DE60201475T2

DE60201475T2 - Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE60201475T2
Application number: DE60201475T
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Ohta-ku Nomoto; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shinya Ohta-ku Kozaki; Tsutomu Ohta-ku Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: EP1277464A3; JP3990880B2; DE60201475D1; US20030113368A1; EP1277464B1; EP1277464A2; KR20030020230A; KR100506752B1; JP2003024767A; US7186459B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein hervorragend biokompatibles, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom mit einer sehr stabilen Membran mit der Fähigkeit, eine darin eingekapselte Substanz kontrolliert freisetzen zu können, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Einschlägiger Stand der Technik
Ein Liposom, das entsteht, wenn ein Lipid in Wasser dispergiert wird, kommt als Modell der Zellmembranstruktur sehr nahe, und es wird erwartet, daß es intensiv als medizinische Substanz, wie als Mittel für die gewebeorientierte Zuführung von Wirkstoffen, künstliche Erythrocyten, Mittel für die Wiederherstellung von Zellen oder als Basis für die Enzymfixierung, verwendet wird. Außerdem wird nicht nur auf dem Gebiet der Medizin und der Pharmazie sondern auch im Bereich der Kosmetika gehofft, daß es eine Substanz ist, die wirksame Komponenten mit einem Stabilitätsproblem selektiv zu einem angegriffenen Teil transportiert und die allmähliche Freisetzung steuert. Wie vorstehend erwähnt, findet ein Liposom einen extrem großen Anwendungsbereich, es wurde jedoch auf seine zerbrechliche Membranstruktur hingewiesen. Mit anderen Worten zerstören chemische oder physikalische Veränderungen eines Lipids, einer Membran bildenden Substanz, die Membran, womit es leicht zum Austritt der enthaltenen Substanz kommt, und die Bereitstellung eines Wirkstoffs für Zielzellen wurde nicht ausreichend verbessert. Es sind herkömmlich Verfahren zur Verstärkung von Liposommembranen bekannt, zu denen ein Verfahren, bei dem die Membran mit einer Wasserstoffbindung versehen wird, indem dieser Sphingomyelin hinzugefügt wird und die Membran verstärkt wird, und ein Verfahren gehören, bei dem die Oxidation von ungesättigtem Lipid durch Hinzufügen von Tocopherol usw. verhindert wird.
Zudem sind ein Liposom mit einer sehr stabilen Liposommembran und ein Verfahren zu dessen Herstellung erforderlich, um eine Liposommembran zu stabilisieren und ein hervorragendes Festhalten des Wirkstoffs darin und eine allmähliche Freisetzung des Wirkstoffs an der Zielzelle zu erreichen.
Um die mechanische Festigkeit eines Liposoms unter physiologischen Bedingungen zu verbessern und zu ermöglichen, daß die Membran die allmähliche Freisetzung eines Wirkstoffs steuert, hat die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 06-178930 herkömmlich einen Liposommembran vorgeschlagen, die durch Beschichten der Oberfläche der Membran mit einem Homopolymer von 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin oder mit einem Copolymer von 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin und einem Monomer erzeugt wird.
Außerdem hat die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 06-298638 ein Liposom vorgeschlagen, das mit einem Sterin und/oder einem Steringlucosid, einschließlich Sitosterin, Campesterin, Stigmasterin oder Brassicasterin, beschichtet ist.
Andererseits sind in US-P-6,146,665 ein Beispiel zur Erzeugung einer Kapsel, die darin einen Wirkstoff enthält, unter Verwendung eines Polyhydroxyalkanoats als eine von Phospholipid verschiedene, biologisch abbaubare und biokompatible Substanz, ein Verfahren zur Herstellung einer Wirkstoffzusammensetzung, die aus einem feinen Partikel besteht, das einen hydrophilen Wirkstoff in einem porösen Korn, das aus Polyhydroxyalkanoat hergestellt ist, einschließt, oder einer Wirkstoffzusammensetzung offenbart, die als Kernsubstanz einen Öltropfen einkapselt, in dem ein lipophiler Wirkstoff in einer aus Polyhydroxyalkanoat bestehenden Hülle gelöst ist.
Das Liposom, das durch Auftragen eines Homopolymers von 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC) oder eines Copolymers von 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin und einem Monomer hergestellt worden ist, wie es in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 06-178930 offenbart ist, hat eine zweifellos bessere mechanische Festigkeit, jedoch weder die erforderliche ausreichende Festigkeit noch eine hervorragende Biokompatibilität.
Das feine Partikel, das einen hydrophilen Wirkstoff in einem aus Polyhydroxyalkanoat hergestellten porösen Korn einschließt, wie es in US-P-6,146,665 offenbart ist, ist zudem nicht giftig, biologisch abbaubar und kann in situ einen Wirkstoff einschließen; es ermöglicht jedoch aufgrund seiner porösen Struktur eine sofortige Verteilung des hydrophilen Wirkstoffs, was zu einem Problem bei der Steuerung der allmählichen Freisetzung führt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Angesichts der vorstehend beschriebenen Probleme aus dem Stand der Technik besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Struktur, die sowohl die Fähigkeit des Festhaltens eines Wirkstoffs und der verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs aus einem Liposom als auch die mechanische Festigkeit von Polyhydroxyalkanoat aufweist, hervorragende Eigenschaften beim Festhalten von hydrophilen Wirkstoffen und anderen wasserlöslichen Substanzen und lipophilen Wirkstoffen und anderen hydrophoben Substanzen zeigt und die allmähliche Freisetzung steuern kann.
Um die vorstehend genannte Aufgabe zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung ein mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zumindest ein Teil der Außenwand mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist.
Liposom steht in der vorliegenden Erfindung für ein einschichtiges Liposom oder ein mehrschichtiges Liposom, das aus einem Lipid, insbesondere Phospholipid allein, oder sowohl Phospholipid als auch Sterin, umfaßt, und unter Anwendung herkömmlicher allgemein bekannter Verfahren als Verfahren zu dessen Herstellung hergestellt werden kann.
Eine im Liposom eingeschlossene Substanz kann entweder eine wasserlösliche Substanz oder eine fettlösliche Substanz sein. Es wird darauf hingewiesen, daß ein wasserlösliches Material im Inneren des Liposoms und ein fettlösliches Material in der Membran des Liposoms festgehalten wird. Außerdem werden diese Substanzen auch chemisch oder physikalisch auf der Membranoberfläche des Liposoms adsorbiert. Die vorstehend genannten drei Fälle in dieser Erfindung, das heißt "Festhalten; im Inneren halten", "Festhalten; in der Membran halten" und "Festhalten; auf der Membranoberfläche adsorbieren", werden hier jeweils als "Einkapseln" definiert. Diese Substanzen, die in der vorliegenden Erfindung vom Liposom festgehalten werden, sind nicht besonders begrenzt, und dazu gehören Marker, ein Plasmid, DNA und RNA, falls das Material wirksam ist, wenn es neben instabilen Materialien in vitro oder in vivo im lebenden Körper verabreicht wird, und Wirkstoffe, von denen erwartet wird, daß sie im Körper allmählich freigesetzt werden oder sofort in einem bestimmten Organ verteilt werden.
Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß ein Liposom mit einem Polyhydroxyalkanoat beschichtet werden kann, indem ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym (nachstehend "Polyhydroxyalkanoat-Synthase" oder "PHA-Synthase" genannt) an einer Lipsommembran immobilisiert wird, 3- Hydroxyacyl-Coenzym A zugesetzt wird und reagieren kann, ferner, daß im vorstehend aufgeführten Fall die Außenseite des Liposoms als Folge der Auswahl einer dafür geeigneten Art des 3-Hydroxyacyl-Coenzyms A mit Polyhydroxyalkanoat mit biologischer Abbaubarkeit und ohne Toxizität beschichtet werden kann, und schließlich, daß dem Liposom die Eigenschaften einer besseren physikalischen und mechanischen Festigkeit und Steuerungsfähigkeit der verzögerten Freisetzung einer eingeschlossenen Substanz verliehen werden können, wenn zumindest ein Teil der Membran des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet wird. Dadurch gelangten sie zur vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom weist das Merkmal auf, daß zumindest ein Teil seiner Außenwand mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist. Außerdem ist das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom durch eine Struktur mit einer Hülle gekennzeichnet, die eine bimolekulare Lipidmembran eines Phospholipids ist, wobei zumindest ein Teil der Außenwand dieser Struktur mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist.
Außerdem weist das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom das Merkmal auf, daß es im Inneren des Liposoms von einem Lipid verschiedene Substanzen einschließt.
Das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen, mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms, wobei zumindest ein Teil der Außenwand des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist, umfaßt die Schritte: Immobilisieren von Polyhydroxyalkanoat-Synthase auf der Oberfläche des in einem wäßrigen Medium dispergierten Liposoms, Zugeben von 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat und Beschichten von zumindest einem Teil der Oberfläche des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat durch die Synthese des Polyhydroxyalkanoats.
Das erfindungsgemäße Liposom hat eine Struktur, bei der zumindest ein Teil der Oberfläche des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist und nicht unbedingt die gesamte Oberfläche beschichtet sein muß, sofern eine zu erzielende Eigenschaft des Liposoms erreicht wird. In der Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht das Beschichten der gesamten Oberfläche, daß eine mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Mikrokapsel mit einer Flüssigkeit als Kern erhalten werden kann, wobei die Überzugsschicht aus Polyhydroxyalkanoat in der Hülle enthalten ist.
Das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom hat eine hervorragende Biokompatibilität, weist eine sehr stabile Membran auf und kann die verzögerte Freisetzung einer eingekapselten Substanz steuern. Das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom kann für eine Vielzahl von Anwendungszwecken verwendet werden, wie als ein Pigment einschließendes Liposom, einen Farbstoff einschließendes Liposom, eine Agrochemikalie einschließendes Liposom, Hämogloblin einschließendes Liposom, einen Kosmetikbestandteil einschließendes Liposom, eine Düngemittelkomponente einschließendes Liposom und eine pharmazeutische Komponente einschließendes Liposom.
Die vorstehend genannten und weitere Aufgaben, Wirkungen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung ihrer Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A , 1B und 1C sind Fließschemata eines Beispiels eines Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen, mit PHA beschichteten Liposoms;
2 zeigt die Ergebnisse der GC-MS-Analyse der äußeren Hülle des mit PHA beschichteten Liposoms von Beispiel 1;
3 zeigt die Ergebnisse der GC-MS-Analyse der äußeren Hülle des mit PHA beschichteten Liposoms von Beispiel 2;
4 zeigt die Ergebnisse der GC-MS-Analyse der äußeren Hülle des mit PHA beschichteten Liposoms von Beispiel 3; und
5 zeigt das Freisetzungsverhalten als Funktion der Zeit von Calcein aus einem mit PHA beschichteten Liposom und einem Liposom ohne PHA bei 25°C und 42 °C in Beispiel 6.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Das Liposom, das für das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet werden soll, kann nach einem herkömmlichen Herstellungsverfahren erzeugt werden, das allgemein als Verfahren zur Herstellung eines Liposoms bekannt ist. Das heißt, daß zu den in dieser Erfindung zu verwendenden Phospholipiden Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SPN) gehören; es kann eine einzige Spezies oder eine Kombination einer Mehrzahl von Spezies verwendet werden. Zu den Phospolipiden können auch ein Phospholipid mit Wasserzusatz und ein mit Enzym behandeltes Phospholipid gehören. Die Phospholipide können synthetisiert werden, aus natürlichen Substanzen, wie Eiern und Sojabohnen, erhalten werden oder sind handelsüblich.
Ein Cholesterin und ein Phospholipid können kombiniert werden, um die Härte und Transparenz der bimolekularen Lipidmembran des Liposoms hervorzurufen. Obwohl das zu verwendende Verhältnis zwischen Cholesterin und Phospholipid in Abhängigkeit von der Lipid-Affinität der eingeschlossenen Substanz geändert werden kann, beträgt das Molverhältnis von Cholesterin:Phospolipid zum Beispiel 1:3 bis 1:1. Ein Liposom mit einer Hülle aus einer bimolekularen Lipidmembran, die aus Phospholipid hergestellt ist, kann nach einem herkömmlichen Herstellungsverfahren erzeugt werden, das allgemein als Verfahren zur Herstellung eines Liposoms bekannt ist. Zu solchen allgemein bekannten Verfahren gehören das Verfahren von Bangham et al. (Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 13, 238 (1965)), dessen Abänderung (offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 52-114013, 59-173133, 2-139029 und 7-241487), das Ultraschallverfahren (Biochemical and Biophysical Research Communication (Biochem. Biophys. Res. Commun., 94, 1367(1980)), das Ethanolinjektionsverfahren (Journal of Cell Biology (J. Cell. Biol.), 66, 621 (1975)), das French-press-Verfahren (Febs Letters (FEBS Lett.), 99, 210 (1979)), das Etherinjektionsverfahren (New York Academy Science (N. Y. Acad. Sci., 308, 250 (1978)), das Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel) (Biochimica et Biophysica Acta (Biochim. Biophys. Acta. 455, 322 (1976)), das Calciumfusionsverfahren (Biochimica et Biophysica Acta (Biochim. Biophys. Acta, 394, 483 (1978)), das Gefrier- und Auftauverfahren (Archive of Biochemistry and Biophysics (Arch. Biochem. Biophys.), 212, 186 (1981)), das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. (Pro. N. A. S. USA, 75, 4194 (1978)), ein Verfahren mit Hilfe eines Glasfilters (Third US-Japan Symposium on Drug Delivery System (1995)) und ein Verfahren unter Verwendung einer kommerziellen Ausrüstung, wie Coatsome. Jedes nach diesen allgemein bekannten Verfahren hergestelltes Liposom kann für die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms, von dem Bangham et al. berichten, beinhaltet das Lösen eines Phospholipids in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform; das Anordnen der entstandenen Lösung in einem auberginenförmigen Kolben; das Entfernen des Lösungsmittels unter einem Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers, wodurch auf der Oberfläche der Glaswand am Boden des Kolbens ein dünner Phospholipidfilm erzeugt wird. Dem entstandenen Film wird unter Rühren eine wäßrige Pufferlösung zugesetzt, die eine einzukapselnde Substanz enthält, womit der Film quellen kann; und der dünne Film wird dann mit einem Voltex oder dergleichen mechanisch abgezogen, wodurch ein Liposom mit mehreren Membranen erzielt wird. Das Quellen muß bei einer Temperatur erfolgen, die 10°C höher als die Phasenübergangstemperatur des Phospholipids ist. Ein Liposom mit mehreren Membranen, das nach diesem Verfahren hergestellt worden ist, weist eine Größenverteilung von 0,2 bis 5 um auf, wenn die Verteilung möglichst gering sein soll, kann kräftig und lange gerührt werden, oder das Liposom kann kurze Zeit mit Ultraschallwellen mit einer geringen Leistung von 5 bis 10 W beschallt werden.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms mittels Ultraschall schließt ferner das Beschallen der Suspension des Liposoms mit mehreren Membranen, das nach dem Verfahren von Bangham et al. hergestellt worden ist, mit Ultraschall mit einer hohen Leistung ein. Das Beschallen mit Ultraschall verringert die Größe allmählich und ergibt schließlich kleine Liposome mit einer Membran mit einem Durchmesser von 20 bis 30 nm. Das Beschallen mit Ultraschall führt zu einer chemischen Zersetzung der Phospholipidmoleküle oder zur Oxidation eines Lipids durch gelösten Sauerstoff und muß folglich in einem Inertgasstrom aus Stickstoff, Argon oder dergleichen durchgeführt werden und darf die Temperatur nicht übermäßig erhöhen.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Ethanolinjektionsverfahren beinhaltet das Auflösen eines Lipids in Ethanol und das Injizieren der entstandenen Lösung bei der Phasenübergangstemperatur oder darüber mit einer Mikrospritze in eine wäßrige Pufferlösung, die eine einzukapselnde Substanz enthält. Das herzustellende Liposom ist ein kleines Liposom mit einer Membran. Dessen Größe ändert sich mit der Konzentration des Lipids. Ein Liposom mit einem Durchmesser von etwa 30 nm wird bei einer geringen Lipidkonzentration (3 mM) erhalten und ein Liposom mit etwa 110 nm bei einer hohen Lipidkonzentration (36 mM). Dieses Verfahren beinhaltet keine Beschallung mit Ultraschall und ist folglich für das Einkapseln einer instabilen Substanz geeignet. Das Liposom ist jedoch verdünnt, und folglich ist in einigen Fällen ein Konzentrationsprozeß, zum Beispiel durch Ultrafiltration, erforderlich. Außerdem hat es den Nachteil, daß Ethanol nicht vollständig aus dem Liposom entfernt wird.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem French-press-Verfahren umfaßt das Anordnen des Liposoms mit mehreren Membranen, das nach dem Verfahren von Bangham et al. hergestellt worden ist, in einer French-press-Zelle, das Extrudieren des Liposoms bei einem Druck von etwa 20.000 psi, wodurch ein Liposom mit einer Membran erzeugt wird, und die Wiederholung dieses Verfahrens, wodurch ein kleines Liposom mit einer Membran mit einem Durchmesser von etwa 30 bis 50 nm erhalten wird. Dieses Verfahren beinhaltet keine Beschallung mit Ultraschall und ist somit für das Einkapseln einer instabilen Substanz geeignet. Die Anwendung eines geringen Drucks erzeugt außerdem ein Liposom mit einer Membran mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 150 nm.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Etherinjektionsverfahren beinhaltet das Auflösen eines Phospholipids in Diethylether oder in einem gemischten Lösungsmittel aus Diethylether und Methanol, das Einführen der entstandenen Lösung in eine wäßrige Pufferlösung, die eine einzukapselnde Substanz enthält, und das Entfernen des Lösungsmittels. Das organische Lösungsmittel wird entfernt, indem die wäßrige Lösung auf 55 bis 65°C erwärmt wird oder sie bei reduziertem Druck bei 30°C gehalten wird. Das Etherinjektionsverfahren kann ein großes Liposom mit einer Membran erzeugen.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel) beinhaltet das Mischen einer Lipidmembran oder eines Liposoms mit mehreren Membranen, das nach dem Verfahren von Bangham et al. hergestellt worden ist, oder eines kleinen Liposoms mit einer Membran, das nach einem anderen Verfahren hergestellt worden ist, mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie Cholsäure oder Desoxycholsäure und das Entfernen des oberflächenaktiven Mittels aus dem Gemisch, wodurch ein relativ großes Liposom (30 bis 180 nm) mit einer Membran erzeugt wird. Um das oberflächenaktive Mittel zu entfernen, kann die Dialyse oder Gelfiltration angewendet werden. Die Größe des erzeugten Liposoms hängt vom Verhältnis zwischen Lipid und oberflächenaktivem Mittel, dem Gehalt an Cholesterin, der Dialyserate usw. ab. Bei diesem Verfahren ist es von Bedeutung, wie der Anteil des entfernten oberflächenaktiven Mittels in der Doppelschicht des Liposoms verringert wird. Folglich sind eine Langzeitdialyse oder einige Wiederholungen der Gelfiltration erforderlich.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Calciumfusionsverfahren beinhaltet die Zugabe von Calciumionen zu einem nach einem anderen Verfahren hergestellten Liposom, das ein saures Phospholipid enthält, wodurch die Fusion der Membran eingeleitet wird, und die anschließende Zugabe eines Chelatbildners, wie EDTA, um das Calcium zu entfernen, wodurch ein großes Liposom (200 bis 1.000 nm) mit einer Membran erreicht wird. Dieses Verfahren ist auf saure Phospholipide, wie Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidsäure (PA) und gemischte Liposome davon begrenzt.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Gefrier- und Auftauverfahren beinhaltet das Gefrieren einer durch Beschallen mit Ultraschall behandelten Liposomlösung mittels flüssigem Stickstoff, das Auftauen der Lösung, indem sie bei Raumtemperatur stehengelassen wird, und das anschließende kurzzeitige Behandeln der entstandenen milchig-weißen Suspension mit Ultraschall. Es wird ein großes Liposom mit einer Membran mit einem Durchmesser von 50 bis 500 nm hergestellt. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß durch den Konzentrierungseffekt beim Gefrieren die Wirksamkeit in Bezug auf das Festhalten verbessert wird.
