrospinale Flüssigkeit (Liquor)

βGal

beta Galactosidase

Green-gal

N-Methylindolyl-β-D-galactopyranosid,

DAB

3,3'-Diaminobenzidin

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent Assay

HPO

2-Hydroxypyridin-N-oxid

HRP

Meerrettichperoxidase

α-human

IVIgG intravenös verabreichbare Immunglobuline

Magenta-Gal

5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

MIT

N-Mthylisothiazolon

MUG

4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid

NBT

Nitroblau-Tetrazoliumchlorid

OD

Optische Dichte

OD 450

Optische Dichte bei 450 nm

Purple-Gal

5-Iod-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

rpm

Umdrehungen pro Minute

TMB

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin

X-Gal

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid

Y-Gal

6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

Sequenzprotokoll – freier Text

Modifiziertes humanes Peptid
N-terminal angehängte Tetrapeptidseqeunz Cys Gly Lys Arg
Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-42 Peptids
Cystein
Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-40 Peptids

Sequenzprotokoll
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Kang et al. „The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 Protein resembles a cell-surface receptor” Nature 1987 [0006]
- Tanzi et al. ”Amyloid beta Protein gene: cDNA, mRNA distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus” Science, 1987 [0006]
- Du et al. [0009]
- Du et al. „Reduced levels of amyloid β-peptide antibody in Alzheimer disease”, Neurology 2001 [0009]

Claims

Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, sowie CSF, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase, b) Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung, c) Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe, d) immunologischer Nachweis des Amyloid beta Autoantikörpers auf der Festphase und e) Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes dadurch gekennzeichnet, dass das Bereitstellen der Antigen-beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist.
Verfahren nach einem der Anspruche 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen bevorzugt eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung bei 4°C über Nacht erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung bei 37°C und 5% CO₂ für 2 Stunde erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mit der Blockinglösung bei 4°C über Nacht durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase eine Mikrotiterplatte ist und dass das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung die folgenden Schritte umfasst a) Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, b) Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Assay-Puffer ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend a) 3 bis 9% BSA, b) 0,01 bis 3% TWEEN c) sowie wenigstens ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe 5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxan (BND), 2-Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologische Nachweis des Amyloid-beta Autoantikörpers die folgenden Schritte umfasst a) Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells b) drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well c) Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier d) Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-Konjugat in jedes Well e) 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur f) Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells g) drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well h) Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier i) Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well j) 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur k) Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jedes Well
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Waschlösung ein Tris-Puffer ist, enthaltend 0,01 bis 3% Tween.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen des Nachweisergebnisses bei 450 ±10 nm erfolgt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte (?), Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), beta-Galactosidase (β-Gal).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal), 5-Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Y-Gal), 5-Iod-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), N-Methylindolyl-β-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salz- oder Schwefelsäure ist.
Mikrotiterplatte mit wenigstens einem Well, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist.
Mikrotiterplatte nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells aufweist.
Mikrotiterplatte nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte mehrere Testeinheiten aufweist, die unabhängig von einander verwendbar sind.
Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben.
Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte b) Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μg/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1, 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und c) Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Trisgepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein antimikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 21 zur Verwendung in einem Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 16.
Testkit zum Nachweis von Amyloid-beta Autoantikörpern in Serum-/Plasma- und/oder CSF-Proben, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1, 2 oder 3 entspricht.
Testkit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Test-Kit Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und oder Stopplösung enthält.
Testkit nach einem der Ansprüche 23 oder 24 zur Verwendung in einem Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 16.