DE602004013021T3

DE602004013021T3 - Herstellung eines alpha-1-proteinaseinhibitors im grossmassstab und dessen verwendung

Info

Publication number: DE602004013021T3
Application number: DE602004013021T
Authority: DE
Inventors: Shabtai Bauer
Original assignee: Kamada Ltd
Current assignee: Kamada Ltd
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2012-04-05
Anticipated expiration: 2024-09-23
Also published as: WO2005027821A3; EP1664123B1; DK1664123T4; SI1664123T2; PL1664123T5; EP1664123B2; CA2538998C; US20110092444A1; ES2305845T5; DE602004013021T2; EP1664123A2; WO2005027821A2; DE602004013021D1; CA2538998A1; AU2004273696A1; SI1664123T1; US20080139465A1; EP1664123A4; IL174410A0; ES2305845T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API) von einem Proteingemisch, Zusammensetzungen, die den gleichen umfassen und die Verwendung davon. Insbesondere, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Massenreinigung von API aus Blutplasma oder Plasmafraktionen, um ein API einer Arzneimittelqualität zu erhalten.
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte für therapeutische Zwecke und andere Anwendungen nützliche Plasmaproteine können lediglich von gepoolten bzw. vereinigten Blutspenden erhalten werden. Eine rekombinante Herstellung von Plasmaproteinen wird durch die Tatsache kompliziert, dass diese Proteine genaue Glycosylierungsmuster erfordern, um deren Funktion und/oder Halbwertzeit im menschlichen Körper zu erhalten. Folglich ist selbst mit den Begleitrisiken einer viralen oder anderen Verunreinigung die einzige zugelassene verfügbare Quelle für einige Proteine, wie beispielsweise Alpha-1 Proteinaseinhibitor, das menschliche Plasma selbst.
Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API) ist ein Abkömmling des menschlichen Plasmas, der zu der Familie der Serin-Proteinaseinhibitoren gehört. Er ist ein Glycoprotein mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 50.600 Dalton, das in der Leber hergestellt und in das Kreislaufsystem sekretiert bzw. sezerniert wird. Das Protein ist ein Polypeptid mit einer einzelnen Kette, an der mehrere Oligosaccharideinheiten kovalent gebunden vorliegen. API weist eine Rolle bei der Steuerung bzw. Kontrolle der Gewebezerstörung durch endogene Serinproteinasen auf und stellt den am weitesten verbreiteten Serin-Proteinaseinhibitor im Blutplasma. Unter anderem werden von API Trypsin, Chymotrypsin, verschiedene Typen von Elastasen, Hautkollagenase, Renin, Urokinase und Proteasen der polymorphkernigen Lymphozyten gehemmt.
API wird gegenwärtig für die Behandlung eines Lungenemphysems in Patienten, die eine genetische Störung bei API aufweisen, therapeutisch verwendet. Gereinigtes API wurde als eine Ersatztherapie in diesen Patienten zugelassen. Die normale Rolle von API besteht in der Regulation der Aktivität der Elastase von Leukozyten, die in der Lunge vorhandene fremde Proteine abbaut. Ist API nicht in ausreichenden Quantitäten vorhanden, um die Elastase-Aktivität zu hemmen, baut die Elastase Lungengewebe ab. Mit der Zeit führt dieses Ungleichgewicht zu einer chronischen Schädigung des Lungengewebes und zum Emphysem.
API wurde ebenfalls als eine Behandlung für Patienten vorgeschlagen, die homozygot für die fehlerhaften Gene des transmembranen Conductance Regulator (CFTR) der zystischen Fibrose (CF) sind, die an wiederholten endobronchialen Infektionen und Sinusitis, fehlerhafter Absorption aufgrund einer Pankreasstörung, einer obstruktiven hepatobiliären Erkrankung und verringerter Fruchtbarkeit leiden. Der Hauptgrund der Morbidität und Mortalität unter CF Patienten besteht in den Lungenkrankheiten. CFTR reguliert den Transport von Wasser und Salzen in die epithelialen Zellen, die die inneren und äußeren Oberflächen des Körpers bedecken. In CF Patienten ist das CFTR Protein aufgrund einer Mutation fehlerhaft, was zu einem fehlerhaften Wasser und Salztransport und der Produktion von dicken Sekreten in einigen Organen (beispielsweise Lunge, Pankreas) führt.
Der Membrandefekt, der durch die CFTR Mutation bewirkt wird, führt zu einer chronischen Entzündung der Lunge und einer Infektion. Eine chronische Infektion der unteren Atmung ruft eine persistierende entzündliche Antwort in den Atemwegen hervor, was zu einer chronischen obstruktiven Erkrankung führt. Da sich Lungenreserven verringern, werden CF Patienten anfällig für Episoden einer Verschlimmerung, die durch eine Verschlechterung der Symptome einer Infektion der Atemwege, insbesondere durch Pseudomonas aeruginosa, charakterisiert ist, was durch eine akute Abnahme der Lungenfunktion begleitet ist. Bei normalen Individuen wird die durch Neutrophile als Reaktion auf eine Infektion sekretierte Elastase durch API neutralisiert, der bekannt ist in das Lungengewebe einzudringen. In Patienten mit CF wird jedoch die nicht regulierte entzündliche Reaktion das/die normale Protease (Elastase)/Anti-Protease (API) Gleichgewicht bzw. Balance überrennt bzw. begräbt. Der anormale Zyklus ist zerstörerisch selbst perpetuierend und selbst ausweitend: erhöhte Elastase führt zu der Rekrutierung von mehr Neutrophilen in der Lunge, die wiederum zusätzliche Proteasen sekretieren. Dies führt zu einer Anhäufung von Elastase in der Lunge und schließlich zu einer Gewebeschädigung, Zerstörung der Lungenarchitektur, schwerer bzw. ernster Lungenfehlfunktion und schließlich zum Tode. Es wurde vorgeschlagen, dass ein Zusatz bzw. eine Ergänzung von zusätzlichem API die schädlichen Wirkungen, die mit den übermäßigen Mengen von Elastase assoziiert sind; verringern kann. Der Bedarf an API übersteigt bereits die Verfügbarkeit des gegenwärtigen Angebots, wobei dieses Problem noch ausgeprägter werden kann, da die Forschung zusätzliche therapeutische Verwendungen von API nahe legt. Um die verfügbare Versorgung mit API zu maximieren, sollte ein Verfahren zur Reinigung von API aus menschlichem Plasma die höchst mögliche Ausbeute aufweisen, und alternative Quellen sollten berücksichtig werden. Daher sind wirksamere Mittel einer Isolation erforderlich, die für eine GMP (gute Herstellungspraxis) Massenproduktion geeignet sind.
Verschiedene Gruppen berichteten eine Herstellung von rekombinantem API. (Beispielsweise G. Wright et al., Biothechnology, Vol. 9, S. 830–834 (1991), A. L. Archibald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 87, S. 5178–5182 (1990)). Gegenwärtig ist jedoch menschliches Plasma die einzige zugelassene Quelle von therapeutischen APIs.
Es wurden verschiedene Verfahren einer Reinigung von API aus menschlichem Plasma beschrieben. Der Hauptteil dieser Verfahren ist auf eine Isolation im Labormaßstab gerichtet, während andere die Produktion auf einem gewerblichen Niveau betreffen. Es werden einige Verfahren einer Isolation offenbart, beispielsweise in der US-P-4,379,087 und 5,610,285 . Zahlreiche frühe Verfahren verwendeten eine Ammoniumsulfatpräzipitation von menschlichem Plasma, gefolgt durch eine Dialyse, weitere Anwendung eines chromatographischen Schrittes auf DEAE-Cellulose. Die für die Dialyse beschriebenen Verfahren sind jedoch nicht einfach auf eine Massenreinigung übertragbar und sind lange, zeitaufwendige Prozesse, die wahrscheinlich die Aktivität der isolierten Proteine gefährden.
Eine Massenreinigung von API aus menschlichem Plasma wurde von Kress et al., (Preparative Biochem., 3: 541–552, 1973) offenbart. Das Präzipitat aus der Behandlung mit 80% Ammoniumsulfat von menschlichem Plasma wurde dialysiert und auf DEAE-Cellulose chromatographiert. Das erhaltene Konzentrat wurde erneut dialysiert und auf SEPHADEX^TM G-100 einer Gelfiltration unterzogen. Die das API beinhaltenden Fraktionen wurden zweimal auf DE-52-Cellulose chromatographisch behandelt, um API zu ergeben.
Glaser et al., (Preparative Biochem., 5: 333–348, 1975) isolierten API aus der Cohn Fraktion IV-1 Paste. Bei diesem Verfahren wurde die gelöste IV-1 Fraktion auf DEAE-Cellulose, QAE-SEPHADEX^TM, Concanavalin-A-SEPHAROSE^TM und SEPHADEX^TM G-150 chromatographisch aufgetrennt, um API zu ergeben. Glaser et al., erreichten jedoch lediglich eine Gesamtausbeute von Fraktion IV-1 Paste von 30%.
Podiarene et al., (Vopr. Med. Khim. 35: 96–99, 1989) berichteten ein Einschrittverfahren zur Isolation von API aus menschlichem Plasma unter Verwendung einer Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern. Die spezifische Aktivität von API wurde 61,1-fach erhöht, wobei die Ausbeute lediglich 20% aus dem Plasma betrug.
Burnouf et al., (Vox. Sang. 52: 292–297, 1987), die mit dem Cohn-Fraktion Effluent II + III begannen, verwendeten eine DEAE-Chromatographie und eine Größenausschlusschromatographie, um ein 80–90% reines (durch SDS-PAGE) API mit einer Ausbeute von 65–70% von diesem Effluent herzustellen.
Hein et al., (Eur. Respir. J. 9: 16s–20s, 1990) stellten ein Verfahren bereit, bei dem Cohn-Fraktion IV-1 Paste als das Ausgangsmaterial verwendet und eine partielle Präzipitation mit Polyethylenglycol verwendet wird, gefolgt durch eine Anionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Sepharose^TM. Das Endprodukt weist eine Reinheit von ungefähr 60% mit einer Ausbeute von 45% aus der IV-1 Paste auf.
Dubin et al., Prep. Biochem. 20: 63–70, 1990) verwendeten eine zweistufige chromatographische Reinigung, wobei Alpha-PI, C₁-Inhibitor, Alpha-1 Antitchymotrypsin und Alpha-1 Trypsininhibitor zuerst von Blue-Sepharose^TM eluiert wurden und anschließend API durch Gelfiltration gereinigt wurde. Die Reinheit und die Ausbeute wurden nicht angegeben.
US-P-4,749,783 offenbart ein Verfahren, bei dem biologisch nicht aktive Proteine in einer Präparation durch Affinitätschromatographie nach einem Schritt einer Virusinaktivierung entfernt wurden. Diese Basis der Trennung zwischen den nativen und den denaturierten Formen des Proteins war die biologische Aktivität des nativen Proteins gegenüber dem Affmitätsharz und nicht körperliche Unterschiede zwischen den nativen und denaturierten Proteinen.
Ein integriertes System einer Plasmafraktionierung, basierend auf Polyethylenglycol (PEG), wurde durch Hen et al., offenbart (Proceedings of the International Workshop an Technology for Protein Separation and Improvement of Blood Plasma Fractionation, Sept. 7–9, 1977, Reston, Va). Bei dem veröffentlichten Verfahren wurde ein Cohn-Gefrierpräzipitat mit ansteigenden Konzentrationen von PEG vermischt, um vier unterschiedliche PEG Fraktionen zu erhalten. Die vier erhaltenen Fraktionen waren, 0–4% PEG Präzipitat, 4–10% PEG Präzipitat, 10–20% PEG Präzipitat und 20% PEG Überstand. Die 20% PEG Überstandsfraktion war durch Albumin dominiert, wobei sie jedoch ebenfalls das meiste API beinhaltete. Diese Fraktion beinhaltete jedoch ebenfalls zahlreiche andere Proteine, einschließlich dem Alpha-1 sauren Glycoprotein, Antithrombin III, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Transferrin, CI Esteraseinhibitor, Prä-Albumin, Retinol bindendes Protein, Transcortin und Angiotensinogen.
Bei dem Versuch API zu isolieren, kombinierten mehrere andere Gruppen die PEG Präzipitation mit anderen Reinigungsverfahren. Beispielsweise verwenden alle US-P-4,379,087 , 4,439,358 , 4,697,003 und 4,656,254 einen PEG Präzipitationsschritt in dem Verfahren eines Isolieren von API. Die offenbarten Verfahren versuchen jedoch nicht die aktive Form von dem nicht aktiven API zu trennen.
Das japanische Patent Nr. 8-99999 offenbart die Verwendung einer PEG Präzipitation in Kombination mit einem SP-Kationen-Austauscher. Das darin beschriebene Verfahren trennt aktives API nicht vollständig von nicht aktivem APL Die spezifische Aktivität von vollständig aktivem API sollte 1,88 (unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 5,3) betragen, wobei das durch dieses Verfahren erreichte Produkt, zeigt lediglich eine relative Aktivität von 1,0. Außerdem liegt die beste durch Kombination einer PEG Präzipitation und einem SP-Kationenaustauschschritt erreichte Ausbeute bei lediglich 50% und scheint nicht einfach auf ein gewerbliches Produktionsniveau vergrößert werden zu können.
US-P-5,610,285 offenbart ein Reinigungsverfahren, das aufeinander folgende Chromatographieschritte von Anionen- und Kationenaustausch kombiniert. Der anfängliche Chromatographieschritt des Anionaustauschs bindet API an die Säule, wobei ebenfalls zahlreiche verunreinigende Proteine, insbesondere Lipoproteine, gebunden werden. Lipoproteine sind in zahlreichen Materialen massenhaft vorhanden, aus denen API isoliert (beispielsweise Cohn IV-1 Paste) wird, und somit dazu neigen die Säule zu verstopfen. Eine derartige Verstopfung macht Säulen einer bestimmten Größe, zusätzliche Dialyse/Filtrationsschritte, und mindestens zwei Kationen-Chromatographieschritte erforderlich. Jene Erfordernisse verringern die Wirksamkeit und Praktikabilität des Verfahrens für Massenprozesse. Weiterhin bindet in dem Verfahren von '285 alles API, sowohl nicht aktives als auch aktives Protein an die Anionenaustauschsäule. Wird das API gemäß des Verfahrens von der Säule eluiert, das heißt hoher Salzphosphatpuffer, dann löst sich sowohl das aktive als auch das nicht aktive Protein von der Säule. Folglich ist keine Trennung von dem aktivem und dem nicht aktiven Protein erfolgt.
US-P-6,093,804 offenbart ein Verfahren, das eine Entfernung von Lipoproteinen von dem Quellenmaterial, gefolgt durch anschließende Austauschschritte mit Anionen und Kationen kombiniert, was zu einem hoch gereinigten, hoch aktiven API führt. Dieses Verfahren erwies sich als wirksam für eine kleine bis zu einer Herstellung mittleren Umfangs einer Quellenmaterialverarbeitung in dem Bereich von einigen Kilogramm.
Wie vorstehend erwähnt, übersteigt das verfügbare Angebot den Bedarf an API. Folglich besteht ein großer Bedarf für und es wäre äußerst vorteilhaft ein Verfahren für eine Massenproduktion von API bereitzustellen, bei dem Qualität, die sich sowohl auf Reinheit als auch Aktivität bezieht, nicht durch Quantität gefährdet wird. Außerdem wäre es äußerst vorteilhaft, stabile, virusinaktivierte gebrauchsfertige Formulierungen des gereinigten API bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API), das dazu geeignet ist vergrößerte bzw. größere Mengen von Quellenmaterial in dem Bereich von mindestens zehn Kilogramm zu bearbeiten und welches ein hoch reines, hoch aktives API ergibt. Es werden ebenfalls Formulierungen offenbart, die das gereinigte API umfassen, insbesondere flüssige Formulierungen, in denen das API hoch stabil vorliegt und Verfahren, die dieselben verwenden.
Das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Verfahren kombiniert eine Entfernung von verunreinigenden Substanzen (d. h. Lipiden, Lipoproteinen und anderen Proteinen) und eine Trennung durch aufeinander folgende chromatographische Schritte von aktivem und nicht aktivem API. Die vorliegende Erfindung offenbart zum ersten Mal ein Verfahren, das für eine Massenproduktion von API, das heißt zum Bearbeiten von Quellenmaterialmengen in dem Bereich von Dekaden von Kilogramm, geeignet ist. Wenn das erhaltene Quellenmaterial von hoher Qualität ist, das heißt das Quellematerial wird nach Filtration erhalten, dann ist der/das Prozess/Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Bearbeiten der Quellenmaterialmengen in dem Bereich von hunderten Kilogramm geeignet. Bisher waren die beschriebenen Verfahren, die eine hohe Reinheit und Aktivität von API ergeben, erwiesenermaßen lediglich zum Bearbeiten von kleinen bis zu mittelgroßen Mengen von Quellematerial wirksam. Wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, wird eine wirksame API Massenproduktion durch Anwenden einer Kombination von zwei Verfahren für die Entfernung von verunreinigenden Substanzen aus einer ursprünglichen Proteinsuspension, durch die Verwendung von aufeinanderfolgenden Anionen-, Kationen- und Anionenaustauschharzen mit spezifischen Elutionsmitteln und durch Erfüllen der GMP Erfordernisse einer Massenproduktion erreicht. Insbesondere, verwenden die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine minimale Anzahl unterschiedlicher Puffer, eine automatisierte Herstellung von Lösungen, eine Verwendung von Lösungen, die in Umgebungslagerungsbedingungen gehalten werden können und insbesondere, werden Puffer und Reagenzien vermieden, die anfällig für mikrobielle Verunreinigungen sind. Das gereinigte API gemäß der vorliegenden Erfindung ist mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95% rein (das heißt 95% M/M des Gesamtproteins) und das gereinigte API ist mindestens 90% aktiv. Die Ausbeute des offenbarten Massenverfahrens beträgt vorzugsweise 50% von der Cohn IV-1 Paste, und gewöhnlich mindestens 60%.
Gemäß von bestimmten Ausführungsformen liegt das Endprodukt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als eine Flüssigkeit vor, die unmittelbar verwendet werden kann. Diese gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform ist gegenüber dem gegenwärtig verfügbaren Endprodukt in der Form eines Pulvers vorteilhaft, da die flüssige Präparation ungleich dem Pulver kein zusätzliches Trocknen und anschließenden Wiederherstellungsschritte vor einer Verabreichung erforderlich macht. Weiterhin ist das API der vorliegenden Erfindung hoch stabil, wobei dessen Formulierungen, einschließlich der flüssigen Formulierung, keine Stabilisatoren erfordern.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von hoch gereinigtem, aktivem API bereit. Gemäß einer Ausführungsform liegt das Endprodukt des Verfahrens in einer flüssigen Form vor.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API) aus einem nicht gereinigten Gemisch aus Proteinen bereit, umfassend:

a. Dispergieren des API beinhaltenden, nicht gereinigten Proteingemisches in einem wässrigen Medium,
b. Entfernen eines Teils verunreinigender Lipide und Proteine durch Zugabe von Siliziumdioxid zu der wässrigen Dispersion als ein Mittel zum Entfernen von Lipid, und Präzipitieren des Teils verunreinigender Proteine aus der wässrigen Dispersion, indem Polyalkylenglycol zugegeben wird,
c. Laden des API beinhaltenden Überstandes von Schritt (b), der API beinhaltet auf ein erstes Anionen-Austauschharz mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert und eine Leitfähigkeit aufweist, so dass API an dem ersten Anionen-Austauschharz zurückgehalten wird,
d. Eluieren einer API beinhaltenden Fraktion von dem ersten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp wie in Schritt (c), dessen pH-Wert und Leitfähigkeit eingestellt wurde,
e. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (d) auf ein Kationen-Austauschharz in dem gleichen Puffertyp, der einen geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API nicht an dem Kationen-Austauschharz zurückgehalten wird,
f. Gewinnen des Durchflusses von Schritt (e), der API beinhaltet,
g. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (f) auf ein zweites Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, der einen geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API an den zweiten Anionen-Austauschharz bindet,
h. Eluieren von API von dem zweiten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, dessen pH-Wert und Leitfähigkeit so eingestellt wurden, um eine Lösung zu erhalten, die gereinigtes, aktives API enthält.

Gemäß einer Ausführungsform stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigtes API bereit, umfassend mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80%, noch bevorzugter mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% API aus dem Gesamtprotein, worin mindestens 90% vorzugsweise 95% des reinen API aktiv sind.
Überall in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird nur ein Puffertyp verwendet, wobei der pH-Wert und die Leitfähigkeit über die verschiedenen Prozessschritte, wie erforderlich, eingestellt werden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”ein Typ” ”gleicher Typ” oder ”einzelner Typ” von Puffer, der hier austauschbar verwendet wird, auf einen Puffer mit einer spezifischen Anionenspezies.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Puffer eine beliebig geeignete Säure/Salz Kombination, die in Bereichen des pH-Werts eine verträgliche Pufferkapazität bereitstellt, die überall in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. In dem Verfahren wird gemäß von bevorzugten Ausführungsformen ein anderer Puffer als ein auf Citrat basierender Puffer verwendet. Gemäß noch einer andren Ausführungsform liegt das Pufferanion als Acetat vor. gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt die Pufferlösung als Natriumacetat vor.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin Virusentfernungs- und/oder Virusinaktivierungsschritte. Verfahren für eine Virusentfernung und Inaktivierung sind im Stand der Technik bekannt.
Ein Verfahren für eine Virusentfernung ist eine Filtration, vorzugsweise eine Nano-Filtration, die sowohl um- bzw. eingehüllte als auch nicht eingehüllte Viren entfernt. Gemäß einer Ausführungsform umfasst der Virusentfernungsschritt eine Filtration. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Schritt der Virusentfernung nach der Kationenaustauschchromatographie ausgeführt. Gewöhnlich wird die Durchflusslösung des Kationenaustauschs, die API beinhaltet, konzentriert und ansschließend nano-filtriert.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die durch die vorliegende Erfindung angewendete Virusinaktivierung eine Lösungsmittel/Detergens (S/D) Behandlung. Der Schritt der Virusinaktivierung wird vorzugsweise vor einem Laden der Lösung auf das zweite Anionenaustauschharz ausgeführt. Gemäß einer Ausführungsform ist das verwendete Detergens Polysorbat und das Lösungsmittel ist Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP). Gemäß einer anderen Ausführungsform liegt das Polysorbat als Polysorbat 80 vor. Gemäß einer Ausführungsform kann Polysorbat 80 von ungefähr 0,8% bis ungefähr 1,3% Volumen pro Masse (V/M) (volume per weight) des erhaltenen Gemischs zugegeben werden und TnBP kann von ungefähr 0,2% bis ungefähr 0,4% Massenanteil (weight per weight) des erhaltenen Gemischs zugegeben werden.
Irgendein nicht gereinigtes Proteingemisch, das eine wesentliche Menge von API beinhaltet kann als ein Ausgangsmaterial für die Reinigung von API gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform wird das API beinhaltende Proteingemisch ausgewählt unter Plasma, insbesondere von Plasma Cohn-Fraktionen IV Paste. Gemäß einer anderen Ausführungsform liegt das API beinhaltende Proteingemisch als Cohn-Fraktion IV-1 Paste vor.
Gemäß mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das nicht gereinigte Proteingemisch, das API umfasst, in Wasser dispergiert, und der pH-Wert der Dispersion wird auf einen pH-Wertbereich von ungefähr 8,0 bis ungefähr 9,5 eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts stabilisiert das API und fördert die Lösung des API in der Dispersion, wodurch die Produktionsausbeute ansteigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung liegt das für die Entfernung von Lipiden und Lipoproteinen von der nicht gereinigten Proteinsuspension verwendete Lipidentfernungsmittel als Siliziumdioxid (Aerosil^TM) vor, wobei die verunreinigenden Proteine aus der Suspension mit Polyalkylenglycol präzipitiert werden. Gemäß einer Ausführungsform liegt der Polyalkylenglycol als Polyethylenglycol vor. Gemäß noch einer anderen Ausführungsform wird der pH-Wert der Dispersion vor der Zugabe von Polyalkylenglycol verringert. Gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert auf einen pH-Wertbereich von ungefähr 5,0 auf ungefähr 6,5 verringert. Die Verringerung des pH-Werts verbessert die Präzipitation, wobei die Lipidentfernungsmittel und das Präzipitat aus der Suspension entfernt werden. Eine Entfernung des Präzipitats von der Lösung kann durch verschiedene dem Fachmann bekannte Verfahren ausgeführt werden, einschließlich Zentrifugation und Filtration, insbesondere Filter-Druck/Press Filtration. Der Überstand von diesem Schritt liegt in einem Bereich des pH-Wertes der für die erste Anionenaustauschchromatographie (pH-Wert von ungefähr 5,0 bis ungefähr 6,5) geeignet ist. Um den Überstand weiter für ein Laden auf das Anionenaustauschharz vorzubereiten, wird dessen Leitfähigkeit von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 mS/cm eingestellt.
Gemäß bestimmter Ausführungsformen ist das erste und das zweite Anionenaustauschharz ein DEAE-Sepharose-Harz und das Kationen-Austauschharz ist ein Carboxymethyl-Sepharose-Harz. Die sequentiellen Chromatographieschritte gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden mit einem einzelnen Puffertypen überall in dem gesamten Verfahren ausgeführt. Individuelle sequentielle Schritte werden unter unterschiedlichen Bedingungen des pH-Wertes und der Leitfähigkeit ausgeführt, um die geeigneten/passenden Bedingungen bereitzustellen, die bei jedem dieser Schritte erforderlich sind. Die Einstellung des pH-Wertes und der Leitfähigkeit in dem Puffer kann durch ein beliebiges dem Fachmann bekanntes Verfahren ausgeführt werden.
Es wurde vor kurzem gezeigt, dass die Trennung von aktivem von nicht aktivem API durch eine Anionenaustauschchromatographie ausgeführt werden kann. Das Kationen-Austauschharz wird verwendet, um die API beinhaltende Fraktion von Substanzen weiter zu reinigen, die das Kationen-Austauschharz binden, während das API durch das Harz durchgeführt wird. Gemäß einer Ausführungsform wird der pH-Wert der API beinhaltenden Fraktion zwischen 5,3 und 5,6 und die Leitfähigkeit von ungefähr 0,8 bis ungefähr 1,1 mS/cm eingestellt, bevor die API beinhaltende Fraktion auf das Kationen-Austauschharz geladen wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zum Trennen von aktivem API von anderen verunreinigenden Substanzen, einschließlich Lösungsmittel-/Detergens-Verbindugen, die, wie vorstehend beschrieben, für eine Virusinaktivierung verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform wird diese Trennung durch die zweite Anionenaustauschchromatographie vorteilhaft erreicht. Gemäß einer Ausführungsform wird vor einem Laden auf das zweite Anionenaustauschharz der pH-Wert der API beinhaltenden Fraktion von ungefähr 6,0 bis ungefähr 8,0 und die Leitfähigkeit von ungefähr 2,0 bis ungefähr 4,0 mS/cm eingestellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin die Schritte eines Änderns der Ionen-Zusammensetzung der Lösung, die gereinigtes, aktives API beinhaltet, um ein physiologisch verträgliches Ion bereitzustellen/zu beinhalten und Sterilisieren der erhaltenen Lösung, um eine flüssige bzw. fluide pharmazeutische Präparation herzustellen.
Gemäß einer Ausführungsform wird vor dem Ionenaustausch die das gereinigte aktive API beinhaltende Lösung konzentriert. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das physiologisch verträgliche Ion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphation, Chloridion und Kombinationen davon. Gewöhnlich liegt der pH-Wert der pharmazeutischen Präparation bei ungefähr 7,0. Gemäß einer noch anderen Ausführungsform wird die Proteinkonzentration der das gereinigte aktive API beinhaltenden Lösung vor einer Sterilisierung auf den Bereich von 20–40 mg/mL eingestellt.
Es wird ebenfalls eine pharmazeutische Präparation offenbart, die ein gereinigtes aktives API umfasst, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wurde. Es wird weiterhin eine pharmazeutische Präparation offenbart, die gereinigtes, aktives API in der Form einer sterilen gebrauchsfertigen Lösung umfasst. Diese Lösung kann für therapeutische, diagnostische oder Reagenzzwecke verwendet werden.
Die fluide pharmazeutische Präparation kann mindestens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 99% von dem Gesamtproteinen umfassen. Mindestens 90% des API kann in dessen aktiver Form vorliegen. Gewöhnlich beinhaltet die pharmazeutische Präparation von ungefähr 1% bis ungefähr 3% API, vorzugsweise ungeführ 2% API:
Die fluide pharmazeutische Präparation kann frei von einem Stabilisierungsmittel sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”Stabilisierungsmittel” auf eine Verbindung, die den aktiven Bestandteil (hier API) innerhalb der pharmazeutischen Präparation stabilisiert. ”Stabilisierung” bezieht sich auf das Verfahren einer Verhinderung des Verlustes einer spezifischen Aktivität und/oder Änderungen in der Sekundärstruktur von den nativen Glycoproteinen. Derartige Stabilisatoren schließen gewöhnlich Albumin, Sucrose und Mannitol ein.
Das API in der fluiden pharmazeutischen Präparation kann für mindestens 3 Monate, vorzugsweise 4 Monate, noch bevorzugter 6 Monate stabil sein, wenn die pharmazeutische Präparation bei einem Temperaturbereich zwischen 20°C bis 25°C gelagert wird.
Das API in der fluiden pharmazeutischen Präparation ist mindestens für 12 Monate, vorzugsweise 24 Monate, noch bevorzugter 36 Monate stabil, wenn die pharmazeutische Präparation bei einem Temperaturbereich von zwischen 2°C bis 8°C gelagert wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”stabil” auf die API Aktivität am Ende der Lagerungszeit, die mindestens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 100% der anfänglichen API Aktivität aufweist.
Es wird ebenfalls eine pharmazeutisch Zusammensetzung offenbart, die als einen aktiven Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge von API umfasst, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, weiter umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträger, Verdünner oder Träger.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann mindestens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 99% API von den Gesamtproteinen umfassen. Mindestens 90% des API kann in dessen aktiver Form vorliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können in herkömmlicher Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern formuliert sein, die ein Bearbeiten der aktiven Verbindungen in Präparationen fördern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Eine genaue Formulierung ist von der gewählten Verabreichungsroute abhängig.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte API kann in der Form, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wässriger Lösung und einem Pulver, formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ebenfalls frei von einem Stabilisator sein.
Für eine Injektion können die Verbindungen der Erfindung in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie beispielsweise Hank's-Lösung, Ringerlösung, oder physiologischem Salzlösungspuffer.
Für eine Verabreichung durch Inhalation wird das gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellte flüssige bzw. fluide API in der Form eines Aerosolsprays, einer unter Druck stehenden Packung oder einem Zerstäuber herkömmlich zugeführt. Ein Aerosolspray wird gewöhnlich mit einem geeigneten Treibmittel, wie beispielsweise Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluormethan, oder Kohlendioxid bereitgestellt. In dem Fall eines unter Druck stehenden Aerosols, kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen einer Einrichtung bestimmt werden, die ein Ventil umfasst, um eine gemessene Menge abzuliefern. Alternativ kann das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte API in lyophylisierter bzw. gefriergetrockneter Pulverform mit einer geeigneten Pulverbasis, beispielsweise Laktose oder Stärke, vermischt werden, um Kapseln oder Kartuschen bzw. Patronen von, beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator zu bilden.
Die fluide pharmazeutische Präparation kann vorzugsweise dazu verwendet werden ein Aerosolspray zur Inhalation zu bilden.
Das gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellte API kann zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenemphysem, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, zystischer Fibrose assoziierten Krankheiten und Störungen bzw. Erkrankungen, Psoriasis und atopischer Dermatitis.
Die therapeutisch wirksame Menge von API kann intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung, Figuren und Ansprüchen ausführlich beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 beschreibt das Proteinprofil eines Tris-Glycin-Gradientengels während des Herstellungsprozesses von API. 1A: Coomassie-Blau gefärbtes Gel. 1B: Ponceau-S gefärbtes Gel. 1C: Immunoblot mit Ziege Anti-API, mit HRP konjugierten Antikörper. Spuren des Gels sind die folgenden: 1,2 – Arzneiendprodukt, 3,4 – betriebseigener API Standard, 5 – Albumin; 6 – Transferrin; Anti-D (IgG); 8, 9, 10 – polymere Fraktion von API.
2 beschreibt das Proteinprofil auf einem 4%–12% SDS-PAGE Gradienten während des API Herstellungsprozesses. 2A: Coomassie-Blau gefärbtes Gel. 2B: Ponceau-S gefärbtes Gel. 2C: Immunoblot mit Ziege anti-API, mit HRP konjugierten Antikörpern. Die Spuren der Gele sind die folgenden: 1 – Probenpuffer, 2,3 – Dispersion vor der Zugabe von Aerosil, 4, 5: Dispersion vor der Zugabe von PEG; 6,7: Eluate nach erster Anionenaustauschchromatographie, 8, 9: Filtrat nach Kationenaustauschchramatographie, 10: Eluat nach zweiter Anionenaustauschchromatographie, 11: Endprodukt des Verfahrens (Arzneimittelsubstanz), 12, 13 formuliertes API (Arzneimittelprodukt), 14, 15 – gewerblicher beziehungsweise betriebseigener Molekulargewichtsstandards.
3 zeigt fern (3A) und nah (3B) UV Circulardichroismus-Spektren von API-Chargen 6112006, 6113010, 612301 und API Primarreferenz-Standard.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von hoch reinem, aktivem und stabilem Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API) bei einer Massenherstellung bereit. Ein besonderer Vorteil des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahrens besteht in dessen Wirksamkeit beim Bearbeiten von Quellematerial in dem Bereich von zehn bis hunderten von Kilogramm ohne die Reinheit und Aktivität des API-Produktes zu gefährden, das mindestens 90% rein ist, von dem mindestens 90% aktiv sind. Die Menge von Quellenmaterial, das gemäß der Lehre dir vorliegenden Erfindung bearbeitet werden kann, ist abhängig von der Qualität des Quellenmaterials (höhere Mengen können bearbeitet werden, wenn das Material gefiltert vorliegt). Weiterhin kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein flüssiges gebrauchsfertiges Produkt erhalten werden, das hoch stabiles API umfasst.
Definitionen
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”Alpha-1 Proteinaseinhibitor” (API) auf ein Glycoprotein, das durch die Leber hergestellt und in den Kreislauf sezerniert wird. API zählt zu der Serin-Proteinaseinhibitor(Serpin)-Familie proteolytischer Inhibitoren. Dieses Glycoprotein mit einem MW von 50,600 Da besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette, die einen Cysteinrest und 12–13% Kohlenhydrate des gesamten Molekulargewichts beinhaltet. API weist drei N-Glycosylierungsstellen an Asparaginresten 46, 83 und 247 auf, die durch Gemische von komplexen bi- und tri-antennenartigen Glykanen besetzt sind. Dies führt zu zahlreichen API Isoformen mit einem isoelektrischen Punkt in dem Bereich von 4,0 bis 5,0. Die Glykanmonosaccharide schließen N-Acetyl-Glucosamin, Mannose, Galactose, Fucose und Sialinsäure ein. API dient als ein Pseudosubstrat für Elastase, wobei Elastase die reaktive Zentralschleife des API Moleküls angreift, in dem die Bindung zwischen den Resten Methionin₃₅₈-Serin₃₅₉ gespalten wird, um einen API-Elastase-Komplex zu bilden. Dieser Komplex wird schnell aus der Blutzirkulation entfernt. API wird ebenfalls als ”Alpha-1 Antitrypsin” (AAT) bezeichnet. Der, wie hier verwendete, Ausdruck ”Glycosylierung” bezieht sich auf ein Protein oder Peptid, das an ein Kohlenhydrat kovalent gebunden vorliegt. Das Kohlenhydrat kann monomer oder aus Oligosacchariden zusammengesetzt sein.
Der Ausdruck ”zystische Fibrose” bezieht sich auf eine vererbte autosomale rezessive Störung, die durch Mutationen in dem Gen bewirkt wird, das für den zystischen Fibrose transmembranen Conductance Regulator (CFTR) Cl^– Kanal kodiert.
Der Ausdruck ”Emphysem” bezieht sich auf einen Zustand, bei dem eine Verminderung bei der Atmungsfunktion und häufig eine Atemlosigkeit, aufgrund einer Überaufblähung der Alveoli in den Lungen auftritt, was sich aus dem Schaden ergibt, der durch die zerstörerische Neutrophilen-Elastase an den Wänden der Alveoli erzeugt wurde.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”API beinhaltende pharmazeutische Präparation” oder ”fluide pharmazeutische Präparation” auf die Lösungszusammensetzung, die das gereinigte API beinhaltet, wie es am Ende des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten wird. Der Ausdruck ”pharmazeutische Zusammensetzung” bezieht sich auf die vorstehend erwähnte pharmazeutische Präparation, die weiterhin Arzneistoffträger, Verdünner oder Träger umfasst. Die ”pharmazeutische Präparation” gemäß der vorliegenden Erfindung liegt immer in der Form einer Flüssigkeit vor, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung in einer beliebig geeigneten Verabreichungsform, wie im Stand der Technik bekannt, vorliegen kann.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von API aus einem nicht gereinigten Proteingemisch bereit, umfassend:

a. Dispergieren des API beinhaltenden, nicht gereinigten Proteingemisches in einem wässrigen Medium,
b. Entfernen eines Teils verunreinigender Lipide und Proteine durch Zugabe von Siliziumdioxid zu der wässrigen Dispersion als ein Mittel zum Entfernen von Lipid und Präzipitieren des Teils verunreinigender Proteine aus der wässrigen Dispersion, indem Polyalkylenglycol zugegeben wird,
c. Laden des API beinhaltenden Überstandes von Schritt (b), der API beinhaltet auf ein erstes Anionen-Austauschharz mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert und eine Leitfähigkeit aufweist, so dass API an dem ersten Anionen-Austauschharz zurückgehalten wird,
d. Eluieren einer API beinhaltenden Fraktion von dem ersten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp wie in Schritt (c), dessen pH-Wert und Leitfähigkeit eingestellt wurde,
e. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (d) auf ein Kationen-Austauschharz in dem gleichen Puffertyp, der einem geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API nicht an dem Kationen-Austauschharz zurückgehalten wird,
f. Gewinnen des Durchflusses von Schritt (e), der API beinhaltet,
g. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (f) auf ein zweites Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, der einen geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API an dem zweiten Anionen-Austauschharz bindet,
h. Eluieren von API von dem zweiten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, dessen pH-Wert und Leitfähigkeit so eingestellt wurden, um eine Lösung zu erhalten, die gereinigtes, aktives API enthält.