Das Verfahren zur Herstellung eines Liposoms nach dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren beinhaltet das Zugeben von Wasser zu einer Etherlösung eines Phospholipids und das Behandeln mit Ultraschall, wodurch eine Wasser/Öl-Emulsion erzeugt wird, das Entfernen des Ethers und das Schütteln der Emulsion mit einem Boltex (boltex), was zu einer Phasenumkehr führt, und außerdem das Entfernen des Ethers bei reduziertem Druck, wodurch ein großes Liposom mit einer Membran (200 bis 1.000 nm) erhalten wird.
Die Größe des Liposoms wird von der Zusammensetzung des Lipids und der Ionenstärke der wäßrigen Lösung beeinflußt; die Zugabe von Cholesterin erhöht die Größe, und eine Erhöhung der Ionenstärke verringert die Größe. Die in den vorstehend genannten Liposomen eingekapselten Substanzen werden in Abhängigkeit von der Anwendung des erfindungsgemäßen, mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms geeignet ausgewählt.
Abgesehen von einem Lipid schließt das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom im Inneren des Liposoms vorzugsweise eine Substanz ein.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für Zusammensetzungen einer Agrochemikalie verwendet wird, kann als im Liposom eingekapselte Substanz irgendeine Substanz verwendet werden, falls sie im Agricultural Chemicals Handbook (von Japan Plant Disease Prevention Association veröffentlicht) aufgelistet ist. Zu erläuternden Beispielen gehören auf Carbamat basierende Insektizide, auf organischem Phosphor basierende Insektizide, auf Pyresteroid basierende Insektizide, auf Harnstoff basierende Insektizide, auf Anilid basierende Insektizide, auf Azol basierende Insektizide und auf Dicarboxylimid basierende Insektizide. Falls erforderlich können diese Chemikalien in einer Kombination von zwei Spezies oder mehreren verwendet werden. Ein Liposom, das eine als Agrochemikalie aktive Komponente einkapselt, kann nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel), dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrier- und Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, dem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und dem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für eine Düngemittelzusammensetzung verwendet wird, gehören zu den im Liposom eingekapselten Substanzen eine wäßrige Lösung eines Stickstoffdüngers, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff, mit Acetaldehyd kondensierter Harnstoff oder mit Isobutylaldehyd kondensierter Harnstoff; eine wäßrige Lösung eines Phosphorsäuredüngers, wie Superphosphat von Kalkdünger, Doppelsuperphosphat von Kalkdünger oder ein Düngemittel aus aufgeschlossenem Phosphat; eine wäßrige Lösung eines auf Kalium basierenden Düngemittels, wie Kaliumsulfat oder Kaliumchlorid; eine wäßrige Suspension eines organischen Düngemittels, wie Fischmehl, Knochenmehl, Preßkuchen aus Sojabohnensamen oder Preßkuchen aus Rapssamen; eine wäßrige Lösung eines gemischten Düngemittels auf der Basis von drei Elementen, wie Ammoniumphosphat oder Kaliumphosphat; und eine wäßrige Lösung eines gemischten Düngemittels von Spurenelementen. Diese Chemikalien können falls erforderlich in einer Kombination von zwei Spezies oder mehreren verwendet werden. Solche Liposome, die eine Düngemittelkomponente einkapseln, können nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel), dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrier- und Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, einem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und einem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für Kosmetika verwendet werden, gehören zu den im Liposom eingekapselten Substanzen eine feuchtigkeitsspeichernde Komponente; ein unbehandelter Wirkstoffextrakt; ein Enzym, wie Tyrosinase, Superoxid-Dismutase und Lipase; ein Vitamin, wie Retinol, Ascorbinsäure, Tocophenol, Pyridoxal und Riboflavin; ein organisches Pigment, wie β-Carotin und Chlorophyll; eine Feuchtigkeitskomponente, wie Glycerin, Sorbitol, Harnstoff, Milchsäure, Propylenglycol, Polyethylenglycol oder dessen Copolymer und ein Glycol-Derivat; eine erweichende Komponente, wie Paraffin, Stearylalkohol, Cetylalkohol, Squalan, Siliconöl und Stearin; eine Behandlungskomponente; eine Schuppen einschränkende Komponente; ein Haartonikum; eine Komponente für die Wiederherstellung des Haarzustands; ein UV-Absorptionsmittel; ein Antioxidans; und ein Duftstoff. Diese Chemikalien können falls erforderlich in einer Kombination von zwei Spezies oder mehreren verwendet werden. Ein Liposom, das eine kosmetische Komponente einkapselt, kann nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel, dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrier- und Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, dem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und dem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für einen künstlichen Erythrocyten verwendet wird, gehören zu dem im Liposom eingekapselten Substanzen Hämoglobin und Hämocyanin.
Diese Substanzen können falls erforderlich in einer Kombination von zwei Spezies oder mehreren verwendet werden. Ein Hämoglobin einkapselndes Liposom kann nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel), dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrier- und Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, dem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und dem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für eine Tinte oder Farbe verwendet wird, gehören zu den im Liposom eingekapselten Substanzen eine wäßrige Farbstofflösung und eine Pigmentdispersion und dazu gehören insbesondere ein Säurefarbstoff, wie C.I. (Color Index) Acid Red 52, C.I. Acid Blue 1, C.I. Acid Black 2 und C.I. Acid Black 123; ein basischer Farbstoff, wie C.I. Basic Blue 7 und C.I. Basic Red 1; ein Direktfarbstoff, wie C.I. Direct Black 19 und C.I. Direct Blue 86; ein öllöslicher Farbstoff, wie C.I. Solvent Black 7, C.I. Solvent Black 123, C.I. Solvent Red 8, C.I. Solvent Red 49, C.I. Solvent Red 100, C.I. Solvent Blue 2, C.I. Solvent Blue 25, C.I. Solvent Blue 55, C.I. Solvent Blue 70, C.I. Solvent Green 3, C.I. Solvent Yellow 21, C.I. Solvent Yellow 61, C.I. Solvent Orange 37, C.I. Solvent Violet 8 und C.I. Solvent Violet 21; ein Reaktionsfarbstoff, wie C.I. Reactive Yellow 15, C.I. Reactive Yellow 42, C.I. Reactive Red 24, C.I. Reactive Red 218, C.I. Reactive; Blue 38 und C.I. Reactive Blue 220; ein schwarzes Pigment, wie Ruß, Kupferoxid, Mangandioxid, Anilinschwarz, Aktivkohle, nichtmagnetisches Ferrit und Magnetit; ein gelbes Pigment, wie Chromgelb, Zinkgelb, Yellow Oxide, Cadmiurngelb, echtes Kaisergelb, Nickeltitangelb, Neburs Gelb, Naphtholgelb S, Hanzar Yellow G, Hanzar Yellow 10G, Benzidingelb G, Benzidingelb GR, Chinolingelblack, Permanentgelb NCG; und Turtladine-Lack; ein oranges Pigment, wie Chromrot, Molybdänorange, Permanentorange GTR, Pyrazolonorange, Vulcan Orange, Benzidinorange G, Indanthren Brilliant Orange RK und Indanthren Brilliant Orange GK; ein rotes Pigment, wie rotes Eisenoxid, Cadmiumbleirot, Quecksilbersulfat, Cadmium, Permanentrot 4R, Litholrot, Pyrazolonrot, Watching Red, Calciumsalz, Lackrot C, Lackrot D, Brilliant Karmin 6B, Brilliant Karmin 3B, Eoxinlack, Rhodaminlack B und Alizarinlack; ein blaues Pigment, wie Moloriblau, Cobaltblau, Alkaliblaulack, Victoriablaulack, Phthalocyaninblau, nichtmetallisches Phthalocyaninblau, teilweise chloriertes Phthalocyaninblau, echtes Himmelblau und Indanthrenblau BC; ein violettes Pigment, wie Manganviolett, Echtviolett B und Methylviolettlack; ein grünes Pigment, wie Chromoxid, Chromgrün, Pigmentgrün B, Malachitgrünlack und Final Yellow Green G; ein weißes Pigment, wie Zinkweiß, Titanoxid, Antimonweiß und Zinksulfat; und ein Verschnittpigment, wie Bariumoxidpulver, Bariumcarbonat, Ton, Siliciumdioxid, Quarzpulver, Talkum und Aluminiumoxidweiß. Natürlich sind die im Liposom eingekapselten Substanzen nicht darauf begrenzt. Diese Substanzen können falls erforderlich in einer Kombination von zwei Substanzen oder mehreren verwendet werden. Ein Liposom, das eine Tintenkomponente einkapselt, kann nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel), dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrierund Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, dem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und dem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom zum Beispiel als Kapsel für die verzögerte Freisetzung eines Wirkstoffs verwendet wird, gehören zu den Wirkstoffen für Medikamente, die im Liposom eingekapselt sind, sowohl leicht wasserlösliche Wirkstoffe als auch schwer wasserlösliche (fettlösliche) Wirkstoffe. Zu diesen Wirkstoffen gehören zum Beispiel ein Sterin (zum Beispiel Cholesterin und Sitosterin), Östrogen (zum Beispiel Östron, Östradiol und Ester davon und Acetylenylöstradiol), Corticoide und Ester davon, ein Peptidhormon, wie Calcitonin, Antibiotika (zum Beispiel Gentamicin, Vancomycin, Amikacin, Kanamycin, Streptomycin, Minocyclin und Tetracyclin), Chloramphenicol, Macrolid-Antibiotika (zum Beispiel Erythromycin und Derivate davon, insbesondere dessen Palmitate oder Stearate, oder Spiramycin), parasitentötende Reagenzien und Wirkstoffe für die Haut (zum Beispiel Clotrimazol, Miconazol und Dithranol), entzündungshemmende Narkotika (zum Beispiel Indomethacin, Diclofenac, Flurbiprofen, Ketoprofen, 4-Biphenylessigsäure und Ethylate davon); Vitamine wie Cyanocobalamin, Enzyme, wie Urokinase, und Wirkstoffe gegen Krebs, wie Fluoruracil und Alacitidin. Diese Chemikalien können falls erforderlich in einer Kombirnation von zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Ein diese Wirkstoffe einkapselndes Liposom kann nach den vorstehend genannten Verfahren, wie dem Ultraschallverfahren, dem Ethanolinjektionsverfahren, dem French-press-Verfahren, dem Etherinjektionsverfahren, dem Verfahren mit Cholsäure (oberflächenaktives Mittel), dem Calciumfusionsverfahren, dem Gefrier- und Auftauverfahren, dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, einem Verfahren unter Verwendung eines Glasfilters und einem Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung, wie Coatsome, hergestellt werden.
Bei einem nach dem vorstehend genannten Verfahren hergestellten Liposom wird die physikalisch-mechanische Festigkeit verbessert, indem zumindest ein Teil der Außenwand mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet wird, und ihm wird Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit verliehen. Wenn das Liposom die Eigenschaft einer verzögerten Freisetzung aufweist, kann es die verzögerte Freisetzung steuern. Nachstehend wird ein Verfahren zum Beschichten des vorstehend genannten Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat beschrieben.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendbare PHA ist nicht besonders begrenzt, sofern dieses PHA mit einem PHA synthetisierendem Enzym synthetisiert werden kann, das an der Biosynthesereaktion von PHA beteiligt ist.
Die Biosynthese von PHA erfolgt hier über eine Polymerisationsreaktion durch ein Enzym, wobei als Substrat (R)-3-Hydroxyacyl-CoA verwendet wird, das auf verschiedenen Stoffwechselwegen aus Alkansäuren als Substrat (zum Beispiel das β-Oxidationssystem und der Fettsäuresyntheseweg) in einem Organismus erzeugt worden ist. Es ist ein PHA synthetisierendes Enzym (auch als PHA-Polymerase, PHA-Synthase bezeichnet), das diese Polymerisationsreaktion katalysiert. Der Begriff "CoA" ist eine Abkürzung für Coenzym A, dessen chemische Struktur wie folgt ist:
Eine Reaktion, mit der PHA durch eine Polymerisationsreaktion mittels eines β-Oxidationssystems und eines PHA synthetisierenden Enzyms aus Alkansäure erzeugt wird, ist nachstehend gezeigt:
Wenn die Reaktion andererseits auf dem Fettsäuresyntheseweg erfolgt, kann eine ähnliche Synthese des PHA durch das PHA synthetisierende Enzym in Betracht gezogen werden, wobei (R)-3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat verwendet wird, in das das in diesem Weg erzeugte (R)-3-Hydroxyacyl-ACP (ACP steht für ein Acyl-Trägerprotein) überführt worden ist.
Außerdem ist bekannt, daß das vorstehend beschriebene, PHB synthetisierende Enzym und das PHA synthetisierende Enzym einer Zelle entnommen werden können, um PHA in einem zellfreien System (in vitro) zu synthetisieren, und nachstehend werden bestimmte Beispiele davon beschrieben.
In Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6279-6283 (1995) wird zum Beispiel berichtet, daß PHB, das eine 3-Hydroxy-n-butansäure-Einheit umfaßt, erfolgreich synthetisiert wurde, als man 3-Hydroxybutyryl-CoA auf ein PHB synthetisierendes Enzym einwirken ließ, das von Alcaligenes eutrophus stammt. Außerdem wird in Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60 (1999) berichtet, daß PHA, das eine 3-Hydroxy-n-butyrylsäure-Einheit oder eine 3-Hydroxy-n-valeriansäure-Einheit umfaßt, erfolgreich synthetisiert wurde, als man 3-Hydroxybutyryl-CoA und 3-Hydroxyvaleryl-CoA auf das PHB synthetisierende Enzym einwirken ließ, das von Alcaligenes eutrophus stammt. Wenn man laut diesem Bericht zudem ein razemisches 3-Hydroxybutyryl-CoA auf das Enzym einwirken ließ, wurde aufgrund der Stereoselektivität des Enzyms PHB synthetisiert, das nur eine 3-Hydroxy-nbuttersäure-Einheit in der R-Konfiguration aufwies. Die Synthese von PHB außerhalb der Zelle unter Verwendung eines PHB synthetisierenden Enzyms, das von Alcaligenes eutrophus stammt, wird auch in Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84 (2000) aufgeführt. Außerdem wird in FEMS Microbiol. Lett., 168, 319-324 (1998) berichtet, daß PHB, das eine 3-Hydroxy-n-Buttersäure-Einheit umfaßt, erfolgreich synthetisiert wurde, als man 3-Hydroxybutyryl-CoA auf ein PHB synthetisierendes Enzym einwirken ließ, das von Chromatium vinosum stammt. In Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000) wird berichtet, daß PHA, das eine Hydroxydecansäure-Einheit umfaßt, synthetisiert wurde, als man 3-Hydroxydecanoyl-CoA auf ein PHA synthetisierendes Enzym einwirken ließ, das von Pseudomonas aeruginosa stammt.
Auf diese Weise ist das PHA synthetisierende Enzym ein Enzym, das die letzte Stufe im PHA-Synthesereaktionssystem in einem Organismus katalysiert, und irgendein PHA, das bekanntlich im Organismus synthetisiert werden kann, wird durch die katalytische Wirkung dieses Enzyms synthetisiert. Wenn man in der vorliegenden Erfindung das 3-Hydroxyacyl-CoA, das dem gewünschten PHA entspricht, auf das auf dem Medium fixierte Enzym einwirken läßt, kann folglich ein mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom mit irgendeinem PHA-Typ hergestellt werden, der bekanntlich im Organismus synthetisiert werden kann.
Als ein Beispiel eines PHA für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann insbesondere ein PHA aufgeführt werden, das mindestens eine der Monomereinheiten enthält, die mit den folgenden Formeln [1] bis [10] angegeben werden.
(wobei die Monomereinheit zumindest eine ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Monomereinheiten besteht, die irgendeine der folgenden Kombinationen von R1 und a aufweisen:

eine Monomereinheit, in der R1 ein Wasserstoffatom (H) darstellt und a eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist;
eine Monomereinheit, in der R1 ein Halogenatom darstellt und a eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
eine Monomereinheit, in der R1 eine chromophore Gruppe darstellt und a eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
eine Monomereinheit, in der R1 eine Carboxylgruppe oder ein Salz davon darstellt und a eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; und eine Monomereinheit, in der R1
darstellt und a eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist),
(worin b eine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R2 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin c eine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R3 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist),
(worin d eine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R4 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist),
(worin e eine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R5 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₇ -CH₃, -C₂H₅ und -C₃H₇ ausgewählt ist),
(worin feine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt),
(worin g eine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt),
(worin h eine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt, R6 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -COOR', -SO₂R", -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇ -CH(CH₃)₂ und -C(CH₃)₃ ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, – CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus -OH, -ONa, -OK, einem Halogenatom, – OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist),
(worin i eine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt, R7 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -OOOR' und -SO₂R" ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, -CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus – OH, -ONa, -OK, einem Halogenatom, -OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist),
(worin j eine ganze Zahl von 1 bis 9 darstellt).

Außerdem können Beispiele des vorstehend beschriebenen Halogenatoms Fluor, Chlor und Brom einschließen.
Ein bestimmtes Beispiel des 3-Hydroxyacyl-CoA für die Verwendung als Substrat für die Synthese des vorstehend genannten PHA kann ein 3-Nydroxyacyl-CoA sein, das mit den folgenden chemischen Formeln [12] bis [21] angegeben wird:

(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und die Kombination aus R1 und a definiert ist wie die Kombination aus R1 und a in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [1] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und b und R2 entsprechend definiert sind wie b und R2 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [2] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und c und R3 entsprechend definiert sind wie c und R3 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [3] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und d und R4 entsprechend definiert sind wie d und R4 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [4] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und e und R5 entsprechend definiert sind wie e und R5 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [5] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und f definiert ist wie f in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [6] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und g definiert ist wie g in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [7] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und h und R6 entsprechend definiert sind wie h und R6 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [8] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und i und R7 entsprechend definiert sind wie i und R7 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [9] angegeben wird) und
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und j definiert ist wie j in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [10] angegeben wird).

Außerden wird in dem Fall, in dem das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom in einem wäßrigen Medium suspendiert verwendet wird, als PHA, das das mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom bildet, ein PHA mit einer hydrophilen funktionellen Gruppe verwendet. Die hydrophile funktionelle Gruppe kann irgendeine hydrophile funktionelle Gruppe sein, es kann jedoch eine anionische funktionelle Gruppe verwendet werden, und die anionische funktionelle Gruppe kann irgendeine anionische funtionelle Gruppe sein, insbesondere kann jedoch eine Carboxylgruppe verwendet werden. Ein Beispiel von PHA mit einer Carboxylgruppe kann ein PHA sein, das aus zumindest einer Monomereinheit besteht, die aus Monomereinheiten ausgewählt ist, die mit der folgenden Formel [11] angegeben werden.
(worin k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist).
Außerdem kann ein bestimmtes Beispiel des vorstehend genannten PHA ein PHA sein, das 3-Hydroxypimelinsäure mit der folgenden Formel [23] enthält.
Außerdem kann ein Beispiel von 3-Hydroxyacyl-CoA für die Verwendung als Substrat für die Synthese von PHA, das mit der vorstehend aufgeführten Formel [11] angegeben wird, 3-Hydroxyacyl-CoA sein, das mit der folgenden Formel [22] angegeben wird.
(worin SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und k mindestens eine Zahl darstellt, die aus den folgenden Zahlen ausgewählt ist, und k in der Monomereinheit entspricht, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [11] angegeben wird. k ist irgendeine ganze Zahl von 1 bis 10).
Außerdem kann das 3-Hydroxyacyl-CoA für die Verwendung als Substrat für die Synthese von PHA, das 3-Hydroxypimelinsäure enthält, die mit der vorstehenden Formel [23] angegeben wird, 3-Hydroxypimelin-CoA sein, das mit der folgenden Formel [24] angegeben wird.
Zu bestimmten Beispielen des vorstehend genannten Halogenatoms können zudem Fluor, Chlor und Brom gehören. Außerdem ist die vorstehend genannte chromophore Gruppe nicht besonders begrenzt, sofern ihr 3-Hydroxyacyl-CoA-Hauptteil der katalytischen Wirkung des PHA synthetisierenden Enzyms ausgesetzt werden kann, es ist jedoch stärker erwünscht, daß zwischen der Carboxylgruppe mit dem daran gebundenen CoA und der chromophoren Gruppe im Molekül des 3-Hydroxyacyl-CoA eine Methylenkette mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen vorliegt, wenn die sterische Hinderung in Betracht gezogen wird, die bei der Synthese eines Polymers auftreten kann. Wenn die Wellenlänge der Lichtabsorption der chromophoren Gruppe außerdem im sichtbaren Bereich liegt, kann ein gefärbtes, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom erhalten werden. Zu Beispielen solcher chromophoren Gruppen können Nitroso, Nitro, Azo, Diarylmethan, Triarylmethan, Xanthen, Acridin, Chinolin, Methin, Thiazol, Indamin, Indophenol, Lacton, Aminoketon, Hydroxyketon, Stilben, Azin, Oxazin, Thiazin, Anthrachinon, Phthalocyanin und Indigoid gehören.
