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GEBIET UND
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft eine Reihe von Verbindungen, Verfahren zur Herstellung
der Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen
enthalten, und ihre Verwendung als therapeutische Mittel. Insbesondere
betrifft die Erfindung Verbindungen, die potente und selektive Inhibitoren
von für cyclisches
Guanosin-3',5'-monophosphat spezifischer Phosphodiesterase
(cGMP-spezifischer PDE), insbesondere PDE5, sind und Nützlichkeit
in einer Vielzahl von therapeutischen Bereichen haben, in denen
eine solche Hemmung als günstig
angesehen wird, einschließlich
der Behandlung von kardiovaskulären
Erkrankungen und erektiler Dysfunktion.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf zahlreiche β-Carbolinverbindungen gerichtet,
die potente und selektive Inhibitoren von PDE5 sind. Zusätzlich können spezifisch
hierin offenbarte Verbindungen zusätzliche fakultative Substituenten
enthalten.
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Zum
Beispiel kann die „Alkyl"-Gruppe, zusätzlich zu
hierin offenbarten Alkyl-Substituenten, geradkettige und verzweigte
Kohlenwasserstoffgruppen sein, die die angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen
enthalten, typischerweise Methyl-, Ethyl- und geradkettige und verzweigte
Propyl- und Butylgruppen. Die Kohlenwasserstoffgruppe kann bis zu
16 Kohlenstoffatome enthalten. Der Begriff „Alkyl" schließt „überbrücktes Alkyl" ein, d.h. eine bicyclische oder polycyclische
Kohlenwasserstoffgruppe, zum Beispiel Norbornyl, Adamantyl, Bicyclo[2.2.2]octyl,
Bicyclo[2.2.1]heptyl, Bicyclo[3.2.1]octyl oder Decahydronaphthyl,
und „Cycloalkyl", d.h. eine cyclische
C3-C8-Kohlenwasserstoffgruppe,
z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl und Cyclopentyl.
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In ähnlicher
Weise kann eine offenbarte „Aryl"-Gruppe unsubstituiert
oder zum Beispiel mit einem oder mehreren, und insbesondere einem
bis drei, Halo, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl,
Haloalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino, Acylamino, Alkylthio, Alkylsulfinyl
und Alkylsulfonyl substituiert sein. Beispiele für zusätzliche Arylgruppen schließen Naphthyl,
Tetrahydronaphthyl, 2-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 2-Methylphenyl, 4-Methoxyphenyl,
3-Trifluormethylphenyl, 4-Nitrophenyl und dergleichen ein.
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Eine
offenbarte „Aryl"-Gruppe kann auch
eine „Heteroaryl"-Gruppe sein, unsubstituiert
oder zum Beispiel mit einem oder mehreren, und insbesondere einem
bis drei, Substituenten substituiert, wie Halo, Alkyl, Hydroxy,
Hydroxyalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Haloalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino,
Acylamino, Alkylthio, Alkylsulfinyl und Alkylsulfonyl. Beispiele
für Heteroarylgruppen
schließen
Thienyl, Furyl, Pyridyl, Oxazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Indolyl,
Triazolyl, Isothiazolyl, Isooxazolyl, Imidazolyl, Benzothiazolyl,
Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl und Thiadiazolyl ein und ähnliche
monocyclische und bicyclische Ringsysteme, die ein oder zwei aromatische
Ringe enthalten und wenigstens ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder
Schwefelatom in einem aromatischen Ring enthalten.
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Ein
offenbarter aliphatischer Heterocyclus kann ein Heterocyclus sein,
bezeichnet als „Het", der definiert ist
als monocyclische, bicyclische und tricyclische Gruppen, die ein
oder mehrere Heteroatome enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die
aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel besteht, fakultativ eine
Oxogruppe (=O) enthaltend, die an den Ring gebunden ist. Nicht-beschränkende Beispiele
für Het-Gruppen
schließen
1,3-Dioxolan, 2- Pyrazolin,
Pyrazolidin, Pyrrolidin, Piperazin, ein Pyrrolin, 2H-Pyran, 4H-Pyran,
Morpholin, Thiopholin, Piperidin, 1,4-Dithian und 1,4-Dioxan ein.
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
ein oder mehrere asymmetrische Zentren enthalten und können daher
als Stereoisomere vorkommen. Die vorliegende Erfindung schließt sowohl
Mischungen als auch separate individuelle Stereoisomere der Verbindungen
der vorliegenden Erfindung ein. Verbindungen der vorliegenden Erfindung
können
auch in tautomeren Formen vorkommen und die Erfindung schließt sowohl
Mischungen als auch separate individuelle Tautomere derselben ein.
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Pharmazeutisch
annehmbare Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Säureadditionssalze
sein, die mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren gebildet werden. Beispiele
für geeignete
Salze schließen
die Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-,
Hydrogenphosphat-, Acetat-, Benzoat-, Succinat-, Fumarat-, Maleat-,
Lactat-, Citrat-, Tartrat-, Gluconat-, Methansulfonat-, Benzolsulfonat-
und p-Toluolsulfonatsalze ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch pharmazeutisch annehmbare
Metallsalze, insbesondere Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze,
mit Basen bereitstellen. Beispiele schließen die Natrium-, Kalium-,
Magnesium- und Calciumsalze ein.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt, ausgewählt aus:
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung sind potente und selektive Inhibitoren
von cGMP-spezifischer
PDE5. Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind von Interesse
zur Verwendung in der Therapie, spezifisch zur Behandlung einer
Vielzahl von Zuständen,
bei denen selektive Hemmung von PDE5 als günstig angesehen wird.
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Phosphodiesterasen
(PDEs) katalysieren die Hydrolyse von cyclischen Nukleotiden, wie
etwa cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und cyclischem Guanosinmonophosphat
(cGMP). Die PDEs sind in wenigstens sieben Isoenzym-Familien einklassifiziert
worden und sind in vielen Geweben vorhanden (J. A. Beavo, Physiol.
