DE69030545T2

DE69030545T2 - Aufspüren und Behandeln von Infektionen durch Verwendung von Immunokonjukaten

Info

Publication number: DE69030545T2
Application number: DE69030545T
Authority: DE
Inventors: Milton David Goldenberg
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1989-08-24
Filing date: 1990-08-24
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2010-08-25
Also published as: DE69030545D1; IL95457A; EP0417927B1; SG46451A1; ES2100164T3; AU636172B2; IE903071A1; ZA906703B; JPH04506217A; ATE151994T1; EP0417927A1; KR0179953B1; KR920700686A; IL95457A0; CA1339415C; AU6408290A; JPH07121880B2; WO1991002541A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien und Verfahren zum zielgerichteten Einsatz eines diagnostischen und/oder therapeutischen Mittels am Herd einer pathogenen Infektion unter Verwendung eines Antikörperkonjugats als Vehikel zum zielgerichteten Einsatz, das spezifisch an ein oder mehrere zugängliche Epitope des Pathogens oder eines mit dem Pathogen assoziierten Antigens bindet.
Die Arzneimitteltherapie gegen Pathogene erfolgt herkömmlicherweise mittels der systemischen Verabreichung des Arzneimittels, um einen Blutspiegel zu erzielen, der toxisch für das Pathogen ist, wo immer es sich im Körper befindet. Es ist daher ein bestimmter Blutspiegel erforderlich, um für eine geeignete Konzentration des Arzneimittels an der Stelle der Infektion zu sorgen. Dies erfordert hohe Dosen, und oftmals wird nicht die gewünschte Toxizität erreicht, ohne daß sich nicht akzeptable Nebenwirkungen für den Patienten ergeben, da viele dieser Arzneimittel allgemeine zytotoxische Eigenschaften aufweisen.
Die Entwicklung und Beschreibung von murinen monoklonalen Antikörpern (MAbs) gegen infektiöse Organismen ist Gegenstand einer Anzahl von Übersichtsartikeln (z. B. M. C. Harris et al., Indian J. Pediatr., Bd. 54 (1987), S. 481-488; S. Cohen, Brit. Med. Bull., Bd. 40 (1984), S. 291-296; R. A. Polin, Eur. J. Clin. Microbiol., Bd. 3 (1984), S. 387-398; R. C. Nowinski et al., Science, Bd. 219 (1983), S. 637-644; Teil V, Monodonal Antibodies to Microorganisms, Kapitel 17-20 einschließlich, in. R. H. Kennett et al., (Hrsg.), Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, New York und London, Plenum Press, 1980, S. 295-362). Diese Druckschriften und weitere auf diesem Gebiet betreffen die Verwendung derartiger monoklonaler Antikörperreagenzien für verbesserte diagnostische Tests auf infektiöse Mikroorganismen unter Einschluß von Bakterien, Viren, Protozoen und Helminthen.
Es ist vorgeschlagen worden, daß diese MAbs als solche sowohl für die Diagnose als auch die Therapie von bestimmten bakteriellen Erkrankungen, wie Gruppe B-Streptokokkeninfektionen (Harris, a.a.O.) , jedoch ausschließlich als diagnostische Mittel bei viralen Erkrankungen (Harris, a.a.O.) verwendet werden können. Im Fall der Gruppe B-Streptokokkeninfektionen wurden MAbs bei Nagetieren zur Behandlung der Infektion verwendet, und es wurde bei diesen begrenzten Versuchen festgestellt, daß eine Wirkung nur erzielt wurde, wenn die MAbs früh nach der Infektion infundiert wurden; nach 6 Stunden oder später gab es unter den Tieren keine Überlebenden (Christensen et al., Pediatric Res., Bd. 18 (1984), S. 1093-1096). Im Fall von Malariaparasiten wurde festgestellt, daß ein Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der gegen die Oberflächenhülle von Malaria-Sporozoiten gerichtet ist, aktiv hinsichtlich des Schutzes von Mäusen gegen eine Malariamfektion ist, was zeigt, daß es die Anheftung von Sporozoiten an Wirtsrezeptorzellen blockiert (P. Potocnjak et al. , J. Exp. Med., Bd. 151 (1980), S. 1504-1513). Dies zeigt weiter, daß die schützende Antikörperwirkung unabhängig vom Komplement oder von Zellen ist, da sie durch das Immunglobulinmolekül, dem der Fc-Anteil fehlt, erzielt wird.
Diese Tierversuche deuten darauf hin, daß frühe Infektionen durch die Verwendung von Organismus-spezifischen MAbs in gut kontrollierten Laborversuchen, die bestimmte Bakterien und Parasiten betreffen, beeinflußt werden können. Ungeachtet dieser einige Jahre alten Berichte wurde nicht gezeigt, daß MAbs eine therapeutische Rolle bei Infektionserkrankungen beim Menschen spielen. Ein Hauptgrund besteht darin, daß derartige MAbs eine schützende Wirkung nur in speziellen, üblicherweise frühen Stadien der Infektion ausüben, wobei sie weniger in der Lage sind, mit den infektiösen Organismen in Wechselwirkung zu treten, wenn diese sich in Gewebereservoirs ausgebreitet haben, die weniger zugänglich für eine Wechselwirkung mit den injizierten MAbs sind. Die Verwendung derartiger MAbs zur Bildung therapeutischer Konjugate wird durch die Druckschriften nicht vorgeschlagen.
EP-A-0 149 709 betrifft eine auf Antikörpern basierende Abbildung und Therapie sowohl von Tumoren als auch von infektiösen Läsionen, wobei ein zweiter Antikörper verwendet wird, um jeglichen primären Antikörper, der sein Ziel nicht erreicht hat, zu maskieren.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an einem Verfahren zum zielgerichteten Einsatz eines diagnostischen Mittels, z. B. eines Abbildungsmittels, oder eines therapeutischen Mittels, z. B. eines Arzneimittels oder Radioisotops, an einem Infektionsherd mit hohem Wirkungsgrad und mit einem verbesserten therapeutischen Index, so daß eine wirksamere Diagnose und/oder Behandlung der Infektion ermöglicht wird.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein wirksames und selektives Verfahren zum zielgerichteten Ansprechen eines Infektionsherds bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, diagnostische und therapeutische Mittel mit hoher Spezifität für Infektionsherde bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein alternatives oder zusätzliches Verfahren zur Chemotherapie für die Behandlung bestimmter mikrobieller und parasitärer Infektionen bereitzustellen, die einer Chemotherapie nicht zugänglich sind oder darauf vergleichsweise wenig ansprechen und die eine schwächende oder lebensbedrohende Krankheit verursachen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, den therapeutischen Index eines chemotherapeutischen Mittels und/oder eines Radiopharmazeutikums zu verbessern.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann im Licht der nachstehenden Erörterung ersichtlich.

Zusamenfassende Darstellung der Erfindung

Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst, indem ein steriles injizierbares Präparat gemäß der Definition in den Ansprüchen 1-16 bereitgestellt wird.
Die Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung polyspezifischer Antikörperkonjugate zum zielgerichteten Ansprechen von Infektionsherden, die ein radiomarkiertes polyspezifisches Konjugat einer Vielzahl von Antikörperfragmenten, die chemisch aneinander gebunden sind und die an eine Vielzahl von Epitopen auf einer einzelnen Art eines Pathogens oder einem oder mehreren Antigenen, die davon abstammen, binden, konjugiert mit mindestens einem diagnostischen Radioisotop, umfassen, und im Fall von mikrobiellen Pathogenen oder Invertebratenparasiten, die eine Vielzahl von Antigenen zu verschiedenen Stadien ihres Lebenszyklus exprimieren, die Verwendung eines polyspezifischen Konjugats einer Vielzahl von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die chemisch aneinander gebunden sind und die an eine Vielzahl von Antigenen, die zu verschiedenen Stadien des Lebenszyklus des Pathogens oder Parasiten exprimiert werden, binden, konjugiert an mindestens ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel. Diese Präparate können in Form von sterilen injizierbaren Präparaten und Reagenzsätzen zur Verwendung bei der Ausführung des vorstehenden Verfahrens bereitgestellt werden.