Für das PHA, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, können auch statistische Copolymere und Blockcopolymere verwendet werden, die jeweils die vorstehend beschriebene Vielzahl von Monomereinheiten enthalten, wodurch die Eigenschaften des PHA geregelt werden können und eine Vielzahl von Funktionen bereitgestellt werden kann, indem die Eigenschaften der entsprechenden Monomereinheiten und der enthaltenen funktionellen Gruppen ausgenutzt werden, um unter Ausnutzung der Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen usw. neue Funktionen zu erreichen. Außerdem ist es auch möglich, auf der Oberfläche des Liposoms ein Blockcopolymer mit irgendeiner Reihenfolge und Zusammensetzung zu synthetisieren, indem die Menge und Reihenfolge, in der das 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat zugesetzt wird, geeignet ausgewählt werden. Je nach Bedarf können zudem nach oder während der Synthese des PHA auch eine chemische Modifizierung und dergleichen vorgenommen werden.
Die Zusammensetzung der Monomereinheit des PHA kann auch in der Richtung, die von der Innenseite des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms zu dessen Außenseite verläuft, geändert werden, indem zum Beispiel die Zusammensetzung, wie die Art und die Konzentration, des 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat mit der Zeit geändert wird. Wenn es erforderlich ist, ein mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom mit einem PHA mit einer geringen Affinität für das Liposom zu erzeugen, wird dabei das Liposom zum Beispiel zuerst mit einem PHA mit einer hohen Affinität für das Liposom beschichtet, und die Zusammensetzung der Monomereinheit des PHA mit einer hohen Affinität für das Liposom wird in der Laminierrichtung in die Zusammensetzung der Monomereinheit des gewünschten PHA geändert, womit zum Beispiel eine mehrschichtige Struktur oder eine Gradientenstruktu erzeugt wird, wodurch eine PHA-Hülle gebildet werden kann, deren Bindung am Liposom stärker ist.
Außerdem kann das chemische Modifizieren des PHA ein mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom bereitstellen, bei dem verschiedene Eigenschaften verbessert worden sind. Das Einführen einer Pfropfkette in ein PHA kann zum Beispiel eine Polyhydroxyalkanoat enthaltende organische Struktur, wie zum Beispiel ein mit PHA beschichtetes Liposom ergeben, von dem zumindest ein Teil mit dem PHA beschichtet ist, dem eine Vielzahl von Eigenschaften verliehen worden sind, die der Pfropfkette zugeschrieben werden können. Das Vernetzen des PHA kann ferner eine Polyhydroxyalkanoat enthaltende organische Struktur, wie ein mit PHA beschichtetes Liposom, bereitstellen, von dem zumindest ein Teil mit dem PHA beschichtet ist, dem eine Vielzahl von physikalisch-chemischen Eigenschaften (zum Beispiel mechanische Festigkeit, Beständigkeit gegenüber Chemikalien und Wärmebeständigkeit) verliehen worden ist. Der Begriff "chemische Modifizierung" bedeutet in der vorliegenden Erfindung, daß die Molekülstruktur einer Polymersubstanz geändert wird, indem eine intramolekulare oder intermolekulare chemische Reaktion der Polymersubstanz oder eine chemische Reaktion zwischen der Polymersubstanz und einer anderen chemischen Substanz ermöglicht wird. Der Begriff "Vernetzen" bedeutet, daß eine Polymersubstanz chemisch oder physikalisch-chemisch intramolekular oder intermolekular gebunden ist, wodurch eine Netzwerkstruktur gebildet wird. Außerdem steht Vernetzungsmittel für eine Substanz mit einer bestimmten Reaktivität gegenüber der vorstehend genannten Polymersubstanz, die zugesetzt wird, um die vorstehend genannte Vernetzungsreaktion vorzunehmen.
Außerdem ist PHA, das mit einem PHA synthetisierenden Enzyms synthetisiert worden ist, das in der erfindungsgemäßen Struktur verwendet wird, im allgemeinen ein isotaktisches Polymer, das nur aus einer R-Konfiguration aufgebaut ist.
3-Hydroxyacyl-CoA für die Verwendung als Synthesesubstrat für PHA kann nach einem Verfahren synthetisiert werden, das geeignet aus einem in vitro Syntheseverfahren unter Verwendung von Enzymen, einem in vivo Syntheseverfahren unter Verwendung von Organismen, wie Mikroorganismen und Pflanzen, einem chemischen Syntheseverfahren und dergleichen ausgewählt ist. Insbesondere ist das Syntheseverfahren mit Enzymen ein Verfahren, das allgemein für die Synthese des Substrats verwendet wird, und zu bekannten Syntheseverfahren mit Enzymen gehört ein Verfahren, das die nachstehende Reaktion unter Verwendung von handelsüblicher Acyl-CoA-Synthetase anwendet (Acyl CoA Ligase, E.C.6.2.1.3) (Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997), Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000), usw.): Acyl-CoA-Synthetase 3-Hydroxyalkansäure + CoA → 3-Hydroxyacyl-CoA.
Für das Syntheseverfahren unter Verwendung von Enzymen und Organismen kann ein Syntheseverfahren vom diskontinuierlichen Typ angewendet werden, oder es kann eine Serienproduktion unter Verwendung von immobilisierten Enzymen und immobilisierten Zellen durchgeführt werden.
PHA synthetisierende Enzyme und Mikroorganismen zur Erzeugung dieser Enzyme
Als PHA synthetisierendes Enzym für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein Enzym, das von einem Mikroorganismus produziert wurde, der geeignet aus Mikroorganismen ausgewählt worden ist, die das Enzym produzieren können, oder eine Transformante, wobei das Gen eines PHA synthetisierenden Enzyms in den Wirt eingeführt worden ist, verwendet werden.
Als Mikroorganismen für die Erzeugung der PHA synthetisierenden Enzyme können PHB oder PHB/V erzeugende Mikroorganismen verwendet werden, und als diese Mikroorganismen können neben Aeromonas sp., Alcaligenes sp., Chromatium sp., Comamonas sp., Methylbacterium sp., Paracoccus sp., Pseudomonas sp. und dergleichen Burkholderia cepacia KK01, Ralstonia eutropha TB64, Alcaligenes sp. TL2 verwendet werden, die von den Erfindern abgetrennt worden sind. Außerdem sind KK01, TB64 und TL2 als FERM BP-4235, FERM BP-6933 bzw. FERM BP-6913 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary hinterlegt.
Als Mikroorganismen für die Erzeugung von PHA synthetisierenden Enzymen können Mikroorganismen verwendet werden, die mcl-PHA und unübliches PHA erzeugen, und als diese Mikroorganismen können die Mikroorganismen Pseudomonas sp., wie Pseudomonas putida P91, Pseudomonas cichorii H45, Pseudomonas cichorii YN2, Pseudomonas jessenii P161 usw., die von den Erfindern abgetrennt worden sind, zusätzlich zu Pseudomonas oleoborans, Pseudomonas resinoborans, Pseudomonas sp. 61-3, Pseudomonas putida KT2442, Pseudomonas aeruginosa und dergleichen und die Mikroorganismen Burkholderia sp., wie Burkholderia sp. OK3 (FERM P-17370), der in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-78753 beschrieben ist, und Burkholderia sp. OK4 (FERM P-17371), der in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-69968 beschrieben ist, verwendet werden. Zusätzlich zu diesen Mikroorganismen können Mikroorganismen verwendet werden, die zu Aeromonas sp., Comamonas sp. und dergleichen gehören und mcl-PHA und unübliches PHA produzieren.
Außerdem sind P91, H45, YN2 und P161 gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke der Patenterteilung beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary auf internationaler Basis als FERM BP-7373, FERM BP-7374, FERM BP-7375 bzw. FERM BP-7376 hinterlegt.
Für die normale Züchtung von Mikroorganismen für die Verwendung bei der erfindungsgemäßen Erzeugung von PHA synthetisierenden Enzymen, zum Beispiel bei der Herstellung von Vorratsstämmen, und der Reproduktion zur Sicherung der Anzahl der Zellen und ihres aktiven Zustands, der für die Erzeugung des PHA synthetisierenden Enzyms erforderlich ist, wird ein Kulturmedium, das die für die Züchtung der zu verwendenden Mikroorganismen erforderlichen Komponenten enthält, geeignet ausgewählt und verwendet. Es kann zum Beispiel irgendeine Art von Kulturmedien, wie allgemeine natürliche Kulturmedien (Nährbouillons, Hefeextrakte usw.) und synthetische Kulturmedien mit zugesetzten Nährstoffquellen, verwendet werden, wenn sie das Wachstum und das Überleben der Mikroorganismen nicht nachteilig beeinflussen.
Für die Züchtung kann irgendein Verfahren, wie eine Flüssigkultur und eine Feststoffkultur, verwendet werden, sofern die Reproduktion der Mikroorganismen möglich ist. Außerdem kann irgendein Typ der Kultur, einschließlich einer diskontinuierlichen Kultur, Zulaufkultur, halbkontinuierlichen Kultur und kontinuierlichen Kultur, verwendet werden. Als Form der diskontinuierlichen Flüssigkultur können ein Verfahren, bei dem Sauerstoff durch Schütteln mit einem Schüttelkolben zugeführt wird, ein Verfahren, bei dem Sauerstoff unter Verwendung eines rührenden Belüftungssystems mit einem Fermentor zugeführt wird, und dergleichen verwendet. Außerdem kann ein mehrstufiges Verfahren angewendet werden, bei dem diese Schritte in mehreren Stufen miteinander verbunden sind.
Wenn das PHA synthetisierende Enzym unter Verwendung von PHA erzeugenden Mikroorganismen erzeugt wird, wie es vorstehend beschrieben ist, können zum Beispiel ein Verfahren, bei dem der Mikroorganismus in einem anorganischen Kulturmedium gezüchtet wird, das eine Alkansäure, wie Octansäure und Nonansäure, enthält, und die Zellen des Mikroorganismus in der logarithmischen Wachstumsphase bis zur frühen Stufe der stationären Phase durch Zentrifugieren oder dergleichen aufgefangen werden, um das gewünschte Enzym herauszulösen, usw. angewendet werden. Wenn der Mikroorganismus zudem unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, wird in einer Zelle des Mikroorganismus von der zugesetzten Alkansäure abgeleitetes mcl-PHA synthetisiert, in diesem Fall muß jedoch allgemein festgestellt werden, daß das PHA synthetisierende Enzym an kleine Partikel des in der Zelle erzeugten PHA gebunden vorliegt. Als Ergebnis von von den Erfindern durchgeführten Untersuchungen wurde jedoch festgestellt, daß selbst im flüssigen Überstand nach dem Zentrifugieren der Flüssigkeit vom Fragmentieren der Zellen, die nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren gezüchtet worden sind, fast eine äquivalente Enzymaktivität vorliegt. Es wird angenommen, daß dies darauf beruht, daß in einer relativ frühen Stufe der Kultur, die von der logarithmischen Wachstumsphase bis zur frühen Stufe der stationären Phase reicht, wie es vorstehend beschrieben ist, eine fast äquivalente Menge des PHA synthetisierenden Enzyms im ungebundenen Zustand vorliegt, da das Enzym tatsächlich kontinuierlich in der Zelle erzeugt wird.
Als anorganisches Kulturmedium für die Verwendung bei den vorstehend genannten Kulturverfahren kann irgendein Medium verwendet werden, das Komponenten enthält, die das Wachstum von Mikroorganismen ermöglichen, wie Phosphorquellen (zum Beispiel Phosphate) und Stickstoffquellen (zum Beispiel Ammoniumsalze, Nitrate usw.), und zu einem anorganischen Kulturmedium können zum Beispiel das Medium MSB, das Medium E (J. Biol. Chem., 218, 97-106 (1956)) und das Medium M9 gehören. Außerdem ist die Zusammensetzung des Mediums M9 für die Verwendung in den Beispielen der vorliegenden Erfindung wie folgt:

Na₂HPO₄: 6,2 g

KH₂PO₄: 3,0 g

NaCl: 0,5 g

NH₄Cl: 1,0 g

(pro Liter Medium, pH = 7,0).
Außerdem wird dem vorstehend genannten anorganischen Kulturmedium vorzugsweise etwa 0,3 % (Vol./Vol.) einer Lösung zugesetzt, die die nachstehend aufgeführten geringfügigen Komponenten enthält, um ein befriedigendes Wachstum des Mikroorganismus und die Erzeugung des PHA synthetisierenden

Enzyms zu sichern: (Lösung, die geringfügige Komponenten enthält)

Nitrilotriessigsäure:	1,5 g
MgSO₄:	3,0 g
MnSO₄:	0,5 g
NaCl:	1,0 g
FeSO₄:	0,1 g
CaCl₂:	0,1 g
CoCl₂:	0,1 g
ZnSO₄ :	0,1 g
CuSO₄:	0,1 g
AlK(SO₄)₂	0,1 g
H₃BO₃:	0,1 g
Na₂MoO₄:	0,1 g
NiCl₂:	0,1 g
(pro Liter)

Die Züchtungstemperatur kann irgendeine Temperatur sein, bei der der vorstehend genannte Mikroorganismus befriedigend wachsen kann, zum Beispiel 14 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 35°C.
Ein gewünschtes PHA synthetisierendes Enzym kann mit einer Transformante produziert werden, die ein Gen eines PHA synthetisierenden Enzyms des vorstehend genannten PHA erzeugenden Mikroorganismus aufweist. Das KIonen des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms, die Herstellung eines Expressionsvektors und das Präparieren der Transformante können nach einem anerkannten Verfahren erfolgen. Bei einer Transformante, die mit einem Mikroorganismus, wie Kolibazillus, als Wirt erhalten worden ist, ist das Medium für die Verwendung bei der Züchtung ein natürliches Medium oder ein synthetisches Medium, zum Beispiel das Medium LB, das Medium M9 oder dergleichen. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 25 bis 37°C. Außerdem wird für 8 bis 27 Stunden eine aerobe Kultur durchgeführt, um das Wachstum des Mikroorganismus zu erreichen. Danach können die Zellen aufgefangen werden, um das in den Zellen gespeicherte PHA synthetisierende Enzym zu sammeln. Falls erforderlich können dem Medium Antibiotika, wie Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol oder Streptomycin, zugesetzt werden. Wenn im Expressionsvektor ein Induktionspromotor verwendet wird, kann dem Medium ein Induktionsmaterial zugesetzt werden, das dem Promotor entspricht, um die Expression zu fördern, wenn die Transformante gezüchtet wird. Zu solchen Induktionsmaterialien gehören zum Beispiel Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG), Tetracyclin und Indolacrylsäure (IAA).
Als PHA synthetisierendes Enzym können Flüssigkeiten von der Fragmentierung der Zellen des Mikroorganismus und unbehandelte Enzyme, wie Ammoniumsulfat vom Einsalzen, das durch Fällen und Auffangen von Proteinkomponenten mit Ammoniumsulfat erhalten worden ist, und dergleichen verwendet werden, oder es können mit verschiedenen Verfahrensarten gereinigte Enzyme verwendet werden. Den Enzymen können falls erforderlich Stabilisatoren, wie Metallsalze, Glycerin, Dithiothreitol, EDTA und Rinderserumalbumin (BSA), und Aktivatoren zugesetzt werden.
Zum Abtrennen und Reinigen der PHA synthetisierenden Enzyme kann irgendein Verfahren angewendet werden, bei dem der Erhalt der Enzymaktivierung der PHA synthetisierenden Enzyme möglich ist. Die erhaltenen Zellen des Mikroorganismus werden zum Beispiel mit einer French-press, einem Ultraschallbrecher, Lysozym, verschiedenen Arten von oberflächenaktiven Mitteln und dergleichen aufgebrochen und danach wird bei einer daraus hergestellten unbehandelten Enzymlösung, die durch Zentrifugieren oder Einsalzen mit Ammoniumsulfat erhalten worden ist, eine Maßnahme, wie die Affinitätschromatographie, die Kationen- oder Anionenaustauschchromatographie und die Gelfiltration, allein oder in Kombination angewendet, wodurch ein gereinigtes Enzym erhalten werden kann. Insbesondere kann ein Genrekombinationsprotein viel bequemer gereinigt werden, wenn das Protein in Form eines vereinigten Proteins mit "tags", wie an den N-Terminus und den C-Terminus gebundenen Histidinresten, ausgeprägt wird und das Protein über diese tags an ein Affinitätsharz gebunden wird. Zum Abtrennen eines gewünschten Proteins aus dem vereinigten Protein können Verfahren zum Spalten der Bindung durch Protease, wie Thrombin und einem Blutgerinnungsfaktor Xa, der Verringerung des pH-Wertes, des Hinzufügens von Imidazol mit einer hohen Konzentration als konkurrierendes Bindungsmittel und dergleichen angewendet werden. Wenn das tag alternativ Intein enthält, wie im Falle der Verwendung von pTXB1 (von New EnglanBiolab Co., Ltd. hergestellt) als Expressionsvektor, wird durch Dithiothreitol oder dergleichen ein reduzierender Zustand erreicht, wodurch die Bindung gespalten wird. Als vereinigtes Protein, das die Reinigung durch Affinitätschromatographie ermöglicht, sind zusätzlich zum tag Histidin auch Glutathion-S-Transferase (GST), eine Chitin-gebundene Domäne (CBD), ein Maltose-gebundenes Protein (MBP) und Thioredoxin (TRX) allgemein bekannt. Das vereinigte Protein GST kann mit einem GST-Affinitätsharz gereinigt werden.
Es können verschiedene Arten der genannten Verfahren angewendet werden, um die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms zu messen, und die Aktivität kann zum Beispiel nach folgendem Verfahren gemessen werden, bei dem als Meßprinzip CoA, das in diesem Prozeß freigesetzt wurde, durch den 3-Hydroxyacyl-CoA unter der katalytischen Einwirkung des PHA synthetisierenden Enzyms polymerisiert wird, wodurch PHA gebildet wird, mit 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) gefärbt wird, um die Messungen vorzunehmen. Reagens 1 : Rinderserumalbumin (von Sigma Co., Ltd. hergestellt) wird in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) mit einer Konzentration von 3,0 mg/ml gelöst; Reagens 2: 3-Hydroxyoctanoyl-CoA wird in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) mit einer Konzentration von 3,0 mmol gelöst; Reagens 3: Trichloressigsäure wird in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) mit einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst; und Reagens 4: 5,5'-Dithiobis-(2- nitrobenzoesäure) wird in 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) mit einer Konzentration von 2,0 mmol gelöst. Erste Reaktion (PHA-Synthesereaktion): 100 µl des Reagens 1 werden zu 100 µl der Lösung der Probe (Enzym) gegeben und damit gemischt und 1 Minute bei 30°C vorinkubiert. 100 µl des Reagens 2 werden zugesetzt und damit gemischt und 1 bis 30 Minuten bei 30°C inkubiert, darauf folgt die Zugabe des Reagens 3, um die Reaktion abzubrechen. Zweite Reaktion (Reaktion zum Färben des ungebundenen CoA): die erste Reaktionslösung, in der die Reaktion abgebrochen worden ist, wird zentrifugiert (15.000 × g, 10 Minuten), und 500 µl des Reagens 4 werden zu 500 µl des flüssigen Überstandes dieser Lösung gegeben und 10 Minuten bei 30°C inkubiert, danach wird die Absorption bei 412 nm gemessen. Berechnung der Enzymaktivität: die Menge des Enzyms, um 1 µmol CoA pro Minute freizusetzen, wird als 1 Einheit (E) definiert.
Verfahren zur Herstellung eines mit PHA beschichteten Liposoms
Wie in den 1A bis 1C gezeigt, kann ein Beispiel des Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen, mit PHA beschichteten Liposoms ein Verfahren sein, das zumindest einen der Schritte umfaßt: (1) Dispergieren des in der vorstehend aufgeführten Art und Weise hergestellten Liposoms in einem wäßrigen Medium (1A ), (2) Fixieren eines PHA synthetisierenden Enzyms am dispergierten Liposom (1B ), (3) Zugeben von 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat, (4) Durchführen der PHA-Synthesereaktion (1C ) und (5) Auffangen des mit PHA beschichteten Liposoms, falls erforderlich Trocknen des entstandenen Produktes, und Verteilen des entstandenen Produktes in einem für die Verwendung geeignet ausgewählten Medium, um das entstandene Produkt als dispergiertes System zu behandeln. In den 1A bis 1C bezeichnet die Bezugsziffer 1 das Liposom, 2 das im Inneren des Liposoms eingekapselte wasserlösliche Material, 4 die am Liposom fixierte Polyhydroxyalkanoat-Synthase und 5 das Polyhydroxyalkanoat.