Rev., 75, S. 725 (1995)).
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PDE5-Inhibition
ist ein besonders attraktives Ziel. Ein potenter und selektiver
Inhibitor von PDE5 liefert gefäßerweiternde,
entspannende und diuretische Wirkungen, die alle bei der Behandlung
verschiedene Erkrankungszustände
günstig
sind. Forschung in diesem Bereich hat zu mehreren Klassen von Inhibitoren
geführt,
die auf der cGMP-Basisstruktur beruhen (E. Sybertz et al., Expert.
Opin. Ther. Pat., 7, S. 631 (1997)).
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WO-A-0015639
offenbart Carbolin-Derivate als c-GMP-Phosphodiesterase-Inhibitoren.
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WO-A-9743287
offenbart Carbolin-Derivate.
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WO-A-9703985
offenbart Inhibitoren von für
cyclisches GMP spezifischer Phosphodiesterase.
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WO-A-9519978
offenbart tetracyclische Derivate.
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US-A-6143746
offenbart tetracyclische Inhibitoren von für cyclisches GMP spezifischer
Phosphodiesterase.
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Die
biochemischen, physiologischen und klinischen Wirkungen von PDE5-Inhibitoren
legen daher deren Nützlichkeit
bei einer Vielzahl von Erkrankungszuständen nahe, bei denen die Modulation
von Glattmuskel-, Nieren-, Hämostase-,
Entzündungs-
und/oder endokriner Funktion wünschenswert
ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind daher nützlich bei
der Behandlung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich stabiler,
instabiler und varianter (Prinzmetal) Angina, Bluthochdruck, pulmonalem
Hochdruck, kongestivem Herzversagen, akutem Atemnotsyndrom, akutem
und chronischem Nierenversagen, Atherosklerose, Zuständen verringerter
Blutgefäßdurchlässigkeit
(z.B. postperkutane transluminale Koronar- oder Carotidangioplastie oder
Transplantatstenose nach Bypassoperation), peripherer Gefäßerkrankung,
Gefäßstörungen,
wie etwa Raynaud-Krankheit,
Thrombocythämie,
entzündlicher
Erkrankungen, Schlaganfall, Bronchitis, chronischem Asthma, allergischem
Asthma, allergischer Rhinitis, Glaucom, Osteoporose, Frühgeburt,
gutartiger Prostatahypertrophie, peptischem Ulcus, männlicher
erektiler Dysfunktion, weiblicher sexueller Dysfunktion und Erkrankungen,
die durch Störungen
der Darmbeweglichkeit gekennzeichnet sind (z.B. Reizdarmsyndrom).
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Eine
besonders wichtige Verwendung ist die Behandlung von männlicher
erektiler Dysfunktion, die eine Form von Impotenz ist und ein häufiges medizinisches
Problem ist. Impotenz kann definiert werden als das Fehlen der Kraft,
beim Mann, zu kopulieren und kann eine Unfähigkeit umfassen, Peniserektion
oder Ejakulation oder beides zu erreichen. Das Auftreten erektiler
Dysfunktion steigt im Alter an, wobei etwa 50% der Männer über 40 an
einem bestimmten Grad an erektiler Dysfunktion leiden.
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Zusätzlich ist
eine weitere wichtige Verwendung die Behandlung weiblicher sexueller
Erregungsstörung.
Weibliche sexuelle Erregungsstörungen
sind definiert als eine wiederkehrende Unfähigkeit, eine angemessene Gleit-/Anschwellreaktion
sexueller Erregung bis zum Abschluß der sexuellen Aktivität zu erreichen oder
zu halten. Die Erregungsreaktion besteht aus Vasokongestion in der
Scheide, Scheidenschmierung und Expansion und Anschwellen der äußeren Genitalien.
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Man
glaubt daher, daß Verbindungen
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind bei der Behandlung männlicher
erektiler Dysfunktion und weiblicher sexueller Erregungsstörung. Somit
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen
der vorliegenden Erfindung, oder einem pharmazeutisch annehmbaren
Salz davon, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine
der beiden Einheiten enthält,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur kurativen oder prophylaktischen
Behandlung erektiler Dysfunktion in einem männlichen Tier und Erregungsstörung in
einem weiblichen Tier, einschließlich Menschen.
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Der
Begriff „Behandlung" schließt Verhindern,
Vermindern, Anhalten oder Umkehren des Fortschreitens oder der Schwere
des Zustands oder der Symptome, der/die behandelt werden soll/sollen,
ein. Als solcher schließt
der Begriff „Behandlung" sowohl medizinische
therapeutische und/oder prophylaktische Verabreichung, wie geeignet,
ein.
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Man
sollte auch verstehen, daß „eine Verbindung
der vorliegenden Erfindung",
oder ein physiologisch annehmbares Salz oder Solvat davon, als die
reine Verbindung oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine der Einheiten enthält,
verabreicht werden kann.
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Obgleich
die Verbindungen der Erfindung primär für die Behandlung sexueller
Dysfunktion bei Menschen in Betracht gezogen werden, wie etwa männlicher
erektiler Dysfunktion und weiblicher Erregungsstörung, können sie auch zur Behandlung
anderer Erkrankungszustände
verwendet werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung
einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der
Behandlung von stabiler, instabiler und varianter (Prinzmetal) Angina,
Bluthochdruck, pulmonalem Hochdruck, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung,
malignem Hochdruck, Phäochromocytom,
kongestivem Herzversagen, akutem Atemnotsyndrom, akutem und chronischem Nierenversagen,
Atherosklerose, Zuständen
verringerter Blutgefäßdurchlässigkeit
(z.B. post-PTCA oder Transplantatstenose nach Bypassoperation),
peripherer Gefäßerkrankung,
Gefäßstörungen,
wie etwa Raynaud-Krankheit, Thrombocythämie, entzündlichen Erkrankungen, Prophylaxe
von Myocardinfarkt, Prophylaxe von Schlaganfall, Schlaganfall, Bronchitis,
chronischem Asthma, allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Glaucom,
Osteoporose, peptischem Ulcus, postperkutaner transluminaler Koronarangioplastie,
Carotidangioplastie, Frühgeburt,
gutartiger Prostatahypertrophie, männlicher und weiblicher erektiler
Dysfunktion oder Erkrankungen, die durch Störungen der Darmbeweglichkeit
gekennzeichnet sind (z.B. IBS).
