DE602004011361T2 - Reversibel immortalizierte, olfaktorische nerven einschliessende glia zellen und deren verwendung zur förderung der nervenregenerierung - Google Patents

Reversibel immortalizierte, olfaktorische nerven einschliessende glia zellen und deren verwendung zur förderung der nervenregenerierung Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuronale Wiederherstellung. Speziell gewährt die Erfindung einen speziellen Typ von Zellen, nämlich olfaktorisch einschlließende Glia (OEG), die reversibel immortalisiert und in Kultur genommen sind, die funktionsfähig und sicher bei der Verwendung in einer Transplantation sind. Die Erfindung findet spezielle Anwendung in Transplantationen, die auf neurale Bereiche gerichtet sind, wie beispielsweise Gehirn, Rückenmark und/oder periphere Nerven, eines Menschen, um die Wiederherstellung einer akuten und chronischen Nervenschädigung nach Operation oder Trauma zu fördern.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • OLFAKTORISCH EINHÜLLENENDE GLIA (OEG)
  • Aus den Untersuchungen von Ramón y Cajal ist bekannt, dass die Fähigkeit von erwachsenen Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) zur Regeneration außerordentlich beschränkt ist. Im Gegensatz dazu verfügen Neuronen aus dem peripheren Nervensystem über ein bemerkenswertes Vermögen zur Regeneration, das unter anderen Faktoren auf spezielle Merkmale der Schwann-Zellen (SC) mit eingehüllten PNS-Axonen zurückgeführt werden kann. Diese Tatsache hat die Verwendung von peripheren Nerven und SC-Transplantaten zur Verbesserung der Regeneration im ZNS mit viel versprechenden Ergebnissen angeregt (Übersichtsarbeit in Jones LL, et al., "Neurotrophic factors, cellular bridges and gene therapy for spinal cord injury", J. Physiol 2001; 533: 83–89). Nichtsdestoweniger macht die unvollständige ZNS-Regeneration mit SC die Suche nach wirksameren Regenerationsmediatoren erforderlich.
  • Aufgrund ihrer speziellen Eigenschaften hat die Verwendung von OEG-Zellen für eine ZNS-Regeneration während der letzten Jahre starke Aufmerksamkeit erhalten. Das olfaktorische System verfügt über bemerkenswerte, differenzierte Eigenschaften innerhalb des Zentralnervensystems erwachsener Säuger. Während der gesamten Lebenszeit eines Organismus werden von an dem olfaktorischen Neuroepithelium vorhandene Vorläuferzellen olfaktorische, sensorische Neuronen erneuert. Sensorische Neuronen von Neugeborenen erweitern neue Axonen, die wachsen und in das ZNS eintreten, um ihre entsprechenden Verknüpfungen in der glomerularen Schicht der Bulbus olfactorius herzustellen. Diese olfaktorischen Axonen sind von einem speziellen Typ von Gliazellen umgeben, die als olfaktorisch einhüllende Glia (OEG) bezeichnet wird.
  • In vivo OEG-Zellen exprimieren mehrere Marker, die für deren Identifikation nach Isolation und Kultivierung verwendet worden sind (siehe Ramon-Cueto A., Avila J. "Olfatory ensheathing glia: properties and function", Brian Res. Bull. 1998; 46: 175–187 und darin enthaltene Literaturstellen). Die OEG-Zellen teilen einige Eigenschaften mit Schwann-Zellen und Astrocyten, obgleich sie ein unterschiedliches Muster von Markern und Eigenschaften präsentieren, mit denen ihre Klassifikation als eine andere Klasse von Gliazellen möglich ist.
  • In Kulturen sind zwei OEG-Zellvarianten identifiziert worden. In Serum-freiem Medium haben Barnett und Mitarbeiter (Franceschini IA, Barnett SC. "Low-affinity NGF-receptor and E-N-CAM expression define two types of olfactory nerve ensheathing cells that share a common lineage". Dev. Biol. 1996; 173: 327–343) zwei extreme, morpholigische Typen in den OEG-Zellkulturen identifiziert, nämlich eine astrocytenähnliche Flachzelle, die GFAP (Faserverbind) exprimiert und PSA-NCAM und auf p75- NGFr negativ ist sowie einen zweiten Type einer Schwann-ähnlichen Spindelzelle, die p75-NGFr exprimiert mit diffusem Farben auf GFAP und negativ auf PSA-NCAM. Alle diese Intermediat-Phänotypen sind möglich und die Beobachtung dieser Phänotypen selbst in einer erzeugten, klonierten Zelllinie stützt die Ansicht, dass sie von einem gemeinsamen Präkursor abgeleitet sind. In unseren OEG-Zellkulturen von erwachsenen Ratten und Human-Spendern haben wir außerdem sowohl morphologische Typen von Zellen als auch die Intermediat-Phänotypen nachgewiesen.
  • Anhand der Daten, die aus unserem Labor und anderen Laboratorien erhalten wurden, ist es zweifelsfrei, dass OEGs eindeutig von Astrocyten oder Schwann-Zellen unabhängig vom Alter des murinen oder humanen Spenders verschieden sind.
  • Die Fähigkeit von OEG-Zellen zur Förderung des Neuritenauswuchses lässt sich zur Ermittlung von Neuritogenese- und/oder Regenerationsmodellen in Kultur verwenden. Der Neuritenauswuchs in Kultur kann einfach eine Neuritogenese anzeigen, wenn embryonische oder neonatale Neuronen verwendet werden. Allerdings lasst sich die Neuritenextension von Erwachsenen-ZNS-Neuronen als ein Kulturmodell für die ZNS-Regeneration betrachten. So haben Wigley und Berry ein Modell für eine Co-Kultur aufgestellt, indem retinale Erwachsenen-Ganglionzellen (nachfolgend RGC) auf einschichtigen Gliazellen verwendet wurden. Erwachsenen-RGC, die auf einer konfluenten Monoschicht von neonatalen, cortikalen Astrocyten kultiviert wurden, sind zum erneuten Nachwachsenlassen von Neutriten über lange Distanzen in der Lage (Wigley CB., Berry M. "Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons", Brain Res. 1988; 470: 85–98). In einer neueren Untersuchung verwendeten Wigley und Mitarbeiter das gleiche Modell, sie verglichen eine Monoschicht von erwachsenen Ratten-OEG mit Neonatalastrocyten und SC. Sie demonstrierten, dass erwachsene Ratten-OEG-Zellen das beste Substrat für eine Neuritenregeneration von erwachsener RGC in Kultur und dieser Effekt hauptsächlich vom interzellularen Kontakt und von Calcium abhängen. Zelluläre Oberflächenmoleküle (Faktoren der Adhäsion, der axonalen Führung usw.) sind bei erwachsenen RGC wichtig, wie von Sonigra und Mitarbeitern demonstriert wurde (Sonigra RJ, Brighton PC, Jacoby J, Hall S, Wigley CB. "Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoten of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture", Glia 1999; 25: 256–269), wobei jedoch deren exakte Identität nicht bestimmt worden ist.
  • Eine anfängliche Regeneration im ZNS ist mit Hilfe der Verwendung von PNS-Schwann-Zellen(SC)-Transplantaten erzielt worden. ZNS-nachwachsende Axone sind zur Durchdringung in diese permissive Umgebung in der Lage, wobei jedoch das Problem in dem geringen Wirkungsgrad des Widereintritts in das zu der Läsion distalen ZNS-Gewebes liegt. Frühere Experimente haben gezeigt, dass OEG-Zellen in der Lage sind, den Wiedereintritt peripherer, sensorischer Axonen in die Rückenmark-ZNS-Umgebung nach Rhizotomie zu vermitteln. Der Wiedereintritt von regenerierenden Axonen in das ZNS ist ebenfalls nach vollständiger Transektion des Rückenmarks beobachtet worden, wen ein überbrückendes Rohr mit SC- und OEG-Zellen eingesetzt wurde. Das Vorhandensein von OEG-Zellen verringerte die Bildung von glialen Narben und schuf einen axonalen Durchgang an der Grenzfläche Transplantat/Wirt. Diese Methode bot eine Möglichkeit zur Erhöhng des Wirkungsgrades des Widereintritts von regenerierenden Axonen in das ZNS-Wirtsgewebe. Die Anwendung des Modells einer vollständigen Transektion von Ratten-Rückenmark, ein außerordentliches Maß der ZNS-Regeneration, die mehrere Trakte im Rückenmark beeinflusst, ist ebenfalls mit einer begleitenden, funktionellen Wiederherstellung demonstriert worden, was mit Hilfe von Verhaltenstests gemessen wurde (Ramon-Cueto A, et al. "Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia", Neuron 2000; 25: 425–435). OEG-Zellen scheinen in der Lage zu sein, im ZNS-Wirtsgewebe zu migrieren und mit den wachsenden Axonen mitzulaufen, womit eine für die ZNS-Regeneration günstige Mikroumgebung geboten wird.