Der Schritt des Dispergierens des Liposoms im dem wäßrigen Medium wird durchgeführt, indem ein oder mehrere ausgewählte Liposome im wäßrigen Medium verteilt werden und die Dispersionsbehandlung durchgeführt wird, falls erforderlich gefolgt von einer Klassifizierung des Liposoms im gewünschten Partikelgrößenbereich.
Es ist erwünscht, daß das Liposom in einem einzigen Dispersionszustand mit einer Partikelgröße des dispergierten Liposoms im Bereich von 100 nm bis 100 µm dispergiert ist, wobei dieser Zustand von der Verwendung abhängt. Wenn die Partikelgröße des dispergierten Liposoms nicht im gewünschten Bereich liegt, kann eine Klassifizierung durch Filtrations- und Sedimentationsverfahren erfolgen, um eine Anpassung vorzunehmen.
Die Partikelgröße des dispergierten Liposoms kann nach bekannten Verfahren, wie dem Absorptionsverfahren, einem statischen Lichtstreuverfahren, einem dynamischen Lichtstreuverfahren und einem Zentrifugensedimentationsverfahren erfolgen, und es kann zum Beispiel eine Vorrichtung zum Messen der Partikelgrößen, wie ein Mehrfachsichter in Form eines Coulter-Zählgerätes verwendet werden.
Die Zusammensetzung des wäßrigen Mediums für die Synthese von PHA kann in diesem Schritt irgendeine Zusammensetzung sein, die es ermöglicht, daß das Liposom im gewünschten Zustand dispergiert wird, und das die nachfolgenden Schritte des Fixierens des Enzyms am Liposom und der Durchführung der PHA-Synthesereaktion nicht stört, die Zusammensetzung kann jedoch so eingestellt werden, daß die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms ausgeübt werden kann, damit die anschließenden Schritte vereinfacht werden. Als Zusammensetzung, die eine Ausübung der Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms erlaubt, kann zum Beispiel ein Puffer verwendet werden. Als Puffer werden allgemeine Puffer für die Verwendung in biochemischen Reaktionen, zum Beispiel Acetatpuffer, Phosphatpuffer, Kaliumphosphatpuffer, 3-(N-Morpholino)propansulfonat-Puffer (MOPS-Puffer), N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonat-Puffer (TAPS-Puffer), Trischloridpuffer, Glycinpuffer und 2-(Cyclohexylamino)etehansulfonat-Puffer (CHES-Puffer) geeignet verwendet. Die Konzentration des Puffers, die es erlaubt, daß die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms ausgeübt wird, kann eine allgemeine Konzentration, und zwar im Bereich von 5 mmol bis 1,0 m sein, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 10 bis 200 mM. Es wird auch eine Anpassung vorgenommen, so daß der pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 9,0, vorzugsweise von 7,0 bis 8,5 liegt, dabei ist jedoch die Möglichkeit nicht ausgeschlossen, daß der pH-Wert in einem vom vorstehend beschriebenen Bereich verschiedenen Bereich festgelegt wird, wobei dies vom am besten geeigneten pH-Wert und der pH-Stabilität des zu verwendenden, PHA synthetisierenden Enzyms abhängt.
Um den Dispersionszustand eines Liposoms im wäßrigen Medium aufrechtzuerhalten, kann außerdem ein geeignetes oberflächenaktives Mittel zugesetzt werden, sofern die Art und Konzentration des oberflächenaktiven Mittels die nachfolgenden Schritte nicht stören und die Art und die Konzentration den Zweck des erfindungsgemäßen, mit PHA beschichteten Liposoms nicht stören. Zu Beispielen des oberflächenaktiven Mittels können zum Beispiel anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumoleat, Natriumdodecylsulfonat, Natriumdodecylsulfat, Natriumdodecyl-N-sarcosinat, Natriumcholat, Natriumdesoxycholat und Natriumtaurodesoxycholat; kationische oberflächenaktive Mittel, wie Cetyltrimethylammoniumbromid und Dodecylpyridiniumchlorid; amphotere oberflächenaktive Mittel, wie 3-[(Cholamidpropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonsäure (CHAPS), 3-[(3-Cholamidpropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure (CHAPSO), Palmitoyllysolecithin und Dodecyl-β-alanin; und nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Octylglucosid, Octylthioglucosid, Heptylthioglucosid, Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA-10), Polyoxyethylendodecylether (Brij, Lubrol), Polyoxyethylen-i-octylphenylether (Triton X), Polyoxyethylennonylphenylether (Nonidet P-40, Triton N), Polyoxyethylenfettsäureester (Span) und Polyoxyethylensorbitolester (Tween) gehören.
Um eine Dispersion des Liposoms im wäßrigen Medium aufrechtzuerhalten, kann auch ein geeignetes Hilfslösungsmittel zugesetzt werden, sofern dessen Art und Konzentration die nachfolgenden Schritte nicht stören und dessen Art und Konzentration die Eigenschaft nicht beeinträchtigen, die für die Verwendung eines erfindungsgemäßen, mit PHA beschichteten Liposoms erforderlich ist. Als Hilfslösungsmittel kann eine oder zwei Arten von Substanzen ausgewählt und verwendet werden, die zum Beispiel aus linearen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Hexan, und deren Derivaten, wie einwertigen Alkoholen, wie Methanol und Ethanol, mehrwertigen Alkoholen, wie Glycerol, Fettsäureethern und Carboxylaten, ausgewählt sind.
Der Schritt des Fixierens des PHA synthetisierenden Enzyms am Liposom kann durchgeführt werden, indem das PHA synthetisierende Enzym der vorstehend genannten Liposomdispersion zugesetzt wird und diese einer Fixierungsbehandlung unterzogen wird. Als Fixierungsbehandlung kann irgendein Verfahren aus Enzymfixierungsverfahren ausgewählt werden, die normalerweise angewendet werden, sofern es dieses Verfahren erlaubt, daß die Aktivität des Enzyms erhalten bleibt, und sofern sie beim gewünschten Liposom angewendet werden können. Zu diesen Verfahren können ein Kovalenzbindungsverfahren, ein Ionenabsorptionsverfahren, ein hydrophobes Adsorptionsverfahren, ein physikalisches Adsorptionsverfahren, ein Affinitätsadsorptionsverfahren, ein Vernetzungsverfahren und ein Gittereinschlußverfahren gehören, Fixierungsverfahren unter Anwendung der Ionenadsorption und der hydrophoben Adsorption sind jedoch besonders geeignet.
Das Enzymprotein, wie ein PHA synthetisierendes Enzym, ist ein Polypeptid, in dem eine große Anzahl von Aminosäuren gebunden ist, und zeigt aufgrund der Aminosäuren mit freien ionischen Gruppen, wie Lycin, Histidin, Arginin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, Eigenschaften als Ionenabsorptionsmittel, und hat aufgrund der Aminosäuren mit freien hydrophoben Gruppen, wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Tryptophan, Phenylalanin und Prolin, Eigenschaften als hydrophobes Absorptionsmittel, da es ein organisches Makromolekül ist. Das Enzymprotein kann mehr oder weniger von einem Liposom adsorbiert sein, das ionisch oder hydrophob ist oder sowohl ionisch als auch hydrophob ist.
Ein Verfahren zum Immobilisieren von PNA-Synthase, primär mittels des Ionenadsorptionsverfahrens, kann ein Liposom, das auf seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe ausprägt, zum Beispiel ein eine anionische Ladung bereitstellendes Lipid, wie Phosphatidylserin oder Phosphatidylsäure, Dicetylphosphorsäure oder Phosphatidylinositol, oder ein gleichzeitig vorhandenes, eine kationische Ladung bereitstellendes Lipid, wie Sterarylamin, verwenden, wodurch ein Liposom erzeugt wird.
Das Fixieren des PHA synthetisierenden Enzyms am Liposom durch ein Ionenadsorptions- oder ein hydrophobes Adsorptionsverfahren wird erreicht, indem das Liposom und das PHA synthetisierende Enzym miteinander in einem vorher festgelegten wäßrigen Medium gemischt werden, so daß eine vorher festgelegte Konzentration erreicht wird. Dabei ist es erwünscht, daß das Reaktionsgefäß in einem vorher festgelegten Ausmaß geschüttelt oder gerührt wird, so daß das Enzym gleichmäßig an der Oberfläche des Liposoms adsorbiert werden kann.
Beim vorstehend beschriebenen Fixierungsprozeß ist es aufgrund des pH-Wertes und der Salzkonzentration des wäßrigen Mediums erwünscht, daß die Zusammensetzung des wäßrigen Mediums, in dem das Liposom und das Enzym miteinander gemischt werden, in Hinblick auf Änderungen der positiven und negativen Ladung der Oberfläche, der Größe der Ladung und der Hydrophobie des Liposoms und des PHA synthetisierenden Enzyms bestimmt wird. Wenn das Liposom zum Beispiel ionenadsorbierend ist, kann die Größe der Ladung, die zur Adsorption zwischen Liposom und PHA synthetisierendem Enzym beiträgt, erhöht werden, wenn die Salzkonzentration verringert wird. Die entgegengesetzte Ladung von Liposom und PHA synthetisierendem Enzym kann auch erhöht werden, wenn der pH-Wert geändert wird. Außerdem kann das Ausmaß der Adsorption zwischen dem Liposom und dem PHA synthetisierenden Enzym direkt gemessen werden, um die Zusammensetzung zu bestimmen. Für Messungen des Ausmaßes der Adsorption kann zum Beispiel ein Verfahren angewendet werden, bei dem eine Lösung des PHA synthetisierenden Enzyms, deren Konzentration bekannt ist, zu einer Lösung mit einem darin dispergierten Liposom gegeben wird, wodurch die Adsorptionsbehandlung erfolgt, gefolgt vom Messen der Konzentration des PHA synthetisierenden Enzyms in der Lösung und einer Bestimmung der Menge des adsorbierten Enzyms unter Anwendung einer Subtraktionsmethode.
Im Falle eines Liposoms, bei dem das Fixieren am Enzym für das Ionenadsorptionsverfahren und das hydrophobe Adsorptionsverfahren problematisch ist, kann zum Fixieren des Enzyms eine Kovalenzbindung falls erforderlich mit Hilfe irgendeiner Behandlung angewendet werden, die die Komplexität des Verfahrens und den möglichen Verlust der Aktivität des Enzyms in Betracht zieht. Zu diesen Fällen gehört zum Beispiel ein Verfahren, das eine Austauschreaktion zwischen einem Liposom mit einer Reaktionsgruppe für Thiol (reaktive Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagieren kann, wie eine Dithiopyridylgruppe und eine Maleimidgruppe) und einer Thiolgruppe des Enzyms vornimmt. Außerdem kann ein Verfahren angewendet werden, um das Enzym mit einem Liposom zu koppeln, das ein Phospholipid mit einer Aminogruppe, wie Phosphatidylethanolamin, enthält, indem eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe des Enzyms unter Verwendung eines Aktivierungsmittels mit einer einzigen funktionellen Gruppe, wie Imid-N-hydroxysuccinat, Ethylchloroformiat, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Woodward-Reagens K, Cyanursäure und Trifluormethansulfonylchlorid, aktiviert wird, oder indem das Enzym unter Verwendung verschiedener Vernetzungsmittel mit zwei funktionellen Gruppen aktiviert wird, die eine Gruppe mit einer anderen Reaktivität enthalten, wie einige Diisocyanate.
Außerdem kann das Enzym durch Affinitätsadsorption mit einem darin eingeführten Liganden am Liposom fixiert werden. In diesem Fall kann als Ligand irgendeine Substanz ausgewählt werden, sofern sie die Affinitätsadsorption ermöglicht, wobei die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms erhalten bleibt. Das Enzym kann fixiert werden, indem ein anderes Biopolymer, wie ein Protein, am PHA synthetisierenden Enzym fixiert wird und das gebundene Biopolymer der Affinitätsadsorption unterzogen wird. Das Biopolymer kann durch Genrekombination oder dergleichen oder durch ein chemisches Verfahren am PHA synthetisierenden Enzym gebunden werden.
Ein Peptid, das Aminosäuresequenzen aufweist, die das Bindungsvermögen für das Liposom aufweisen, kann auch mit dem Polyhydroxyalkanoat synthetisierenden Enzym vereinigt werden und dazu gebracht werden, das Polyhydroxyalkanoat synthetisierende Enzym auf der Oberfläche des Liposoms zu fixieren, wobei dies auf der Bindung zwischen einem Teil des Peptids, das der Aminosäuresequenz entspricht, die das Bindungsvermögen für das Liposom aufweist, und dem Liposom basiert.
Die Aminosäuresequenz mit dem Bindungsvermögen für das Liposom kann zum Beispiel durch Auswählen aus einer willkürlichen Peptidbank bestimmt werden. Insbesondere kann zum Beispiel eine Bank von Phagen zeigenden Peptiden, die durch Koppeln eines willkürlichen synthetischen Gens mit dem N-terminalen Gen des Oberflächenproteins des Phagen vom Typ M 13 (zum Beispiel Gen III-Protein) hergestellt wurden, geeignet verwendet werden, in diesem Fall erfolgt die Bestimmung der Aminosäuresequenz mit einem Bindungsvermögen für das Liposom jedoch nach folgendem Verfahren. Insbesondere wird die Bank aus Phagen zeigenden Peptiden dem Liposom oder einem Phospholipid, das im Liposom enthalten ist, zugesetzt, damit der Phage mit dem Phospholipid in Kontakt kommt, darauf folgt eine Trennung von gebundenen Phagen und ungebundenen Phagen durch Waschen. Der am Liposom gebundene Phage wird mit einer Säure oder dergleichen eluiert und mit einer Pufferlösung neutralisiert, und danach wird der Kolibazillus mit dem Phagen infiziert, um den Phagen zu amplifizieren. Wenn dieses Auswahlverfahren einige Male wiederholt wird, wird eine Vielzahl von KIonen mit einem Bindungsvermögen für das gewünschte Liposom konzentriert. Um einen einzelnen Klon zu erhalten, werden hier auf der Kulturplatte Kolonien mit dem Phagen erzeugt, mit dem der Kolibazillus erneut infiziert wird. Jede einzelne Kolonie wird auf dem flüssigen Kulturmedium gezüchtet, darauf folgen eine Fällung und Reinigung des Phagen, der im flüssigen Überstand des Mediums vorliegt, durch Polyethylenglycol oder dergleichen und eine Analyse der Basensequenz, wodurch die Struktur des Peptids erkannt werden kann.
Die Aminosäuresequenz des Peptids mit einem Bindungsvermögen für das Liposom, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wird, wird mit dem Polyhydroxyalkanoat synthetisierenden Enzym vereinigt, wobei eine üblicherweise verwendete gentechnische Methodologie angewendet wird. Das Peptid mit dem Bindungsvermögen für das Liposom kann mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus des Polyhydroxyalkanoat synthetisierenden Enzyms gekoppelt werden, das ausgeprägt werden soll. Das Peptid kann auch mit einer eingefügten geeigneten Spacer-Sequenz ausgeprägt werden. Diese Spacer-Sequenz hat vorzugsweise etwa 3 bis 400 Aminosäuren und kann irgendeine Aminosäure einschließen. Besonders bevorzugt verhindert diese Spacer-Sequenz weder die Funktion des PHA synthetisierenden Enzyms noch verhindert sie die Bindung des PHA synthetisierenden Enzyms am Liposom.
Das Liposom mit dem daran fixierten Enzym, das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, kann direkt verwendet werden oder kann auch verwendet werden, nachdem es dem Gefriertrocknen oder dergleichen unterzogen worden ist.
Die Menge des am Liposom fixierten Phospholipids kann im Bereich von 10 Einheiten (E) bis 1.000 Einheiten (E), wünschenswerterweise von 50 Einheiten (E) bis 500 Einheiten (E) pro 1 g Phospholipid festgelegt werden, wobei eine Einheit (E) als die Menge des PHA synthetisierenden Enzyms definiert wird, wenn die CoA-Menge, die bei der Reaktion freigesetzt wird, durch die PHA durch Polymerisation von 3-Hydroxyacyl-CoA synthetisiert wird, gleich 1 µmol pro Minute beträgt.
Der Zeitraum, in dem das Fixieren des Enzyms erfolgt, beträgt wünschenswerterweise 1 Minute bis 24 Stunden, stärker erwünscht 10 Minuten bis 1 Stunde. Ein zu langes Ruhenlassen oder Stehenlassen der Probe ist nicht bevorzugt, da das zu einer Koagulation der Liposome und zu einer Verringerung der Enzymaktivität führen kann.
Das Enzym kann auch am Liposom fixiert werden, wenn das Liposom der Enzymlösung direkt zugesetzt wird, ohne daß der vorherige Schritt des Dispergierenes des Liposoms im wäßrigen Medium durchgeführt wird, und das Liposom dann in der Enzymlösung dispergiert wird. In diesem Fall kann durch die elektrische Abstoßung und die sterische Hinderung, die mit der ionischen funktionellen Gruppe verbunden sind, die das Enzym aufweist, das am Liposom fixiert ist, das Dispergieren des Liposoms im wäßrigen Medium erleichtert werden und es nicht mehr erforderlich sein, dem wäßrigen Medium ein oberflächenaktives Mittel zuzusetzen oder die Menge des oberflächenaktiven Mittels zu verringern.
Der Schritt der Zugabe von 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat wird durchgeführt, indem eine getrennt hergestellte konservierte Lösung von 3-Hydroxyacyl-CoA der wäßrigen Dispersion des Liposoms mit dem im vorhergehenden Schritt daran fixierten Enzym zugesetzt wird, so daß die gewünschte Konzentration erreicht wird. 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat wird mit Endkonzentrationen von im allgemeinen 0,1 mmol bis 1,0 m, wünschenswerterweise von 0,2 mmol bis 0,2 m und ferner vorzugsweise von 0,2 bis 1,0 mmol zugesetzt.
Im vorstehend beschriebenen Schritt ändert sich die Zusammensetzung, wie Art und Konzentration, von 3-Hydroxyacyl-CoA in der wäßrigen Reaktionslösung mit der Zeit, wodurch es möglich wird, die Zusammensetzung der Monomereinheit des das Liposom bedeckenden PHA in der Richtung zu ändern, die von der Innenseite zur Außenseite des Liposoms verläuft.
Die Form dieses Liposoms mit der geänderten Zusammensetzung der Monomereinheit kann zum Beispiel eine Form sein, bei der die Änderung der Zusammensetzung des PHA-Überzugs kontinuierlich ist, und das Liposom mit einer PHA-Schicht überzogen ist, die einen Gradienten der Zusammensetzung aufweist, der in der Richtung verläuft, die sich von der Innenseite zur Außenseite erstreckt. Das Herstellungsverfahren kann zum Beispiel ein Verfahren sein, bei dem während der Synthese des PHA der Reaktionslösung ein 3-Hydroxyacyl-CoA mit einer anderen Zusammensetzung zugesetzt wird.
Als andere Form kann außerdem eine Form vorliegen, bei der die Zusammensetzung des PHA-Überzugs stufenweise geändert wird und PHA mit unterschiedlichen Zusammensetzungen das Liposom in mehreren Schichten bedeckt. Das Herstellungsverfahren für diese Form kann ein Verfahren sein, bei dem PHA mit einer bestimmten Zusammensetzung von 3-Hydroxyacyl-CoA synthetisiert wird, gefolgt vom zeitweiligen Auffangen des gerade hergestellten Liposoms aus der Reaktionslösung durch Zentrifugieren, Gelfiltration und dergleichen, und dem erneuten Zugeben einer Reaktionslösung von 3-Hydroxyacyl-CoA mit einer anderen Zusammensetzung usw.
Der Schritt der Durchführung der PHA-Synthesereaktion erfolgt, indem die Zusammensetzung der Reaktionslösung so vorbereitet wird, daß eine Zusammensetzung erhalten werden kann, die es erlaubt, daß die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms ausgeübt werden kann, wenn die Zusammensetzung der Reaktionslösung nicht bis zum vorhergehenden Schritt vorbereitet worden ist, und die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit eingestellt werden, damit durch das zu synthetisierende PHA ein mit PHA beschichtetes Liposom mit der gewünschten Form erhalten werden kann.