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer
Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung der obengenannten Zustände und Störungen bereitgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Behandlung der obengenannten Zustände und Störungen in einem menschlichen
oder nicht-menschlichen tierischen Körper bereit, welches die Verabreichung
einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der vorliegenden
Erfindung an besagten Körper
umfaßt.
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Verbindungen
der Erfindung können über jeden
geeigneten Weg verabreicht werden, zum Beispiel durch orale, bukkale,
Inhalations-, sublinguale, rektale, vaginale, transurethrale, nasale,
topische, perkutane, d.h. transdermale, oder parenterale (einschließlich intravenöser, intramuskulärer, subkutaner
und intrakoronarer) Verabreichung. Parenterale Verabreichung kann
unter Verwendung einer Nadel und Spritze oder unter Verwendung einer
Hochdrucktechnik, wie POWDERJECT®, durchgeführt werden.
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Orale
Verabreichung einer Verbindung der Erfindung ist der bevorzugte
Weg. Orale Verabreichung ist am bequemsten und vermeidet die Nachteile,
die mit anderen Verabreichungswegen verbunden sind. Für Patienten,
die an einer Schluckstörung
oder an Beeinträchtigung
der Wirkstoffabsorption nach oraler Verabreichung leiden, kann der
Wirkstoff parenteral, z.B. sublingual oder bukkal, verabreicht werden.
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Verbindungen
und pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen diejenigen ein, bei denen
der aktive Inhaltsstoff in einer wirksamen Menge verabreicht wird,
um seinen beabsichtigten Zweck zu erreichen. Genauer gesagt bedeutet
eine „therapeutisch wirksame
Menge" eine Menge,
die darin wirksam ist, die Entwicklung der existierenden Symptome
der zu behandelnden Person zu verhindern oder diese Symptome zu
lindern. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt innerhalb der
Fähigkeiten
der Fachleute, insbesondere im Lichte der hierin bereitgestellten
detaillierten Offenbarung.
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Eine „therapeutisch
wirksame Dosis" bezieht
sich auf diejenige Menge der Verbindung, die dazu führt, die
gewünschte
Wirkung zu erzielen. Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können mit
pharmazeutischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren
bestimmt werden, z.B. zur Bestimmung der LD50 (der
Dosis, die für
50% der Population letal ist) und der ED50 (der
Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das
Dosisverhältnis
zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische
Index, der als das Verhältnis
zwischen LD50 und ED50 ausgedrückt wird.
Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, sind bevorzugt.
Die aus solchen Daten erhaltenen Daten können verwendet werden bei der
Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung bei Menschen.
Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb
eines Bereiches von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50 mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die
Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der eingesetzten
Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren.
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Die
exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können vom
einzelnen Arzt angesichts des Zustandes des Patienten ausgewählt werden.
Dosierungsmenge und -intervall können
individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit
zu liefern, die ausreichend sind, um die therapeutischen Wirkungen
aufrechtzuerhalten.
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Die
verabreichte Menge an Zusammensetzung hängt ab von der zu behandelnden
Person, vom Gewicht der Person, von der Schwere des Leidens, der
Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes.
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Genauer
liegen orale Dosierungen einer Verbindung der vorliegenden Erfindung,
zur Verabreichung an einen Menschen bei der kurativen und prophylaktischen
Behandlung der oben identifizierten Zustände und Störungen, bei etwa 0,5 bis etwa
1000 mg täglich
für einen
durchschnittlichen erwachsenen Patienten (70 kg). Somit enthalten
einzelne Tabletten oder Kapseln, für einen typischen erwachsenen
Patienten, 0,2 bis 500 mg aktive Verbindung, in einem geeigneten
pharmazeutisch annehmbaren Vehikel oder Trägerstoff zur Verabreichung
in einzelnen oder mehreren Dosen, einmal oder mehrmals pro Tag.
Dosierungen für
intravenöse,
bukkale oder sublinguale Verabreichung liegen typischerweise bei
0,1 bis 500 mg pro Einzeldosis, nach Erfordernis. In der Praxis
bestimmt der Arzt das aktuelle Dosierungsregime, das für einen
individuellen Patienten am geeignetsten ist, und die Dosierung variiert
mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten.
Die obigen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall,
es kann aber individuelle Fälle
geben, in denen höhere
oder niedrigere Dosierungen angebracht sind, und solche liegen innerhalb
des Schutzumfangs dieser Erfindung.
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Für die menschliche
Verwendung kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein
verabreicht werden, wird aber im allgemeinen in Vermischung mit
einem pharmazeutischen Trägerstoff
verabreicht, der im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg
und die pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen
zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung können
somit in einer herkömmlichen
Art und Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch
annehmbarer Trägerstoffe
formuliert werden, die Füllstoffe
und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung von Verbindungen der
vorliegenden Erfindung zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch
verwendet werden können.