Ausführliche Beschreibung

Antimikrobielle Mittel werden herkömmlicherweise in vier Hauptgruppen eingeteilt, und zwar auf der Basis der Beeinflussung (1) der bakteriellen Zellwandsynthese, (2) der Cytoplasmamembran, (3) der Proteinsynthese und (4) der Nucleinsäuresynthese; oftmals kann jede dieser Gruppen in mehrere Klassen unterteilt werden. Übersichtsartikel über die antimikrobielle Chemotherapie finden sich in dem Kapitel von M. P. E. Slack (In: Oxford Textbook of Medicine, 2. Auflg., Bd. I, herausgegeben von D. J. Weatherall, J. G. G. Lidingham und D. A. Warrell, S. 5.35-5.53; Oxford University Press, Oxford/Melbourne/New York, 1987) und in Abschnitt XII, Chemotherapy of Microbial Diseases (In: Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6. Auflg., Goodman et al., Hrsg., S. 1080-1248; Macmillan Publishing Co., New York, 1980).
Wie in diesen Texten angegeben ist, sind einige antimikrobielle Mittel selektiv hinsichtlich ihrer Toxizität, da sie den Mikroorganismus bei Konzentrationen, die vom Wirt toleriert werden, abtöten oder hemmen (d. h. das Arzneimittel wirkt auf mikrobielle Strukturen oder Biosynthesewege, die sich von denen der Wirtszellen unterscheiden). Andere Mittel sind nur zur zeitweiligen Hemmung des Wachstums der Mikrobe imstande, die das Wachstum wiederaufnehmen kann, wenn der Hemmstoff entfernt wird. Oftmals ist die Fähigkeit, eine Mikrobe oder einen Parasiten abzutöten oder zu hemmen, eine Funktion der Konzentration des Mittels im Körper und dessen Flüssigkeiten.
Diese Prinzipien und die verfügbaren antimikrobiellen Arzneimittel sind zwar erfolgreich bei der Behandlung vieler Infektionen und insbesondere bakterieller Infektionen; andere Infektionen sind jedoch resistent oder sprechen vergleichsweise wenig auf eine systemische Chemotherapie an, z. B. virale Infektionen und bestimmte pilzliche, Protozoen- und Parasiteninfektionen.
"Mikrobe" bezeichnet hier Viren, Bakterien, Rickettsien, Mycoplasmen, Protozoen und Pilze, während "Pathogen" sowohl Mikroben als auch infektiöse mehrzellige Invertebraten, z. B. Helminthen, Spirocheten und dergl. bezeichnet.
Viren können Wirtszellen infizieren und vor zirkulierenden systemischen Arzneistoffen "verborgen" sein. Selbst wenn die virale Proliferation aktiv ist und das Virus aus den Wirtszellen freigesetzt wird, können systemische Mittel unzureichend wirksam in Spiegeln sein, die vom Patienten toleriert werden.
Entsprechend ist eine Anzahl von pilzlichen, Protozoen- und Parasiteninfektionen resistent gegenüber einer systemischen Arzneimitteltherapie, zumindest zum Teil aus dem Grund, daß eine wirksame antipathogene Dosis eines Arzneistoffs über dem Spiegel liegt, der vom Patienten toleriert wird, oder aus dem Grund, daß die Infektion über herkömmliche systemische Wege der Arzneimittelverabreichung nur schwierig zugänglich war.
Die vorliegende Erfindung löst viele der Probleme, die mit der Behandlung von Infektionen verbunden sind, die gegenüber einer herkömmlichen Arzneimitteltherapie refraktär sind, und zwar unter Verwendung von sehr spezifischen Antikörpern, die gegen mikrobielle oder parasitäre Antigene erzeugt wurden, um ein wirksames Radionuclid und/oder chemisches Mittel zielgerichtet an den Infektionsherd zu bringen und dabei selektiv das Pathogen abzutöten. Ein zielgerichtetes Arzneimittel kann eine verstärkte Wirksamkeit aufgrund einer signifikant erhöhten Konzentration an der Zielstelle im Vergleich zum Rest des Körpers aufweisen. Ein Antikörper zum zielgerichteten Einsatz ist in der Lage, an ein zugängliches Epitop des Pathogens oder an Antigene, die von dem Pathogen abgegeben werden oder die aus dessen Fragmentierung und/oder Zerstörung stammen und die sich am Infektionsherd anreichern, zu binden. Das Epitop kann sich auf der Oberfläche des Pathogens oder Antigens oder an einem zugänglichen Ort im Pathogen befinden. Die therapeutische Komponente des Konjugats wird dabei an der Zielstelle mit einem höheren Wirkungsgrad und einem verbesserten Ziel-zu-Nichtziel-Verhältnis lokalisiert.
Der zielgerichtete Einsatz ist auch wirksam für diagnostische Mittel und insbesondere Mittel für die szintigraphische Abbildung oder magnetische Resonanzabbildung (MRI) von Infektionsstellen. Dies hilft dem behandelnden Arzt bei der Bewertung des Zustands des Patienten und des Stadiums der Infektion und beim Entwurf und bei der Überwachung von Behandlungsprotokollen.
Die Antikörperkomponente kann polyspezifisch sein, d. h. sie kann eine Vielzahl von Antikörpern enthalten, die an eine Vielzahl von Epitopen auf dem Pathogen oder seinem Antigen binden. Die polyspezifische Antikörperkomponente kann ein polyklonales Antiserum, vorzugsweise affinitätsgereinigt, aus einem Tier, das mit einer immunogenen Form des Pathogens oder seines Antigens belastet und zur Bildung einer Vielzahl von spezifischen Antikörpern gegen das Pathogen oder dessen Antigen stimuliert wurde, sein. Eine weitere Alternative ist die Verwendung eines "künstlichen polyklonalen" Gemisches, bei dem es sich um ein Gemisch von monoklonalen Antikörpern mit einem definierten Bereich von Epitopenspezifitäten handelt.
In beiden Arten von polyklonalen Gemischen sind die polyspezifischen Antikörper chemisch aneinander unter Bildung eines einzigen polyspezifischen Moleküls, das zur Bindung an jedes von mehreren Epitopen imstande ist, gebunden. Die Konjugation derartiger polyspezifischer Moleküle zum zielgerichteten Einsatz mit einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß das Mittel die Stelle der Infektion erreicht, womit das Ziel-zu-Nichtziel-Verhältnis und die Wirksamkeit des Vehikels erhöht werden. Ein Weg, um eine derartige Verknüpfung durchzuführen, besteht darin, bivalente F(ab')&sub2;-Hybridfragmente durch Mischen von zwei verschiedenen F(ab')&sub2;-Fragmenten, gebildet z. B. durch Pepsinverdau von zwei verschiedenen Antikörpern, reduktive Spaltung unter Bildung eines Gemisches von Fab'-Fragmenten, gefolgt von oxidativer Wiederherstellung der Disulfidbindungen unter Bildung eines Gemisches von F(ab')&sub2;-Fragmenten unter Einschluß von Hybridfragmenten, die einen Fab'-Anteil, der spezifisch für jedes der ursprünglichen Antigene ist, enthalten, herzustellen. Verfahren zur Herstellung derartiger Hybridantikörperfragmente werden in Feteanu, "Labeled Antibodies in Biology and Medicine", S. 321-323 (McGraw-Hill Int. Bk. Co., New York et al., 1978); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 93 (1961), S. 470; und Hammerling et al., J. Exp. Med., Bd. 128 (1968), S. 1461 sowie in US-Patent 4 331 647 beschrieben.
Dem Fachmann sind weitere Verfahren zur Herstellung von bivalenten Fragmenten bekannt, die vollständig heterospezifisch sind, z. B. unter Verwendung von bifunktionellen Linkern zur Verknüpfung von gespaltenen Fragmenten. Es sind rekombinante Moleküle bekannt, die die leichten und schweren Ketten eines Antikörpers enthalten, z. B. gemäß dem Verfahren von Boss et al., US-Patent 4 816 397. Analoge Verfahren zur Herstellung von rekombinanten oder synthetischen bindenden Molekülen mit den charakteristischen Eigenschaften der Antikörper sind in die Erfindung eingeschlossen. Mehr als zwei verschiedene monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente können unter Verwendung von verschiedenen Linkern, die dem Fachmann bekannt sind, verknüpft werden.
Das immunologische Profil der im wesentlichen monospezifischen und vorzugsweise monoklonalen Antikörper, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen polyspezifischen Konjugate verwendet werden, kann eingestellt werden, um eine optimale Bindung an das Pathogen oder dessen Antigene sicherzustellen, und zwar durch Mischen der Antikörperspezifitäten für verschiedene Antigene und ihre Epitope in speziellen Fällen von Infektionen sowie Bindungskonstanten für die Zielepitope, so daß die Selektivität und der Wirkungsgrad des zielgerichteten Einsatzes des erfindungsgemäßen Reagenzes genau eingestellt werden.
Ein erfindungsgemäßes Abbildungsreagenz kann bispezifische, trispezifische oder allgemeiner polyspezifische Antikörper/Fragment-Konjugate umfassen, und es kann ferner ein abbildendes Radioisotop oder eine paramagnetische Spezies umfassen.
Die Antikörperkomponente des Konjugats kann ganze Antikörper, Antikörperfragmente oder Unterfragmente umfassen. Die Verwendung des Ausdrucks "Antikörper" bedeutet hier, daß ganze Antikörper, Antikörperfragmente und Unterfragmente eingeschlossen sind, und der Ausdruck ist somit äquivalent zu dem Ausdruck "Antikörper/Fragment", der austauschbar damit in der vorliegenden Erörterung verwendet wird, sofern nichts anderes angegeben ist. Antikörper können ganze Immunglobuline (IgG) einer beliebigen Klasse, z. B. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, chimäre Antikörper oder Hybridantikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitopspezifitäten oder Fragmente, z. B. F(ab')&sub2;, Fab', Fab und dergl. unter Einschluß von Hybridfragmenten, sein, und sie umfassen zusätzlich beliebige Immunglobuline oder beliebige natürliche, synthetische oder gentechnische Proteine, die wie ein Antikörper durch Binden an ein spezifisches Antigen unter Bildung eines Komplexes reagieren.
Antikörper können Antiserumpräparate aus einer Anzahl von üblicherweise verwendeten Tieren, z. B. Ziegen, Primaten, Eseln, Schweinen, Kaninchen, Pferden, Hühnern, Meerschweinchen, Ratten oder Mäusen, und sogar humane Antiseren nach entsprechender Selektion und Reinigung umfassen. Die tierischen Antiseren werden durch Impfen der Tiere mit einer immunogenen Form des Pathogens oder von dessen Antigen nach herkömmlichen Verfahren, Blutentnahme aus den Tieren und Gewinnung von Serum oder einer Immunglobulin enthaltenden Serumfraktion gewonnen.
Das Antiserum wird vorzugsweise nach herkömmlichen Verfahren affinitätsgereinigt, z. B. durch Bindung von Antigen an eine chromatographische Säulenpackung, z. B. Sephadex, Durchleiten des Antiserums durch die Säule, wobei spezifische Antikörper zurückgehalten werden und andere Immunglobuline und Verunreinigungen abgetrennt werden, und anschließende Gewinnung gereinigter Antikörper durch Elution mit einem chaotropen Mittel, wahlweise gefolgt von einer weiteren Reinigung, z. B. mittels Durchleiten durch eine Säule mit gebundenen Blutgruppenantigenen oder anderen Nicht-Pathogenspezies. Dieses Verfahren kann bevorzugt sein, wenn die gewünschten Antikörper aus dem Serum von Patienten isoliert werden, die einen Antikörpertiter gegen das fragliche Pathogen entwickelt haben, wobei die Retention von Antikörpern, die zur Bindung an exponierte Epitope imstande sind, sichergestellt wird.
Aus Hybridomen stammende monoklonale Antikörper (Mensch, Affe, Ratte, Maus oder dergl.) sind ebenfalls für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet und haben den Vorteil einer hohen Spezifität. Sie können ohne weiteres nach Verfahren hergestellt werden, die nun allgemein als herkömmliche Verfahren der Immunisierung von Säugern mit einem immunogenen Antigenpräparat, der Fusion von Immunlymph- oder Milzzellen mit einer unsterblichen Myelomzellinie und der Isolierung der spezifischen Hybridomklone angesehen werden. Weniger konventionelle Verfahren der Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind nicht ausgeschlossen, wie Interspezies-Fusionen und gentechnische Manipulationen der hypervariablen Regionen, da es hauptsächlich die Antigenspezifität der Antikörper ist, die ihre Eignung in der vorliegenden Erfindung beeinflußt. Humane Lymphozyten können mit einer humanen Myelomzellinie verschmolzen werden, um Antikörper mit speziellen Spezifitäten und vorzugsweise gegen Epitope, die durch zirkulierende Antikörper gegen die hauptsächlichen antigenen Stellen auf dem Pathogen nicht maskiert werden, herzustellen.
Die vorliegende Erfindung faßt auch die Verwendung von antigenspezifischen Fragmenten zur Erzeugung des polyspezifischen Antikörperkonjugats ins Auge. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papainverdau von ganzen Immunglobulinen nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Es ist bekannt, daß Antikörperfragmente durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin unter Bereitstellung eines 5S-Fragments, das als F(ab')&sub2; bezeichnet wird, hergestellt werden können. Dieses Fragment kann weiter unter Verwendung eines Thiolreduktionsmittels und wahlweise einer Blockierungsgruppe für die Sulfhydrylgruppen, die sich aus der Spaltung der Disulfidbindungen ergeben, gespalten werden, wobei monovalente 3,5S Fab'-Fragmente hergestellt werden. Alternativ dazu führt eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Papain direkt zu zwei monovalenten Fab-Fragmenten und einem Fc-Fragment. Diese Verfahren werden unter anderem von Goldenberg in den US-Patenten 4 036 945 und 4 331 647 und darin zitierten Druckschriften sowie in Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 89 (1960), S. 230; Porter, Biochem. J., Bd. 73 (1959), S. 119; und Edelmann et al., in "Methods in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1, S. 422 (Acad. Press, 1967) beschrieben und sind herkömmlich auf diesem Gebiet.
Weitere Verfahren der Spaltung von Antikörpern, wie die Trennung der schweren Ketten von monovalenten leichten-schweren Kettenfragmenten, die weitere Spaltung der Fragmente oder andere enzymatische, chemische oder gentechnische Verfahren können angewandt werden, solange die Fragmente eine Spezifität gegen das Pathogen oder Antigen, gegen das die Ausgangsantikörper erzeugt wurden, behalten.
Antikörper gegen Viren oder virale Antigene können durch Impfen eines Wirts mit rohen oder gereinigten, lebenden, abgeschwächten oder abgetöteten Viren oder mit Antigenen, die von den Viren abgegeben werden, z. B. Hüllprotein, Anteilen davon oder Fragmenten, die sich aus der Zerstörung der Viren ergeben, hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können durch Immunisierung von Mäusen oder anderen Säugerspezies mit dem Virus oder viralen Antigenen, Isolierung von Splenozyten aus dem immunisierten Wirt und Verschmelzen mit einer geeigneten Myelomzellinie unter Verwendung somatischer Zellhybridisierungstechniken zur Bildung von Hybridomen, die antivirale Antikörper bilden, hergestellt werden. Diese Hybridome können isoliert, subkloniert und kultiviert werden, um monoklonale Antikörper herzustellen. Die aus den Hybridomen stammenden mqnoklonalen Antikörper gegen virale Antigene stammen üblicherweise von Maus oder Ratte und sind typischerweise IgGs oder IgMs, wobei jedoch geeignete Antikörper zur Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate nicht im Hinblick auf Spezies oder Ig-Klasse beschränkt sein sollen.
Im allgemeinen können Antikörper üblicherweise gegen die meisten Antigene unter Anwendung der zahlreichen herkömmlichen Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, erzeugt werden. Antikörper, die spezifisch an andere mikrobielle oder parasitäre Antigene auf dem Organismus selbst oder auf Fragmenten oder abgesonderten oder angereicherten Antigenen binden, können durch Anpassung der vorstehenden Methoden auf eine Weise, die für den Fachmann inzwischen herkömmlich ist, erzeugt werden. Beliebige Antikörper, die an ein Pathogen oder dessen Antigen, das sich in einer ausreichenden Konzentration am Infektionsherd im Körper eines Säugers findet, binden, können zur Herstellung der Konjugate zum zielgerichteten Einsatz für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern gegen die Agentien infektiöser Erkrankungen sind entwickelt worden und werden zusammenfassend in einem Übersichtsartikel von Polin in Eur. J. Clin. Microbiol., Bd. 3/5 (1984), S. 387-398 dargestellt, was die einfache Verfügbarkeit zeigt. Das Hauptinteresse an derartigen Antikörpern bestand in der Vergangenheit jedoch in ihrer Verwendung in diagnostischen in vitro-Assays. Einige nicht-konjugierte Antikörper sind als therapeutische Mittel in Tiermodellen untersucht worden, jedoch nur mit begrenztem Erfolg.
Der Wert der Konjugation derartiger Antikörper mit Radioisotopen und/oder Arzneimitteln oder Toxinen, um einen zielgerichteten Nachweis, eine Abbildung oder Therapie der Infektion zu erreichen, ist nicht erkannt worden, und die Wirksamkeit derartiger Mittel konnte aus derartigen Darstellung im Stand der Technik nicht vorhergesagt werden.
Zu den monoklonalen Antikörpern (MAbs) gegen Pathogene und ihre Antigene, die von Polin, a.a.O., zitiert werden, gehören:

Antibakterielle MAbs

Streptococcus agalactiae
Legionella pneumophilia
Streptococcus pyogenes
Escherichia coli
Neisseria gonorrhosae
Neisseria meningitidis
Pneumococcus
Hemophilis influenzae B
Treponema pallidum
Spirocheten der Lyme-Krankheit
Pseudomonas aeruginosa
Mycobacterium leprae
Brucella abortus
Mycobacterium tuberculosis
Tetanus-Toxin

Antivirale MAbs

Tollwut-Virus
Influenza-Virus
Cytomegalovirus
Herpes simplex I und II
Menschliches Serum-Parvo-artiges Virus
Respiratory-Syncytial-Virus
Varicella-Zoster-Virus
Hepatitis B-Virus
Masern-Virus
Adenovirus
Menschliche T-Zell-Leukämie-Viren
Epstein-Barr-Virus
Maus-Leukämie-Virus*
Mumps-Virus
Vesikular-Stomatitis-Virus
Sindbis-Virus
Lymphozytisches Choriomeningitis-Virus
Warzen-Virus
Blue-Tongue-Virus
Sendai-Virus
Katzen-Leukämie-Virus*
Reo-Virus
Polio-Virus
Simian-Virus 40*
Maus-Brusttumor-Virus *
Dengue-Virus
Rubella-Virus
* tierisches Virus

Anti-Protozoen-MAbs

Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Toxoplasma gondii
Trypanosoma rangeli
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rhodesiensei
Trypanosoma brucei
Schistosoma mansoni
Schistosoma japanicum
Babesia bovis
Elmeria tenella
Onchocerca volvulus
Leishmania tropica
Trichinella spiralis
Theileria parva
Taenia hydatigena
Taenia ovis
Taenia saginata
Echinococcus granulosus
Mesocestoides corti