  • Alle diese Daten stützen die Ansicht, dass OEG-Zellen sich funktionell von den anderen neuralen Zellen, wie beispielsweise den Astrocyten oder Schwan-Zellen, unterscheiden.
  • Eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Verwendung dieser Zellen ist ein vollständiges Verständnis ihrer Wachstumsbedingungen. Bestimmte Mitogene für OEG-Zellen wurden anfänglich charakterisiert wie Faktoren, die in einem mit Astrocyten konditioniertem Medium (ACM) bestehen, die nicht an Heparin binden und mit Antikörpern gegen Neuregulin-1 (NRG-1) gehemmt werden können. Darüber hinaus ist halbgereinigter, boviner Hypophysenextrakt, der ein Ausgangsstoff für mehrere gliale Mitogene und einschließlich GGF einer NRG-1 ist, auf OEG aktiv.
  • Während Experimente an Ratten ausgeführt wurden, die vermuten lassen, dass OEG-Zelltransplantate eine funktionelle Wiederherstellung nach Rückenmarksverletzungen begünstigen, sind diese Untersuchungen auf Primaten ausgeweitet worden, wo die supraspinale Kontrolle motorischer Funktionen grundlegend ist, um eine funktionelle Wiederherstellung einzuschätzen. In diesem Zusammenhang ist die Verfügbarkeit einer nicht eingeschränkten Quelle, auf die man zugreifen kann, von Human-OEG-Zellen zum Transplantieren in Patienten von größter Bedeutung. Wir haben Bedingungen für eine verlängerte Subkultur von erwachsenen Ratten-OEG-Zellen unter Verwendung einer speziellen Mischung von trophischen Faktoren, biochemischen Verbindungen und Medium definiert. Diese Kombination ermöglicht das Wachstum der Human-OEG-Zellen. Allerdings verlieren nach längerer Inkulturnahme OEG-Zellen ihre Fähigkeit, die axonale Regeneration von erwachsenen ZNS-Neuronen zu unterstützen, obgleich sie die Fähigkeit aufrechterhalten, eine axonale Erweiterung von jungen Neuronen zu stützen. Eine derartige, lang anhaltende Inkulturnahme von OEG-Zellen scheint keine Alternative dafür zu sein, eine ausreichende Population zum Transplantieren zu erhalten.
  • Die WO 02/088337 offenbart eine Methode, um große Menge an OEG-Zellen zu erhalten, die das Infizieren von primären OEG-Zellen mit retroviralen Vektoren umfasst, wobei diese Vektoren die telomerase-katalytische Subeinheit Tert aufweisen, um modifizierte OEG-Zellen zu erhalten. Allerdings wird nichts über die Fähigkeit dieser Zellen ausgesagt, die axonale Regeneration von erwachsenen ZNS-Neuronen zu unterstützen.
  • Eine Alternative dazu, über eine unbegrenzte Menge an OEGs zu verfügen, ist die Erzeugung von immortalisierten nicht-tumorgenen, klonalen Zelllinien, die die axonale Regeneration unterstützenden Eigenschaften von primären OEG-Zellkulturen bewahren. Es sind klonierte Ratten-OEG-Zelllinie durch Immortalisation unter Verwendung des SV40-großen-T-Antigens entwickelt worden, das von einem konstitutiven, zellularen Promotor exprimiert wird (Moreno-Flores MT, et al. "Immortalised olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons", J. Neurochem. 2003; 85: 861871). Einige dieser immortalisierten Ratten-OEGs zeigten sich vergleichbar mit primären Ratten-OEG- Zellen und SC hinsichtlich der Förderung der axonalen Regeneration von erwachsenem RGN. Allerdings ist das anhaltende Vorhandensein des Onkogens (in diesem Fall ein Gen, das SV40-groß-T-Antigen codiert) in diesen Zellen ein Problem insofern, dass es das Risiko einer malignen Transformation erhöhen kann, die nach der Transplantation erfolgt.
  • Es besteht immer noch ein Bedarf für eine zugängliche und nicht beschränkte Quelle von Human-OEG-Zellen, die die Eigenschaften der Förderung der axonalen Regeneration bewahren und gleichzeitig die Erzeugung von Tumoren vermeiden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Der Gegenstand unserer Erfindung beruht auf der Fähigkeit von OEG-Zellen, die neuronale, axonale Regeneration in vitro und in vivo zu fördern, eine Fähigkeit, die bis jetzt von keinem anderen Zelltyp, primär oder genetisch modifiziert, in diesem Umfang geteilt wird. Wir haben eine Möglichkeit gefunden, durch reversible, genetische Modifikation und Auswahl unbegrenzter Mengen an OEG-Zellen zu erhalten, die ihre Fähigkeit zu einer axonalen Regeneration bewahren.
  • Im Verlaufe unserer Untersuchungen haben wir eine Prozedur gefunden, primäre Zellen umgekehrt zu immortalisieren und immortalisierte, klonierte Zelllinien von OEGs von Human-Spendern zu erhalten. Wir haben in Tests festgestellt, dass alle diese Zelllinien stark primären OEGs hinsichtlich ihrer molekularen Marker ähneln. Vor allem haben wir festgestellt, dass einige dieser Zelllinien ihre Fähigkeit zur Unterstützung der axonalen Regeneration von erwachsenen Neuronen selbst dann bewahren, wenn der Prozess der Immortalisation umgekehrt wird.
  • Nach einem der Aspekte der vorliegenden Erfindung wird eine reversibel immortalisierte oder umgekehrt immortalisierte, humane, olfaktorische, einhüllende Glia (OEG-Zelllinie) bereitgestellt. Diese Zelllinie kann in einer Therapiemethode angewendet werden, wie beispielsweise in einer Methode zur Förderung der neuronalen Regeneration, indem diese Zellen in die Regionen der Verletzung in dem Zentralnervensystem und/oder peripheren Nervensystem transplantiert werden.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen einer Population von funktionellen Human-OEG-Zellen zur Transplantation in einen Patienten bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe von primären OEG; (b) Immortalisieren der OEG-Zellen durch Transformieren der OEG-Zellen mit einem Vektor, der ein entfernbares DNA-Segment aufweist, welches ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen enthält, wodurch immortalisierte OEG-Zellen erzeugt werden; (c) Aufziehen der immortalisierten OEG-Zellen; (d) Auswählen derjenigen immortalisierten, klonalen OEG-Zelllinien, die die funktionellen Eigenschaften von Eltern-OEG-Zellen bewahren (d. h. die Fähigkeit eine axonale Regeneration erwachsener CNS-Neuronen auszulösen) und (e) Entfernen des Onkogens (oder der Kombination von Onkogenen) aus den immortalisierten OEG-Zellen, wobei die Entfernung zur Erzeugung der Population von Human-OEG-Zellen für die Transplantation in den Patienten führt. Bevorzugt werden die OEG-Zellen aus einem Human-Spender erhalten, und das Onkogen ist ein beliebiges Gen, das in der Lage ist, den Eintritt in die Seneszenz zu umgehen, einschließlich solche, die SV40-groß-T-Antigen codieren, telomerase-katalytische Subeinheit, Bmi-1-Protein oder irgendeine Kombination dieser Onkogene.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung geschaffen, die diese funktionelle, menschliche, olfaktorische, umhüllende Glia(OEG)-Zelle aufweist und einen pharmazeutisch duldbaren Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine reversibel immortalisierte OEG-Zelle.