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Diese
pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine herkömmliche
Art und Weise hergestellt werden, z.B. mit herkömmlichen Misch-, Lösungs-,
Granulier-, Drageeherstellungs-, Zerreib-, Emulgier-, Einkapselungs-,
Einschließungs-
oder Lyophilisierungsverfahren. Die richtige Formulierung hängt vom
ausgewählten
Verabreichungsweg ab. Wenn eine therapeutisch wirksame Menge einer
Verbindung der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird, liegt
die Zusammensetzung typischerweise in Form einer/eines Tablette,
Kapsel, Pulvers, Lösung
oder Elixiers vor. Wenn sie in Tablettenform verabreicht wird, kann
die Zusammensetzung zusätzlich
einen festen Trägerstoff
enthalten, wie etwa eine Gelatine oder ein Adjuvans. Die Tablette,
die Kapsel und das Pulver enthalten etwa 5% bis etwa 95% Verbindung
der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 25% bis etwa
90% Verbindung der vorliegenden Erfindung. Wenn sie in flüssiger Form
verabreicht wird, kann ein flüssiger
Trägerstoff
zugesetzt werden, wie etwa Wasser, Petroleum oder Öle tierischen
oder pflanzlichen Ursprungs. Die flüssige Form der Zusammensetzung
kann weiter physiologische Kochsalzlösung, Dextrose- oder andere
Saccharidlösungen
oder Glykole enthalten. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, enthält die Zusammensetzung
etwa 0,5 bis etwa 90 Gew.-% einer Verbindung der vorliegenden Erfindung
und vorzugsweise etwa 1% bis etwa 50% einer Verbindung der vorliegenden
Erfindung.
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Wenn
eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der vorliegenden
Erfindung durch intravenöse,
kutane oder subkutane Injektion verabreicht wird, liegt die Zusammensetzung
in Form einer pyrogenfreien, parenteral annehmbaren wäßrigen Lösung vor.
Die Herstellung solcher parenteral annehmbaren Lösungen, die pH, Isotonizität, Stabilität und dergleichen
angemessen berücksichtigt,
liegt innerhalb des Fachwissens. Eine bevorzugte Zusammensetzung
zur intravenösen,
kutanen oder subkutanen Injektion enthält typischerweise, zusätzlich zu
einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, ein isotonisches Vehikel.
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Für orale
Verabreichung können
die Verbindungen leicht formuliert werden, indem eine Verbindung der
vorliegenden Erfindung mit aus dem Stand der Technik gut bekannten
pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen
zusammengebracht wird. Solche Trägerstoffe
ermöglichen,
die vorliegenden Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln,
Flüssigkeiten,
Gels, Sirupe, Aufschlämmungen,
Suspensionen und dergleichen zur oralen Aufnahme durch einen zu
behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Zubereitungen
für orale
Verwendung können
erhalten werden, indem eine Verbindung der vorliegenden Erfindung
mit einem festen Füllstoff
zugegeben wird, fakultativ eine resultierende Mischung vermahlen
wird und die Mischung von Granülen,
nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, verarbeitet wird, um
Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Füllstoffe
schließen
zum Beispiel Füller
und Cellulosezubereitungen ein. Falls gewünscht können Desintegrationsmittel
zugesetzt werden.
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Für Verabreichung
durch Inhalation werden Verbindungen der vorliegenden Verbindung
geeigneterweise in Form einer Aerosolspraypräsentation aus unter Druck stehenden
Packungen oder einem Vernebelungsgerät unter Verwendung eines geeigneten
Treibmittels zugeführt.
Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit
durch Bereitstellen eines Ventils, um eine abgemessene Menge zuzuführen, bestimmt
werden. Kapseln und Patronen, z.B. Gelatine, zur Verwendung in einem
Inhalator oder Insufflator können
formuliert werden, die ein Pulvergemisch aus der Verbindung und
einer geeigneten Pulverbasis, wie etwa Lactose oder Stärke, enthalten.
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Die
Verbindungen können
für parenterale
Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche
Infusion, formuliert werden. Formulierungen für Injektion können in
Dosiseinheitsform, z.B. in Ampullen, oder in Mehrfachdosisbehältern, mit
einem zusätzlichen
Konservierungsstoff, präsentiert
werden. Die Zusammensetzungen können
solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder
wäßrigen Vehikeln
annehmen und können
Formulationshilfsstoffe, wie etwa Suspensions-, Stabilisierungs-
und/oder Dispergiermittel enthalten.
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Pharmazeutische
Formulierungen für
parenterale Verabreichung schließen wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen
in wasserlöslicher
Form ein. Zusätzlich
können
Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen
hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Vehikel schließen Fettöle oder
synthetische Fettsäureester
ein. Wäßrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen. Fakultativ
kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel, die
die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen
und die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen ermöglichen, enthalten. Alternativ
kann eine vorliegende Zusammensetzung in Pulverform für Konstitution
mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreien Wasser,
vor Gebrauch vorliegen.
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie etwa Suppositorien
oder Retentionseinläufe,
die z.B. herkömmliche
Suppositoriengrundstoffe enthalten. Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen
Formulierungen können
die Verbindungen auch als eine Depotzubereitung formuliert werden.
Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum
Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion
verabreicht werden. So können
die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben
Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder
Ionenaustauschharzen oder als kaum lösliche Derivate, zum Beispiel
als ein kaum lösliches
Salz, formuliert werden.
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Viele
der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch
kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Solche pharmazeutisch
annehmbaren Basenadditionssalze sind diejenigen Salze, die die biologische
Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Säuren beibehalten und die durch
Reaktion mit geeigneten anorganischen oder organischen Basen erhalten
werden.
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Insbesondere
kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oral, bukkal oder
sublingual in Form von Tabletten, die Füllstoffe, wie etwa Stärke oder
Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli, entweder allein
oder in Vermischung mit Füllstoffen,
oder in Form von Elixieren oder Suspensionen, die Geschmacksstoffe
oder Färbemittel
enthalten, verabreicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können mit
pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoffen, wie etwa Suspensionsmitteln,
hergestellt werden. Eine Verbindung kann auch parenteral injiziert
werden, zum Beispiel intravenös,
intramuskulär,
subkutan oder intrakoronar. Für
parenterale Verabreichung wird die Verbindung am besten in Form
einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet,
die weitere Substanzen enthalten kann, zum Beispiel Salze oder Monosaccharide,
wie etwa Mannitol oder Glucose, um die Lösung mit Blut isotonisch zu
machen.