Anti-Mycoplasmen-MAbs

Mycoplasma arthritidis
M. hyorhinis
M. orale
M. arginini
Acholeplasma laidlawii
M. salivarium
M. pneumoniae
Zusätzliche Beispiele für MAbs, die gegen infektiöse Mikroorganismen erzeugt und in der Literatur beschrieben wurden, sind nachstehend angegeben.
MAbs gegen Malariaparasiten können gegen die Sporozoit-, Merozoit-, Schizont- und Gametocyt-Stadien gerichtet sein. Monoklonale Antikörper sind gegen Sporozoiten (Circumsporozoit-Antigen) erzeugt worden, und es ist gezeigt worden, daß sie Sporozoiten in vivo und in Nagetieren neutralisieren (N. Yoshida et al., Science, Bd. 207 (1980), S. 71-73).
Mehrere Gruppen haben MAbs gegen T. gondii, den Protozoen-Parasiten, der an Toxoplasmose beteiligt ist, entwickelt (Kasper et al., J. Immunol., Bd. 129 (1982), S. 1694-1699; Id., Bd. 130 (1983), S. 2407-2412).
MAbs sind gegen schistosomulare Oberflächenantigene entwickelt worden, und es ist festgestellt worden, daß sie gegen Schistosomulae in vivo oder in vitro wirken (Simpson et al., Parasitology, Bd. 83 (1981), S. 163-177; Smith et al., Parasitology, Bd. 84 (1982), S. 83-91, Gryzch et al., J. Immunol., Bd. 129 (1982), S. 2739-2743; Zodda et al., J. Immunol., Bd. 129 (1982), S. 2326-2328; Dissous et al., J. Immunol., Bd. 129 (1982), S. 2232-2234).
Trypanosoma cruzi ist das hervorrufende Agens der Chagas-Krankheit und wird durch blutsaugende Reduviid-Insekten übertragen. Es ist ein MAb erzeugt worden, der spezifisch die Differentiation einer Form des Parasiten zu einer anderen (Epimastigot-Stadium zu Trypomastigot-Stadium) in vitro hemmt und der mit einem Zelloberflächen-Glycoprotein reagiert; dieses Antigen fehlt jedoch bei Säugerformen (Blutstromformen) des Parasiten (Sher et al., Nature, Bd. 300 (1982), S. 639-640). Geeignete MAbs sind gegen die meisten Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Protozoen, Helminthen), die für die Mehrzahl der Infektionen bei Menschen verantwortlich sind, entwickelt worden, und viele sind bisher für in vitro-diagnostische Zwecke verwendet worden. Diese Antikörper und neuerer MAbs, die nach herkömmlichen Verfahren zur weiteren Verbesserung des zielgerichteten Einsatzes unter Verwendung von MAB- Kombinationen erzeugt werden können, eignen sich für die in vivo-Verwendung als abbildende und therapeutische Reagenzien, wenn sie mit geeigneten Radionucliden und Arzneistoffen konjugiert werden.
Es ist im allgemeinen günstig, Antikörper mit einer relativ hohen Immunreaktivität, d. h. einer Bindungskonstante von mindestens etwa 10&sup5;/Mol und vorzugsweise von mindestens etwa 10&sup7;/Mol sowie hoher Immunspezifität, d. h. mindestens etwa 40%, vorzugsweise mindestens etwa 60% und insbesondere mindestens etwa 70-95% für Pathogenantigene, zu verwenden.
Für bestimmte Anwendungen, z. B. für die Abbildung, kann es jedoch bevorzugt sein, Antikörper mit einer etwas geringeren Bindungskonstante in der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Antikörper mit hohen Bindungskonstanten binden mit großer Wahrscheinlichkeit fest nicht nur an Pathogene und ihre Antigene an der Stelle der Infektion, sondern auch an derartige Pathogene und/oder Antigene, die im Kreislaufsystem vorhanden sind. Bei Antikörpern mit einer geringeren Bindungskonstante besteht andererseits eine Tendenz, sich hauptsächlich an konzentrierten Pathogen/Antigen-Herden aufgrund einer Art von Massenwirkungseffekt anzureichern. Dies verringert die vorzeitige Clearance und Nichtziel-Anreicherung der abbildenden Markierung und erhöht damit die wirksame Menge für den zielgerichteten Einsatz am Infektionsherd.
Antikörperkonjugate für die Abbildung können nach einer Reihe herkömmlicher Verfahren, die von der einfachen Glutaraldehydverknüpfung bis zu eleganteren und spezifischeren Verknüpfungen zwischen funktionellen Gruppen reichen, hergestellt werden. Die Antikörper und/oder Antikörperfragmente werden vorzugsweise kovalent aneinander gebunden, und zwar direkt oder durch eine kurze oder lange Linkergruppe, durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen auf dem Antikörper/Fragment, z. B. Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thioloder Hydroxygruppen. Verschiedene herkömmliche Linker zusätzlich zu Glutaraldehyd können verwendet werden, z. B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Bis- (hydroxysuccinimid)-ester, Carbodiimide, Maleinimid-hydroxysuccinimidester und dergl.
Ein einfaches Verfahren besteht darin, die Antikörper/Fragmente in Gegenwart von Glutaraldehyd unter Bildung eines Antikörper-Verbundmaterials zu mischen. Die anfängliche Schiff-Base-Verknüpfung kann z. B. durch Borhydridreduktion zu sekundären Ammen stabilisiert werden. Dieses Verfahren wird herkömmlicherweise zur Herstellung anderer Konjugate von Proteinen, z. B. Peroxidase-Antikörper-Konjugaten für immunhistochemische Anwendungen oder für Immunoassays, angewandt. Ein Diisothiocyanat oder ein Carbodiimid kann anstelle von Glutaraldehyd als nicht ortsspezifischer Linker verwendet werden.
Bispezifische Antikörper können nach einer Reihe herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Disulfidspaltung und Neubildung von Gemischen aus ganzen IgG oder vorzugsweise F(ab')&sub2;-Fragmenten, durch Fusionen von mehr als einem Klon unter Bildung von Polyomen, die Immunglobuline mit mehr als einer Spezifität bilden, und durch gentechnische Verfahren. Die bispezifischen Antikörper können an ein oder mehrere virale Epitope binden. Bispezifische ("Hybrid") Antikörperfragmente werden durch oxidative Verknüpfung von Fab'-Fragmenten hergestellt, die durch reduktive Spaltung von verschiedenen Antikörpern erhalten werden. Ein Anteil davon enthält Fragmente, die spezifisch für beide Antigene sind, gegen die die ursprünglichen Antikörper erzeugt wurden.
Eine selektivere Verknüpfung kann unter Verwendung eines heterobifunktionellen Linkers, wie eines Maleinimid-hydroxysuccinimidesters, erzielt werden. Die Reaktion des letztgenannten Esters mit einem Antikörper/Fragment derivatisiert Amingruppen auf dem Antikörper/Fragment, und das Derivat kann dann z. B. mit einem Antikörper-Fab-Fragment mit freien Sulfhydrylgruppen (oder einem größeren Fragment oder einem intakten Immunglobulin, an das Sulfhydrylgruppen z. B. durch Traut-Reagenz angeheftet wurden) umgesetzt werden. Bei einem derartigen Linker ist die Wahrscheinlichkeit der Vernetzung von Gruppen des gleichen Antikörpers geringer, und die Selektivität der Verknüpfung wird erhöht.
Es ist vorteilhaft, die Antikörper-Fragmente an Stellen, die von den Antigen-Bindungsstellen entfernt sind, zu verknüpfen. Dies kann z. B. durch Verknüpfung an gespaltenen Interketten-Sulfhydrylgruppen erreicht werden, wie es vorstehend angegeben wurde. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Umsetzung eines Antikörpers, dessen Kohlenhydratanteil oxidiert worden ist, mit einem weiteren Antikörper, der mindestens eine freie Aminfunktion aufweist. Dies führt zu einer anfänglichen Schiff-Base-Verknüpfung (Imin-Verknüpfung), die vorzugsweise durch Reduktion zu einem sekundären Amin, z. B. durch eine Borhydrid-Reduktion, unter Bildung des endgültigen Verbundmaterials stabilisiert wird. Derartige ortsspezifische Verknüpfungen werden für kleine Moleküle oder Polypeptide oder für Festphasen-Polymerträger im US-Patent 4 671 958 und für größere Addenden im US-Patent 4 699 784 beschrieben.
Ähnliche Reaktionen können herangezogen werden, um eine Vielzahl von Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten, z. B. Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, aneinander unter Bildung von polyspezifischen Konjugaten oder Konjugaten mit mehr als einer epitopen Spezifität für ein Pathogen oder dessen Antigen zur Erhöhung der Bindungsaffinität oder der Wirksamkeit an der Zielstelle zu binden. Bispezifische Konjugate können an einen Antikörper/ein Fragment, der/das spezifisch für ein drittes, viertes oder weiteres Epitop ist, z. B. unter Verwendung eines heterobifunktionellen Maleinimid-hydroxysuccinimidester-Linkers, um eine Amingruppe zu derivatisieren, gefolgt von einer Umsetzung des Derivats mit einem Fragment mit einer freien Sulfhydrylgruppe, die wahlweise mit einem Reagenz, wie 2-Iminothiolan, eingeführt wurde, gebunden werden. Alternative Verknüpfungsverfahren erkennt der Durchschnittsfachmann leicht auf der Basis der Beschreibung für die Bildung von bispezifischen Verbundmaterialien, und sie erfordern nur eine geringe Variation und Anpassung derartiger Verfahren.
Die Antikörperkomponente des Konjugats kann mit einem Radioisotop für die szintigraphische Abbildung oder einem Magnetresonanz-Abbildungsverstärkungsmittel zur Verwendung als ein diagnostisches Abbildungsmittel markiert oder konjugiert oder für die Konjugation angepaßt werden. Beliebige herkömmliche Verfahren zur Radiomarkierung, die zur Markierung von Proteinen für die in vivo-Verwendung geeignet sind, sind im allgemeinen für die Markierung des Verbundmaterials geeignet. Dies kann durch direkte Markierung z. B. mit einem Radioisotop eines Halogens oder eines Metallions unter Anwendung herkömmlicher Techniken oder ausgefeilterer Methoden oder durch Anheften eines Chelatbildners für ein Radiometall oder ein paramagnetisches Ion erfolgen. Derartige Chelatbildner und die Arten ihrer Anheftung an Antikörper sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und unter anderem in Childs et al., J. Nuc. Med., Bd. 26 (1985), S. 293 sowie in den Goldenberg-US-Patenten 4 331 647, 4 348 376, 4 361 544, 4 458 457, 4 444 744 und 4 624 846 beschrieben. Typisch sind Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese weisen typischerweise Gruppen an der Seitenkette auf, durch die der Chelatbildner an den Antikörper angeheftet werden kann. Alternativ dazu können Carboxyl- oder Amingruppen auf dem Chelatbildner aktiviert und dann mit einem Antikörper nach bekannten Verfahren gekuppelt werden. Zum Beispiel weist Deferoxamin, bei dem es sich um einen Chelatbildner für Ga-67 handelt, eine freie Amingruppe auf, die mit einem geeigneten Linker so modifiziert werden kann, daß sie eine aktivierte Carboxyl-, Isothiocyanat- oder dergl. Gruppe enthält und dann an Amine auf dem Antikörper gekuppelt wird.
Der Chelatbildner kann an den Antikörper direkt oder über eine kurzkettige oder langkettige Linkergruppe, über eine oder mehrere funktionelle Gruppen auf dem Antikörper, z. B. Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thiol- oder Hydroxylgruppen, gebunden werden. Verschiedene herkömmliche Linker können verwendet werden, z. B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Carbodiimide, Bishydroxysuccinimidester, Maleinimid-hydroxysuccinimidester, Glutaraldehyd und dergl., und vorzugsweise ein selektiver sequentieller Linker, wie der Anhydrid-isothiocyanat-Linker, der im US-Patent 4 680 338 beschrieben wird.
Die Markierung mit Iod-131 (I-131) oder Iod-123 (I-123) kann ohne weiteres unter Anwendung eines oxidativen Verfahrens bewirkt werden, bei dem ein Gemisch aus radioaktivem Kalium- oder Natriumiodid und dem Antikörper mit Chloramin-T behandelt wird, wie es z. B. von Greenwood et al., Biochem. J., Bd. 89 (1963), S. 114 und in modifizierter Form von McConahey et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., Bd. 29 (1969), S. 185 beschrieben wird. Dies führt zu einer direkten Substitution von Iodatomen anstelle von Wasserstoffatomen an dem Antikörpermolekül, vermutlich an Thyrosinresten, möglicherweise auch an Tryptophan und sogar an Phenylalaninresten, und zwar abhängig von den Anteilen des Reagenzes und den Reaktionsbedingungen. Alternativ kann die Lactoperoxidase-Iodierung angewandt werden, wie sie von Feteanu, a.a.O., S. 303 und den darin zitierten Druckschriften beschrieben wird.
Einige weiterentwickelte Verfahren der Markierung werden in den anhängigen US-Anmeldungen mit den Seriennummern 742 436 (6-7-85), 084 544 (8-12- 87) und 176 421 (4-I-88) beschrieben. Eine Vielzahl von Markierungstechniken werden in Feteanu, "Labeled Antibodies in Biology and Medicine", S. 214-309 (McGraw-Hill Int. Book Co., New York et al., 1978) beschrieben. Die Einführung von verschiedenen Metallradioisotopen kann gemäß den Verfahren von Wagner et al., J. Nucl. Med., Bd. 20 (1979), S. 428; Sundberg et al., J. Med. Chem., Bd. 17 (1974), S. 1304 und Saha et al., J. Nucl. Med., Bd. 6 (1976), S. 542 erfolgen. Die vorstehenden Verfahren dienen lediglich der Erläuterung der vielen Verfahren zur Radiomarkierung von Proteinen, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiele für Verbindungen, die sich für die MRI-Abbildungsverstärkung eignen, umfassen paramagnetische Ionen, z. B. Gd(III)-, Eu(III)-, Dy(III)-, Pr(III)-, Pa(III)-, Mn(II)-, Cr(III)-, Co(III)-, Fe(III)-, Cu(II)-, Ni(II)-, Ti(III)- und V(IV)-Ionen, oder Radikale, z. B. Nitroxide, und diese werden mit einem Substrat, das Chelatbildner für paramagnetische Ionen trägt, konjugiert oder chelatisierenden funktionellen Gruppen, z. B. SH, NH&sub2;, COOH, für die Ionen oder Linkern für die Radikaladdenden ausgesetzt. Das MRI-Verstärkungsmittel muß in ausreichenden Mengen vorhanden sein, um die Detektion durch eine äußere Kamera unter Anwendung von Magnetfeldstärken, die vernünftig erzielt werden können und mit der Sicherheit des Patienten und dem Aufbau der Instrumente verträglich sind, zu ermöglichen. Die Anforderungen an derartige Mittel sind auf dem Gebiet dieser Mittel, die ihre Wirkung auf Wassermoleküle im Medium haben, bekannt und werden unter anderem z. B. in Pykett, Scientific American, Bd. 246 (1982), S. 78 und Runge et al., Am. J. Radiol., Bd. 141 (1987), S. 1209 beschrieben.