  • Das Onkogen (oder eine Kombination von Onkogenen) wird entfernbar bevorzugt erzeugt, indem es mit Rekombinase-Targetstellen flaniert wird und das Entfernen durch Einführen in die immortalisierten Zellen eines Gens erreicht wird, das zur Erzeugung einer Rekombinase exprimiert wird, die speziell die Rekombinase-Targetstellen erkennt. Bevorzugt ist die Rekombinase Cre-Rekombinase, während die Rekombinase-Targetstellen loxP-Stellen sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen enthält das entfernbare DNA-Segment ferner ein Suizidgen, das ein Genprodukt codiert, welches die Zerstörung der immortalisierten Zelle durch ein exogenes Mittel ermöglicht, wenn das entfernbare DNA-Segment nicht aus den Zellen entfernt ist. Bevorzugt ist das Suizidgen ein Gen, welches Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codiert und die Zellen durch Exponierung an Gancyclovir zerstört werden, wenn das entfernbare DNA-Segment nicht aus den Zellen entfernt ist.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung gewährt ein Verfahren zum Erzeugen einer Population von funktionellen Human-OEG-Zellen zur Transplantation in einen Patienten, welches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe von primären OEG; (b) Immortalisieren der OEG-Zellen durch Transformieren der OEG-Zellen mit einem Vektor, der ein entfernbares DNA-Konstrukt aufweist, das ein Onkogen (oder eine Kombination von Onkogenen) enthält, ein selektierbares Markergen und ein Gen, das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codiert, wobei die Gene zusammen an beiden Seiten von loxP-Stellen flankiert sind; (c) Aufziehen der immortalisierten OEG; (d) Auswählen solcher klonaler OEG-Zellen, die die funktionellen Eigenschaften von Eltern-OEG-Zellen bewahren und (e) Umkehren der Immortalisierung der OEG-Zellen durch Entfernen des DNA-Konstruktes aus den immortalisierten OEG-Zellen, wobei das Entfernen durch Einführen eines Gens in die immortalisierten OEG-Zellen erzielt wird, das eine Cre-Rekombinaseaufspaltung codiert, um die Exzision des DNA-Konstruktes an den loxP-Stellen zu bewirkten, wobei die Exzision zur Erzeugung der Population von funktionellen OEG-Zellen für eine Transplantation in den Patienten ergibt.
  • Populationen von funktionellen Human-OEG-Zellen, die mit Hilfe der vorgenannten Verfahren erzeugt werden, werden ebenfalls zusammen mit der Verwendung von Human-OEG-Zellen bereitgestellt, die mit Hilfe der vorgenannten Verfahren in der Erzeugung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten auf neuronale Schädigung erzeugt wurden, welches Verfahren das Transplantieren dieser OEG-Zellen in neuronale Regionen umfasst, wie beispielsweise Gehirn, Rückenmark und/oder periphere Nerven, die bei einem Patienten geschädigt oder verletzt sind, und zwar in einer ausreichenden Menge solcher OEG-Zellen, um die neuronalen Schädigungen oder Verletzungen in dem Patienten zu beheben oder die Wiederherstellsung einer akuten oder chronischen Nervenschädigung nach chirurgischem Eingriff oder Trauma zu fördern.
  • Nach einem anderen Aspekt gewährt die Erfindung reversibel immortalisierte Human-OEG-Zellen, die eine primäre OEG-Zelle aufweisen, die mit einem DNA-Konstrukt transformiert ist, welches zwei Rekombinase-Targetstellen aufweist, die ein Onkogen flankieren (oder eine Kombination von Onkogenen), die zur Immortalisation der OEG-Zelle beitragen, wobei die Immortalisation infolge der Exzision des DNA-Konstruktes durch Spaltung an den Rekombinase-Targetstellen reversibel ist, wenn die Targetstellen an einer Rekombinase exponiert werden, die speziell die Targetstellen erkennt. Die Rekombinase-Targetstellen sind vorzugsweise loxP-Stellen und die Immortalisation ist infolge der Cre-Rekombinaseaufspaltung an den loxP-Stellen reversibel. Das DNA-Konstrukt kann ferner ein selektierbares Markergen einschließend und ferner ein Suizidgen aufweisen, das ein Genprodukt codiert, welches zur Zerstörung der immortalisierten OEG-Zelle durch ein exogenes Mittel in der Lage ist, wenn das DNA-Konstrukt nicht aus den Zellen entfernt ist. Bevorzugt ist das Suizidgen ein Gen, welches Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codiert, während das exogene Mittel Gancyclovir ist.
  • In einer der Ausführungsformen wird eine reversibel immortalisierte Human-OEG-Zelllinie geschaffen.
  • Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine reversibel immortalisierte Human-OEG-Zelle geschaffen, die bei Transplantation in einen Patienten funktionsfähig ist, erzeugt durch Exponieren des DNA-Konstruktes im Inneren der vorstehend beschriebenen, immortalisierten OEG-Zelle an einer Rekombinase, welche das DNA-Konstrukt durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen exzidiert. Die Verwendung der vorstehend beschriebenen immortalisierten OEG-Zellen in der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Patienten auf neuronale Schädigung wird ebenfalls gewährt, wobei das Medikament eine ausreichende Menge dieser reversibel immortalisierten OEG-Zelle zum Transplantieren in den verletzten Bereich eines Patienten aufweist, um die neuronale Regeneration in dem Patienten zu fördern.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die allgemeine Morphologie von Human-OEG-Zellen nach Dissoziation und Aufziehen für eine Woche (DIV 1) oder nach fünf aufeinander folgenden Passagen (DIV 2).
  • 2 zeigt die Immunfluoreszenz von Human-OEG, gefärbt mit Antikörpern gegen glialen Markern, wie beispielsweise Neuroligin, APP (22C11), S100 und GFAP.
  • 3 zeigt die Expression von Vertretern der EGF-R-Familie. Es wurden Zellenextrakte, die von Human-OEGs in verschiedenen Medien erhalten wurden, mit Hilfe des Western-Blots mit Antikörpern gegen Erb B2, Erb B3 und Erb B4 analysiert. Als eine beladene Kontrolle wurde Tubulin verwendet. Die Figur enthält die Daten aus einem ähnlichen Experiment mit einem Parallel-Kulturmedium aus etablierten Zelllinien von Ratten-OEGs.
  • 4 zeigt die axonale Regenerationsfähigkeit von retinalen Ratten-Neuronen, gefärbt mit Antikörpern gegen neuronale Proteine, wie beispielsweise neuronalspezifisches Tubulin (334), axonalen Proteinen, wie beispielsweise MAPIB-SM131 (SM131) oder MAP2 (305) oder dem somatodendritischen Protein MAP2 (514).
  • 5 zeigt eine schematische Darstellung des lentiviralen Konstrukts pLOX-Ttag-Ires-TK, welches als Onkogen das Gen enthält, das SV40-groß-T-Antigen codiert.
  • 6 eine schematische Darstellung des lentiviralen Konstrukts pLOX-HTERT-Ires-TK, das als Onkogen das Gen enthält, welches die telomerase-katalytische Subeinheit codiert.
  • 7 zeigt eine schematische Darstellung des lentiviralen Konstrukts pLOX-CWBmil, das als Onkogen das Gen enthält, welches Bmi-1-Protein codiert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung gelangen auf dem Fachgebiet gut bekannte Methoden der konventionellen Molekularbiologie, Mikrobiologie und Methoden der rekombinanten DNA-Methoden zum Einsatz. Siehe hierzu beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laborstory Manual" (1989); "DNA Cloning: A Practical Approach", Band I und II (D. N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. Higgins Herausgeber (1985)]; "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins Herausgeber (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); oder "Current Protocols in Molecular Biology", Herausgeber Frederick M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1999.
  • Der Begriff "Nucleinsäure-Konstrukt" oder "DNA-Konstrukt" wird gelegentlich verwendet, um codierende Sequenzen oder Sequenzen zu zeichnen, die funktionsfähig mit entsprechenden regulatorischen Sequenzen verknüpft sind und in einen Vektor mm Transformieren einer Zelle insertiert sind. Der Begriff kann austauschbar mit dem Begriff "transformierende DNA" verwendet werden. Ein solcher Nucleinsäure-Konstrukt kann eine codierende Sequenz für ein Genprodukt enthalten, das von Interesse ist, zusammen mit einem selektierbaren Markergen und/oder Reportergen.
  • Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" oder "funktionsfähig insertiert" bedeutet hierin, dass die regulatorischen Sequenzen, die zur Expression der codierenden Sequenz benötigt werden, in ein Nucleinsäure-Molekül in den entsprechenden Stellungen in Bezug auf die codierende Sequenz eingesetzt sind, um so die Expression der codierenden Sequenz zu ermöglichen. Die gleiche Definition gilt gelegentlich für die Anordnung anderer Kontrollelemente der Transkription (zum Beispiel Enhancers) in einem Expressionsvektor.
  • Der Begriff "selektierbares Markergen" bezieht sich auf ein produktcodierendes Gen, das, wenn es exprimiert ist, einen selektierbaren Phänotyp beiträgt, wie beispielsweise antibiotische Widerstandsfähigkeit auf einer transformierten Zellen.
  • Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie beispielsweise Plamid, Phage, Cosmid oder Virus, in den ein anderes Nucleinsäure-Segement funktionsfähig insertiert werden kann, um eine Replikation oder Expression des Segmentes zustande zu bringen. Spezieller bezieht sich der Begriff "viraler Vektor" auf einen Virus, der zur Übertragung einer fremden oder heterologen, genetischen Information an einen Wirt in der Lage ist. Diese fremde genetische Information kann in ein Proteinprodukt translatiert werden, was jedoch für die Fremdinformation keine notwendige Voraussetzung ist.