Dieses Verfahren stellt API Fraktionen von mindestens ungefähr 90% API von dem Gesamtprotein bereit, stellt häufig Fraktionen von größer als ungefähr 95% reinem API bereit und kann Fraktionen von 99% reinem API erreichen. Von dem API ist mindestens 90% aktiv. Es werden ebenfalls mindestens 95% aktives API erreicht. Die Aktivität von API wird, wie nachfolgend beispielhaft erläutert, durch eine Trypsinhemmung bzw. -inhibition erfasst.
Es wurde vorhergehend offenbart, dass eine Anionenaustauschchromatographie die prinzipielle Stufe darstellt, bei der das aktive API von nicht aktivem API getrennt wird ( US-P-6,093,804 ). Das in dem US-Patent beschriebene Verfahren, das auf eine kleine bis Kleinmaßstab-Herstellung angepasst war, verwendet jedoch verschiedene Puffertypen, um eine derartige Trennung (Laden des Anionenaustauschs mit Nicht-Citrat-Puffer und Eluieren einer API beinhaltenden Fraktion mit einem auf Citrat basierenden Puffer) zu erreichen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Erfordernisse einer Massenproduktion erfüllt, von denen eines die Verwendung von einem Puffertypus in allen chromatographischen Schritten offenbart, während der pH-Wert und die Leitfähigkeit des Puffers, wie überall in den verschiedenen Verfahrensschritten erforderlich, eingestellt werden.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Puffer eine beliebig geeignete Säure/Salz Kombination, die eine verträgliche Pufferkapazität in Bereichen des pH-Wertes überall in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen wird in dem Verfahren ein anderer Puffer als ein auf Citrat basierender Puffer verwendet. Gemäß einer Ausführungsform liegt der Anionenpuffer als Acetat vor. Gemäß einer anderen Ausführungsform liegt die Pufferlösung als Natriumacetat vor.
Die Sterilität der Präparationen der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiges Anliegen, da das Produkt, Menschen zu therapeutischen Zwecken, insbesondere durch intravenöse Verabreichung oder durch Inhalation, verabreicht werden soll. Auch wenn das Quellenmaterial Plasma auf die Anwesenheit verunreinigender Viren untersucht wird und größte Bemühungen unternommen werden, um verunreinigte Spenderfraktionen auszuschließen, besteht ein Bedarf weiter sicherzustellen bzw. zu gewährleisten, dass das Endprodukt des Verfahrens virusfrei wäre.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin Virusentfernungs- und/oder Virusinaktivierungsschritte. Eine Virusverminderung kann durch verschiedene Verfahren, einschließlich einer Nano-Filtration; Lösungsmittel/Detergens Behandlung, Iod-Inaktivierung, beispielsweise einer Behandlung mit einem iodinierten Ionenaustauschmatrixmaterial, wie beispielsweise iodiniertem SEPHADEX^TM (wie in der WO 97/48422 und der WO 97/48482 ), Behandlung mit Pathogen inaktivierenden Verbindungen, Wärmeinaktivierung, Gammabestrahlung, oder einem beliebig geeigneten virentötenden Verfahren.
Mit Lipid beschichtete Viren werden durch Behandlung mit nicht ionischen biologisch verträglichen Lösungsmitteln und Detergenzien inaktiviert. Verfahren für eine Vireninaktivierung durch Anwendungen von Lösungsmittel-Detergenzien werden, beispielsweise in EP 0 131 740 beschrieben. Viren, die nicht mit Lipid beschichtet sind, können jedoch nicht durch Behandlungen mit Lösungsmittel-Detergens inaktiviert werden, so dass folglich andere Inaktivierungsverfahren für deren Inaktivierung, einschließlich Eliminierung durch physikalische Mittel, beispielsweise der Filtration der Präparation durch sehr kleine Filterlöcher verwendet werden müssen, um so Viren durch einen Größenausschluss (Nano-Filtration) zu entfernen.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der Schritt der Virenentfernung eine Filtration. Sowohl umhüllte als auch nicht umhüllte Viren werden durch Filtration, vorzugsweise durch Nano-Filtration, oder durch andere im Stand der Technik bekannte Filtrationsverfahren, entfernt. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Virusentfernungsschritt nach der Kationenaustauschchromatographie ausgeführt. Gemäß einer Ausführungsform kann die API beinhaltende Kationenaustausch Durchflusslösung durch Ultrazentrifugation konzentriert werden. Vor der Nano-Filtration kann der pH-Wert des konzentrierten Retentats auf ungefähr 6,8 bis ungefähr 7,7 und dessen Leitfähigkeit auf ungeführ 2,5 bis ungefähr 3,5 mS/cm eingestellt werden. Das Filtrat (”Nano-Filtrat”) wird für den nachfolgenden Schritt einer Virusinaktivierung gewonnen bzw. gesammelt.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das durch die vorliegende Erfindung verwendete Verfahren einer Virusinaktivierung eine Lösungsmittel/Detergens (S/D) Behandlung. Dieser Schritt wird vorzugsweise vor dem Laden der Lösung auf das zweite Anionenaustauschharz ausgeführt. Gemäß einer Ausführungsform ist das verwendete Detergens ein nicht ionisches Detergens, wie beispielsweise Polysorbat, wobei das Lösungsmittel TnBP ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform liegt das Polysorbat als Polysorbat 80 vor. Gemäß einer Ausführungsform kann das Polysorbat 80 von ungefähr 0,8% bis ungefähr 1,3% Massenanteil des sich ergebenden Gemisches und TnBP von ungefähr 0,2% bis ungefähr 0,4% Massenanteil des sich ergebenden Gemisches zugegeben werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die S/D Virusinaktivierung in einem Bereich des pH-Werts zwischen ungefähr 6,0 und 9,0 und einem Leitfähigkeitsbereich zwischen ungefähr 2.0 bis ungefähr 4,0 mS/cm ausgeführt.
Das nicht gereinigte Proteingemisch, aus dem das API gewonnen wird, liegt vorzugsweise als die Cohn Fraktion IV-1 Paste vor, kann jedoch andere Cohn Fraktionen einschließen, getrennt oder in Kombination von menschlichem Blutplasma, Plasmafraktionen oder einer beliebigen API beinhaltenden Proteinpräparation. Beispielsweise ist das gegenwärtige Verfahren auf die Reinigung von rekombinantem menschlichem API aus der Milch transgener Tiere übertragbar. (Wenn Milch als Ausgangsmaterial verwendet werden kann, wird zuerst eine Ammoniumsulfat- oder eine Natriumchlorid-Präzipitation angewendet, um API von Kaseinen zu trennen, und wobei das Präzipitat durch den gegenwärtigen Reinigungsprozess geführt wird.) Gemäß einer Ausführungsform ist das nicht gereinigte Proteingemisch, das API umfasst, in einem wässrigen Medium, vorzugsweise Wasser, mit einem Verhältnis von zwischen ungefähr 20 bis ungefähr 30 Liter pro 1 Kg von Quellenmaterial dispergiert, insbesondere Cohn Fraktion IV-1 Paste. Der pH-Wert der Dispersion wird auf einen Bereich des pH-Werts von ungefähr 8,0 bis ungefähr 9,5 eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts stabilisiert das API und fördert die Lösung des API in der Dispersion, wodurch die Produktionsausbeute erhöht wird. Für einen weiteren Anstieg in der Stabilität von API kann eine Dispersion bei erhöhter Temperatur stattfinden. Gemäß einer Ausführungsform wird eine Dispersion bei einer Temperatur von zwischen 35°C und 40°C ausgeführt oder die Lösung erwärmt.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der leichten Beseitigung von Verunreinigungen oder Nebenprodukten, die andererseits die Wirksamkeit des API Reinigungsverfahrens gefährden. Insbesondere, beinhalten die Präparationen der Cohn Fraktion IV-1 Paste eine signifikante Menge des Lipoproteins APO A-1, das die Wirkung einer Hemmung des Säulenflusses und der Kapazität, während der Reinigung, aufweist. Andere nicht erwünschte Proteine, wie beispielsweise Albumin und Transferrin sind ebenfalls in der Pastenpräparation vorhanden, Entfernen eines Anteils derartiger Verunreinigungen wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch zwei aufeinander folgende Schritte ausgeführt. (a) Entfernen verunreinigender Lipide und Lipoproteine durch ein Lipidentfernungsmittel und (b) Präzipitieren eines Anteils von verunreinigendem Protein von der API beinhaltenden wässrigen Dispersion.
Gemäß der vorliegenden Erfindung liegt das Lipidentfernungsmittel als Siliziumdioxid (Aerosil^TM) vor. Das Aerosil^TM wird mit einem Verhältnis von 1:10 bis 1:14 Aerosil^TM: Kg von IV-1 Paste zugegeben. Dieser Schritt wird bei einem hohen pH-Wert von ungefähr 9,0 ausgeführt, wobei das sich ergebende Gemisch für ungefähr 60–120 Min. bei einer Temperatur zwischen 35°C und 40°C gerührt wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Polyalkylenglycol, beispielsweise Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycol (PPG), zum Präzipitieren des Anteils der verunreinigenden Proteine, verwendet. Es können andere dem Fachmann bekannte Alkohole verwendet werden, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Gemäß einer Ausführungsform wird Polyethylenglycol verwendet. Gemäß einer anderen Ausführungsform weist das in dem Verfahren verwendete PEG ein Molekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000 KDa auf, weist vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen 3.500 und 4.500 KDa auf. Das zu der Lösung zugegebene PEG beträgt mindestens 2% Masse pro Volumen (weight per volume) des gebildeten Gemisches. Gemäß einer Ausführungsform beträgt das zugegebene PEG ungefähr 3% bis 15% Masse pro Volumen des gebildeten Gemisches. Gemäß einer anderen Ausführungsform beträgt das zugegebene PEG zwischen 10 bis 12% Masse pro Volumen des sich ergebenden Gemisches. Vor der Zugabe des Polyalkylenglycols wird die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur (in dem Bereich von ungefähr 20°C bis 25°C) eingestellt und der pH-Wert der Dispersion wird verringert. Die Verringerung des pH-Wertes verbessert die Präzipitation und der Überstand von diesem Schritt befindet sich in einem Bereich des pH-Wertes, der für die erste Anionenaustauschchromatographie geeignet ist. Gemäß einer Ausführungsform wird der pH-Wert auf einen Bereich des pH-Wertes von ungefähr 5,0 bis ungefähr 6,5 durch die Zugabe von, beispielsweise Essigsäure, verringert. Außerdem kann ein Salz, wie beispielsweise Natriumchlorid oder der gleichen zu dem wässrigen Gemisch in einer Menge zugegeben werden, die ausreichend ist, um eine Leitfähigkeit von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 zu erreichen, um den Überstand für ein Laden auf das Anionenaustauschharz weiter zu präparieren. Die Entfernung von verunreinigenden Proteinen ohne einen Verlust von API ermöglicht eine signifikante Verringerung bei der Einrichtungsgröße, beispielsweise der Säulengröße.
Alle vorstehend beschriebenen Schritte zum Entfernen verunreinigender Substanzen werden in einem Behälter ausgeführt, was höchst vorteilhaft für ein gewerbliches Massenproduktionsverfahren ist.
Das sich bildende Präzipitat kann durch herkömmliche Mittel, wie beispielsweise Zentrifugation oder Filtration getrennt und anschließend verworfen werden. Der Überstand ist für eine weitere Reinigung, wie nachfolgend beschrieben, bereit. Es können verschiedene Typen von Anionenaustauscherharzen, einschließlich DEAE-Sephadex, QAE-Sephadex, DEAE-Sephacel, DEAE-Cellulose, DEAE-Sepharose und dergleichen, verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform liegt das Anionenaustauschharz als DEAE-Sepharose vor. Es können eine Vielzahl von Bedingungen bei diesem besonderen Schritt verwendet werden. Für die besten Ergebnisse wird das Anionenaustauschmedium in einer Chromatographiesäule angeordnet und das API wird davon eluiert. Gemäß einer Ausführungsform wird das Anionenaustauschharz zuerst mit einer schrittweisen Anwendung von Puffer, ausgehend mit einer Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 3,5–4,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 8,0 bis 12,0 mS/cm, und anschließend mit einer Lösung eines pH-Wertes von ungefähr 5,5 bis 6,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 2,5 bis ungefähr 3,5 mS/cm äquilibriert. Nachdem das Harz äquilibriert ist, wird der vorstehend beschriebene Überstand auf das erste Anionenaustauschharz geladen. Diese Bedingungen von pH-Wert und Leitfähigkeit gestatten das Zurückhalten von API auf der Säule, während das Anionenaustauschmedium gewaschen wird. Die Leitfähigkeit des Waschpuffers (bei einem pH-Wert von ungefähr 5,5–6,5) wird von ungefähr 1,8-2,4 auf ungefähr 2,5-45,0 während des Waschens erhöht. Dieser Anstieg stellt geeignete Bedingungen bereit, so dass die Säule zu deren gesamten Kapazität beladen wird, und trotzdem kein API in dem Durchfluss verworfen wird, um eine maximale API-Ausbeute zu erhalten.
Das API wird anschließend von der Säule eluiert. Gemäß einer Ausführungsform wird die Elution mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 5,5 bis 6,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 9,0 bis ungefähr 11 mS/cm ausgeführt.
Folgend auf eine Trennung einer API beinhaltenden Lösung von einem Ionenaustauschharz wird die Lösung behandelt, um deren Wassergehalt und die Ionen-Zusammensetzung durch herkömmliche Mittel, wie beispielsweise Diafiltration, Ultrafiltration, Lyophilisierung, etc. oder Kombinationen davon zu verringern und zu ändern.
Gemäß einer Ausführungsform wird das nach der ersten Anionenaustauschchromatographie erhaltene API beinhaltende Effluent durch Zentrifugation konzentriert. Das Retentat wird dann gegen Wasser diafiltriert, um eine Leitfähigkeit in dem Bereich von ungefähr 3,5 bis ungefähr 4,5 mS/cm zu erreichen.
Um die API beinhaltende Lösung, die nach der ersten Anionenaustauschchromatographie erhalten wurde, weiter zu reinigen, wird die Lösung mit dem gleichen Puffertyp, der für den Anionenaustauschschritt verwendet wurde, mit einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Leitfähigkeit auf ein Kationen-Austauschharz so geladen, dass das API durchlaufen und mit dem Pufferdurchfluss ausgewaschen werden kann, während verunreinigende Substanzen auf dem Kationen-Austauschharz zurückgehalten werden.
Gemäß einer Ausführungsform liegt das Kationen-Austauschharz als Carboxymethylsepharose vor, die in einer Chromatographiesäule angeordnet vorliegt. Das Kationen-Austauschharz wird zuerst schrittweise mit Pufferanwendungen äquilibriert, ausgehend von einer Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 3,5–4,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 8,0 bis ungefähr 12,0 mS/cm, und anschließend mit einer Lösung eines pH-Wertes von ungefähr 5,5–6,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 0,8 bis ungefähr 1,1 mS/cm. Die API beinhaltende Fraktion wird mit dem gleichen Puffer wie bei dem zweiten Äquilibrierungsschritt (pH-Wert ungefähr 5,5–6,5 und eine Leitfähigkeit von ungefähr 0,8 bis ungeführ 1,1 mS/cm) auf eine Säule geladen und der Durchfluss wird gewonnen.
Erneut kann, wie vorstehend offenbart, die nach der Kationenaustauschchromatographie erhaltene API beinhaltende Lösung kann so behandelt werden, dass deren Wassergehalt verringert wird. Gemäß einer Ausführungsform wird die Lösung durch Ultrafiltration konzentriert.
Wie vorstehend offenbart, wird die Anionenaustauschchromatographie prinzipiell dazu verwendet, um aktives API von nicht aktivem API zu trennen. Die vorliegende Erfindung umfasst weiter Verfahren zum Trennen von aktivem API von anderen verureinigenden Substanzen, einschließlich Lösungsmittel/Detergens Verbindungen, die, wie vorstehend beschrieben, für eine Virusinaktivierung verwendet wurden.
Gemäß einer Ausführungsform wird eine derartige Trennung durch die zweite Anionenaustauschchromatographie erreicht. Die vorliegende Erfindung zeigt vorteilhafter Weise, dass verunreinigende Substanzen, insbesondere nicht ionische Detergenzien und Lösungsmittel, die allgemein für eine Virusinaktivierung verwendet werden, in dem DEAE-Sepharose Anionenaustauschharz unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung, wie nachfolgend ausführlich beschrieben, nicht zurückgehalten werden. Das von dem zweiten Anionenaustauschchromatographieschritt eluierte API ist folglich nicht nur hoch aktiv, sondern ebenfalls hoch rein. Das Anionenaustauschharz wird zuerst schrittweise mit Pufferanwendungen, ausgehend mit einer Lösung eines pH-Wertes von ungefähr 3,5–4,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 8,0 bis ungefähr 12,0 mS/cm äquilibriert, und anschließend mit einer Lösung eines pH-Wertes von ungefähr 5,5 bis ungefähr 6,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 2,5 bis ungefähr 3,5 mS/cm. Als nächstes wird die API beinhaltende Fraktion gewöhnlich nach einer Virusinaktivierungsbehandlung auf das zweite Anionenaustauschharz geladen. Auf dieser Stufe kann der pH-Wert des Ladungspuffers erhöht werden, wobei ein Waschen in einem Schritt ausgeführt werden kann, da die Lösung bereits von dem Hauptteil verunreinigender Proteine gereinigt vorliegt. Gemäß einer Ausführungsform beträgt der pH-Wert des Ladungspuffers von ungefähr 6,0 bis ungefähr 8,0 und die Leitfähigkeit von ungefähr 2,0 bis ungefähr 4,0 mS/cm. Der pH-Wert des Waschpuffers beträgt ungefähr 5,5–6,5 und die Leitfähigkeit ungefähr 2,5–3,5 mS/cm.
Das API wird dann von der Säule eluiert. Gemäß einer Ausführungsform wird die Elution mit einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von ungefähr 5,5 bis 6,5 und einer Leitfähigkeit von ungefähr 11 bis 13 mS/cm ausgeführt.
Die Lösung, die aktives, gereinigtes API beinhaltet, das nach der zweiten Anionenaustauschchromatographie erhalten wurde, kann weiter bearbeitet werden, um eine pharmazeutische Präparation für therapeutische, diagnostische oder weitere Verwendungen zu erhalten. Um ein Produkt für eine therapeutische Verabreichung herzustellen, umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung, weiterhin die Schritte eines Änderns der Ionen-Zusammensetzung der das gereinigte aktive API beinhaltenden Lösung, um ein physiologisch verträgliches Ion zu beinhalten und die erhaltene Lösung zu stabilisieren. Physiologisch verträgliche Substanzen, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung beispielsweise verwendet werden, sind Natriumchlorid, Natriumphosphat und Glycin mit einem gepufferten pH-Wert, der mit physiologischen Bedingungen verträglich ist.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Ionen-Zusammensetzung der das aktive, gereinigte API beinhaltenden Lösung geändert, um das physiologisch verträgliche Phosphation durch eine Diafiltration gegen Natriumphosphatpuffer, bei einem physiologischen pH-Wert von ungeführ 7,0 zu beinhalten. Die erhaltene Lösung wird anschließend konzentriert und mit einem Filter sterilisiert, um eine fluide pharmazeutische Präparation zu erhalten, die für eine therapeutische Verabreichung geeignet ist.
Es wird ebenfalls eine fluide pharmazeutische Präparation offenbart, die ein gereinigtes aktives API umfasst, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Diese Lösung kann für therapeutische, diagnostische oder Reagenzien-Zwecke verwendet werden.
Die fluide pharmazeutische Präparation kann mindestens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 99% API von dem Gesamtprotein umfassen. Mindestens 90% des API kann in dessen aktiver Form vorliegen.
Die API beinhaltende pharmazeutische Präparation ist hoch rein. Verglichen mit anderen von Plasma abgeleiteten zugelassenen Produkten beinhaltet die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene API-Lösung eine verringerte Menge von Unreinheiten. Bisher bekannte Zusammensetzungen von API schließen mindestens einen Proteinstabilisator, einschließlich Albumin, Sucrose und Mannitol, ein. Nun wird eine API Präparation offenbart, die keinen Proteinstabilisator aufweist und dennoch, wie nachfolgend beispielhaft erläutert, äußerst stabil ist. Diese Reinheit ermöglicht ein Verschreiben der pharmazeutischen Präparation an ein beliebiges davon benötigendes/bedürftiges Subjekt. Beispielsweise ist eine API Präparation, die Sucrose als einen Proteinstabilisator beinhaltet von einer Verschreibung an Diabetespatienten ausgeschlossen; Mannitol ist bekannt in einem bestimmten Prozentsatz in der Population Allergien zu verursachen, wobei folglich ein Verabreichen eines Mannitol beinhaltenden Arzneimittels an ein Subjekt eine anaphylaktische Reaktion bewirken kann. Proteinstabilisatoren, insbesondere Proteinstabilisatoren, die von menschlichen Quellen, wie beispielsweise Albumin abgeleitet sind, sind in der pharmazeutischen API Präparation unerwünscht, da derartige Proteine ihrerseits Reinigungsprozesse durchmachen sollten, wobei das Endprodukt weitere Unreinheiten beinhalten kann.
Das gereinigte API, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, ist hoch stabil. Das API in der fluiden pharmazeutischen Präparation kann für mindestens 3 Monate, vorzugsweise 4 Monate, noch bevorzugter 6 Monate stabil sein, wenn die pharmazeutische Präparation bei einem Temperaturbereich zwischen 20°C bis 25°C gelagert wird.
Das API in der fluiden pharmazeutischen Präparation kann für mindestens 12 Monate, vorzugsweise 24 Monate, noch bevorzugter 36 Monate stabil sein, wenn die pharmazeutische Präparation bei einem Temperaturbereich zwischen 2°C bis 8°C gelagert wird.
Die mit Filter sterilisierte API beinhaltende Lösung kann unmittelbar verwendet werden, und kann ebenfalls in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingeschlossen werden, die für therapeutische Zwecke verwendet werden kann. Der Ausdruck ”pharmazeutische Zusammensetzung” ist hier vorgesehen in einem breiteren Sinn verstanden zu werden, um Präparationen einzuschließen, die eine Proteinzusammensetzung gemäß dieser Erfindung beinhalten, die nicht nur für therapeutische Zwecke, sondern ebenfalls für Reagenz oder diagnostische Zwecke, wie im Stand der Technik bekannt, oder für die Gewebekultur verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die vorgesehen ist für eine therapeutische Verwendung sollte eine therapeutische Menge von API beinhalten, das heißt, die Menge, die für verhindernde oder heilende Gesundheitsmaßnahmen notwendig ist. Falls die pharmazeutische Präparation als ein Reagenz oder Diagnostikum verwendet werden soll, dann sollte es Reagenz- oder Diagnostikum-Mengen von API beinhalten.
Es wird ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die als einen aktiven Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge von API umfasst, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, weiter umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträger, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”therapeutisch wirksame Menge” auf eine Menge eines Proteins oder einer Proteinformulierung oder Zusammensetzung, die wirksam ist, um einen Zustand in einem lebenden Organismus zu behandeln, an den es über eine Zeitdauer verabreicht wurde.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann mindestens 90%, vorzugsweise 95%, noch bevorzugter 99% API aus dem Gesamtprotein umfassen. Mindestens 90% des API kann in dessen Form aktiv sein.
Es können pharmazeutische Zusammensetzungen durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise durch eine herkömmliches Mischungs-, Lösungs-, Granulier-, Mahl-, Pulverisier, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulgier-, Einkapselungs-, Fang- bzw. Einfang- oder Lyophilisier-Verfahren.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann folglich in herkömmlicher Weise unter Verwendung eines oder mehrerer verträglicher Verdünnungsmittel oder Träger, die Arzneistoffträger und Zusatzstoffe umfassen, formuliert werden, die ein Bearbeiten der aktiven Verbindungen in Präparationen fördert, was pharmazeutisch genutzt werden kann. Eine genaue Formulierung ist von dem gewählten Verabreichungsweg abhängig.
API Formulierungen oder Zusammensetzungen können für eine Vielzahl von Verabreichungsmodi geeignet sein. Diese kann eine orale, parenterale, subkutane, intravenöse, pulmonale, intraläsionale oder topikale Verabreichung einschließen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral oder durch Inhalation verabreicht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung können für intravenöse Injektionen, eine intravenöse Infusion, intradermale, intraläsionale, intramuskuläre und subkutane Injektionen oder Depots formuliert werden. Die API beinhaltende pharmazeutische Präparation, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, ist gegenüber einer bisher bekannten API beinhaltenden Präparation von Vorteil, da das API ebenfalls hoch stabil ist, wenn die Präparation in einer flüssigen Form gehalten wird. Folglich besteht nicht das Erfordernis die API Präparation für eine stabile Lagerung in eine Form eines Pulvers zu lyophilisieren. Anschließend besteht nicht das Erfordernis vor einer Verwendung für eine parenterale Verabreichung das Pulver in eine Flüssigkeit wiedereinzusetzen.
Wie hier beschrieben, wird API für die Behandlung von Lungenkrankheiten verwendet. Eine intravenöse Verabreichung beeinflusst derartige Lungenkrankheiten, indem sie in die Lunge diffundiert und Elastase und andere Proteasen neutralisiert. Durch Untersuchen von Proben einer bronchoalveolaren Lavage (BAL) wurde gezeigt, dass exogenes API, das intravenös verabreicht wurde und in die Lungen diffundierte, einen mehr als 3-fachen Anstieg im pulmonalen API-Spiegel bewirkte, und dass sich die Anti-Elastaseaktivität nach 6 Tagen einer Infusion von API verdoppelte (Wewers et al., Am. Rev. Respir. Dis. 135: 539–543, 1987). Nichtsdestotrotz, erreicht das meiste intravenöse verabreichte API niemals die Lunge. Es wurde geschätzt, dass lediglich 2% der intravenös verabreichten Dosis die Lunge erreichen (Hubbard et al., Crystal, Lung (Suppl.) 565–578, 1990).
Folglich kann eine Verabreichung von API durch die Inhalationsroute vorteilhafter sein, da es den unteren Atmungstrakt unmittelbar erreicht. Diese Route sollte geringere therapeutische Dosen von API erfordern, und folglich wäre das spärliche Angebot von menschlichem Plasma abgeleiteten API's für die Behandlung mehrerer Patienten verfügbar. Diese Verabreichungsroute kann ebenfalls bei dem Neutralisieren von Elastase von Neutrophilen mehr wirksam sein. Außerdem ist die Verabreichung durch Inhalation für den Patienten einfacher und weniger belastend als die intravenöse Route und würde die Belastung auf das lokale Gesundheitssystem (indem weniger klinischer Einsatz erforderlich ist) verringern.
Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Verabreichung durch die Inhalationsroute sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen werden für eine Verabreichung durch Inhalation die aktiven Bestandteile in der Form eines Aerosolsprays von einer unter Druck stehenden Packung oder einem Zerstäuber mit der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, beispielsweise Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluormethan, oder Kohlendioxid, abgegeben. Die Betriebsbedingungen für eine Abgabe einer geeigneten Inhalationsdosis werden entsprechend dem Typus der verwendeten mechanischen Einrichtung variieren. Für mehrere Aerosolabgabesysteme, wie beispielsweise Zerstäuber, wird die Häufigkeit einer Verabreichung und Betriebsdauer hauptsächlich durch die pro Volumeneinheit in dem Aerosol befindlichen Menge der aktiven Zusammensetzung (API gemäß der vorliegenden Erfindung) diktiert. Gewöhnlich ist die Betriebsdauer, umso kürzer je höher die Konzentration des Proteins in der Zerstäuberlösung ist. Mehrere Einrichtungen, wie beispielsweise die Dosierinhalatoren, können höhere Aerosolkonzentrationen erzeugen als andere und werden somit für kürzere Dauern betrieben, um zu dem erwünschten Ergebnis zu gelangen.
Andere Einrichtungen, wie beispielsweise Pulverinhalatoren sind so gestaltet, um verwendet zu werden bis eine gegebene Charge von aktivem Material durch die Einrichtung aufgebraucht ist. Die in die Einrichtung geladene Charge wird dementsprechend formuliert sein, um die genaue Inhalationsdosismenge von API zur Abgabe bei einer einzelnen Verabreichung zu beinhalten. (Siehe allgemein Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ed. 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Kapitel 92 für Information bezüglich einer Aerosolverabreichung.)
Ungeachtet welche Einrichtung für die Aerosolisierung verwendet wird, wird der aktive Bestandteil in der Form einer Dispersion oder von Teilchen vorliegen. Die Dispersion von Teilchen kann in der Form von flüssigen Tropfen oder in der Form eines Pulvers (trocken oder suspendiert) vorliegen. Die das API beinhaltende fluide pharmazeutische Präparation wird unmittelbar für eine Aerosolisierung verwendet.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte API kann zum Behandeln von Lungenemphysem verwendet werden. Es ist bekannt, dass Patienten mit API Mangel eine Belastung auf niedriger Stufe von Neutrophilen in deren unteren Atmungswegen aufweisen. Eine Berechnung der API-Spiegel und Anti-Neutrophilen-Elastase-Verteidigungen in derartigen Patienten, zeigte, dass beide merklich verringert waren. Zusammengefasst, unterstützen diese Beobachtungen die Hypothese, dass ein Mangel an API einen Patienten für ein Emphysem anfällig macht, indem die Balance zwischen Neutrophilen-Elastase und Anti-Neutrophilen-Elastase in dem unteren Atmungsweg verändert ist. Wohingegen normale Menschen einen adäquaten Anti-Neutrophilen-Esterase-Schirm aufweisen, um den unteren Atmungsweg zu schützen, weisen jene mit API Mangel keinen auf, was der Neutrophilen-Elastase gestattet Lungengewebe zu zerstören. Wird einem Patienten mit endogenem API Mangel folglich exogenes API mit der richtigen Dosis bereitgestellt, so kann er die schädlichen Wirkungen eines derartigen Mangels überwinden.
Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte API kann ebenfalls zur Behandlung von Lungenkrankheiten und Störungen verwendet werden, die mit zystischer Fibrose assoziiert sind.
Bei an zystischer Fibrose leidenden Patienten besteht der hauptsächliche Todesgrund in dem Verlust der Lungenfunktion. Patienten mit einem erzwungenen Ausatmungsvolumen in einer Sekunde (FEV1) von unterhalb 30% von deren vorhergesagten Wert weisen eine 2-jährige Mortalität von größer als 50% auf. Die gegenwärtige Mortalitätsrate liegt bei 1,2 Toten pro 100 Patienten pro Jahr, das mittlere Überleben liegt bei 32 Jahren. In einem spezifizierten Fall starben 94% an kardiorespiratorischer Fehlfunktion. Respiratorische Fehlfunktion ist durch eine erhöhte Atemnot bzw. Dyspnoe, Hypoxämia und Erhöhung des arteriellen PCO2 gekennzeichnet. CF-Patienten sind während deren Lebenszeit als Folge deren Zustandes auf Grund einer verringerten Lungenfunktion und konstanten Lungeninfektionen in deren Tag täglichen Aktivitäten eingeschränkt.
Einer der wichtigsten Nebenwirkungen einer chronischen Infektion, die mit CF assoziiert vorliegt, besteht als Reaktion auf bakterielle Infektionen in der chronischen Anwesenheit von phagozytischen Neutrophilen in der Lunge und der Freisetzung von verschiedenen chemischen Attraktanten. Diese Leukozyten sekretieren Elastase, die das Potential aufweist das elastische Gewebe der Lunge zu zerstören. Außerdem wurde gezeigt, dass Neutrophile von CF-Patienten sich in einem Zustand erhöhter Reaktionsfreudigkeit befinden und dazu neigen bereitwilliger zu degranulieren, was die Gewebe zerstörende Elastase freisetzt. Folglich scheinen Patienten mit CF einen Zustand einer nicht regulierten entzündlichen Antwort aufzuweisen, die die normale Protease (Elastase)/Anti-Protease (API) Balance überrennt bzw. begräbt, was zu der Anhäufung von Elastase in der Lunge und schließlich zur Lungenschädigung führt. Vorherige Untersuchungen zeigten, dass ein großer Anteil der Lungenschädigung in CF Patienten von der Anwesenheit einer nicht neutralisierten Elastase und anderen Proteasen herrührt. Der anormale Zyklus ist zerstörerisch selbst-perpetuierend und selbst-ausdehnend: erhöhte Elastase führt zu der Rekrutierung von mehr Neutrophilen zu der Lunge, die wiederum zusätzliche Proteasen sekretieren. Dieser Zyklus überrennt weiterhin die natürliche normale Protease(Elastase)/Anti-Protease Balance, was zu einer Zerstörung der Lungenarchitektur, schwerer Lungendysfunktion und schließlich zum Tode führt.
Patienten mit CF leiden an chronischen Lungeninfektionen, die mit Antibiotika zu behandeln sind. Beispielsweise mit Azithromycin, einem Antibiotikum das nachweislich bei der Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Bakterien wirksam ist. Mit der erhöhten Langlebigkeit von CF Patienten werden neue Infektionen, wie beispielsweise mit B. cepacia und S. maltophilia auftreten. Es besteht die Möglichkeit, dass eine prophylaktische Verwendung von API in CF Patienten deren Lungenfunktion verbessern kann und dadurch das Auftreten derartiger Infektionen verringert.
Vorzugsweise wird API an CF Patienten durch die Inhalationsroute verabreicht. Es wurde vor kurzem gezeigt (McElvaney et al., 1991), dass aerosoliertes bzw. aerosolisiertes Alpha Antitrypsin, das an Patienten mit zystischer Fibrose gegeben wurde, die Neutrophilen-Elastase in der Auskleidungsflüssigkeit des Lungenepithels (ELF) unterdrückte, was die Anti-Neutrophilen-Elastase-Kapazität in der ELF wiederherstellte und wodurch die Hemmwirkung der ELF auf die Fähigkeit von Neutrophilen eine Pseudomonas Infektion wirksam zu bekämpfen, umgekehrt wurde. Vorteilhafter Weise können Aerosolformulierungen unter Verwendung der flüssigen API Präparation der vorliegenden Erfindung einfach hergestellt werden. Für eine aerosolisierte Formulierung ist eine höhere API Konzentration in dem Bereich von 10% erforderlich. Wie hier nachfolgend, beispielhaft erläutert, liegt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes API bei dieser Konzentration für mindestens 8 Wochen, vorzugsweise 12 Wochen wesentlich stabil vor, wenn es bei einem Temperaturbereich von 2–8°C gelagert wird.
Die Prinzipien der Erfindung können mit Bezugnahme auf die nicht beschränkenden Beispiele, nachfolgend besser verstanden werden.
Beispiele
Erfassung einer API Aktivität
Die Konzentration von aktivem API wird durch eine Hemmung bzw. Inhibition der Pankreaselastase vom Schwein bestimmt. Im Prinzip vergleicht der Assay zwischen der Hemmungsrate von Elastase, die mit einer Testprobe erhalten wurde und der Hemmungsrate einer Elastase, die mit einem API Referenzstandard (Kamada, Israel) erhalten wurde, die als 100% Aktivität aufweisend betrachtet wird. Die Elastase-Aktivität wird durch die Rate einer Spaltung des Elastasesubstrats (Succinyl-Alanin-Alanin-Alanin-p-Nitroanilid) erfasst, was zu der Freisetzung des Spaltproduktes führt, das bei 405 nm absorbiert wird. Die Abnahme der Elastase-Aktivität bei der Anwesenheit von API steht in unmittelbarer Beziehung mit der Menge von aktivem API in dem Reaktionsgemisch.
Die Aktivität eines API Referenzstandards wird durch die Hemmung einer Trypsin-Esterase-Aktivität bewertet. Aktives API bindet unter Assaybedingungen aktives Trypsin in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 und verringert die Trypsin-Esterase-Aktivität, die entsprechend eines anderen Verfahrens ähnlich zu dem USP 25 Verfahren erfasst wird. Die Menge von aktiven Trypsinstellen in der Trypsinpräparation wird vorher durch Titration mit p-Nitrophenyl-p-Guanidino-Benzoat (NPGB) bestimmt: Folgend auf eine Zugabe des Titrationssubstrats steht die Zunahme einer Absorption bei 402 nm der Trypsinpräparation in direktem Verhältnis mit der Menge von in der Trypsinpräparation vorhandenen aktiven Trypsinmolekülen.
Beispiel 1: Vorbehandlung des Quellenmaterials
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Ausgangsmaterial als Cohn Fraktion IV-1 Paste vor, die durch die dem Fachmann wohl bekannte Cohn-Oncley Fraktionierungstechnik erhalten wird. Die Präparation einer wässrigen Lösung von der Fraktion IV-1 Paste wird nachfolgend beschrieben. Die IV-1 Paste wird in ungefähr 35 Volumen von Wasser mit einer Wasserqualität für die Injektion gelöst, (IV-1 Paste Gewicht in Kg mal 35). Die Menge von Ausgangspaste, 75–87 Kg pro Reinigungsvorgang, wird in Anteilen zu einem doppelwandigen rostfreien Stahlkessel gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 9,2 unmittelbar nach Mischen des ersten Anteils eingestellt und wurde weiterhin durch 0,5 N NaOH weiter eingestellt bis die gesamte Paste und das Wasser zugegeben waren. Die Lösung wurde für ungefähr 10 Minuten vermischt.
Fraktion IV-1 Paste, ähnlich anderen Plasmafraktionen, beinhaltet verschiedene Proteine, wie beispielsweise Lipoproteine, Immunglobuline, Globuline, Metalloproteine, etc.. Diese Proteine müssen von dem API getrennt werden, um eine flüssige stabile Präparation herzustellen, wobei jedoch etwas ebenfalls an das Ionenaustauschharz binden wird und dadurch die Reinigung von API stören bzw. behindern wird. Vor einer Zugabe der Lösung auf ein Anionenaustauschharz wird vorzugsweise ein Anteil dieser verunreinigenden Proteine entfernt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Entfernen einer derartigen verunreinigenden Fraktion in zwei Schritten ausgeführt.
Entfernen von Lipiden und Lipoproteinen
Der vorstehend erhaltenen Dispersion wird ein Lipidentfernungsmittel, Aerosil^TM (Siliziumdioxid) mit 78–85 g/Kg Paste zugegeben. Nach Zugabe von Aerosil wurde der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit NaOH 0,5 N auf 8,8 eingestellt. Das Gemisch wurde für 90 Min. bei 38°C und mit einer Rührrate von 870–1450 Upm inkubiert. Nach 90 Min. wurde die Dispersion auf 22°C gekühlt und der pH-Wert wurde auf 6,1 eingestellt.
Präzipitation verunreinigender Proteine
Der, wie vorstehend erhaltenen, Dispersion wurde Polyethylenglycol (PEG) eines mittleren Molekulargewichts von 4.000 KDa mit 10,5–11,5% Masse pro Volumen des erhaltenen Gemisches zugegeben, während mit 2660–2900 Upm gerührt wurde. Nach der Lösung von PEG wurde der pH-Wert der Dispersion mit 2% Essigsäure auf 6,0 eingestellt. Die Leitfahigkeit wurde mit festem NaCl auf 3,0 mS eingestellt. Es wurde ein Präzipitat verunreinigender Proteine und Viren, einschließlich Prionenproteinen, gebildet. Dieses Präzipitat wurde durch kontinuierliche Zentrifugation (Selbst-Entschlammungs-Zentrifuge, Modell CSA19-06-476, Westfalia) mit einer Zentrifugationsrate von 300–450 Litern/Std. entfernt. Das durch die Zentrifugation erhaltene Sediment wurde verworfen, wobei der Überstand unter Verwendung eines 1 μm (nominal) Cellulosefaser-Tiefenfilters (depth filter) und einem Druck von ≤ 25 Psi weiter filtriert wurde.
Beispiel 2: Erste Anionenaustauschchromatographie
Das für die erste Anionenaustauschchromatographie verwendete Harz war DEAE-Sepharose Fast Flow, die in einer rostfreien Stahl 316-L Säule (CF 1000/150 SS CHROMAFLOW, Pharmacia) gepackt ist, und ein Volumen von 117 Litern aufweist. Das DEAE-Sepharose-Harz wurde zuerst schrittweise mit Natriumacetat-Puffer, wie folgt, äquilibriert:

a) pH-Wert 4,0, Leitfähigkeit 10,0 mS/cm
b) pH-Wert 6,0, Leitfähigkeit 3,0 mS/cm Flussrate. 7–200 Liter/Min.

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wies der erhaltene filtrierte Überstand bereits den geeigneten pH-Wert und die Leitfähigkeit von pH-Wert 6,0 und 3,0 mS/cm auf. Somit wurde er unmittelbar auf die äquilibrierte DEAE-Sepharosesäule, mit einer Flussrate von 12–14 Litern/Min., geladen.
Bei einer derartigen Massenproduktion ist es entscheidend die Waschbedingungen derart einzustellen, dass die Säule mit deren maximalen Kapazität geladen wird und dass dennoch kein API in den Durchfluss leckt. Dies wurde durch einen zwei Schritte umfassenden Säulenwaschgang mit Natriumacetat-Puffer mit den folgenden Bedingungen erreicht: erster Waschgang – pH-Wert 6,0, Leitfähigkeit 2,1 mS/cm; zweiter Waschgang: pH-Wert 6,0, Leitfähigkeit 3,0 mS/cm. Das API wird auf der Säule zurückgehalten, wobei andere Proteine, beispielsweise Albumin und Transferrin ausgewaschen werden.
Eine Elution des API von der Säule wurde mit einem Natriumacetat-Puffer ausgeführt, der einen pH-Wert von 6,2 und eine Leitfähigkeit von 10,0 mS/cm aufwies. Der Druck auf die Säule betrug ≤ 35 Psi und die Flussrate betrug 12–14 Liter/Min. Die das API beinhaltende Fraktion wurde dann so behandelt, dass der Wassergehalt und die Ionen-Zusammensetzung, wie in Beispiel 3 beschrieben, eingestellt werden konnte.
Beispiel 3: Einstellung von Wassergehalt und Ionen-Zusammensetzung
Das das API beinhaltende Effluent wurde durch Ultrazentrifugation mit einer Polysulfonmembran mit einem nominalen Ausschluss von 10 KD und einer Gesamtmembranfläche von 12,2 m² (UFP-10C-65) in einer Hohlfaserkartusche (Amersham Biosciences) auf 100 Kg (Gesamtgewicht) konzentriert. Der Retentatdruck betrug 15–20 Psi und die Flussrate 20–40 Liter/Min.. Das Filtrat wurde dann verworfen und das Retentat wurde gegen Wasser mit einer Wasserqualität für die Injektion (WFI) diafiltriert. Der Retentatdruck betrug 15–20 Psi bei einer Flussrate von 20–40 Litern/Min., und die Diafiltration wurde fortgeführt bis die Lösung eine Leitfähigkeit von 4,0 mS/cm erreichte.
Beispiel 4: Kationenaustauschchromatographie
Um die das API beinhaltende Fraktion, die nach dem Vorgang von Beispiel 3 erhalten wurde, weiter von verbliebener verunreinigender Substanz zu reinigen, wurde die Lösung unter Verwendung des gleichen Natriumacetat-Puffers unter Bedingungen einer Kationenaustauschchromatographie unterzogen, die die Retention von lediglich verunreinigenden Substanzen an das Kationenharz gestattet, während das API mit dem Säulendurchfluss ausgewaschen wurde.
Das verwendete Kationen-Austauschharz war CM-Sepharose Fast Flow, das in eine rostfreie Stahl-316-L Säule (CF 1000/150 SS CHROMAFLOW, Pharmacia) mit einem Volumen von 117 Litern gepackt wurde.
Das Harz wurde mit Natriumacetat-Puffer unter den folgenden Bedingungen äquilibriert:

a) pH-Wert 4,0; Leitfahigkeit 10,0 mS/cm
b) pH-Wert 5,35, Leitfähigkeit 0,95 mS/cm Flussrate: 7–22 Liter/Min.