Es ist darauf hinzuweisen, daß viele der Verfahren zur Einführung von Metallen, direkt oder in Form von Chelaten, in Antikörper sich für die Einführung von MRI-Mitteln in die Antikörperkonjugate der Erfindung unter Bildung von Abbildungsmitteln für Infektionen eignen. MRI-Mittel weisen vorteilhafterweise eine große Anzahl von paramagnetischen Ionen oder Radikalen für die verstärkte Abbildung auf. Ein Verfahren zur Einführung einer Vielzahl derartiger Ionen besteht darin, ein Trägerpolymeres mit Chelaten zu beladen und den Träger mit dem Antikörper-Verbundmaterial zu verknüpfen, und zwar vorzugsweise ortsspezifisch an einer Stelle, die von der Antigenbindungsstelle des Konjugats entfernt ist. Dies hat den Vorteil, daß eine große Anzahl an Chelatbildnern an den Antikörper an wenigen Stellen auf dem Antikörper selbst angeheftet werden kann, so daß die Immunreaktivität nicht ernsthaft beeinträchtigt wird. Beispiele für Polymere, die sich für die Beladung des Antikörpers mit Chelatbildnern eignen, umfassen z. B. Polyole, Polysaccharide, Polypeptide und dergl., wie die, die z. B. in den US-Patenten 4 699 784 (Shih et al.) und 4 046 722 (Rowiand) beschrieben werden.
Eine Art von Polysaccharid ist Dextran. Der Chelatbildner kann funktionalisiert werden, so daß er reaktive Gruppen gegenüber den Dextranhydroxylen enthält, z. B. Anhydride, Isocyanate oder Isothiocyanate und dergl. Alternativ kann das Dextran auf einer Reihe von Wegen, z. B. durch Umwandlung in ein Aminodextran, derivatisiert werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß ähnliche Verfahren sich für die Beladung eines Antikörpers oder eines Antikörperkonjugats mit einer Vielzahl von Arzneimittelmolekülen eignen, wie es nachstehend ausführlicher erörtert wird.
Das Verfahren zur Herstellung eines Antikörperkonjugats mit einem Aminodextran (AD) -Träger beginnt normalerweise mit einem Dextranpolymeren, vorteilhafterweise einem Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht (MW) von etwa 10 000 bis 100 000, vorzugsweise etwa 10 000 bis 40 000 und insbesondere etwa 15 000. Das Dextran wird dann mit einem Oxidationsmittel umgesetzt, um eine kontrollierte Oxidation eines Anteils seiner Kohlenhydratringe unter Bildung von Aldehydgruppen zu bewirken. Die Oxidation wird zweckmäßigerweise mit glykolytischen chemischen Reagenzien, z. B. NaIO&sub4;, nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Es ist zweckmäßig, die Menge des Oxidationsmittels so einzustellen, daß etwa 50 bis 150 und vorzugsweise 100 Aldehydgruppen für ein Dextran mit einem MW von etwa 40 000 und etwa der gleiche Anteil an Aldehydgruppen für Dextrane mit anderen MW erzeugt werden. Eine größere Anzahl an Aldehydgruppen und entsprechend Amingruppen ist weniger vorteilhaft, da sich das Polymere dann mehr wie Polylysin verhält. Eine geringere Anzahl führt zu einer weniger günstigen Beladung mit dem Chelatbildner oder Boraddenden, was von Nachteil sein kann.
Das oxidierte Dextran wird dann mit einem Polyamin, vorzugsweise einem Diamin und insbesondere einem Mono- oder Polyhydroxydiamin, umgesetzt. Geeignete Amine umfassen z. B. Ethylendiamin, Propylendiamin oder dergl. Polymethylendiamine, Diethylentriamin oder dergl. Polyamine, 2,3-Diamino-2- hydroxypropan oder auf andere Weise hydroxylierte Diamine oder Polyamine und dergl. Ein Überschuß des Amins in bezug auf die Aldehydgruppen kann eingesetzt werden, um eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Aldehydfunktionen in Schiff-Basen (Imin-Gruppen) sicherzustellen.
Eine reduktive Stabilisierung des erhaltenen Zwischenprodukts wird durch Umsetzung des Schiff-Base-Zwischenprodukts mit einem Reduktionsmittel, z. B. NaBH&sub4;, NaBH&sub3;CN oder dergl., erreicht. Ein Überschuß des Reduktionsmittels wird angewandt, um eine im wesentlichen vollständige Reduktion der Imingruppen zu sekundären Amingruppen und die Reduktion jeglicher nicht umgesetzter Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen sicherzustellen. Das erhaltene Addukt kann weiter gereinigt werden, indem es durch eine herkömmliche Größenausschlußsäule geleitet wird, um vernetzte Dextrane zu entfernen. Eine Abschätzung der Anzahl der verknüpfbaren primären Aminogruppen auf dem AD kann durch Umsetzung einer abgewogenen Probe mit Trinitrobenzolsulfonsäure und Korrelation der optischen Dichte bei 420 nm mit einem Standard erhalten werden. Dieses Verfahren führt normalerweise zu einer im wesentlichen vollständigen Umwandlung der berechneten Anzahl der Aldehydgruppen zu primären mingruppen auf dem AD.
Alternativ dazu kann das Dextran nach herkömmlichen Verfahren zur Einführung von Aminfunktionen, z. B. durch Umsetzung mit Cyanogenbromid, an die sich eine Reaktion mit einem Diamin anschließt, derivatisiert werden. Das AD sollte mit einem Derivat des speziellen Arzneimittels oder Chelatbildners in einer aktivierten Form, vorzugsweise als Carboxyl-aktiviertes Derivat, das nach herkömmlichen Verfahren, z. B. unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder einer wasserlöslichen Variante davon, hergestellt wurde, umgesetzt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die vorstehenden Ausführungen lediglich die auf diesem Gebiet anerkannten Verfahren zum Anhängen von radioaktiven Markierungen und/oder Arzneimitteln oder Toxinen an Antikörper/Fragmente erläutern und daß andere Verfahren genutzt werden können, um erfindungsgemäße Konjugate herzustellen.
Das erfindungsgemäße szintigraphische Abbildungsverfahren wird ausgeführt, indem einem menschlichen Patienten parenteral eine für die szintigraphische Abbildung wirksame Menge des radiomarkierten Antikörperkonjugats injiziert wird. Parenteral bedeutet z. B. intravenös, intraarteriell, intrathekal, interstitial oder intrakavitär. Es wird in Betracht gezogen, daß ein Individuum eine Dosis im Bereich von etwa 1 mCi bis 50 mCi des radiomarkierten Konjugats erhält, wobei die Menge eine Funktion des speziellen Radioisotops und der Art der Verabreichung ist. Für die intravenöse Injektion betragen die Mengen normalerweise: etwa 2-10 mCi und vorzugsweise etwa 2-5 mCi I- 131; etwa 5-10 mCi und vorzugsweise etwa 8 mCi I-123; etwa 10-40 mCi und vorzugsweise etwa 20 mCi Tc-99m; etwa 2-5 mCi und vorzugsweise etwa 4 mCi In-111 oder Ga-67. Die Mengen anderer abbildender Radiouclide können vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres mit Bezug auf die vorstehenden Isotope und im Hinblick auf die Halbwertszeit des Nuclids und die Größe des Antikörper/Fragment/Verbundmaterials, an das es konjugiert werden soll, bestimmt werden.
Das radiomarkierte Antikörper-Verbundmaterial wird zweckmäßigerweise als ein injizierbares Präparat für die Anwendung bei Säugern und vorzugsweise als steriles injizierbares Präparat für die Anwendung beim Menschen bereitgestellt, und zwar für den zielgerichteten Einsatz eines szintigraphischen Abbildungsmittels an einem Infektionsherd, wobei das Präparat vorzugsweise folgendes enthält: eine sterile injizierbare Lösung, die eine wirksame Menge eines radiomarkierten Konjugats in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel, vorzugsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei physiologischem pH-Wert und physiologischer Konzentration, enthält. Weitere herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Vehikel können verwendet werden, wie es für die Stelle der parenteralen Verabreichung erforderlich ist.
Ein repräsentatives Präparat, das erfindungsgemäß parenteral verabreicht werden soll, enthält etwa 0,1 bis 20 mg und vorzugsweise etwa 2 mg radiomarkiertes Antikörperkonjugat in einer sterilen Lösung, die vorteilhafterweise außerdem z. B. etwa 10 mg Humanserumalbumin (1% USP; Parke-Davis) pro ml an 0,04 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,4; Bioware) mit einem Gehalt an 0,9% Natriumchlorid enthält.
Wenn genügend Isotop an der Zielstelle abgelagert worden ist, dann erfolgt eine Abtastung mit einer herkömmlichen planaren und/oder SPECT-gamma- Kamera oder unter Verwendung einer in der Hand gehaltenen gamma-Sonde, die extern oder intern zur Lokalisierung der Infektion verwendet wird. Das Szintigramm wird normalerweise durch eine gamma-Abbildungskamera mit einem oder mehreren Fenstern zum Nachweis von Energien im Bereich von 50 bis 500 keV aufgenommen. Die Zielstelle kann eine beliebige Stelle sein, an der das Pathogen oder dessen Antigene in einem relativ konzentrierten Herd vorhanden sind.
Die magnetische Resonanzabbildung (MRI) erfolgt nach einem Verfahren, das analog dem Verfahren der szintigraphischen Abbildung ist, mit der Ausnahme, daß die Abbildungsmittel MRI-Verstärkungsspezies anstelle von Radioisotopen enthalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß das magnetische Resonanzphänomen auf einem anderen Prinzip als die szintigraphie beruht. Normalerweise ist das erzeugte Signal mit den Relaxationszeiten der magnetischen Momente von Protonen in Kernen von Wasserstoffatomen von Wassermolekülen in der Region, die abgebildet werden soll, korreliert. Das magnetische Resonanzabbildungsverstärkungsmittel wirkt durch Erhöhung der Geschwindigkeit der Relaxation, wobei der Kontrast zwischen Wassermolekülen in der Region, wo das Abbildungsmittel sich anreichert, und Wassermoleküle an anderen Stellen im Körper erhöht wird. Die Wirkung des Mittels besteht jedoch darin, sowohl T&sub1; als auch T&sub2; zu erhöhen, wobei die erstgenannte Wirkung zu einem größeren Kontrast führt, während die letztgenannte Wirkung zu einem geringeren Kontrast führt. Dementsprechend ist das Phänomen konzentrationsabhängig, und es gibt normalerweise eine optimale Konzentration einer paramagnetischen Spezies für eine maximale Wirksamkeit. Die optimale Konzentration variiert abhängig von dem speziellen verwendeten Mittel, dem Ort der Abbildung, der Art der Abbildung, d. h. Spin-Echo, Sättigung-Erholung und verschiedene andere stark von T&sub1; oder T&sub2; abhängige Abbildungstechniken, sowie der Zusammensetzung des Mediums, in dem das Mittel gelöst oder suspendiert ist. Diese Faktoren und ihre relative Bedeutung sind auf diesem Gebiet bekannt; vgl. z. B. Pykett, a.a.O., und Runge et al., a.a.O.
Das erfindungsgemäße MRI-Verfahren wird ausgeführt, indem einem Säuger und vorzugsweise einem Menschen parenteral eine zur magnetischen Resonanzabbildung wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Konjugats eines Antikörperkonjugats unter Einschluß eines MRI-Verstärkungsmittels injiziert wird. Es wird in Betracht gezogen, daß das Individuum eine Dosis an markiertem Konjugat erhält, die ausreichend ist, um das MRI-Signal an der Stelle der Infektion um mindestens etwa 20% und vorzugsweise 50-500% zu verstärken, wobei die Menge eine Funktion der speziellen paramagnetischen Spezies und der Art der Verabreichung ist.
Das markierte Antikörperkonjugat wird wiederum zweckmäßigerweise als ein injizierbares Präparat für die Verwendung bei Säugern und vorzugsweise als ein steriles injizierbares Präparat für die Verwendung bei Menschen bereitgestellt. Ein typisches Präparat für den zielgerichteten Einsatz eines MRI-Mittels am Infektionsherd umfaßt vorzugsweise: eine sterile injizierbare Lösung, die eine wirksame Menge eines markierten Konjugats in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel, vorzugsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei physiologischem pH-Wert und physiologischer Konzentration, enthält. Weitere herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Vehikel für die parenterale Verabreichung können verwendet werden, wie es für die Stelle der parenteralen Verabreichung erforderlich ist.
Ein repräsentatives erfindungsgemäßes Präparat, das parenteral verabreicht werden soll, enthält normalerweise etwa 0,1 bis 50 mg und vorzugsweise etwa 5 mg an markierten polyspezifischem Antikörper-Verbundmaterial in einer sterilen Lösung, die vorteilhafterweise außerdem z. B. etwa 10 mg Humanserumalbumin (1% USP; Parke-Davis) pro ml an 0,04 M Phosphatpuffer (pH- Wert 7,4; Bioware) mit einem Gehalt an 0,9% Natriumchlorid enthält. Wenn das MRI-Mittel an der Zielstelle abgelagert worden ist, wird eine Abtastung mit einer herkömmlichen MRI-Kamera durchgeführt, um die Infektion abzubilden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Lokalisierungsverhältnis des primären markierten Antikörperkonjugats durch die Verwendung eines nicht markierten zweiten Antikörpers verstärkt, um nicht ans Ziel gelangtes zirkulierendes Konjugat abzufangen und dessen Clearance zu fördern, wie es für verwandte Abbildungsmittel in Goldenberg, US-Patent 4 624 846 (EP-A-0 149 709) beschrieben wird. Diese Technik ist gleichfalls auf einen Antikörper oder ein Antikörper-Verbundmaterial, das an ein therapeutisches Arzneimittel konjugiert ist, anwendbar, wie nachstehend erörtert wird. Der Ausdruck "Lokalisierungsverhältnis" wird in seinem herkömmlichen Sinn verwendet, d. h. das Verhältnis von Ziel-zu-Nichtziel-Antikörperkonjugat. Im allgemeinen wird der zweite Antikörper in einer Menge verwendet, die das Lokalisierungsverhältnis des primären Antikörperkonjugats um mindestens etwa 20% und typischerweise um 50% oder mehr erhöht.
Bei dem zweiten Antikörper kann es sich um ganzes IgG oder IgM oder ein Fragment von IgG oder IgM handeln, solange es zur Bindung des primären Antikörperkonjugats unter Bildung eines Komplexes imstande ist, der aus dem Kreislauf und den Nichtzielräumen rascher als das primäre Antikörperkonjugat selbst entfernt wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem zweiten Antikörper um ganzes IgG oder IgM. Wenn der primäre Antikörper ein Fragment von IgG oder IgM ist, dann ist es bevorzugt, daß der zweite Antikörper ein ganzes IgG oder IgM ist, so daß der primäre/sekundäre Komplex die Fähigkeit zur Aktivierung der Komplementkaskade behält. Wenn umgekehrt der primäre Antikörper ein ganzes IgG ist, dann kann es sich bei dem zweiten Antikörper um ein Fragment handeln, wenn der Komplex noch die Komplement-fixierenden Eigenschaften behält.