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Für Veterinärgebrauch
wird eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein ungiftiges
Salz davon als eine geeignet annehmbare Formulierung gemäß normaler
tierärztlicher
Praxis verabreicht. Der Tierarzt kann das Dosierungsregime und den
Verabreichungsweg, das/der für
ein bestimmtes Tier am geeignetsten ist, leicht bestimmen.
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So
stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff
oder Trägerstoff
dafür umfaßt. Durch
die vorliegende Erfindung wird weiter ein Verfahren zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die eine
Verbindung der vorliegenden Erfindung umfaßt, wobei das Verfahren umfaßt, daß eine Verbindung
der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Verdünnungsstoff
oder Trägerstoff
dafür vermischt
wird.
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In
einer besonderen Ausführungsform
schließt
die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur kurativen
oder prophylaktischen Behandlung erektiler Dysfunktion in einem
männlichem
Tier oder Erregungsstörung
in einem weiblichem Tier, einschließlich Menschen, ein, die eine
Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares
Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff
oder Trägerstoff
umfaßt.
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
mit jeder im Stand der Technik bekannten Methode oder mit den folgenden
Verfahren, die einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden, hergestellt
werden. Insbesondere können
Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß den Syntheseschemata hergestellt
werden, die in den folgenden Beispielen veranschaulicht sind.
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Man
sollte verstehen, daß Schutzgruppen
gemäß allgemeinen
Prinzipien der synthetischen organischen Chemie eingesetzt werden
können,
um Verbindungen der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Schutzgruppenbildende
Reagentien, wie Benzylchlorformiat und Trichlorethylchlorformiat,
sind den Fachleuten gut bekannt, siehe zum Bespiel T. W. Greene
et al., „Protective
Groups in Organic Synthesis, Third Edition", John Wiley and Sons, Inc., NY, NY
(1999). Diese Schutzgruppen werden, wenn erforderlich, durch geeignete basische,
saure oder hydrogenolytische Bedingungen, die den Fachleuten bekannt
sind, abgespalten. Demgemäß können Verbindungen
der vorliegenden Erfindung, die hierin nicht spezifisch exemplifiziert
sind, von Fachleuten hergestellt werden.
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Zusätzlich können Verbindungen
der vorliegenden Erfindung in andere Verbindungen der vorliegenden
Erfindung umgewandelt werden. So kann zum Beispiel ein bestimmter
Substituent interkonvertiert werden, um eine weitere substituierte
Verbindung der vorliegenden Erfindung herzustellen. Beispiele für geeignete
Interkonversionen schließen
ORa zu Hydroxy mit geeigneten Mitteln (z.B.
unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie etwa SnCl2,
oder eines Palladium-Katalysators, wie Palladium-auf-Kohlenstoff)
oder Amino zu substituiertem Amino, wie etwa Acylamino oder Sulfonylamino,
unter Verwendung von standardmäßigen Acylierungs-
oder Sulfonylierungsbedingungen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
als individuelle Stereoisomere oder als eine razemische Mischung
hergestellt werden. Individuelle Stereoisomere der Verbindungen
der Erfindung können
aus Razematen durch Trennung unter Verwendung von im Stand der Technik
für die
Trennung razemischer Mischungen in deren konstituierende Stereoisomere
bekannten Methoden hergestellt werden, zum Beispiel durch Verwendung
von HPLC auf einer chiralen Säure,
wie etwa Hypersil-Naphthylharnstoff, oder unter Verwendung der Trennung
von Salzen von Stereoisomeren. Verbindungen der Erfindung können in
Assoziation mit Lösemittelmolekülen durch
Kristallisation aus, oder Verdampfung von, einem geeigneten Lösemittel
isoliert werden.
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Die
pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionsalze
der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die ein basisches Zentrum
enthalten, können
auf eine herkömmliche
Art und Weise hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Lösung der
freien Base mit einer geeigneten Säure, entweder rein oder in
einer geeigneten Lösung,
behandelt und das resultierende Salz entweder durch Filtration oder
durch Verdampfung des Reaktionslösemittels
unter Vakuum isoliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze
können
in einer analogen Art und Weise durch Behandeln einer Lösung einer
Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer geeigneten Base
erhalten werden. Beide Arten von Salz können unter Verwendung von Ionenaustauschharztechniken
gebildet oder interkonvertiert werden. So wird gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer
Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines Salzes oder Solvates
(z.B. Hydrates) bereitgestellt, gefolgt von (i) Salzbildung oder
(ii) Solvatbildung (z.B. Hydratbildung).
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Viele
der folgenden Beispiele wurden aus der Verbindung von Strukturformel
(I), d.h. 1-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-2,3,4,9-tetrahydro-1H-β-carbolin,
hergestellt. Die Synthese von Verbindung (I) ist offenbart in U.S.-Patent
Nr. 6,117,881 (Bombrun), das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit
miteinbezogen ist. Weitere Beispiele wurden aus der Verbindung von
Strukturformel (II) hergestellt. Die Synthese von Verbindung (II)
ist offenbart in U.S.-Patent Nr. 5,859,006 (Daugan), das hierin
durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit miteinbezogen ist. Verbindungen,
die analog sind zu Verbindungen (I) und (II), aber unterschiedliche
Substituentengruppen aufweisen, können in einer identischen oder ähnlichen
Art und Weise wie Verbindung (I) und (II) durch Einsetzen geeigneter
Ausgangsmaterialien synthetisiert werden.
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Beispiel
1 (5aR,10R)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-7,8-dimethyl-5,5a,8,9,10,11-hexahydro-7H-7,8,9a,11-tetraazabenzo[b]fluoren-6-on
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Beispiel
1 wurde hergestellt aus Verbindung (II) unter Verwendung der folgenden
Synthesesequenz. Im allgemeinen wurde das Carbamat-Zwischenprodukt
1 an der C4-Position durch überschüssiges Hydrazin unter
thermischen Reaktionsbedingungen reduziert, um Bishydrazin-Zwischenprodukt
2 zu liefern. Die Methode von Winterfield et al. Arch. Pharmaz,
304, S. 216 (1971), wurde verwendet, um die Cyclisierung von Zwischenprodukt
2 zum 2,3,5-Triazin-1-on, Beispiel 1, zu fördern.