Die Leitfähigkeit der Lösung wurde vor dem Laden der API beinhaltenden Fraktion auf die Säule mit NaCl auf 0,95 mS/cm und der pH-Wert mit 2% Essigsäure auf 5,35 eingestellt. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 0,5% und die gesamte Proteinbeschickung betrug ≤ 4 Kg. Die Flussrate betrug 18–22 Liter/Min. bei einem Druck von 29 ≤ Psi. Es wurde der das API beinhaltende Säulendurchfluss gewannen. Der pH-Wert wurde mit 0,15 M NaOH auf 6,75 und die Leitfähigkeit mit festem NaCl auf 3,0 mS/cm eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde unter Verwendung einer Polysulfonmembran mit einem nominalen Ausschluss von 10 KD und einer gesamten Membranfläche von 12,2 m² (UFP-10C-65) in einer Hohlfaser-Kartusche (Amersham Biosciences) ultrafiltriert. Es wurde das Retentat gewonnen und das Effluent wurde verworfen.
Beispiel 5: Virusinaktivierung
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die nach der Kationenaustauschchromatographie erhaltene API beinhaltenden Fraktion einer Virusentfernung und Inaktivierung unterzogen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurde die Virusentfernung durch eine Nano-Filtration ausgeführt. Die das API beinhaltende Lösung wurde einer Vor-Filtration durch eine Polysulfonmembran mit einer Porengröße von 0,1 + 0,2 μm, einem nominalen Oberflächenbereich von 0,6 m² (5441358 K-1 SS, Sartorius) mit einem Druck von ≤ 30 Psi unterzogen. Das Retentat wurde in einem 600 Liter rostfreien doppelwandigen und unter Druck stehenden Stahl 316-L Behälter gewonnen, der mit einem Rührer vom Schiffstyp ausgerüstet war. Das Retentat wurde mit WFI auf eine Proteinkonzentration von 6,0–8,5 mg/mL verdünnt und der pH-Wert und die Leitfähigkeit wurden erneut mit 0,15 M NaOH/2% Essigsäure auf 7,25 beziehungsweise mitfestem NaCl auf 3,0 mS/cm eingestellt. Die Temperatur des Behälters wurde bei 22,5°C gehalten.
Es wurde eine Nano-Filtration mit einem Planova 15N Filter (15N1-000, Asahi Kasei Corporation) mit einem nominalen Oberflächenbereich von 1,0 m² ausgeführt. Der erhaltene Betriebsdruck durch N₂ betrug 13,8 Psi. Das durch pro m² des Filters transportierte Volumen betrug mehr als 250 Liter.
Um weiter Virus zu entfernen, wurde die API beinhaltende Lösung einer Virusinaktivierung unterzogen, indem das Lösungsmittel/Detergens Verfahren verwendet wurde. Es wurde Polysorbat 80 auf eine Endkonzentration von 0,95–1,25% M/M und TnBP auf eine Endkonzentration von 0,28–0,33% V/M zugegeben. Das Gemisch wurde für ungefähr 4,5–5,5 Std. bei 30–50 Upm gerührt.
Beispiel 6: Zweite Anionenaustauschchromatographie
Die zweite Anionenaustauschchromatographie wird verwendet, um die API beinhaltende Lösung, die nach der Virusinaktivierung von dem verwendeten Lösungsmittel und Detergens erhalten wurde, weiter zu reinigen. Da während der Schritte, die nach der ersten Anionenaustauchchromatographie ausgeführt wurden etwas von dem aktivem API inaktiv wurde, wurde ebenfalls das inaktive API entfernt. Folglich beinhaltet die erhaltene Lösung nach diesem Schritt hoch gereinigtes, aktives API.
Das für die zweite Anionenaustauschchromatographie verwendete Harz war DEAE-Sepharose Fast Flow, die in eine rostfreie Stahl 316-L Säule (BPSS 800/150 SS, Pharmacia) mit einem Volumen von 75 Liter gepackt wurde.
Das DEAE-Sepharose-Harz wurde zuerst schrittweise mit Natriumacetat-Puffer, wie folgt, äquilibriert:

a) pH-Wert 4,0, Leitfähigkeit 10,0 mS/cm
b) pH-Wert 6,0, Leitfähigkeit 3,0 mS/cm

Da mm die API beinhaltende Fraktion teilweise gereinigt vorlag, wurde eine schnellere Flussrate von 18–22 Liter/Min. angewendet. Aus dem gleichen Grund konnte der pH-Wert dieser Fraktion auf 7,5 erhöht werden und die Säule konnte mit einer Einstellung von Pufferbedingungen gewaschen werden. Die Leitfähigkeit der geladenen Lösung betrug 3,0 mS/cm und die gesamte Proteinbeschickung betrug ungefähr 2,5 Kg. Der pH-Wert des Natriumacetat-Waschpuffers betrug 6,0 und dessen Leitfähigkeit 3,0 mS/cm. Das gesamte Waschvolumen betrug 1125–1200 Liter mit einer Flussrate von 18–22 Liter/Min..
Die Elution des API von der Säule wurde mit einem Natriumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 und einer Leitfähigkeit von 12,0 mS/cm ausgeführt. Das Eluat der zweiten Anionenaustauschsäule beinhaltete 96% reines API, von dem mehr als 90% aktiv war.
Beispiel 7: Reinheit von API durch das Verfahren
Proben von verschiedenen Schritten des Verfahrens wurden durch Techniken einer Proteintrennung und Detektion analysiert. 1 beschreibt das Proteinprofil von API in der pharmazeutischen Präparation, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde; Standard API, das durch Kamda, Israel hergestellt wurde, und polymeres API auf nativen Tris-Glycin 8% bis 16% Gradientengelen. Unter nativen Bedingungen werden Proteine gemäß sowohl nach dem Molekulargewicht als auch der Struktur getrennt.

Nicht denaturierende Proben wurden in einem Proben-Puffer (Invitrogen^TM LC2673) in der Menge auf die Gele geladen, die in Tabelle 1 ausgeführt wird. Polymere Formen von API wurden von einem gereinigten API (Chargen-Nr. 6110003, Kamada), das bei 35°C für 6 Monate gelagert war, das einer Gelpermeations-Chromatographie unter Verwendung einer Sepharyl 200HR Säule unterzogen wurde, abgeleitet. Es wurden drei Fraktionen (Spuren 8–10) für eine Analyse auf den nativen Gelen gewonnen. Die Gele liefen in einem Tris-Glycin Laufpuffer (10x Invitrogen^TM LC2672). Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (1A), Ponceau-S (1B) gefärbt oder auf eine Nitrocellulosemembran geblottet (BioRad Trans Blot). Es wurde dann eine Immunfärbung unter Verwendung von Anti-Mensch API Antikörpern ausgeführt, die mit Meerrettich-Peroxidase (HRP, ICN/Cappel, 55236) konjugiert waren und mit einer Verdünnung von 1:400 (1C) verwendet wurden. Tabelle 1: Proben, die auf die native Gele geladen wurden

Spur(en)	Probe	Protein geladen (μg/mL)
		A	B
½	Arzneimittelendprodukt	2,5/5	½
¾	Betriebseigener API-Standard	2,5/5	½
5	Albumin	3,5	1,4
6	Transferrin	3,5	1,4
7	Anti-D (IgG)	3,5	1,4
8	Polymere Fraktion von API	3,6	1,44
9	Polymere Fraktion von API	3,6	1,49
10	Polymere Fraktion von API	3,6	1,32

Die während des Reinigungsverfahrens erhaltenen Proben wurden durch 4–12% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (2A), Ponceau-S (2B) gefärbt oder es wurde ein immun-Blotting mit Ziege Anti-API, HRP konjugierten Anti-Körpern ausgeführt. Die Proben sind in Tabelle 2 ausführlich dargelegt. Tabelle 2: Geladene Proben auf den SDS-PAGE-Gelen

Spur(en)	Probe	Protein geladen (μg/mL)
		A	B
1	Probenpuffer
2, 3	Vor-Aerosil	15	3
4, 5	Vor-PEG	15	3
6, 7	Erstes DEAE-Eluat	4,0	0,8
8, 9	Ultrafiltrat nach Kationaustau.	2,0	0,4
10	Zweites DEAE-Eluat	2,0	0,4
11	Arzneimittelsubstanz	2,0	0,4
12, 13	Arzneimittelprodukt	2,0	0,4
14	MW-Größenmacker gewerbl.	10 μl pro Spur
15	MW betriebseigener Marker	4,6	2,3

Die 1 und 2 zeigen deutlich, dass die meisten verunreinigenden Proteine während des Verfahrens der vorliegenden Erfindung entfernt wurden. Die Arzneimittelendsubstanz zeigt lediglich eine scharfe und einwandfreie Bande.
Beispiel 8: Weitere Aufreinigung von API
Nach der zweiten, in Beispiel 6 beschriebenen Anionenaustausch-Chromatographie wurde die das aktive, reine API enthaltende Fraktion durch Ultrafiltration (UFP-10C-65:Polysulfonmembran mit einer nominalen cut-off Grenze von 10 KDa und einem nominalen Membranbereich von 12,2 m²) konzentriert. Das Filtrat wurde verworfen und das Retentat, auf 60 Kg konzentriert, wurde erneut einer Diafiltration unterzogen. Die Diafiltration wurde durchgeführt, um das Acetat-Ion durch ein physiologisch verträgliches Ion, insbesondere Phosphat-Ion, zu ersetzen. Die Diafiltrationsbedingungen waren Filtration gegen Natriumphosphatpuffer, 18–22 nM in 0,6% NaCl, pH 7,0, Retentatdruck von 15–20 Psi. Der endgültige pH des Retentats war physiologischer pH von 7,0. Nach der zweiten Ultrafiltration wurde die Proteinkonzentration auf 22–24 mg/ml gebracht. Die Zubereitung wurde unter Verwendung von zwei Polysulfon-Filtern von 0,45 und 0,2 μm (Sartorius, 5101507H9-B) in seriellem Ersatz Filter-sterilisiert. Die Filtration wurde bei einem Druck von ≤ 25 Psi durchgeführt und das sterile Filtrat wurde in einem vorab mit Dampf sterilisierten Behälter gewonnen. Die das End-API enthaltende Zubereitung umfasste 22–24 mg/ml Protein bei einem pH von 7,0 ± 0,1 bei einer Konzentration von 6–8 mg/ml und einer Phosphatkonzentration von 18–22 mM. Diese Lösung weist pharmazeutische Reinheit auf, ist eine gebrauchsfertige Zubereitung und wird daher als pharmazeutische Zubereitung bezeichnet.
Beispiel 9: Charakterisierung von physiko-chemischen und Struktur-Eigenschaften von API
Charakterisierungs-Studien von drei Chargen der API-enthaltenden pharmazeutischen Zubereitung, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren von Kamada (Israel) hergestellt wurden, wurden durchgeführt, um Informationen über physiko-chemische und Struktur-Eigenschaften des API-Moleküls zu erhalten. Drei lts wurden untersucht: Chargen 6112006, 6113010 und 6123010. Die Untersuchungen der Charge #6112006 (Herstellung: Juni 2006) wurde nach 12–20 Monaten Lagerung der Charge bei 2–8°C durchgeführt. Während die Untersuchungen der Chargen #6112010 und #6123010 (Herstellung: Oktober 2003) unmittelbar nach der Produktion begonnen und innerhalb von 3 Monaten, während der die Chargen bei 2–8°C gelagert wurden, beendet wurden.
Die Charakterisierungs-Studien wurden in drei Labors durchgeführt, in den Analytischen R & D und Validierungs-Labors von Kamada (Israel), bei M-Scan Limited (UK) und bei dem Weizmann Wissenschafts-Institut (Israel).
Massenspektrometrie des intakten Proteins
Zur Bestimmung des Molekulargewichts des intakten API's wurde verzögerte Extraktions-Matrix-Laser-Desorption-Ionisationszeit des Flugs(Delayed Extraktion-Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight; MALDI-TOF MS)-Massenspektrometrie eingesetzt.
MALDI-TOF MS ist eine Technik, bei der ein Co-Präzipitat einer UV-Licht absorbierenden Matrix ein Protein-Molekül mit einem Nanosekunden-Laserpuls bestrahlt wird. Das meiste der Laser-Energie wird durch die Matrix absorbiert, die unerwünschte Fragmentierung des Moleküls verhindert. Die ionisierten Proteinmoleküle werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und gelangen in die Flugröhre. Während des flugs in dieser Röhre werden unterschiedliche Moleküle gemäß deren Verhältnis: Masse zu Ladung aufgetrennt und gelangen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu dem Detektor. Auf diese Art und Wiese ergibt jedes Molekül ein unterschiedliches Signal. Dieses Verfahren ermöglicht eine genaue Messung des intakten Molekulargewichtes von Biopolymeren von 400 bis zu 500.000 Da.
Alle drei untersuchten Chargen wiesen ein vergleichbares intaktes Molekulargewicht auf, wie in Tabelle 3 nachstehend gezeigt. Tabelle 3: Molekulargewicht von intaktem API

API-Charge Intaktes Molekulargewicht, Da

6112006 50.600 Da + 50 Da

6113010 50.550 Da + 50 Da

6123010 50.500 Da + 50 Da
Aminosäurezusammensetzungsanalyse und Bestimmung des Extinktionskoeffizienten
Die Aminosäurezusammensetzung ist eine wichtige Eigenschaft von Proteinen. Die Kombination der Aminosäureanalyse mit spektrophotometrischer Bestimmung der Absorption bei 280 nm ermöglichte die Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten von API. Dividieren des molaren Extinktionskoeffizienten des Proteins durch dessen intaktes Molekulargewicht führt zum Extinktionskoeffizienten einer 0,1%-igen Proteinlösung.