Es ist bevorzugt, daß mindestens ein Bestandteil des primären/sekundären Paars ein ganzes IgG oder IgM ist. Ein Vorteil der Verwendung von IgM besteht darin, daß es einen höhermolekularen Komplex mit primärem Antikörper oder mit abgelösten Konjugaten, d. h. diagnostischen und/oder therapeutischen Prinzipien, wie Arzneimitteln, chelatisierenden Mitteln, Radionucliden und dergl., bildet. Dies erhöht die Geschwindigkeit und Wirksamkeit der Clearance von primärem Nichtziel-Antikörper und/oder -Prinzip, insbesondere aus dem Blut.
Der zweite Antikörper kann nach Verfahren hergestellt werden, wie sie im vorstehend erwähnten Goldenberg-Patent '846 beschrieben werden. Monoklonales Anti-Spezies-IgG ist auch erhältlich und wird mit Vorteil als zweiter Antikörper im vorliegenden Verfahren verwendet. Nichtmetallische Konjugate, z. B. radioiodierte Linkergruppen oder organische paramagnetische Spezies, wie Nitroxide, können ebenfalls Haptene sein, für die der zweite Antikörper spezifisch ist.
Der zweite Antikörper wird dem Individuum injiziert, nachdem eine ausreichende Zeit nach der parenteralen Verabreichung des primären polyspezifischen Antikörperkonjugats abgelaufen ist, um eine maximale Aufnahme davon durch Infektionsherde zu ermöglichen, und zwar typischerweise etwa 2-72 Stunden nach der anfänglichen Verabreichung und vorzugsweise etwa 4-48 Stunden nach der Verabreichung. Wenn der primäre Antikörper nicht intravenös verabreicht wird, dann kann es von Vorteil sein, zumindest einen Teil des sekundären Antikörpers auf dem gleichen parenteralen Weg zu verabreichen. Es ist jedoch von Vorteil, mindestens einen Teil des zweiten Antikörpers intravenös zu verabreichen, um die Clearance des primären Antikörpers zu beschleunigen, der in das Kreislaufsystem diffundiert ist.
Eine alternative oder zusätzliche Maßnahme zur Verwendung des zweiten Antikörpers, um zirkulierenden markierten primären Antikörper zu entfernen und das Lokalisierungsverhältnis des primären Antikörpers zu verstärken, besteht in der Verwendung von Abbildungsverstärkungs-Subtraktionstechniken, wie sie in den vorstehenden Goldenberg-Patenten sowie in den dort zitierten Druckschriften beschrieben werden. Dies ist eine auf diesem Gebiet anerkannte Technik, bei der ein indifferenter Antikörper oder ein Fragment mit einem Radionuclid markiert wird, das unabhängig nachgewiesen werden kann, und der markierte indifferente Antikörper dem Individuum injiziert wird. Dieser Antikörper weist im wesentlichen die gleichen Kinetiken von Verteilung und Metabolismus wie der primäre Antikörper während der für die Abbildung erforderlichen Zeitspanne auf. Die Injektion derartiger Antikörper ist gegenüber herkömmlichen Subtraktionsmitteln, wie Tc-99m-markiertem Serumalbumin, bevorzugt, die sich jedoch dennoch für die Verwendung zur Verstärkungsbildverarbeitung durch Kompensation des Hintergrunds eignen. Die Verwendung des radiomarkierten indifferenten Antikörpers als Subtraktionsmittel erlaubt die computergestützte Korrektur von Nichtziel-Hintergrundstrahlung von Organen, die die Clearance von Antikörpern aus dem Kreislaufsystem bewirken.
Der Durchschnittsfachmann erkennt, daß der primäre monoklonale Antikörper und der indifferente Antikörper, der als Subtraktionsmittel verwendet wird, vorzugsweise aus der gleichen Spezies oder dem gleichen Myelom/Hybridom stammen, so daß der zweite Antikörper den primären monoklonalen Antikörper und das indifferente Antikörper-Immunglobulin aus Nichtzielbereichen mit im wesentlichen der gleichen Geschwindigkeit entfernt. Es ist ferner bevorzugt, daß der zweite Antikörper für eine konstante Region der primären und indifferenten Immunglobulin-Spezies spezifisch ist.
Die eingeführte Menge des zweiten Antikörpers ist im allgemeinen die Menge, die den zirkulierenden primären Antikörper um 10-85% innerhalb von 2- 72 Stunden verringern kann. Das Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper, das die Clearance beeinflußt, hängt von den Bindungseigenschaften des primären und sekundären Antikörperpaars ab. Ein vorläufiges Screening von Patientenblut in vitro kann herangezogen werden, um eine anfängliche Abschätzung des geeigneten Verhältnisses zu erhalten. Das Screening wird herangezogen, um das Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper, das erforderlich ist, um eine Präzipitinbande z. B. in einem Geldiffusionstest zu erhalten, zu bestimmen. Dies gibt den allgemeinen Bereich des molaren Verhältnisses von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper an, das als ein Maß für die untere Grenze des Verhältnisses dient, da die in vivo-Anwendung ein höheres Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper erfordern kann, als durch derartige in vitro-Tests angezeigt wird.
In der Praxis liegt das molare Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper im allgemeinen im Bereich von etwa 5-50, wobei der Bereich jedoch nicht als beschränkend angesehen werden darf. Molare Verhältnisse von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper von 15-25 und vorzugsweise von 20-25 haben sich als vorteilhaft erwiesen, wenn sowohl der primäre als auch der zweite Antikörper ganze IgG sind. Abbildungspräparate und Reagenzsätze können zweiten Antikörper in einem getrennten Behälter für die Injektion zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Verabreichung des Antikörperkonjugats enthalten.
Es sind viele Arzneimittel und Toxine bekannt, die eine zytotoxische Wirkung auf pathogene Mikroben, die einen Menschen infizieren können, haben. Sie finden sich in jedem der ohne weiteres erhältlichen, anerkannten Kompendien von Arzneimitteln und Toxinen, wie dem Merck Index und dergl. Beliebige derartige antibiotische oder zytotoxische Arzneimittel können an einen anti- Pathogen-Antikörper oder ein Antikörper-Verbundmaterial unter Bildung eines erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels konjugiert werden, und die Verwendung eines derartigen Konjugats zur Verbesserung des zielgerichteten Einsatzes eines antibiotischen oder zytotoxischen Arzneimittels an einem Infektionsherd, so daß dessen wirksame Konzentration an der Stelle erhöht wird, ist ein Teil der vorliegenden Erfindung.
Eines oder mehrere antibiotische oder zytotoxische Arzneimittel können mit einem polymeren Träger konjugiert werden, der dann an den Antikörper oder das Antikörper-Verbundmaterial für die therapeutische Verwendung konjugiert wird. In bestimmten Fällen ist es möglich, ein Arzneimittel als Teil des Antikörperkonjugats teilweise oder vollständig zu entgiften, während es sich im Kreislauf befindet, was systemische Nebenwirkungen des Arzneimittels oder Toxins verringern und dessen Verwendung erlauben kann, wenn die systemische Verabreichung des Arzneimittels nicht akzeptabel wäre. Die Verabreichung von mehr Molekülen des Arzneimittels, konjugiert an ein Polymeres, das ferner an den Antikörper konjugiert ist, erlaubt die Therapie, während die systemische Toxizität gemildert wird.
Die erfindungsgemäße Methodik ist auf die therapeutische Behandlung von Infektionen durch Konjugation des primären Antikörpers oder Antikörper- Verbundmaterials an ein antibiotisches oder zytotoxisches Arzneimittel oder ein Toxin anwendbar. Auf diesem Gebiet anerkannte Verfahren der Konjugation von Arzneimitteln oder Toxinen an Immunglobuline werden z. B. in dem Kapitel von O'Neill mit dem Titel "The Use of Antibodies as Drug Carriers" in: Drug Carriers in Biology and Medicine, G. Gregoriadis, Hrsg., Academic Press, London, 1979; Amon et al., Recent Results in Cancer Res., Bd. 75 (1980), S. 236 und Moelton et al., Immunolog. Res., Bd. 62 (1982), S. 47 beschrieben, was die Bekanntheit zeigt. Diese Verfahren sind den Verfahren ähnlich, die zur Kupplung von Arzneimitteln angewandt werden, die gegen verschiedene Krankheiten hervorrufende Mikroorganismen, wie gegen Bakterien, Viren, Pilze und diverse Parasiten, wirksam sind, an Antikörper, die gegen diese Mikroorganismen, ihre Produkte oder Antigene, die mit deren Läsionen verbunden sind, entwickelt wurden.
Derartige antibiotische oder zytotoxische Arzneimittel unter Einschluß z. B. von Tetracyclinen, Chloramphenicol, Piperazin, Chloroquin, Diaminopyridinen, Metroniazid, Isoniazid, Rifampinen, Streptomycinen, Sulfonen, Erythromycin, Polymixinen, Nystatin, Amphotericinen, 5-Fluorcytosin, 5-Iod- 2'-desoxyuridin, 1-Adamantanamin, Adeninarabinosid, Amanitinen und Azidothymidin (AZT) sind zur Kupplung an geeignete spezifische Antikörper/Fragmente und Antikörper/Fragment-Verbundmaterialien bevorzugt. Verschiedene weitere potentielle antibiotische/zytotoxische Mittel für die Verwendung in der Erfindung sind in Goodman et al., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 6. Auflg., A. G. Gilman et al., Hrsg., Macmillan Publishing Co., New York, 1980, angegeben, was die allgemeine Bekanntheit zeigt. Verschiedene Bedingungen, die für den zielgerichteten Einsatz von Arzneimitteln an speziellen Zielstellen geeignet und günstig sind, sind im Überblick von Trouet et al. in: Targeting of Drugs, G. Gregoriadis et al., Hrsg., Plenum Press, New York und London, 1982, S. 19-30 dargestellt worden, was die klinische Kenntnis zeigt, wie ein derartiger zielgerichteter Einsatz Vorteile für Patienten, die an infektiösen Läsionen leiden, mit sich bringen würde.
Die Verwendung eines zweiten Antikörpers, wie es vorstehend im Zusammenhang mit der Abbildung beschrieben wurde, erhöht die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels in der gleichen Weise wie für das diagnostische Abbildungskonjugat. Die Wirksamkeit des therapeutischen Mittels wird als dessen therapeutischer Index ausgedrückt, der, verwendet im herkömmlichen Sinn, als das Verhältnis von therapeutischen Wirkungen zu unerwünschten Nebenwirkungen definiert ist. Er ist oftmals als ein quantitatives Maß der Wirksamkeit im Vergleich zur Toxizität in einem Standardmodellsystem definiert, z. B. das Verhältnis der mittleren letalen Dosis (LD&sub5;&sub0;) zur mittleren wirksamen Dosis (ED&sub5;&sub0;). Die Verwendung eines zweiten Antikörpers, wie es hier beschrieben wird, führt zu einer Erhöhung des therapeutischen Index von antiviralen Antikörpern und Antikörper-Verbundkonjugaten durch Entfernen von primärem Nichtziel-Antikörper und/oder abgelöstem therapeutischem Prinzip. Außer daß der zweite Antikörper spezifisch für den primären monoklonalen Antikörper ist, wie es vorstehend beschrieben wurde, kann er im Fall des therapeutischen Präparats auch spezifisch für das therapeutische Mittel sein. Er kann auch spezifisch für einen Träger für das therapeutische Mittel sein.
Hier in Betracht gezogene therapeutische Präparate umfassen monospezifische anti-Pathogen-Antikörper/Fragmente gemäß der vorstehenden Definition, konjugiert an ein therapeutisch wirksames Radioisotop und/oder antibiotisches/zytotoxisches Arzneimittel, und zwar in einem geeigneten Vehikel für die parenterale Verabreichung. Ein therapeutisches Präparat kann gleichfalls ein polyspezifisches anti-Pathogen-Antikörper/Fragment-Verbundmaterial, konjugiert an ein Radioisotop und/oder antibiotisches/zytotoxisches Arzneimittel, enthalten.
Es ist in bestimmten Fällen von Vorteil, ein Arzneimittel mit einem Radionuclid zu kombinieren, insbesondere wenn das Pathogen "sich versteckt" oder in gewisser Weise unzugänglich ist. Die längere Reichweite von Radionucliden kann verborgenes Pathogen erreichen, solange eine gewisse Menge Antigen für das Konjugat zugänglich ist. Außerdem kann die Strahlung die Lyse einer infizierten Zelle hervorrufen und intrazelluläres Pathogen der antimikrobiellen Arzneimittelkomponente des Konjugats aussetzen.
Therapeutische Präparate können auch einen getrennt abgepackten zweiten Antikörper gemäß der vorstehenden Beschreibung enthalten. Geeignete Vehikel sind auf diesem Gebiet bekannt und können z. B. sterile PBS-Lösungen analog zu denen, die für die Verabreichung von diagnostischen Abbildungsmitteln verwendet werden, wie sie vorstehend erörtert wurden, enthalten.
Die erfindungsgemäßen antimikrobiellen polyspezifischen Abbildungskonjugate und monospezifischen oder polyspezifischen therapeutischen Konjugate können außerdem zweckmäßigerweise in einem therapeutischen oder diagnostischen Reagenzsatz für den zielgerichteten Antikörpereinsatz an einem Infektionsherd bereitgestellt werden. Typischerweise umfaßt ein derartiger Reagenzsatz ein Fläschchen, das das erfindungsgemäße Antikörperkonjugat als ein lyophilisiertes Präparat oder in einem Injektionsvehikel enthält. Wenn das Konjugat für die szintigraphische Abbildung oder für die Radioisotoptherapie verwendet werden soll, dann wird es im allgemeinen als ein kaltes Konjugat zusammen mit Reagenzien und Hilfsmitteln für die Radiomarkierung in getrennten Behältern bereitgestellt, während MRI-Mittel und therapeutische Arzneimittel/Toxin-Konjugate im allgemeinen mit einer paramagnetischen Spezies oder einem antibiotischen/zytotoxischen Mittel, das bereits mit dem Antikörper/Fragment-Verbundmaterial oder dem monospezifischen Antikörper/Fragment konjugiert ist, bereitgestellt. Der Reagenzsatz kann ferner einen zweiten, getrennt verpackten, nicht markierten Antikörper oder ein Antikörperfragment, das spezifisch gegen den Antikörper oder das Fragment oder das therapeutische Mittel, einen Träger dafür oder ein chelatbildendes Mittel für das Radionuclid oder das paramagnetische Ion ist, enthalten.
Die erfindungsgemäßen abbildenden Präparate und Verfahren können relativ kleine Infektionsherde nachweisen und abbilden und sind leicht und sicher zu verwenden. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Reagenzien und Verfahren stellen ein Mittel zum zielgerichteten Einsatz von Radioisotopen und Arzneimitteln an Infektionsstellen bereit, so daß der therapeutische Index verbessert wird, die systemischen Nebenwirkungen verringert werden und die Wirksamkeit erhöht wird.