Die Konzentration des Puffers für die Reaktionslösung, die es erlaubt, daß die Aktivität des PHA synthetisierenden Enzyms ausgeübt werden kann, kann eine allgemeine Konzentration, das heißt eine Konzentration im Bereich von 5 mmol bis 1,0 m, sein, ist jedoch wünschenswerterweise eine Konzentration im Bereich von 10 bis 200 mmol. Der pH-Wert wird so eingestellt, daß der pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 9,0, vorzugsweise von 7,0 bis 8,5 liegt, die Möglichkeit, daß die Bedingungen in bezug auf den pH-Wert in einem anderen als dem vorstehend beschriebenen Bereich festgelegt werden, ist jedoch nicht ausgeschlossen, wobei dies vom am besten geeigneten pH-Wert und der pH-Stabilität des zu verwendenden, PHA synthetisierenden Enzyms abhängt.
Die Reaktionstemperatur wird geeignet eingestellt, wobei dies von der Eigenschaft des zu verwendenden, PHA snythetisierenden Enzyms abhängt, sie kann jedoch normalerweise bei 4 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C eingestellt werden. Die Möglichkeit, daß die Temperaturbedingung in einem vom vorstehend beschriebenen Bereich abweichenden Bereich eingestellt werden kann, ist jedoch nicht ausgeschlossen, wobei dies von der am besten geeigneten Temperatur und der Wärmebeständigkeit des zu verwendenden, PHA synthetisierenden Enzyms abhängt.
Die Reaktionszeit wird geeignet ausgewählt und in einem Bereich festgelegt, der normalerweise von 1 Minute bis 24 Stunden, vorzugsweise von 30 Minuten bis 3 Stunden reicht, wobei dies von der Stabilität usw. des zu verwendenden, PHA synthetisierenden Enzyms abhängt.
Durch diesen Schritt wird ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten, die Struktur der Monomereinheiten des PHA, das das Liposom bildet, kann jedoch bestimmt werden, wenn das PHA mit Chloroform aus dem mit PHA beschichteten Liposom extrahiert wird und danach eine Analyse der Zusammensetzung durch Gaschromatographie oder dergleichen durchgeführt wird oder ein Laufzeit-Sekundärionen-Massenspektrometer (TOF-SIMS) und ein Ionenzerstäuberverfahren angewendet werden.
Das Molekulargewicht des PHA ist nicht besonders begrenzt, das Zahlenmittel des Molekulargewichts liegt jedoch wünschenswerterweise im Bereich von 1.000 bis 10.000.000, stärker bevorzugt von 3.000 bis 1.000.000, damit die Festigkeit des mit PHA beschichteten Liposoms erhalten bleibt und eine konstante Ladungsmenge bereitgestellt wird. Das Molekulargewicht des PHA kann durch GPC (Gelpermeationschromatographie) gemessen werden, nachdem das PHA mit Chloroform aus dem mit PHA beschichteten Liposom extrahiert worden ist.
Der Gehalt der PHA-Beschichtung hängt von der Verwendung des mit PHA beschichteten Liposoms ab, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 1 bis 30 Masse-%, vorzugsweise von 1 bis 20 Masse-%, stärker bevorzugt von 1 bis 15 Masse-%, bezogen auf die Trockenmasse des Liposoms.
Die Partikelgröße des mit PHA beschichteten Liposoms, das durch den vorstehend beschriebenen Schritt erhalten worden ist, hängt von der Verwendung des mit PHA beschichteten Liposoms ab, beträgt jedoch im allgemeinen 50 µm oder weniger, vorzugsweise 10 µm oder weniger, stärker bevorzugt 0,01 bis 10 µm. Die Partikelgröße des mit PHA beschichteten Liposoms kann nach bekannten Verfahren, wie einem Absorptionsverfahren, einem statischen Lichtstreuverfahren, einem dynamischen Lichtstreuverfahren und einem Zentrifugensedimentationsverfahren, gemessen werden, und es kann zum Beispiel eine Vorrichtung zum Messen der Partikelgröße, wie ein Mehrfachsichter in Form eines Coulter-Zählgerätes, verwendet werden.
Außerdem kann das durch diesen Schritt erhaltene, mit PHA beschichtete Liposom vor seiner Verwendung verschiedenen Arten von sekundären Behandlungen und einer Behandlung, wie dem chemischen Modifizieren, unterzogen werden.
Ein mit PHA beschichtetes Liposom mit weiteren vorteilhaften Funktionen und Eigenschaften kann zum Beispiel erhalten werden, wenn das PHA auf der Oberfläche des mit PHA beschichteten Liposoms einer chemischen Modifizierung unterzogen wird. Es wird zum Beispiel eine Pfropfkette eingeführt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom mit unterschiedlichen Arten von Eigenschaften erhalten werden kann, die sich von der Pfropfkette ableiten. Wenn wie später beschrieben zum Beispiel Polysiloxan als Pfropfkette eingeführt wird, kann ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten werden, bei dem die mechanische Festigkeit, das Dispersionsvermögen, die Witterungsbeständigkeit, das Wasserabweisungsvermögen (Wasserbeständigkeit), die Wärmebeständigkeit und dergleichen noch besser sind. Wenn das PHA auf dem mit PHA beschichteten Liposom vernetzt ist, können zudem die mechanische Festigkeit, die chemische Beständigkeit, die Wärmebeständigkeit und dergleichen des mit PHA beschichteten Liposoms weiter verbessert werden.
Das Verfahren zum chemischen Modifizieren ist nicht besonders begrenzt, sofern es ein Verfahren ist, mit dem der Zweck, eine gewünschte Funktion und Struktur zu erhalten, erreicht wird; als geeignetes Verfahren kann jedoch zum Beispiel ein Verfahren angewendet werden, bei dem das PHA mit einer reaktiven funktionellen Gruppe an der Seitenkette synthetisiert wird und die chemische Modifizierung durch die chemische Reaktion dieser funktionellen Gruppe erfolgt.
Die Art der vorstehend beschriebenen reaktiven funktionellen Gruppe ist nicht besonders begrenzt, sofern sie dem Zweck dient, eine gewünschte Funktion und Struktur zu erhalten, und sie kann zum Beispiel eine Epoxygruppe sein, wie es bereits beschrieben worden ist. PHA mit einer Epoxygruppe an der Seitenkette kann wie im Falle eines normalen Polymers mit einer Epoxygruppe chemisch umgewandelt werden. Insbesondere sind zum Beispiel die Umwandlung in eine Hydroxylgruppe und das Einführen einer Sulfongruppe möglich. Es kann auch eine Verbindung mit Thiol und Amin zugesetzt werden, und es wird zum Beispiel eine Verbindung mit einer reaktiven funktionellen Gruppe am Terminus, insbesondere eine Verbindung mit einer Aminogruppe, die eine hohe Reaktivität gegenüber der Epoxygruppe aufweist, zugesetzt und umgesetzt, wodurch die Pfropfkette des Polymers entsteht.
Zu Verbindungen mit Aminogruppen an den Termini können zum Beispiel Polyvinylamin, Polyethylenimin und mit Amino modifizierte Polymere, wie mit Amino modifiziertes Polysiloxan (mit Amino modifiziertes Siliconöl) gehören. Davon kann als mit Amino modifiziertes Polysiloxan handelsübliches modifiziertes Siliconöl oder mit Amino modifiziertes Polysiloxan, das nach einem Verfahren synthetisiert worden ist, das in J. Amer. Chem. Soc., 78, 2278 (1956) beschrieben ist oder dergleichen verwendet werden, und es kann erwartet werden, daß die mechanische Festigkeit, das Dispersionsvermögen, die Lichtbeständigkeit, die Witterungsbeständigkeit, das Wasserabweisungsvermögen (Wasserbeständigkeit) und die Wärmebeständigkeit usw. verbessert werden, wenn dem Polymer eine Pfropfkette hinzugefügt wird.
Außerdem ist ein weiteres Beispiel einer chemischen Umwandlung eines Polymers mit einer Epoxygruppe eine Vernetzungsreaktion durch eine Diaminverbindung, wie Nexamethylendiamin, Succinsäureanhydrat, 2-Ethyl-4-methylimidazol oder dergleichen, und ein Beispiel einer physikalisch-chemischen Umwandlung ist eine Vernetzungsreaktion durch Bestrahlen mit Elektronenstrahlen oder dergleichen. Von diesen verläuft die Reaktion zwischen PHA mit einer Epoxygruppe an der Seitenkette und Hexamethylendiamin gemäß dem nachstehend beschriebenen Schema, wodurch ein vernetztes Polymer erzeugt wird.
Als Schritt zur Rückgewinnung des erfindungsgemäßen, mit PHA beschichteten Liposoms kann es falls erforderlich getrocknet werden, oder es kann erreicht werden, daß es in einem Medium dispergiert und als Dispersionssystem behandelt wird, wenn das Dispersionsmedium entsprechend der Anwendung des mit PHA beschichteten Liposoms geeignet ausgetauscht wird.
Wenn das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom zum Beispiel als ein Liposom für eine Zusammensetzung einer Agrochemikalie verwendet wird, kann die im vorhergehenden Schritt erhaltene Dickstoffsuspension direkt als Zusammensetzung einer Agrochemikalie verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, die Dickstoffsuspension so zu behandeln, daß die Formulierung in eine für die Verwendung besser geeigneten Form, wie eine wäßrige Suspension, ein Hydratationsmittel, ein Pulver und ein Granulat, insbesondere in die Form einer wäßrigen Suspension, gebracht wird. Die wäßrige Suspension wird hergestellt, indem der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Dickstoffsuspension ein Stabilisator, wie ein Puffer, ein Gefrierschutzmittel, ein die relative Dichte regelndes Mittel und ein antiseptisches Mittel zugesetzt werden. Zu Beispielen des zu verwendenden Puffers gehören Polysaccharide, wie Carboxymethylcellulose, Xanthangummi, Ramzangummi (ramzan gum), Johannisbrotgummi, Karrageen und Werangummi (weran gum); synthetische Polymere, wie Natriumpolyacrylat; feine mineralische Pulver, wie Aluminiummagnesiumsilicat, Fetton, Bentonit, Hectorit und Siliciumdioxid von einem Trockenprozeß; und Aluminiumoxid-Sol. Zu Beispielen der Gefrierschutzmittel gehören Alkohole, wie Propylenglycol, ein. Zu Beispielen der die Schwere regelnden Mittel gehören wäßrige Salze, wie Natriumsulfat, und Harnstoff.
Wenn das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für eine Düngemittelzusammensetzung verwendet wird, kann die im vorhergehenden Schritt erhaltene Dickstoffsuspension direkt als Düngemittelzusammensetzung verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, die Dickstoffsuspension zu behandeln, so daß die Formulierung in eine für die Verwendung besser geeignete Form, wie eine wäßrige Suspension, ein Hydratationsmittel, Pulver und Granulat, insbesondere in die Form einer wäßrigen Suspension, gebracht wird. Die wäßrige Suspension wird hergestellt, indem der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Dickstoffsuspension ein Stabilisator, wie ein Puffer, ein Gefrierschutzmittel, ein die relative Dichte regelndes Mittel und ein antiseptisches Mittel zugesetzt werden. Zu Beispielen des zu verwendenden Puffers gehören Polysaccharide, wie Carboxymethylcellulose, Xanthangummi, Ramzangummi, Johannisbrotgummi, Karrageen und Werangummi; synthetische Polymere, wie Natriumpolyacrylat; feine mineralische Pulver, wie Aluminiummagnesiumsilicat, Fetton, Bentonit, Hectorit und Siliciumdioxid von einem Trockenprozeß; und Aluminiumoxid-Sol. Beispiele der Gefrierschutzmittel schließen Alkohole, wie Propylenglycol, ein. Zu Beispielen der die Schwere regelnden Mittel gehören wäßrige Salze, wie Natriumsulfat, und Harnstoff.
Wenn das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für Kosmetika verwendet wird, kann das Dispersionsmedium aus allgemein bekannten Kosmetikgrundstoffen ausgewählt werden, für die folgende als Beispiel aufgeführt werden: Kohlenwasserstoffe, wie festes oder flüssiges Paraffin, Kristallöl, Ceresin, Ozokerit und Montanwachs; pflanzliche und tierische Fette und Wachse, wie Olive, Erdwachs, Carnaubawachs, Lanolin und Spermazet; Fettsäuren und Derivate davon, wie Stearinsäure, Palmitinsäure, Oleinsäure, Glycerolmonostearat, Glyceroldistearat, Glycerolmonooleat, Isopropylmyristat, Isopropylstearat und Butylstearat; Silicone, wie Methylpolysiloxane, Methylpolycyclosiloxane, Methylphenylpolysiloxane und Silicon-Polyether-Copolymere; Alkohole, wie Ethanol, Isopropylalkohol, Cetylalkohol, Stearylalkohol, Palmitylalkohol und Hexyldodecylalkohol; und Polyalkohole mit wasserhaltender Wirkung, wie Glycole, Glycerin und Sorbitole.
Wenn das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für einen künstlichen Erythrocyten verwendet wird, wird eine im vorhergehenden Schritt erhaltene Dickstoffsuspension in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, und große Partikel werden nach allgemein bekannten Verfahren, wie dem Gelfiltrationsverfahren und dem Zentrifugentrennverfahren, daraus entfernt.
Wenn das erfindungsgemäße, mit PHA beschichtete Liposom zum Beispiel als Liposom für eine Tinte verwendet wird, wird es in einem wäßrigen Medium dispergiert. Damit die Dispersion des Filterkuchens in Wasser getragen wird, können ein oberflächenaktives Mittel, ein Schutzkolloid und ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel in Mengen zugesetzt werden, die keine signifikante Verringerung der Beständigkeit der Beschichtung hervorrufen. Es können auch ein Konservierungsmittel, ein Viskositätsverbesserer, ein pN-Modifikationsmittel, ein Chelatbildner und dergleichen zugesetzt werden.
Insbesondere gehören zu Schutzkolloiden, die dem Liposom für eine Tinte zugesetzt werden können, natürliche Proteine, wie Leim, Gelatine, Casein, Albumin, Akaziengummi und Fischleim, Alginsäure und synthetische Polymere, wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyethylenoxid, Hydroxyethylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, aromatisches Amid, Polyacrylsäure, Polyvinylether, Polyvinylpyrrolidon, Acryl und Polyester.
Das Schutzkolloid wird falls erforderlich für den Zweck verwendet, das Fixieren, die Viskositätsverbesserung und die Trocknungseigenschaften zu verbessern, und der Gehalt des Schutzkolloids in der Tinte beträgt vorzugsweise 30 Masse-% oder weniger, besonders bevorzugt 20 Masse-% oder weniger.
Das oberflächenaktive Mittel, das dem Liposom für die Tinte zugesetzt werden kann, kann irgendein anionisches, kationisches, amphoteres und nichtionisches oberflächenaktives Mittel sein. Zu Beispielen von anionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören Fettsäureester, wie Natriumstearat, Kaliumoleat und teilhärtbares Talkfettsäure-Natrium; Alkylsulfate, wie Natriumdodecylsulfat, Tri(2-hydroxyethyl)ammoniumdodecylsulfat und Natriumoctadecylsulfat; Benzolsulfonate, wie Natriumnonylbenzolsulfonat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Natriumoctadecylbenzolsulfonat und Natriumdodecyldiphenyletherdisulfonat; Naphthalinsulfonate, wie Natriumdodecylnaphthalinsulfonat und Napthalinsulfonsäure-Formalin-Kondensate; Sulfosuccinate, wie Natriumdidodecylsulfosuccinat und Natriumdioctadodecylsulfosuccinat; Polyoxyethylensulfate, wie Natriumpolyoxyethylendodecylethersulfat, Tri(2-hydroxyethyl)ammoniumpolyoxyethylendodecylethersulfat, Natriumpolyoxyethylenoctadecylethersulfat und Natriumpolyoxyethylendodecylphenylethersulfat; und Phosphate, wie Kaliumdodecylphosphat und Natriumoctadecylphosphat. Zu Beispielen der kationischen oberflächenaktiven Mittel gehören Alkylaminsalze, wie Octadecylammoniumacetat und Kokosnußölaminacetat; und quaternäre Ammoniumsalze, wie Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Octadecyltrimethylammoniumchlorid, Dioctadecyldimethylammoniumchlorid und Dodecylbenzyldimethylammoniumchlorid. Zu Beispielen von amphoteren oberflächenaktiven Mitteln gehören Alkylbetaine, wie Dodecylbetain und Octadecylbetain; und Aminoxide, wie Dodecyldimethylaminoxid. Zu Beispielen von nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören Polyoxyethylenalkylether, wie Polyoxyethylendodecylether, Polyoxyethylenhexadecylether, Polyoxyetehylenoctadecylether und Polyoxyethylen(9-octadecenyl)ether; Polyoxyethylenphenylether, wie Polyoxyethylenoctylphenylether und Polyoxyethylennonylphenylether; Oxiranpolymere, wie Polyethylenoxid und ein Copolymer von Ethylenoxid und Propylenoxid; Sorbitanfettsäureester, wie Sorbitandodecansäureester, Sorbitanhexadecansäureester, Sorbitanoctadecansäureester, Sorbitan(9-octadecensäurelester, Sorbitan(9-octadecensäure)triester, Polyoxyethylensorbitandodecansäureester, Polyoxyethylensorbitanhexadecansäureester, Polyoxyethylensorbitanoctadecansäureester, Polyoxyethylensorbitanoctansäuretriester, Polyoxyethylensorbitan(9-octadecensäure)ester und Polyoxyethylensorbitan(9-octadecensäure)triester; Sorbitolfettsäureester, wie Polyoxyethylensorbitol(9-octadecensäure)tetraester; und Glycerinfettsäureester, wie Glycerinoctadecansäureester und Glycerin(9-octadecensäure)ester. Von diesen oberflächenaktiven Mitteln sind jene mit einem HLB-Wert von mehr als oder gleich 14 besonders bevorzugt. Der Gehalt des vorstehend genannten oberflächenaktiven Mittels beträgt für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung 0 bis 10 %, vorzugsweise 0 bis 5 %, bezogen auf die Gesamtmenge der wäßrigen Tintenzusammensetzung, obwohl sie sich in Abhängigkeit davon ändert, ob eine einzige Art eines oberflächenaktiven Mittels verwendet wird oder zwei oder mehr Arten von oberflächenaktiven Mitteln in Kombination verwendet werden.
Das erfindungsgemäße, mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom enthält vorzugsweise 20 bis 95 Masse-% Wasser oder 1 bis 60 Vol.-% des Liposoms, bezogen auf die Gesamtmenge der Zusammensetzung.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen besonders beschrieben. Jedes Beispiel, das nachstehend beschrieben wird, stellt jedoch nur ein Beispiel der besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, der technische Gedanke der vorliegenden Erfindung sollte jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt sein.
Bezugsbeispiel 1
Herstellung einer Transformante, die ein PHA synthetisierendes Enzym produzieren kann, und Erzeugung dieses PHA synthetisierenden Enzyms
Eine Transformante, die das PHA synthetisierende Enzym produzieren kann, wurde nach folgendem Verfahren hergestellt.
Der Stamm YN2 wurde über Nacht bei 30°C auf 100 ml Kulturmedium LB (1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid, pH = 7,4) gezüchtet, danach wurde die Chromosomen-DNA abgetrennt und aufgefangen, wobei das Verfahren von Marmer, et al. angewendet wurde. Die erhaltene Chromosomen-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Hindlll vollständig zersetzt. pUC18 wurde als Vektor verwendet und mit dem Restriktionsenzym Hindlll gespalten. Es wurde die Dephosphorylierung des Terminus durchgeführt (Molecular Cloning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press), und danach wurde ein DNA-Ligations-Kit Ver. 11 (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet, um die Spaltstelle (Klonierungsstelle) des Vektors mit dem durch Hindlll vollständig zersetzten Fragment der Chromosomen-DNA zu koppeln. Ein Plasmidvektor mit diesem darin eingeführten Chromosomen-DNA-Fragment wurde für die Transformation des Stammes Escherichia coli HB101 verwendet, wodurch eine DNA-Bank des Stamms YN2 hergestellt wurde.