  • Die Begriffe "Immortalisation" oder "immortalisiert" bezeichnen eine Zelle oder einen Prozess zum Erzeugen einer Zelle, die in Kultur unbegrenzt proliferiert und so den Eintritt in Seneszenz umgeht. In der vorliegenden Erfindung bezeichnet die Immortalisation einen Prozess, durch den eine primäre Zellkultur in einer solchen Weise transformiert wird, die dazu führt, dass sich die Zellen in einigen Punkten ähnlich wie eine Tumorzelle verhalten und speziell in der proliferativen Charakteristik von Tumorzellen.
  • Der Begriff "Selektion" bezieht sich auf einen Prozess, mit Hilfe dessen immortalisierte, klonierte OEG-Zelllinien einzeln auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung des neuronalen Überlebens und zur Förderung der axonalen Regeneration von erwachsenen ZNS-Neuronen assayiert wird, um ausschließlich solche klonierte Zelllinien auszuwählen, die diese funktionellen Eigenschaften aufrecht erhalten.
  • Der Begriff "Umkehr-Immortalisation" bezieht sich auf einen Prozess, mit Hilfe dessen Zellen mit einem Mittel immortalisiert werden, das ihnen zur Rückkehr zu einem nicht-immortalisierten Zustand zu einem späteren Zeitpunkt ermöglicht.
  • Eine "reversibel immortalisierte" Zelle ist eine Zelle, die sich momentan in einem immortalisierten Zustand befindet, jedoch in einen nicht-immortalisierten Zustand zu einem späteren Zeitpunkt zurückkehren kann, indem der Prozess der Umkehr-Immortalisation angewendet wird, wie er hierin beschrieben ist.
  • Eine "revers-immortalisierte" Zelle ist eine Zelle, die dem gesamten Prozess der Umkehr-Immortalisation unterworfen wurde und sich nun in einem nicht-immortalisierten Zustand befindet.
  • Der hierin verwendete Begriff "funktionell" bedeutet, dass die revers-immortalisierten OEG-Zellen in der Lage sind, eine axonale Wiederherstellung von erwachsenen ZNS-Neuronen in vitro in einem Co-Kultursystem auszulösen und damit immer noch über die Fähigkeit zur Förderung der neuronalen Regeneration in vivo bei Transplantation in den neuralen verletzten Bereich eines Patienten verfügt.
  • Der Begriff "Suizidgen" bezieht sich auf ein Gen, das den Zellen, die reversibel immortalisiert wurden, einen Lethalitäts-Phenotyp vermittelt. In einer allgemeineren Bedeutung lässt sich das "Suizidgen" als ein negativ selektierbares Markergen vorstellen. Die Expression seines Genproduktes ermöglicht der Zelle, getötet zu werden, d. h. durch Behandlung der Zelle mit einem exogenen Mittel, wie beispielsweise einem antibiotischen oder antiviralen Mittel.
  • Der Begriff "Rekombinase/Rekombinase-Target" bezieht sich auf Paare miteinander in Wechselwirkung befindlicher Moleküle, von denen das eine ein Rekombinase-Enzym ist und das andere eine DNA-Stelle ist, die speziell von diesem Rekombinase-Enzym erkannt und aufgespalten wird. Die Rekombinase/Rekombinase-Target sind paarig aufgrund der spezifischen Wechselwirkung zwischen den beiden, d. h. das Binden der Rekombinase an ihrer erkennenden DNA-bindenden Sequenz und Aufspalten der DNA an dieser Stelle.
  • Der hierin verwendete Begriff "neuronale Schädigung" bezeichnet jede beliebige Schädigung die zu irgendeiner funktionellen, neurologischen Beeinträchtigung als Folge eines neuronalen Zelltodes, einer Desorganisation des neuronalen Traktes, einer Axon-Degeneration oder einer Synapse-Eliminierung führt, die sich aus irgendeiner akuten oder chronischen, traumatischen Verletzung oder irgendeinem degenerativen Krankheitszustand ergibt. Die Förderung der neuronalen, axonalen Regeneration kann somit die Reparatur von überlebenden, neuronalen Kreisen in einer Vielzahl von Situationen erleichtern, einschließlich traumatischen Läsionen des Hirns und des Rückenmarks, axonale, regenerative Erkrankungen und einschließlich Multiple Sklerose und neuronale, degenerative Erkrankungen, einschließlich unter anderem Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, Motoneuron-Erkrankung und spinozerebelläre Ataxie.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung steht jetzt ein Mittel zur Verfügung, das Risiko einer malignen Transformation von transplantierten Human-OEG-Zellen, die mit Hilfe der Immortalisierung primärer Human-OEG-Zellen und Erweiterung in Zellkultur erzeugt worden sind, auf ein Minimum herabzusetzen. Die Erfinder haben reversibel immortalisierte Human-OEG-Zellen unter Verwendung eines rekombinanten Virus, wie beispielsweise ein Lentivirus, das ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen enthält, die zum Auslösen eines homogenen Wachstums in der Lage sind, mit Hilfe von Rekombinase-Targetstellen flaniert. Die Exzision des Onkogens oder der Kombination von Onkogenen aus den immortalisierten Zellen wird mit Hilfe einer ortsspezifischen Rekombination, gefolgt von der Einführung in die Zellen eines Gens erreicht, das die Rekombinase codiert und die Rekombinase-Targetstellen speziell erkennt. Nach ortsspezifischer Rekombination und onkogener Exzision hält die Zellproliferation an und die Zellen entwickeln die Merkmale primärer Human-OEG-Zellen. Darüber hinaus besitzen die Zellen ein minimales onkogenes Potential.
  • Ein bedeutendes Merkmal der revers-immortisierten Human-OEG-Zellen, besteht, wie vorstehend beschrieben wurde, darin, dass das Risiko ihrer malignen Transformation in Transplantationspatienten stark verringert ist. Die sichere Verwendung dieser Zellen für eine OEG-Transplantation ist gemäß der Erfindung darüber hinaus sogar noch durch die Zugabe eines "Suizidgens" zu dem anfänglichen viralen Konstrukt verbessert worden, das zum Immortalisieren der Zellen verwendet wurde. In einer exemplarischen Ausführungsform ist das Suizidgen ein Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase(HSV-tk)-Gen, das in den lentiviralen Vektor zwischen den zwei lox-P-Stellen eingebaut wurde. Wenn das Onkogen (oder Kombination von Onkogenen) erfolgreich mit Hilfe der Cre-Rekombinase über den vorstehend beschriebenen Mechanismus exzidiert wurde, wird auch das HSV-tk-Gen exzidiert. Sofern es nicht exzidiert wurde, kann die Zelle durch Behandlung mit Gancyclovir, einem antiviralen Mittel, zerstört werden, das auf das HSV-tk-Genprodukt zielt.
  • Damit sind die reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen der Erfindung Human-OEG-Zellen, die ein heterologes DNA-Konstrukt aufweisen, das einen selektierbaren Marker hat und ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen, mit denen die Zellen zur Proliferation in Kultur befähigt werden, wobei das selektive Markergen und das Onkogen (oder Onkogene) gemeinsam von den DNA-bindenden Stellen für eine Rekombinase flankiert werden. Wahlweise weist das DNA-Segment ferner ein "Suizidgen" auf, das sich ebenfalls im Inneren der Rekombinase-Bindungsstellen befindet. Die Erfindung wird praktiziert, indem die primären Human-OEG-Zellen mit dem DNA-Konstrukt transformiert werden, die transformierten OEG-Zellen unter Standardbedingungen kultiviert werden, die zur Erweiterung der Population von transformierten OEG-Zellen geeignet sind, wonach die transformierten OEG-Zellen an der Rekombinase exponiert werden, die die Bindungsstellen auf dem DNA-Konstrukt erkennt (zum Beispiel durch Infizieren der transformierten OEG-Zellen mit einem viralen Vektor, der ein die Rekombinase codierendes Gen enthält. Wenn das DNA-Konstrukt ebenfalls ein "Suizidgen" enthält, werden die OEG-Zellen darüber hinaus Bedingungen ausgesetzt, die alle Zellen tuten werden, die noch das DNA-Konstrukt enthalten, gefolgt von einer Behandlung mit Rekombinase.
  • Die Methode zum Erhalten und Einleiten von Kulturen von primären Human-OEG-Zellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise kann primäre OEG von dem Patienten oder Spender entweder in Form des Bulbus olfactorius erhalten werden, der die offensichtlichen Schwierigkeiten und Risiken in sich trägt, oder aus der olfaktorischen Mucosa Lamina Propria. Mit der Erfindung haben wir das Problem gelöst, ausrechend OEG-Zellen zur Transplantation ausschließlich von der beschränkten Verfügbarkeit der olfaktorischen Mucosa Lamina Propria zu erhalten. Die menschliche, olfaktorische Mucosa lässt sich relativ leicht mit Hilfe einer einfachen endoskopischen Prozedur oder durch örtliche Anästhesie biopsieren (Feron et al. "new techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons, Arch. Otorlaryngol. Head Neck. Surg. 1998; 124: 861–866).