Radionuclid-Immunkonjugate sind besonders wirksam für die mikrobielle Therapie. Nachdem festgestellt worden ist, daß markierte Antikörper an infektiösen Stellen in einem Individuum lokalisiert werden, werden höhere Dosen des markierten Antikörpers, im allgemeinen 20 mCi bis 150 mCi pro Dosis für I-131, 5 mCi bis 30 mCi pro Dosis für Y-90 oder 5 mCi bis 20 mCi Re-186, jeweils bezogen auf einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg, injiziert. Die Injektion kann intravenös, intraarteriell, intralymphatisch, intrathekal oder intrakavitär (d. h. parenteral) erfolgen, und sie kann wiederholt werden. Es kann von Vorteil für einige Therapien sein, mehrfache aufgeteilte Dosen an Antikörper oder Antikörper-Verbundmaterial zu verabreichen und auf diese Weise für höhere mikrobielle toxische Dosen zu sorgen, ohne daß üblicherweise ein proportionaler Anstieg der Bestrahlung von normalen Geweben bewirkt wird.
Eine Reihe von Radioucliden eignen sich für die Therapie, und sie werden in den speziellen Antikörper durch die vorstehend erörterten Markierungstechniken sowie andere herkömmliche Techniken, die auf diesem Gebiet bekannt sind, eingebaut. Bevorzugte therapeutisch wirksame Radionuclide sind Astat-211, Bismut-212, Yttrium-90, Rhenium-186, Rhenium-188, Kupfer-67, Iod- 131 und Iod-125, wobei jedoch andere Radionuclide sowie Lichtsensibilisierungsmittel ebenfalls geeignet sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern, die eine erhebliche Anzahl von Boratomen mit mindestens 20% des natürlichen Vorkommens des Bor-10-Isotops aufweisen. Der Bor enthaltende Addend kann nach einer Reihe von Verfahren, wie sie im US-Patent 4 824 659 (Hawthorne) beschrieben werden, eingeführt werden. Der Bor-10 enthaltende Antikörper kann nach einem oder mehreren der vorstehenden Verfahren unter Bildung eines Antikörpers, der sowohl eine oder mehrere Radiomarkierungen zum Infektionsnachweis und/oder zur Therapie als auch einen hohen Gehalt an Bor-10-Atomen für die Absorption von thermischen Neutronen enthält, radiomarkiert werden. Alternativ dazu kann der Bor-markierte Antikörper ohne Anheftung von gamma-emittierenden Isotopen an den Antikörper verwendet werden. Die infektiösen Läsionen werden dann mit einem gut kollimierten Strahl von thermischen Neutronen bestrahlt, die bevorzugt von Bor-10-Kernen auf dem borhaltigen Addenden absorbiert werden, und der aktivierte Kern zerfällt rasch zu Lithium-7 und einem alpha-Teilchen. Diese erhaltenen alpha-Teilchen sind toxisch, und ihre Erzeugung tötet benachbarte Mikroorganismen und Zellen ab.
Eine besonders wirksame Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen besteht in der Behandlung des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) und der prodromalen Immunschwäche, die als AIDS-related Complex (ARC) aufgrund einer HIV-Infektion bekannt ist. Es gibt zwar keine Heilung für AIDS oder ARC, es werden jedoch Arzneimittel, die die Aktivität von reverser Transkriptase, die ein einzigartiges Merkmal des HIV-Retrovirus ist, blockieren, bei AIDS-Patienten untersucht. Patienten werden jedoch schließlich resistent und erleiden einen Rückfall, so daß andere therapeutische Maßnahmen erforderlich sind.
AIDS-Patienten entwickeln zirkulierende Antikörper gegen verschiedene HIV-Komponenten, wie virale Kernantigene, Hüllglycoprotein-Antigenkomplex und Transmembranprotein. Die Hauptreaktivität bei AIDS-Patienten ist gegen ein mögliches virales Hüllglycoprotein mit einem Molekulargewicht von 41 000 (gp41) gerichtet. Es konnte nicht vorhergesagt werden, daß Antikörper sich für den zielgerichteten Einsatz gegen HIV bei Menschen eignen, da möglicherweise zu erwarten war, daß die eigenen Antikörper des Patienten die Zielstellen, die für den zielgerichteten Einsatz von exogenen HIV-Antikörpern erforderlich sind, sättigen würden.
Es wurde nun festgestellt, daß exogene monoklonale Antikörper gegen HIV und insbesondere Antikörper, die spezifisch gegen bestimmte Hüllglycoprotein-Epitope sind, eine hohe Selektivität und Affinität für das Virus aufweisen und in der Tat hinsichtlich der Epitopspezifität von den natürlich auftretenden menschlichen HIV-Antikörpern unterschieden werden können. Die Immunisierung von Mäusen mit HIV-Hüllglycoprotein-Antigenextrakten hat zu monoklonalen Antikörpern geführt, die mit verschiedenen Hüllantigenepitopen reagieren. Einzelne derartige monklonale Antikörper und vorzugsweise eine Kombination derartiger Antikörper sind bevorzugte Antikörperkomponenten des erfindungsgemäßen Antikörperkonjugats für die Verwendung bei Nachweis, Abbildung und Therapie von HIV-Infektionen. Alternativ dazu können Antikörper aus Menschen oder Affen aus ihren Wirten durch herkömmliche Immunglobulinisolierungs- und Reinigungsverfahren isoliert und als zielgerichtete Mittel aufgrund ihrer Fähigkeit zum zielgerichteten Einsatz gegen HIV-infizierte Zellen in vitro (z. B. durch Immunfluoreszenz-Anfärbverfahren) ausgewählt werden. Menschliche Antikörper sind vorzugsweise die, die als Ziele Epitope auf dem Virus haben, die von den hauptsächlichen antigenen Stellen verschieden und getrennt sind. Affenantikörper werden vorzugsweise in Tieren hergestellt, in denen erfolgreiche Modelle der HIV-Infektion erhalten wurden. Monoklonale Antikörper von Menschen oder Affen können nach bekannten Techniken hergestellt werden, die z. B. die Transfektion von Maus-Myelomzellen mit DNA aus Menschen oder Affen für die Antikörperbildung beinhalten, wie es z. B. in Gillies et al., Biotechnology, Bd. 7/8 (1989), S. 799-804 und Nakatani et al., Biotechnology, Bd. 7/8 (1989), S. 805-810 beschrieben wird.
Ein Verbundmaterial-HIV-Antikörperpräparat, konjugiert an ein Radionuclid, z. B. Bismut-212 oder einen anderen alpha-Strahler mit kurzer Reichweite, oder an einen Inhibitor der reversen Transkriptase kann also in therapeutischen Dosen des Radionuclids oder des Arzneimittels zur wirksamen Behandlung von Patienten mit AIDS verwendet werden.
Auch von anderen Erkrankungen ist gezeigt worden, daß sie resistent oder refraktär gegenüber einer systemischen Chemotherapie sind. Diese Erkrankungen umfassen verschiedene virale, pilzliche, bakterielle und Protozoeninfektionen sowie spezielle parasitäre Infektionen. Weitere virale Infektionen umfassen die, die vom Influenza-Virus, Herpes-Virus, z. B. Epstein- Barr-Virus und Cytomegalovirus, Tollwut-Virus (Rhabdoviridae) und Papova-Virus hervorgerufen werden, die alle schwierig mit systemischen antibiotischen/zytotoxischen Mitteln zu behandeln sind. Die Verwendung von Antikörperkonjugaten und insbesondere Konjugaten aus Antikörper/Fragment-Verbundmaterialien zum zielgerichteten Einsatz gegen derartige Viren sorgt für einen signifikant höheren therapeutischen Index für antivirale Arzneimittel und Toxine, so daß deren Wirksamkeit verstärkt wird und systemische Nebenwirkungen verringert werden. Die zielgerichtete Radioimmuntherapie mit Konjugaten von Antikörpern/Fragmenten und/oder Verbundmaterialien daraus mit therapeutischen Radioisotopen (unter Einschluß von Boraddenden, die durch thermische Neutronen aktivierbar sind) bietet einen neuen Ansatz der antiviralen Therapie.
Protozoen, die vergleichsweise resistent gegenüber einer systemischen Chemotherapie sind, umfassen z. B. Plasmodien (insbesondere P. falciparum, den Malariaparasiten), Toxoplasma gondii (das infektiöse Agens der Toxoplasmose), Leishmaniae (das infektiöse Agens bei der Leishmaniase) und Eschenchia histolytica. Nachweis und Behandlung von Malaria in ihren verschiedenen Stadien werden durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper/Fragment-Konjugate erheblich verbessert. Wie vorstehend festgestellt wurde, sind MAbs die an Sporozoit-Antigene binden, bekannt. Da jedoch die Blutstadiumparasiten keine Sporozoit-Antigene aufweisen, ist die Verwendung von MAbs gegen Sporozoit-Antigene zum zielgerichteten Einsatz auf eine relativ kurze Zeitspanne beschränkt, in der die Sporozoiten sich frei im Kreislauf befinden, und zwar vor und unmittelbar nach der Injektion und Entwicklung in den Wirt-Hepatozyten. Es ist daher bevorzugt, ein Gemisch aus MAbs oder ein MAb- Verbundmaterial gegen z. B. mehr als ein Parasitenstadium von P. falciparum als zielgerichtetes Mittel für die wirksamere Behandlung von Malaria bei Menschen zu verwenden, die nicht auf eine herkömmliche Chemotherapie ansprechen. Die MAbs sind an ein geeignetes Radionuclid für die Abbildung (z. B. Tc-99m) oder für die Therapie (z. B. Astat-211; Rhenium-186) oder an ein Antimalaria-Arzneimittel (z. B. Pyrimethamin) für eine selektivere Therapie konjugiert.
Toxoplasmose ist ebenfalls resistent gegenüber einer systemischen Chemotherapie. Es ist nicht klar, ob MAbs, die spezifisch an T. gondii binden, oder natürliche Wirtsantikörper eine Rolle bei der Immunreaktion auf Toxoplasmose spielen können; wie im Fall von Malariaparasiten sind geeignete zielgerichtete MAbs jedoch wirksame Vehikel für die Abgabe von therapeutischen Mitteln.
Schistosomiase, eine weit verbreitete Helmintheninfektion, wird von frei schwimmenden Cercariae ausgelöst, die von einigen Süßwasserschnecken getragen werden. Wie im Fall von Malaria gibt es verschiedene Stadien der Cercariae, die an dem infektiösen Prozeß beteiligt sind. MAbs, die an eine Vielzahl von Stadien von Cercariae und wahlweise an eine Vielzahl von Epitopen auf einem oder mehreren davon binden und vorzugsweise in Form eines polyspezifischen Verbundmaterials vorliegen, können an ein abbildendes oder therapeutisches Mittel für den wirksamen zielgerichteten Einsatz und eine verstärkte therapeutische Wirksamkeit konjugiert werden.
MAbs, die an eine oder mehrere Formen von Trypanosoma cruzi, das ursächliche Agens der Chagas-Krankheit, binden, können hergestellt und für den Nachweis und die Behandlung dieser mikrobiellen Infektion verwendet werden. Der vorstehend angegebene MAb, der mit einem Zelloberflächenglycoprotein reagiert, sowie MAbs, die mit anderen Oberflächenantigenen auf Differenzierungsstadien des Trypanosoms reagieren, sind geeignet, um abbildende und therapeutische Mittel zielgerichtet an Stellen der parasitären Infiltration im Körper einzusetzen.
Ein weiterer infektiöser Organismus, der sehr schwierig durch verfügbare Arzneimittel zu behandeln ist, ist der Leprabacillus (Mycobacterium leprae). Antikörper, die spezifisch an eine Vielzahl von Epitopen auf der Oberfläche von M. leprae binden, können hergestellt werden, und zwar z. B. durch Belastung einer Maus mit abgeschwächtem oder fragmentiertem M. leprae oder dessen Oberflächenantigenen, und diese können allein oder in Kombination verwendet werden, um abbildende Mittel und/oder antibiotische/zytotoxische Mittel gegen den Bacillus zu richten.
Helminthen-Parasiteninfektionen z. B. Strongybidose und Trichinose, die selbst relativ refraktär gegenüber chemotherapeutischen Mitteln sind, sind geeignete Kandidaten für die erfindungsgemäße Antikörper-gerichtete Diagnose und Therapie unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an ein oder vorzugsweise eine Vielzahl von Epitopen auf den Parasiten binden.
Es sind Antikörper verfügbar oder können leicht erzeugt werden, die spezifisch an die meisten Mikroben und Parasiten binden, die für die Mehrzahl von Infektionen bei Menschen verantwortlich sind, wie es durch die vorstehende Offenbarung und die Zitate von Druckschriften erläutert wurde. Viele davon sind bereits für in vitro-diagnostische Zwecke verwendet worden, und die vorliegende Erfindung zeigt ihre Eignung als Komponenten von Antikörperkonjugaten zum zielgerichteten Einsatz diagnostischer und therapeutischer Mittel an Infektionsstellen. Mikrobielle Pathogene und Invertebratenparasiten von Menschen und Säugern sind Organismen mit komplexen Lebenszyklen, die eine Vielzahl von Antigenen aufweisen, die in verschiedenen Stadien exprimiert werden. Die zielgerichtete Behandlung kann daher am besten bewirkt werden, wenn Antikörperkonjugate, die antigene Determinanten auf verschiedenen Formen erkennen, in Kombination verwendet werden, und zwar als Gemische oder als polyspezifische Konjugate, die an die entsprechende therapeutische Gruppe gebunden sind. Das gleiche Prinzip gilt für die Verwendung von MAb-Reagenzien zum Nachweis von Infektionsstellen durch Anheftung an Abbildungsmittel, z. B. Radiouclide und/oder MRI-Verstärkungsmittel.
In dem Ausmaß, in dem therapeutische Radioisotope, Arzneimittel, Toxine und andere zytotoxische Mittel eine hämatopoietische Toxizität als Nebenwirkung ihrer Verabreichung zeigen, ist die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Cytokins, insbesondere eines Lymphokins oder eines anderen Wachstumsfaktors, zur Linderung oder Verhinderung einer derartigen Toxizität und zur Stimulierung der Markbildung von Vorteil und ein Teil der Erfindung. Das Cytokin kann als ein getrenntes Präparat bereitgestellt werden. Gemäß einer derartigen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Präparat in einer Form vorliegen, die sich für die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung eignet, wobei das Präparat eine Menge des Cytokins umfaßt, die ausreicht, um die hämatopoietische Toxizität des therapeutischen Mittels zu lindern oder zu verhindern, wenn es einem Patienten zu einem Zeitpunkt vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des therapeutischen Konjugats verabreicht wird. Eine derartige Verabreichung erfolgt analog zu der, die in der gleichzeitig anhängigen Us-Patentanmeldung des gleichen Inhabers mit der Seriennummer 174 490 (EP-A-0 336 631) beschrieben wird.
Ohne weitere Ausführung wird angenommen, daß ein Fachmann unter Heranziehung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Umfang nutzen kann. Die nachstehenden bevorzugten speziellen Ausführungsformen sind daher lediglich als erläuternd aufzufassen.