Zur Auswahl des DNA-Fragmentes, das das Gen eines PHA synthetisierenden Enzyms des Stammes YN2 enthielt, wurde eine Sonde für die Koloniehybridisierung hergestellt. Es wurden Oligonucleotide synthetisiert, die aus den Basensequenzen mit der Sequenzidentifizierungsnummer 5 und der Sequenzidentifizierungsnummer 6 bestanden (Amasham Pharmacia·Biotech), und diese Olionucleotide wurden als Primer verwendet, um die PCR mit der Chromosomen-DNA als Templat durchzuführen. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde als Sonde verwendet. Das Markieren der Sonde erfolgte unter Verwendung eines handelsüblichen Markenenzyms AlkPhosDirect (Amasham Pharmacia·Biotech). Die erhaltene markierte Sonde wurde verwendet, um nach dem Koloniehybridisierungsverfahren aus der Chromosomen-DNA-Bank der Stämme YN2 Stämme von Escherichia coli auszuwählen, die rekombinante Plasmide aufweisen, die Gene eines PHA synthetisierenden Enzyms einschließen. Die Plasmide wurden nach dem Alkaliverfahren aus den ausgewählten Stämmen aufgefangen, wodurch das DNA-Fragment erhalten werden kann, das das Gen des PHA synthetisierenden Enzyms einschließt.
Das hier erhaltene Gen-DNA-Fragment wurde zu einem Vektor pBBR122 (Mo Bi Tec) rekombiniert, der eine weite Wirtsbereich-Replikationsregion einschließt, die weder zu Inc P, Inc Q noch zu Inc W gehört, die eine Inkompatibilitätsgruppe bilden. Wenn dieses rekombinante Plasmid nach dem Elektroporationsverfahren in den Stamm Pseudomonas cichorii YN2ml transformiert wurde (ein Stamm, dem die Fähigkeit zur Synthese von PHA fehlt), wurde die Fähigkeit des Stamms YN2ml zur Synthese von PHA wiederhergestellt, womit er folglich eine Komplementeigenschaft zeigt. Damit ist gesichert, daß das ausgewählte Gen-DNA-Fragment eine Gendomäne eines PHA synthetisierenden Enzyms einschließt, die im Stamm Pseudomonas cichorii YN2ml in das PHA synthetisierende Enzym translatiert werden kann.
Für dieses DNA-Fragment, das das Gen eines PHA synthetisierenden Enzyms einschließt, wurden die Basensequenzen gemäß der Sanger-Sequenzierungstechnik bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß in diesen bestimmten Basensequenzen Basensequenzen vorlagen, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 und der Sequenzidentifizierungsnummer 4 angegeben werden, die jeweils ein Peptid codieren. Wie nachstehend beschrieben konnte sichergestellt werden, daß alle aus einzelnen Peptidketten bestehenden Proteine eine Enzymaktivität aufwiesen, und die Basensequenzen, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 und der Sequenzidentifizierungsnummer 4 angegeben werden, waren PHA synthetisierende Enzyme. Insbesondere wurde sichergestellt, daß die Basensequenz mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 die Aminosäuresequenz codierte, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 angegeben wird, und die Basensequenz mit der Sequenzidentifizierungsnummer 4 die Aminosäuresequenz codierte, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 3 angegeben wird, und das Vermögen, PHA zu synthetisieren, bei einem Protein auftreten kann, das nur eine dieser Aminosäuresequenzen aufweist.
Bei dem Gen eines PHA synthetisierenden Enzyms mit der Basensequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 angegeben wird, wurde die PCR mit einer Chromosomen-DNA als Templat durchgeführt, wodurch die gesamte Länge des PHA synthetisierenden Enzyms wiederhergestellt wurde.
Für diese Basensequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 angegeben wird, wurden ein Oligonucleotid mit Basensequenzen stromaufwärts seines Startcodons (Sequenzidentifizierungsnummer 7), das als stromaufwärtiger Primen dient, und ein Oligonucleotid mit Basensequenzen stromabwärts seines Stopcodons (Sequenzidentifizierungsnummer 8), das als stromabwärtiger Primen dient, gestaltet bzw. synthetisiert (Amasham Pharrnacia·Biotech). Mit diesen Oligonucleotiden als Primer wurde die PCR mit der Chromosomen-DNA als Templat durchgeführt, um die Gesamtlänge des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms zu amplifizieren (LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.).
Auf ähnliche Weise wurde für das Gen des PHA synthetisierenden Enzyms mit der Basensequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 4 angegeben wird, die PCR mit der Chromosomen-DNA als Templat durchgeführt, um die Gesamtlänge des Enzyms des PHA synthetisierenden Enzyms wiederherzustellen. Für die Basensequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 4 angegeben wird, wurden ein Oligonucleotid mit Basensequenzen stromaufwärts seines Startcodons (Sequenzidentifizierungsnummer 9), das als stromaufwärtiger Primer dient, und ein Oligonucleotid mit Basensequenzen stromabwärts seines Stopcodons (Sequenzidentifizierungsnummer 10), das als stromabwärtiger Primen dient, gestaltet bzw. synthetisiert (Amasham Pharmacia·Biotech). Mit diesem Oligonucleotid als Primer wurde die PCR durchgeführt, um die Gesamtlänge des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms zu amplifizieren (LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.1.
Dann wurde das durch PCR amplifizierte Fragment, das die erhaltene Gesamtlänge des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms einschließt, unter Verwendung des Restriktionsenzyms Hindlll jeweils vollständig zersetzt. Außerdem wurde auch der Expressionsvektor pTrc99A mit dem Restriktionsenzym Hindlll gespalten und der Dephosphorylierungsbehandlung unterzogen (Molecular Cloning, Bd. 1, S. 572, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press). Ein DNA-Fragment, das die Gesamtlänge des Gens des PHA snthetisierenden Enzyms einschließt, wobei die unnötigen Basensequenzen an beiden Termini entfernt worden waren, wurde mit der Spaltstelle dieses Expressionsvektors pTrc99A gekoppelt, wobei ein DNA Ligation Kit Ver. II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Escherichia coli (HB101: Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde nach dem Kaliumchloridverfahren unter Verwendung des erhaltenen rekombinanten Plasmids transformiert. Die erhaltene Rekombinante wurde gezüchtet, es wurde eine Amplifikation des rekombinanten Plasmids durchgeführt, und das rekombinante Plasmid wurde für jeden Typ aufgefangen. Das rekombinante Plasmid, das die Gen-DNA mit der Sequenzidentifizierungsnummer 2 zurückbehielt, wurde als pYN2-C1 definiert (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 2), und das rekombinante Plasmid, das die Gen-DNA mit der Sequenzidentifizierungsnummer 4 zurückbehielt, wurde als pYN2-C2 definiert (von der Sequenzidentifizierungsnummer 4 abgeleitet).
Escherichia coli (Stamm HB101 fB, fadB-Mangelmutante) wurde nach dem Kaliumchloridverfahren unter Verwendung von pYN2-C1 und pYN2-C2 transformiert, wodurch rekombinante Stämme von Escherichia coli, der rekombinante Stamm pYN2-C1 und der rekombinante Stamm pYN2-C2, die jeweils ihr eigenes Rekombinationsplasmid aufwiesen, erhalten wurden.
Der rekombinante Stamm pYN2-C1 und der rekombinante Stamm pYN2-C2 wurden jeweils in 200 ml Medium M9 ausgestrichen, das 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % Octansäure enthielt, und bei 37°C und mit 125 Ausschlägen/Minute einer Schüttelkultur unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, und die Plasmid-DNA wurde nach einem üblichen Verfahren aufgefangen.
Für pYN2-C1 wurden jeweils das Oligonucleotid, das als stromaufwärtiger Primer dient (Sequenzidentifizierungsnummer 11;) und das Oligonucleotid, das als stromabwärtiger Primer dient (Sequenzidentifizierungsnummer 12) gestaltet und synthetisiert (Amasham Pharmacia·Biotegh). Mit diesen Oligonucleotiden als Primer wurde die PCR mit pYN2-C1 als Templat durchgeführt, um die Gesamtlänge des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms zu amplifizieren, das den BamHlRestriktionsort stromaufwärts und den Xhol-Restriktionsort stromabwärts aufweist (LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.). Auf ähnliche Weise wurden für pYN2-C2 jeweils das Oligonucleotid, das als stromaufwärtiger Primen dient (Sequenzidentifizierungsnummer 13) und das Oligonucleotid, das als stromabwärtiger Primen dient (Sequenzidentifizierungsnummer 14) gestaltet und synthetisiert (Amasham Pharmacia·Biotech). Mit diesem Oligonucleotid als Primer wurde die PCR mit pYN2-C2 als Templat durchgeführt, um die Gesamtlänge des Gens des PHA synthetisierenden Enzyms zu amplifizieren, das den BamHI-Restriktionsort stromaufwärts und den Xhol-Restriktionsort stromabwärts aufweist (LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.).
Jedes gereinigte, durch PCR amplifizierte Produkt wurde mit BamHI und Xhol aufgeschlossen und in die entsprechende Stelle des Plasmids pGEX-6P-1 (von Amasham Pharmacia·Biotech Co., Ltd. hergestellt) eingefügt. Diese Vektoren dienten dazu, Escherichia coli (JM109) zu transformieren, wodurch ein Stamm für die Expression erhalten wurde. Dieser Stamm wurde mit den DNA-Fragmenten überprüft, die durch Behandlung mit der BamHI- und Xhol-Plasmid-DNA erhalten worden waren, die mittels Miniprep (Wizard Minipreps DNA Purification Systems, von PROMEGA Co., Ltd. hergestellt) in großer Menge hergestellt worden waren. Der erhaltene Stamm wurde vorher über Nacht in 10 ml Medium LB-Amp gezüchtet, und danach wurde 0,1 ml des Stamms in 10 ml des Mediums LB-Amp gegeben, und es erfolgte eine 3-stündige Schüttelkultur bei 37°C und 170 U/min. Danach wurde IPTG zugesetzt (mit einer abschließenden Konzentration von 1 mmol) und die Züchtung erfolgte 4 bis 12 Stunden kontinuierlich bei 37°C.
Der durch IPTG induzierte Escherichia coli wurde aufgefangen (8.000 × g, 2 Minuten, 4°C) und bei 4°C erneut in 1 ml PBS suspendiert. Die Zellen wurden durch Gefrieren und Auftauen und Beschallen zerkleinert und zentrifugiert (8.000 × g, 10 Minuten, 4°C), um Zellabfälle zu entfernen. Das Vorhandensein der gewünschten Expressionsproteine im Überstand (zellfreier Extrakt) wurde durch SDS-PAGE bestätigt, darauf folgte eine Reinigung des induzierten und ausgeprägten GST-Fusionsproteins mit Kügelchen von Glutathion Sepharose 4B (von Amasham Pharmacia.Biotech Co., Ltd. hergestellt).
Die Glutathion-Sepharose für die Verwendung bei dieser Reinigung wurde behandelt, um vorher eine nichtspezifische Adsorption zu vermeiden. Insbesondere wurde die Glutathion-Sepharose dreimal mit der gleichen PBS-Menge gewaschen (8.000 × g, 1 Minute, 4°C), und danach wurde die gleiche Menge PBS, die 4 % BSA enthielt, zugesetzt, um die Glutathion-Sepharose 1 Stunde bei 4°C zu behandeln. Nach der Behandlung wurde die Glutathion-Sepharose zweimal mit der gleichen Menge PBS gewaschen und erneut in der halben Menge PBS suspendiert. 40 µl der vorbehandelten Glutathion-Sepharose wurden zu 1 ml zellfreiem Extrakt gegeben und bei 4°C leicht gerührt. Dadurch wurden die Fusionsproteine GST-YN2-C1 und GST-YN2-C2 an Glutathion-Sepharose adsorbiert.
Nachdem sie adsorbiert worden war, wurde die Glutathion-Sepharose durch Zentrifugieren aufgefangen (8.000 × g, 1 Minute, 4°C) und dreimal mit 400 µl PBS gewaschen. Danach wurden 40 µl reduziertes Glutathion mit 10 mmol zugesetzt und 1 Stunde bei 4°C gerührt, um das adsorbierte Fusionsprotein zu eluieren. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand aufgefangen (8.000 × g, 2 Minuten, 4°C), und danach wurde die Dialyse gegenüber PBS durchgeführt, um das GST-Fusionsprotein zu reinigen. Durch SDS-PAGE wurde bestätigt, daß dieses Protein ein einziges Band aufwies.
500 µg jedes GST-Fusionsproteins wurden durch PreScission-Protease (Amasham Pharmacia·Biotech, 5 E) aufgeschlossen und danach durch Glutathion-Sepharose geleitet, um die Protease und GST zu entfernen. Die durchlaufenden Fraktionen wurden außerdem mit einer Säule Sephadex G200 behandelt, die mit PBS ausgeglichen worden war, wodurch die abschließenden gereinigten Expressionsproteine YN2-C1 und YN2-C2 erhalten wurden. Durch SDS-PAGE wurde bestätigt, daß sie ein einzelnes Band mit 60,8 kDa bzw. 61,5 kDa aufwiesen.
Jede gereinigte Enzymlösung wurde mit einem Konzentrierungsmittel für eine Probe einer biologischen Lösung (Mizubutorikun AB-1 100, von Ato Co., Ltd. hergestellt) konzentriert, wodurch 10 E/ml der gereinigten Enzymlösung erhalten wurden.
Die Aktivität jedes gereinigten Enzyms wurde nach dem vorstehend aufgeführten Verfahren gemessen. Mit dem Kit Micro BCA mit einem Reagens für die mengenmäßige Erfassung von Proteinen (Pierce Chemical Co., Ltd.) wurden auch die Konzentrationen der Proteine in der Probe gemessen. Das Ergebnis der Messung der Aktivität jedes gereinigten Enzyms ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Bezugsbeispiel 2
Herstellung des PHA synthetisierenden Enzyms 2
Der Stamm P91, H45, YN2 oder P161 wurde in 200 ml Medium M9 ausgestrichen, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co., Ltd. hergestellt) und 0,1 % Octansäure enthielt, und bei 30°C und 125 Ausschlägen/Minute einer Schüttelkultur unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren (10.000 × g, 4°C, 10 Minuten) aufgefangen und erneut in 200 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) suspendiert und erneut zentrifugiert, wodurch die Zellen gewaschen wurden. Die Zellen wurden erneut in 2,0 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) suspendiert und mit einem Ultraschallbrecher aufgebrochen, gefolgt vom Zentrifugieren (12.000 × g, 4°C, 10 Minuten) und dem Auffangen des Überstands, wodurch ein unbehandeltes Enzym erhalten wurde. Das Meßergebnis der Aktivität jedes unbehandelten Enzyms ist in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Jedes Enzym wurde mit einem Konzentrierungsmittel für eine Probe einer biologischen Lösung (Mizubutorikun AB-1 100, von Ato Co., Ltd. hergestellt) konzentriert, wodurch 10 E/ml der gereinigten Enzymlösung erhalten wurden.
(Bezugsbeispiel 3)
Synthese von 3-Hydroxyacyl-CoA
(R)-3-Hydroxyoctanoyl-CoA wurde nach folgendem Verfahren synthetisiert, das auf dem Verfahren von Rehm BHA, Kruger N, Steinbuche) A (1998) Journal of Biological Chemistry 273, S. 24044-24051 basiert, wobei dieses Verfahren leicht abgeändert wurde. Acyl-CoA-Synthetase (von Sigma Co., Ltd. hergestellt) wurde in einer Lösung von Tris-HCl-Puffer (50 mmol, pH = 7,5) gelöst, die 2 mmol ATP, 5 mmol MgCl₂, 2 mmol CoA und 2 mmol (R)-3-Hydroxyoctanoat enthielt, so daß die Konzentration 0,1 mE/µl betrug. Die Lösung wurde in einem warmen Bad mit 37°C aufbewahrt und zu geeigneten Zeitpunkten wurden Proben gezogen, um den Verlauf der Reaktion durch HPLC zu analysieren. Der Probe der Reaktionslösung wurde Schwefelsäure bis zu einer Konzentration von 0,02 n zugesetzt, um die Enzymreaktion zu unterbrechen, und danach wurde (R)-3-Hydroxyoctanoat, das ein unreagiertes Substrat darstellt, mit n-Heptan extrahiert und entfernt. Für die Analyse durch HPLC mit der Säule RP18 (Nucleosil C18, 7 µm, Knauser) wurde bei einem linearen Konzentrationsgradienten von Acetonitril unter Verwendung von 25 mmol einer Phosphatpufferlösung (pH = 5,3) als mobile Phase eluiert, und die Absorptionsspektren bei 200 und 500 nm wurden mit einem Diodenarray-Nachweisgerät überwacht, wodurch die Thioesterverbindung nachgewiesen wurde, die durch die Enzymreaktion erzeugt worden war. Auf ähnliche Weise wurden (R)-3-Hydroxy-5-phenylvaleryl-CoA und (R)-3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeryl-CoA hergestellt.
Beispiel 1
Mit PHA beschichtetes Liposom mit eingekapselter Tinte
In einen 1 l Becher, der 70 ml einer gemischten Lösung aus Chloroform und Isopropylether mit einem Verhältnis von 1:1 enthielt, wurden 159,7 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 172,0 mg Distearylphosphatidylcholin und 168,3 mg Cholesterin (Molverhältnis 1:1:2, insgesamt 500 mg) gegeben. Dieser Lösung wurden 10 ml einer Lösung des wasserlöslichen Farbstoffs Direct Special Black AXN (von Nihon Kayaku erhältlich) gegeben, und die entstandene Lösung wurde emulgiert, indem sie 30 s mit Ultraschallwellen mit 50 Watt beschallt wurde, und dieses Verfahren wurde 1 1 mal wiederholt, wobei ein Ultraschallerzeuger vom Proben-Typ (Ohtake) verwendet wurde, wodurch eine Wasser/Öl-Emulsion hergestellt wurde. Die so hergestellte Emulsion wurde durch einen Rotationsverdampfer gegeben, um das organische Lösungsmittel bei 60°C und reduziertem Druck zu entfernen, wodurch ein einen Farbstoff einkapselndes Liposom erhalten wurde. Der Wert des Vakuums des Verdampfers war in der ersten Stufe hoch, und dieser Wert wurde eingestellt, indem er im Verlauf des Verdampfens des organischen Lösungsmittels verringert wurde, um den Siedeverzug zu verhindern. Danach wurde außerdem eine Spurenmenge des organischen Lösungsmittels, die im den Farbstoff einkapselnden Liposom verblieben war, durch Spülen mit Stickstoffgas entfernt. Dem entstandenen, einen Farbstoff einkapselnden Liposom wurde eine geeignete Menge einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung (pH = 7,0) bis zu 30 ml zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde mit einem Filter mit 1,2 µm (Acrodisc, Gelman) filtriert, darauf folgte eine 24-stündige Dialyse mit einer Dialysemembran (Spectrapor, Spectrum Medical) in einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung, um den externen Farbstoff zu entfernen, wodurch ein einen Farbstoff einkapselndes Liposom erhalten wurde. Der mittlere Partikeldurchmesser des Liposoms wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren mit 650 nm bestimmt.
Die von Pseudomonas cichorü YN2 stammende PHA-Synthase YN2-C1, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde dem den Farbstoff einkapselnden Liposom (100E) zugesetzt, und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Dann wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (R)-3-Hydroxyoctanoyl-CoA zugegeben, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte durch 30-minütiges Inkubieren bei 37°C.
Die Reaktionslösung wurde nach einem Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde. Das mit PHA beschichtete Liposom wurde nach dem dynamischen Lichtstreuverfahren bestimmt, und es wurde als monodisperses System mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 750 nm festgestellt.
Ein Teil des hergestellten, mit PHA beschichteten Liposoms wurde vakuumgetrocknet, und das entstandene Produkt wurde in 20 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde dann 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen, wodurch die äußere Membran zersetzt wurde. Der Extrakt wurde filtriert, wobei ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm verwendet wurde, gefolgt vom Konzentrieren mit einem Rotationsverdampfer bei verringertem Druck, der Methanolyse auf der Basis eines üblichen Verfahrens, der Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, El-Modus) und der anschließenden Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindung der PHA-Monomereinheit. Dadurch wurde das PHA als PHA mit 3-Hydroxyoctansäure als Monomereinheit identifiziert, wie es in 2 gezeigt ist. Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Temperatur der Säule: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 16.000 und Mw = 36.000 bestimmt.