Zur Aminosäureanalyse wurden API-Chargen-Proben mit konstant siedender HCL hydrolysiert, unter Verwendung von Phenylisothiocyanat derivatisiert und durch Reversphasen(RP)-HPLC analysiert. API in den Chargen 6112006, 6113010 und 6123010 wies eine vergleichbare Aminosäurezusammensetzung auf (siehe Tabelle 4, nachstehend). Die kleinen Unterschiede im Gehalt an Asparagin- und Glutamin-Säure in den API-Chargen 6112006 und 6113010 bzw. 6123010 gehen auf die Dauer der Hydrolyse zurück, 24 Std. für Charge 6112006 und 16 Std. für die Chargen 6113010 und 6123010. Tabelle 4: Aminosäurezusammensetzung

Aminosäure	Erwartetes Verhältnis	API-Charge #6112006 Berechnetes Verhältnis relativ zu Leu = 45	API-Charge #6113010 Berechnetes Verhältnis relativ zu Leu = 45	API-Charge #6123010 Berechnetes Verhältnis relativ zu Leu = 45
Asparaginsäure	43	28,5	16,9	16,0
Glutaminsäure	50	42,5	27,4	26,1
Serin	21	19,9	20,2	20,9
Glycin	22	21,6	20,9	21,6
Histidin	13	13,9	12,9	12,9
Arginin	7	7,6	7,0	7,0
Threonin	30	25,5	29,5	28,7
Alanin	24	23,4	23,3	23,4
Prolin	17	16,9	16,5	17,2
Tyrosin	6	5,7	5,8	5,8
Valin	24	21,8	21,7	21,3
Methionin	9	9,3	8,9	9,2
Isoleucin	19	17,4	17,0	16,7
Leucin	45	45,0	45,0	45,0
Phenylalanin	27	27,0	26,7	26,5
Lysin	34	35,5	30,7	30,2
Tryptophan	2	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt
Cystein	1	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt

Der Extinktionskoeffizient von API wurde für die Charge #6113010 und #6123010 bestimmt und wies einen vergleichbaren Extinktionskoeffizienten auf, wie in Tabelle 5 gezeigt ist. Tabelle 5: API Extinktionskoeffizient

API-Charge # Molarer Extinktionskoeffizient, L mol^–1 cm^–1 Extinktionskoeffizient (0,1%) bei 280 nm

6113010 24,618 0,49

6123010 22,908 0,45
Peptid-Mapping
Peptid-Mapping wurde nach Cyanogenbromid(CBr)-Verdau unter Verwendung von MALDI-MS und on-line Elelektrospray (ES) MS durchgeführt. Das Konzept des gewählten Verfahrens des Mappens besteht in der Erzeugung von Peptide durch chemische Spaltung, Bestimmung deren Molekulargewichts und genauer Bestimmung der Anwesenheit oder des Fehlens der Komponententeile der bekannten Proteinsequenz. Die Techniken des ES-MS unter Verwendung von Atmosphärendruck-Ionisationsquelle und MALDI-MS erzeugen die Möglichkeit einer genauen Bestimmung der intakten Molekulargewichte von Biopolymeren bis zu 130 KDa bzw. 500 KDa. Das Kuppeln von On-line Mikro-Bohrungen und Nano-Kapillar-HPLC direkt mit Elektro-Spray-Massenspektrometrischer Erfassung der getrennten Spaltprodukte erhöht die Leistung der Technik. Ein wirklicher Vorteil dieses Mapping-Verfahrens besteht darin, dass es eine gleiche Wahrscheinlichkeit der Beobachtung der C-terminalen sowie der N-terminalen Bereiche gibt.

Das Peptid-Mapping-Profil aller drei untersuchten Chargen, Charge #6112006, #6113010 und 6123010 ist in Tabelle 6 gezeigt, die zeigt, dass alle drei Chargen ein vergleichbares Profil aufweisen. Tabelle 6: Peptid-Mapping durch Cyanogenbromid(CNBr)-Verdau

Gegenstand	Charge #6112006, Molekularmasse des Peptid/Glycopeptids	Charge #6113010, Molekularmasse des Peptid/Glycopeptids	Charge #6123010, Molekularmasse des Peptid/Glycopeptids
Glycopeptid Rest 243–351 (Homoserin) plus NeuAc₂Hex₅HexNAc₄	13.967	13.971	13.971
N-teminale Peptidreste 1–63 (Homoserin) plus NeuAc₂Hex₅HexNAc₄Fuc	9184	9185	9185
Fucosylierte N-terminale Glycopeptidreste 1–63 (Homoserin) plus NeuAc₂Hex₅HexNAc₄	9331	9331	9331
Glycopeptidrest 64–220 (Homoserin) plus NeuAc₂Hex₅HexNAc₄	20.170,5	20.174	20.175
Das 24 AS Signalpeptid	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt
Peptide 1–63, 243–351 und 64–221 in nicht glycosylierter Form	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt	Nicht bestimmt
C-terminale Peptidreste 386–394	970,5 486,0 (doppelt geladen)	970,7 486,0 (doppelt geladen)	970,8 486,40 (doppelt geladen)
Bestätigung der Sequenz	100%

N-verknüpfte Oligosaccharid-Populationsanalyse
Der Zweck des Tests bestand darin, das profil der Oligosaccharide zu erhalten, die an API gebunden waren, und die Glycosylierungsstellen des API's zu bestimmen, d. h. die Punkte der Bindung von Oligosacchariden an das Polypeptid. Lediglich N-verknüpfte Oligosaccharide wurden bewertet, da in API bekanntermaßen keine O-verknüpfte Oligosaccharide vorkommen.

Die Oligosaccharid-Analyse beinhaltet enzymatischen Verdau von API-Proben mit Chymotrypsin und nachfolgender verdau mit Peptid N-Glycosidase F (PNGase F), Trennung freigesetzter Kohlenhydrate von Peptiden unter Verwendung einer C18 Sep-pak Kartusche, Permethylierung der Glycane und schließlich deren Analyse mittels Beschuss mit schnellen Atomen (Fast Atom Bombardement; FAB) MS und MALDI-TOF MS. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7, nachstehend gezeigt. Tabelle 7: N-verknüpfte Oligosaccharid-Population

Glycane	Charge #6112006 m/z-Signal	Charge #6113010 m/z-Signal	Charge #6123010 m/z-Signal
NeuAc₂Hex₅HexNAc₄	279 (Hauptsignal)	279 (Hauptsignal)	2793 (Hauptsignal)
NeuAc₃Hex₅HexNAc₅	3604 (Nebensignal)	3604 (Nebensignal)	3605 (Nebensignal)
NeuAc₂Hex₅HexNAc₄Fuc	2969 (Nebensignal)	2969 (Nebensignal)	2968 (Nebensignal)
NeuAc₃Hex₆HexNAc₅ ^Fuc	3779 (Nebensignal)	3779 (Nebensignal)	3779 (Nebensignal)
N-Glycosylierungsstellen	Asn-46, Asn-83 und Asn-247	Asn-46, Asn-83 und Asn-247	Asn-46, Asn-83 und Asn-247

Monosaccharidzusammensetzungs-Analyse

Die Monosaccharid-Zusammensetzung eines Glycoproteins ist eine grundlegende Eigenschaft dessen Oligosaccharid-Anteils. Für die Monosaccharid-Analyse wurden die API-Proben methanolisiert, derivatisiert und mittels Chromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) analysiert. Das Verfahren ermöglichte die Bestimmung der Monosaccharide pro Mol Glycoprotein und daher die Annäherung des gesamten prozentualen Oligosaccharids. Die Monosaccharidzusammensetzung der drei überprüften Chargen ist in nachstehender Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8: Monosaccharidzusammensetzung

Monosaccharide	Charge #6112006		Charge #6113010		Charge #6123010
Monosaccharide	Monosaccharide nMol vorhanden/mg Protein	Verhältnis (Mannose = 3,0)	Monosaccharide nMol vorhanden/mg Protein	Verhältnis (Mannose = 3,0)	Monosaccharide nMol vorhanden/mg Protein	Verhältnis (Mannose = 3,0)
Fuc	7,7	0,1	12,0	0,2	10,4	0,2
Man	197	3,0	200	3,0	204	3,0
Gal	182	2,8	208	3,1	216	3,2
GalNAc	Nicht bestimmt	/	Nicht bestimmt	/	Nicht bestimmt	/
GlcNAc	125	1,9	222	3,3	242	3,6
NeuAc	93	1,4	128	1,9	98	1,4

Circulärer Dichroismus
Der Zweck der spektroskopischen Messungen des circulären Dichroismus (circular Dichroism; CD) besteht darin, die Sekundär- und Tertiär-Struktur des mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen API's zu charakterisieren. Der CD des API wurde in zwei bereichen gemessen: nahe UV, 320–260 nm, und fernes UV, 260–180 nm. Fernes UV-CD-Spektrum wurde dazu verwendet, α-Helizes zu bestimmen und nahes UV-CD wurde dazu verwendet die Tertiär-Struktur zu charakterisieren.
CD-Spektroskopie erfasst Unterschiede der Absorption des links-drehenden polarisierten Lichts gegenüber rechts-drehendem polarisiertem Licht, die aufgrund struktureller Asymetrie entstehen. Das fehlen einer regulären Struktur führt zu einer CD-Intensität von 0, während eine geordnete Struktur ein Spektrum ergibt, das sowohl positive als auch negative Signale enthält. CD-Spektren mit fernem und nahem UV der API-Chargen 6112006, 6113010 und 6123010 und dem primären API-Referenzstandard #02/07 sind in den 3A bzw. 3B gezeigt.
Beispiel 10: API Stabilität
A. Stabilität eines gewöhnlichen pharmazeutischen Präparats, welches 2% API umfasst Materialien und Methoden
Die Stabilität von API in dem durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene pharmazeutischen Präparat wurde bis zu 36 Monate bei einer Lagerungstemperatur von 5 ± 3°C gemäß den nachstehend aufgeführten Parametern, wie in Tabelle 9 nachstehend beschrieben, bestimmt: Aussehen; Gehalt an aktivem API; Verteilung der Molekülgröße (Konzentration von API Monomeren und Konzentration von API Aggregaten. API Aggregate sind inaktiv); und pH.
Die API Aktivität wurde durch den Elastase Inhibitionsassay, wie vorstehend beschrieben, und durch die Anwesenheit von API Aggregaten bestimmt, welche mittels analytischer Flüssigchromatographie [Größenausschluss (SEC) HPLC] unter Verwendung einer Zorbax GF-250 Säule analysiert wurden. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mittels Absorption bei 280 nm bestimmt.
Ergebnisse

Die Stabilität eines gewöhnlichen pharmazeutischen Präparats, welches gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde und 2% API enthält, wird in Tabelle 9 nachstehend gezeigt. Tabelle 9: Stabilität von API, welches bei 5 ± 3°C gelagert wurde

Test		Aussehen	Gehalt an aktivem API	Molekulare Größenverteilung		pH
Spezifikatio		Die Lösung ist klar und farblos	2.0–2.4 g/100 ml	Polymer & Aggregat < 10%	Monomer ≥ 90%	6.8–7.2
Start (8.5.2000)		Durchlauf	2.2	0.0	98.5	6.8
1 Monat (8.6.2000)	Up*	Durchlauf	2.2	0.3	98.3	6.8
1 Monat (8.6.2000)	Inv.**	Durchlauf	2.3	0.3	98.1	6.8
2 Monate (8.7.2000)	Up*	Durchlauf	2.1	0.4	98.9	6.8
2 Monate (8.7.2000)	Inv.**	Durchlauf	2.1	0.4	98.8	6.8
3 Monate (8.8.2000)	Up*	Durchlauf	2.0	0.4	98.7	6.8
3 Monate (8.8.2000)	Inv.**	Durchlauf	2.0	0.4	97.8	6.9
6 Monate (8.11.2000)	Up*	Durchlauf	2.0	0.8	98.3	6.9
6 Monate (8.11.2000)	Inv.**	Durchlauf	2.1	0.8	98.2	6.8
9 Monate (9.2.2001)	Up*	Durchlauf	2.0	1.0	99.0	6.8
9 Monate (9.2.2001)	Inv.**	Durchlauf	2.0	1.3	98.1	6.8
12 Monate (8.5.2001)	Up*	Durchlauf	2.0	1.0	98.5	6.8
12 Monate (8.5.2001)	Inv.**	Durchlauf	2.1	1.3	98.0	6.8
18 Monate (8.11.2001)	Up*	Durchlauf	2.2	1.5	98.0	6.8
18 Monate (8.11.2001)	Inv.**	Durchlauf	2.2	1.2	98.8	6.8
24 Monate (8.5.2002)	Up*	Durchlauf	1.9	9.3	90.7	6.8
24 Monate (8.5.2002)	Inv.**	Durchlauf	1.9	9.4	90.6	6.8
36 Monate (8.5.2003)	Up*	Durchlauf	2.0	11.0	89.0	6.8
36 Monate (8.5.2003)	Inv.**	Durchlauf	2.0	11.0	89.0	6.8

*Up: Aufrechte Position
**Inv.: Umgedrehte Position

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene API ist, wie in Tabelle 9 gezeigt, äußerst stabil. Ein besonderer Vorteil des pharmazeutischen Präparats besteht, wie hierin vorstehend gezeigt, darin, dass hoch gereinigtes, aktives API in einer gebrauchsfertigen, flüssigen Lösung ohne die Anwesenheit von irgendeinem Proteinstabilisator ebenfalls äußerst stabil ist.
B. Stabilität eines konzentrierten API pharmazeutischen Präparats, welches 5–20% API umfasst
Der Zweck der Untersuchung bestand darin die API Stabilität unter Bedingungen zu bestimmen, welche für eine Aerosolerzeugung förderlich sind. Diese Bedingungen schließen eine erhöhte API Konzentration auf ungefähr 10%, und vorzugsweise bis zu 20% ein. Die Stabilität der konzentrierten Lösungen wurde in der Kälte (2–8°C) und bei Umgebungstemperatur (–25°C) bestimmt. Die Stabilität wurde durch die Bildung von Aggregaten (Aggregatformen von API sind inaktiv) und durch Bestimmen der API Aktivität, wie vorstehend hier beschrieben, bestimmt.
Materialien und Methoden
API Lösungen in einem Protein Konzentrationsbereich von 5%–20% wurden aus einem 2% API Präparat (Chargen-Nr. 6013009, Kamada, Israel) hergestellt. Die Lösungen wurden in der Abwesenheit von Tween 80 und in der Anwesenheit von Tween 80 bei Konzentrationen von 0%, 0,01%, 0,05% und 0,1% inkubiert; ein Satz wurde unter Kühlung bei 2°C–8°C und der andere Satz bei 20°C–25°C gehalten. Die Proben beider Sätze wurden zu den Zeitpunkten 0, 4 Wochen, 8 Wochen und 12 Wochen auf Proteingehalt, API Aktivität, Konzentration an API Monomeren und Konzentration an API Aggregaten untersucht.
Die 2% API Lösung wurde von 2% API auf –20% und höher durch einen A. G. Technology NMWC 10000 Ultrafilter (UFP-10C-4X2A) konzentriert. Aliquots der konzentrierten Lösung wurden beruhend auf dem Anfangsvolumen und API Konzentration während der Ultrafiltration bei verschiedenen Stadien entnommen. Die folgenden API Konzentrationen wurden erhalten: 6,34%, 12,2%, 18,1% und 22,84%. Diese Lösungen dienten zur Herstellung der Endlösungen, welche in der Studie verwendet wurden, und enthielten 5%, 10%, 15% und 20% Protein.
Ergebnisse

Stabilität von konzentrierten API Präparaten, welche wie nachstehend aufgeführt, hergestellt und bei 20–25°C, wie in Tabelle 10 nachstehend gezeigt, gehalten wurden. Tabelle 10: Stabilität von konzentrierten API Präparaten, welche bei 20–25°C gelagert wurden.