Beispiele

In den nachstehenden Beispielen werden alle Temperaturen unkorrigiert in ºC angegeben. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Teil- und Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Spezifischer muriner monoklonaler Antikörper gegen HIV-gp160

Mäuse werden mit dem gpl6o-Hüllvorläuferprotein von HIV-1 hyperimmunisiert. Milzlymphozyten aus den hyperimmunisierten Tieren werden mit SP2/0- Myelomzellen verschmolzen, und die verschmolzenen Zellen werden in HAT in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten verdünnt. Nach 10 Tagen werden die Überstände aus Vertiefungen, die wachsenden Hybride enthalten, durch ELISA auf ihre Reaktivität mit gp160 getestet. Vertiefungen, die monoklonale Antikörper enthalten, die reaktiv mit gp160 sind, werden anschließend auf ihre Reaktivität mit den HIV-I-Hüllproteinen gp120 und gp41 (gp160-Produkte) abgesucht. Für gp160 spezifische Klone, die nicht durch Antikörper in menschlichem Serum aus seropositiven AIDS-Patienten blockiert werden, werden subkloniert. Vier Klone mit hoher Spezifität und Affinität, von denen mindestens zwei an HIV in Gegenwart voneinander binden können (nachstehend zusammenfassend MAb-160s und einzeln MAb-160s1, MAb-160s2, MAb-160s3, MAb-160s4), werden in Kultur vervielfacht und zur Herstellung von Ascites-Flüssigkeit in Balb-c-Mäusen verwendet. Jeder MAb-160s wird aus der Ascitesflüssigkeit durch Affinitätschromatographie an Protein A gereinigt. Es wird festgestellt, daß die Klone zur IgG&sub1;-Unterklasse gehören, und sie werden zur Herstellung von Konjugaten verwendet.
Monoklonale Antikörper gegen weitere HIV-Antigene können bei Patienten verwendet werden, die keine signifikanten Blutspiegel des Antigens und keine signifikanten Blutspiegel des Antikörpers, die die Bindung des monoklonalen anti-HIV-Antikörpers blockieren, aufweisen.

Beispiel 2

Herstellung von 99m-Tc-MAb-160s1-Fab'-Abbildungsmittel

Gereinigter MAb-160s1, der gemäß Beispiel 1 hergestellt wird, wird zu dem F(ab')&sub2;-Fragment mit Pepsin umgesetzt, und das divalente Fragment wird zu Fab' durch Reduktion mit Cystin umgesetzt. Nach Entfernung des Cystins durch Gelfiltration wird das Fab' mit einem gepufferten Reduktionsmittel, vorzugsweise SnCl&sub2;, gemischt und lyophilisiert. 99m-Tc-MAb-160s1-Fab' wird unmittelbar vor der Injektion in den Patienten durch Zugabe von 20 mCi 99mTc-Pertechnetat in steriler Kochsalzlösung zu einem Fläschchen, das den lyophilisierten Mab-160s1-Fab' enthält, hergestellt.

Beispiel 3

Herstellung von 131-I-X-MAB-160s1+2-F(ab')&sub2;

Gereinigter MAb-160s1 und MAb-160s2, die gemäß Beispiel 1 hergestellt werden, werden jeweils zu Fab'-Fragmenten umgesetzt, wie es in Beispiel 2 beschrieben wird. Die Thiolgrupen der MAb-160s2-Fragmente werden mit Iodacetamid als Endgruppen versehen, und das mit Endgruppen versehene Fragment wird mit Maleinimid-hydroxysuccinimid-p-nitrobenzoatester derivatisiert, und die Fragmente werden getrennt durch Gelfiltration gereinigt. Die gereinigten Fragmente werden miteinander unter Bildung eines chemisch verbundenen divalenten Verbundmaterials mit dualer Spezifität für das gp-160-Antigen umgesetzt. Das Verbundmaterial wird mit I-131 nach dem Chloramin-T-Verfahren radioiodiert, um eine Aktivität von 180 mCi pro Dosis zu erzielen.

Beispiel 4

Diagnostische Abbildung

Ein 24 Jahre alter männlicher Patient wird mit AZT behandelt und wird resistent gegenüber dem Arzneimittel; er exprimiert HIV-p24-Antigen in seinem Blut. Er zeigt Unwohlsein und hat tägliche Anfälle von Schüttelfrost und Fieber. Es wird eine immunszintigraphische Studie unter Verwendung des gemäß Beispiel 2 hergestellten Abbildungsmittels durchgeführt. In das Fläschchen, das 1 mg lyophilisiertes Fab' enthält, werden 20 mCi an Generator-erzeugtem Natriumpertechnetat in PBS gegeben. Nach 5 Minuten wird das Abbildungsmittel injiziert, und der Patient wird 3 Stunden später mit einer gamma-Kamera im SPECT-Modus abgetastet. Intensive Herde mit gebundenem Tc-99m werden in zahlreichen Lymphknoten und in der Milz beobachtet.
Analog können Nachweis und Abbildung anderer viraler Infektionen unter Verwendung eines Einzelantikörper- oder Mehrfachantikörper-Konjugats, radiomarkiert oder MRI-Verstärker markiert, gemäß den allgemeinen Verfahren, die in den vorstehenden Beispielen erläutert wurden, durchgeführt werden.

Beispiel 5

AIDS -Therapie

Dem Patienten von Beispiel 4 wird eine Injektion von 131-I-MAb- 160d1+2-F(ab')&sub2;, der aus einem Anteil einer Standarddosis gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde, in einer Dosis von 5 mCi gegeben. Eine planare Abbildung unter Verwendung einer gamma-Kamera zeigt eine intensive Anreicherung von I- 131 an den gleichen Stellen, die mit 99m-Tc-MAb-160s-Fab' abgebildet wurden. Die Blutpharmakokinetik zeigt, daß der Patient sicher mit 180 mCi an radioiodiertem MAb behandelt werden kann. Ihm werden 180 mCi 131-I-Mab-160s-1+2- F(ab')&sub2; injiziert. Im Verlauf der nächsten beiden Wochen fallen die Blutspiegel an p24-HIV-Antigen rasch, und das Antigen ist nach 3 Wochen nicht nachweisbar. Eine zweite Abbildungsstudie nach 4 Wochen mit 99m-Tc-Mab-160s- Fab' ist negativ, wobei sich keine Lokalisierung von gebundenem Tc-99m in Lymphknoten oder Milz zeigt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt der Patient weitere Zeichen der Besserung mit einer Abnahme des Fiebers.
Analoge antivirale therapeutische Konjugate können für die Behandlung anderer viraler Infektionen unter Anwendung der allgemeinen Methodik, die in den vorstehenden Beispielen erläutert wurde, hergestellt werden.

Beispiel 6

Anti-Malaria-Antikörper

Mäuse werden mit Merozoiten aus Plasmodium falciparum hyperimmunisiert. Milzzellen aus den hyperimmunisierten Tieren werden mit SP2/0-Myelomzellen verschmolzen, und die verschmolzenen Zellen werden in HAT in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten verdünnt. Nach 10 Tagen werden die Überstände aus Vertiefungen, die wachsende Hybride enthalten, auf die spezifische Bindung an Merozoiten, die an Polyacrylamidkügelchen mit Glutaraldehyd gebunden sind, unter Verwendung eines I-125-markierten Kaninchen-anti-Maus- IgG getestet. Hybridomklone aus Vertiefungen, die Merozoiten-bindende monoklonale Antikörper enthalten, werden subkloniert. 3 von 20 positiven Klonen, die jeweils an Merozoiten in Gegenwart voneinander binden können (nachstehend zusammenfassend als a-mer-MAb und einzeln als a-mer-MAb1, a-mer-MAb2 und a-mer-MAb3 bezeichnet), werden jeweils in Kultur vervielfacht und zur Bildung von Ascitesflüssigkeit in Balb-c-Mäusen verwendet. Jeder a-mer-MAb wird aus der Ascitesflüssigkeit durch Affinitätschromatographie an Protein A gereinigt. Es wird festgestellt, daß die Klone zur IgG&sub1;-Unterklasse gehören, und sie werden zur Herstellung von Konjugaten verwendet.
Nach einem vollständig analogen Verfahren werden 3 Klone, die spezifisch an P. falciparum-Sporozoiten binden (nachstehend zusammenfassend als a-spo-MAb und einzeln als a-spo-MAb1, a-spo-MAb2 und a-spo-MAb3 bezeichnet), hergestellt und vervielfacht; Ascites-gebildete monoklonale Antikörper werden gereinigt. Es wird festgestellt, daß sie ebenfalls zur IgG&sub1;-Unterklasse gehören.