  • Um primäre OEG-Zellen reversibel zu immortalisieren kann jedes beliebige Onkogen oder Kombination von Onkogenen verwendet werden, wobei viele von ihnen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Das Gen, welches SV40-groß-T-Antigen (SV40Tag) codiert, ist ein bekanntes Onkogen, das zum Immortalisieren von primären Zellen verwendet wird, wobei jedoch auch andere verwendet werden können. Diese schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: virale Onkogene, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind und zellulare Onkogene, wie beispielsweise Bmi-1, telomerase-katalytische Subeinheit, c-Myc, oder Gene, welche den Wachstumsfaktor-Rezeptor u. a. codieren. In einer speziellen Ausführungsform weist das DNA-Segment lediglich ein Onkogen auf. In einer anderen speziellen Ausführungsform weist das DNA-Segment eine Kombination von zwei oder mehreren Onkogenen auf, wobei die Onkogene in diesem Fall in Tandem-Position oder in irgendeiner anderen geeigneten Position vorliegen können.
  • Das Onkogen/die Onkogene lässt sichlassen sich mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden zuführen, beispielsweise im Inneren eines beliebigen Vektors, der zur Zuführung von genetischem Material zu Zellen geeignet ist. Hierin werden Lentivirus-Vektoren exemplifiziert. Andere geeignete Vektoren schließen Retrovirus-Vektoren ein, speziell OncoRNA-Retroviren, sowie adeno-assoziierte Viren und Adenviren. Beispiele für Lentivirus-Vektoren schließen Human-Immunodeficiency-Virus-Typ 1 (HIV-1) ein, von dem viele geeignete Vektoren abgeleitet worden sind. Andere Lentiviren, die zur Verwendung als Vektoren geeignet sind, schließen die Gruppe des Primaten-Lentivirus ein und einschließlich den Human-Immunodeficiency-Virus-Typ 2 (HIV-2), Human-Immunodeficiency-Virus-Typ 3 (HIV-3), Simian-Immunodeficiency-Virus (SIV), Simian-AIDS-Retrovirus (SRV-1), Human-T-Zellen-lymphotropes Virus-Typ 4 (HTLV4) sowie die bovine Lentivirus-, equine Lentivirus-, feline Lentivirus- und ovine/caprine Lentivirus-Gruppen. Zusätzlich zur Zuführung des Onkogens/der Onkogene mit Hilfe der vorgenannten Methoden kann/können das Onkogen/die Onkogene mit Hilfe anderer, auf dem Gebiet bekannter Methoden zugeführt werden, wie beispielsweise durch Elektroporation in die Zellen in ähnlicher Weise, wie dieses in der EP-235113 gelehrt wird.
  • In ähnlicher Weise lässt sich jedes beliebige selektierbare Markergen in dem DNA-Konstrukt, welches das Onkogen führt, verwenden, wobei viele von diesen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Mehrere selektierbare Markersysteme sowie Vektoren und andere Mittel, um Onkogene in Zellen einzuführen, wurden beispielsweise beschreiben in "Current Protocols in Molecular Biology", Herausgeber Frederick M. Ausubel et. a., John Wiley & Sons, 2001.
  • Darüber hinaus sind zahlreiche Beispiele für geeignete "Suizidgene" auf dem Fachgebiet bekannt. Zur Verwendung bevorzugt ist das HSV-tk-Gen, wobei jedoch auch andere zur Anwendung gelangen können. Zahlreiche Beispiele wurden ausgeführt von Ausubel et al., 2001, supra.
  • Zusätzlich zu dem immortalisierenden Onkogen oder der Kombination von Onkogenen, dem selektierbaren Markergen und dem Suizidgen kann das DNA-Konstrukt ein oder mehrere gewünschte Gene aufweisen, wie beispielsweise zur Unterstützung des Wachstums.
  • Die vorgenannten Gene können funktionsfähig mit einer oder mehreren 5' und/oder 3' exprimierenden-kontrollierenden Regionen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Hinsichtlich der Promotoren können die ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannten konstitutiven oder induzierbaren Promotoren zum Einsatz gelangen.
  • Ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt sind DNA-Rekombinase-Systeme, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind. Zur Verwendung bevorzugt ist das Cre/lox-System (Cre-Rekombinase, LoxP-Bindungsstellen), wobei jedoch auch andere Systeme angewendet werden können, einschließlich das FLP/FRT-System von Saccharomyces cerevisiae, ohne darauf beschränkt zu sein. Es gilt als selbstverständlich, dass, wenn das DNA-Konstrukt Target-Bindungsstellen für eine spezielle Rekombinase enthält, diese Rekombinase in der Umkehrung der Immortalisation der OEG-Zellen zu verwenden ist.
  • In der US-P-5629159 wird eine Vielzahl von DNA-Konstrukten beschrieben, die zur Verwendung in der Immortalisation und der Desimmortalisation von pankreatischen Inselzellen und neuralen Zellen exemplifiziert wurden. Eine oder mehrere dieser Variationen können gemäß der vorliegenden Erfindung unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden der Umkehr-Immortalisation von OEG-Zellen angepasst werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst: (1) das Immortalisieren primärer Human-OEG-Zellen mit einem lentiviralen Vektor, der das SV40-Tag-Gen enthält, das HSV-tk-gen und ein geeignetes, selektierbares Markergen (zum Beispiel Neo oder HSA, die das wämestabi1e Antigen codieren), flankiert von loxP-Stellen; (2) Auswählen von Transformanten und Aufziehen dieser in Kultur; (3) Umkehren der Immortalisation durch Infizieren der Zellen mit einem geeigneten Vektor, wie beispielsweise einem Adenovirus-Vektor, der ein exprimierbares Cre-Rekombinasegen führt, um das Onkogen zu exzidieren; sowie wahlweise (4) Zerstören von Zellen, in denen das Onkogen nicht erfolgreich durch Behandeln der Zellen nicht erfolgreich exzidiert wurde, indem die Zellen mit Gancyclovir behandelt werden. Vektoren und Systeme für diesen Typ sind für die reversible Immortalisierung zahlreicher primärer Zellen entwickelt worden (Westerman & Leboulch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8971–8976, 1996), wobei diese jedoch nicht für die Umkehr-Immortalisation von primären OEG-Zellen angewendet wurden. Was noch wichtiger ist, zum Zeitpunkt vor der vorliegenden Erfindung war unbekannt, ob ein solches System zur Erzeugung von OEG-Zellen verwendet werden könnte, das in vivo nach der Transplantation funktionsfähig sein würde, indem deren Axon-Regenerationseigenschaften bewahrt werden, und das ein ausreichend geringes, onkogenes Potential hätte, um für eine solche Anwendung sicher zu sein.
  • Es sind bevorzugte Ausführungsformen getestet worden, wie sie detailliert in den Beispielen beschrieben werden. Zusammengefasst dargelegt, wurden OEG-Zellen von menschlichen Bulbus olfactorius unter Anwendung eines rekombinanten Lentivirus, der das Gen enthält, welches SV40Tag, flankiert von loxP-Rekombinations-Targetstellen codiert, gemäß dem Protokoll immortalisiert, das von Dr. Trono's Laboratorium (Beispiel 1) beschrieben wurde. Die Exzision von SV40Tag aus immortalisierten Zellen ließ sich dann durch ortsspezifische Rekombination mit der Cre-Rekombinase erzielen. Zellen, die mit diesem rekombinanten Virus immortalisiert wurden, exprimierten das Onkogen [(SV40Tag in diesem Fall) oder irgendein anderes Onkogen oder eine Kombination davon] und hielten nicht an, sich zu teilen. Nach Exzision des SV40Tag mit Cre-Rekombinase codierenden Gens hörten die Zellen auf zu wachsen, und die DNA-Synthese fiel ab und die Zellen wurden nach einer begrenzten Zeitdauer seneszent.
  • Zusammengenommen demonstrieren diese Ergebnisse, dass die Umkehr-immortalisierten Human-OEG-Zellen, die mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens erzeugt wurden, in vivo nach Transplantation als OEG-Zellen fungieren. Darüber hinaus sind die Zellen hinsichtlich des onkogenen Potentials ausreichend schwach, um für die Transplantation in Patienten mit einem Bedarf für eine solche Behandlung sicher zu sein. Obgleich ähnliche Protokolle der Umkehr-Immortalisation für andere Zelltypen eingesetzt worden sind, war die erfolgreiche Umkehr der Immortalisation, um in vivo funktionelle Human-OEG-Zellen zu liefern, ein überraschendes Ergebnis. So sind Human-OEG-Zellen, die nach einer Umkehr-Immortalisation erhalten wurden, tatsächlich zur Förderung der neuronalen Regeneration in der Lage (Beispiel 2).