Beispiel 2
Mit PHA beschichtetes Liposom mit eingekapseltem Antibiotikum
Ein Liposom, das Vancomycin als Antibiotikum einkapselt, wurde wie folgt hergestellt. In einem auberginenförmigen Kolben wurden 2,1 g gereinigtes Eigelblecithin und 0,9 g Cholesterin in 20 ml Chloroform gelöst. Danach wurde das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer entfernt, dann wurde ein Vakuumtrockner verwendet, um ein vollständig getrocknetes Membrankomponentengemisch zu erhalten. Diesem Gemisch wurden 20 ml einer 5 -igen wäßrigen Glucoselösung und 0,4 g Vancomycin zugesetzt, und das entstandene Gemisch wurde durch Ultraschall dispergiert, gefolgt vom Gefrieren und Auftauen, wodurch ein multi-lamellares Vehikel erhalten wurde, das Vancomycin enthielt. Die Lösung wurde auf einer Säule Sephadex G-50 gelfiltriert, um das Vancomycin zu entfernen, das nicht im Liposom eingekapselt war, womit eine nach der Größe aufgeteilte Liposomfraktion erhalten wurde. Der mittlere Partikeldurchmesser wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren mit 750 nm bestimmt.
Die PHA-Synthase YN2-C2, die von Pseudomonas cichorii YN2 abgeleitet ist, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde dem Material zugesetzt (100 E), und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Danach wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (R)-3-Hydroxy-5-phenylvaleryl-CoA zugegeben, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte durch 30-minütiges Inkubieren bei 37°C.
Die Reaktionslösung wurde durch ein Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G- 50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde. Das mit PHA beschichtete Liposom wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren bestimmt, und es wurde als monodisperses System mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 820 nm erkannt.
Ein Teil des hergestellten, mit PHA beschichteten Liposoms wurde vakuumgetrocknet, und das entstandene Material wurde in 20 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde dann 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen, wodurch die äußere Membran zersetzt wurde. Der Extrakt wurde filtriert, wobei ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm verwendet wurde, gefolgt vom Konzentrieren mit einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck, der Methanolyse auf der Basis eines üblichen Verfahrens, der Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, E1-Modus) und der anschließenden Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindung der PHA-Monomereinheit. Dadurch wurde das PHA als ein PHA identifiziert, das 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure als Monomereinheit aufweist, wie es in 3 gezeigt ist. Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Säulentemperatur: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 18.000 und Mw = 38.000 bestimmt.
Beispiel 3
Mit PHA beschichtetes Liposom mit einer eingekapselten Agrochemikalie Ein Liposom, das o,o-Dimethyl-o-(3-methyl-4-nitrophenyl)phosphorthioat als wirksamen Bestandteil einer Agrochemikalie einkapselt, wurde wie folgt hergestellt. In einem auberginenförmigen Kolben wurden 2,1 g gereinigtes Eigelblecithin und 0,9 g Cholesterin in 20 ml Chloroform gelöst. Danach wurde das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer entfernt, danach wurde ein Vakuumtrockner verwendet, um ein vollständig getrocknetes Membrankomponentengemisch zu erhalten. Diesem Gemisch wurden 20 ml einer 5 -igen wäßrigen Lösung von o-(3-Methyl-4-nitrophenyl)phosphorthioat-Lösung gegeben und das entstandene Gemisch wurde durch Ultraschall dispergiert, gefolgt vom Gefrieren und Auftauen, wodurch ein multi-lamellares Vehikel erhalten wurde, das o-(3-Methyl-4-nitrophenyl)phosphorthioat enthielt. Die Lösung wurde auf einer Säule Sephadex G-50 gelfiltriert, um das o-(3-Methyl-4-nitrophenyl)phosphorthioat zu entfernen, das nicht im Liposom eingekapselt war, womit eine nach der Größe aufgeteilte Liposomfraktion erhalten wurde. Der mittlere Partikeldurchmesser wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren mit 730 nm bestimmt.
Die PHA-Synthase, die vom Stamm P161 abgeleitet ist, die in Bezugsbeispiel 2 hergestellt worden war, wurde dem Material zugesetzt (100 E), und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Danach wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (R)-3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeryl-CoA zugegeben, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte durch 30-minütiges Inkubieren bei 37°C.
Die Reaktionslösung wurde durch ein Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde. Das mit PHA beschichtete Liposom wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren bestimmt, und es wurde als monodisperses System mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 790 nm bestimmt.
Ein Teil des hergestellten, mit PHA beschichteten Liposoms wurde vakuumgetrocknet, und das entstandene Material wurde in 20 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde dann 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen, wodurch die äußere Membran zersetzt wurde. Der Extrakt wurde filtriert, wobei ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm verwendet wurde, gefolgt vom Konzentrieren mit einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck, der Methanolyse auf der Basis eines üblichen Verfahrens, der Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) und der anschließenden Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindung der PHA-Monomereinheit. Dadurch wurde das PHA als ein PHA identifiziert, das (R)-3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure als Monomereinheit aufweist, wie es in 4 gezeigt ist. Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Säulentemperatur: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 15.000 und Mw = 35.000 bestimmt.
Beispiel 4
Mit PHA beschichtetes Liposom mit einem eingekapselten kosmetischen Mittel Ein Liposom, das 2,4-Dihydroxybenzophenon, ein Beispiel eines UV-Absorptionsmittels, als kosmetisches Mittel einkapselt, wurde wie folgt hergestellt. In einen 1 l Becher, der 70 ml einer gemischten Lösung aus Chloroform und Isopropylether mit einem Verhältnis von 1:1 enthielt, wurden 159,7 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 172,0 mg Distearylphosphatidylcholin und 168,3 mg Cholesterin (Molverhältnis 1:1:2, insgesamt 500 mg) gegeben. Dieser Lösung wurden 10 ml einer Lösung von 2,4-Dihydroxybenzophenon mit 5 Gew.-% zugegeben, und die entstandene Lösung wurde emulgiert, indem sie 11 mal 30 s mit Ultraschallwellen mit 50 Watt beschallt wurde, wobei ein Ultraschallerzeuger vom Proben-Typ (Ohtake) verwendet wurde, wodurch eine Wasser/Öl-Emulsion hergestellt wurde. Die so hergestellte Emulsion wurde durch einen Rotationsverdampfer gegeben, um das organische Lösungsmittel bei 60°C und reduziertem Druck zu entfernen, wodurch ein Liposom mit eingekapseltem 2,4-Dihydroxybenzophenon erhalten wurde. Der Wert des Vakuums des Verdampfers war in der ersten Stufe hoch, und dieser Wert wurde eingestellt, indem er im Verlauf des Verdampfens des organischen Lösungsmittels verringert wurde, um den Siedeverzug zu verhindern. Danach wurde außerdem eine Spurenmenge des organischen Lösungsmittels, die im Liposom mit dem eingekapselten 2,4-Dihydrobenzophenon verblieben ist, durch Spülen mit Stickstoffgas entfernt. Dem entstandenen, 2,4-Dihydrobenzophenon einkapselnden Liposom wurde eine geeignete Menge einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung (pH = 7,0) bis zu 30 ml zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde mit einem Filter mit 1,2 µm (Acrodisc, Gelman) filtriert, darauf folgte eine 24-stündige Dialyse mit einer Dialysemembran (Spectrapor, Spectrum Medical) in einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung, um das externe 2,4-Dihydroxybenzophenon zu entfernen, wodurch ein 2,4-Dihydrobenzophenon einkapselndes Liposom erhalten wurde. Der mittlere Partikeldurchmesser des Liposoms wurde mit einem dynamischen Lichtstreuverfahren mit 660 nm bestimmt.
Die PNA-Synthase, die vom Stamm H45 abgeleitet ist, die in Bezugsbeispiel 2 hergestellt worden war, wurde dem Liposom mit dem eingekapselten 2,4-Dihyddroxybenzophenon zugesetzt (100 E) zugesetzt, und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Dann wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (R)-3-Hydroxyoctanoyl-CoA zugegeben, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte durch 30-minütiges Inkubieren bei 37°C.
Die Reaktionslösung wurde nach dem Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde. Das mit PHA beschichtete Liposom wurde nach dem dynamischen Lichtstreuverfahren bestimmt, und es wurde als monodisperses System mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 730 nm festgestellt.
Ein Teil des hergestellten, mit PHA beschichteten Liposoms wurde vakuumgetrocknet, und das entstandene Produkt wurde in 20 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde dann 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen, wodurch die äußere Membran zersetzt wurde. Der Extrakt wurde filtriert, wobei ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm verwendet wurde, gefolgt vom Konzentrieren mit einem Rotationsverdampfer bei verringertem Druck, der Methanolyse auf der Basis eines üblichen Verfahrens, der Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, E1-Modus) und der anschließenden Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindung der PHA-Monomereinheit. Dadurch wurde das PHA als PHA mit 3-Hydroxyoctansäure als Monomereinheit identifiziert. Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Temperatur der Säule: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 17.000 und Mw = 37.000 bestimmt.
Beispiel 5
Liposom für einen künstlichen Erythrocyten
Aus der Vene eines Rindes wurde Blut aufgefangen (1,5 l), wobei ein Blutsammelbeutel verwendet wurde, der ein gerinnungshemmendes Mittel enthielt. Das aufgefangene Blut wurde in einem verschlossenen Behälter aseptisch transportiert und bei 4°C gehalten. Die nachfolgenden Schritte wurden alle aseptisch bei einer geringen Temperatur von 4°C durchgeführt. Es wurde eine Zentrifugenreinigung mit einer kontinuierlichen Zentrifuge unter Verwendung einer physiologischen Kochsalzlösung durchgeführt, womit durch das Entfernen von Thrombocyten, Leukocyten und Plasma aus dem Blut 500 ml grob gereinigte Erythrocyten erhalten wurden. Der Erythrocyt wurde außerdem mit einem Plasmaabscheider mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm gereinigt, wobei physiologische Kochsalzlösung verwendet wurde. Der gereinigte Erythrocyt wurde hämolysiert, indem 1 l pyrogenfreies destilliertes Wasser auf 500 ml Erythrocyt zugesetzt wurde. Bei dem Erythrocyten wurde die Erythrocytenmembran entfernt, und er wurde mit einem Plasmaabscheider mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm und einem Plasmakomponentenabscheider mit einem Porendurchmesser von 0,1 µm filtersterilisiert. Es wurden etwa 1,2 l Hämoglobin von Erythrocyten, bei denen die Membran entfernt worden war, mit einer Hämoglobinkonzentration von 8 % (Gew./Gew.) erhalten. Für die Dialyse wurde das Material durch Ultrafiltration konzentriert, wobei ein Dialysator TAF10W (Hohldialysator auf Cellulosebasis von Terumo Corp.) verwendet wurde, wodurch etwa 180 ml Hämoglobin von Erythrocyten, bei denen die Membran entfernt worden war, mit einer Hämoglobinkonzentration von 50 % (Gew./Gew.) erhalten wurden.
27,76 g gereinigtes Phosphatidylcholin mit einer Hydrierungsrate von 80 %, 6,96 g Cholesterin und 3,75 g gereinigte Phosphatidsäure mit einer Hydrierungsrate von 80 % wurden in Chloroform gelöst. Von der Lipidlösung, die in einen auberginenförmigen Kolben gegeben worden war, wurde das Chloroform durch Verdampfen entfernt, wodurch am Boden des auberginenförmigen Kolbens eine Lipidmembran erzeugt wurde. Ein 16-stündiges Vakuumtrocknen entfernte zudem das Chloroform vollständig.
Es wurde eine Rohmateriallösung hergestellt, indem ein 180 ml des Hämoglobins von Erythrocyten, bei denen die Membran entfernt worden war, der Lipidmembran zugesetzt wurden, die bei der Herstellung des das Liposom bildenden Lipids hergestellt worden war, wodurch mit einem Poltex-Mischer eine Emulsion erhalten wurde. Das Rohmaterial wurde in ein Druckgefäß mit einer schmalen Düse, ein Parr-Zellbrecher (von Parr Corp., USA erhältlich) gegeben, gasförmiger Stickstoff wurde eingeführt, und es wurde ein Druck von bis zu 130 kg/cm^² angewendet. Das Ganze wurde 30 Minuten stehengelassen, damit das Stickstoffgas ausreichend in die Rohmateriallösung eindringen konnte. Dann wurde das Ventil der Düse allmählich geöffnet, um das Rohmaterial auszustoßen, wobei der Druck bei 130 kg/cm² gehalten wurde.
Das Fluid wurde nach dem Druckausstoß durch Gelfiltration (Säule Sephadex G- 50) aufgeteilt, um das Hämoglobin zu entfernen, das nicht im Liposom eingekapselt war, wodurch ein Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin erhalten wurde.
Die PHA-Synthase YN2-C1, die von Pseudomonas cichorii stammt, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde dem Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin zugesetzt (100 E), und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Danach wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (Rn-3-Hydroxyoctanoyl-CoA zugesetzt, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte 30 Minuten durch Inkubieren bei 37°C.
Die Reaktionslösung wurde durch ein Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde. Das mit PHA beschichtete Liposom wurde durch ein dynamisches Lichtstreuverfahren bestimmt, und es wurde als monodisperses System mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 720 nm festgestellt.
Ein Teil des hergestellten, mit PHA beschichteten Lipsosoms wurde vakuumgetrocknet, und der Rest wurde in 20 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde dann 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen, wodurch die äußere Membran zersetzt wurde. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm filtriert, gefolgt vom Konzentrieren mit einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck, der Methanolyse auf der Basis eines üblichen Verfahrens, der Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) und der anschließenden Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindung der PNA-Monomereinheit. Dadurch wurde das PHA als ein PHA identifiziert, das 3-Hydroxyoctansäure als Monomereinheit aufweist. Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Temperatur der Säule: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 17.000 und Mw = 37.000 bestimmt.
Beispiel 6
Kontrollierte Freisetzbarkeit aus einem mit PHA beschichteten Liposom mit eingekapseltem Calcein
In einen 1 l Becher, der 70 ml einer gemischten Lösung aus Chloroform und Isopropylether in einem Verhältnis von 1:1 enthielt, wurden 500 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin gegeben. Dieser Lösung wurden 10 ml einer wäßrigen Lösung der wäßrigen fluoreszierenden Verbindung Calcein zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde emulgiert, indem sie 11 mal 30 s mit Ultraschallwellen mit 50 Watt beschallt wurde, wobei ein Ultraschallerzeuger vom Proben-Typ (Ohtake) verwendet wurde, wodurch eine Wasser/Öl-Emulsion hergestellt wurde. Die so hergestellte Emulsion wurde durch einen Rotationsverdampfer geleitet, um das organische Lösungsmittel bei 60°C und reduziertem Druck zu entfernen, wodurch ein Liposom mit eingekapseltem Calcein erhalten wurde. Der Wert des Vakuums des Verdampfers war in der ersten Stufe hoch, und dieser Wert wurde folglich geregelt, indem er im Verlauf des Verdampfens des organischen Lösungsmittels verringert wurde, um einen Siedeverzug zu vermeiden. Danach wurde durch Spülen mit Stickstoffgas zudem eine Spurenmenge des organischen Lösungsmittels entfernt, die im Liposom mit eingekapseltem Calcein verblieben war. Dem entstandenen Liposom mit eingekapseltem Calcein wurde eine geeignete Menge einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung (pH = 7,0) bis auf 30 ml zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde mit einem Filter mit 1,2 µm (Acrodisc, Gelman) filtriert, wodurch ein Liposom erhalten wurde, in dessen Innerem Calcein eingekapselt war.
Die PHA-Synthase YN2-C1, die von Pseudomonas cichorü YN2 stammt, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde einem Teil des Liposoms mit eingekapseltem Calcein zugesetzt (100 E), und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C stehengelassen. Danach wurde dem Produkt das in Bezugsbeispiel 3 hergestellte (R)-3-Hydroxyoctanoyl-CoA zugegeben, so daß die Endkonzentration 5 mmol betrug. Die Synthesereaktion erfolgte 90 Minuten durch Inkubieren bei 20°C.
Die Reaktionslösung wurde nach dem Gelfiltrationsverfahren (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch ein mit PHA beschichtetes Liposom erhalten wurde.
Die Freisetzung von Calcein aus dem mit PHA beschichteten Liposom und einem Liposom, das nicht mit PHA beschichtet war, wurde durch Messen der Intensität der Fluoreszenz von Calcein bestimmt. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. In 5 bezeichnet die Bezugsziffer 6 das Verhalten bei der Freisetzung von Calcein aus dem mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposom und die Bezugsziffer 7 bezeichnet das Verhalten bei der Freisetzung von Calcein aus dem Liposom, das nicht mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist.
In bezug auf die Fähigkeit einer Phospholipidmembran zur verzögerten Freisetzung bei einer Temperatur (25°C) unterhalb der Phasenübergangstemperatur hatte das mit PHA beschichtete Liposom (6) ein hervorragendes Festhaltevermögen im Vergleich mit dem Liposom, das nicht mit PHA beschichtet war (7). In bezug auf die Fähigkeit einer Phospholipidmembran zur verzögerten Freisetzung bei der Phasenübergangstemperatur (etwa 42°C) zeigte das mit PHA beschichtete Liposom (6) im Vergleich mit dem nicht mit PHA beschichteten Liposom (7) die Eigenschaften einer schnellen Freisetzung. Wenn die Temperatur wieder auf 25°C zurückkehrte, war das Freisetzungsvermögen des mit PHA beschichteten Liposoms eingeschränkt.
Es wurde somit deutlich, daß das mit PHA beschichtete Liposom dieses Beispiels bei der Temperaturempfindlichkeit der verzögerten Freisetzung im Vergleich mit einem nicht mit PHA beschichteten Liposoms besser ist. Die Verbesserung des Festhaltevermögens bei Raumtemperatur (25°C) beruht anscheinend auf dem eingeschränkten Austritt des Inhalts aus dem Liposom, der dem Unterschied des osmotischen Drucks zwischen der Außenseite und der Innenseite des Liposoms aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit der PNA-Beschichtung zugeschrieben werden kann. Andererseits liegt der Grund für eine Verbesserung des Freisetzungsvermögens bei der Phasenübergangstemperatur anscheinend darin, daß der Unterschied des osmotischen Drucks im mit PHA beschichteten Liposoms im Verhältnis zu dem nicht mit PHA beschichteten Liposoms bei einem relativ hohen Wert gehalten wird, und somit beschleunigt dieser Unterschied beim osmotischen Druck den Austritt des Inhalts, was folglich zu einem schnellen Durchdringen des Inhalts führt, da die äußere Hülle aus PHA porös ist.
Beispiel 7
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom mit einer Gradientenstruktur
In einen 1 l Becher, der 70 ml einer gemischten Lösung aus Chloroform und Isopropylether in einem Verhältnis von 1:1 enthielt, wurden 500 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin gegeben. Dieser Lösung wurden 10 ml einer wäßrigen Lösung der wäßrigen fluoreszierenden Verbindung Calcein zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde emulgiert, indem sie 11 mal 30 s mit Ultraschallwellen mit 50 Watt beschallt wurde, wobei ein Ultraschallerzeuger vom Proben-Typ (Ohtake) verwendet wurde, wodurch eine Wasser/Öl-Emulsion hergestellt wurde. Die so hergestellte Emulsion wurde durch einen Rotationsverdampfer geleitet, um das organische Lösungsmittel bei 60°C und reduziertem Druck zu entfernen, wodurch ein Liposom mit eingekapseltem Calcein erhalten wurde. Der Wert des Vakuums des Verdampfers war in der ersten Stufe hoch, und dieser Wert wurde folglich geregelt, indem er im Verlauf des Verdampfens des organischen Lösungsmittels verringert wurde, um einen Siedeverzug zu vermeiden. Danach wurde durch Spülen mit Stickstoffgas zudem eine Spurenmenge des organischen Lösungsmittels entfernt, die im Liposom mit eingekapseltem Calcein verblieben war. Dem entstandenen Liposom mit eingekapseltem Calcein wurde eine geeignete Menge einer 10 mmol Phosphorsäurepufferlösung (pH = 7,0) bis auf 30 ml zugesetzt, und die entstandene Lösung wurde mit einem Filter mit 1,2 µm (Acrodisc, Gelman) filtriert, wodurch ein Liposom erhalten wurde, in dessen Innerem Calcein eingekapselt war.
Die PHA-Synthase YN2-C1, die von Pseudomonas cichorü YN2 stammt, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde einem Teil des Liposoms mit eingekapseltem Calcein zugesetzt (100 E), und das entstandene Material wurde 30 Minuten bei 20°C leicht gerührt, um das Enzym für die PHA-Synthese auf der Oberfläche des Liposoms zu fixieren.