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Darstellung des cis-β-Carbolincarbamat-Zwischenproduktes
1
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Methylchlorformiat
(ClCO2Me, 4,8 ml, 62 mmol) wurde tropfenweise
zu einer Suspension von Verbindung (II) (20 g, 53 mmol) und N-Methylmorpholin
(NMM, 14,2 ml, 129 mmol) in THF, Tetrahydrofuran, (150 ml) bei 0°C unter einer
Stickstoffdecke zugegeben. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur
erwärmt, dann
für 3 Tage
gerührt.
Die resultierende Mischung wurde mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt, mit
Salzlösung (150
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösemittel wurde unter verringertem Druck
abgezogen, um Zwischenprodukt 1 als einen bernsteinfarbenen Schaum
zu liefern (21 g, 96%): TLC Rf (1:9/Ethylacetat/Chloroform)
= 0,70. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10,83 (s,
1H), 7,52 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,09 (t,
J = 6,8 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz,
1H), 6,67 (s, 1H), 6,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,2 Hz,
2H), 5,32 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,76 (s, 1H), 3,33 (s, 7H), 2,99–2,97 (m,
1H) ppm; API MS m/z 409 [C22H20N2O6 + H]+.
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Darstellung des cis-β-Carbolinbishydrazin-Zwischenproduktes
2
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Natriummethoxid
(NaOMe, 22 ml, 113 mmol, 30% Lösung
in Methanol) wurde tropfenweise zu einer Mischung von Zwischenprodukt
1 (14,0 g, 34 mmol) und 1,2-Dimethylhydrazin-Dihydrochlorid (9,1 g, 69 mmol) in Ethoxyethanol
(70 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Rückfluß unter einer Stickstoffdecke
für 15 Stunden
erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und
die orangen Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration entfernt. Das
Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, um ein dunkelrotes Öl zu liefern,
das durch Flashsäulenchromatographie
unter Elution mit Ethylacetat/Chloroform (1:19) gereinigt wurde,
um Zwischenprodukt 2 als einen gelben Schaum zu liefern, der ohne
weitere Reinigung verwendet wurde (2,62 g, 17%): TLC Rf (1:9
Ethylacetat/Chloroform) = 0,26; API MS m/z 351 [C24H30N6O3 +
H]+.
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Darstellung von Beispiel
1
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Natriummethoxid
(3,2 ml, 17 mmol, 30% Lösung
in Methanol) wurde tropfenweise einer Mischung von Zwischenprodukt
2 (2,6 g, 5,6 mmol) und 2-Ethoxyethanol (20 ml) zugegeben, dann
wurde die resultierende Mischung bei Rückfluß unter einer Stickstoffdecke
für 66
Stunden erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann
unter verringertem Druck konzentriert, um ein oranges Öl zu liefern,
das durch Flashsäulenchromatographie
unter Elution mit Ethylacetat/Chloroform (1:19) gereinigt wurde,
um das Rohprodukt als einen bernsteinfarbenen Schaum zu liefern.
Dieser Rückstand
wurde weiter durch eine Aufschlämmung
in Wasser/Methanol (3:1), gefolgt von Vakuumfiltration, gereinigt,
um Beispiel 1 als ein gelbbraunes Pulver zu liefern (0,192 g, 8%):
mp 207–213°C; TLC Rf (1:4 Ethylacetat/Chloroform) = 0,46.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10,22 (s,
1H), 7,45 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,00–6,88 (m, 5H),
6,02 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,65 (s, 1H), 3,77 (d, J = 11,6 Hz, 1H),
3,50–3,46
(m, 2H), 3,34 (s, 6H), 3,22 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 2,78–2,70 (m,
1H) ppm; CI MS m/z 391 [C22H22N4O3 + H]+;
[α]d 25°C = +10,0° (c = 0,5,
Chloroform). Analyse berechnet für
C22H22N4O3·0,25
H2O: C, 66,91; H, 5,74; N, 14,19. Gefunden:
C, 66,67; H, 5,66; N, 13,79. Es wurde durch mehrere DEPT-Experimente
und durch eine Reihe von NOE-Differenzexperimenten bestätigt, daß die relative
Stereochemie von Beispiel 1 das gewünschte cis-Isomer war: eine
positive NOE-Verstärkung
vom C12a-Proton bei 3,77 ppm zum C6-Proton bei 4,65 ppm; eine positive
NOE-Verstärkung
vom C6-Proton bei 4,65 ppm zum C12a-Proton bei 3,77 ppm. HPLC-Analyse
(Aquasil-C18-Säule,
100 × 4,6
mm, Retentionszeit = 12,0 Minuten und 18,3 Minuten; 45% Acetonitril/55%
0,03% TFA in Wasser; Durchfluß =
0,75 ml/Minute; Detektor @ 254 nm; 25°C) zeigte zwei Peaks, 6,0% des
trans-Isomers bzw. 94,0% des cis-Isomers, und mit einer Gesamtreinheit
von 100%.
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Die
Verbindungen der Beispiele 2–23
wurden in einer Art und Weise hergestellt, die ähnlich ist zu den Synthesen,
die in Beispiel 1 in U.S.-Patent Nr. 5,859,006 und in U.S.-Patent
Nr. 6,117,881 beschrieben sind.