  • Damit demonstriert die vorliegende Erfindung, dass mit Hilfe transduzierender, primärer Human-OEG-Zellen mit einem rekombinanten Virus, der ein Onkogen (oder eine Kombination von Onkogenen) einbaut, ein Suizidgen und ein Rekombinase/Rekombinase-Targetsystem, eine wohldifferenzierte, reversibel immortalisierte nicht-tumorgene Human-OEG-Zelllinie erzeugt wird. Die erfolgreiche Erzeugung einer solchen Zelllinie wäre vor den gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Ergebnissen nicht vorhersagbar gewesen.
  • Die Transplantation von OEG-Zellen ist eine viel versprechende Alternaive, um die Wiederherstellung des Nervensystems zu fördern, die neuronale Regeneration und die Behandlung neuronaler Schädigung, Verletzungen oder SNC-Schädigungen, einschließlich traumatische Schädigungen des Hirns und des Rückenmarks. Axonale, degenerative Erkrankungen, einschließlich Multiple Sklerose, und neuronale, degenerative Erkrankungen, einschließlich unter anderem Alzheimer Krankheit, Parkinson-, Huntington-, Motoneuron-Erkrankungen, spinozerebellare Ataxien, für Patienten, die an Schädigungen, Verletzungen und Läsionen leiden. Mit der vorliegenden Erfindung ist eine wesentliche Einschränkung der Entwicklung dieser Therapie im Zusammenhang mit der beschränkten Verfügbarkeit von OEG-Zellen zur Transplantation überwunden worden.
  • Daher richtet sich die vorliegende Erfindung in einem der Aspekte auf die Verwendung von Human-OEG-Zellen, die mit Hilfe der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, auf die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Humanpatienten, der an einer neuronalen Schädigung leidet, indem eine Behandlung mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung erfolgt, die die vorgenannten definierten, revers-immortalisierten OEG-Zellen enthält. Die Zahlt der zur Anwendung gelangenden Zellen wird von der Größe der Läsion und dem Zustand des zu behandelnden Patienten abhängen. Die Anwendung wird in der Regel operativ erfolgen, um die Stelle der Läsion freizulegen, sodass die erfindungsgemäßen Zellen direkt aufgebracht werden können.
  • Die Behandlung kann autolog sein, indem auf diese Weise revers-immortalisierte Human-OEG-Zellen verwendet werden, die von OEG-Zellen des Patienten erzeugt wurden. Damit verringert sich das Risiko nachteiliger Immunreaktionen, obgleich ein Nachteil darin besteht, dass eine gewisse Zeitdauer von dem Moment benötigt wird, in dem eine Probe von dem Patienten entnommen wird, bis ausreichend revers-immortalisierte Zellen für die Behandlung erzeugt sind. Alternativ kann die Behandlung heterolog sein, indem eine Bank von reversibel-immortalisierten oder revers-immortalisierten Human-OEG-Zellen benutzt wird, die leicht verfügbar sind. Diese Bank von Zellen umfasst eine Sammlung von reversibel-immortalisierten oder revers-immortalisierten Human-OEG-Zellen, die entsprechend den hierin beschriebenen Methoden der Erfindung hergestellt wurden, und das Selektieren die von solchen, die sich durch eine große Histokompatibilität und Wirksamkeit zur Förderung der axonalen Regeneration auszeichnen. Die Verfügbarkeit dieser Sammlung von Zellen wird die zum Behandlung erforderliche Zeitdauer erheblich herabsetzen, beispielsweise nach einer ZNS-Verletzung, obgleich die Anwendung von immunsupressiven Verbindungen nötig sein könnte.
  • Eine Bank von Zellen zur Transplantation, die reversibel-immortalisierte und revers-immortalisierte Human-OEG-Zellen aufweist, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • In einer der Ausführungsformen weist die erfindungsgemäße Zellbank eine Bibliothek oder eine Vielzahl von reversibel-immortalisierten oder revers-immortalisierten Human-OEG-Zelllinien auf, von denen jede für mindestens ein oder mehrere kritische Antigen-Gene homozygot ist, d. h. Gene, die Histokompatibilitätsantigene codieren: Vorzugsweise ist jede der Zelllinien im Bezug auf mindestens ein MHC(Major Histocompatibility Complex)-Allel homozygot, das in einer Humanpopulation vorliegt, wobei jeder Vertreter dieser Mehrzahl von Zelllinien für eine unterschiedliche Reibe von MHC-Allelen im Bezug auf die übrigen Vertreter der Mehrzahl von OEG-Zelllinien homozygot ist. Bevorzugt ist jeder Vertreter der Bibliothek auf eine andere Kombination von Histokompatibilitäts- oder MHC-Antigen-Allelen homozygot. Die Sammlung kann tiefgefroren aufbewahrt und zu den Anwendungsstellen gebracht werden. Unter Anwendung der Methoden der vorliegenden Erfindung lässt sich eine Reihe reversibel-immortalisierter oder revers-immortalisierter Human-OEG-Zellen aus einer Bank solcher Zellen selektieren, die im Bezug auf ein oder mehrere Histokompatibilitätsantigen-Allele homozygot sind in dem Fall von MHC-Allelen, die zu einem MHC-Allel eines Patienten mit Bedarf für eine Transplantation passen.
  • Es kann eine Behandlungsmethode unter Anwendung der erfindungsgemäßen Human-OEG-Zellen mit anderen Therapien kombiniert werden, wie beispielsweise die Anwendung von neurotrophen oder Wachstumsfaktoren, pharmakologischen Mitteln, die die Wirkung von Neurotransmittern nachahmen, antiapoptotischen Mitteln, Mitteln, die in Wachstumshemmer von Axonen eingreifen sowie physische Rehabilitation und Training. Es kann ein Polymergerüst angewendet werden, um ein gerichtetes Wachstum der regenerierenden Axonen zu ermöglichen.
  • Ebenfalls werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Zellen aufweisen, in Betracht gezogen. Die Zellen können bevorzugt einen pharmakologisch geeigneten Träger aufweisen, wie beispielsweise ein physiologisch kompatibles Vehikel, einschließlich die folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: Kulturmedium, wie beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium, RPMI 1640, Fisher's, Iscove's oder McCoy's Medium; oder bevorzugt ein festes, halbfestes, gelatinöses oder viskoses Trägermedium, wie beispielsweise Collagen, Collagenglykosaminoglycan, Fibrin, Polyvinylchlorid, Polyaminosäuren, wie beispielsweise Polylysin oder Polyornithin, Hydrogele, Agarose, Dextransulfat oder Silicon. In bestimmten Ausführungsformen kann das Trägermedium Wachstumsfaktoren aufweisen oder andere Mittel, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
  • Wenn als ein Vehikel ein fester, halbfester oder gelatinöser Träger verwendet wird, können Zellen in die flüssige Phase des Vehikels eingeführt werden, die anschließend behandelt wird, sodass sie etwas fester wird. In den Ausführungsformen der Erfindung, in denen das Vehikel eine feste Struktur hat, kann das Vehikel in Form gepresst sein, die der Form der Schädigung angepasst ist.
  • Die folgenden Beispiele werden zur detaillierteren Beschreibung der Erfindung geboten. Sie dienen zur Veranschaulichung und nicht jedoch zur Einschränkung der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • UMKEHR-IMMORTALISATION VON PRIMÄREN HUMAN-OEG-ZELLEN UNTER ANWENDUNG DES CRE/LOX-SYSTEMS
  • In den in diesem Beispiel beschriebenen Protokollen wurden Human-OEG-Zellen unter Verwendung eines rekombinanten Lentivirus immortalisiert, der das Gen enthält, welches SV40Tag flankiert von loxP-Stellen codiert. Es wurden Zellen vor und nach der Behandlung mit einem rekombinanten Adenovirus charakterisiert, die das Gen, welches die Cre-Rekombinase codiert, transferieren können, um zu ermitteln, ob diese Vorgehensweise eine OEG-Zelllinie erzeugen könnte, die für eine Transplantation klinisch anwendbar wäre.