Das entstandene Material wurde durch Gelfiltration (Säule Sephadex G-50) nach der Größe aufgeteilt, wodurch eine Liposomfraktion mit einem fixierten Syntheseenzym erhalten wurde. Dem vorstehend genannten Liposom mit dem fixierten Syntheseenzym wurden 100 Gew.-Teile 0,1 m Phosphorsäurepuffer (pH = 7,0) zugesetzt, der 30 mmol (R)-3-Nydroxyoctanyl-CoA (nach dem Verfahren hergestellt, das in Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997) beschrieben ist) und 0,1 % Rinderserumalbumin (von Sigma Chemical Corp. erhältlich) enthielt. Während diese Reaktionslösung bei 30°C leicht weitergerührt wurde, wurde dieser Lösung mit einer Rate von 25 Gew.-Teilen/Minute 0,1 m Phosphorsäurepuffer (pH = 7,0) zugesetzt, der 30 mmol (R)-3-Hydroxypimelyl-CoA (nach dem Verfahren hergestellt, das in J. Bacteriol., 182, 2753-2760 (2000) angegeben ist) und 0,1 % Rinderserumalbumin (von Sigma Corp. erhältlich) enthielt, wobei eine Mikroschlauchpumpe (MP-3N, von Tokyo Rikakikai Co., Ltd. erhältlich) verwendet wurde.
Nach 30-minütigem Schütteln wurde die entstandene Lösung mit 0,1 m Phosphorsäurepuffer (pH = 7,0) gewaschen, um unreagierte Substanzen usw. zu entfernen, gefolgt vom Lufttrocknen, wodurch ein mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom erhalten wurde.
Nachdem dieses mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom gefriergetrocknet worden war, wurde das Molekulargewicht des auf dessen Oberfläche gebildeten Polymers mit einem Laufzeit-Sekundärionen-Massenspektrometer (TOF-SIMS IV, von CAMECA erhältlich) bestimmt. Das erhaltene Massenspektrum zeigte, daß die Oberfläche des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms aus einem Copolymer von 3-Hydroxypimelinsäure und 3-Hydroxyoctansäure (Molverhältnis 17:1) besteht. Wenn die Oberfläche des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms zudem Stück für Stück abgeschabt wurde und das Massenspektrum in ähnlicher Weise mit einem TOF-SIMS gemessen wurde, nahm der Anteil von 3-Hydroxypimelinsäure von der Zusammensetzung des vorstehend genannten Copolymers allmählich ab und der Anteil von 3-Hydroxyoctansäure von der Zusammensetzung nahm zu. Das zeigt, daß die Oberfläche des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms dieses Beispiels mit Polyhydroxypimelat mit hydrophilen funktionellen Gruppen beschichtet ist, daß die Schicht direkt unter der Oberfläche mit einem Copolymer von 3-Hydroxypimelinsäure mit hydrophilen funktionellen Gruppen und 3-Hydroxyoctansäure mit hydrophoben funktionellen Gruppen beschichtet ist, und daß das Liposom eine Gradientenstruktur hat, bei der der Anteil von 3-Hydroxyoctansäure von der Zusammensetzung zunimmt, je weiter unten die Schicht ist.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gelpermeationschromatographie (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 µm), Lösungsmittel: Chloroform, Säulentemperatur: 40°C, auf Polyethylen bezogen) mit Mn = 21 .000 und Mw = 40.000 bestimmt.
Beispiel 8
Herstellung eines mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms (chemische Modifizierung)
Wie bei Beispiel 7 wurde ein Liposom mit einem fixierten Enzym hergestellt, indem darin Calcein eingekapselt wurde und auf dessen Oberfläche die PNA-Synthase YN2-C1 immobilisiert wurde, die von Pseudomonas cichorii YN2 abgeleitet ist, die in Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war.
1 Gew.-Teil des vorstehend genannten Liposoms mit dem fixierten Enzym wurde in 48 Gew.-Teilen 0,1 m Phosphorsäurepuffer (pH = 7,0) suspendiert, und dieser Suspension wurden 0,8 Gew.-Teil (R,S)-3-Hydroxy-5-phenoxyvaleryl-CoA, das durch Hydrolyse von 3-Hydroxy-5-phenoxyvalerat hergestellt worden war, das durch die Reformatsky-Reaktion von 3-Phenoxypropanol und Bromacetat, wodurch 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure erhalten wurde, und das anschließende Verfahren, das in Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997) beschrieben ist, erhalten worden war, 0,2 Gew.-Teil (R,S)-3-Hydroxy-7,8-epoxyoctanoyl-CoA, das hergestellt worden war, indem der ungesättigte Teil von 3-Hydroxy-7-octensäure, die nach dem Verfahren synthetisiert worden war, das in Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91 (1990) beschrieben ist) mit 3-Chlorbenzoesäure epoxidiert wurde, gefolgt von dem Verfahren, das in Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997) beschrieben ist, und 0,1 Gew.-Teil Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Corp.) zugegeben, und die entstandene Lösung wurde dann 2 Stunden bei 30°C leicht gerührt, wodurch die Probe 1 erhalten wurde.
Als vergleichender Bezug wurde die Probe 2 nach dem gleichen vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten, außer daß (R,S)-3-Hydroxy-7,8-epoxyoctanoyl-CoA durch 3-Hydroxyoctanoyl-CoA ersetzt wurde.
10 µl der vorstehend genannten Proben wurden auf einen Objektträger gegeben, und diesem wurden 10 µl einer 1 %-igen wäßrigen Lösung von Nile Blue A zugesetzt. Die entstandene Lösung wurde auf dem Objektglas gemischt, ein Abdeckglas wurde aufgelegt und danach folgte die Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop (330 bis 380 nm Exzitationsfilter, 420 nm Langweg-Absorptionsfilter; von Nikon Corp. erhältlich). Dadurch zeigten alle Proben die Emission einer Fluoreszenz von der Oberfläche des Liposoms. Dadurch wurde deutlich, daß das Liposom auf seiner Oberfläche mit PHA beschichtet ist.
Als Kontrolle wurde 1 Gew.-Teil Liposom, das nicht mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet war, zu 49 Gew.-Teilen von 0,1 m Phosphorsäurepuffer (pH = 7,0) gegeben, und diese Lösung wurde 2,5 Stunden bei 30°C leicht gerührt und dann in ähnlicher Weise durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Als Ergebnis wurde von der Oberfläche des Liposoms überhaupt keine Fluoreszenz emittiert.
Außerdem wurde PHA, das die Außenmembran sein soll, nach einem Verfahren erhalten, das die Wiedergewinnung eines Teils der Probe durch Zentrifugieren (10.000 × g, 4°C, 10 Minuten), das Vakuumtrocknen der Substanz, deren Suspendieren in Chloroform, das 20-stündige Rühren der Suspension bei 60°C und deren anschließendes Extrahieren beinhaltet. Dieser Extrakt wurde durch ¹H NMR analysiert (verwendete Vorrichtung: FT-NMR, Bruker DPX400, Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: deuteriertes Chloroform (einschließlich TMS)1. Die Prozentsätze der Einheiten der Seitenkette, die aus diesen Ergebnissen berechnet wurden, sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3 Zusammensetzung der äußeren Hülle aus PHA von Kapselstrukturen (1H NMR, Einheit %)
50 Gew.-Teile der vorstehend angegebenen Probe 1 wurden zentrifugiert (10.000 × g, 4°C, 10 Minuten), um das mit Polyhydroxyalkanoat beschichtete Liposom wiederzugewinnen. Das entstandene Liposom wurde in 50 Gew.-Teilen gereinigtem Wasser suspendiert, und das Verfahren wurde dreimal wiederholt. In dieser Suspension wurde 0,5 Gew.-Teil Hexamethylendiamin als Vernetzungsmittel gelöst. Nachdem die Auflösung bestätigt worden war, wurde das Wasser durch Gefriertrocknen entfernt (Probe 3). Außerdem konnte die Probe 3 12 Stunden bei 70°C reagieren (Probe 4).
Die vorstehend genannten Proben 3 und 4 wurden in Chloroform suspendiert, und die entstandene Suspension wurde 20 Stunden bei 60°C gerührt, und danach wurde das PHA, das die äußere Hülle sein soll, herausgelöst. Nach dem Entfernen des Chloroforms durch Vakuumtrocknen wurde das PHA mit einem Kalorimeter mit Differentialabtastung (DSC: Perkin Elmer; Pyris 1, Rate der Temperaturerhöhung: 10°C/min) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Probe 3 in der Nähe von 90°C einen deutlichen exothermen Peak aufwies, der darauf hinweist, daß die Epoxygruppen im Polymer mit Hexamethylendiamin reagieren, wodurch das Vernetzen der Polymere untereinander weitergehen kann. Andererseits zeigte die Probe 4 keinen deutlichen Wärmefluß, was nahelegt, daß die Vernetzungsreaktion fast völlig abgeschlossen war.
Außerdem wurden bei den gleichen Proben die Infrarotspektren gemessen (FT-IR: Perkin Elmer 1720X). Als Ergebnis erschienen bei der Probe 4 keine Peaks, die Aminen (ungefähr 3340 cm^–1 ) und Epoxygruppen (ungefähr 822 cm^–1 ) zugeschrieben werden können, die bei der Probe 3 zu erkennen waren.
Zusammenfassend wird deutlich, daß PHA mit Epoxygruppen an seinen Seitenketten mit Hexamethylendiamin zur Reaktion gebracht werden kann, wodurch ein vernetztes Polymer erhalten wird.
Andererseits wurde die Probe 2 als vergleichender Bezug in ähnlicher Weise ausgewertet; die Ergebnisse zeigen jedoch deutlich, daß eine Vernetzung der Polymere untereinander sowie bei den vorstehend aufgeführten Ergebnissen nicht erreicht wurde.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom, wobei zumindest ein Teil seiner Außenwand mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat aus mindestens einer der Einheiten besteht, die aus den Monomereinheiten der Formeln [1] bis [10] ausgewählt sind:
(worin das Symbol „a" eine ganze Zahl darstellt und die Kombination aus R1 und „a" ausgewählt ist aus: einer Kombination aus einem Wasserstoffatom und irgendeiner ganzen Zahl von 0 bis 10; einer Kombination aus einem Halogenatom und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; einer Kombination aus einer chromophoren Gruppe und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; einer Kombination aus einer Carboxylgruppe oder einem Salz davon und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; und einer Kombination von
und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 7),
(worin b irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R2 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin c irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R3 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist),
(worin d irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R4 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin e irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R5 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, C₃F₇ -CH₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin f irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt),
(worin g irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt),
(worin h irgendeine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt und R6 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -COOR', -SO₂R", -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇ -CH(CH₃)₂ und -C(CH₃)₃ ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, -CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus -OH, -ONa, -OK, einem Halogenatom, -OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist),
(worin i irgendeine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt und R7 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -OOOR' und -SO₂R" ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, -CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus -OH, -ONa, -OK, einem Halogenatom, -OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist), und
(worin j irgendeine ganze Zahl von 1 bis 9 darstellt).
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine hydrophile funktionelle Gruppe aufweist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 3, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine anionische funktionelle Gruppe aufweist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 4, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Carboxylgruppe aufweist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit mit einer Carboxylgruppe mindestens eine Monomereinheit ist, die aus Monomereinheiten der Formel [1 1 ] ausgewählt ist
(worin k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist).
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei eine Zusammensetzung der Monomereinheit des Polyhydroxyalkanoats in Richtung von der Innenseite des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms zu dessen Außenseite geändert ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats chemisch modifiziert ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 8, wobei das chemisch modifizierte Polyhydroxyalkanoat mindestens eine Pfropfkette aufweist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Pfropfkette durch chemisches Modifizieren von Polyhydroxyalkanoat erzeugt ist, das mindestens eine Monomereinheit mit einer Epoxygruppe enthält.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Pfropfkette eine Pfropfkette von Verbindungen ist, die jeweils eine Aminogruppe aufweisen.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 1 1, wobei die Verbindung mit einer Aminogruppe eine mit einer endständigen Aminogruppe modifizierte Verbindung ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 12, wobei jede der mit endständigen Aminogruppen modifizierten Verbindungen unabhängig aus Polyvinylamin, Polyethylenimin und mit endständigen Aminogruppen modifiziertem Polysiloxan ausgewählt ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 8, wobei zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats vernetzt ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 14, wobei das vernetzte Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat ist, bei dem ein Polyhydroxyalkanoat, das mindestens eine Monomereinheeit mit einer Epoxygruppe enthält, vernetzt ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 14 oder 15, wobei das vernetzte Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat ist, das mit mindestens einer der Verbindungen bzw. Maßnahmen vernetzt ist, die aus einer Diaminverbindung, einem Succinsäureanhydrid, 2-Ethyl-3-methylimidazol und Bestrahlen mit Elektronenstrahlen ausgewählt sind.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 16, wobei die Diaminverbindung Hexamethylendiamin ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei im Liposom eine von einem Lipid verschiedene Substanz enthalten ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 18, wobei die Substanz eine Pigmentsuspension, ein Farbstoff, eine Komponente einer Agrochemikalie, Hämoglobin, eine kosmetische Komponente, eine Düngemittelkomponente oder eine pharmazeutisch wirksame Komponente ist.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Molekulargewicht des Polyhydroxyalkanoats im Bereich von 1000 bis 10000000 liegt.
Mit Polyhydroxyalkanoat beschichtetes Liposom nach Anspruch 20, wobei das Molekulargewicht des Polyhydroxyalkanoats im Bereich von 3000 bis 1000000 liegt.
Verfahren zur Herstellung eines mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms, wobei zumindest ein Teil der Außenwand des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat beschichtet ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Immobilisieren von Polyhydroxyalkanoat-Synthase auf der Oberfläche des in einem wäßrigen Medium dispergierten Liposoms; Zugeben von 3-Hydroxyacyl-CoA als Substrat; und Beschichten von zumindest einem Teil der Oberfläche des Liposoms mit Polyhydroxyalkanoat, indem die Polyhydroxyalkanoat-Synthesereaktion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Polyhydroxyalkanoat aus mindestens einer der Monomereinheiten besteht, die aus Monomereinheiten der Formeln [1] bis [10] ausgewählt sind, und jedes entsprechende 3-Hydroxyacyl-CoA aus 3-Hydroxyacyl-CoA ausgewählt ist, das mit den Formeln [12] bis [21] angegeben wird:
(worin das Symbol „a" eine ganze Zahl darstellt und die Kombination aus R1 und „a" ausgewählt ist aus: einer Kombination aus einem Wasserstoffatom und irgendeiner ganzen Zahl von 0 bis 10; einer Kombination aus einem Halogenatom und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; einer Kombination aus einer chromophoren Gruppe und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; einer Kombination aus einer Carboxylgruppe oder einem Salz davon und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 10; und einer Kombination von
und irgendeiner ganzen Zahl von 1 bis 7),
(worin b irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R2 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin c irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R3 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin d irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt und R4 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇, ausgewählt ist),
(worin e irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt und R5 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ , -C₃F₇ -CH₃, -C₂H₅ und -C₃H₇, ausgewählt ist),
(worin f irgendeine ganze Zahl von 0 bis 7 darstellt),
(worin g irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 darstellt),
(worin h irgendeine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt und R6 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -COOR', -SO₂R", -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇ -CH(CH₃)₂ und -C(CH₃)₃ ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, -CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus -OH, -ONa, -OK, einem Halogenatom, -OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist),
(worin i irgendeine ganze Zahl von 1 bis 7 darstellt und R7 aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -OOOR' und -SO₂R" ausgewählt ist, wobei R' aus einem Wasserstoffatom (H), Na, K, – CH₃ und -C₂H₅ ausgewählt ist und R" aus -ON, -ONa, -OK, einem Halogenatom, -OCH₃ und -OC₂H₅ ausgewählt ist),
(worin j irgendeine ganze Zahl von 1 bis 9 darstellt),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, das Symbol „a" eine ganze Zahl darstellt und die Kombination aus R1 und a definiert ist wie die Kombination aus R1 und a in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [1] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und b und R2 entsprechend definiert sind wie b und R2 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [2] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und c und R3 entsprechend definiert sind wie c und R3 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [3] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und d und R4 entsprechend definiert sind wie d und R4 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [4] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und e und R5 entsprechend definiert sind wie e und R5 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [5] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und f definiert ist wie f in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [6] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und g definiert ist wie g in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [7] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und h und R6 entsprechend definiert sind wie h und R6 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [8] angegeben wird),
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und i und R7 entsprechend definiert sind wie i und R7 in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [9] angegeben wird) und
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und j definiert ist wie j in der Monomereinheit, die mit der vorstehend aufgeführten Formel [10] angegeben wird).
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine hydrophile funktionelle Gruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine anionische funktionelle Gruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Carboxylgruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Monomereinheit des Polyhydroxyalkanoats mit der Carboxylgruppe mindestens eine ist, die aus Monomereinheiten der Formel [11] ausgewählt ist, und das 3-Hydroxyacyl-CoA, das jeder der Monomereinheiten entspricht, mindestens eines ist, das aus 3-Hydroxyacyl-CoA der Formel [22] ausgewählt ist:
(worin k irgendeine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt)
(worin -SCoA ein CoA darstellt, das an Alkansäure gebunden ist, und k definiert ist wie k in der Monomereinheit, die mit der Formel [11] angegeben wird).
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die Zusammensetzung des 3-Hydroxyacyl-CoA einer zeitlichen Änderung unterliegt, wodurch die Zusammensetzung der 3-Hydroxyalkansäure-Einheit des Polyhydroxyalkanoats in Richtung von der Innenseite des mit Polyhydroxyalkanoat beschichteten Liposoms zu dessen Außenseite geändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei das Verfahren ferner einen Schritt umfaßt, bei dem zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats, mit dem das Liposom überzogen ist, chemisch modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Schritt des chemischen Modifizierens ein Schritt ist, bei dem zumindest einem Teil des Polyhydroxyalkanoats eine Pfropfkette hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Schritt des Hinzufügens einer Pfropfkette ein Schritt ist, bei dem zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats mit einer Verbindung umgesetzt wird, die eine endständige reaktive funktionelle Gruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei das Polyhydroxyalkanoat mindestens eine Monomereinheit mit einer Epoxygruppe enthält.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei die Verbindung mit einer endständigen reaktiven funktionellen Gruppe eine Aminogruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Verbindung mit einer Aminogruppe eine mit einer endständigen Aminogruppe modifizierte Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die mit endständigen Aminogruppen modifizierte Verbindung aus Polyvinylamin, Polyethylenimin und mit endständigen Aminogruppen modifiziertem Polysiloxan ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Schritt des chemischen Modifizierens ein Schritt ist, bei dem zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats vernetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Vernetzungsschritt ein Schritt ist, bei dem zumindest ein Teil des Polyhydroxyalkanoats mit einem Vernetzungsmittel umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, wobei das Polyhydroxyalkanoat mindestens eine Monomereinheit mit einer Epoxygruppe enthält.
Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, wobei das Vernetzungsmittel mindestens eines ist, das aus einer Diaminverbindung, Succinsäureanhydrid und 2-Methyl-4-methylimidazol ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Diaminverbindung Hexamethylendiamin ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Vernetzungsschritt ein Schritt ist, bei dem das Polyhydroxyalkanoat mit Elektronenstrahlen bestrahlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 41, wobei das Polyhydroxyalkanoat synthetisierende Enzym von einem Mikroorganismus, der das Enzym produzieren kann, oder einer Transformante produziert wird, die ein Gen aufweist, das mit diesem Produktionsvermögen assoziiert ist, das in einen Wirt eingeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, ein Mikrooroganismus ist, der zu Pseudomonas sp. gehört.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierende Enzym produzieren kann, mindestens ein Mikroorganismus ist, der aus Pseudomonas putida P91 (FERM BP-7373), Pseudomonas cichorii N45 (FERM BP-7374), Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376) ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, ein Mikrooroganismus ist, der zu Burkholderia sp. gehört.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, mindestens ein Mikroorganismus ist, der aus Burkholderia cepacia KK01 (FERM BP-4235), Burkholderia sp. OK3 (FERM P-17370) und Burkholderia sp. OK4 (FERM BP-17371) ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, ein Mikrooroganismus ist, der zu Alcaligenes sp. gehört.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, Alcaligenes sp. TL2 (FERM BP-6913) ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, ein Mikrooroganismus ist, der zu Ralstonia sp. gehört.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei der Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat synthetisierendes Enzym produzieren kann, Ralstonia eutropha TB64 (FERM BP-6933) ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Wirts-Mikroorganismus Escherichia coli ist.