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Beispiel
2 2-Benzyl-6-(4-methoxyphenyl)-6,7,12,12a-tetrahydropyrazino[1',2':1,6]pyrido[3,4-b]indol-1,3-dion
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Beispiel
3 (+–,cis)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5a,6,10,11-tetrahydro-5H-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-9-on
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Beispiel
4 (+–,cis)-10-(4-Methoxyphenyl)-5a,6,10,11-tetrahydro-5H-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-9-on
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Beispiel
5 (+–,cis)-6-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-11-hydroxy-8-oxa-5,6,8,9,11a,12-hexahydroindolo[3,2-b]-chinolizin-10-carbonsäuremethylester
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Beispiel
6 (+–,trans)-6-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5,6,9,10,11a,12-hexahydroindolo[3,2-b]chinolizin-8,11-dion
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Beispiel
7 (6R,11aS)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5,5a,10,11-tetrahydro-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-6,9-dion
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Beispiel
8 6,7,12,12b-Tetrahydro-1H-indolo[2,3-a]-chinolizin-2,4-dion
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Beispiel
13 14-Methyl-8,13,13b,14-tetrahydro-7H-indolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]chinazolin-5-on
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Beispiel
14 5,13-Dihydro-6H-6a,10,12,13-tetraazaindeno[2,1-a]-anthracen-7-on
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Beispiel
15 2-Methoxy-5,7,8,13,13b,14-hexahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[1,2-b]isochinolin-3-ol
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Beispiel
16 7,8,13,13b-Tetrahydro-5H-5,6a,13-triazaindeno[1,2-c]phenanthren-6-on
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Beispiel
17 7-Oxo-5,7,11b,12-tetrahydro-6H-6a,12-diazaindeno[1,2-a]fluoren-3-carbonsäureethylester
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Beispiel
19 1-(3-Hydroxybenzyl)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-β-carbolin-1-carbonsäure
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Die
Verbindungen der Beispiele 20–23
und ähnliche
Verbindungen können
aus Verbindung (I) und einer Verbindung (III) hergestellt werden.
worin X OH oder Halo ist.
Die Reaktion wird in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid
(EDCI) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) in einem geeigneten organischen
Lösemittel,
wie etwa Dimethylformamid (DMF) oder Dichlormethan (CH
2Cl
2), für
mehrere Stunden, z.B. 8 Stunden bis 2 Tage, durchgeführt. Ein
Heteroaryl- oder anderes Arylringsystem kann statt des Phenylrings
von Verbindung (III) verwendet werden, und das Heteroaryl- oder
Arylringsystem kann fakultativ substituiert sein.
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Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
zu Tabletten für
orale Verabreichung formuliert werden. Zum Beispiel kann eine Verbindung
der vorliegenden Erfindung mit einem polymeren Trägerstoff
durch die Copräzipitationsmethode,
die in WO 96/38131 angegeben ist, die hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist,
in eine Dispersion hinein ausgebildet werden. Die copräzipitierte
Dispersion kann mit Hilfsstoffen vermischt, dann zu Tabletten verpreßt werden,
die fakultativ filmbeschichtet werden.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden auf eine Fähigkeit,
PDE5 zu hemmen, getestet. Die Fähigkeit
einer Verbindung, PDE5-Aktivität
zu hemmen, steht im Zusammenhang mit dem IC50-Wert
für die Verbindung,
d.h. der Inhibitorkonzentration, die für 50% Hemmung der Enzymaktivität erforderlich
ist. Die IC50-Werte für Verbindungen der vorliegenden
Erfindung wurden unter Verwendung von rekombinanter menschlicher
PDE5 bestimmt.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen typischerweise einen
IC50-Wert gegen rekombinante menschliche
PDE5 von weniger als etwa 50 μM
und vorzugsweise weniger als etwa 25 μM und bevorzugter weniger als
15 μM. Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen typischerweise einen
IC50-Wert gegen rekombinante menschliche
PDE5 von weniger als etwa 1 μM
und oft weniger als etwa 0,05 μM.
Um den vollen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erreichen, hat
ein vorliegender PDE5-Inhibitor eine IC50 von
etwa 0,1 nM bis etwa 15 μM.
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Die
Herstellung rekombinanter menschlicher PDEs und die IC50-Bestimmungen
können
mit im Stand der Technik gut bekannten Methoden durchgeführt werden.
Beispielhafte Methoden sind wie folgt beschrieben:
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EXPRESSION
VON MENSCHLICHEN PDEs
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Expression in Saccharomyces
cerevisae (Hefe)
-
Rekombinante
Produktion von menschlicher PDE1B, PDE2, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D,
PDE5 und PDE7 wurde in ähnlicher
Weise zu derjenigen durchgeführt,
die in Beispiel 7 von U.S.-Patent Nr. 5,702,936 beschrieben ist,
das hierin durch Bezugnahme miteinbezogen wird, mit der Ausnahme,
daß der
eingesetzte Hefetransformationsvektor, der vom Basis-ADH2-Plasmid
abgeleitet ist, beschrieben in Price et al., Methods in Enzymology,
185, S. 308–318
(1990), Hefe-ADH2-Promotor- und -Terminatorsequenzen enthielt und
der Saccharomyces cerevisae-Wirt der Protease-defizitäre Stamm
BJ2-54 war, hinterlegt am 31. August 1998 bei der American Type
Culture Collection, Manassas, Virginia, unter Zugangsnummer ATCC
74465. Transformierte Wirtszellen wurden in 2 × SC-leu-Medium, pH 6,2, mit
Spurenmetallen und Vitaminen, angezogen. Nach 24 Stunden wurde YEP-Medium enthaltendes
Glycerol bis zu einer Endkonzentration von 2 × YET/3% Glycerol zugegeben.
Ungefähr
24 Std. später
wurden Zellen geerntet, gewaschen und bei –70°C aufbewahrt.
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ZUBEREITUNGEN
MENSCHLICHER PHOSPHODIESTERASE
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Bestimmungen
der Phosphodiesterase-Aktivität
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Phosphodiesterase-Aktivität der Zubereitungen
wurde wie folgt bestimmt. PDE-Tests, die eine Kohletrenntechnik
einsetzten, wurden durchgeführt,
im wesentlichen wie beschrieben in Loughney et al. (1996). In diesem
Test wandelt PDE-Aktivität
[32P]cAMP oder [32P]cGMP in das entsprechende [32P]5'-AMP oder [32P]5'-GMP im Verhältnis zur
vorliegenden Menge der PDE-Aktivität um. Das [32P]5'-AMP oder [32P]5'-GMP wurde dann durch
die Wirkung von Schlangengift-5'-Nukleotidase
in freies [32P]Phosphat und nicht-markiertes Adenosin oder Guanosin
umgewandelt. Daher ist die Menge an freigesetztem [32P]Phosphat
proportional zur Enzymaktivität.