  • Es wurden Human-Zellen aus post-mortem-Humangewebe von erwachsenen Spender erhalten. Das Gewebe gehörte männlichen und weiblichen erwachsenen Spender des Bulbus olfactorius, wobei die äußere Schicht abgetrennt und mit 0,1% Trypsin digeriert war. Das Alter des Spenders schien für den Erfolg der Kultur keine Einschränkung zu sein. Das Gewebe wurde mit steriler, Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die ein Antibiotikum enthielt (Penicillin/Streptomycin) sowie Antifungin (Primocin). Sodann wurde das Gewebe für 20 Minuten bei 37°C einer kontrollierten Proteolyse mit einer Trypsinlösung unterworfen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Gewebe mechanisch zerkleinert, indem das digerierte Material durch Pasteur-Pipetten mit abnehmenden Durchmessern gezogen wurde, und in einem speziell für diesen Zelltyp beschaffenen Medium kultiviert. Das halbdefinierte Medium enthielt bovinen Hypophysenextrakt, Forskolin, eine geringe Menge an fötalem Kälberserum, hitzepassiviert, in Kombination mit Dulbeco's Modified Medium (DMEM), wie beschriebenen wurde in Moreno-Flores MT, Lim F, Martin-Bermejo MJ, Diaz-Nido J, Avila J, Wandosell F. "Immortalised olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons", J. Neurochem. 2003; 85: 861–871.
  • Die Human-Zellen wurden bei 37°C in dem Medium in 7% CO2 gehalten und anschließend als OEG-Zellen nach den allgemeinen Kriterien charakterisiert, wie sie in Ramon-Cueto A, Avila J. "Olfactory ensheathing glia: properties and function". Brain Res. Bull. 1998; 46: 175–187, angegeben sind. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 3 gezeigt. Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung der verschiedenen Zellmarker, die aus murinen OEG-Zellen, Astrocyten, Schwann-Zellen und Oligodendrocyten-O2-Astrocytenlinie und Human-OEG-Zellen analysiert wurden. TABELLE 1 Analysierte Zellenmarker
    Marker Astrocyt-1 O-2A Schwann mGE hGe
    T.A T.S.
    O4 – + + +– +– n. d.
    p75NGFr – – + – + +
    PSA-N-CAM – – – + – n. d.
    GFAP +(f) – + +(d) +(f) +/–(d) +(d)
    GalC – + + – – n. d.
    HHK-1 – + + – – n. d.
    A2B5 – + – – – n. d.
    GD3 –/+ + – – – n. d.
    S100 ++ n. d. + ++ ++
    22C11 + n. d. + ++ ++
    Vim + n. d. + + +
    Neuroligin – n. d. n. d. ++ ++
    Erb2 ++ n. d. n. d. ++ +++
    Erb3 +++ n. d. n. d. +/++ +
    Erb4 +++ n. d. n. d. +/– +
    3-PGDH n. d. n. d. n. d ++ ++
    • (f) Faserfärbung; (d): Diffusfärbung; n. d.: nicht bestimmt
  • Um diese Human-OEG-Zellen zu immortalisieren haben wir ein reversibles System angewendet, das beschrieben wurde von Dr. D. Trono's Lab (Naldini L, Blomer U, Gage FH, Trono D, Verma IM.
  • "Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector". Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 1996; 93: 11382–11388; Salmon P, Oberholzer J, Occhiodoro T, Morel P, Lou J, Trono D. "Reversible immortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer of specific genes". Mol. Ther. 2000; 2: 404–414), indem das lentivirale Konstrukt verwendet wurde, das bezeichnet wurde durch pLOX-Ttag-Ires-TK (5) und als Onkogen das Gen enthält, welches SV40-groß-T-Antigen codiert. Alternativ können auch lentivirale Konstrukte verwendet werden, die bezeichnet werden durch pLOX-HTERT-Ihres-TK (6), das als Onkogen das Gen enthält, welches die telomerase-kathalytische Subeinheit codiert, oder durch pLOX-CWBmi1 (7), das als Onkogen das Gen enthält, welches Bmi-1-Protein codiert.
  • Aus diesen Infektionen wurden etablierte Klone erhalten, die solchen Human-Zellen mit der höchsten Wachstumsrate folgten, wobei anfangs einige Klone erhalten worden waren und als OEG-Zellen charakterisiert wurden. Beispielsweise exprimieren die mit pLOX-Ttag-Ires-TK immortalisierten Zellen T-Antigen (> 85%), S100 und 3-PDGH.
  • BEISPIEL 2
  • REGENERATIONSASSAY VON ERWACHSENEN RETINALEN AXONEN
  • Zur Förderung der axonalen Regeneration von erwachsenen retinalen Ratten-Ganglionneuronen (RGN) wurde eine Standardprozedur angewendet, um das Regenerationsvermögen in Zellkultur zu ermitteln. Diese Methode gibt die in vivo-Reparatureigenschaften von OEG-Zellen besser wieder als andere neuritogene Assays.
  • Kurz gesagt, wurde die Methode wie folgt angewendet: Es wurden von P60-Rattenaugen Retinas zerlegt und mit 0,1% Trypsin digeriert. Die Digestion wurde mit 2 mg/ml Sojabohnen-Inhibitor vor Trypsin angehalten und eine feinteilige Suspension von Zellen erhalten, indem das digerierte Material durch Pasteur-Pipetten mit abnehmenden Durchmessern gezogen wurde. Die Zellen wurden zentrifugiert und erneut in einem definierten Medium suspendiert (Moreno-Flores et al., 2003). Die RGN wurden auf Monoschichten von Gliazellen aufgezogen: Primäre OEG oder etablierte Zelllinien.
  • Für eine Immunocytochemie wurde eine gemischte Kultur von neuronalen Human-OEG-Zellen mit 4% Paraformaldehyd nach sieben Tagen Kultur fixiert. 4 zeigt das axonale Regenerationsvermögen von retinalen Rattenneuronen, gefärbt mit Antikörpern gegen neuronale Proteine, wie beispielsweise neuronales, spezifisches Tubulin (334), axonale Proteine, wie beispielsweise MAP1B-SM131 oder MAP2 (305) oder somatodendritisches Protein MAP2 (514).
  • Unsere Daten zeigen, dass reversibel-immortalisierte Human-OEG-Zellen die axonale Regeneration von erwachsener RGN in einem ähnlichen Maß förderte wie entweder primäre OEG-Zellen oder klonierte Zelllinien von Ratten-OEG-Zellen.
  • Berücksichtige man, dass mehrere neuere Untersuchungen die Fähigkeit von OEG-Zellen, die in vivo ZNS-axonale Regeneration (Li Y, Field PM, Raisman G. "Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells". Science 1997; 277: 2000–2002; Li Y, Field PM, Raisman G. "Regeneration of adult rat corticospinal axons induced by transplanted olfactory ensheathing cells", J. Neurosci. 1998; 18: 10514–10524; Ramon-Cueto A. Plant GW, Avila J, Bunge MB. "Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants". J. Neurosci. 1998; 18: 3803–3815; und Ramon-Cueto A, Cordero MI, Santos-Benito FF, Avila J. "Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia". Neuron 2000; 25: 425–435), mit einer eindrucksvollen, motorischen und sensorischen funktionellen Wiederherstellung selbst nach vollständiger Transektion des Rückenmarks zu fördern [Ramon-Cueto et al. 2000 siehe oben], und dass unsere neueren vorläufigen Experimente zeigen, dass etablierte Zelllinien von einer Ratten-Quelle derartige neuronale, regenerative Fähigkeiten in Kultur und in vivo bewahrten, kommen wir zu der Schlussfolgerung, dass die reversible Immortalisierung von Human-OEG-Zellen dieses nicht als eine deutliche Verringerung in dem Regenerationsvermögen erzeugte, selbst wenn die zugrunde liegenden Molekularmechanismen bisher nicht bekannt sind.
  • Nach unserer Kenntnis ist dieses das erste Mal, dass nachgewiesen worden ist, dass reversibel immortalisierte Human-OEG-Zellen in der Lage sind, die axonale Regeneration von kultivierten Neuronen aus reifer Säuger-ZNS zu unterstützen. Unsere Human-OEG-Zelllinien stellen nützliche Mittel dar, um in der Anwendung von OEG-Zellen sowohl in der Forschung als auch in Anwendungen voranzukommen.
  • Diese Zelllinien und ähnliche solche können allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese aufweisen, zur Behandlung von ZNS-Läsionen verwendet werden.