Beispiel 7

Herstellung von anti-Malaria-Konjugat

Jeder der gereinigten a-mer-MAbs und a-spo-MAbs, die gemäß Beispiel 6 hergestellt wurden, wird in ein Fab'-Fragment mit Pepsin bei anschließender Cystinreduktion analog dem Verfahren von Beispiel 2 umgesetzt, und die Fragmente werden mit einem Überschuß an Iodacetamid mit Endgruppen versehen. Zu einem äquimolaren Gemisch aus 6 verschiedenen, mit Endgruppen versehenen Fab'-Fragmenten in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 4,5 wird ein 50-facher molarer Überschuß an Glutaraldehyd gegeben, gefolgt etwa 5 bis 15 Minuten später von einem 30-fachen molaren Überschuß an Pyrimethamin (jeweils relativ zur Gesamtzahl der Mole an Antikörperfragmenten), und das Gemisch wird für 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das erhaltene Konjugat weist einen Mittelwert von 2-3 Fab'-Fragmenten und 5-10 Pyrimethaminen pro Konjugatmolekül auf. Das Konjugat wird von niedermolekularen Reagenzien auf einer kurzen Polyacryamidgelsäule befreit und steril filtriert.

Beispiel 8

Malaria-Therapie

Einem Patienten, der an einem Anfall von P. falciparum-Malaria in einem späten Stadium leidet und Schüttelfrost und Fieber erfährt, wird eine Lösung des anti-Malaria-Konjugats gemäß Beispiel 7 in physiologischer Kochsalzlösung infundiert. Ein rascher Abfall der Blutspiegel an Merozoiten wird beobachtet, und Schüttelfrost und Fieber gehen innerhalb einiger Stunden zurück. Die Leber des Patienten erhält sowohl Merozoiten-Konjugatkomplexe als auch unkomplexiertes Konjugat, die beide Pyrimethamin an Sporozoiten freisetzen, wobei ein Wiederauftreten des Anfalls gehemmt wird. Zusätzlich führt die langsame hydrolytische Spaltung der Schiff-Base-Verknüpfungen an Pyrimethamin zu einem verlängerten Plasmaspiegel des Arzneimittels, der ebenfalls eine suppressive Heilung der Infektion bewirkt. Eine häufige Überwachung des Bluts des Patienten erlaubt es, die Infusion so einzustellen, daß optimale Arzneimittelspiegel und therapeutische Wirkungen erzielt werden.
Analoge Konjugate unter Verwendung von Einzel- oder Mehrfach-Antikörper/Fragment-Konjugaten von Arzneimitteln oder Radioucliden, die an Toxoplasmose-Protozoen-Antigene, Schistosoma-Antigene, Trypanosomen-Antigene, bakterielle, pilzliche und andere mikrobielle oder parasitäre Antigene binden, können durch Variation der vorstehenden erläuterten Verfahren auf eine Weise, die der Fachmann erkennt, hergestellt werden, und die Infektionen, die von derartigen Pathogenen verursacht werden, können unter Verwendung dieser Konjugate behandelt werden.

Beispiel 9

Spezifische monoklonale Antikörper gegen Mycobacterium leprae

Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an Lepra- Bacilli binden, werden durch Hyperimmunisierung von Mäusen mit einem Beschallungsprodukt von Mycobacterium leprae, Fusion der erhaltenen Milzzellen und Absuchen der Klone auf eine spezifische Bindung an die Bacilli durch Konjugation von Überständen aus Vertiefungen, die wachsende Hybride enthalten, mit Fluorescein, Inkubation der Konjugate mit fixierten M. leprae, waschen und Nachweis von gebundenen Antikörpern unter UV-Licht hergestellt. 4 positive Klone werden subkloniert und vervielfacht; Ascites-gebildete Antikörper werden gemäß Verfahren, die analog zu denen aus Beispiel 1 sind, gereinigt.

Beispiel 10

Herstellung von Lepra-Therapiekonjugaten

Ein Gemisch aus den 4 monoklonalen Antikörpern, die gemäß Beispiel 9 hergestellt wurden, wird mild mit Periodat oxidiert, um im Mittel einen Zukkerrest in der Kohlenhydratregion zu spalten. Ein Amionodextran, an das im Mittel 20 Carborane angeheftet sind, wird mit dem oxidierten Antikörper umgesetzt, und das Schiff-Base-Konjugat wird mit Borhydrid stabilisiert. Das erhaltene Konjugat wird mit I-131 analog zu dem Verfahren von Beispiel 3 radioiodiert, um eine Aktivität von 70 mCi pro Dosis zu erzielen.

Beispiel 11

Lepra-Therapie

Einem Patient, der an einer akuten disseminierten Lepra mit hohem Fieber und zahlreichen Hautläsionen leidet, die refraktär gegenüber einer herkömmlichen Chemotherapie ist, wird intravenös eine Dosis von 70 mCi in Kochsalzlösung des gemäß Beispiel 10 hergestellten Konjugats infundiert. Es tritt eine allmähliche Verringerung des Fiebers bei einer Lokalisierung des Konjugats an den Stellen von subkutanen Läsionen und in anderen Herden auf, die durch gamma-szintigraphie nachweisbar sind. Nach 5 Tagen ist nicht lokalisiertes Konjugat weitgehend entfernt und ausgeschieden, Läsionen und Infektionsherde enthalten jedoch noch gebundenes Konjugat. Der Patient wird einem kollimierten thermischen Neutronenstrahl, der auf die szintigraphisch nachgewiesenen Läsionen und Infektionsherde gerichtet ist, ausgesetzt. Innerhalb der folgenden Woche wird eine signifikante Nekrose an den Stellen der Läsionen beobachtet, und eine Regenerierung von Gewebe beginnt an den Grenzen der Läsionen. Die herkömmliche Chemotherapie wird dann wiederaufgenommen, wobei sich eine weitere Besserung zeigt, die schließlich eine erfolgreiche Behandlung des Patienten erlaubt.
Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg durch Austausch anderer beschriebener Reaktanten und/oder Verfahrensbedingungen der Erfindungen gegen die, die in den vorstehenden Beispielen verwendet wurden, wiederholt werden. Auf diese Weise können Antikörper gegen andere menschliche Erkrankungen hervorrufende Pathogene und/oder ihre Antigene, z. B. beliebige der weiteren erläuternden Pathogene, die hier aufgezählt wurden, hergestellt und in erfindungsgemäße abbildende oder therapeutische Mittel einverleibt werden, und es können erfolgreich diagnostische und therapeutische Ergebnisse bei Patienten erzielt werden.

Claims

1. Steriles injizierbares Präparat zum Abbilden eines Infektionsherdes bei einem menschlichen Patienten, enthaltend ein radiomarkiertes, polyspezifisches Konjugat einer Vielzahl von Antikörperfragmenten, die chemisch miteinander verbunden sind und die an eine Vielzahl von Epitopen auf einer einzelnen Art eines Pathogens oder einem oder mehreren Antigenen, die davon abstammen, binden, konjugiert mit mindestens einem diagnostischen Radioisotop, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel.

2. Steriles injizierbares Präparat zum Diagnostizieren oder Behandeln eines Infektions herdes eines mikrobiellen Pathogens oder Invertebratenparasiten, das/der eine Vielfalt von Antigenen zu verschiedenen Stadien seines Lebenszyklus exprimiert, bei einem menschlichen Patienten, enthaltend ein polyspezifisches Konjugat einer Vielzahl von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die chemisch miteinander verbunden sind und die an eine Vielzahl von Antigenen binden, die zu verschiedenen Stadien des Lebenszyklus des Pathogens oder Parasiten exprimiert werden, konjugiert mit mindestens einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel, in Kombination mit einem pharmakologisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel.

3. Präparat nach Anspruch 1, wobei das diagnostische Radioisotop aus der Gruppe I-131, I-123, Tc-99m, In-111 und Ga-67 ausgewählt wird.

4. Präparat nach Anspwch 2, wobei das diagnostische oder therapeutische Mittel ausgewählt wird aus einem Radioisotop, einem Magnetresonanz- Abbildungsverstärkungs-Mittel, einem therapeutischen Radioisotop, einem Boraddenden, einem antipathogenen Arzneimittel oder einem zytotoxischen Mittel.

5. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das polyspezifische Konjugat spezifisch an eine Vielzahl von zugänglichen Epitopen auf dem Pathogen oder pathogen-assoziiertem Antigen bindet, die nicht durch die nativen Antikörper des Patienten gesättigt oder blockiert sind.

6. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente monoklonale Antikörper oder Fragmente davon sind.

7. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das polyspezifische Konjugat ein Konjugat eines Antiserums ist oder ein Konjugat von Fragmenten eines Antiserums ist.

8. Präparat nach Anspruch 7, wobei das Antiserum affinitätsgereinigt ist.

9. Präparat nach Anspruch 8, wobei die Affimtatsreimgung bewirkt wird durch Entfernen der Antikörper, die an Antigene binden, die mit dem Pathogen assoziiert sind, das mit einem signifikanten Spiegel in dem Blutstrom des Patienten zirkuliert; und/oder durch Kontakt mit gebundenem Pathogen oder pathogenassoziierten Antigenen, und anschließende Gewinnung des Antiserums, das für Antikörper angereichert ist, die das Pathogen oder die pathogenassozuerten Antigene binden.

10. Präparat nach Anspruch 1, wobei das Pathogen ein RNA- oder DNA Virus, ausgewählt aus menschlichem Immundefizienivirus (HIV), Herpes-Virus, Zytomegab-Virus, Tollwut-Virus, Influenza-Virus, Hepatitis B-Virus, Sendai-Virus, Katzen-Leukämievirus, Reo-Virus, Polio-Virus, menschlichem Serum-Parvo-artigem Virus, Simian-Virus 40, Respiratory- Syncytial-Virus, Maus-Brusttumor-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Dengue- Virus, Rubella-Virus, Masern-Virus, Adenovirus, menschlichem T-Zell- Leukämievirus, Epstein-Barr-Virus, Maus-Leukämievirus, Mumps-Virus, Vesikular-Stomatitis-Virus, Sindbis-Virus, lymphozytischem Choriomeningitis-Virus, Warzenvirus und Blue-Tongue-Virus, ist.

11. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pathogen ein Bakterium, ausgewählt aus Streptococcus agalactiae, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Esche richia coli, Neisseria gonorrhosae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, Lyme-Disease-Spirochäten, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis ist oder das Pathogen-assoziierte Antigen Tetanustoxin ist.

12. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pathogen eine Protozoe, ausgewählt aus Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Elmeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus und Mesocestoides corti, ist.

13. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pathogen ein Helminth oder ein Malariaparasit ist.

14. Präparat nach Anspruch 1, wobei das Pathogen ein Mycoplasma, ausgewählt aus Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium und M. pneumoniae, ist.

15. Präparat nach Anspruch 2, wobei das therapeutische Mittel ein antibiotisches oder zytotoxisches Mittel ist, das eine hämatopoietische Toxizität als eine Nebenwirkung seiner Verabreichung verursacht; wobei das Präparat weiterhin, als ein getrenntes Präparat, ein Zytokin enthält; und wobei das Präparat eine Form besitzt, die für eine gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung geeignet ist, wobei das Präparat eine Menge des Zytokins enthält, die ausreichend ist, die hämatopoietische Toxizität des Mittels zu lindern oder zu verhindern, wenn es an einen Patienten zu einer Zeit vor, gleichzeitig mit oder anschließend an eine Verabreichung des therapeutischen Konjugats verabreicht wird.

16. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vielzahl der chemisch gebundenen Antikörper oder Antikörperfragmente mindestens drei chemisch verbundene Antikörper oder Antikörperfragmente umfaßt.

17. Verwendung einer Vielzahl von Antikörperfragmenten, die chemisch miteinander verbunden sind und die an eine Vielzahl von Epitopen auf einer einzelnen Art eines Pathogens oder einem oder mehreren Antigenen, die davon abstammen, binden, konjugiert mit oder angepaßt für eine Konjugation mit mindestens einem diagnostischen Radioisotop zur Bildung eines radiomarkierten polyspezifischen Konjugats, zur Herstellung eines Mittels zum Abbilden eines Infektionsherdes gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 5-14 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren zum Abbilden eines Infektionsherdes, wobei ein Patient, der mit einem Pathogen infiziert ist, parenteral mit dem polyspezifischen Konjugat injiziert wird, das Radioisotop ohne die Verwendung einer Second- Antibody-Clearance zu dem Focus geleitet wird, und eine szintigraphische Abbildung des Infektionsherdes erhalten wird.

18. Verwendung einer Vielzahl von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die chemisch miteinander verbunden sind und die an eine Vielzahl von Antigenen binden, die zu verschiedenen Stadien des Lebenszyklus eines Pathogens oder Parasiten exprimiert werden, konjugiert mit oder angepaßt für eine Konjugation mit mindestens einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel zur Bildung eines polyspezifischen Konjugats, zur Herstellung eines Mittels zum Diagnostizieren oder Behandeln eines Infektionsherdes eines mikrobiellen Pathogens oder invertebraten Parasiten, der eine Vielfalt von Antigenen zu verschiedenen Stadien seines Lebenszyklus exprimiert, bei einem Menschen gemäß einem der Ansprüche 2, 4-9 oder 11-16, zur Verwendung in einem Verfahren zum Diagnostizieren oder Behandeln eines Infektionsherdes, wobei ein Patient, der mit dem Pathogen oder Parasiten infiziert ist, parenteral mit dem Konjugat injiziert wird, wodurch die diagnostische oder therapeutische Wirkung des Mittels bewirkt wird.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei ein Zytokin als ein getrenntes Präparat verwendet wird, um das Mittel herzustellen; und wobei in dem Verfahren eine Menge des Zytokins, die ausreicht, die hämatopoietische Toxizität des Mittels zu lindern oder zu verhindern, an den Patienten zu einer Zeit vor, gleichzeitig mit oder anschließend an die Verabreichung des therapeutischen Konjugats verabreicht wird.