Der Test wurde bei 30°C
in einer 100 μl
Reaktionsmischung durchgeführt,
die (Endkonzentrationen) 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 μM ZnSO4, 5 mM MgCl2 und
0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. PDE-Enzym war in Mengen
vorhanden, die < 30%
Gesamthydrolyse des Substrats lieferten (lineare Testbedingungen).
Der Test wurde durch Zugabe von Substrat (1 mM [32P]cAMP oder -cGMP)
initiiert und die Mischung wurde für 12 Minuten inkubiert. Fünfundsiebzig
(75) μg
Crotalus atrox-Gift wurde dann zugegeben und die Inkubation wurde
für 3 Minuten
fortgesetzt (15 Minuten insgesamt). Die Reaktion wurde durch Zugabe
von 200 μl
Aktivkohle (25 mg/ml Suspension in 0,1 M NaH2PO4, pH 4) gestoppt. Nach Zentrifugation (750 × g für 3 Minuten),
um die Kohle absetzen zu lassen, wurde eine Probe des Überstandes
für Radioaktivitätsbestimmung
in einem Szintillationszähler
abgenommen und die PDE-Aktivität
wurde berechnet.
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Reinigung von PDE5 aus
S. cerevisiae
-
Zellpellets
(29 g) wurden auf Eis mit einem gleichen Volumen Lysepuffer (25
mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM MgCl2, 0,25 mM DTT,
1 mM Benzamidin und 10 μM
ZnSO4) aufgetaut. Zellen wurden in einem
Mikrofluidizer® (Microfluidics
Corp.) unter Verwendung von Stickstoff bei 20.000 psi lysiert. Das
Lysat wurde zentrifugiert und durch 0,45 μm-Einwegfilter filtriert. Das Filtrat
wurde auf eine 150 ml-Säule
aus Q SEPHAROSE® Fast-Flow (Pharmacia)
aufgebracht. Die Säule
wurde mit 1,5 Volumenteilen Puffer A (20 mM Bis-Tris-Propan, pH
6,8, 1 mM MgCl2, 0,25 mM DTT, 10 μM ZnSO4) gewaschen und mit einem Stufengradienten
von 125 mM NaCl in Puffer A, gefolgt von einem linearen Gradienten
von 125–1000
mM NaCl in Puffer A eluiert. Aktive Fraktionen aus dem linearen
Gradienten wurden auf eine 180 ml-Hydroxyapatitsäule in Puffer B (20 mM Bis-Tris-Propan (pH
6,8), 1 mM MgCl2, 0,25 mM DTT, 10 μM ZnSO4 und 250 mM KCl) aufgebracht. Nach dem Beladen
wurde die Säule
mit 2 Volumenteilen Puffer B gewaschen und mit einem linearen Gradienten
von 0–125
mM Kaliumphosphat in Puffer B eluiert. Aktive Fraktionen wurden
gepoolt, mit 60% Ammoniumsulfat ausgefällt und in Puffer C (20 mM
Bis-Tris-Propan, pH 6,8, 125 mM NaCl, 0,5 mM DTT, und 10 μM ZnSO4) resuspendiert. Der Pool wurde auf eine
140 ml-Säule
SEPHACRYL® S-300
HR aufgebracht und mit Puffer C eluiert. Aktive Fraktionen wurden
auf 50% Glycerol verdünnt
und bei –20°C aufbewahrt.
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Die
resultierenden Zubereitungen waren nach SDS-PAGE etwa 85% rein.
Diese Zubereitungen hatten spezifische Aktivitäten von etwa 3 μmol cGMP
hydrolysiert pro Minute pro Milligramm Protein.
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Hemmende Wirkung
auf cGMP-PDE
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cGMP-PDE-Aktivität von Verbindungen
der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung eines einstufigen
Tests gemessen, der von Wells et al., Biochim. Biophys. Acta, 384,
430 (1975) adaptiert worden war. Das Reaktionsmedium enthielt 50
mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM Magnesiumacetat, 250 μg/ml 5'-Nukleotidase, 1 mM EGTA und 0,15 μm 8-[H3]-cGMP.
Sofern nicht anders angegeben, war das verwendete Enzym eine menschliche
rekombinante PDE5 (ICOS Corp., Bothell, Washington).
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Verbindungen
der Erfindung wurden in DMSO gelöst,
wobei sie letztendlich mit 2% im Test vorlagen. Die Inkubationszeit
betrug 30 Minuten, während
derer die Gesamtsubstratumwandlung 30% nicht überstieg.
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Die
IC50-Werte für die untersuchten Verbindungen
wurden aus Konzentrations-Reaktions-Kurven bestimmt, die typischerweise
Konzentrationen verwenden, die von 10 nM bis 10 μM reichten. Tests gegen andere PDE-Enzyme
unter Verwendung von Standardmethodik zeigten, daß Verbindungen
der Erfindung selektiv auf das cGMP-spezifische PDE-Enzym sind.
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Biologische
Daten
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Es
wurde festgestellt, daß die
Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung typischerweise einen IC
50-Wert
von weniger als 500 nM (d.h. 0,5 μM)
zeigen. In-vitro-Testdaten
für repräsentative
Verbindungen der Erfindung sind in der folgenden Tabelle angegeben:
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Offensichtlich
können
viele Modifikationen und Variationen der Erfindung, wie hierin zuvor
dargelegt, vorgenommen werden, ohne vom Geist und Schutzumfang derselben
abzuweichen, und daher sollten nur solche Beschränkungen auferlegt werden, wie
sie durch die beigefügten
Ansprüche
angegeben sind.