Claims (29)

  1. Verfahren zum Herstellen einer Population von reversibel immortalisierten, olfaktorischen, einhüllenden Human-Gliazellen (OEG), die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen für die Transplantation in einen Patient zu fördern, welches Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer von primären Human-OEG-Zellen erhaltenen Probe; b) Immortalisieren der OEG-Zellen durch Transformieren der OEG-Zellen mit einem DNA-Konstrukt, das ein entfernbares DNA-Segment aufweist, welches ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen enthält, wodurch immortalisierte OEG-Zellen erzeugt werden; c) Aufziehen der immortalisierten OEG-Zellen; d) Auswählen solcher immortalisierten klonalen OEG-Zelllinien, die die Eigenschaft des Fördern der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen bewahren, und e) Entfernen des Onkogens oder einer Kombination von Onkogenen aus den immortalisierten OEG-Zellen, wobei die Entfernung zur Erzeugung der Population von Human-OEG-Zellen für die Transplantation in den Patienten führt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen entfernbar erzeugt wird, indem es mit Rekombinase-Targetstellen flankiert wird und das Entfernen durch Einführen in die immortalisierten Zellen eines Gens erzielt wird, das exprimiert wird, um eine Rekombinase zu erzeugen, die speziell die Rekombinase-Targetstellen erkennt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Rekombinase Cre-Rekombinase ist und die Rekombinase-Targetstellen loxP-Stellen sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Onkogen das Gen ist, welches SV40-groß-T-Antigen codiert, das Gen, das eine katalytische Telomerase-Subeinheit codiert, das Gen, das Bmi-1-Protein oder irgendeine Kombination dieser Onkogene codiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das entfernbare DNA-Segment ferner ein Suizidgen enthält, das ein Genprodukt codiert, welches die Zerstörung der immortalisierten Zellen durch ein exogenes Mittel ermöglicht, wenn das entfernbare DNA-Segment nicht aus den Zellen entfernt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Suizidgen ein Gen ist, das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codiert und die Zellen durch Exponienmg an Gancyclovir exponiert wird, wenn das entfernbare DNA-Segment nicht aus den Zellen entfernt ist.
  7. Population reversibel immortalisierter Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 1.
  8. Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 1, zur Verwendung als ein Medikament.
  9. Verwendung einer Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neuraler Schädigung, wobei das Medikament eine ausreichende Menge der Human-OEG-Zellen nach Anspruch 7 zum Transplantieren in den Patienten aufweist, um eine Förderung der neuronalen Regeneration in der neuronal geschädigten Region des Patienten zu gewähren.
  10. Verfahren zum Herstellen einer Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen zum Transplantieren in einen Patienten zu fördern, umfassend: a) Bereitstellen einer von primärem Human-OEG-Zellen erhaltenen Probe; b) Immortalisierende OEG-Zellen durch Transformieren der OEG-Zellen mit einem DNA-Konstrukt, aufweisend ein entfernbares DNA-Segment, das ein Onkogen oder Kombination von Onkogenen, ein auswählbares Markgen, und ein Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codierendes Gen enthält, wobei die Gene durch die loxP-Stellen an einer oder an der anderen Seite zusammen flankiert werden; c) Aufziehen der immortalisierten OEG-Zellen; d) Auswählen solcher immortalisierten klonalen OEG-Zelllinien, die die Eigenschaft des Förderns der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen bewahren, und e) Umkehren der Immortalisierung der Human-OEG-Zellen durch Entfernen des DNA-Segmentes aus den immortalisierten OEG-Zellen, wobei das Entfernen durch Einführen eines Gens in die immortalisierten OEG-Zellen erzielt wird, das Cre-Rekombinase codiert, um eine Exzision des DNA-Segmentes an den loxP- Stellen herbeizuführen, wobei die Exzision zur Erzeugung der Population von Human-OEG-Zellen zum Transplantieren in einen Patienten führt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Onkogen das Gen ist, das SV40-T-Antigen codiert, das Gen ist, das telomerase-katalytische Untereinheit codiert, das Gen ist, das Bmi-1-Protein codiert oder irgendeine Kombination dieser Onkogene.
  12. Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 10.
  13. Population reversibel immortalisierter Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 10 zur Verwendung als ein Medikament.
  14. Verwendung einer Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit verfügen, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen zu fördern, herstellbar mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 10 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung neuraler Schädigung, wobei das Medikament eine ausreichende Menge der OEG-Zellen nach Anspruch 12 zum Transplantieren in den Patienten aufweist, um die Förderung der neuronalen Regeneration in der neuronal geschädigten Region vorzusehen.
  15. Reversibel immortalisierte Human-OEG-Zelle, die über die Fähigkeit verfügt, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen zu fördern, aufweisend eine primäre Human-OEG-Zelle, die mit einem DNA-Konstrukt transformiert ist, aufweisend zwei Rekombinase-Targetstellen, die ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen flankieren, die der OEG-Zelle die Immortalisierung vermitteln, wobei die Immortalisierung durch Exzision des DNA-Konstruktes durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen reversibel ist, wenn die Targetstellen an einer Rekombinase exponiert werden, die speziell diese Targetstellen erkennt.
  16. Reversibel immortalisierte OEG-Zelle nach Anspruch 15, wobei die Rekombinase-Targetstellen loxP-Stellen sind und die Immortalisierung reversibel ist durch Cre-Rekombinase Aufspaltung an den loxP-Stellen.
  17. Reversibel immortalisierte OEG-Zelle nach Anspruch 15, wobei das DNA-Konstrukt ferner ein auswählbares Markergen aufweist.
  18. Reversibel immortalisierte OEG-Zelle nach Anspruch 15, wobei das DNA-Konstrukt ferner ein Suizidgen aufweist, das ein Genprodukt codiert, welches die Zerstörung der immortalisierten OEG-Zelle durch ein exogenes Mittel ermöglicht, wenn das Onkogen nicht aus den Zellen entfernt ist.
  19. Reversibel immortalisierte OEG-Zelle nach Anspruch 18, wobei das Suizidgen ein Gen ist, das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase codiert und das exogene Mittel Gancyclovir ist.
  20. Zelllinie, aufweisend eine Population der reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen nach Anspruch 15.
  21. Reversibel immortalisierte Human-OEG-Zelle, die über die Fähigkeit verfügt, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen bei Transplantation in einen Patienten zu fördern, herstellbar durch Exponieren des DNA-Konstruktes im Inneren der immortalisierten Human-OEG-Zelle nach Anspruch 15 an einer Rekombinase, die das DNA-Konstrukt durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen exzidiert.
  22. Reversibel immortalisierte Human-OEG-Zelle, die über die Fähigkeit verfügt, die Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen bei Transplantation in einen Patienten zu fördern, herstellbar durch Exponieren des DNA-Konstruktes im Inneren der immortalisierten Human-OEG-Zelle nach Anspruch 15 an einer Rekombinase, die das DNA-Konstrukt durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen exzidiert, zur Verwendung als ein Medikament.
  23. Verwendung einer reversibel immortalisierten Human-OEG-Zelle mit der Fähigkeit zu Förderung der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen bei Transplantation in einen Patienten, herstellbar durch Exponieren des DNA-Konstruktes im Inneren der immortalisierten Human-OEG-Zelle nach Anspruch 15 an einer Rekombinase, die das DNA-Konstrukt durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen exzidiert, in der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung neuraler Schädigung, wobei das Medikament eine ausreichende Menge an reversibel immortalisierten OEG-Human-Zellen nach Anspruch 21 aufweist, zum Transplantieren in den Patienten, um die Forderung der neuronalen Regeneration in der neuronal geschädigten Region des Patienten vorzusehen.
  24. Zellenbank, aufweisend eine Population von reversibel immortalisierten Human-OEG-Zellen, die über die Fähigkeit zur Förderung der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen verfügt, herstellbar nach den Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 10 und 11.
  25. Reversibel immortalisierte, olfaktorische, einhüllende Glia(OEG)-Zelllinie, die über die Fähigkeit zur Förderung der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen verfügt, aufweisend eine primäre Human-OEG-Zelle, transformiert mit einem DNA-Konstrukt, aufweisend zwei Rekombinase-Targetstellen, die ein Onkogen oder eine Kombination von Onkogenen flankiert, die der OEG-Zelle die Immortalisation vermittelt, wobei die Immortalisation reversibel ist durch Exzision des DNA-Konstruktes durch Aufspaltung an den Rekombinase-Targetstellen, wenn die Targetstellen an einer Rekombinase exponiert sind, die speziell diese Targetstellen erkennt.
  26. Zelllinien nach Anspruch 25 für die Verwendung in einem Verfahren für Therapie.
  27. Zelllinien nach Anspruch 25 zur Verwendung für die Förderung der neuronalen Regeneration.
  28. Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend eine Human-OEG-Zelllinie nach Anspruch 25 bis 27, und einen pharmazeutisch duldbaren Träger.
  29. Verwendung von reversibel immortalisierten, olfaktorischen, einhüllenden Human-Glia-Zellen, die über die Fähigkeit zur Förderung der Axon-Regeneration von Erwachsenen-CNS-Neuronen nach Anspruch 7, 13, 22 oder 25 verfügen, in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer neuronalen Schädigung.
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