Gruppenbeschreibung	Probe I.D. (*)	Protein (mg/mL)	API (mg/mL)	Spezifisch API Aktivität	HPLC % API Monomer	HPLC % API Aggregate
5% API kein Tween	5₀ a	51.92	48.8	0.94	96.8	3.23
	5₃₀ a T-1	49.06	50.4	1.03	96.54	3.48
	5₆₀ a T-1	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
	5₉₀ a T-1	50.9	45.6	0.90	95.01	4.95
5% API 0.01% Tween	5₀ b	50.93	48.2	0.95	97.1	2.81
	5₃₀ b T-1	49.45	50.3	1.02	94.82	5.19
	5₆₀ b T-1	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
	5₉₀ b T-1	51.6	46.8	0.91	94.43	5.42
5% API 0.05% Tween	5₀ c	51.87	49.3	0.95	96.7	3.30
	5₃₀ c T-1	50.49	53.3	1.05	95.41	4.60
	5₆₀ c T-1	48.9	46.9	0.96	93.82	6.10
	5₉₀ T-1	51.3	44.0	0.86	92.28	7.56
5% API 0.1% Tween	5₀ d	51.81	47.8	0.92	96.4	3.62
	5₃₀ d T-1	48.94	51.5	1.05	96.40	3.60
	5₆₀ d T-1	48.9	44.3	0.90	93.59	6.29
	5₉₀ d T-1	51.0	42.0	0.82	91.04	8.90
10% API No Tween	10₀ a	95.48	95.3	1.00	96.4	3.56
	10₃₀ a T-1	97,18	102.6	1.05	95.22	4.78
	10₆₀ a T-1	96.7	94.2	0.93	93.89	6.08
	10₉₀ a T-1	93.8	90.5	0.97	92.72	7.21
10% API 0.01% Tween	10₀ b	95.76	95.0	0.99	96.4	3.62
	10₃₀ b T-1	97.40	106.4	1.09	95.11	4.89
	10₆₀ b T-1	96.2	90.9	0.94	93.98	5.98
	10₉₀ b T-1	95.3	89.0	0.93	92.07	7.85
10% API 0.05% Tween	10₀ c	97.08	93.6	0.96	96.5	3.55
	10₃₀ c T-1	98.17	106.2	1.08	94.35	5.66
	10₆₀ c T-1	97.9	86.7	0.88	92.36	7.65
	10₉₀ c T-1	96.5	89.6	0.93	90.72	9.22
10% API 0.1% Tween	10₀ d	98.01	96.4	0.98	96.2	3.81
	10₃₀ d T-1	97.29	102.7	1.05	93.61	6.39
	10₆₀ d T-1	96.3	91.7	0.95	92.39	7.61
	10₉₀ d T-1	96.9	85.3	0.88	89.43	10.49
15% API kein Tween	15₀ a	147.50	147.2	1.00	96.1	3.90
	15₃₀ a T-1	148.60	139.2	0.94	93.00	7.01
	15₆₀ a T-1	153.5	145.9	0.95	92.29	7.67
	15₉₀ a T-1	151.2	134.2	0.89	89.56	10.36
15% API 0.01% Tween	15₀ b	148.60	151.6	1.02	95.9	3.80
	15₃₀ b T-1	152.00	139.2	0.92	92.95	7.06
	15₆₀ b T-1	152.0	144.5	0.95	91.58	8.40
	15₉₀ b T-1	151.1	134.6	0.89	88.46	11.39
15% API 0.05% Tween	15₀ c	150.10	149.4	0.99	96.0	4.00
	15₃₀ c T-1	150.20	137.6	0.92	92.07	7.94
	15₆₀ c T-1	154.6	143.9	0.93	90.05	9.82
	15₉₀ c T-1	148.4	145.4	0.98	86.50	13.37
15% API 0.1% Tween	15₀ d	149.00	154.7	1.04	96.2	3.74
	15₃₀ d T-1	152.60	142.4	0.93	91.80	8.21
	15₆₀ d T-1	154.4	143.0	0.93	89.27	10.65
	15₉₀ d T-1	147.7	140.5	0.95	85.37	14.38
20% API No Tween	20₀ a	186.8	192.3	1.03	95.6	4.44
	20₃₀ a T-1	190.7	169.0	0.89	90.95	8.98
	20₆₀ a T-1	197.8	159.0	0.80	89.19	10.16
	20₉₀ a T-1	193.1	159.0	0.82	84.93	14.98
20% API 0.01% Tween	20₀ b	191.9	186.5	0.97	95.4	4.59
	20₃₀ b T-1	202.9	175.1	0.86	90.03	9.60
	20₆₀ b T-1	194.7	159.1	0.82	85.86	14.04
	20₉₀ b T-1	192.1	161.1	0.84	85.19	14.70
20% API 0.05% Tween	20₀ c	194.6	192.2	0.99	95.7	4.34
	20₃₀ c T-1	186.4	169.7	0.91	89.85	10.06
	20₆₀ c T-1	187.0	160.1	0.86	87.02	12.98
	20₉₀ c T-1	195.4	160.9	0.82	82.17	17.75
20% API 0.1% Tween	20₀ d	192.3	190.0	0.99	95.4	4.63
	20₃₀ d T-1	199.2	171.8	0.86	88.83	11.10
	20₆₀ d T-1	196.5	160.8	0.82	88.20	11.75
	20₉₀ d T-1	189.0	167.8	0.89	81.39	18.58

*Probencodes:

I. %-20, 15, 10, 5 API
II. Indizes: 0-Zeitpunkt null, 30–4 Wochen, 60–8 Wochen, 90–12 Wochen
III. a: kein Tween, b: 0,01% Tween, c: 0,05% Tween, d: 0,1% Tween
IV. T-1: 25°C, T-2: 2–8°C

Die Stabilität konzentrierter API Präparate, welche, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und in der Kälte bei 2–8°C gehalten wurden, wird in Tabelle 11 nachstehend gezeigt. Tabelle 11: Stabilität konzentrierter API Präparate, welche bei 2–8°C gelagert wurden.

Gruppenbeschreibung	Proben I.D. (*)	Protein (mg/mL)	API (mg/mL)	Spezifische API Aktiviät	HPLC (% API Mono.)	HPLC (% API Aggreg.)
5% API kein Tween	5₀ a	51.92	48.8	0.94	96.8	3.23
	5₃₀ a T-2	48.73	50.3	1.03	96.85	3.15
	5₆₀ a T-2	49.2	50.4	1.02	96.46	3.55
	5₉₀ a T-2	50.4	48.6	0.97	96.14	3.87
5% API 0.01% Tween	5₀ b	50.93	48.2	0.95	97.1	2.81
	5₃₀ b T-2	49.12	52.1	1.06	96.58	3.43
	5₆₀ b T-2	49.4	48.6	0.98	95.83	4.18
	5₉₀ b T-2	50.8	45.2	0.89	95.55	4.46
5% API 0.05% Tween	5₀ c	51.87	49.3	0.95	95.7	3.30
	5₃₀ c T-2	49.67	52.1	1.05	95.60	4.41
	5₆₀ c T-2	49.3	48.4	0.98	94.89	5.12
	5₉₀ c T-2	49.4	48.6	0.98	93.56	6.45
5% API 0.1% Tween	5₀ d	51.81	47.8	0.92	96.4	3.62
	5₃₀ d T-2	49.06	52.8	1.08	94.52	5.35
	5₆₀ d T-2	49.4	47.2	0.96	92.94	7.07
	5₉₀ d T-2	49.9	462	0.93	91.68	8.32
10% API kein Tween	10₀ a	95.48	95.3	1.00	96.4	3.56
	10₃₀ a T-2	96.58	103.9	1.08	96.18	3.82
	10₆₀ a T-2	96.9	94.1	0.97	95.53	4.48
	10₉₀ a T-2	96.6	99.7	1.03	95.03	4.89
10% API 0.01% Tween	10₀ b	95.76	95.0	0.99	96.4	3.62
	10₃₀ b T-2	97.02	108.0	1.11	96.06	3.95
	10₆₀ b T-2	96.6	95.7	0.99	95.36	4.65
	10₉₀ b T-2	97.3	97.4	1.00	94.15	5.82
10% API 0.05% Tween	10₀ c	97.08	93.6	0.96	96.5	3.55
	10₃₀ c T-2	97.73	98.40	1.01	95.18	4.72
	10₆₀ C T-2	97.5	96.5	0.99	94.82	5.19
	10₉₀ c T-2	97.3	97.9	1.01	93.32	6.64
10% API 0.1% Tween	10₀ d	98.01	96.4	0.98	96.2	3.81
	10₃₀ d T-2	96.96	106.7	1.10	94.59	5.41
	10₆₀ d T-2	99.7	97.5	0.98	93.66	6.35
	10₉₀ d T-2	96.9	93.9	0.97	91.37	8.51
15% API kein Tween	15₀ a	141.50	147.2	1.00	96.1	3.90
	15₃₀ a T-2	150.00	150.7	1.00	94.95	5.06
	15₆₀ a T-2	150.6	145.5	0.97	95.17	4.85
	15₉₀ a T-2	146.7	149.7	1.02	93.88	6.06
15% API 0.01% Tween	15₀ b	148.60	151.6	1.02	95.9	3.80
	15₃₀ b T-2	150.40	145.0	0.96	94.90	5.21
	15₆₀ b T-2	149.1	149.3	1.00	94.26	5.75
	15₉₀ b T-2	146.6	153.0	1.04	93.11	6.90
15% API 0.05% Tween	15₀ c	150.10	149.4	0.99	96.0	4.00
	15₃₀ c T-2	150.20	138.9	0.92	95.00	4.84
	15₆₀ c T-2	152.1	150.1	0.99	93.67	6.33
	15₉₀ c T-2	146.7	149.5	1.02	92.24	7.77
15% API 0.1% Tween	15₀ d	149.00	154.7	1.04	96.2	3.74
	15₃₀ d T-2	149.00	141.8	0.95	94.90	5.08
	15₆₀ d T-2	152.5	146.8	0.96	93.18	6.83
	15₉₀ d T-2	146.9	148.0	1.01	91.10	8.92
20% API kein Tween	20₀ a	186.8	192.3	1.03	95.6	4.44
	20₃₀ a T-2	194.7	_185.8	_0.95	_94.03	5.99
	20₆₀ a T-2	194.5	190.9	0.98	93.90	6.11
	20₉₀ a T-2	190.3	194.8	1.02	92.33	7.47
20% API 0.01% Tween	20₀ b	191.9	186.5	0.97	95.4	4.59
	20₃₀ b T-2	200.3	189.9	0.95	94.03	5.97
	20₆₀ b T-2	192.9	194.9	1.01	93.55	6.46
	20₉₀ b T-2	189.8	188.8	4.99	91.85	7.87
20% API 0.05% Tween	20₀ c	194.6	192.2	0.99	95.7	4.34
	20₃₀ c T-2	207.7	193.6	0.93	93.75	626
	20₆₀ c T-2	189.7	202.4	1.07	92.36	7.65
	20₉₀ c T-2	196.0	189.9	0.97	91.25	8.57
20% API 0.1% Tween	20₀ d	192.3	190.0	0.99	95.4	4.63
	20₃₀ d T-2	198.2	190.3	0.96	93.33	6.67
	20₆₀ c T-2	190.2	202.0	1.06	92.69	7.32
	20₉₀ c T-2	196.4	185.8	0.95	90.10	9.53

*Probencodes:

Die in den vorstehend aufgeführten Tabellen gezeigten Daten zeigen, dass die Abnahme des Prozentsatzes der aktiven monomeren Form von API nicht immer durch die Aktivitätsdaten widergespiegelt wird, welche durch den Elastaseassay erhalten werden. Die API Aktivität wurde daher durch den Prozentsatz an API Monomeren bewertet, welche mittels HPLC bestimmt wurden.

Eine graphische Darstellung wurde eingesetzt, um die Stabilität von API nach 12 und 24 Monaten zu schätzen, welches bei den vorstehend beschriebenen Bedingungen gelagert wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 nachstehend zusammengefasst. Tabelle 12: Erwarteter Prozentsatz an API Monomeren nach 12 Monaten Lagerung bei 2–8°C.

Konzentration von API, %	Konzentration von Tween 80, %	Prozentsatz an API Monomer
Konzentration von API, %	Konzentration von Tween 80, %	Zeitpunkt Null	12 Monat	24 Monat
5	0	97.0	94.1	91.3
	0.01		90.2	83.1
	0.05		84.3	71.7
	0.1		77.0	57.4
10	0	96.6	90.9	85.2
	0.01		87.7	78.7
	0.05		84.6	72.6
	0.1		78.0	59.4
15	0	96.2	88.3	80.4
	0.01		84.1	72.0
	0.05		80.6	65.0
	0.1		75.4	54.6
20	0	95.6	84.2	72.8
	0.01		82.2	70.0
	0.05		78.3	61.0
	0.1		76.6	57.6

Schlussfolgerungen
Der Einsatz von Ultrafiltration zum Konzentrieren der 2% Lösung, welche durch das vorliegende Verfahren erhalten wurde, verursachte die Bildung von einigen Aggregaten. Die konzentrierten Lösungen enthielten daher am Anfang des Assays bereits eine höhere Aggregatkonzentration im Vergleich zu der Aggregatkonzentration in der anfänglichen 2% Lösung. Die Anwesenheit von Tween 80 in der konzentrierten Lösung führte zu einer Zunahme der Aggregation während dem Lagerungszeitraum. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Darüber hinaus führte eine Zunahme der anfänglichen API Konzentration zu einer Zunahme bei der Bildung von Aggregaten. Dieses Phänomen wurde während des ganzen Assays, sowohl bei Temperaturbedingungen als auch mit oder ohne Tween 80, beobachtet. Allgemeine Analysen aller erhaltenen Daten zeigen jedoch eindeutig, dass konzentrierte Lösungen von API, welches bei 2–8°C gelagert wird, für zumindest 3 Monate im Wesentlichen stabil sind und bei dieser Temperatur für ein Jahr, selbst in der Anwesenheit von etwas Tween 80, eine gute Wirksamkeit beibehalten werden. Die gebrauchsfertige API-enthaltende, fluide Präparation, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, ist daher zu Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche parenteral als auch mittels Inhalation verabreicht werden sollen, auf äußerste geeignet.

Claims

Verfahren zum Reinigen von Alpha-1 Proteinaseinhibitor (API) aus einem nicht gereinigten Proteingemisch, umfassend: a. Dispergieren des API beinhaltenden, nicht gereinigten Proteingemischs in einem wässrigen Medium, b. Entfernen eines Teils verunreinigender Lipide und Lipoproteine durch Zugabe von Siliziumdioxid zu der wässrigen Dispersion als ein Mittel zum Entfernen von Lipid und Präzipitieren des Teils verunreinigender Proteinen aus der wässrigen Dispersion, indem Polyalkylenglycol zugegebenen wird, c. Laden des API beinhaltenden Überstandes von Schritt (b), der API beinhaltet auf ein erstes Anionen-Austauschharz mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert und eine Leitfähigkeit aufweist, so dass API an dem ersten Anionen-Austauschharz zurückgehalten wird, d. Eluieren einer API beinhaltenden Fraktion von dem ersten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp wie in Schritt (c), dessen pH-Wert und Leitfähigkeit eingestellt wurde, e. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (d) auf ein Kationen-Austauschharz in dem gleichen Puffertyp, der einen geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API nicht an dem Kationen-Austauschharz zurückgehalten wird, f. Gewinnen des Durchflusses von Schritt (e), der API beinhaltet, g. Laden der API beinhaltenden Fraktion von Schritt (f) auf ein zweites Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, der einen geeigneten pH-Wert und eine geeignete Leitfähigkeit aufweist, so dass API an das zweite Anionen-Austauschharz bindet, h. Eluieren von API von dem zweiten Anionen-Austauschharz mit dem gleichen Puffertyp, dessen pH-Wert und Leitfähigkeit so eingestellt wurden, um eine Lösung zu erhalten, die gereinigtes, aktives API enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das aus dem Gesamt-API wiedergewonnene, erhaltene API mindestens 90% aktives API umfasst, wobei vorzugsweise das aus dem Gesamt-API wiedergewonnene, erhaltene API mindestens 95% aktives API umfasst, oder wobei die API-Lösung mindestens 90% API aus dem wiedergewonnenen Gesamt-Protein umfasst, wobei vorzugsweise das erhaltene API mindestens 95% API aus dem wiedergewonnenen Gesamt-Protein umfasst, oder wobei die Puffer-Lösung anders ist als ein auf Citrat basierender Puffer, oder wobei die Puffer-Lösung ein auf Acetat basierender Puffer ist, oder weiterhin einen Virus-Entfernungsschritt umfasst, wobei vorzugsweise der Virus-Entfernungsschritt eine Nano-Filtration umfasst, oder wobei das nicht gereinigte Gemisch von Proteinen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cohn Fraktionen, humanem Blutplasma und Plasmafraktionen, wobei vorzugsweise das nicht gereinigte Proteingemisch Cohn Fraktion IV-Paste ist, oder wobei das erste und das zweite Anionen-Austauschharz ein DEAE-Sepharose-Harz ist, oder wobei das Kationen-Austauschharz ein Carboxymethyl-Sepharose-Harz ist, oder wobei sich der pH-Wert der Pufferlösung für die Elution des API von dem ersten und zweiten Anionen-Austauschharz zwischen einem pH-Wert von 5,5 und 6,5 befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin einen viralen Inaktivierungsschritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der virale Inaktivierungsschritt umfasst, Zugeben eines Lösungsmittels und eines Detergenz zu dem API von Schritt (1), das von dem Kationen-Austauschharz gesammelt wurde, wobei vorzugsweise das Detergenz ein nicht-ionisches Detergenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polyalkylenglycol Polyethylenglycol ist, oder wobei die Präzipitation bei einem pH-Wert von ungefähr 5,0 bis ungefähr 6,5 ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend, Ändern der Ionen-Zusammensetzung der Lösung, die gereinigtes, aktives API beinhaltet, um ein physiologisch verträgliches Ion zu erhalten und Sterilisieren der erhaltenen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die API beinhaltende Lösung vor dem Ionenaustausch konzentriert wird, oder wobei das physiologisch verträgliche Ion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphat-Ion, einem Chlorid-Ion und Kombinationen davon.